CN103740733A

CN103740733A - 一种诊断用微小隐孢子虫重组抗原

Info

Publication number: CN103740733A
Application number: CN201410011922.2A
Authority: CN
Inventors: 尹继刚; 高依然; 向梅; 姜宁; 陆慧君; 陈启军
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2014-01-12
Filing date: 2014-01-12
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-12
Also published as: CN103740733B

Abstract

本发明公开了一种微小隐孢子虫重组抗原基因MUCIN，及其表达的融合蛋白重组抗原rMUCIN，随机取的520份健康人血清，用重组抗原rMUCIN和rCp23做检测抗原，ELISA检测人血清IgG抗体，用spss软件对数据进行分析rMUCIN蛋白质与rCP23蛋白质检测未知血清阳性率相同（X_C ²=0.370 P=0.543＞0.05），而rMUCIN蛋白质检测未知血清阳性率高于微小隐孢子虫粗抗原（X_C ²=5..222 P=0.02＜0.05）。本发明还提供了ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，它是以重组抗原rMUCIN做检测抗原，以rCp23做阳性对照，特异性、敏感性和可靠性更强。

Description

一种诊断用微小隐孢子虫重组抗原

技术领域

本发明属生物学诊断技术领域，确切地说是一种诊断用微小隐孢子虫重组抗原及以该抗原为诊断抗原检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒。

背景技术

隐孢子虫属顶复门原虫。从致病性方面分类该虫属于机会性原虫。虫体主要寄生于胃肠道上皮细胞的微绒毛边缘，感染宿主后症状表现轻重不一。隐孢子虫是公认的引起发展中国家儿童腹泻的重要原因之一也是艾滋病患者，免疫力低下者主要的致死原因。目前为止隐孢子虫分为24种，其中感染人的主要虫种为微小隐孢子虫（C ． parvum）和人隐孢子虫（C. hominis）。美国将微小隐孢子虫列为B类生物武器。本病缺乏明显的临床特征，在症状和体征上与其他病原体引起的肠炎相比无明显区别。目前隐孢子虫的检测方法主要包括病原学检测、免疫学检测和分子生物学方法。但是，病原学检测费时、费力，镜检的敏感性差、干扰多。分子生物学方法对仪器要求较高，不宜普及。免疫学检测具有较高的特异性与敏感性适用于临床诊断与流行病学调查。

但是目前国内外的研究的重组抗原主要集中在表面抗原 CP23、CP41、SA35 与SA40等。隐孢子虫很多虫种的基因组信息已经公布，这将为更多抗原，特别是诊断等抗原分子的研究提供重要基础。

国内尚无标准化的重组抗原诊断试剂盒，所以急需寻找新的敏感、特异的重组抗原，对隐孢子虫病流行病学调查和防治研究具有重要意义。因此本实验旨在筛选可替代天然抗原的重组抗原，用于隐孢子虫病的免疫学诊断。

发明内容

本发明的目的是为提高隐孢子虫病的免疫学诊断敏感性和特异性，而提供一种微小隐孢子虫重组抗原基因、重组抗原蛋白及用于隐孢子虫病的免疫学诊断试剂盒。

一种微小隐孢子虫重组抗原基因MUCIN，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

一种微小隐孢子虫重组抗原rMUCIN，它是由碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示基因表达的蛋白。

ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，它的检测抗原是由碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示基因表达的蛋白；

所述的ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，阳性对照为微小隐孢子虫rCp23抗原。

本发明提供了一种微小隐孢子虫重组抗原基因MUCIN，及其表达的融合蛋白重组抗原rMUCIN，随机取的520份健康人血清，用重组抗原rMUCIN和rCp23做检测抗原，ELISA检测人血清IgG抗体，用spss软件对数据进行分析rMUCIN蛋白质与rCP23蛋白质检测未知血清阳性率相同（X_C ²=0.370 P=0.543＞0.05），而rMUCIN蛋白质检测未知血清阳性率高于微小隐孢子虫粗抗原（X_C ²=5..222 P=0.02＜0.05）。本发明还提供了ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，它是以重组抗原rMUCIN做检测抗原，以rCp23做阳性对照，特异性、敏感性和可靠性更强。

附图说明

图1 MUCIN基因1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的产物图； M :Marker；1:MUCIN基因的PCR扩增；

图2 克隆载体酶切鉴定结果；M :Marker；1:重组质粒 PMD18-T- MUCIN双酶切；

图3重组表达载体的酶切鉴定结果； M :Marker；1:重组质粒pET-28a-MUCIN双酶切；

图4 、5纯化的目的蛋白鉴定结果； M :蛋白质分子量标准；1:重组蛋白质rMUCIN；

图6 重组抗原MUCIN和CP23抗微小隐孢子虫 IgG抗体反应吸光度值的线性回归；实线表示最佳拟合线；

图7 Western blot检测阳性血清样本，M: 蛋白质分子量标准；1-15：重组抗原MUCIN Western blot检测部分阳性血清样本；NC：阴性对照。

具体实施方式

实施例 1 微小隐孢子虫抗原基因的 MUCIN 的克隆

一、提取微小隐孢子虫C ． parvum (长春分离株)总DNA

（1）1×10⁷个微小隐孢子虫加入1ml裂解液((0.5% SDS ,1mM EDTA , 50mM Tris-HCl （pH 8.5）)悬浮沉淀两次，每次14000×g，5min，弃掉上清；

（2）加入100µL裂解液悬浮沉淀后在漩涡震荡器上混匀30s；

（3）再液氮中静置1min后立即放入65℃水浴，1min。重复此步骤18次，每重复三次放漩涡震荡仪上混匀30s；

（4）加入1µL 20mg/ml的蛋白酶K，55℃水浴锅中静置3h；

（5）90℃水浴锅中静置20min以灭活蛋白酶K；

（6）加入400ul裂解液，再加入500µL Tris饱和酚，上下震荡混匀30s后离心12000×g，5min；

（7）吸取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下震荡混匀30s后离心，12000×g，5min；

（8）吸取上清，再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下震荡混匀30s后离心，12000×g，5min；

（9）吸取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc，-20℃过夜。

（10）4℃离心12000×g，30min，弃掉上清；

（11）加入1ml 75%乙醇，离心12000×g，10min。重复1次；

（12）待沉淀干燥后，用10µL MilliQ水溶解DNA。

二、引物的设计与合成

根据Genebank上MUCIN基因（序列号为AF068065.1）对应的结构域，加上pET-28a (+)图谱中利于克隆入表达载体的酶切位点而设计引物，下划线部分为酶切位点BamHI、XhoI；

上游引物：5’- GGATCCATTCCAGGTTCACATTCCG -3’(BamHI)；

下游引物：5’- CTCGAGTTAAGATTCGTTCCAGAATGATG’(XhoI)。

三、PCR扩增目的基因

以提取的DNA样本为模板，进行降落PCR扩增，反应体系：上游引物（10pM）0.5μL，下游引物（10pM）0.5μL；模板DNA ，2.5μL；10mM dNTPs，2μL；10×PCR Buffer，2.5μL；Ex Taq Polymerase （5U/μL），0.2μL； ddH₂O，16.8μL；总体积，25μL。

反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s；退火温度为58℃ 30s；72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的产物(图1)。

四、目的基因PCR扩增产物的回收目的基因与克隆载体pMD18-T连接及转化

1）PCR阳性产物回收按Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒的说明书进行。将回收PCR产物连接到pMD18-T载体上，连接反应体系：胶回收产物1μL；pMD18-T 载体，1μL；Ligation Solution 3μL；ddH2O，5μL；总体积10μL。混匀并瞬离后置16℃ 水浴锅中过夜连接。

2）转化

将10ul pMD18-T连接产物加入DH5α感受态细胞，轻轻摇匀，冰上静置30min，42℃水浴锅中热激90s，冰水中水浴2min，加入800ul无抗生素的LB培养液，37℃摇床中180r/min振荡45min，3,000rpm，3min，离心。吸出上清，留200ul上清混匀后涂LB-Amp（100μg/mL）平板。

3）重组克隆载体的鉴定

挑取平板上的单克隆菌落，分别接种于5ml 含1‰Amp的LB培养液中，37℃，180r/min振荡培养过夜。甘油保菌，保存-80℃冰箱；剩下菌液提取质粒用于克隆载体酶切鉴定（图2）。测序结果通过DNAman分析和在NCBI上BLAST进行同源性分析比对，测序结果，目的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，重组克隆载体命名为pMD18-T-MUCIN。

实施例 2 构建重组质粒 pMD18-T- MUCIN 及表达

重组质粒pMD18-T- MUCIN及表达载体pET-28-a用BamHI、XhoI两种内切酶进行酶切，将MUCIN基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳回收插入表达载体pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-MUCIN。重组表达载体的酶切鉴定结果见图3。将重组表达质粒pET-28a-MUCIN转入BL21(DE3)中进行表达，融合蛋白命名为rMUCIN，在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白并分析其可溶性，The QIAexpressionist™说明书纯化6×His标签蛋白进行操作。

重组蛋白的SDS-PAGE与Western blot鉴定：配制12%聚丙烯酰胺凝胶，Western blot 常规方法。一抗：鼠源抗HIS标签单克隆抗体(天津三箭公司)TBST稀释（1：5000）。封闭液：5% 脱脂奶粉。二抗：碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG（H+L）抗体。显色液：BCIP/NBT。结果（图 4和图5）可见纯化出的目的蛋白质。

实施例3 用rMUCIN为检测抗原的ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体

按照Priest等人制备微小隐孢子虫Cp23抗原，用于血清学检测对照抗原（Priest J, Kwon J, Moss D.Detection by enzyme immunoassay of serum immunoglobulin G antibodies that recognize specific Cryptosporidium parvum antigens. Clin Microbiol Rev. 1999,37(5):1385-92）。

一、血清学检测

本实验随机取520份健康人血清，用重组抗原rMUCIN和rCp23特异性检测人血清IgG抗体加一抗时：加人阴性血清的孔作为阴性对照，加TBST孔作为空白对照。

（1）将重组蛋白rMUCIN、Cp23抗原分别用Coating buffer（1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃）稀释至终浓度5µg/mL，0.2µg/mL以50µL/孔的量加入到96孔微量滴定板的各孔板中，4℃条件下包被过夜，ELISA自动洗板机彻底洗涤微量滴定孔4次，每次3min；

（2）每个孔中加入100µL Blocking buffer（含0.5％BSA的PBS），37℃温箱中孵育1h,ELISA自动洗板机洗涤3次，每次3min；

（3）将用Tween Buffer 1:50稀释后的人血清以100µL/孔的量加入到ELISA板中，37℃温箱中孵育3-4h，ELISA自动洗板机洗涤3次，每次3min；

（4）每个孔中加入50µL用Tween Buffer以1:20000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人（Sigma公司，圣路易斯，美国）IgG抗体，37℃温箱中孵育1h，ELISA自动洗板机洗涤3次，每次3min；

（5）一个PNPP [4 - 硝基苯基磷酸二钠水合物]（Sigma公司，圣路易斯，美国）显色剂药片溶解于5mL 9.7％，二乙醇胺（pH为9.8），制成底物显色液，向每个孔加入50µL的底物显色液，避光条件下显色；

（6）显色后，通过酶标仪检测OD₄₀₅值。

二、ELISA结果判定标准：

结果判定标准：以A₄₀₅值阴性对照平均值+3×阴性对照标准差作为阳性。

取42个阴性血清样本，根据公式计算出A₄₀₅值大于0.36为阳性血清。为提高实验精确度每份样本重复3个孔，求平均值后代入公式计算。

三、血清样本ELISA结果分析

对rMUCIN与rCP23重组抗原检测未知血清结果统计并用四格表（表1）进行分析。

Figure 2014100119222100002DEST_PATH_IMAGE001

用SPSS 18.0软件对数据进行分析，rMUCIN与rCP23蛋白质检测未知血清阳性率采用卡方检验， P≤0.05 时判断差异有统计学意义。结果P=0.56＞0.05，说明MUCIN与CP21抗原检测血清阳性率相同。

采用线性回归分析rMUCIN与rCP23蛋白质对IgG抗体的相关性。P≤0.05被认为有统计学意义。对于抗隐孢子虫 IgG抗体反应，吸光度值揭示了MUCIN和CP23具有相关性（r² = 0.406，P <0.001）

Figure 2014100119222100002DEST_PATH_IMAGE002

用spss软件对数据进行分析rMUCIN蛋白质与rCP21蛋白质检测未知血清阳性率相同（X_C ²=0.370 P=0.543＞0.05），而rMUCIN蛋白质检测未知血清阳性率高于微小隐孢子虫粗抗原（X_C ²=5..222 P=0.02＜0.05）（图6）。

四、 Western blot分析血清样品。

随机选出ELISA 检测出的阳性血清样本，经过12% Western blot检测血清样本。半干转硝酸纤维素膜（NC），电压为24V，时间为40min。TBST 1:100稀释血清，将NC膜裁成2毫米宽的条带，4℃下孵育过夜。TBST洗4次，每次5min。用TBST 1:20000倍稀释碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体， 37℃，1h，用TBST洗4次，每次5min。滴加BCIP/NBT显色液，直至有特异性条带出现，立即放入去离子水中以终止反应。Western blot检测阳性血清样本分析结果见图7。结果证明MUCIN蛋白质可做为检测隐孢子虫的候选抗原，其特异性和敏感性较好，用于隐孢子虫血清学检测。

<110> 吉林大学

<120>一种诊断用微小隐孢子虫重组抗原

<160> 1

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> 微小隐孢子虫

<400> 1

attccaggtt cacattccgg atttattaat ggtacatctg gagaacaatc acatgagaaa 60

gatccaagta ctggtaagcc acttgatcca aatacaggtt tgccattcga tgaagattct 120

ggtagtttaa ttaacccaga gactggagat aaacttcaag gatcacattc tggtacattt 180

atgccagtac caggtaaacc acaaggtgaa aatggaggta tcatgacacc tgagcagata 240

ttggaagcat taaataaatt gccaacaagt aatgaagtaa atatttcacc aagaccaagt 300

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taccaggttg atggaaagaa gactattcca ggttctgcag cttcagtaat tcacactgct 420

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ttaccattca ttccaggatt taacgtgctt gtagatcctc agactggaga gcaaatcaag 540

ggttctgttc cttatgtttc attgtacgtt aaggaaaaga atattgtaac agaagctgct 600

tatggtctac cagttgatcc aaagactggt ttcccaattg atccaattag ttacctcccg 660

tttgctaaga atggcgaact aattgatcct atctctggta aatatttcag tggttcaatt 720

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ccaattgatc catcaacaaa tatgccttac gatccaaaaa caggcaaatt aattgatcca 840

gaatctggca ttgctattga taattctgtt tcaggtgtgt ttgcaactgt acctggtact 900

gctgcaccga aaaagggtgg tgtcattccg gagtcagttg cagctgaggc agcaaagaaa 960

tactttgcag ccaatgttga gggagaggga gaaggagaag aagttccacc accgccagaa 1020

tcatctagta acattgcaat ccaagctgct ggtggtgctt ctgctgctgt aggtctcgta 1080

gctgctggtg ttggtgcatg gtatgcaagc agaaacagac aggaaggaga agatgatgat 1140

gactatgcag atggatttga agcagaatat gaagaagaag aggaagaaga gggtgatgaa 1200

gcagcaaatg aaactgttgt tacaattgag cgtgattcat cattctggaa cgaatcttaa 1260

Claims

1.一种微小隐孢子虫重组抗原基因MUCIN，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种微小隐孢子虫重组抗原rMUCIN，它是由碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示基因表达的蛋白。

3.ELISA法检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，其特征在于：它的检测抗原是由碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示基因表达的蛋白。

4.根据权利要求3所述的ELISA法检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，其特征在于：阳性对照为微小隐孢子虫Cp23抗原。