CN116143894A - 隐孢子虫cgd2_3320蛋白质作为卵囊壁外壁标记蛋白质的应用 - Google Patents

隐孢子虫cgd2_3320蛋白质作为卵囊壁外壁标记蛋白质的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了隐孢子虫cgd2_3320蛋白质作为卵囊壁外壁标记蛋白质的应用，本发明人经研究发现氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示的隐孢子虫蛋白质，是一种卵囊壁外壁蛋白质，其位于隐孢子虫卵囊壁的外表面，本发明人证实了该蛋白作为检测用抗原的可行性，该蛋白的两段重组蛋白（序列表SEQ ID N0.3，5所示）抗体能用于未破壁隐孢子虫卵囊（活的隐孢子虫卵囊）的免疫学检测，且本发明还提供了该蛋白质一段特异性多肽。

Description

隐孢子虫cgd2_3320蛋白质作为卵囊壁外壁标记蛋白质的 应用
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及检测用隐孢子虫卵囊壁的外壁蛋白及其应用。
背景技术
隐孢子虫为寄生原虫顶复门（Apicomplexa）下的一个属，包括多个感染人或动物的物种。其中人兽共患的“微小隐孢子虫”（Cryptosporidium parvum）和人体特异的“人隐孢子虫”（Cryptosporidium hominis）是全球范围内造成由隐孢子虫病引起的严重、甚至致死的腹泻的两个主要病原；而微小隐孢子虫亦可感染包括牛、山羊和绵羊等多个经济动物，可造成其幼崽严重腹泻及死亡。隐孢子虫为胃肠道寄生虫，主要通过粪-口途径传播，宿主因摄取被隐孢子虫污染的水或食品等后被感染。其主要寄生于小肠上皮细胞，对宿主造成的症状轻重不一，主要表现为中度至重度腹泻。在免疫功能正常的人群和动物中，隐孢子虫病一般为自限性；但是在免疫力低下的宿主中（如艾滋病患者），是主要的致死原因。隐孢子虫卵囊呈圆形或椭圆形，显微尺寸（如微小隐孢子虫卵囊直径约5微米），主要结构包括卵囊壁和其包裹的4个子孢子，可以在环境中长期存活。卵囊壁结构特异，可抵抗常规的次氯酸钠消毒，因此隐孢子虫是控制食品（如蔬菜、莓果等）和水样（如饮用水、娱乐用水等）中微小隐孢子虫污染的一大难题。迄今为止尚无针对微小隐孢子虫的特效药物和疫苗，这进一步加大了对微小隐孢子虫防治工作的需求。目前，针对环境中人或动物临床样本中的微小隐孢子虫检测方法主要包括病原学检测，分子生物学检测和免疫学检测卵囊或虫体抗原。其中病原检测可通过显微镜直接观察未染色或标记的卵囊，但该方法费时费力，灵敏度极低，需熟练的技术员操作；现有的分子生物学诊断灵敏度和特异性较高，但对检测仪器要求较高；而免疫学检测方法具有一定的灵敏度和特异性，适用于临床检查和环境样本监测，但需要拥有可特异性标记卵囊外壁的抗体。此外，环境中的虫体卵囊含量通常被高度稀释，部分临床样本的卵囊含量较低，针对这类样本的检测需在使用上述诊断方法前进行卵囊的富集和浓缩（非特异的物理方法：仅通过离心沉淀；通过高密度液体漂浮、结合离心沉淀；特异的免疫学方法：使用偶链了可标记隐孢子虫卵囊外壁的抗体的小颗粒或小磁珠捕获卵囊，再通过离心沉淀或磁性物体沉淀收集颗粒或磁珠）。
目前国内的隐孢子虫的临床检测方法主要靠抗酸染色等方法进行检测卵囊，该方法特异性低，敏感性差。而目前国外有一种荧光抗体标记隐孢子虫卵囊壁的诊断试剂盒，其利用一个具体基因信息不详的卵囊壁蛋白为抗原（仅一个蛋白质）制作的抗体荧光标记卵囊壁，用于显微镜观察检测。该抗体也被用于样本中隐孢子虫卵囊的免疫学富集。基于该抗体的检测试剂盒价格昂贵，不易大规模利用。且国内利用间接免疫荧光（IFA）检测环境水样或临床样本中隐孢子虫的方法处于空白，主要原因是目前领域内仍未发现可用于研发标记卵囊外壁的特异性抗体的、位于隐孢子虫卵囊壁外壁的蛋白质。因此，寻找隐孢子虫卵囊壁外壁的标记蛋白质，据此制备抗卵囊外壁的特异抗体，并建立相关免疫学检测方法和样本富集方法，对水样中隐孢子虫的监测、临床隐孢子虫病的检测和诊断、人与动物隐孢子虫感染的流行病调查、以及人兽共患隐孢子虫的防治研究等具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，而提供了检测用隐孢子虫cgd2_3320卵囊壁外壁标记蛋白质分子及应用。
隐孢子虫cgd2_3320蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1、3或4所示；
所述的隐孢子虫cgd2_3320蛋白质它位于隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面。
隐孢子虫cgd2_3320蛋白特异性多肽，它的氨基序列为：PSDQKFEDPTC。
抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白抗体，它是采用所述的隐孢子虫cgd2_3320蛋白制备的抗体，能与隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面特异性结合。
抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白外壁特异性多肽抗体，它是采用上述的隐孢子虫卵囊壁蛋白特异性多肽的蛋白制备的抗体。
抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白抗体或抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白外壁特异性多肽抗体在检测隐孢子虫方面的应用；
所述的检测隐孢子虫为未破壁的隐孢子虫卵囊。
本发明提供了隐孢子虫cgd2_3320蛋白质作为卵囊壁外壁标记蛋白质的应用，本发明人经研究发现氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示的隐孢子虫蛋白质，是一种卵囊壁外壁蛋白质，其位于隐孢子虫卵囊壁的外表面，本发明人证实了该蛋白作为检测用抗原的可行性，该蛋白的两段重组蛋白（序列表SEQ ID N0.3，5所示）抗体能用于未破壁隐孢子虫卵囊（活的隐孢子虫卵囊）的免疫学检测，且本发明还提供了该蛋白质一段特异性多肽。
附图说明
图1为cgd2_3320-1，cgd2_3320-2目的片段的扩增；
图2为该蛋白重组蛋白证明该其为卵囊壁外壁蛋白；
图3为特异性多肽抗体效价检测图；
图4特异性多肽抗体通过IFA证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白；
图5特异性多肽抗体通过免疫电镜（IEM）证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白；
图6多肽抗体不同滴度检测灵敏度；
图7不同样本特异性检测图。
具体实施方式
实施例1 微小隐孢子虫基因为cgd2_3320的蛋白质的重组蛋白质表达
一、微小隐孢子虫cgd2_3320蛋白质重组蛋白质的筛选
（1）在隐孢子虫的专业网站（http://cryptodb.org/cryptodb/）搜索基因号cgd2_3320，下载其核苷酸序列（序列如SEQ ID N0.2所示）及氨基酸序列（序列如SEQ ID N0.1所示）；
（2）构建原核表达载体
针对构建的原核表达载体：
将该蛋白质的氨基酸分成2段（序列如SEQ ID N0.3，5所示）分别连接在表达载体pET-28a 上，表达cgd2_3320-1，cgd2_3320-2重组蛋白质。
针对cgd2_3320碱基序列，进行引物设计，利用DNAMAN选择合适的酶切位点，所选的酶切位点为：上游：BamH I （GGATCC）, Xho I (CTCGAG), 并对引物的特异性进行blast比对，设计的引物如表为：
F1: CGCGGATCCTTACCACCAAATTGTATTCATGGC
R1: CCGCTCGAGATATGAATCCCACCATCCTAGAAG
F2: CGCGGATCCAATCCTCAGCATGTTTATGGAAG
R2: CCGCTCGAGTCATAAATATTGAAATACTGACTCATCATG
，上述引物扩增的片段大小分别为456 bp，1344 bp。设计好的引物由吉林省库美生物公司合成。
提取微小隐孢子虫DNA 作为模板，加入上述引物，利用高保真酶（诺唯赞P515-01）进行PCR, 反应体系为：2⨯Phanta Max Master Mix预混液25 µL，上下游引物各2 µL，DNA模板1µL，水20 µL，总体积50 µL；反应程序为：预变性: 95℃ 3 min；变性：95℃，15 s；退火:60℃，30 s；延伸：72℃，60 s；72℃，5 min, 35个循环，PCR产物经核酸电泳鉴定后,利用胶回收试剂盒回收基因片段（见图1），然后测其浓度进行酶切,同时准备好空载体pET-28a。
对目的片段与空载体pET-28a进行双酶切，根据酶的说明书，酶切的体系：1 μg质粒；BamH I,Xho I各1 µL；10×Buffer 2 µL；水加至20 µL。酶切条件：37℃水浴1 h，然后检查酶切效果，胶回收目标片段，然后对其测浓度，根据Solution I (Takara) 说明书将载体与片段连接，（片段与载体的摩尔比为5：1）在16℃水浴中连接30 min，然后转至BL21（condonplus）感受态中，在含卡娜霉素抗性的固体培养基上涂板培养，PCR鉴定并测序，将鉴定正确的表达菌株接种至含K+液体培养基中培养。
二、重组蛋白的表达及纯化
（1）表达条件的筛选与优化
将成功连接pET-28a载体（His标签）上的菌株划线，挑单菌落于5 mL液体培养基中培养8-10h。然后将菌液按1:100扩大培养2h左右，测600 nm的OD值达到0.6左右时，进行诱导表达。加入终浓度为0.1 mmol/ L 的IPTG进行诱导，设定三个不同的诱导温度与时长，分别为16℃，12 h；25℃，6 h；37℃，3 h。同时设立不加IPTG的对照组，确定最佳表达条件。
（2）His标签重组蛋白质的纯化
1）选择适当的诱导条件诱导蛋白表达之后，收集菌液，4℃，3500 r/min离心10min后，弃掉上清。
2）加入适量的PBS缓冲液充分悬浮沉淀。
3）用20 mL 10 mM的咪唑溶液将沉淀涡旋混匀，加入PMSF（0.5 mmol/L）和TritonX-100（1%）混匀后将离心管置于冰水混合物中，用超声破碎仪将菌体破碎，设定超声参数：工作时间15 min，超声3 s，停止3 s，功率为160 W。
4）将超声后的液体16400 rpm/min，4℃离心30 min，收集上清液。
5）利用His GraviTrapTM柱子纯化重组蛋白质，待镍柱内的20%乙醇流完之后加入20 mL 5 mM的咪唑溶液平衡柱子。10 mM咪唑流完之后缓慢加入上述裂解菌体上清，孵育2h左右，然后使其缓慢流经镍柱。随后依次加入20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM咪唑进行洗杂。最后加入500 mM咪唑1 mL，孵育10 min，收集流出液，重复3次。整个过程在4℃进行。
6）将PBS预冷，透析蛋白以去咪唑，透析时间不应少于1 h，获得cgd2_3320-1，cgd2_3320-2重组蛋白。透析后测定蛋白浓度，并用SDS-PAGE和Western blot对该重组蛋白质进行鉴定。
实施例2重组蛋白动物免疫及抗体的制备及间接免疫荧光检测
一、实验动物免疫程序
重组蛋白免疫新西兰大白兔。首次免疫取300 μg/只（重组蛋白）与弗氏完全佐剂等体积乳化，皮内多点注射。首免两周后，取重组蛋白 (150 μg/只）与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后加强免疫，共四次。首次免疫前和第四次免疫后14天的血清, 采自耳缘静脉血，分离血清，用于后续检测。
二、间接免疫荧光检测
对于环境或临床样本，利用饱和食盐水漂浮或蔗糖漂浮的方法，除去大部分细菌及杂质在进行后续试验，然后按以下步骤进行操作；
（1）处理盖玻片：将盖玻片用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸处理30 min，ddH2O漂洗一次，室温2 h风干。
（2）固定样本：将完整微小隐孢子虫卵囊用4%多聚甲醛室温固定30 min，用PBS洗去多余的甲醛。
（3）画圈涂样：用组化笔在已处理盖玻片中央画一小圈，取30μL子孢子滴在小圈内，室温放置1 h；
（4）清洗：吸去盖玻片上的液体，用PBS洗3-4次，5 min/次；
（5）一抗：用含3% BSA 的PBS将抗血清1∶50稀释后取50 μL加入盖玻片上，室温孵育 1h或者4℃ 过夜。（注：对于卵囊壁外壁蛋白的验证：抗体孵育15 min，且对样本不做透化处理，能染上绿色荧光（制备的抗体识别该蛋白），则证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白。
（6）二抗：PBS洗涤后，每孔中加入Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (1∶1 000)，37 ℃避光1 h。
（7）染核：PBS洗涤，每孔加入终浓度为1 µg/mL的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，室温避光染核5 min，PBS洗3-4次。
（8）封片：滴一滴抗荧光淬灭剂封片液（Beyotime, P0126-5 mL），用封片液封片后荧光显微镜下观察。
结果如图2所示，该重组蛋白抗体均证明该蛋白是隐孢子虫卵囊壁外壁蛋白，且荧光信号较强，说明该蛋白具有潜在的建立价值。为了更加确切证实其是卵囊壁外壁蛋白以及最大效果的提高检测的灵敏度与特异性，我们对其设计了1段特异性良好的多肽序列进一步佐证。
实施例3微小隐孢子虫cgd2_3320特异性多肽的筛选
（1）在隐孢子虫的专业网站（http://cryptodb.org/cryptodb/）搜索基因号cgd2_3320，下载其氨基酸序列；
（2）特异性多肽的设计
针对特异性多肽的筛选：
将所下载的该基因的氨基酸序列输入网址swissmodel.expasy.org中，预测其空间结构，寻找位于Loop区的10-14个氨基酸的多肽片段。然后利用iedb.org网址，分析其B细胞表位，选择预测值较高的片段。最后利用NCBI进行特异性比对分析，选择特异性较强的片段进行合成。
（3）为了增强多肽与KLH和BSA的偶联效率，在设计多肽的时，有选择的避开含有半胱氨酸的多肽，并在N端或C端没有半胱氨酸的多肽后面人工加上一个半胱氨酸。所设计的多肽序列为：PSDQKFEDPTC, 该多肽委托上海强耀生物科技有限公司合成。
（4）多肽与KLH/BSA偶联: 首先将1 mg的KLH/BSA溶解于200 µL的ddH2O中，取200µg MBS (m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺) 溶解到0.04 mL的DMF（二甲基甲酰胺）溶液中，加到载体蛋白溶液中，RT混匀2 h，PBS透析过夜。取2 mg多肽溶于0.4 mL的PBS中，再将透析过夜的混合物分别加到2份多肽溶液中，RT作用4 h，透析12 h，20 µL分装后-20℃保存。将上述偶联好的BSA-peptide利用SDS-PAGE进行鉴定。
实施例4动物免疫及多克隆抗体的制备及效价测定
一、实验动物免疫程序
多肽偶联成功的peptide(PSDQKFEDPTC)-KLH免疫新西兰大白兔。首次免疫取偶联好的多肽 (300 μg/只）与弗氏完全佐剂等体积乳化，皮内多点注射。两周后将peptide-KLH(150 μg/只）与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后作为加强免疫，共四次。首次免疫前和第四次免疫后14天的血清, 采自耳缘静脉血，分离血清，用于抗体效价的检测。
二、间接ELISA方法检测血清抗体效价
以偶联的BSA多肽为包被抗原，免疫前的血清作为阴性对照，4次免疫后的血清为一抗，碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗兔IgG (H+L)作为二抗，进行间接ELISA检测。包被抗原终浓度为5 μg/mL，血清从1：500开始作倍比稀释用，二抗按1:20000稀释，加入显色液，用酶标仪检测A405值。
（1）包被抗原：用Coating Buffer（pH为9.6的0.05 M碳酸盐缓冲液）稀释已经偶联成功的peptide-BSA 5 µg/mL， 50 µL/每孔，37℃，1h后，4℃过夜；或者37℃两h便可进行下一步。
（2）洗板：利用Washing Buffer（0.05% Tween-20，8g NaCl/L ）洗板，利用ELISA洗板机洗板3-4次，每次间隔4 min。
（3）封闭：加入Blocking Buffer（3% BSA于pH为9.6的0.05 M碳酸盐缓冲液中）100µL/每孔，37℃孵育1 h。
（4）洗板：同（2）步骤。
（5）孵一抗：使用Tween Buffer（含0.5% BSA和0.05% Tween-20的PBS溶液）稀释抗体，以首次免疫前的血清作为阴性对照，最后一次免疫后的血清作为阳性抗体，免疫前血清作为阴性对照，按1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000稀释倍数稀释抗体，每孔50 µL，37℃孵育1 h。
（6）洗板：同（2）
（7）孵酶标二抗：使用Tween Buffer，1:20000稀释碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)作为二抗， 50 µL/每孔，37℃孵育1 h。
（8）洗板：同（2）
（9）显色：利用显色液buffer配制1 mg/mL的显色液（PNPP底物显色），50µL/每孔，37℃避光显色10-20 min，然后利用酶标仪检测A405读值，以偶联BSA的多肽作为检测包被抗原，以ELISA方法检测使用KLH-多肽免疫的兔血清抗体效价。
结果如图3所示，家兔四次免疫后，血清有效滴度达1:32,000可进行后续试验。
实施例5免疫电镜标记
利用特异性多肽进行免疫电镜标记，进一步验证其为卵囊壁外壁蛋白。
一、电镜样品的制备
（1）脱囊：微小隐孢子虫卵囊于脱囊液（不完全培养基中含0.75%牛胆酸钠盐），37℃孵育1h。
（2）固定：4%多聚甲醛-0.1 %戊二醛室温固定2 h，马来酸盐缓冲液（含0.5 mM马来酸盐）清洗三次，每次30 min。
（3）块染：将样品与含有0.5 %的醋酸双氧铀的马来酸盐缓冲液在20℃孵育30min，马来酸盐缓冲液清洗三次每次15 min。
（4）凝集：在50 ℃水浴锅中，将固定后的寄生虫用完全溶解的2 %低熔点琼脂糖吹打均匀，室温放置30 min待其充分凝固后，切成～0.5 mm3的小块。
二、样品的脱水及浸透
（1）乙醇梯度脱水：30 %酒精4 ℃脱水30 min；50%酒精4 ℃脱水1 h；70%，80%，90%酒精-20 ℃脱水各1 h；两次100%酒精1 h。
（2）预浸透：无水乙醇：LR-White（2:1）-20℃浸透1 h；无水乙醇：LR-White(1:1)-20℃浸透1 h；无水乙醇：LR-White（1:2）-20℃浸透1 h。
（3）浸透：样品在LR-White中-20℃浸透过夜；样品在LR-White中-20℃浸透24 h；样品在LR-White中-20℃浸透12 h。
（4）聚合：使用 LR-White包埋样品，将样品置于明胶胶囊中，加满LR-White，-15℃紫外聚合24 h。
三、免疫标记
（1）定位及超薄切片：半薄切片1.5 µm厚，选择寄生虫丰富的地方进行超薄切片，超薄切片厚度80 nm，用涂有芳华膜的铜网捞取切片，电镜检查合格后，用涂有芳华膜的镍网捞取切片用于后续金标。
（2）封闭：将镍网倒扣于含有5 %脱脂奶，0.01 % TWEEN 20的PBS上（PBS-MT），室温孵育1 h。
（3）一抗：将抗体稀释于PBS-MT中，4℃过夜，PBS清洗2 min×8次。
（4）二抗：将Goat anti-Rabbit IgG（10 nm Gold）1:50稀释于PBS-MT中，37 ℃ 孵育1 h，PBS清洗1 min×4次,去离子水清洗1 min×4次。
（5）后固定：2%戊二醛四度固定10 min，去离子水清洗1 min×4次。
（6）染色：将镍网插入2 %醋酸双氧铀中染色15 min，去离子水清洗2 min×8次。
实施例6间接免疫荧光检测样本
对于环境或临床样本，利用饱和食盐水漂浮或蔗糖漂浮的方法，除去大部分细菌及杂质在进行后续试验，然后按以下步骤进行操作；
（1）处理盖玻片：将盖玻片用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸处理30 min，ddH2O漂洗一次，室温2 h风干。
（2）固定样本：将完整卵囊用4%多聚甲醛室温固定30 min，用PBS洗去多余的甲醛。
（3）画圈涂样：用组化笔在已处理盖玻片中央画一小圈，取30μL子孢子滴在小圈内，室温放置1 h；
（4）清洗：吸去盖玻片上的液体，用PBS洗3-4次，5 min/次；
（5）一抗：用含3% BSA（牛血清白蛋白） 的PBS将1μL抗多肽血清1∶50稀释后，取50μL加入盖玻片上，室温孵育 1h或者4℃ 过夜。（注：对于卵囊壁外壁蛋白的验证：抗体孵育15 min，且对样本不做透化处理，能染上荧光，则证明该蛋白为卵囊壁外壁蛋白）。
（6）二抗：PBS洗涤后，每孔中加入Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (1∶1 000)，37 ℃避光1 h。
（7）染核：PBS洗涤，每孔加入终浓度为1 µg/mL的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，室温避光染核5 min，PBS洗3-4次。
（8）封片：滴一滴抗荧光淬灭剂，用封片液封片后荧光显微镜下观察。
如图4-5所示，特异性多肽抗体能够灵敏特异的识别隐孢子虫卵囊壁，且该多肽兔血清抗体具有良好的敏感性，如图6所示，当血清 1：50稀释时荧光强度很亮，随着抗体不断稀释，荧光强度逐渐减弱，当血清稀释比列为 1：800 时还有微弱的荧光，该实验表明血清抗体灵敏度效果好。
（注：对于卵囊壁外壁蛋白的验证：抗体孵育15 min，且对样本不做透化（tritol,SDS等试剂）处理，即抗体只能识别卵囊壁外壁的蛋白，此时如果该蛋白对应的抗体荧光强度比较明显，说明抗体所识别的蛋白胃卵囊壁外壁蛋白）。
环境中样本的检测中，如图7所示，多肽抗体只识别隐孢子虫卵囊（上图片中微小隐孢子虫和泰泽隐孢子虫），不与其他物种（大肠杆菌，球虫等）发生交叉反应，说明抗体特异性良好。
因此选择该卵囊壁外壁蛋白作为候选抗原，作为诊断试剂检测环境水样或临床样本中隐孢子虫的检测潜力巨大。

Claims (8)

1. 隐孢子虫cgd2_3320蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1、3或5所示。
2.隐孢子虫cgd2_3320蛋白，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2、4或6所示。
3.根据权利要求1所述的隐孢子虫cgd2_3320蛋白质，其特征在于：所述的隐孢子虫cgd2_3320蛋白质它位于隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面。
4.隐孢子虫cgd2_3320蛋白特异性多肽，它的氨基序列为：PSDQKFEDPTC。
5.抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白抗体，其特征在于：它是采用权利要求1所述的隐孢子虫cgd2_3320蛋白制备的抗体，能与隐孢子虫卵囊壁外壁的外表面特异性结合。
6.抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白外壁特异性多肽抗体，它是采用权利要求3所述的隐孢子虫卵囊壁蛋白特异性多肽的蛋白制备的抗体。
7.抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白抗体或抗隐孢子虫cgd2_3320蛋白外壁特异性多肽抗体在检测隐孢子虫方面的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的检测隐孢子虫为未破壁的隐孢子虫卵囊。
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