CN109824766A - 一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽腺病毒4型Fiber2蛋白、制备方法及其检测试剂盒。将禽腺病毒4型Fiber2基因经密码子优化后连接pCold原核表达载体，转化BL21感受态细胞，诱导表达后收集菌体，超声破碎菌体后离心，收集上清，His凝胶柱纯化获得包被用抗原。该试剂盒包括Fiber2蛋白包被的检测板、血清稀释液、工作浓度的羊抗鸡HRP酶标抗体、阴性对照、阳性对照、TMB显色液和终止液。本发明的试剂盒可快速而特异地检测血清中Fiber2抗体有无，用于检测鸡血清中腺病毒4型Fiber2蛋白抗体，反应特异性好，灵敏度高，操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠，适用于鸡群体感染状况监测和评估、发现早期隐性感染。

Description

一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测 试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种Fiber2蛋白及其制备方法、检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒。

背景技术

2015年，在我国山东、河南、安徽和江苏等省份的鸡群大面积流行一种以3～5周龄肉鸡突然发病死亡，剖检病变主要表现为心包积液、肝脏黄疸、肿大和出血为特征的传染病，该病造成30％-60％的死亡率，给我国养禽业造成了很大的经济损失。国内研究证实该病是由禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)引起，能够引起鸡心包积水和肝炎综合征，在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。FAdV-4疫病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、黄羽鸡、肉种鸡和蛋鸡均可感染发病。

通过对I群禽腺病毒的流行病学调查发现，FAdV-4属于腺病毒科禽腺病毒属中的Ⅰ群禽腺病毒成员，是无囊膜双股DNA病毒，其衣壳由Fiber、Hexon和Penton 3个主要结构蛋白组成。因此，提供一种快速、准确的检测禽腺病毒4型抗体的方法来监测和评估鸡群感染情况，发现早期隐性感染显得尤为必要。

发明内容

本发明提供了一种Fiber2蛋白及其制备方法、检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒，能够有效地检测出鸡血清中腺病毒4型Fiber2蛋白抗体，反应特异性好，灵敏度高。

为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种Fiber2蛋白，所述Fiber2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明提供了一种上述方案所述的Fiber2蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Fiber2蛋白的编码基因，利用同源重组方法将所述Fiber2蛋白的编码基因连接至pCold原核表达载体获得表达质粒pCold-Fiber2；

2)将所述表达质粒pCold-Fiber2转入大肠杆菌BL21中获得重组菌株；

3)诱导表达步骤2)中所述的重组菌株获得发酵上清液，使用凝胶柱纯化所述发酵上清液，获得Fiber2蛋白。

本发明提供了一种基于间接ELISA法检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒，包括以下组成：包被有上述方案所述Fiber2蛋白的检测板。

优选的，还包括以下组成：

血清稀释液；

阳性对照品；

阴性对照品；

底物显色液；

终止液；

山羊抗鸡IgG-HRP二抗；

25倍PBST浓缩液；

封板膜。

优选的，所述蛋白的包被浓度为200ng/孔。

优选的，待检血清的最佳稀释浓度为1:50。

优选的，所述山羊抗鸡IgG-HRP二抗在使用时按照1:4000的比例进行稀释。

本发明提供了一种Fiber2蛋白及其制备方法、检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒。本发明提供的Fiber2蛋白与常见的禽病病原NDV、IBDV、IBV、H5、H7和H9亚型AIV阳性血清均无交叉反应。说明本发明提供的Fiber2蛋白能够用来作为抗原标志物检测禽腺病毒4型抗体。

本发明提供了一种基于间接ELISA法检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒，本发明提供的试剂盒可快速检测鸡血清中腺病毒4型Fiber2蛋白抗体，敏感性为96％，特异性为100％，反应特异性、重复性好，灵敏度高，操作简单。为临床进行FAdV-4流行病学调查和疫苗免疫反应检测提供更为客观的方法，从而为制定有效防控措施提供依据。

附图说明

图1为实施例2中目的蛋白SDS-PAGE分析图；

图2为实施例4中交叉反应性试验结果分析图；

图3为实施例5中敏感性和特异性试验结果分析图；

图4为实施例7中临床血清样品检测结果分析图。

具体实施方式

本发明提供了一种Fiber2蛋白，所述Fiber2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，具体如下：

ATGCTGCGTGCACCGAAACGTCGCCATAGTGAAAATGGCAAACCGGAAACCGAAGCCGGCCCGAGTCCGGCTCCGATTAAGCGCGCAAAACGCATGGTTCGTGCCAGCCAGCTGGATCTGGTGTATCCGTTTGATTATGTTGCCGATCCGGTGGGTGGCCTGAATCCGCCGTTTCTGGGTGGTAGTGGCCCGCTGGTGGATCAGGGCGGCCAGTTAACCCTGAATGTTACCGATCCGATTATTATTAAGAACCGCAGCGTTGATCTGGCACATGATCCGAGTCTGGATGTTAATGCACAGGGTCAGCTGGCAGTGGCAGTGGATCCGGAAGGCGCACTGGATATTACCCCGGATGGTCTGGATGTGAAAGTGGATGGCGTGACCGTTATGGTGAATGATGATTGGGAACTGGCCGTGAAAGTTGATCCGAGCGGCGGCCTGGATAGCACCGCCGGTGGTCTGGGCGTGAGCGTTGATGATACCCTGCTGGTGGATCAAGGTGAACTGGGTGTTCATCTGAATCAGCAGGGCCCGATTACCGCCGATAGTAGCGGCATTGATCTGGAAATTAATCCGAATATGTTCACCGTTAATACCAGTACCGGCAGTGGTGTGCTGGAACTGAATCTGAAAGCACAGGGCGGCATTCAGGCAGATAGTAGTGGTGTGGGCGTGAGCGTGGATGAAAGTCTGCAGATTGTTAATAATACCCTGGAAGTTAAACCGGATCCGAGCGGTCCGCTGACCGTGAGTGCCAATGGCCTGGGCCTGAAATATGATACCAATACCCTGGCCGTGACCGCAGGCGCACTGACCGTGGTGGGTGGTGGTAGCGTTAGCACCCCGATTGCCACCTTTGTGAGCGGTAGCCCGAGCCTGAATACCTATAATGCAACCACCGTTAATAGTAGTGCAAATGCCTTTAGCTGCGCATATTATCTGCAGCAGTGGAATATTCAGGGTCTGCTGGTGACCAGCCTGTATCTGAAACTGGATAGCGCCACCATGGGCAATCGCCCGGGCGATCTGAATAGCGCCAATGCAAAATGGTTTACCTTTTGGGTTAGCGCCTATCTGCAGCAATGCAATCCGAGCGGCATTCAGGCGGGTACCGTTAGTCCGAGTACCGCCACCCTGACCGATTTTGAACCGATGGCAAATCGTAGCGTTACCAGCCCGTGGACCTATAGCGCCAATGGTTATTATGAACCGAGCATTGGCGAATTTCAGGTGTTTAGTCCGGTTGTGACCGGCGCATGGAATCCGGGTAATATTGGCATTCGCGTGCTGCCGGTTCCGGTTAGCGCAAGTGGCGAACGCTATACCCTGCTGTGTTATAGTCTGCAGTGTACCAATGCCAGCATTTTTAATCCGAATAATAGTGGCACCATGATTGTGGGTCCGGTTCTGTATAGCTGCCCGGCCGCAAGCCTGCCGTAA。

在本发明中，所述Fiber2蛋白能够与腺病毒4型Fiber2蛋白抗体特异性反应，与常见的禽病病原NDV、IBDV、IBV、H5、H7和H9亚型AIV阳性血清均无交叉反应。能够用来作为抗原标志物检测禽腺病毒4型抗体。

本发明提供了一种上述方案所述的Fiber2蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Fiber2蛋白的编码基因，利用同源重组方法将所述Fiber2蛋白的编码基因连接至pCold原核表达载体获得表达质粒pCold-Fiber2；

2)将所述表达质粒pCold-Fiber2转入大肠杆菌BL21中获得重组菌株；

3)诱导表达步骤2)中所述的重组菌株获得发酵上清液，使用凝胶柱纯化发酵上清液，获得Fiber2蛋白。

在本发明中，人工合成核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Fiber2蛋白的编码基因；所述编码基因是根据大肠杆菌BL21对密码子的偏爱性，使用Optimizer软件优化后的Fiber2蛋白的编码基因。本发明对所述优化参数和程序没有特殊要求，采用Optimizer软件的常规优化参数和程序即可。

本发明在获得所述编码基因后，利用同源重组方法将所述Fiber2蛋白的编码基因连接至pCold原核表达载体获得表达质粒pCold-Fiber2。本发明对所述同源重组的方法没有特殊限定采用本领域常规的同源重组方法即可。

本发明在获得所述表达质粒pCold-Fiber2后，优选的还包括将所述表达质粒pCold-Fiber2转入大肠杆菌感受态细胞进行扩繁；所述大肠杆菌感受态细胞优选为DH5α感受态细胞；本发明在所述扩繁后优选的收集阳性质粒，将所述阳性质粒转入大肠杆菌BL21获得重组菌株。

本发明在获得重组菌株后，优选的对所述重组菌株进行诱导表达，所述诱导表达的诱导剂优选为0.4mmol/L IPTG；所述诱导表达的温度优选为16℃；所述诱导表达的时间优选为12h。

本发明在所述诱导表达结束后获得发酵上清液，使用凝胶柱纯化所述发酵上清液，获得Fiber2蛋白。本发明中，所述凝胶柱优选为带有His标签的镍柱；本发明中，所述纯化的步骤和参数详见实施例2。

本发明提供了一种基于间接ELISA法检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒，包括以下组成：

包被有上述方案所述Fiber2蛋白的检测板；

血清稀释液；

阳性对照品；

阴性对照品；

底物显色液；

终止液；

山羊抗鸡IgG-HRP二抗；

25倍PBST浓缩液；

封板膜。

本发明提供的试剂盒包括包被有抗原的检测板，所述抗原为上述技术方案所述的Fiber2蛋白。在本发明中，所述蛋白的包被浓度为200ng/孔。本发明对所述包被方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的包被方法即可。所述包被有抗原的检测板进行封闭。所述封闭用封闭液优选为含2％BSA的PBST溶液。

在本发明中，所述试剂盒应在低温冷藏，使用时，优选将所有试剂应恢复至室温，试剂应轻轻旋转或振荡混匀。在本发明中，所述试剂盒的操作方法优选按照如下步骤进行操作：

1.取出反应板，在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置；

2.加入待检血清：待检血清与血清稀释液按照1:50的比例进行稀释(即1μL待检血清加入50μL血清稀释液，混匀，备用)，然后每孔加入经血清稀释液稀释的待检血清100μL(每板同时设置阴性对照和阳性对照各2孔，对照组同样按照上述方法稀释)，使用封板膜封板后微量振荡器或手动方式，震动30秒，放置37℃孵育1小时；

3.小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加入200μL 1×PBST，静置30秒，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍净；

注：1×PBST配置1mL 25倍PBST浓缩液加入24mL超纯水稀释，即为1×PBST。注意：在拍干ELISA板前配制好酶标二抗。

4.加入酶标二抗：使用血清稀释液将HRP酶标二抗按照1:4000的比例进行稀释(即1μL酶标二抗加入1mL血清稀释液，在振荡器上震荡混匀，备用)，然后每孔加入100μL，使用封板膜封板后在微量振荡器或手动方式，震动30秒，37℃孵育30分钟；

5.重复洗涤3次；

注意：在拍干ELISA板前配制好TMB显色液(避光放置)。

6.TMB显色：TMB底物A溶液与TMB底物B溶液按照1:1的比例进行混匀后，每孔加入100μL，置于避光环境中，室温孵育10分钟；

7.终止：每孔加入100μL终止液，终止反应后立即读值；

8.读值：使用酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD，数据读取应在10分钟内完成。

【结果判定】

1.试验结果同时符合下列条件，方为有效：

①两孔阴性对照OD450平均值应＜0.2；

②两孔阳性对照OD450平均值应≥0.6；

2.S/P计算方法

S/P＝﹝(待检血清OD值-阴性对照OD的平均值)/(阳性对照OD的平均值-阴性对照OD的平均值)﹞×100％；

3.按以下方法判定结果：

①阳性：待检血清S/P值≥0.20，即FAdV-4血清为阳性；

②阴性：待检血清S/P值<0.25，即FAdV-4血清为阴性。

在本发明中，所述试剂盒在使用时应注意一下事项：

【注意事项】

1.试剂盒从冷藏环境中取出后，应置室温下平衡至少30分钟后再使用；

2.吸取每个样品后都要更换吸头；

3.加液时均应使用加液器并经常校对其准确性，以减少试验误差；

4.进行大批量样品操作时应注意控制加样时间，应使用八或十二通道微量移液器，从稀释板转移到反应板中，缩短加样时间；尽量避免加样速度缓慢或加样时间过长等情况；

5.封板膜只限一次使用，以避免交叉污染；

6.结果判定必须以酶标仪读数为准，且终止反应后应立即读数，在10分钟内完成；

7.不同批次试剂不能混用；任何液体制剂如出现絮状物或浑浊状态，均不能再继续使用；

8.底物B液中含有TMB成份，对强光和氧化剂敏感，应尽量避光；

9.请严格按照实验操作步骤操作。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Fiber2蛋白的编码基因；所述编码基因是根据大肠杆菌BL21对密码子的偏爱性，使用Optimizer软件优化后的Fiber2蛋白的编码基因。

2)将人工合成的Fiber2蛋白的编码基因和原核表达载体pCold使用HindⅢ和XbaⅠ双酶切，将得到的Fiber2蛋白编码基因片段和载体酶切片段采用同源重组方法进行连接，得到连接产物；

3)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，在获得阳性质粒后，将其转化BL21感受态细胞进行诱导表达，0.4mmol/L的IPTG 16℃中诱导12h，得到未纯化的Fiber2蛋白。

实施例2

将实施例1得到的重组菌液按照1:100的体积比接种于5mL LB溶液(含有氨苄霉素)中，在37℃，220rpm条件下培养12h后，全部接种于500mL LB溶液(含有氨苄霉素)中，在37℃，220rpm条件下培养至吸光值达到0.4～0.6，然后按上述步骤继续培养24h后，以8000rpm的转速离心5min，收集菌体。

将菌体用15mLPBS重悬并加入1mmol/L PMSF后超声破碎，离心收集上清，用0.45μm过滤器过滤，收集滤液，将滤液与2mL蛋白纯化镍柱在4℃孵育过夜。次日将孵育的液体自然流出，收集流出液体50μL为挂柱液体(柱子首先用10倍柱体积含20mmol/L咪唑的平衡液(20mmol/L NaH₂PO₄；0.5mol/LNaCl；20mmol/L imidazole；pH7.6)清洗，收集每次洗涤的液体50μL为洗涤液体，然后每次用5mL含50mmol/L咪唑的洗脱液洗脱柱子5～10次，收集每次的洗脱液50μL为洗脱液，将收集的液体用SDS-PAGE胶鉴定，选取洗脱液中纯度好的蛋白洗脱液，用8％的PEG20000浓缩并加入1mmol/L PMSF后储存于-80℃备用。

纯化后的Fiber2蛋白经SDS-PAGE电泳后湿转印至PVDF膜，以1：100稀释抗Fiber2蛋白的兔源多克隆血清，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(1：4000稀释)，进行Western blot分析，具体结果如表1所示。由图2可以看出，纯化的Fiber2蛋白能够与FAdV-4阳性血清结合，而与对照样品(新城疫病毒HN蛋白多克隆抗体)无反应，表明：经以上实验过程，成功纯化出目的蛋白。

实施例3

以实施例2纯化的Fiber2蛋白为包被抗原采用间接ELISA法检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒

【试剂盒组分】

1.已包被抗原的酶标板2块；

2.血清稀释液1瓶(50mL)；

3.阳性对照1管(100μL)；

4.阴性对照1管(100μL)；

5.TMB底物A溶液1瓶(12mL)；

6.TMB底物B溶液1瓶(12mL)；

7.终止液1瓶(25mL)；

8.HRP酶标二抗1管(20μL)；

9.25倍PBST浓缩液1瓶(25mL)；

10.封板膜2张。

【操作步骤】

使用前所有试剂应恢复至室温(25℃左右)，试剂应轻轻旋转或振荡混匀。

1.取出反应板，在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置；

2.加入待检血清：待检血清与血清稀释液按照1:50的比例进行稀释(即1μL待检血清加入50μL血清稀释液，混匀，备用)，然后每孔加入经血清稀释液稀释的待检血清100μL(每板同时设置阴性对照和阳性对照各2孔，对照组同样按照上述方法稀释)，使用封板膜封板后微量振荡器或手动方式，震动30秒，放置37℃孵育1小时；

3.小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加入200μL 1×PBST，静置30秒，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍净；

注：1×PBST配置1mL 25倍PBST浓缩液加入24mL超纯水稀释，即为1×PBST。注意：在拍干ELISA板前配制好酶标二抗。

4.加入酶标二抗：使用血清稀释液将HRP酶标二抗按照1:4000的比例进行稀释(即1μL酶标二抗加入1mL血清稀释液，在振荡器上震荡混匀，备用)，然后每孔加入100μL，使用封板膜封板后在微量振荡器或手动方式，震动30秒，37℃孵育30分钟；

5.重复洗涤3次；

注意：在拍干ELISA板前配制好TMB显色液(避光放置)。

6.TMB显色：TMB底物A溶液与TMB底物B溶液按照1:1的比例进行混匀后，每孔加入100μL，置于避光环境中，室温孵育10分钟；

7.终止：每孔加入100μL终止液，终止反应后立即读值；

8.读值：使用酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD，数据读取应在10分钟内完成。

【结果判定】

1.试验结果同时符合下列条件，方为有效：

①两孔阴性对照OD450平均值应＜0.2；

②两孔阳性对照OD450平均值应≥0.6；

2.S/P计算方法

S/P＝﹝(待检血清OD值-阴性对照OD的平均值)/(阳性对照OD的平均值-阴性对照OD的平均值)﹞×100％；

3.按以下方法判定结果：

①阳性：待检血清S/P值≥0.20，即FAdV-4血清为阳性；

②阴性：待检血清S/P值<0.25，即FAdV-4血清为阴性。

实施例4

交叉反应性试验

采用实施例3的试剂盒及检测方法测定FAdV-4鸡阳性血清、H5、H7和H9亚型AIV阳性血清、ALV、IBV、IBDV、CAV和NDV鸡阳性血清及SPF鸡阴性血清，具体检测结果如图2所示。

由图2可以看出，只有FAdV-4阳性鸡血清S/P值＞0.20，其余血清的S/P值＜0.20，结果表明：本发明提供的以Fiber2蛋白为包被抗原的试剂盒特异性好，无交叉反应。

实施例5

敏感性和特异性试验

将背景清楚的150份FAdV-4鸡阳性血清和150份SPF鸡阴性血清分别50倍稀释，按照实施例3的操作步骤进行试验，具体检测结果如图4所示。

合格标准为：阳性血清P/N值≥0.20应为150个，阴性血清P/N值＜0.25应为150个，利用公式：敏感性＝阳性样品数/阳性样品总数×100％，特异性＝阴性样品数/阴性样品总数×100％，计算敏感性和特异性。

按上述操作步骤进行试验，其中阳性血清P/N值＞0.25，为145个，阴性血清P/N值＜0.25为150个；通过计算发现，该ELISA检测方法的敏感性应为96％，特异性应为100％。

实施例6

重复性试验

为了测定“FAdV-4抗体间接ELISA检测方法”的重复性，用3批试剂盒(181008、181015、181110)分别对随机抽取的50份FAdV阳性血清和50份阴性血清进行检测，测定试剂盒批间重复性，具体检测结果如表1所示。

表1批间可重复性试验阴阳性检测结果

从上表1可以看出，3个不同批次的试剂盒检测随机抽取的FAdV-450份阳性血清的S/P值均大于0.2，50份阴性血清S/P值均小于0.2，批间差异小，批间可重复性很好。

实施例7

临床血清样品检测

采用所建立的间接ELISA方法对山东省和甘肃省鸡场送检的235份血清样品进行FAdV-4抗体检测，初步了解这些省份不同地区鸡群中FAdV-4的感染和流行情况。具体检测结果如图4所示。

由图4可以看出，235份鸡血清样品中共有233份显示为FAdV-4抗体阳性，阳性率为99％。该实验结果表明FAdV-4病在我国广泛流行，同时证明该ELISA检测方法能够灵敏、特异且快速的检测鸡FAdV-4血清抗体的有无，为防控FAdV-4病奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgcgtg caccgaaacg tcgccatagt gaaaatggca aaccggaaac cgaagccggc 60

ccgagtccgg ctccgattaa gcgcgcaaaa cgcatggttc gtgccagcca gctggatctg 120

gtgtatccgt ttgattatgt tgccgatccg gtgggtggcc tgaatccgcc gtttctgggt 180

ggtagtggcc cgctggtgga tcagggcggc cagttaaccc tgaatgttac cgatccgatt 240

attattaaga accgcagcgt tgatctggca catgatccga gtctggatgt taatgcacag 300

ggtcagctgg cagtggcagt ggatccggaa ggcgcactgg atattacccc ggatggtctg 360

gatgtgaaag tggatggcgt gaccgttatg gtgaatgatg attgggaact ggccgtgaaa 420

gttgatccga gcggcggcct ggatagcacc gccggtggtc tgggcgtgag cgttgatgat 480

accctgctgg tggatcaagg tgaactgggt gttcatctga atcagcaggg cccgattacc 540

gccgatagta gcggcattga tctggaaatt aatccgaata tgttcaccgt taataccagt 600

accggcagtg gtgtgctgga actgaatctg aaagcacagg gcggcattca ggcagatagt 660

agtggtgtgg gcgtgagcgt ggatgaaagt ctgcagattg ttaataatac cctggaagtt 720

aaaccggatc cgagcggtcc gctgaccgtg agtgccaatg gcctgggcct gaaatatgat 780

accaataccc tggccgtgac cgcaggcgca ctgaccgtgg tgggtggtgg tagcgttagc 840

accccgattg ccacctttgt gagcggtagc ccgagcctga atacctataa tgcaaccacc 900

gttaatagta gtgcaaatgc ctttagctgc gcatattatc tgcagcagtg gaatattcag 960

ggtctgctgg tgaccagcct gtatctgaaa ctggatagcg ccaccatggg caatcgcccg 1020

ggcgatctga atagcgccaa tgcaaaatgg tttacctttt gggttagcgc ctatctgcag 1080

caatgcaatc cgagcggcat tcaggcgggt accgttagtc cgagtaccgc caccctgacc 1140

gattttgaac cgatggcaaa tcgtagcgtt accagcccgt ggacctatag cgccaatggt 1200

tattatgaac cgagcattgg cgaatttcag gtgtttagtc cggttgtgac cggcgcatgg 1260

aatccgggta atattggcat tcgcgtgctg ccggttccgg ttagcgcaag tggcgaacgc 1320

tataccctgc tgtgttatag tctgcagtgt accaatgcca gcatttttaa tccgaataat 1380

agtggcacca tgattgtggg tccggttctg tatagctgcc cggccgcaag cctgccgtaa 1440

Claims (7)

1.一种Fiber2蛋白，其特征在于，所述Fiber2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.权利要求1所述的Fiber2蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Fiber2蛋白的编码基因，利用同源重组方法将所述Fiber2蛋白的编码基因连接至pCold原核表达载体获得表达质粒pCold-Fiber2；

2)将所述表达质粒pCold-Fiber2转入大肠杆菌BL21中获得重组菌株；

3)诱导表达步骤2)中所述的重组菌株获得发酵上清液，使用凝胶柱纯化所述发酵上清液，获得Fiber2蛋白。

3.一种基于间接ELISA法检测禽腺病毒4型抗体的试剂盒，其特征在于，包括以下组成：

包被有权利要求1所述Fiber2蛋白或权利要求2所述方法制备得到的Fiber2蛋白的检测板。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下组成：

血清稀释液；

阳性对照品；

阴性对照品；

底物显色液；

终止液；

山羊抗鸡IgG-HRP二抗；

25倍PBST浓缩液；

封板膜。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白的包被量为200ng/孔。

6.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，待检血清的稀释浓度为1:50。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述山羊抗鸡IgG-HRP二抗在使用时按照1:4000的比例进行稀释。