CN114031679A

CN114031679A - 检测用隐孢子虫卵囊壁外壁标记蛋白质及其应用

Info

Publication number: CN114031679A
Application number: CN202111323961.2A
Authority: CN
Inventors: 朱冠; 王东强; 尹继刚; 武晓东; 赵继学; 姜鹏; 王广
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2021-11-10
Publication date: 2022-02-11

Abstract

本发明公开了一种隐孢子虫卵囊壁蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1、2、3或4所示；隐孢子虫特异性多肽，氨基序列为：A‑1：C‑ENIEQESNEANI或A‑2：KITGSHKVFRSSFYSR‑或A‑3：C‑SLSVNEYNAEIVDHE或A‑4：C‑NRAYRIDKYVPRGFT；抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体，它能与隐孢子虫卵囊壁的外表面特异性结合；抗隐孢子虫特异性多肽抗体，它是采用所述的隐孢子虫特异性多肽的蛋白制备的抗体；在检测隐孢子虫的应用。本发明蛋白抗体均证明该蛋白是隐孢子虫卵囊壁外壁蛋白，且荧光信号较强；多肽抗体滴度高，检测效果好，不发生交叉反应，特异性良好。

Description

检测用隐孢子虫卵囊壁外壁标记蛋白质及其应用

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及检测用隐孢子虫卵囊壁外壁标记蛋白质及其应用。

背景技术

隐孢子虫为寄生原虫顶复门（Apicomplexa）下的一个属，包括多个感染人或动物的物种。其中人兽共患的“微小隐孢子虫”（Cryptosporidium parvum）和人体特异的“人隐孢子虫”（Cryptosporidium hominis）是全球范围内造成由隐孢子虫病引起的严重、甚至致死的腹泻的两个主要病原；而微小隐孢子虫亦可感染包括牛、山羊和绵羊等多个经济动物，可造成其幼崽严重腹泻及死亡。隐孢子虫为胃肠道寄生虫，主要通过粪-口途径传播，宿主因摄取被隐孢子虫污染的水或食品等后被感染。其主要寄生于小肠上皮细胞，对宿主造成的症状轻重不一，主要表现为中度至重度腹泻。在免疫功能正常的人群和动物中，隐孢子虫病一般为自限性；但是在免疫力低下的宿主中（如艾滋病患者），是主要的致死原因。隐孢子虫卵囊呈圆形或椭圆形，显微尺寸（如微小隐孢子虫卵囊直径约5微米），主要结构包括卵囊壁和其包裹的4个子孢子，可以在环境中长期存活（图1）。卵囊壁结构特异，可抵抗常规的次氯酸钠消毒，因此隐孢子虫是控制食品（如蔬菜、莓果等）和水样（如饮用水、娱乐用水等）中微小隐孢子虫污染的一大难题。迄今为止尚无针对微小隐孢子虫的特效药物和疫苗，这进一步加大了对微小隐孢子虫防治工作的需求。目前，针对环境中人或动物临床样本中的微小隐孢子虫检测方法主要包括病原学检测，分子生物学检测和免疫学检测卵囊或虫体抗原。其中病原检测可通过显微镜直接观察未染色或标记的卵囊，但该方法费时费力，灵敏度极低，需熟练的技术员操作；现有的分子生物学诊断灵敏度和特异性较高，但对检测仪器要求较高；而免疫学检测方法具有一定的灵敏度和特异性，适用于临床检查和环境样本监测，但需要拥有可特异性标记卵囊外壁的抗体。此外，环境中的虫体卵囊含量通常被高度稀释，部分临床样本的卵囊含量较低，针对这类样本的检测需在使用上述诊断方法前进行卵囊的富集和浓缩（非特异的物理方法：仅通过离心沉淀；通过高密度液体漂浮、结合离心沉淀；特异的免疫学方法：使用偶链了可标记隐孢子虫卵囊外壁的抗体的小颗粒或小磁珠捕获卵囊，再通过离心沉淀或磁性物体沉淀收集颗粒或磁珠）。

目前国内的隐孢子虫的临床检测方法主要靠抗酸染色等方法进行检测卵囊，该方法特异性低，敏感性差。而目前国外有一种荧光抗体标记隐孢子虫卵囊壁的诊断试剂盒，其利用一个具体基因信息不详的卵囊壁蛋白为抗原（仅一个蛋白质）制作的抗体荧光标记卵囊壁，用于显微镜观察检测。该抗体也被用于样本中隐孢子虫卵囊的免疫学富集。基于该抗体的检测试剂盒价格昂贵，不易大规模利用。且国内利用间接免疫荧光（IFA）检测环境水样或临床样本中隐孢子虫的方法处于空白，主要原因是目前领域内仍未发现可用于研发标记卵囊外壁的特异性抗体的、位于隐孢子虫卵囊壁外壁的蛋白质。因此，寻找隐孢子虫卵囊壁外壁的标记蛋白质，据此制备抗卵囊外壁的特异抗体，并建立相关免疫学检测方法和样本富集方法，对水样中隐孢子虫的监测、临床隐孢子虫病的检测和诊断、人与动物隐孢子虫感染的流行病调查、以及人兽共患隐孢子虫的防治研究等具有非常重要的意义。

发明内容

本发明目的是提供检测用隐孢子虫卵囊壁外壁标记蛋白质及其应用。

隐孢子虫卵囊壁蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1、2、3或4所示；

所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白，位于隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面。

隐孢子虫特异性多肽，它的氨基序列为：

A-1：C-ENIEQESNEANI

或A-2：KITGSHKVFRSSFYSR-C

或A-3：C-SLSVNEYNAEIVDHE

或A-4：C-NRAYRIDKYVPRGFT；

抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体，它能与隐孢子虫卵囊壁的外表面特异性结合，所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白为所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白。

抗隐孢子虫特异性多肽抗体，它是采用所述的隐孢子虫特异性多肽的蛋白制备的抗体。

抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体或抗隐孢子虫特异性多肽抗体在检测隐孢子虫的应用；

所述的检测隐孢子虫为检测未破壁的隐孢子虫卵囊。

本发明提供了隐孢子虫卵囊壁蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1、2、3或4所示；所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白，位于隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面。隐孢子虫特异性多肽，它的氨基序列为：A-1：C-ENIEQESNEANI或A-2：KITGSHKVFRSSFYSR-C或A-3：C-SLSVNEYNAEIVDHE或A-4：C-NRAYRIDKYVPRGFT；抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体，它能与隐孢子虫卵囊壁的外表面特异性结合，所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白为所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白。抗隐孢子虫特异性多肽抗体，它是采用所述的隐孢子虫特异性多肽的蛋白制备的抗体。抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体或抗隐孢子虫特异性多肽抗体在检测隐孢子虫的应用；所述的检测隐孢子虫为检测未破壁的隐孢子虫卵囊。本发明蛋白抗体均证明该蛋白是隐孢子虫卵囊壁外壁蛋白，且荧光信号较强；多肽抗体滴度高，检测效果好，不发生交叉反应，特异性良好。

附图说明

图1 隐孢子虫主要结构示意图；

图2为3种重组蛋白证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白；

图3 为4种多肽多克隆抗体效价检测图；

图4 A1多肽抗体通过间接免疫荧光（IFA）证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白；

图5 A1多肽抗体不同滴度检测灵敏度；

图6 不同样本特异性检测图。

具体实施方式

实施例1微小隐孢子虫cgd3_4170蛋白质重组蛋白质的筛选

1、在隐孢子虫的专业网站（http://cryptodb.org/cryptodb/）搜索基因号cgd3_4170，下载其氨基酸序列，序列如SEQ ID N0.1所示；

2、构建原核表达载体

将该蛋白质的氨基酸分成3部分，分别为：N51-C498序列如SEQ ID N0.2所示；N493-C813序列如SEQ ID N0.3所示,N807-C1289序列如SEQ ID N0.4所示（N,C分别表示蛋白质的N端与C端），分别连接在表达载体pET-28a 上，表达重组蛋白质。

实施例2 三段重组蛋白的表达及纯化

1、表达条件的筛选与优化

将成功连接pET-28a载体（His标签）上的菌株划线，挑单菌落于5 mL液体培养基中培养8-10小时。然后将菌液按1:100扩大培养2小时左右，测600 nm的OD值达到0.6左右时，进行诱导表达。加入终浓度为0.1 mmol/ L 的IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）进行诱导，设定三个不同的诱导温度与时长，分别为16℃，12 h；25℃，6 h；37℃，3 h。同时设立不加IPTG的对照组，确定最佳表达条件。

2、His标签重组蛋白质的纯化

1）选择适当的诱导条件诱导蛋白表达之后，收集菌液，4℃，3500 r/min离心10min后，弃掉上清；

2）加入适量的PBS缓冲液充分悬浮沉淀；

3）用20 mL 5 mM的咪唑溶液将沉淀涡旋混匀，加入PMSF（0.5 mmol/L）和TritonX-100（1%）混匀后将离心管置于冰水混合物中，用超声破碎仪将菌体破碎，设定超声参数：工作时间15 min，超声3 s，停止3 s，功率为160 W；

4）将超声后的液体16400 rpm/min，4℃离心30 min，收集上清液；

5）利用His GraviTrap^TM柱子纯化重组蛋白质，待镍柱内的20%乙醇流完之后加入20 mL 5 mM的咪唑溶液平衡柱子。5 mM咪唑流完之后缓慢加入上述裂解菌体上清，孵育2小时左右，然后使其缓慢流经镍柱。随后依次加入20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM咪唑进行洗杂。最后加入500 mM咪唑1 mL，孵育10 min，收集流出液，重复3次。整个过程在4℃进行；

6）将PBS预冷，透析蛋白以去咪唑，透析时间不应少于1 h。透析后测定蛋白浓度，并用SDS-PAGE和Western blot对这3段重组蛋白质进行鉴定。

实施例3 重组蛋白动物免疫及抗体的制备及间接免疫荧光检测

一、实验动物免疫程序

3段重组蛋白免疫新西兰大白兔。首次免疫取300ug/只（重组蛋白）与弗氏完全佐剂等体积乳化，皮内多点注射。首免两周后，取重组蛋白 (150μg/只）与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后加强免疫，共四次。首次免疫前和第四次免疫后14天的血清,采自耳缘静脉血，分离血清，用于后续检测。

二、间接免疫荧光检测

对于环境或临床样本，利用饱和食盐水漂浮或蔗糖漂浮的方法，除去大部分细菌及杂质在进行后续试验，然后按以下步骤进行操作；

（1）处理盖玻片：将盖玻片用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸处理30 min，ddH₂O漂洗一次，室温2 小时风干。

（2）固定样本：将完整卵囊用4%多聚甲醛室温固定30 min，用PBS洗去多余的甲醛。

（3）画圈涂样：用组化笔在已处理盖玻片中央画一小圈，取30 μL子孢子滴在小圈内，室温放置1 小时；

（4）清洗：吸去盖玻片上的液体，用PBS洗3-4次，5 min/次；

（5）一抗：用含3% BSA 的PBS将抗血清1∶50稀释后取50 μL加入盖玻片上，室温孵育 1小时或者4℃ 过夜。（注：对于卵囊壁外壁蛋白的验证：抗体孵育15 分钟，且对样本不做透化处理，能染上荧光，则证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白，如图1）。

（6）二抗：PBS洗涤后，每孔中加入Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (1∶1 000)，37 ℃避光1 h。

（7）染核：PBS洗涤，每孔加入终浓度为1 µg/mL的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，室温避光染核5 min，PBS洗3-4次。

（8）封片：滴一滴抗荧光淬灭剂，用封片液封片后荧光显微镜下观察。

结果如图1所示，上述3组重组蛋白抗体均证明该蛋白是隐孢子虫卵囊壁外壁蛋白，且荧光信号较强，说明该蛋白具有潜在的建立价值。为了更加确切证实其是卵囊壁外壁蛋白以及最大效果的提高检测的灵敏度与特异性，我们对其设计了4段特异性良好的多肽序列进一步佐证。

实施例4 微小隐孢子虫cgd3_4170特异性多肽的筛选

（1）在隐孢子虫的专业网站（http://cryptodb.org/cryptodb/）搜索基因号cgd3_4170，下载其氨基酸序列；

（2）特异性多肽的设计

针对特异性多肽的筛选：将所下载的该基因的氨基酸序列输入网址swissmodel.expasy.org中，预测其空间结构，寻找位于Loop区的10-14个氨基酸的多肽片段。然后利用iedb.org网址，分析其B细胞表位，选择预测值较高的片段。最后利用NCBI进行特异性比对分析，选择特异性较强的片段进行合成。

（3）为了增强多肽与KLH和BSA的偶联效率，在设计多肽的时，有选择的避开含有半胱氨酸的多肽，并在N端或C端没有半胱氨酸的多肽后面人工加上一个半胱氨酸。所设计的多肽序列如表1所示：

实施例5 动物免疫及多克隆抗体的制备及效价测定

一、实验动物免疫程序

多肽偶联成功的peptide-KLH免疫新西兰大白兔。首次免疫取偶联好的多肽(300μg/只）与弗氏完全佐剂等体积乳化，皮内多点注射。两周后将peptide-KLH (150μg/只）与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后作为加强免疫，共四次。首次免疫前和第四次免疫后14天的血清，采自耳缘静脉血，分离血清，用于抗体效价的检测。

二、间接ELISA方法检测血清抗体效价

以偶联的BSA多肽为包被抗原，免疫前的血清作为阴性对照，4次免疫后的血清为一抗，碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗兔IgG (H+L)作为二抗，进行间接ELISA检测。包被抗原终浓度为5μg/mL，血清从1：500开始作倍比稀释用，二抗按1:20000稀释，加入显色液，用酶标仪检测A405值。

（1）包被抗原：用Coating Buffer（pH为9.6的0.05 M碳酸盐缓冲液）稀释已经偶联成功的peptide-BSA 5 µg/mL， 50 µL/每孔，37℃，1小时后，4℃过夜；或者37℃两小时便可进行下一步。

（2）洗板：利用Washing Buffer（0.05% Tween-20，8g NaCl/L ）洗板，利用ELISA洗板机洗板3-4次，每次间隔4 min。

（3）封闭：加入Blocking Buffer（3% BSA 于pH为9.6的0.05 M碳酸盐缓冲液中）100 µL/每孔，37℃孵育1 h。

（4）洗板：同（2）步骤。

（5）孵一抗：使用Tween Buffer（含0.5% BSA和0.05% Tween-20的PBS溶液）稀释抗体，以首次免疫前的血清作为阴性对照，最后一次免疫后的血清作为阳性抗体，免疫前血清作为阴性对照，按1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000稀释倍数稀释抗体，每孔50 µL，37℃孵育1 h。

（6）洗板：同（2）

（7）孵酶标二抗：使用Tween Buffer，1:20000稀释碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG (H+L)作为二抗， 50 µL/每孔，37℃孵育1 h。

（8）洗板：同（2）

（9）显色：利用显色液buffer配制1 mg/mL的显色液（PNPP底物显色），50 µL/每孔，37℃避光显色10-20 min，然后利用酶标仪检测A405读值，以偶联BSA的多肽作为检测包被抗原，以ELISA方法检测使用KLH-多肽免疫的兔血清抗体效价。

结果如图2所示，4只家兔四次免疫后，血清有效滴度达1:32,000，其中A-1多肽抗体滴度高，检测效果更好，所以后续检测均用A-1多肽抗血清。

实施例6 免疫电镜标记验证实验

利用A-1多肽进行免疫电镜标记，进一步验证其为卵囊壁外壁蛋白。

一、电镜样品的制备

（1）脱囊：隐孢子虫卵囊于脱囊液（不完全培养基中含0.75%牛胆酸钠盐），37℃ 孵育1h。

（2）固定：4%多聚甲醛-0.1 %戊二醛室温固定2 h，马来酸盐缓冲液（含0.5 mM 马来酸盐）清洗三次，每次30 min。

（3）块染：将样品与含有0.5 %的醋酸双氧铀的马来酸盐缓冲液在20℃孵育30min，马来酸盐缓冲液清洗三次每次15 min。

（4）凝集：在50 ℃水浴锅中，将固定后的寄生虫用完全溶解的2 %低熔点琼脂糖吹打均匀，室温放置30 min待其充分凝固后，切成～0.5 mm³的小块。

二、样品的脱水及浸透

（1）乙醇梯度脱水：30 %酒精4 ℃脱水30 min；50%酒精4 ℃脱水1 h；70%，80%，90%酒精-20 ℃脱水各1 h；两次100%酒精1 h。

（2）预浸透：无水乙醇：LR-White（2:1）-20℃浸透1 h；无水乙醇：LR-White(1:1)-20℃浸透1 h；无水乙醇：LR-White（1:2）-20℃浸透1 h。

（3）浸透：样品在LR-White中-20℃浸透过夜；样品在LR-White中-20℃浸透24 h；样品在LR-White中-20℃浸透12 h。

（4）聚合：使用 LR-White包埋样品，将样品置于明胶胶囊中，加满LR-White，-15℃紫外聚合24 h。

三、免疫标记

（1）定位及超薄切片：半薄切片1.5 µm厚，选择寄生虫丰富的地方进行超薄切片，超薄切片厚度80 nm，用涂有芳华膜的铜网捞取切片，电镜检查合格后，用涂有芳华膜的镍网捞取切片用于后续金标。

（2）封闭：将镍网倒扣于含有5 %脱脂奶，0.01 % TWEEN 20的PBS上（PBS-MT），室温孵育1 h。

（3）一抗：将抗体稀释于PBS-MT中，4℃过夜，PBS清洗2 min×8次。

（4）二抗：将Goat anti-Rabbit IgG（10 nm Gold）1:50稀释于PBS-MT中，37 ℃ 孵育1 h，PBS清洗1 min×4次,去离子水清洗1 min×4次。

（5）后固定：2%戊二醛四度固定10 min，去离子水清洗1 min×4次。

（6）染色：将镍网插入2 %醋酸双氧铀中染色15 min，去离子水清洗2 min×8次。

实施例6 间接免疫荧光检测样本

（1）处理盖玻片：将盖玻片用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸处理30 min，ddH2O漂洗一次，室温2 小时风干。

（4）清洗：吸去盖玻片上的液体，用PBS洗3-4次，5 min/次；

（5）一抗：用含3% BSA（牛血清白蛋白）的PBS将1μL抗A-1多肽血清1∶50稀释后，取50 μL加入盖玻片上，室温孵育 1小时或者4℃ 过夜。（注：对于卵囊壁外壁蛋白的验证：抗体孵育15 分钟，且对样本不做透化处理，能染上荧光，则证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白，如图1）。

结果：如图3所示，多肽A1抗体能够灵敏特异的识别隐孢子虫卵囊壁，且利用A1多肽兔血清抗体具有良好的敏感性，如图4所示，当血清 1：100稀释时荧光强度很亮，随着抗体不断稀释，荧光强度逐渐减弱，当血清稀释比列为 1：10000 时还有微弱的荧光，该实验表明血清抗体灵敏度效果非常好。

环境中样本的检测中，A1多肽抗体只识别隐孢子虫卵囊（微小隐孢子虫和泰泽隐孢子虫），不与其他物种（大肠杆菌，球虫，贾滴虫）发生交叉反应，说明抗体特异性良好。

因此选择该卵囊壁外壁蛋白作为候选抗原，作为诊断试剂检测环境水样或临床样本中隐孢子虫的检测潜力巨大。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 检测用隐孢子虫卵囊壁外壁标记蛋白质及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1289

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

<400> 1

Met Phe Ile Ser Leu Lys Phe Leu Phe Leu Phe Gly Leu Val Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Asn Phe Asn Tyr Tyr Asn Ser Glu Asn Cys Val Lys Ser

20 25 30

Phe Ser Phe Ser Ser Gln Ala His Asn Tyr Asp Ser Lys Ser Pro His

35 40 45

Ile Lys Ser Val Ile Asp Asp Asp Lys Phe Ile Lys Ser Arg Val Asp

50 55 60

Lys Ala Lys Tyr Arg Tyr Ile Lys Leu Lys Asn Gly Leu Lys Ala Phe

65 70 75 80

Leu Val Ser Lys Glu Asp Ala Glu Lys Ser Glu Val Ala Ile Leu Val

85 90 95

Asp Val Gly Phe Leu Tyr Asp Pro Pro Lys Ile Ile Gly Leu Ser Asn

100 105 110

Leu Val Gln Tyr Ser Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Gln Tyr Pro Asn Ile

115 120 125

Asn Glu Phe His Asn Phe Ile Lys Leu Leu Asn Gly Arg Met Tyr Leu

130 135 140

Asp Leu His Glu Lys Ser Thr Val Tyr Ser Phe Thr Ile Gly Thr Glu

145 150 155 160

Tyr Leu Ser Glu Ser Ile Phe Arg Phe Ser Ser Tyr Phe His Ser Pro

165 170 175

Leu Leu Asn Asn Asp Thr Ile Asn Lys Ala Met Leu Thr Ile Phe Ser

180 185 190

Gln Leu Asn Arg Met Lys Arg Asn Glu Phe Trp Ala Lys Arg Glu Ile

195 200 205

Glu Arg Glu Ile Ile Gly Leu Asn Ala Lys Phe Asp Thr Phe Tyr Tyr

210 215 220

Gly Asn Lys Asn Thr Leu Leu Asn Asn Pro His Leu Ser Glu Gly Glu

225 230 235 240

Ile Tyr Glu Lys Val Arg His Tyr Phe Ser Lys Phe Tyr Ser Pro Asn

245 250 255

Asn Met Lys Leu Ala Ile Val Gly Arg Glu Pro Leu Asp Lys Leu Glu

260 265 270

Lys Tyr Val Ile Gln Asn Phe Ala His Ile Lys Ser Asn Gly Phe Asn

275 280 285

Ile Val Arg Ile Asp Asp Ser Tyr Lys Tyr Ile Val Asn Pro Phe Ile

290 295 300

Arg Ile Ser Lys Asn Ile Val Thr Ile Arg Arg Phe Lys Lys Thr Gly

305 310 315 320

Ile Asn Thr Ile Asn Leu Arg Phe Pro Ile Glu Ile Gln Val Val Asn

325 330 335

Trp Lys Arg Ile Pro Thr Met Tyr Ile Lys Tyr Leu Leu Asp Gly Asn

340 345 350

Tyr Lys Gly Ile Leu Arg Lys Tyr Leu Lys Ser Ile Gly Ile Ser Asn

355 360 365

Pro Ile Lys Val Gly Val Val Asn Tyr Glu Gly Phe Ser Thr Leu Asp

370 375 380

Ile Ser Ile Asp Leu Tyr Asn Ser Gln Leu Arg His Ser Trp Asn Leu

385 390 395 400

Val Lys Ala Val Ile Ser Ala Val Lys Tyr Ile Ile Glu Leu Pro Val

405 410 415

Ser Glu Arg Ile Val Glu Glu Ala Lys Asn Val Ala Asp Ile Ile Phe

420 425 430

Asn Tyr Arg Glu Thr Glu Phe Thr Arg Asp Leu Ala Tyr Asn Ile Val

435 440 445

Tyr Lys Ala Ser Lys Tyr Arg Ile Lys Pro Gln Glu Ile Ile Tyr Ala

450 455 460

Asp Glu Val Met Glu Ile Val Asp Ile Ser Phe Ile Lys Ala Phe Ile

465 470 475 480

Ser Ser Ile Lys Ile Asp Gln Val Ser Ile Phe Phe Phe Thr Pro Val

485 490 495

Leu Leu Ile Lys Lys Ile Thr Gly Ser His Lys Val Phe Arg Ser Ser

500 505 510

Phe Tyr Ser Arg Gly Phe Asn Val Leu Asn Ser Asn Val Thr Pro Ala

515 520 525

Gly Ile Glu Ser Pro Lys Asn Asn Lys Arg Asp Val Thr Gln Ile Ile

530 535 540

Leu Trp Val Tyr Asn Thr Ile Lys Gln Tyr Leu Ile Lys Ile Leu Thr

545 550 555 560

Phe Ile Phe Gln Lys Glu Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ser Ile Lys Lys

565 570 575

Asp Ile Gly Lys Gly Asn Ser Asp Gln Glu Ser Asp Glu Ile Asn Lys

580 585 590

Glu Asn Ser Phe Val Glu Cys Asn Met Val Tyr Lys Ser Lys Asn Leu

595 600 605

Leu Thr Asp Tyr Cys Val Asn Arg Phe Pro Ser Glu Phe Phe Glu Asp

610 615 620

Ile Tyr Asn Leu Ser Leu Ser Ala Ile Lys Ser Thr Tyr Asn Leu Asp

625 630 635 640

Ile Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Thr Pro Phe Asp Leu Ser Leu Arg Pro

645 650 655

Ser Asp Glu Asp Thr Lys Ile Val Pro Gln Pro Leu Ile Leu Ser Ile

660 665 670

Lys Arg Phe Met Asn Lys Asn Ile Arg Ser Phe Asn Ser Met Glu Asn

675 680 685

Asp Ile Ile Asn Lys Tyr Asn Phe Trp Tyr Glu Ser Asp Ala Ser His

690 695 700

Tyr Ser Asp Leu Asn Gln Lys Gly Ala Leu Ile Asn Lys Leu Tyr Asn

705 710 715 720

Asn Ser Glu Leu Ala Lys Ser Ile Tyr Gln Asn Leu Thr Asp Ile Glu

725 730 735

Thr Thr His Ser Asn Asp Met Leu Lys Asn Ile Val Gly Glu Asn Ile

740 745 750

Glu Gln Glu Ser Asn Glu Ala Asn Ile Lys Arg Phe Asp Phe Tyr Ser

755 760 765

Asn Ile Val Tyr Phe Tyr Tyr Lys Asn Ser Val Lys Gln Ser Tyr Pro

770 775 780

Glu Val Ser Ile Leu Ile Arg Ile Leu Thr Pro Asn Ile Asn Ser Lys

785 790 795 800

Ile Gly Arg His Pro Lys Val Leu Lys Val Leu Pro Arg Leu Val Val

805 810 815

Ala Ile Glu Ile Leu Cys Val Leu Leu Asn Asn Ser Leu Glu Asp Glu

820 825 830

Ile Tyr Asp Phe Arg Ile Ala Arg Asn Glu Phe Lys Ile Ser Ser Phe

835 840 845

Asn Asp Tyr Thr Tyr Asn Gly Leu Pro Asn Gly Phe Glu Ile His Leu

850 855 860

Lys Gly Phe His Asp Val Leu Pro Lys Phe Leu Arg Ile Phe Ala Lys

865 870 875 880

His Leu Ser His Pro Asn Lys Tyr Phe Thr Leu Glu Gln Phe Glu Asp

885 890 895

Ala Phe Lys His Val Asn Arg Tyr Leu Tyr Gln Tyr Val Tyr Phe Thr

900 905 910

Pro Ser Ile Ile Lys Ser Leu Thr Ile Leu Arg Ser Val Thr Glu Asn

915 920 925

Gln Ser Leu Ser Pro Phe Asp Arg Leu Asn Glu Leu Lys Tyr Ile Ser

930 935 940

Tyr Arg Asp Ile Ile Glu Leu Ser Glu Phe Phe Ala Lys Gln Gly Gln

945 950 955 960

Val Glu Gly Leu Phe Met Asn Asn Ile Asp Pro Phe Glu Ala Gly Leu

965 970 975

Val Val Asn Glu Phe Leu Asp Cys Leu Gly Arg Asn Ile Ile Ile Ser

980 985 990

Gly Ile Ile Ser Leu Ser Val Asn Glu Tyr Asn Ala Glu Ile Val Asp

995 1000 1005

His Glu Leu Leu Lys Asn Ala Phe Arg Lys Glu Ser Lys Glu Tyr Ser

1010 1015 1020

Ile Lys Asn Met Leu Val Pro Ile Tyr His Ala Gly Glu Asn Tyr Phe

1025 1030 1035 1040

Asn Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Thr Leu Pro Ile Arg Leu Trp

1045 1050 1055

Lys Ser Tyr Arg Phe Glu Tyr Ser Ser Ile Asp Glu Glu Lys Ser Ile

1060 1065 1070

Ser Ser Leu Ala Leu Phe Ile Gly Thr Lys Thr Pro Phe Thr Ile Ser

1075 1080 1085

Leu Val Thr Leu Leu Ser Ile Ile Leu Ser Asp Leu Ala Ser Lys Phe

1090 1095 1100

Leu Lys Lys Ile Ser Asn Lys Asn Tyr Ser Val Val Val Phe Ser Thr

1105 1110 1115 1120

Ser Tyr Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Ser Val Val Gln Val Glu Ser Tyr

1125 1130 1135

Ser Lys Asp Ile Val Ser Leu Ser Glu Phe Leu Ile Val Phe Ile Lys

1140 1145 1150

Glu Ile Phe Glu Thr Pro Phe Ile Ile Asp Lys Ser Phe Phe Tyr Lys

1155 1160 1165

Val Lys Arg Asp Cys Ile Asn Lys Phe Lys Asn Leu Pro Asn Lys Ile

1170 1175 1180

Glu Leu Phe Ser Asn Leu Phe Phe Thr Phe Ile Glu Gly Thr Asp Phe

1185 1190 1195 1200

Pro Phe Gln Trp Ile Glu Lys Val Ile His Thr Leu Glu Asn Phe Ser

1205 1210 1215

Tyr Asp Arg Phe Ile Lys Ser Ile Lys Phe Leu Asn Lys Ala Pro Gln

1220 1225 1230

Ile Met Ile Ala Ile Gln Ser Lys Ala Ser Asn Arg Ala Tyr Arg Ile

1235 1240 1245

Asp Lys Tyr Val Pro Arg Gly Phe Thr Met Leu Asn Ser Thr Asp Asp

1250 1255 1260

Leu Leu Asn Gln Asp Asn Leu Ser Ile Tyr Lys Leu Pro Ile Ala Ile

1265 1270 1275 1280

Ser Arg Asn Ile Leu Ser Gln Glu Phe

1285

<210> 2

<211> 448

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

<400> 2

Ser Val Ile Asp Asp Asp Lys Phe Ile Lys Ser Arg Val Asp Lys Ala

1 5 10 15

Lys Tyr Arg Tyr Ile Lys Leu Lys Asn Gly Leu Lys Ala Phe Leu Val

20 25 30

Ser Lys Glu Asp Ala Glu Lys Ser Glu Val Ala Ile Leu Val Asp Val

35 40 45

Gly Phe Leu Tyr Asp Pro Pro Lys Ile Ile Gly Leu Ser Asn Leu Val

50 55 60

Gln Tyr Ser Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Gln Tyr Pro Asn Ile Asn Glu

65 70 75 80

Phe His Asn Phe Ile Lys Leu Leu Asn Gly Arg Met Tyr Leu Asp Leu

85 90 95

His Glu Lys Ser Thr Val Tyr Ser Phe Thr Ile Gly Thr Glu Tyr Leu

100 105 110

Ser Glu Ser Ile Phe Arg Phe Ser Ser Tyr Phe His Ser Pro Leu Leu

115 120 125

Asn Asn Asp Thr Ile Asn Lys Ala Met Leu Thr Ile Phe Ser Gln Leu

130 135 140

Asn Arg Met Lys Arg Asn Glu Phe Trp Ala Lys Arg Glu Ile Glu Arg

145 150 155 160

Glu Ile Ile Gly Leu Asn Ala Lys Phe Asp Thr Phe Tyr Tyr Gly Asn

165 170 175

Lys Asn Thr Leu Leu Asn Asn Pro His Leu Ser Glu Gly Glu Ile Tyr

180 185 190

Glu Lys Val Arg His Tyr Phe Ser Lys Phe Tyr Ser Pro Asn Asn Met

195 200 205

Lys Leu Ala Ile Val Gly Arg Glu Pro Leu Asp Lys Leu Glu Lys Tyr

210 215 220

Val Ile Gln Asn Phe Ala His Ile Lys Ser Asn Gly Phe Asn Ile Val

225 230 235 240

Arg Ile Asp Asp Ser Tyr Lys Tyr Ile Val Asn Pro Phe Ile Arg Ile

245 250 255

Ser Lys Asn Ile Val Thr Ile Arg Arg Phe Lys Lys Thr Gly Ile Asn

260 265 270

Thr Ile Asn Leu Arg Phe Pro Ile Glu Ile Gln Val Val Asn Trp Lys

275 280 285

Arg Ile Pro Thr Met Tyr Ile Lys Tyr Leu Leu Asp Gly Asn Tyr Lys

290 295 300

Gly Ile Leu Arg Lys Tyr Leu Lys Ser Ile Gly Ile Ser Asn Pro Ile

305 310 315 320

Lys Val Gly Val Val Asn Tyr Glu Gly Phe Ser Thr Leu Asp Ile Ser

325 330 335

Ile Asp Leu Tyr Asn Ser Gln Leu Arg His Ser Trp Asn Leu Val Lys

340 345 350

Ala Val Ile Ser Ala Val Lys Tyr Ile Ile Glu Leu Pro Val Ser Glu

355 360 365

Arg Ile Val Glu Glu Ala Lys Asn Val Ala Asp Ile Ile Phe Asn Tyr

370 375 380

Arg Glu Thr Glu Phe Thr Arg Asp Leu Ala Tyr Asn Ile Val Tyr Lys

385 390 395 400

Ala Ser Lys Tyr Arg Ile Lys Pro Gln Glu Ile Ile Tyr Ala Asp Glu

405 410 415

Val Met Glu Ile Val Asp Ile Ser Phe Ile Lys Ala Phe Ile Ser Ser

420 425 430

Ile Lys Ile Asp Gln Val Ser Ile Phe Phe Phe Thr Pro Val Leu Leu

435 440 445

<210> 3

<211> 321

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

<400> 3

Phe Thr Pro Val Leu Leu Ile Lys Lys Ile Thr Gly Ser His Lys Val

1 5 10 15

Phe Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Arg Gly Phe Asn Val Leu Asn Ser Asn

20 25 30

Val Thr Pro Ala Gly Ile Glu Ser Pro Lys Asn Asn Lys Arg Asp Val

35 40 45

Thr Gln Ile Ile Leu Trp Val Tyr Asn Thr Ile Lys Gln Tyr Leu Ile

50 55 60

Lys Ile Leu Thr Phe Ile Phe Gln Lys Glu Leu Gln Thr Glu Asp Thr

65 70 75 80

Ser Ile Lys Lys Asp Ile Gly Lys Gly Asn Ser Asp Gln Glu Ser Asp

85 90 95

Glu Ile Asn Lys Glu Asn Ser Phe Val Glu Cys Asn Met Val Tyr Lys

100 105 110

Ser Lys Asn Leu Leu Thr Asp Tyr Cys Val Asn Arg Phe Pro Ser Glu

115 120 125

Phe Phe Glu Asp Ile Tyr Asn Leu Ser Leu Ser Ala Ile Lys Ser Thr

130 135 140

Tyr Asn Leu Asp Ile Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Thr Pro Phe Asp Leu

145 150 155 160

Ser Leu Arg Pro Ser Asp Glu Asp Thr Lys Ile Val Pro Gln Pro Leu

165 170 175

Ile Leu Ser Ile Lys Arg Phe Met Asn Lys Asn Ile Arg Ser Phe Asn

180 185 190

Ser Met Glu Asn Asp Ile Ile Asn Lys Tyr Asn Phe Trp Tyr Glu Ser

195 200 205

Asp Ala Ser His Tyr Ser Asp Leu Asn Gln Lys Gly Ala Leu Ile Asn

210 215 220

Lys Leu Tyr Asn Asn Ser Glu Leu Ala Lys Ser Ile Tyr Gln Asn Leu

225 230 235 240

Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Ser Asn Asp Met Leu Lys Asn Ile Val

245 250 255

Gly Glu Asn Ile Glu Gln Glu Ser Asn Glu Ala Asn Ile Lys Arg Phe

260 265 270

Asp Phe Tyr Ser Asn Ile Val Tyr Phe Tyr Tyr Lys Asn Ser Val Lys

275 280 285

Gln Ser Tyr Pro Glu Val Ser Ile Leu Ile Arg Ile Leu Thr Pro Asn

290 295 300

Ile Asn Ser Lys Ile Gly Arg His Pro Lys Val Leu Lys Val Leu Pro

305 310 315 320

Arg

<210> 4

<211> 395

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

<400> 4

Leu Lys Val Leu Pro Arg Leu Val Val Ala Ile Glu Ile Leu Cys Val

1 5 10 15

Leu Leu Asn Asn Ser Leu Glu Asp Glu Ile Tyr Asp Phe Arg Ile Ala

20 25 30

Arg Asn Glu Phe Lys Ile Ser Ser Phe Asn Asp Tyr Thr Tyr Asn Gly

35 40 45

Leu Pro Asn Gly Phe Glu Ile His Leu Lys Gly Phe His Asp Val Leu

50 55 60

Pro Lys Phe Leu Arg Ile Phe Ala Lys His Leu Ser His Pro Asn Lys

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Leu Glu Gln Phe Glu Asp Ala Phe Lys His Val Asn Arg

85 90 95

Tyr Leu Tyr Gln Tyr Val Tyr Phe Thr Pro Ser Ile Ile Lys Ser Leu

100 105 110

Thr Ile Leu Arg Ser Val Thr Glu Asn Gln Ser Leu Ser Pro Phe Asp

115 120 125

Arg Leu Asn Glu Leu Lys Tyr Ile Ser Tyr Arg Asp Ile Ile Glu Leu

130 135 140

Ser Glu Phe Phe Ala Lys Gln Gly Gln Val Glu Gly Leu Phe Met Asn

145 150 155 160

Asn Ile Asp Pro Phe Glu Ala Gly Leu Val Val Asn Glu Phe Leu Asp

165 170 175

Cys Leu Gly Arg Asn Ile Ile Ile Ser Gly Ile Ile Ser Leu Ser Val

180 185 190

Asn Glu Tyr Asn Ala Glu Ile Val Asp His Glu Leu Leu Lys Asn Ala

195 200 205

Phe Arg Lys Glu Ser Lys Glu Tyr Ser Ile Lys Asn Met Leu Val Pro

210 215 220

Ile Tyr His Ala Gly Glu Asn Tyr Phe Asn Ser Tyr Glu Val Leu Asp

225 230 235 240

Leu Thr Thr Leu Pro Ile Arg Leu Trp Lys Ser Tyr Arg Phe Glu Tyr

245 250 255

Ser Ser Ile Asp Glu Glu Lys Ser Ile Ser Ser Leu Ala Leu Phe Ile

260 265 270

Gly Thr Lys Thr Pro Phe Thr Ile Ser Leu Val Thr Leu Leu Ser Ile

275 280 285

Ile Leu Ser Asp Leu Ala Ser Lys Phe Leu Lys Lys Ile Ser Asn Lys

290 295 300

Asn Tyr Ser Val Val Val Phe Ser Thr Ser Tyr Tyr Ser Thr Leu Thr

305 310 315 320

Phe Ser Val Val Gln Val Glu Ser Tyr Ser Lys Asp Ile Val Ser Leu

325 330 335

Ser Glu Phe Leu Ile Val Phe Ile Lys Glu Ile Phe Glu Thr Pro Phe

340 345 350

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355 360 365

Lys Phe Lys Asn Leu Pro Asn Lys Ile Glu Leu Phe Ser Asn Leu Phe

370 375 380

Phe Thr Phe Ile Glu Gly Thr Asp Phe Pro Phe

385 390 395

Claims

1. 隐孢子虫卵囊壁蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1、2、3或4所示。

2.根据权利要求1所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白，其特征在于：所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白位于隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面。

3.隐孢子虫特异性多肽，它的氨基序列为：

A-1：C-ENIEQESNEANI

或A-2：KITGSHKVFRSSFYSR-C

或A-3：C-SLSVNEYNAEIVDHE

或A-4：C-NRAYRIDKYVPRGFT；

抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体，其特征在于：它能与隐孢子虫卵囊壁的外表面特异性结合，所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白为权利要求1所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白。

4.抗隐孢子虫特异性多肽抗体，其特征在于：它是采用包括权利要求3所述的隐孢子虫特异性多肽的蛋白制备的抗体。

5.抗隐孢子虫卵囊壁蛋白抗体或抗隐孢子虫特异性多肽抗体在检测隐孢子虫的应用。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的检测隐孢子虫为检测未破壁的隐孢子虫卵囊。