CN111122860A - 一种检测肺炎衣原体抗体间接elisa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。终止液为2 M浓硫酸。CP重组抗原的序列为SEQ ID NO.1。通过方阵优化最佳抗原包被浓度和血清稀释度、确定酶标二抗稀释度、确定封闭液种类和封闭时间、抗体孵育时间。本发明用于检测CP抗体具有特异性强、敏感性高、稳定性好和通量高等优点，可以很好的而检测人体血清中CP抗体，对临床诊断具有一定的指导意义。

Description

一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,CP)是一种全球比较常见的社区获得性肺炎的主要病原之一，幼儿和老年人是易感人群，四季均可发病，主要经由飞沫传染。临床上主要以呼吸道症状，咽痛、声嘶、流涕等，也可表现发烧、咳嗽。

CP感染通常是轻度的、自限性的疾病，由于其症状不典型，故常常被忽略或是漏诊。研究表明，CP感染与一些慢性疾病有关，例如，哮喘、中耳炎、结节性红斑、动脉粥样硬化及心内膜炎、冠心病等，CP感染还会导致脑血管和中枢神经系统受损，严重者会危及生命，引起广泛关注。

现阶段CP的检测方法主要有：细胞的分离培养、血清学检测、分子生物学方法和联合检测。

上述检测方法存在的问题有：

第一，CP是一种专性胞内寄生菌，分离培养周期长、成本高；

第二，PCR检测衣原体DNA，其特异性和敏感性高，但是对实验室环境有特殊要求，实验室需要配备高端设备和高级技术人员，而且PCR的假阳性率难以控制，一般实验室难以开展；

第三，血清学的检测方法由于其通量高、成本低、特异性强和灵敏度高等优点，广泛的应用于临床检测和流行病学调查。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，解决现阶段检测成本高、灵敏度有限、特异性差、对检测环境要求高、培养时间长、PCR的假阳性率难以控制等技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明一方面提供一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、 TMB显色液和终止液。

进一步，终止液为2M浓硫酸。

进一步，CP重组抗原的序列为SEQ ID NO.1。

进一步，抗原包被方法是：使用CBS碳酸盐缓冲溶液稀释蛋白质浓度至2μg/mL，100μL/孔，放于4℃包被12-18h。

进一步，稀释液和洗涤液都是含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(10×)，使用去离子水稀释成1×即可直接使用。

进一步，阴性对照血清是临床上诊断未感染肺炎衣原体的人血清。

进一步，阳性对照血清是临床上确诊有肺炎衣原体的人血清。

本发明另一方面还提供使用上述检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法，

步骤一，一抗孵育：取出试剂，待恢复室温后，将阴阳性对照液和待检样品使用血清稀释板稀释所需的稀释倍数，转至抗原板，孵育；

步骤二，二抗孵育：使用PBST洗液洗涤后加入酶标二抗，孵育；

步骤三，显色：洗涤后加入显色液反应；

步骤四，终止：加入终止液，测定其吸光光度值。

本发明的有益效果体现在：

1，本发明提供的一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，通过方阵优化最佳抗原包被浓度和血清稀释度、确定酶标二抗稀释度、确定封闭液种类和封闭时间、抗体孵育时间。本发明用于检测CP抗体具有特异性强、敏感性高、稳定性好和通量高等优点，可以很好的检测人体血清中CP抗体，对临床诊断具有一定的指导意义。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书中所特别指出的方案来实现和获得。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。

图1是HRP标抗的羊抗人二抗最适稀释度的确定。

图2是HRP标抗的羊抗人二抗最适孵育时间的确定。

图3是TMB显色时间的确定。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为对本发明技术方案的限制。

本发明使用本实验室研制的CP抗原作为抗原，经过优化ELISA检测方法，最终确定该抗原可以很好的应用于CP抗体检测。

实验中，以阳性OD₄₅₀值/阴性OD₄₅₀值(P/N)最大时作为最佳反应条件。本实验所用到的酶标板购自CORNING公司，羊抗人IgG和TMB显色液使用的是索莱宝品牌。

本发明一方面提供一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。其中，终止液为2M浓硫酸。稀释液和洗涤液都是含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(10×)，使用时使用去离子水稀释成1×即可直接使用。

其中，CP重组抗原的序列为SEQ ID NO.1。选取反应原性强的蛋白质进行序列分析和密码子优化，最终送至金唯智生物技术有限公司进行基因合成，成功构建重组质粒、转入BL21表达菌诱导表达、纯化、复性和透析，成功制备了CP重组抗原。

抗原包被方法是：使用CBS碳酸盐缓冲溶液稀释蛋白质浓度至2μg/mL，100μL/ 孔，放于4℃包被12-18h。封闭：取出包被ELISA板，弃去包被液，使用PBST(0.05％吐温-20，pH7.4)洗涤5次，3min/次，弃尽洗液后加入2％BSA(pH 7.4的PBS稀释)，200μL/孔，37℃封闭2h。

阴性对照血清是临床上诊断未感染肺炎衣原体的人血清。阳性对照血清是临床上确诊有肺炎衣原体的人血清。

使用检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法，

步骤一，一抗孵育：取出试剂，待恢复室温后，将阴阳性对照液和待检样品使用血清稀释板稀释所需的稀释倍数，转至抗原板，孵育；

步骤二，二抗孵育：使用PBST洗液洗涤后加入酶标二抗，孵育；

步骤三，显色：洗涤后加入显色液反应；

步骤四，终止：加入终止液，测定其吸光光度值。

具体的，一抗孵育：取出ELISA板，弃去封闭，使用PBST洗涤5次，3min/次，加入1：50稀释血清，100μL/孔，37℃孵育1h。

二抗孵育：取出ELISA板，弃去一抗孵育液，使用PBST洗涤5次，3min/次，加入1：10000稀释的HRP标记羊抗人IgG二抗，37℃孵育45min。

显色：取出ELISA板，弃去二抗孵育液，使用PBST洗涤5次，3min/次，加入 TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色10min。

终止：取出酶标板，加入2M的浓硫酸，50μL/孔.

读数：使用酶标仪读取其OD₄₅₀值，并保存。

间接ELISA的条件优化

最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

采用方阵滴定法，用包被液将rCP进行2倍比稀释，终浓度分别为0.5、1、2、4、 8、16μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH 7.4的PBST溶液)洗涤5次，每次3min；每孔加入200μL封闭液(5％脱脂奶粉)于37℃封闭2h；用洗涤液洗涤5次，每次3min；将肺炎衣原体阴性血清和阳性血清用封闭液分别作1：50、1：100、1：200、1：400、1：800倍比稀释，取100μL分别加入各孔中，于37℃孵育1h；用洗涤液洗涤5次，每次3min；将 HRP标记的山羊抗人IgG二抗(1：1 000稀释)加入到各孔中，每孔100μL，37℃孵育1h；用洗涤液洗涤5次，每次3min；最后每孔加入100μL的TMB显色液，于37℃避光显色15min，并向每孔加入50μL的反应终止液，用酶标仪读取在OD₄₅₀波长处的吸光度值。选择阳性血清孔的OD₄₅₀值在1.0左右，阴性血清孔的OD₄₅₀值在0.1左右，且P/N值最大时的抗原浓度和血清稀释度作为最适抗原包被浓度和血清稀释度。

当重组蛋白rCP包被浓度为2μg/mL，血清稀释度为1：50时，阳性血清OD₄₅₀值接近1，阴性血清OD₄₅₀值接近0.1，且P/N值最大。故确定最适抗原包被浓度为2 μg/mL，血清最佳稀释度为1：50(表1)。

表1抗原最适包被浓度及血清最适稀释度的方阵滴定结果(P/N值)

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，分别加入不同的封闭液：1 是1％的BSA、2是2％的BSA、3是1％的FBS、4是5％的脱脂奶粉、5是2％的明胶。封闭后用最适血清稀释度进行反应，洗涤后再加入HRP标记的山羊抗人IgG二抗，最后加入TMB显色并加入终止液。读取OD₄₅₀，比较各组的读值以及P/N值，选择P/N值最大时的封闭液最为最适封闭液。

经2％BSA封闭后的ELISA板洗涤后无颗粒状沉淀物，且相比较P/N值最大，因此将2％BSA作为最佳封闭液(表2)。

表2不同封闭液的OD₄₅₀值

血清最佳反应时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2 h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清，按照37℃条件进行不同时间的孵育：分别为15min、30min、45min、60min和90min，洗涤后再加入HRP标记的山羊抗人IgG二抗，最后加入TMB显色并加入终止液。读取OD₄₅₀，比较各组的读值以及P/N值，选择P/N值最大时的血清反应时间为最适血清反应时间。

当一抗血清在37℃作用60min时P/N值最高，因此确定待检血清最佳作用时间为60min(表3)。

表3不同血清作用时间的OD₄₅₀值

酶标二抗反应浓度及时间的确定

二抗最佳反应浓度的确定：自抗原包被至二抗孵育都使用已经确定的最佳条件进行，将HRP标记的山羊抗人IgG二抗进行1:1 000、1:2 000、1:3 000和1:5 000。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，选择P/N值最大时的稀释倍数作为酶标二抗的最佳反应浓度。

二抗最佳反应时间的确定：从抗原包被至二抗稀释都使用已经确定的最佳反应条件进行，二抗反应时间设定为15min、30min、45min和60min。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，选择P/N值最大时的反应时间作为酶标二抗的最佳反应时间。

显色时间的确定

从抗原包被至加入TMB显色液，都按照最佳条件进行，设置5min、10min、15 min和20min避光显色时间。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，选择P/N值最大时的反应时间作为最佳显色时间。

如图1所示，当HRP标抗的羊抗人二抗的稀释度为1：3 000时，其P/N值最大，因此确定1：3 000为二抗最适稀释度。

如图2所示，当HRP标抗的羊抗鸡二抗的反应时间为45min时，P/N值最大，因此确定当HRP标抗的羊抗鸡二抗的最佳反应时间为45min。

如图3所示，当显色时间为10min时，P/N值最大，故最佳显色时间是10min。

临界值(Cut-off值)的确定

选取30份CP抗体阴性的人血清，参照实施例1中的2.间接ELISA步骤进行 ELISA检测，计算平均值(X)和标准差(S)，即当检测血清的OD₄₅₀≥X+3S时，为 CP抗体阳性；当OD₄₅₀≤X+2S时，为阴性；当X+2S<OD₄₅₀<X+3S时，该血清为可疑样本，复检，结果仍在可疑区间，则判定为阳性。

结果显示，30份血清的平均OD₄₅₀为0.187，标准差为0.047。根据试验结果，血清样品的OD₄₅₀≥0.328时判为阳性；OD₄₅₀≤0.281时判为阴性；0.281<OD₄₅₀<0.328时，判为可疑。复检，结果仍在可疑区间，则判定为阳性。

实施例2间接ELISA诊断试剂盒的符合性试验

分别采用本研究建立的方法和商品化的CP抗体检测ELISA试剂盒对200份的临床人血清进行ELISA检测，最终商品化试剂盒阳性检出20份，本研究阳性检出率22 份，总体符合率是77％。故本发明能够很好的用于CP抗体的检测。

表4 200份人血清的符合性实验

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京拂晓生物科技有限公司

<120> 一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1593

<212> DNA

<213> 1

<400> SEQUENCE NO.1

atgcagggca ttatgaccgt tcgcagcgaa gaaggcgaaa aagaaattag ccgcctgcag 60

gatctgatta gcctgcagca gcagaccgtt caggatctgc gcagccgcat tgatgatgaa 120

cagaaacgct gctggaccgc gctgcagcgc attaaccaga gccagaaaga tattcagcgc 180

gcgcatgatc gcgaagcgag ccagcgcgcg tgcgaaggca ccgaaatgga ttgcgcggaa 240

cgccagcagc tggaaaaaga tctgcgccgc cagctgaaaa gcatgcagga atggattgaa 300

atgcgcggca ccattcatca gcaggaaaaa gcgtggcgca aacagaacgc gaaactggaa 360

cgcctgcagg aagatctgcg cctgaccggc attgcgtttg atgaacagag cctgttttat 420

cgcgaatata aagaaaaata tctgagccag aaactggata tgcagaaaat tctgcaggaa 480

gttaacgcgg aaaaaagcga aaaagcgtgc ctggaaagcc tggttcatga ttatgaaaaa 540

cagctggaac agaaagatgc gaacctgaaa aaagcggcgg cggtttggga agaagaactg 600

ggcaaacagc agcaggaaga ttatgaacag acccaggaaa ttcgccgcct gagcaccttt 660

attctggaat atcaggatag cctgcgcgaa gcggaaaaag ttgaaaaaga ttttcaggaa 720

ctgcagcagc gctatagccg cctgcaggaa gaaaaacagg ttaaagaaaa aattctggaa 780

gaaagcatga accattttgc ggatctgttt gaaaaaggca gcggcagcgg cagcaaagtt 840

ctggcggttg ttctgaccat tattgcgctg attgcgattg cggttctgat tgcgtgcatt 900

attgcggcgt gcggcggctt tccgctgctg ctgagcgcgc tgaacctgta taccattggc 960

gcgtgcgtta gcctgccgat tattgcgagc accagcgttg cgctgatttg cctgtgcacc 1020

tttgttgcga acagcctgat taaaccggtt attaccgttc gcaccacccg cggcagcggc 1080

agcggcagcc cgaactatgg ctgggaagat agctgcaaca cctgccatca tacccgccgc 1140

aaaaaaccga gcagctttgg ctttgttccg ctgtataccg aagaagattt taacccgaac 1200

tttacctttg gcgaatatga tagcaaagaa gaaaaacagt ataaaagcag ccaggttgcg 1260

gcgtttcgca acattacctt tgcgaccgat agctatacca ttaaaggcga agaaaacctg 1320

gcgattctga ccaacctggt tcattatatg aaaaaaaacc cgaaagcgac cctgtatatt 1380

gaaggccata ccgatgaacg cggcgcggcg agctataacc tggcgctggg cgcgcgccgc 1440

gcgaacgcga ttaaagaaca tctgcgcaaa cagggcatta gcgcggatcg cctgagcacc 1500

attagctatg gcaaagaaca tccgctgaac agcggccata acgaactggc gtggcagcag 1560

aaccgccgca ccgaatttaa aattcatgcg cgc 1593

Claims (8)

1.一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。

2.如权利要求1所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，终止液为2 M浓硫酸。

3.如权利要求1所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，CP重组抗原的序列为SEQ ID NO.1。

4.如权利要求3所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，抗原包被方法是：使用CBS碳酸盐缓冲溶液稀释蛋白质浓度至2 µg/mL，100 µL/孔，放于4 ℃包被 12-18 h。

5.如权利要求4所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，稀释液和洗涤液都是含有Tween-20的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，阴性对照血清是临床上诊断未感染肺炎衣原体的人血清。

7.如权利要求1所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，阳性对照血清是临床上确诊有肺炎衣原体的人血清。

8.使用如权利要求1-7任一项所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，

步骤一，一抗孵育：取出试剂，待恢复室温后，将阴阳性对照液和待检样品使用血清稀释板稀释所需的稀释倍数，转至抗原板，孵育；

步骤二，二抗孵育：使用PBST洗液洗涤后加入酶标二抗，孵育；

步骤三，显色：洗涤后加入显色液反应；

步骤四，终止：加入终止液，测定其吸光光度值。

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