CN107937349B - 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系，其保藏号为CGMCC No.14316。该细胞系不仅能识别非洲猪瘟的多克隆抗体，而且还能与非洲猪瘟感染猪的阳性血清发生特异性反应。本发明的非洲猪瘟P54抗原的单克隆Vero细胞系可用于稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白，可作为细胞模型或病毒感染模型进行应用，细胞传代稳定性好，生长速度快，培养条件简单，能保证大量供应，对于非洲猪瘟的检测及致病机理研究具有良好的应用前景。

Description

稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备与应用
技术领域
本发明涉及基因工程及免疫技术领域，具体地说，涉及一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备方法与应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种猪的烈性、高度接触性传染病。1921年，肯尼亚首次记录了非洲猪瘟的爆发，目前非洲大陆次撒哈拉地区的大多数非洲国家均有流行。该病于1957年传入欧洲南部地区，1971年传入加勒比海地区和南美洲，2007年传入高加索地区和俄罗斯，现在仍在非洲、南撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯流行。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，在《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中，ASF被列为优先防范的13种重大外来动物疫病之一。目前我国还未发现有该病，但2007年,非洲猪瘟传播至欧亚接壤的高加索地区并很快传至格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆以及俄罗斯地区,且呈现出继续蔓延的趋势，这使得我国对该病的防控形势十分严峻。
ASFV属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，是一种有囊膜的双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。病毒基因组全长为170kb～190kb，整个基因组含有151个ORF，可以编码150-200个蛋白质，可以编码的结构蛋白有54种以上，包括p54、p72、p30等。其中p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜，是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码，分子质量约为25ku，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网处。P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网转化成病毒包膜前体时起十分重要的作用。P54蛋白可分泌到病毒体外，并以二硫键连接的I型膜结合物形式感染细胞，而且感染细胞后在内质网膜处短暂表达，对该基因的转录分析表明，P54基因的转录发生在病毒感染的晚期，是ASFV晚期病毒蛋白。在弱毒攻毒后7～10d即可检测到抗体，用P54蛋白建立的ELISA抗体检测方法，具有很高的敏感性，特异性和稳定性，与OIE全病毒抗原ELISA水平相当，是目前综合评价最好的诊断抗原，已应用于ELISA检测中。
ASF可通过与野猪接触、受污染的猪制品和媒介昆虫传播。除非洲外,该病已经在美洲、欧洲等多个国家发生，尤其2007年以来,与我国紧邻的俄罗斯联邦国家已有发病报道，且多个发病国家集中在欧亚两大洲交界处，所以该病具有传入我国极大的潜在风险。为了维持我国畜牧业健康持续发展，保护国民身体健康以及维护国家利益，开展该病的检测技术研究具有重大意义。
目前，针对该疫病的检测主要有以下几种主要的方法：1)基于主要抗原-抗体的ELISA方法，包括基于P72和P54的ELISA试剂盒，这些试剂盒成本昂贵，且有国外公司设置了专利保护壁垒，国内没有成熟的商品化试剂盒；2)基于病原核酸的检测方法，包括PCR、荧光PCR等，但这些方法存在容易交叉污染的弊端，且需要其它方法辅助进行进一步鉴别；3)基于病毒学的IFA研究方法，该方法是OIE推荐的实验室确诊方法。但该方法有病毒感染过程，操作繁琐耗时长，且涉及生物安全的问题，因此应用范围受限，亟需该方法的替代方法。本发明利用非洲猪瘟的敏感细胞Vero细胞首次建立了非洲猪瘟主要抗原P54的稳定单克隆vero细胞系，可用于非洲猪瘟病毒感染的检测和确诊，而且无需活病毒感染，在普通条件下即可对样品进行确诊，有效缩短了检测时间。建立的稳定单克隆Vero细胞系还能进一步用于非洲猪瘟病毒的致病机理的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系，所述细胞系为P54稳定克隆细胞系，保藏号为CGMCC No.14316。
本发明还提供一种重组慢病毒表达载体pLV-ASFV-P54-AG，所述表达载体可按如下方法构建得到：
(1)以人工合成的非洲猪瘟病毒全长基因序列为模板，利用overlap PCR扩增出P54基因序列与Azami Green基因序列的融合片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收；
(2)用限制性内切酶MluI和NotI双酶切PCR胶回收产物以及慢病毒载体pLV-puro，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并利用T4DNA连接酶连接回收的P54-AG基因片段与pLV-puro载体回收片段，构建重组慢病毒表达载体pLV-ASFV-P54-AG。
其中，步骤(1)中，用于扩增非洲猪瘟病毒P54基因的特异性引物对为：上游引物序列P54-F为：5’-CGACGCGTCGATGGATTCTGAATTTTTTCAAC-3’，下划线处为MluI识别位点；下游引物序列P54-R为：
Figure BDA0001483915870000031
Figure BDA0001483915870000032
斜体部分为P54的基因序列，黑体加粗部分为铰链区序列，未加粗部分为载体phmAG1-MCLinker的基因序列；用于扩增Azami Green基因序列的特异性引物对为：上游引物序列AG-F为：
Figure BDA0001483915870000033
Figure BDA0001483915870000034
斜体部分为P54的基因序列，黑体加粗部分为铰链区序列，未加粗部分为载体phmAG1-MCLinker的基因序列，下游引物序列AG-R为：5’-ATTTGCGGCCGCTTTATTAGTCAGCGGAATTACCGGTCTT-3’，下划线处为NotI识别位点。
其中，步骤(1)中25μL的PCR反应体系包括：10×EasyPfu Buffer反应液2.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，2.5mM dNTPs 2.5μL，模板DNA2μL，双蒸水补充至25μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，进行35个循环；72℃延伸10min。首先分别以引物P54-F和P54-R扩增P54基因序列，以引物AG-F和AG-R扩增载体phmAG1-MCLinker的基因序列，然后将上述两个PCR扩增产物的胶回收产物以体积比1:1混合，用引物P54-F和AG-R进行扩增，即能扩增出P54与Azami Green融合的基因片段。琼脂糖凝胶电泳结果表明，融合片段的大小约为1328bp。PCR产物经胶回收后测定浓度备用。
本发明还提供所述表达载体在制备稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系中的应用。
本发明稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系可按如下方法制备：用所述重组慢病毒表达载体pLV-ASFV-P54-AG与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK293细胞(优选HEK293V)，包装表达P54蛋白的慢病毒，将收获的慢病毒感染Vero细胞，并筛选稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的单克隆Vero细胞系。
前述的方法，用于筛选稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的单克隆Vero细胞系的PCR检测引物为：P54-RT-F2:5’-AAGATCAGCAATGGGCAGAAGT-3’，P54-RT-R2:5’-ACTGTCGTGTAAGGCTCAGTCG-3’。
具体地，制备稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系的方法包括以下步骤：利用基因工程技术获得ASFV P54的基因序列，并融合Azami Green基因后将其克隆至慢病毒载体pLV-puro以构建重组慢病毒载体pLV-ASFV-P54-AG，然后将重组慢病毒载体与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染293V细胞，包装表达P54蛋白的慢病毒。将收获的慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染Vero细胞，采用嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法筛选出两株稳定表达ASFV P54蛋白的单克隆Vero细胞系，并进一步通过Western Blot和细胞免疫荧光试验确定了效果比较好的一株单克隆Vero细胞系，即P54稳定克隆细胞系，命名为Vero-AG-ASFV-P54，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.14316，分类命名为：稳定表达ASFV-P54基因的Vero细胞系，保藏日期2017年8月25日。
本发明利用荧光定量PCR、Western-Blot和间接免疫荧光试验对Vero-AG-ASFV-P54细胞系进行了鉴定。结果表明，该细胞系可稳定表达ASFV P54蛋白，不仅能与ASFV的多克隆抗体发生特异性反应，而且还能识别ASFV感染猪的阳性血清。稳定表达ASFV P54蛋白的单克隆Vero细胞系的成功构建为非洲猪瘟免疫荧光检测方法的建立提供了物质保障。
本发明还提供所述Vero-AG-ASFV-P54细胞系在制备非洲猪瘟病毒诊断用抗原试剂中的应用。
本发明还提供所述Vero-AG-ASFV-P54细胞系在制备非洲猪瘟病毒诊断用阳性血清检测试剂中的应用。
本发明还提供所述Vero-AG-ASFV-P54细胞系在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
本发明还提供所述Vero-AG-ASFV-P54细胞系在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。
本发明还提供所述Vero-AG-ASFV-P54细胞系在表达非洲猪瘟病毒P54蛋白中的应用。将所述稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系在含10％FBS的DMEM培养基中，于37℃5％CO2条件下进行培养、传代至细胞密度达90％，收集细胞，依次经裂解、破碎、离心，收集的上清利用亲和层析柱进行目的蛋白纯化。
本发明进一步提供了利用Vero-AG-ASFV-P54细胞系对ASFV感染猪阳性血清进行检测的间接免疫荧光检测方法。将Vero-AG-ASFV-P54细胞培养至细胞爬片上，用4％多聚甲醛进行固定，5％BSA封闭，PBS洗涤，然后加入待检猪血清；经过一定时间反应后，洗去未结合的血清抗体；以TRITC标记兔抗猪荧光抗体为二抗，DAPI染核，封片后，于激光共聚焦显微镜下观察结果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)本发明提供的稳定表达非洲猪瘟病毒主要抗原P54蛋白的Vero-AG-ASFV-P54细胞不仅能识别非洲猪瘟的多克隆抗体，而且还能与非洲猪瘟感染猪的阳性血清发生反应，与未感染非洲猪瘟的阴性血清不发生反应，具有很强的特异性。
(二)本发明提供的Vero-AG-ASFV-P54细胞传代稳定性好，生长速度快，培养条件简单，能保证大量供应。
(三)本发明针对非洲猪瘟病毒粒子内层囊膜，参与病毒的吸附与进入，可以刺激机体产生具有一定中和能力抗体的P54蛋白构建了其稳定表达的单克隆Vero细胞系，为非洲猪瘟免疫荧光检测方法的建立提供了优选的生物材料。
(四)本发明制备的Vero-AG-ASFV-P54细胞携带Azami绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下可见细胞自发绿色荧光信号，且发出的绿色荧光信号比EGFP发出的绿色荧光信号强1.3倍以上，更易于观察和分析。
附图说明
图1为本发明实施例1中p54基因与Azami绿色荧光蛋白的融合片段电泳图；其中，1为DNA Marker，2为融合片段。
图2为本发明实施例1中Vero-AG-ASFV-P54细胞P54基因的荧光PCR扩增曲线。
图3为本发明实施例1中Vero-AG-ASFV-P54细胞P54基因的荧光PCR的熔解曲线。
图4为本发明实施例1中Vero-AG-ASFV-P54细胞GAPDH基因的荧光PCR扩增曲线。
图5为本发明实施例1中Vero-AG-ASFV-P54细胞GAPDH基因的荧光PCR熔解曲线。
图6为本发明实施例1中P54基因相对表达量。
图7为本发明实施例2中稳定表达ASFV P54基因的Vero细胞的Western Blot鉴定结果。
图8为本发明实施例3中稳定表达ASFV P54基因的Vero细胞(Vero-AG-ASFV-P54)与P54多抗反应的激光共聚焦免疫荧光结果(放大标尺50μm)。其中，绿色荧光为AzamiGreen自发荧光，图中用字母AG表示，蓝色为DAPI染核，图中用字母D表示，红色荧光为荧光二抗，图中用字母R表示。
图9为本发明实施例3中稳定表达ASFV P54基因的Vero细胞(Vero-AG-ASFV-P54)与ASFV感染猪血清反应的激光共聚焦免疫荧光试验结果(放大标尺20μm)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的单克隆Vero细胞系的构建
1、主要仪器
ABI 9700PCR扩增仪，Applied Biosystems公司产品；Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司产品；GE GeneQuan Pro核酸蛋白定量测定仪，General Electric公司产品；三洋MCO-15AC二氧化碳培养箱，SANYO公司产品。Nikon Eclipse Ti-U型倒置荧光显微镜，Nikon公司产品。
2、主要试剂和材料
DMEM(货号SH30022)，FBS(货号SV30087)，Hyclone公司产品；phmAG1-MCLinker(MBL，货号AM-V0039)，购自上海浩然生物技术有限公司；慢病毒载体pLV-puro(货号VL3001)，辅助载体pH1、pH2(货号KLV3501)，PEG慢病毒纯化试剂盒(货号P1202)均购自北京英茂盛业生物科技有限公司；胰蛋白酶(货号0458)，Amresco公司产品；Qiagen PlasmidPlus Maxi Kit质粒提取试剂盒(货号12963)，RNeasy Mini Kit(货号74104)，Qiagen公司产品；MluI(货号1071B)，NotI(货号1166A)限制性内切酶，T4DNA连接酶(货号6022)，TaKaRa公司产品；EasyPfu DNA Polymerase(货号AP211)、TransScript Green Two-Step qRT-PCRSuperMix(货号AQ301-01)，北京全式金生物技术有限公司。
293V细胞和vero细胞，中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所实验室保存。
25cm细胞培养瓶(货号430639)，6孔板(货号3516)，24孔板(货号3524)均采购自Corning。
3、操作步骤
3.1ASFV P54基因与Azami绿色荧光蛋白的扩增
根据GenBank中已公布的ASFV P54基因序列号(GenBank:FN557520.1)人工合成P54全长，然后设计了一对用于P54基因扩增的特异性引物，并在上游引物的5’端引入了限制性内切酶MluI的识别序列。其中，上游引物序列P54-F为：5’-CGACGCGTCGATGGATTCTGAATTTTTTC AAC-3’，下划线处为MluI识别位点；下游引物序列P54-R为：
Figure BDA0001483915870000081
Figure BDA0001483915870000091
(其中斜体部分为P54的基因序列，黑体加粗部分为铰链区序列，未加粗部分为载体phmAG1-MCLinker的基因序列)，预期扩增片段大小为625bp(包括MluI的识别序列和保护性碱基)。
针对phmAG1-MCLinker设计了一对用于Azami Green基因序列扩增的特异性引物，并在下游引物的5’端引入了限制性内切酶NotI识别序列。其中，上游引物序列AG-F为：
Figure BDA0001483915870000092
Figure BDA0001483915870000093
(其中斜体部分为P54的基因序列，黑体加粗部分为铰链区序列，未加粗部分为载体phmAG1-MCLinker的基因序列)，下游引物序列AG-R为：5’-ATTTGCGGCCGCTTTATTAGTCAGCGGAATTACCGGTCTT-3’，(下划线处为NotI识别位点)，预期扩增片段的大小为781bp(包括NotI的识别序列和保护性碱基)。
分别以非洲猪瘟病毒DNA和phmAG1-MCLinker载体为模板，以相应的特异性引物利用PCR技术分别扩增ASFV P54基因序列和Azami Green(AG)基因序列，PCR反应体系均为：10×EasyPfu Buffer反应液2.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，2.5mMdNTPs 2.5μL，模板DNA2μL，双蒸水补充至25μL。反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，进行35个循环，最后再72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，将二者胶回收的PCR产物以体积比1:1混合后，以引物P54-F和AG-R进行PCR扩增实现P54基因和Azami Green基因的融合，预期融合片段的大小为1328bp。其PCR反应体系和反应条件同前。琼脂糖凝胶电泳检测P54-AG融合的PCR产物，结果表明，扩增产物的大小约为1328bp，与预期大小一致(图1)。胶回收1328bp大小的目的条带，并测定浓度。
3.2重组慢病毒载体pLV-ASFV-P54-AG的构建与鉴定
用限制性内切酶MluI、NotI双酶切P54-AG胶回收产物以及慢病毒载体pLV-puro，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并利用T4DNA连接酶连接回收的P54-AG基因片段与pLV-puro载体回收片段构建重组慢病毒载体pLV-ASFV-P54-AG，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经含有氨苄青霉素的LB平板37℃过夜培养后，挑取单个菌落，接种至氨苄青霉素抗性的LB液体培养基5ml中，37℃振荡培养过夜，取pLV-ASFV-p54-AG菌液1ml送北京六合华大基因科技有限公司测序。测序结果表明，ASFV-P54-AG基因序列、插入位置以及阅读框都准确无误。
插入载体的p54-AG基因序列如下：中间黑色加粗碱基序列为铰链区，中间黑色加粗碱基序列的前方序列为P54基因序列，中间黑色加粗碱基序列的后方序列为Azami Green基因序列，用来保证P54和Azami Green两蛋白融合后保持正确的构象。
Figure BDA0001483915870000101
3.3质粒大量提取
取pLV-ASFV-p54-AG的菌液3μl接种至3ml含有氨苄青霉素的LB培养基37℃振荡培养12小时，取培养物1ml接种至30ml含有氨苄青霉素的LB培养基继续培养12-14小时。收集菌体按照Qiagen Plasmid Plus Mini Kit质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。
质粒提取后用紫外分光光度计测量OD260值，计算质粒浓度并用无菌蒸馏水稀释至0.5μg/μl，保存在-20℃备用。
3.4慢病毒包装
(1)在转染前24小时将合适数量的HEK293V细胞接种到90mm培养皿，转染时细胞汇合度为90％-95％。
(2)转染前用新鲜完全培养基替换原有培养基。
(3)将pLV-ASFV-p54-AG慢病毒载体、pH1，pH2共转染293V细胞，包装pLV-ASFV-p54-AG过表达慢病毒。
(4)转染后24小时后换用新鲜完全培养基。
(5)转染后48小时收集细胞培养上清，0.45μm过滤去除细胞碎片。
(6)用PEG慢病毒纯化试剂盒纯化病毒。
3.5慢病毒感染Vero细胞和筛选
(1)感染前一天将Vero细胞铺板到35mm培养皿，使感染时细胞密度为80％左右。
(2)将300μl慢病毒悬液加入1.7ml细胞完全培养基，然后加入聚凝胺至终浓度为6μg/μl。混合均匀，制备为病毒感染液。
(3)用病毒感染液替换原细胞培养基，放入细胞培养箱培养24小时。
(4)第二天换液，继续培养24小时。
(5)加入嘌呤霉素至终浓度为5μg/ml。筛选2周。中间换液或传代后重新添加嘌呤霉素。
(6)1周后细胞不再死亡，将细胞扩大培养后冻存细胞，并检测目的基因表达。
3.6单克隆细胞筛选
(1)消化筛选后的多克隆细胞，吹吸分散为单个细胞。
(2)用有限稀释法将细胞铺到96孔板。培养3-4天。
(3)观察细胞，标记单个细胞克隆且生长良好的孔。
(4)继续培养3天，消化单克隆细胞扩大培养。
(5)待细胞生长到6孔板，冻存细胞，提取细胞总RNA进行Realtime PCR检测目的基因表达。
3.7Realtime PCR检测目的基因表达
(1)收集细胞，提取细胞总RNA。
(2)按照试剂盒说明书进行反转录。
(3)根据P54基因序列设计用于进行荧光PCR检测的引物：P54-RT-F2:5’-AAGATCAGCAATGGGCAGAAGT-3’，P54-RT-R2:5’-ACTGTCGTGTAAGGCTCAGTCG-3’；内参GAPDH的引物为：GAPDH-F：5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，GAPDH-R：5’-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。分别以cDNA为模板，对目的基因和内参基因进行荧光PCR检测。反应体系均为：cDNA模板1μl，上游引物0.8μl，下游引物0.8μl，2×SYBR Buffer 10μl，ddH2O补充至20μl。反应条件：95℃预变性5min，95℃15sec，60℃1min，40个循环。熔解曲线：65℃到95℃，每0.5度保温5sec。
4、试验结果
4.1Realtime PCR检测结果
对挑选的11株稳定细胞株进行Realtime PCR检测，结果显示P54基因在细胞中均有表达，但表达差异较大。P54荧光PCR检测结果见图2，熔解曲线分析结果见图3，GAPDH荧光PCR检测结果见图4，熔解曲线分析结果见图5。对P54与GAPDH的荧光PCR检测结果进行统计分析(表1)，计算P54基因的相对表达量(图6)。通过在这些细胞系中比较P54的mRNA表达水平，选择P54表达量最高的两株细胞即P54-21和P54-24进行后续实验。
表1 Realtime PCR检测结果
Figure BDA0001483915870000131
实施例2利用Vero-AG-ASFV-P54细胞系表达非洲猪瘟病毒P54蛋白
1、主要仪器
Thermo公司的CO2培养箱。
2、主要试剂、耗材和细胞
DMEM(Hyclone，SH30022)，FBS(Hyclone，SV30087)，胰蛋白酶(Amresco，0458)，Sigma公司产品。
细胞裂解液购自Promega公司，货号E1941。
T25细胞培养瓶(货号430168)，6孔板(货号3516)，24孔板(货号3524)均采购自Corning公司。
稳定表达ASFV P54蛋白的Vero细胞(Vero-AG-ASFV-P54-21和Vero-AG-ASFV-P54-24)、稳定表达Azami Green的Vero细胞(Vero-AG)和Vero细胞由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
3、操作步骤
3.1细胞培养：分别将Vero-AG-ASFV-P54、Vero-AG)和Vero细胞复苏后在T25细胞培养瓶中(培养基为含10％FBS的DMEM培养基)，于37℃5％CO2条件下进行培养、传代至细胞密度达到90％。
3.2收集细胞，将细胞悬浮于细胞裂解液中。
3.3将细胞悬浮液置于冰上，超声破碎细胞，至悬浮液完全清亮。
3,4将上述混合液16000rpm离心30分钟，取上清，弃沉淀。利用亲和层析柱Superdex 75(GE公司)，用洗脱液(20mM Tris，50mM NaCl)进行洗脱，收集20-60kD蛋白出峰位置的洗脱液，进行目的蛋白纯化。
3.5测定蛋白浓度，分装蛋白。
4、试验结果
复苏的(Vero-AG-ASFV-P54-21和Vero-AG-ASFV-P54-24)细胞第3天进行首次传代，将细胞按1:4的密度稀释后，经48小时培养，细胞密度可达90％，与对照Vero细胞的生长速度基本一致，说明插入外源基因后并不影响细胞的增殖，生长速度很快，能保证大量供应。
实施例3稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的单克隆Vero细胞系的Western Blot鉴定
1、主要仪器
PowerPac 1000型蛋白质电泳仪及其转印系统，Bio-Rad公司产品；102型Kodak医用X光洗片机，Kodak公司产品；EU-88型图像扫描仪，Epson公司产品；VCX605型超声波破碎仪，Sonics&Materials公司产品。
2、主要试剂、耗材和细胞
DMEM(货号SH30022)，FBS(货号SV30087)，Hyclone公司产品；胰蛋白酶(货号0458)，Amresco公司产品，鼠抗Azami Green的单抗(2F11)、鼠抗β-Actin的单抗(ZM-0001)、辣根酶标记的山羊抗鼠IgG(货号ZB-2305)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；鼠抗p54蛋白的多克隆抗体，波兰国家兽医研究所保存。
稳定表达ASFV-P54蛋白的单克隆Vero细胞(Vero-AG-ASFV-P54-21和Vero-AG-ASFV-P54-24)、稳定表达Azami Green的Vero细胞(Vero-AG)和Vero细胞，均由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
T25细胞培养瓶(货号430168)，corning Incorporated公司产品；X光胶片(货号MXG-1)，Kodak公司产品。
3、操作步骤
3.1蛋白样品的制备
将Vero-AG-ASFV-P54-21、Vero-AG-ASFV-P54-24、Vero-AG和Vero细胞培养至95～100％单层(约6×106个/瓶)倒掉培养液，用PBS漂洗细胞后，向各瓶内加入500μL RIPA细胞裂解液，待细胞完全裂解后将溶液吸至1.5mL Eppendorf管内进行超声破碎(30％工作循环，破碎2s，间歇8s，破碎3次)，4℃14000×g离心5min，上清液即为所需蛋白样品，置-20℃冰箱保存备用。
3.2 SDS-PAGE
3.2.1制胶：按比例配制分离胶，混匀，将凝胶液注入两层玻璃空隙，在液面上小心注入一层去离子水，静置约30min使分离胶完全聚合；按比例配制浓缩胶，吸去分离胶上面的去离子水后，将浓缩胶注入分离胶上层，插入梳子，静置约30min使胶液完全聚合。
3.2.2煮样：按照1:4比例混合蛋白样品和5×蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，冷却至室温后，12000rpm离心5min，保留上清液。
3.2.3加样：取5μl蛋白Marker和10μl蛋白样品上样至SDS-PAGE胶加样孔中。
3.2.4电泳：加样完毕，120v电泳约90min，电泳至溴酚蓝染料前沿到达凝胶末端，停止电泳。
3.3 Western-blot
3.3.1转膜：采用半干转转印法(5mA，1h)将蛋白质从SDS-PAGE胶中转印至PVDF(0.22um)膜上
3.3.2膜封闭：将PVDF膜放入含5％脱脂奶的PBS内，于摇床上室温摇动封闭1h。
3.3.3一抗孵育：分别以鼠抗Azami Green的单抗(1:5000)，鼠抗β-actin的单抗(1:1000)，鼠抗P54的多抗(1：8000)为一抗，将剪开的PVDF膜的对应部分分别放入上述抗体稀释液中，于摇床上室温摇动孵育1h。
3.3.4洗膜：用PBST洗膜3次，每次5min。
3.3.5酶标二抗孵育：采用HRP标记的山羊抗鼠单抗做1：5000稀释后，将剪开的PVDF膜的对应部分分别置于上述二抗稀释液中，于摇床上室温摇动孵育1h。
3.3.6洗膜：用PBST洗膜3次，每次5min。
3.3.7底物反应：配制化学发光检测液ECL，将发光液均匀滴至PVDF膜上，室温避光反应5min。
3.3.8曝光：将蛋白面朝上的PVDF膜装入洁净的保鲜袋内，并将其固定在X光片暗盒内，在暗室中取出X光片置于暗盒内的保鲜袋上进行曝光。
3.3.9显影、定影：将达到曝光时间的X光片从暗盒中取出，置于加入显影液和定影液的洗片机中进行洗片。
3.3.10胶片扫描：利用扫描仪对胶片进行扫描，保存图片。
4、试验结果
Western-blot结果显示(图7)：Line1：Vero-AG-ASFV-P54-21有两条带，一条(26+20)kd左右的融合蛋白带，一条26kd左右的Azami green。Line2：Vero-AG-ASFV-P54-24有两条带，一条(26+20)kd左右的融合蛋白带，一条26kd左右的Azami green。通过比较Line1和Line2中细胞表达P54蛋白的水平，可以看出Vero-AG-ASFV-P54-24细胞系中P54的表达水平高于Vero-AG-ASFV-P54-21细胞系中P54的表达水平，因此，在后续实际应用中，选择Vero-AG-ASFV-P54-24进行应用研究，并将该株细胞送至中国科学院微生物研究所保藏，命名为：稳定表达ASFV-P54基因的Vero细胞系(Vero-AG-ASFV-P54)。Line3：Vero-AG细胞对照只有一条26kd的带，显示Azami Green已经表达。Line:4：Vero细胞，可见只有β-actin有表达，既没有P54蛋白也没有Azami Green蛋白。
实施例4稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系在利用细胞免疫荧光法检测猪血清中的应用
1、主要仪器
Leica TCS SP5激光共聚焦荧光显微镜，Leica公司产品。
2、主要试剂、耗材和细胞
DMEM(Hyclone，SH30022)，FBS(Hyclone，SV30087)，胰蛋白酶(Amresco，0458)，封片剂(货号ZLI-9556)，抗Azami Green的单抗(2F11)，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；罗丹明(TRITC)标记山羊抗小鼠IgG(货号T5393)，Sigma公司产品；P54多抗和ASFV灭活的猪阳性血清，波兰国家兽医研究所保存。
T25细胞培养瓶(货号430168)，6孔板(货号3516)，24孔板(货号3524)均采购自Corning。
稳定表达ASFV P54蛋白的Vero细胞(Vero-AG-ASFV-P54)、稳定表达Azami绿色荧光蛋白的Vero细胞(Vero-AG)和Vero细胞均由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
3、操作步骤
3.1制作细胞爬片：在6孔细胞培养板内预先放置灭菌盖玻片，将生长状态良好的细胞用胰酶消化后，将单细胞悬液以约105个/ml的密度接种于6孔细胞培养板孔内，每孔2ml；于37℃5％CO2培养箱中过夜培养，形成90％左右的单层细胞。
3.2固定：小心吸弃各孔内的细胞培养基，向每孔内加入2ml4％多聚甲醛，于室温固定15min。
3.3一抗孵育：用镊子取出孔内的细胞爬片，将鼠抗Azami Green抗体1:1000、鼠抗p54的多抗(1：1000)和ASFV感染猪阳性血清(1:50)稀释后，向细胞爬片滴加500μl抗体稀释液，于室温、湿盒内孵育1h。
3.4洗涤：用TBST洗涤3次，每次5min。
3.5二抗孵育：将TRITC标记的山羊抗鼠荧光抗体(1:100)和TRITC标记的兔抗猪荧光抗体(1:100)稀释后，向对应的细胞爬片滴加500μl抗体稀释液，于室温、湿盒内孵育1h，DAPI染核。
3.6洗涤：用TBST洗涤3次，每次5min。
3.7封片：用吸水纸吸除爬片上的残留液体，向爬片细胞面滴加5μl含防荧光淬灭剂的封片剂，制作封片。
3.8激光共聚焦显微镜观察：寻找最佳拍照区域，调整对比度放大倍数后，进行拍照，保存照片。
4、试验结果：
免疫荧光试验结果表明，通过慢病毒包装系统构建的稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞(Vero-AG-ASGV-P54)不仅能够与鼠抗P54蛋白的多抗发生特异性反应(图8)，而且还能识别ASFV感染猪阳性血清(图9)，同时还可观察到ASFV P54蛋白的绿色点状荧光信号(图8、图9，Azami Green)能够与多抗或猪血清的红色染色信号(图8、图9，pAb ASFV-P54/positive ASFV Serum)发生共定位(图8，图9，Merge)。而Vero细胞和Vero-AG细胞对照与P54多抗、ASFV感染的猪阳性血清均不发生反应(图8、图9)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备与应用
<130> KHP171115901.6
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgacgcgtcg atggattctg aattttttca ac 32
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacgctcacc attccttggg tcgatcctcc tcctgaacca ccactaccac ccgatcctcc 60
gccgcccaag gagttttc 78
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaaactcct tgggcggcgg aggatcgggt ggtagtggtg gttcaggagg aggatcgacc 60
caaggaatgg tgagcgtg 78
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atttgcggcc gctttattag tcagcggaat taccggtctt 40
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagatcagca atgggcagaa gt 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgtcgtgt aaggctcagt cg 22

Claims (6)

1.一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系，其特征在于，所述细胞系为P54稳定克隆细胞系，保藏号为CGMCC No.14316。
2.权利要求1所述细胞系在制备非洲猪瘟病毒诊断用抗原试剂及试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述细胞系在制备非洲猪瘟病毒诊断用阳性血清检测试剂及试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述细胞系在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。
5.权利要求1所述细胞系在表达非洲猪瘟病毒P54蛋白中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系在含10％FBS的DMEM培养基中，于37℃5％CO2条件下进行培养、传代至细胞密度达90％，收集细胞，依次经裂解、破碎、离心，收集的上清利用亲和层析柱进行目的蛋白纯化。
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