CN111273005B

CN111273005B - 一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111273005B
Application number: CN202010160678.1A
Authority: CN
Inventors: 刘晶; 凌慧芳; 王先梅; 刘群
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111273005A

Abstract

本发明公开了一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法。本发明提供的检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒包括如下：抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；所述TgGRA54蛋白为如下a或b或c：a)序列表中序列2所示的蛋白质；b)序列表中序列2第35‑416位氨基酸所示的蛋白质；c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。本发明采用TgGRA54蛋白可用于临床上大批量弓形虫病的诊断，用其作为抗原制备间接酶联免疫试剂盒，其检测效果好，快速简便，特异性好。

Description

一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法。

背景技术

弓形虫在世界范围内分布广泛，是一种属于顶复亚门孢子虫纲真球虫目的专性胞内原虫，引起的弓形虫病是危害人畜健康和经济发展的人兽共患病之一。弓形虫宿主种类十分广泛，几乎能感染所有的温血动物和部分冷血动物。我国饲养的动物和宠物中，都存在一定的感染率。其中，动物弓形虫感染中最常见的是猪，感染率为7.19％-75.95％，多数省份感染率在20％-40％，地区之间感染率差异较大。我国牛弓形虫感染率为0％-52.50％，山羊弓形虫感染率为1.4％-29.86％，可引起羊只流产或产弱羔及木乃伊胎。牛羊肉是中国人消费的主要肉品之一，因此，在牛和羊等牲畜的检疫工作中，准确的检疫和科学的处理可大大减少因弓形虫病造成的人畜健康问题和经济损失。

弓形虫的感染没有明显的临床症状，仅依靠发病症状的诊断并不可靠。目前诊断弓形虫病的方法主要有病原学检测、分子生物学检测和血清学检测。病原学诊断方法涉及到对虫株的分离，试验周期长，不适合用于大批量临床样本的检测。分子生物学诊断方法一般依靠特定的核酸序列扩增和其它一些新兴的技术，费用昂贵，不适合在临床上推广。血清学诊断方法具有准确、便捷、快速等优点，目前是临床上常用的诊断方法。其中IFA一般认为是血清学诊断的金标准，ELISA方法相较于其它试验检测弓形虫IgG抗体的敏感性和特异性较高，而且易于商品化和自动化，适合弓形虫IgG抗体筛查，因此受到广泛关注。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括如下：

1)、抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；

所述TgGRA54蛋白为如下a或b或c：

a)序列表中序列2所示的蛋白质；

b)序列表中序列2第35-416位氨基酸所示的蛋白质；

c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。

上述试剂盒中，所述抗原TgGRA54蛋白或所述抗原TgGRA54蛋白溶液的包被浓度为2.5μg/mL；

或所述包被TgGRA54蛋白的酶标板中每孔TgGRA54蛋白含量为0.25μg。

上述包被液为将抗原TgGRA54蛋白或抗原TgGRA54蛋白溶液稀释为2.5μg/mL的包被浓度的溶液，具体采用Tris-HCl缓冲液。

上述试剂盒，还包括如下：

2)封闭液：体积百分含量为5％的马血清溶液；

3)用于稀释待测样品或血清标准品的稀释液；所述稀释液为封闭液；

4)结合待测样品的酶标二抗，在本发明的实施例中具体为HRP标记兔抗牛IgG抗体；

5)显色液；

6)弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品；

在本发明检测方法中，所述弓形虫阳性牛血清标准品和所述弓形虫阴性牛血清标准品的稀释倍数为1:200。

上述试剂盒中，还包括7)记载判断标准的可读载体；

所述判断标准如下：若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有弓形虫抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有弓形虫抗体；

或，所述试剂盒还包括8)记载下述检测或辅助检测离体待测样品中是否含有弓形虫的方法的可读载体。

本发明另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。

本发明提供的方法，为将上述1)-6)或1-8)所述的物质分别单独包装。

上述抗原TgGRA54蛋白在如下1)-6)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；

2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；

3)制备检测或辅助检测待测样品是否感染或含有弓形虫产品中的应用；

4)检测或辅助检测待测样品是否感染或含有弓形虫产品中的应用；

5)制备诊断或辅助诊断弓形虫病产品中的应用；

6)诊断或辅助诊断弓形虫病产品中的应用。

上述酶联免疫试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；

或，上述酶联免疫试剂盒中的1)-6)所述的物质在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；

或上述酶联免疫试剂盒中的1)-8)所述的物质在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；

本发明还提供检测或辅助检测离体待测样品中是否含有弓形虫的方法，是利用上述的酶联免疫试剂盒检测或辅助检测待测样品中是含有否弓形虫IgG抗体，或用TgGRA54蛋白作为抗原检测或辅助检测待测样品中是含有否弓形虫IgG抗体。

上述方法包括如下步骤：

1)包被：用Tris-HCl缓冲液将抗原TgGRA54蛋白溶液稀释至2.5μg/mL，按照每孔100μL加入酶标板中，包被；

2)封闭：加入5％马血清溶液作为封闭液进行封闭；

3)加待测样品：将待测样品的血清、弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品分别用封闭液进行1:200梯度稀释；反应；

4)加酶标二抗：取结合待测样品的血清的酶标二抗(在本发明的实施例中具体为HRP标记兔抗牛IgG抗体)用封闭液1:10000稀释，加入酶标板孔孵育；

5)显色：将底物显色液加入显色；

6)终止：加入终止液；

7)读数：在酶标仪上读出OD值；

若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有IgG抗体，

若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有IgG抗体。

上述待测样品来源于牲畜或人或其他宠物，上述牲畜具体为牛或羊。

本发明采用TgGRA54蛋白可用于临床上大批量弓形虫病的诊断，用其作为抗原制备间接酶联免疫试剂盒，其检测效果好，快速简便，特异性好。

附图说明

图1为TgGRA54目的基因单克隆PCR扩增结果；M：DNA分子质量标准；1：TgGRA54序列扩增结果。

图2为TgGRA54-His目的蛋白表达情况；M：蛋白标准品；1：未诱导的菌液；2：经IPTG诱导的菌液；3：目的蛋白在上清的表达情况；4：目的蛋白在包涵体的表达情况。

图3为TgGRA54-His目的蛋白上清纯化效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，弓形虫阳性牛血清标准品为经间接免疫荧光抗体试验(抗原为弓形虫、一抗为血清，二抗为FITC标记兔抗牛IgG抗体(美国KPL公司产品))检测为强阳性的血清，且滴度为1：6400；弓形虫阴性牛血清标准品为间接免疫荧光抗体试验(抗原为弓形虫、一抗为血清，二抗为FITC标记兔抗牛IgG抗体)检测为阴性的血清。

实施例1、弓形虫TgGRA54蛋白的表达和纯化

1、弓形虫速殖子的收集

待细胞瓶中的弓形虫大量释放时，用细胞刮将细胞刮落，并用27g针头反复吹打以破碎细胞，使得胞内虫体释放。用5μm滤膜除去培养液中的细胞碎片，将含有新鲜虫体的培养液移至离心管，1900rpm离心8min，弃上清。虫体沉淀用PBS洗两遍，重悬后计数，进行弓形虫RNA的提取。

2、弓形虫RNA的提取

1)收集培养于HFF细胞上的弓形虫速殖子约3-5×10⁷个，离心后弃上清，加入1mLTrizol，重悬并反复吹打至充分溶解，室温作用10min。

2)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s后室温静置3-5min。

3)4℃低温条件下10000g离心20min。离心后将样品置于冰上，小心吸取上清至新的EP管中(注意不要吸到DNA)。

4)加入等体积的预冷后的异丙醇，并将样品置于-20℃作用15min。

5)4℃低温条件下10000g离心20min，弃上清。

6)加入1mL预冷后的75％乙醇，轻轻悬起沉淀，4℃低温条件下10000g离心10min。

7)重复上一步，弃掉上清后，打开EP管盖子，待乙醇挥发完全。

8)加入15μL DEPC水溶解并轻柔吹打管壁及管底。

9)取5μL提取到的RNA进行核酸胶鉴定，判定有无DNA污染；同时利用cDNA反转录试剂盒进行反转录。

10)将反转录的cDNA于-20℃保存。

3、TgGRA54蛋白基因的克隆

以上述弓形虫cDNA为模板，用TgGRA54-His上游引物和TgGRA54-His下游引物进行PCR扩增，得到1186bpPCR扩增产物(图1)。

TgGRA54-His上游引物：AGCAAATGGGTCGCGGATCCCCCTCATCGCTTCGCATTT

TgGRA54-His下游引物：TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGGCGTGGTTCAGTTCATT

上述PCR扩增采用Fastpfu高保真DNA聚合酶，进行PCR反应过程，95℃预变性10min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，34个循环后，72℃终延伸10min。

经过测序，该PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列1所示(下划线为pET-28a载体同源臂)。

将PCR产物进行核酸电泳后，利用胶回收试剂盒回收PCR得到的目的片段，置于-20℃保存。

将上述PCR产物纯化后使用单片段连接试剂盒(购自北京诺唯赞生物技术有限公司)将纯化后的弓形虫目的基因片段与pET-28a骨架(出自Novagen公司)进行单片段连接，37℃作用40min，得到重组载体pET-28a-TgGRA54。

重组载体pET-28a-TgGRA54为将序列1所示的PCR扩增产物同源重组到pET-28a载体的载体，该载体表达出融合TgGRA54蛋白(TgGRA54-His)，该融合TgGRA54的氨基酸序列为序列表序列2，其中，序列2第35-416位氨基酸为TgGRA54蛋白，第1-34位、第417-429位为pET28a骨架上的一些无义氨基酸和His标签蛋白。

将重组载体加入至刚刚解冻的大肠杆菌感受态Trans1-T1，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min，于超净工作台中向其中加入500μL无抗性LB培养基，放入37℃恒温摇床中培养。45min后3000rpm5min离心并弃去上清，留200μL将沉淀重悬起来并均匀涂布至卡那霉素抗性的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中培养14-16h。待平板上长出肉眼可见的菌落后，挑取单克隆，进行菌液PCR鉴定并将阳性菌液送检测序，选择测序正确的克隆，小量提取质粒pET-28a-TgGRA54，置于-20℃保存。

4、TgGRA54-His的诱导表达

将上述pET-28a-TgGRA54阳性质粒转化至原核表达感受态Transetta(购自北京全式金生物技术有限公司)中，得到重组菌Transetta/pET-28a-TgGRA54。

将重组菌Transetta/pET-28a-TgGRA54在500mL含有0.6mM IPTG的LB培养基中37℃诱导培养2h。4℃低温条件下收集菌体。于超声波破碎仪超裂细菌，将裂解物在4℃低温条件下10000rpm离心15min，分离上清液和沉淀，并进行SDS-PAGE电泳。以未诱导培养为对照。

结果如图2所示，该目的蛋白(融合蛋白TgGRA54，也可称为TgGRA54-His)在上清和包涵体中都有表达，大小为50KD。

将上清液用0.45μm的滤器过滤，然后使用镍柱通过亲和层析的方法进行纯化，纯化后的蛋白进行透析和浓缩，得到纯化融合蛋白TgGRA54溶液，其溶剂为蛋白纯化的洗脱液(氯化钠14.61g，Tris base 1.211g，咪唑8.6g，超纯水500mL，pH7.9，于4℃保存备用)。

经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化融合蛋白TgGRA54溶液浓度，为1.1mg/mL。

将纯化融合蛋白TgGRA54溶液进行SDS-PAGE分析，结果见图3，可以看出，得到大小为50KD的纯化融合蛋白TgGRA54(TgGRA54-His)。

实施例2、弓形虫抗体间接酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的制备

一、弓形虫抗体间接酶联免疫检测方法的建立

ELISA试验的最佳抗原抗体工作浓度、包被缓冲液和包被条件、封闭液和封闭条件、血清孵育条件、二抗稀释度和孵育条件的确定、显色时间的确定，都是通过固定其他条件，变动所要确定的条件，最后根据其特异性逐步实现的。

1、抗原和血清最佳工作浓度的确定

1)包被：

根据棋盘滴定法摸索抗原包被浓度与血清稀释倍数。使用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Na₂CO₃ 1.43g，NaHCO₃ 3.066g，溶于1000mL蒸馏水中，用浓HCl/NaOH调节pH至9.6，4℃保存备用)将实施例1制备的纯化融合蛋白TgGRA54溶液稀释至0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，得到稀释蛋白作为抗原，加入96孔酶标板中，每孔加入100μL已稀释的蛋白进行包被。4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗涤3次。

2)封闭：

加入100μL/孔的封闭液(体积百分含量5％马血清溶液，将马血清溶于PBS中)。，在37℃孵育1h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。

3)加一抗：

将弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品分别用封闭液进行1:50、1:100、1:200、1:400四个梯度稀释，与不同稀释度的蛋白组成方阵。稀释后的样品100μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育1h，洗板4次，拍干。

4)加酶标二抗：

取HRP标记兔抗牛IgG抗体(购自北京迈晨科技有限公司)，用封闭液按体积比1:10000倍稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤4次，拍干。

5)显色：

将辣根过氧化物酶底物显色液(购自北京迈晨科技有限公司)按100μL/孔加入酶标板中，室温5min。

6)终止：

加入终止液(2MH₂SO₄)50μL/孔。

7)读数：

以450nm波长测定各种阳性血清标准品的OD值，计算与阴性血清对照OD值的比值(P/N)，选择阳性血清OD450值接近于1，P/N最大的一组数据，作为抗原的最佳包被浓度及血清的最佳稀释倍数。

结果抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL，，血清最佳工作浓度为1:200。

2、包被缓冲液和包被条件的确定

1)包被：

使用不同的包被液将实施例1制备的纯化融合蛋白TgGRA54溶液稀释至2.5μg/mL得到稀释蛋白作为抗原，加入96孔酶标板中，每孔加入100μL已稀释的蛋白进行包被(每孔0.25μg包被蛋白)。不同包被条件下包被，用PBST缓冲液洗涤3次。

上述包被液分别如下：

Tris-HCl缓冲液：称取Tris Base 2.4228g，溶于1000mL蒸馏水中，用浓HCl/NaOH调节pH至7.2，4℃保存备用；

碳酸盐/碳酸氢盐：称取Na₂CO₃ 1.43g，NaHCO₃ 3.066g，溶于1000mL蒸馏水中，用浓HCl/NaOH调节pH至9.6，4℃保存备用；

PBS：称取NaCl 8.0g，K₂HPO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，溶于1000mL蒸馏水中，用浓HCl/NaOH调节pH至7.2，4℃保存备用。

上述包被条件分别为：37℃2h 4℃过夜，37℃1h 4℃过夜，4℃过夜及37℃2h。以棋盘法进行摸索。

2)封闭：与1相同；

3)加一抗：将弓形虫阳性牛血清标准品及弓形虫阴性牛血清标准品进行1:200梯度稀释。

稀释后的样品100μL，加入对应的酶标板中，37℃孵育1h，洗板4次，拍干。

4)加酶标二抗：与1相同；

5)显色：与1相同；

6)终止：与1相同；

7)读数：在酶标仪上读数与1相同；

选择阳性血清OD450值接近于1，P/N最大的一组数据，确定最佳的包被缓冲液和包被条件。

结果最佳的包被缓冲液为Tris-HCl缓冲液，最佳的包被条件为4℃过夜。

3、封闭液和封闭条件的确定

1)包被：

使用Tris-HCl缓冲液将实施例1制备的纯化融合蛋白TgGRA54溶液稀释至2.5μg/mL得到稀释蛋白作为抗原，加入96孔酶标板中，每孔加入100μL已稀释的蛋白进行包被。4℃过夜包被，用PBST缓冲液洗涤3次。

2)封闭：

加入100μL/孔的不同的封闭液，采用不同封闭条件封闭，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。

上述封闭液如下：1％马血清溶液(体积百分含量，溶剂为PBS)、5％马血清溶液(体积百分含量，溶剂为PBS)、DMEM(购自北京迈晨科技有限公司)、1％脱脂乳(质量百分比，溶剂为PBS)、5％脱脂乳(质量百分含量，溶剂为PBS)、2％鸡血清溶液(体积百分比，溶剂为PBS)、PBS(配方同上2)。

封闭时间选择：37℃30min、37℃1h、37℃2h。以棋盘法进行最适封闭液及封闭时间的摸索。

稀释后的样品100μL，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

4)加酶标二抗：与1相同；

5)显色：与1相同；

6)终止：与1相同；

7)读数：在酶标仪上读与1相同；

选择阳性血清OD450值接近于1，P/N最大的一组数据，确定最适封闭液及封闭时间。

结果，最适封闭液为5％马血清溶液，最佳封闭时间为37℃1h。

4、血清孵育条件的确定

1)包被：与3相同；

2)封闭：

加入100μL/孔的5％马血清溶液封闭液，37℃1h封闭，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。

稀释后的样品100μL，加入对应的酶标板中，不同孵育条件，洗板4次，拍干。

不同孵育条件分为4组：第一组：37℃15min孵育；第二组：37℃30min孵育；第三组37℃1h孵育；第四组37℃2h孵育。

4)加酶标二抗：与1相同；

5)显色：与1相同；

6)终止：与1相同；

7)读数：在酶标仪上读与1相同；

选择阳性血清OD450值接近于1，P/N最大的一组数据，确定最适孵育条件。

结果最佳的血清孵育条件为37℃，30min。

5、酶标记二抗稀释度和孵育条件的确定

1)包被：与3相同；

2)封闭：与4相同；

稀释后的样品100μL，加入对应的酶标板中，37℃，30min，洗板4次，拍干。

4)加酶标二抗：

取HRP标记兔抗牛IgG抗体(购自北京迈晨科技有限公司)，作4个梯度稀释，分别为1:2500、1:5000、1:10000、1:20000，100μL/孔，孵育条件设置37℃30min、37℃1h和37℃2h。洗涤4次，拍干。以棋盘法进行摸索。

5)显色：与1相同；

6)终止：与1相同；

7)读数：在酶标仪上读与1相同；

选择阳性血清OD450值接近于1，P/N最大的一组数据，确定最适酶标记二抗稀释度为和最适孵育条件。

最适酶标记二抗稀释度为1:10000，最佳的孵育条件为37℃1h。

6、显色时间的确定

1)包被：与3相同；

2)封闭：与4相同；

3)加一抗：与5相同；

4)加酶标二抗：

取HRP标记兔抗牛IgG抗体(购自北京迈晨科技有限公司)，作1:10000稀释，100μL/孔，孵育条件设置37℃1h。洗涤4次，拍干。

5)显色：将辣根过氧化物酶底物显色液(购自北京迈晨科技有限公司)按100μL/孔加入对应酶标板中，室温分别显色2min、5min、8min、10min。

6)终止：与1相同；

7)读数：在酶标仪上读与1相同；

选择阳性血清OD450值接近于1，P/N最大的一组数据，确定最适的显色时间。

结果最适的显色时间为室温5min。

7、ELISA检测方法临界值的确立

以弓形虫检测金标准(IFAT)为标准，检测在临床上收集到弓形虫阴性奶牛的血清，检测出12份阴性血清。

1)包被

使用Tris-HCl缓冲液包被液将实施例1制备的纯化融合蛋白TgGRA54溶液稀释至2.5μg/mL得到稀释蛋白作为抗原，加入96孔酶标板中，每孔加入100μL已稀释的蛋白进行包被。4℃过夜包被，用PBST缓冲液洗涤3次。

2)封闭：

3)加待测样品：将已确定的12份牛弓形虫阴性血清进行1:200梯度稀释。

4)加酶标二抗：

取HRP标记兔抗牛IgG抗体(购自北京迈晨科技有限公司)，酶标记二抗作1:10000稀释，100μL/孔，孵育条件设置37℃1h。洗涤4次，拍干。

5)显色：

将辣根过氧化物酶底物显色液(购自北京迈晨科技有限公司)按100μL/孔加入酶标板中，室温显色5min。

6)终止：加入终止液(2M H₂SO₄)50μL/孔。

7)读数：

在酶标仪上读出OD450值。每份血清重复2孔。计算出这12份血清OD450值的平均值和标准方差，阴阳性临界值等于

最终确定的阴阳性临界值为：0.306；

判断标准为：待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有弓形虫IgG抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有弓形虫IgG抗体。

8、弓形虫抗体间接酶联免疫检测方法的建立

根据上述各个条件摸索，建立如下最佳弓形虫抗体间接酶联免疫检测方法：

1)包被

2)封闭：

3)加待测样品：将待测样品血清进行1:200梯度稀释。

稀释后的样品100μL，加入对应的酶标板中，每组设置4个重复，37℃，30min，洗板4次，拍干。

以弓形虫阳性牛血清标准品及弓形虫阴性牛血清标准品为阳性对照和阴性对照。

4)加酶标二抗：

5)显色：

6)终止：加入终止液(2M H₂SO₄)50μL/孔。

7)读数：在酶标仪上读出OD450值。

阳性对照OD450值≥0.306，且阴性对照OD450值小于0.306，则检测方法有效。

若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有弓形虫IgG抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有弓形虫IgG抗体。

二、弓形虫抗体间接酶联免疫检测试剂盒的制备

弓形虫抗体间接酶联免疫检测试剂盒包括如下组分：

1)实施例1的TgGRA54蛋白或TgGRA54蛋白溶液(溶剂为Tris-HCl缓冲液)或包被抗原TgGRA54蛋白的酶标板；

2)封闭液；

所述封闭液为体积百分比5％马血清溶液；

3)用于稀释待测样品的稀释液；所述稀释液为封闭液；

4)结合待测样品的酶标二抗；

5)显色液；

6)弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品。

7)记载判断标准的可读载体；所述判断标准如下：若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有弓形虫抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有弓形虫抗体；

8)记载上述一的8的方法的可读载体。

将上述各个组分分别单独包装，制备得到弓形虫抗体间接酶联免疫检测试剂盒。

实施例3、ELISA检测方法的评价

1、特异性试验

方法与实施例2的一的8相同，不同的是，将待测样品替换为牛弓形虫阳性血清(TG+)、牛新孢子虫阳性血清(NC+)、牛新孢子虫阴性血清(NC-)。

结果如表1所示，显示该蛋白建立的ELISA检测方法特异性较好，与新孢子虫无交叉反应。

表1特异性试验结果

2、灵敏度试验

方法与实施例2的一的8相同，不同的是，将待测样本替换为牛弓形虫阳性血清分别作1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600倍比稀释，并设置阴阳性对照(牛弓形虫阳性血清标准品和牛弓形虫阴性血清标准品)。

结果如表2所示，该方法的灵敏度可达到1:6400。

表2灵敏度试验结果

3、重复性试验

1)批内重复

用同一批制备的重组蛋白包被酶标板，选用牛弓形虫阳性血清标准品和牛弓形虫阴性血清标准品各一份，按照实施例2的一的8的方法进行检测。

连续3天对同一样品进行测定，设置板间重复和板内重复，每个样本设置4个重复，比较其OD450值，计算样品OD450在同一天测定中的变异系数和3天内测定的总变异系数。结果如表3。

统计学结果表明，该间接ELISA方法板间重复和板内重复的变异系数(CV％)小于10％，批内重复试验差异不显著(P＞0.05)。证明所建的间接ELISA方法具有良好的可重复性。

表3批内重复试验结果

2)批间重复

分别用3个批次制备的蛋白包被酶标板，用实施例2的一的8的方法做批间重复性试验。设置板间重复和板内重复，每个样本设置4个重复，比较其OD450值，计算样品OD450不同批次蛋白的变异系数。结果如表4。统计学结果表明，该间接ELISA方法板间重复和板内重复的变异系数(CV％)小于10％，批间重复试验差异不显著(P＞0.05)。证明所建的间接ELISA方法具有良好的可重复性。

表4批间重复试验结果

实施例4、ELISA检测方法的应用

将间接免疫荧光抗体试验(金标准，抗原为弓形虫、一抗为血清，二抗为FITC标记兔抗牛IgG抗体(美国KPL公司产品)检测过的70份牛弓形虫阳性血清，用实施例2的一的8方法检测，并设置阴性对照(E12、F12为阴性对照，其余为70份牛弓形虫阳性血清)。

结果如下表5所示：

表5为本发明实施例2的方法检测结果

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.545	0.617	1.009	0.857	0.556	0.782	0.528	0.652	0.358	0.729	0.53	0.737
B	0.770	0.565	0.651	0.740	0.402	0.599	0.497	0.564	0.489	0.583	0.755	0.805
													C	0.558	0.466	0.780	0.900	0.921	0.669	0.565	0.519	0.979	0.581	0.326	0.689
D	0.782	0.704	0.978	0.949	0.852	0.455	0.506	0.337	0.545	0.656	0.913	0.396
													E	0.827	0.556	0.525	0.315	0.496	1.248	0.653	0.637	0.456	0.808	0.652	0.072
F	0.474	1.019	0.559	0.680	0.630	1.120	0.341	0.333	0.671	0.425	0.981	0.052

上述结果表明，该ELISA检测方法的检出符合率100％(70/70)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业大学

<120> 一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1186

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

agcaaatggg tcgcggatcc ccctcatcgc ttcgcatttt gctcgtggcc tggacgatca 60

tctcagatgc agagttgaat cacttcagta gtcaagctcc acttagctgg ccaaggtgtg 120

tcgtcgtgtc cgctgctgac gacgcccaac gtgacagagg cgacacaacg gcagcttcct 180

ctagtagaga tgaagaactg gaggcagcag gacctgccga cgaagcgaaa aaagcagctg 240

gagagaacgc tagagaatgt gctgggactt gcaacgagcc gccggacgga tctgtacatg 300

tgcggtccag tgacggcagc gaatatttgg atgagcaacc gggtgacggg gccgggcaaa 360

tagtagagca gccacgttct gatgaagctg aaggcagcga atcgcaggcc tctgttggtg 420

ggcgatacta cgaacaggag gcttctgacg gcaagcgcca cgacgaagag gagcctcctg 480

acagacgtgg atacgttgaa aaggcagctg tttcagatga tggggatgca gtgcgtccta 540

cagtggtaga aggtgaggac caagagctcc ttctgaagcc cataggaaaa gggaaagctt 600

gtgagcgtgt tattgtctct aggatccgcg atgggggagt gaagcgcggc aagaagatgg 660

gttttaatgc cgttgggata aacatgccaa tgtggagctg ttacgggatg agcgtatccg 720

aagctggaag tggattcccc agggactgga tggcctctct ttcaagaaga aacatcctga 780

acgtcgttaa cgaagaagct ctacttcgaa aggcgaagaa tcgaatcggg attgagctgg 840

cttgggagag tggggaaggt ggcgaaaaac cgtatatgaa gtgtgaagaa ggtgggctgt 900

acgtgccggt gattgtgacc aacgtagagg atcaggaacc ctacagggtc gaactttctc 960

cgaccaagtt ctggtccgcg gcctcatcaa gaacgggtcg tttatatgtg ataccagagc 1020

aggaggcaag tgtcacagag ggtgacaagg aggacgagaa gtctgtgtac attattccaa 1080

tggaggcatt ggaaggtcac gtgtttttgc ctcatgggta tctgaaagga cattactcgg 1140

agatgccaaa tgaactgaac cacgccaagc ttgcggccgc actcga 1186

<210> 2

<211> 429

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Pro Ser Ser Leu Arg Ile Leu Leu Val Ala Trp Thr Ile Ile

35 40 45

Ser Asp Ala Glu Leu Asn His Phe Ser Ser Gln Ala Pro Leu Ser Trp

50 55 60

Pro Arg Cys Val Val Val Ser Ala Ala Asp Asp Ala Gln Arg Asp Arg

65 70 75 80

Gly Asp Thr Thr Ala Ala Ser Ser Ser Arg Asp Glu Glu Leu Glu Ala

85 90 95

Ala Gly Pro Ala Asp Glu Ala Lys Lys Ala Ala Gly Glu Asn Ala Arg

100 105 110

Glu Cys Ala Gly Thr Cys Asn Glu Pro Pro Asp Gly Ser Val His Val

115 120 125

Arg Ser Ser Asp Gly Ser Glu Tyr Leu Asp Glu Gln Pro Gly Asp Gly

130 135 140

Ala Gly Gln Ile Val Glu Gln Pro Arg Ser Asp Glu Ala Glu Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ser Gln Ala Ser Val Gly Gly Arg Tyr Tyr Glu Gln Glu Ala Ser

165 170 175

Asp Gly Lys Arg His Asp Glu Glu Glu Pro Pro Asp Arg Arg Gly Tyr

180 185 190

Val Glu Lys Ala Ala Val Ser Asp Asp Gly Asp Ala Val Arg Pro Thr

195 200 205

Val Val Glu Gly Glu Asp Gln Glu Leu Leu Leu Lys Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Gly Lys Ala Cys Glu Arg Val Ile Val Ser Arg Ile Arg Asp Gly Gly

225 230 235 240

Val Lys Arg Gly Lys Lys Met Gly Phe Asn Ala Val Gly Ile Asn Met

245 250 255

Pro Met Trp Ser Cys Tyr Gly Met Ser Val Ser Glu Ala Gly Ser Gly

260 265 270

Phe Pro Arg Asp Trp Met Ala Ser Leu Ser Arg Arg Asn Ile Leu Asn

275 280 285

Val Val Asn Glu Glu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Lys Asn Arg Ile Gly

290 295 300

Ile Glu Leu Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly Gly Glu Lys Pro Tyr Met

305 310 315 320

Lys Cys Glu Glu Gly Gly Leu Tyr Val Pro Val Ile Val Thr Asn Val

325 330 335

Glu Asp Gln Glu Pro Tyr Arg Val Glu Leu Ser Pro Thr Lys Phe Trp

340 345 350

Ser Ala Ala Ser Ser Arg Thr Gly Arg Leu Tyr Val Ile Pro Glu Gln

355 360 365

Glu Ala Ser Val Thr Glu Gly Asp Lys Glu Asp Glu Lys Ser Val Tyr

370 375 380

Ile Ile Pro Met Glu Ala Leu Glu Gly His Val Phe Leu Pro His Gly

385 390 395 400

Tyr Leu Lys Gly His Tyr Ser Glu Met Pro Asn Glu Leu Asn His Ala

405 410 415

Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

420 425

Claims

1.一种检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒，包括如下组分：

1）、抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；

所述TgGRA54蛋白为如下a或b：

a）序列表中序列2所示的蛋白质；

b）序列表中序列2第35-416位氨基酸所示的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述抗原TgGRA54蛋白或所述抗原TgGRA54蛋白溶液的包被浓度为2.5μg/mL；

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述包被液为Tris-HCl缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下组分：

2）封闭液：体积百分含量为5%的马血清溶液；

3）用于稀释待测样品的血清或血清标准品的稀释液；所述稀释液为封闭液；

4）结合待测样品的酶标二抗；

5）显色液；

6）弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品。

5.根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒还包括7）记载判断标准的可读载体；

或，所述试剂盒还包括8）记载如下方法的可读载体；

所述方法包括如下步骤：

1）包被：用Tris-HCl缓冲液将抗原TgGRA54蛋白溶液稀释至2.5μg/mL，按照每孔100μL加入酶标板中，包被；

2）封闭：加入5%马血清溶液作为封闭液进行封闭；

3）加待测样品：将待测样品的血清、弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品分别用封闭液进行1:200梯度稀释；反应；

4）加酶标二抗：取结合待测样品的血清的酶标二抗用封闭液1:10000稀释，加入酶标板孔孵育；

5）显色：将底物显色液加入显色；

6）终止：加入终止液；

7）读数：在酶标仪上读出OD值；

6.制备权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于：将试剂盒中所述组分分别单独包装。

7.权利要求1中的抗原TgGRA54蛋白在如下1）-3）中至少一种中的应用：

1）制备检测或辅助检测待测样品中是否含有弓形虫IgG抗体产品中的应用；

2）制备检测或辅助检测待测样品是否感染弓形虫产品中的应用；

3）制备诊断或辅助诊断弓形虫病产品中的应用。

8.权利要求1-5中任一所述的酶联免疫试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有弓形虫IgG抗体产品中的应用。