CN116903713B - 一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产方法及应用 - Google Patents

一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产方法及应用，属于病原微生物检测技术领域。本发明所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述重组蛋白，是基于B细胞抗原表位的预测，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位，通过表达系统进行表达得到。本发明所述重组蛋白作为重组抗原时，具有较好的抗原性，能够快速、高效的捕获血清中的目标分子，可准确快速地检测出微孢子虫的感染，适应基层大规模微孢子虫检测的需要。同时也适用于同属的其他微孢子虫，适用范围广泛。

Description

一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产 方法及应用
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产方法及应用。
背景技术
微孢子虫是一类专性胞内寄生的机会性病原，能感染几乎所有动物，包括人类和重要的经济动物，不仅给人类生产造成重大经济损失，而且还是人类健康的严重威胁。因此，微孢子虫已经成为各养殖业生产中及进出口检疫等方面关注的重要病原微生物。微孢子虫可通过破损的皮肤及眼部损伤的直接接触和性行为传播(Didier et al.2001)。在人体中也发现了能感染昆虫的微孢子虫，这可能是通过昆虫的叮咬、皮肤损伤或污染的食物或水传播的。微孢子虫的垂直传播目前尚未在人类中发现，但在非人类的灵长类和其他许多不同的哺乳类动物中已被报道。
脑炎微孢子虫是一种人畜共患微孢子虫。脑炎微孢子虫可引起人类和许多哺乳动物产生疾病，在昆虫中也发现了脑炎微孢子虫的感染。脑炎微孢子虫可以造成它们宿主的散播性感染疾病，几乎可以涉及所有器官系统。脑炎微孢子虫病能够引起多种临床症状，包括胃肠炎、角膜炎、鼻窦炎、细支气管炎、肾炎、膀胱炎、输尿管炎、尿道炎、前列腺炎、肝炎、暴发性肝衰竭、腹膜炎、脑炎、皮肤小结等(Kester et al.1998,2000；Mertens etal.1997；Orenstein et al.1997；Schwartz et al.1993b,1996；Sheth et al.1997；Visvesvara et al.1995b；Zendar et al.1989)。当前，临床和生产上都缺乏有效治疗微孢子虫感染的药物和制剂。因此，及时诊断脑炎微孢子虫感染并控制其传染源是非常重要的防御措施。
目前，实验室常用的微孢子虫的诊断方法有常规染色法、电镜检测和分子生物学法检测，其中基于PCR的检测方法准确度高，且具有进一步鉴定基因型的优势。但这些检测技术对仪器设备和检测人员的技术水平有严格要求，主要用于实验室研究。检测粪便或尿液中的微孢子虫，需要从粪便或尿液中分离微孢子虫，操作较复杂，不适用基层大规模的检测。血清学检测是活体动物或人类重要的诊断方法，此方法可以有效检测多种动物中由微孢子虫侵染产生的抗体。酶联免疫吸附试验是血清学诊断的一种重要方法，目前酶联免疫吸附试验主要用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的微孢子虫作为抗原，但该方法抗原纯度较低，成份复杂，价格昂贵。而原核表达系统表达出的重组目的蛋白，具有蛋白产量高、操作简单、费用低廉等优势，成为众多学者研究的热点。因此，如何通过原核表达系统制备一种敏感性高、特异性强的微孢子虫诊断抗原，用于微孢子虫病的血清学诊断，是急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产方法及应用，可同时对大量样本进行检测，适应基层微孢子虫检测的需要，具有很好的应用前景。
本发明提供了一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了编码上述重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了一种扩增上述基因的引物对，包括核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物。
本发明还提供了生产上述重组蛋白的方法，包括以下步骤：将上述基因连接到表达载体上，构建得到重组表达载体；
利用所述重组表达载体转化至表达宿主基因组内，构建得到重组表达宿主；
诱导所述重组表达宿主生产权利要求1所述重组蛋白。
优选的，当所述表达宿主为原核表达细菌时，所述表达载体的基础载体包括pET-32a(+)。
优选的，所述原核表达细菌包括E.coli Rosetta感受态细胞。
优选的，得所述重组蛋白后，还包括纯化。
本发明还提供了上述重组蛋白或上述方法生产得到的重组蛋白在制备检测微孢子虫的试剂中的应用。
优选的，当利用免疫学方法检测微孢子虫时，以上述重组蛋白或上述方法生产得到的重组蛋白作为抗原。
本发明还提供了一种检测微孢子虫的试剂盒，包括抗原和其他免疫学检测试剂；
所述抗原为上述重组蛋白或上述方法生产得到的重组蛋白。
有益效果：本发明提供了一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述重组蛋白，是基于B细胞抗原表位的预测，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位，通过表达系统进行表达得到。
本发明所述重组蛋白作为重组抗原时，具有较好的抗原性，能够快速、高效的捕获血清中的目标分子，可准确快速地检测出微孢子虫的感染，适应基层大规模微孢子虫检测的需要。同时也适用于同属的其他微孢子虫，适用范围广泛。
附图说明
图1为重组蛋白EcSSP1的表达纯化结果图；A：纯化的重组蛋白EcSSP1-His的SDS-PAGE分析结果图，泳道1：超声破碎后的上清液；泳道2：加样后的流穿液；泳道3-9：不同浓度咪唑洗脱的目的蛋白；B：His抗体检测表达的重组蛋白结果图；
图2为微孢子虫表面蛋白EcSSP1多克隆抗体的Westernblot分析和表面蛋白EcSSP1亚细胞定位分析结果图；A：重组蛋白EcSSP1的Westernblot分析结果图；B：EcSSP1多克隆抗体与E.cuniculi总蛋白的Westernblot分析结果图；C：表面蛋白EcSSP1亚细胞定位分析结果图；A1和B1表示白光下的微孢子虫；A2和B2表示DAPI标记的细胞核；A3表示滴加anti-EcSSP1多克隆鼠抗，B3表示滴加阴性血清；A4和B4表示图片进行merge的结果；
图3为所述重组蛋白的检测灵敏度结果图；A：灌胃感染5×103个E.cuniculi血清的Westernblot分析结果图；B：灌胃感染5×105个E.cuniculi血清的Western blot分析结果图；C：灌胃感染5×107个E.cuniculi血清的Westernblot分析结果图；D：灌胃1×PBS血清的Westernblot分析结果图；
图4为所述重组蛋白的检测特异性结果图；A：腹腔注射感染E.hellem血清的Westernblot分析结果图；B：腹腔注射感染E.cuniculi血清的Westernblot分析结果图；C：腹腔注射感染E.intestinalis血清的Westernblot分析结果图；D：腹腔注射1×PBS血清的Westernblot分析结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述重组蛋白是通过对微孢子虫表面蛋白EcSSP1进行B细胞抗原表位分析，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位，设计特异性引物扩增出相应的基因片段，利用同源重组的方法连接到pET-32a(+)表达载体中。并将其转化至表达菌株；诱导表达后通过镍柱亲和层析纯化获得所述重组蛋白。
本发明还提供了编码上述重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了一种扩增上述基因的引物对，包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物。
本发明所述引物对优选为同源重组引物，其中上游引物(SEQ ID No.3)：5’-ACAAGGCCATGGCTGATATCATGTGCGACTATGAGCTGAAG-3’；下游引物(SEQ ID No.4)：5’-TGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAAGATTCTCCCTGTAAGTGCT-3’。
本发明还提供了生产上述重组蛋白的方法，包括以下步骤：将上述基因连接到表达载体上，构建得到重组表达载体；
利用所述重组表达载体转化至表达宿主基因组内，构建得到重组表达宿主；
诱导所述重组表达宿主生产权利要求1所述重组蛋白。
本发明对所述生产的具体表达系统并没有特殊限定，利用本领域所熟知的原核表达系统、、真核表达系统甚至植物表达系统以及其他表达系统均可满足要求，实施例中以原核表达为例进行说明。
利用原核表达的方式生产所述重组蛋白时，优选包括以下步骤：根据截取的序列设计特异性引物，从微孢子虫的基因组中扩增出编码SEQ ID NO.1所示蛋白的核苷酸序列，或通过基因合成的方法合成编码SEQ ID NO.1所示蛋白的核苷酸序列，将扩增或合成的重组蛋白的基因序列插入到pET-32a(+)原核表达载体的BamHI和HindIII位点之间。然后将构建的重组表达质粒转化至表达菌株；将表达菌株在培养基中扩大培养，加入诱导剂诱导后，收集菌液超声破碎，最后通过镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白。本发明所述表达菌株优选为E.coli Rosetta感受态细胞。本发明所述培养基优选为含氨苄(工作浓度100μg/mL)的LB液体培养基。本发明在诱导所述表达时，优选向300mL液体培养基中加入300μL 1M IPTG，37℃诱导4h。本发明在得所述重组蛋白后，优选还包括纯化：收集诱导后的菌液，用BufferA溶液重悬菌体沉淀，于冰上超声破碎30min。破碎后12000rpm，4℃离心30min，将蛋白上清转移至50mL离心管中。混匀50％Ni-NTA，从中吸取1mL装柱。加入20mL无菌水进行润洗，再加入20mL BufferA进行平衡。随后将蛋白上清与镍柱进行结合，控制流速为3秒1滴。先用20mM咪唑除去杂蛋白，然后用50mM咪唑洗脱目的蛋白。上述所有加入柱中的液体均需要通过0.22μm滤膜过滤。
本发明还提供了上述重组蛋白或上述方法生产得到的重组蛋白在制备检测微孢子虫的试剂中的应用。
本发明所述重组蛋白可特异并且快速、高效的捕获血清中的目标分子，可准确快速地检测出微孢子虫的感染，适应基层大规模微孢子虫检测的需要。当利用免疫学方法检测微孢子虫时，本发明优选以上述重组蛋白或上述方法生产得到的重组蛋白作为抗原。
本发明还提供了一种检测微孢子虫的试剂盒，包括抗原和其他免疫学检测试剂；
所述抗原为上述重组蛋白或上述方法生产得到的重组蛋白。
本发明所述免疫学检测优选包括Westernblot或ELISA等。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白、编码基因和生产方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
重组蛋白EcSSP1的表达纯化及His抗体检测表达重组蛋白。
1、将保存的菌液接种于300mL含氨苄的LB培养基中，在37℃，180rpm摇床中培养，当生长至对数期(OD600为0.6)时，加入300μL 1M IPTG，37℃诱导4h。收集诱导后的菌液，用BufferA溶液重悬菌体沉淀，于冰上超声破碎30min。破碎后12000rpm，4℃离心30min，将蛋白上清转移至50mL离心管中。混匀50％Ni-NTA，从中吸取1mL装柱。加入20mL无菌水进行润洗，再加入20mLBufferA进行平衡。随后将蛋白上清与镍柱进行结合，控制流速为3秒1滴。先用20mM咪唑除去杂蛋白，然后用50mM咪唑洗脱目的蛋白。上述所有加入柱中的液体均需要通过0.22μm滤膜过滤。
结果如图1中A所示。
2、His抗体检测EcSSP1重组蛋白：
(1)电泳：取40μL纯化后的蛋白与10μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀后，煮沸10min，取其中10μL进行SDS-PAGE。
(2)转膜：在半干转膜仪上放上经转膜缓冲液浸泡过的滤纸，然后放置PVDF膜和PAGE蛋白胶，最后再放经转膜缓冲液浸泡过的滤纸。转膜仪参数设定为电压25V，电流1.5A，转膜时间15min；
(3)封闭：电转完成后，将PVDF膜置入20mL 5％脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2h；
(4)用一抗稀释液按照1:1000(v/v)的工作浓度稀释鼠抗His抗体，抗体与PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，用1×TBST清3次，每次10min；
(5)用PBS以1:8000(v/v)稀释羊抗鼠IgG-HRP，然后二抗与PVDF膜室温共孵育40min后，用1×TBST清洗3次，每次10min；
(6)PVDF膜与ECL化学发光底物避光反应后，利用成像仪观察PVDF膜的显色结果。
结果如图1中B所示。
实施例2
表面蛋白EcSSP1多克隆抗体的Westernblot分析和亚细胞定位分析
1、EcSSP1多克隆抗体的Westernblot分析
(1)电泳：将EcSSP1重组蛋白和E.cuniculi可溶性蛋白进行SDS-PAGE。
(2)转膜：在半干转膜仪上放上经转膜缓冲液浸泡过的滤纸，然后放置PVDF膜和PAGE蛋白胶，最后再放经转膜缓冲液浸泡过的滤纸。转膜仪参数设定为电压25V，电流1.5A，转膜时间15min；
(3)封闭：电转完成后，将PVDF膜置入20mL 5％脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2h；
(4)用一抗稀释液按照1:1000(v/v)的工作浓度EcSSP1多克隆抗体，抗体与PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，用1×TBST清3次，每次10min；
(5)用PBS以1:8000(v/v)稀释羊抗鼠IgG-HRP，然后二抗与PVDF膜室温共孵育40min后，用1×TBST清洗3次，每次10min；
(6)PVDF膜与ECL化学发光底物避光反应后，利用成像仪观察PVDF膜的显色结果。
结果如图2中A、B所示。
2、EcSSP1亚细胞定位分析
(1)E.cuniculi的固定：在载玻片的中心位置，滴加50μL 0.01％(W/V，g/ml)的多聚赖氨酸溶液后风干，得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用；吸取10μL(浓度106/mL)的E.cuniculi至多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5min；向载玻片上滴加50μL4％(W/V，g/ml)的多聚甲醛溶液，固定25min；吸除多余液体，向培养孔添加100μL 0.01mol/LPBS溶液浸浴样品，缓慢振荡清洗3次，每次5min；
(2)封闭：吸除液体后滴加50μL封闭液覆盖孢子，18～37℃处理1h；所述的封闭液为0.05％(V/V)Tween 20，2％(V/V)TritonX-100，0.05％(W/V，g/ml)BSA和10％(V/V)山羊血清的PBS溶液；
(3)间接免疫荧光法标记E.cuniculi：吸除封闭液，清洗液清洗3次，每次5min，所述清洗液为含0.05％(V/V)Tween20的PBS溶液；然后采用封闭液将EcSSP1多克隆抗体和阴性血清按体积比为1:200稀释制备一抗工作液，然后滴加50μL一抗工作液浸浴孢子，18～37℃孵育1h；吸除一抗工作液液，滴加清洗液清洗3次，每次5min；采用封闭液将AlexaFluor488标记的山羊抗小鼠IgG按体积比为1:1000稀释制备二抗工作液，再滴加50μL二抗工作液浸浴孢子，常温孵育1h；吸除二抗工作液，滴加清洗液清洗3次，每次5min；
(4)DAPI标记E.cuniculi细胞核：滴加50μL 1μg/mLDAPI染色液覆盖孢子，室温孵育30min；吸除染色液，滴加清洗液清洗3次，每次5min；吸除液体，取5μL抗荧光淬灭封片剂点加到载玻片上，盖上盖玻片，指甲油封片；
(5)激光共聚焦显微镜进行观察拍照。
结果如图2中C所示。
实施例3
重组蛋白EcSSP1在检测血清中E.cuniculi感染的应用，包括如下步骤：
1、E.cuniculi的培养：用兔肾细胞系(RK13)培养E.cuniculi。将RK13在T25细胞瓶内培养，待其长满瓶壁后，按照细胞和孢子比例为1:20感染，培养至孢子成熟释放到细胞外，收集培养上清进行孢子纯化。
2、待检血清的制备：每只C57BL/6小鼠通过灌胃感染E.cuniculi，感染剂量分别为5×103个、5×105个、5×107个，并连续灌胃感染两天，对照组小鼠灌胃1×PBS溶液。在感染的第14天，获取抗血清，并于-20℃保存。
3、免疫印迹(Westernblot)检测
(1)裁剪大小合适的PVDF膜置于甲醇中激活15s，然后经dd H2O清洗20s后，浸泡在转膜缓冲液中，待用；
(2)首先在半干转膜仪上放上经转膜缓冲液浸泡过的滤纸，然后放置PVDF膜和PAGE蛋白胶，最后再放经转膜缓冲液浸泡过的滤纸。转膜仪参数设定为电压25V，电流1.5A，转膜时间15min；
(3)电转完成后，将PVDF膜置入20mL 5％脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2h；
(4)用一抗稀释液按照1:200(v/v)的抗体工作浓度稀释抗血清，抗体与PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，用1×TBST清3次，每次10min；
(5)用PBS以1:8000(v/v)稀释羊抗鼠IgG-HRP，然后二抗与PVDF膜室温共孵育40min后，用1×TBST清洗3次，每次10min；
(6)PVDF膜与ECL化学发光底物避光反应后，利用成像仪观察PVDF膜的显色结果。
结果如图3所示，灌胃感染5×103个～5×107个E.cuniculi的血清中，均可检测到重组蛋白EcSSP1；但阴性对照灌胃1×PBS的血清中无法检测到重组蛋白EcSSP1。
实施例4
重组蛋白EcSSP1在间接ELISA检测方法中的应用
将实施例1得到的纯化的重组蛋白EcSSP1(0.5μg/孔)与ELISA包被液充分混匀后加入到酶标板中，每孔100μL，4℃过夜。
甩干板中的ELISA包被液，PBST摇洗3次，5min/次，然后每孔加入200μLELISA封闭缓冲液，37℃放置2h,封闭完成后用PBST摇洗3次。
用ELISA封闭缓冲液或PBS将阳性血清与阴性血清按照1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800进行梯度稀释，然后每孔加100μL，每孔3个重复，37℃放置2h，孵育结束后PBST摇洗3次。
用ELISA封闭缓冲液或PBS稀释羊抗鼠lgG-HRP，稀释比例为1:5000，每孔加100μL，37℃放置1-2h，孵育结束后PBST摇洗3次。
加入TMB显色液，每孔200μL，37℃避光放置30min，然后加入浓度为2M的H2SO4终止其反应，每孔加入50μL。
将酶标板放置在酶标仪中，设定450nm吸收波长检测，相同稀释倍数下待测孔吸光值大于阴性孔2.1倍即认定为阳性。
结果如表1所示，即使血清稀释到1:6400，纯化的重组蛋白EcSSP1仍能够与阳性血清发生反应，但不与阴性血清发生反应，说明纯化的重组蛋白EcSSP1具有很好的敏感性。
表1重组蛋白EcSSP1的间接ELISA检测结果
实施例5
重组蛋白EcSSP1在检测血清中E.hellem、E.cuniculi、E.intestinalis感染的应用，包括如下步骤：
1、E.hellem、E.cuniculi、E.intestinalis的培养：用兔肾细胞系(RK13)培养E.hellem和E.cuniculi；用人包皮成纤维细胞系(HFF)培养E.intestinalis。将RK13和HFF在T25细胞瓶内培养，待其长满瓶壁后，按照细胞和孢子比例为1:20感染，培养至孢子成熟释放到细胞外，收集培养上清进行孢子纯化。
2、待检血清的制备：每只C57BL/6小鼠通过腹腔注射感染E.hellem、E.cuniculi、E.intestinalis，每只小鼠感染剂量为1×107个，并连续感染两天，对照组小鼠注射1×PBS溶液。在感染的第14天，获取抗血清，并于-20℃保存。
3、免疫印迹(Westernblot)检测
(1)裁剪大小合适的PVDF膜置于甲醇中激活15s，然后经dd H2O清洗20s后，浸泡在转膜缓冲液中，待用；
(2)首先在半干转膜仪上放上经转膜缓冲液浸泡过的滤纸，然后放置PVDF膜和PAGE蛋白胶，最后再放经转膜缓冲液浸泡过的滤纸。转膜仪参数设定为电压25V，电流1.5A，转膜时间15min；
(3)电转完成后，将PVDF膜置入20mL 5％脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2h；
(4)用一抗稀释液按照1:200(v/v)的抗体工作浓度稀释抗血清，抗体与PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，用1×TBST清洗3次，每次10min；
(5)用PBS以1:8000(v/v)稀释羊抗鼠IgG-HRP，然后二抗与PVDF膜室温共孵育40min后，用1×TBST清洗3次，每次10min；
(6)PVDF膜与ECL化学发光底物避光反应后，利用成像仪观察PVDF膜的显色结果。结果如图4所示。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种微孢子虫表面抗原EcSSP1的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述重组蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.一种扩增权利要求2所述基因的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物。
4.生产权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述基因连接到表达载体上，构建得到重组表达载体；
利用所述重组表达载体转化至表达宿主基因组内，构建得到重组表达宿主；
诱导所述重组表达宿主生产权利要求1所述重组蛋白。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，当所述表达宿主为原核表达细菌时，所述表达载体的基础载体包括pET-32a（+）。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述原核表达细菌包括E. coli Rosetta感受态细胞。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，得所述重组蛋白后，还包括纯化。
8.权利要求1所述重组蛋白或权利要求4~7任一项所述方法生产得到的重组蛋白在制备检测微孢子虫感染的试剂中的应用，其特征在于，所述微孢子虫为脑炎微孢子虫。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，当利用免疫学的方法检测微孢子虫感染时，以权利要求1所述重组蛋白或权利要求4~7任一项所述方法生产得到的重组蛋白作为抗原。
10.一种检测微孢子虫感染的试剂盒，其特征在于，包括抗原和其他免疫学检测试剂；
所述抗原为权利要求1所述重组蛋白或权利要求4~7任一项所述方法生产得到的重组蛋白。
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