CN116082524B - 一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116082524B
CN116082524B CN202310033146.5A CN202310033146A CN116082524B CN 116082524 B CN116082524 B CN 116082524B CN 202310033146 A CN202310033146 A CN 202310033146A CN 116082524 B CN116082524 B CN 116082524B
Authority
CN
China
Prior art keywords
swine fever
african swine
fever virus
fusion protein
recombinant fusion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310033146.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116082524A (zh
Inventor
帅丽芳
李红卫
何跃忠
谭凯莹
何敏杰
梁智文
覃刘生
毛莹莹
颜仁和
陈学继
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Institute Of Biomedicine
Original Assignee
South China Institute Of Biomedicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Institute Of Biomedicine filed Critical South China Institute Of Biomedicine
Priority to CN202310033146.5A priority Critical patent/CN116082524B/zh
Publication of CN116082524A publication Critical patent/CN116082524A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116082524B publication Critical patent/CN116082524B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/14052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒P30‑P54重组融合蛋白及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明将P30‑P54的基因序列进行了优化设计，并将优化好的P54、P30序列进行了前后顺序置换，从而大大提高了蛋白的表达量。在此基础上，本发明还构建了重组质粒和杆状病毒，将杆状病毒转染SF9细胞，获得表达非洲猪瘟病毒P30‑P54融合蛋白，为构建表达非洲猪瘟病毒P54‑P30重组融合蛋白的亚单位疫苗奠定了基础。该重组融合蛋白还可用于检测非洲猪瘟病毒抗体，基于该非洲猪瘟病毒P30‑P54重组融合蛋白的特异性，可将其应用于非洲猪瘟病毒抗体检测的研发，从而推动我国非洲猪瘟病毒抗体检测事业的发展。

Description

一种非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白及其构建方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高致死性传染病。
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病，死亡率高达100％。ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
ASFV为有囊膜的双链DNA病毒，是非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是迄今发现的唯一DNA虫媒病毒。胞外病毒粒子直径约为200nm，由内核(Internal core)、内核心壳(Coreshell)、内膜(Innerenvelope)、衣壳(Capsid)、囊膜(External envelope)形成的同心多层20面体对称结构组成。ASFV基因组为170～190kb的线性双链DNA，含有约150～181个开放阅读框，编码约150～200种蛋白。内核心壳由PP220、PP62等多聚蛋白构成。内膜在电子显微镜下为单脂膜，主要来源于内质网膜，包含p54、p17、p12蛋白。衣壳由2000多个六边形壳粒组成，主要为p72蛋白，占病毒粒子总量的33％，衣壳蛋白p72、pE120R介导成熟病毒粒子从病毒工厂到细胞膜转运、出芽排出，p72具有促进病毒蛋白折叠/降解的伴侣分子样作用，可募集Hsp70促进病毒蛋白的折叠。P54和P30蛋白参与病毒附着的两个不同步骤，介导ASFV病毒与细胞受体之间的特异性相互作用，并且都有助于抗体介导的保护性免疫应答，其中P30蛋白在病毒感染细胞的内化过程中起作用。由于ASFV生物学特性的复杂性，迄今未能研制出安全有效的疫苗[8]。P30、P72蛋白在病毒感染过程中的重要作用，使其成为疫苗开发、抗体治疗和基于抗原的诊断检测的重要靶点。
非洲猪瘟病毒结构蛋白P30、P54、P72、P35、PK205R和CD2v蛋白具有较高的免疫原性。
P30蛋白是最具抗原性的蛋白之一，常在感染后的2-4h表达，12h后合成减少，能诱导中和抗体的产生，在整个感染期都能检测到，是ASFV重要的结构蛋白。我国新修定的ASFV检测标准中，检测时的包被抗体是P30蛋白单克隆抗体，酶标抗体是辣根过氧化酶标记的P30蛋白单抗，这种检测方法操作简单，可降低假阳性风险，广泛应用于血清学的检测。
P54蛋白是病毒入侵猪体后表达的早期膜蛋白，位于病毒的内囊膜，也是研究较多的蛋白之一，免疫原性较好，结构保守，在机体内产生时间早、持续时间长，在病毒的吸附和入侵中具有重要作用。P54蛋白可直接与动力蛋白结合，形成病毒跨膜结构域，实现病毒在胞质内运转。可以根据P54蛋白特性建立一系列非洲猪瘟病毒的ELISA检测方法，也可以制作基于P54蛋白的单克隆抗体的竞争性酶联免疫吸附试验。p54蛋白能引发强的IgG免瘴应答，能检测到IgG反应又能检测到IgM，且该方法快速实用。
设计并优化P30-P54蛋白的核苷酸序列，表达的P30-P54的融合蛋白用于非洲猪瘟抗体的快速检测方法，对大规模流行病学调查和无症状感染猪的筛查具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一发明提供了一种非洲猪瘟病毒P30-P54重组融和蛋白。本发明的重组融和蛋白具有与非洲猪瘟病毒的生物学特性，可以提高对非洲猪瘟病毒的检测和监控。非洲猪瘟病毒P30-P54重组融和蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHHHHHHGSGGSSGGMDFILNISMKMEVIFKTDLRSSSQVVFHAGSLYNWFSVEIINSGRIVTTAIKTLLSTVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKISFYLTYIGSGGSSGG。
此外，我们将P30-P54的基因序列进行了优化设计，并将优化好的P54、P30序列进行了前后顺序置换，从而大大提高了蛋白的表达量。编码该非洲猪瘟病毒P30-P54重组融和蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
AAGCTTATGGATAGCGAGTTTTTCCAGCCTGTGTACCCCAGGCACTACGGCGAGTGTCTGTCCCCCGTGACCACCCCTAGCTTTTTCTCCACCCACCACCACCACCATCACGGATCCGGCGGCTCCAGCGGCGGAATGGACTTTATCCTGAACATCAGCATGAAGATGGAGGTCATTTTCAAGACCGATCTGAGAAGCAGCAGCCAGGTGGTGTTTCACGCCGGCAGCCTGTACAACTGGTTCAGCGTGGAGATCATCAATAGCGGCAGGATCGTGACCACCGCCATCAAGACCCTGCTGTCCACCGTGAAGTACGACATCGTGAAGTCCGCCAGGATCTACGCCGGCCAGGGCTACACCGAGCACCAGGCTCAGGAGGAGTGGAATATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAGGAGACCGAGAGCAGCGCCTCCTCCGAGAACATCCACGAGAAGAATGATAACGAGACCAATGAGTGTACCAGCAGCTTCGAGACCCTGTTTGAGCAGGAGCCCAGCTCCGAGGTGCCCAAGGACTCCAAGCTGTACATGCTGGCCCAGAAGACCGTGCAGCACATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCTGACTTTAACAAGGTCATTAGAGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTACGGCACCCCTCTGAAGGAGGAGGAGAAGGAGGTGGTGAGACTGATGGTCATTAAGCTGCTGAAGAAGATCAGCTTTTACCTGACCTACATCGGATCCGGCGGCTCCAGCGGCGGATGAGCTAGC。
第二个方面，本发明提出了一种重组质粒，所述重组质粒包含上述编码非洲猪瘟病毒P30-P54重组融和蛋白的基因序列，其具体的构建方法包括以下步骤：
1、将含有上述的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融和蛋白的核苷酸序列插入至pUC57载体上构成载体I；
2、将载体I和pQB3S质粒分别进行HindIII和Nhe I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别胶回收小片段和大片段；
3、将载体I和pQB3S质粒连接转化后，得到重组质粒，命名为pQB3S-P30-P54。
第三个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞可表达上述的P30-P54蛋白。
第四个方面，本发明提供了一种重组杆状病毒的构建方法，构建方法包括以下步骤：
将上述的重组质粒pQB3S-P30-P54、表达质粒Bacmid DNA共转染宿主细胞(昆虫细胞Sf9)，培养收集上清，离心去细胞碎片，得到杆状病毒。
更优选地，Promega FuGENE HD Transfection Reagent转染试剂。
更优选地，转染包括以下步骤：
A)准备转染DNA混合物
1.向无菌的1.5mL离心管中加入95μL ddH2O(或无血清培养基)，再向离心管中加入5μL Promega FuGENE HD Transfection Reagent转染试剂，充分混匀。2.向无菌的1.5mL离心管中加入92μL ddH2O(或无血清培养基)，再向离心管中加入40ng Bacmid DNA，再向离心管中加入300ng重组质粒pQB3S-P30-P54，充分混匀。3.将步骤1中溶液加入步骤2中，充分混匀，室温静置20-30min。
B)将DNA混合物加到Sf9细胞中
1.将DNA混合物逐滴均匀加入细胞培养皿中。2.放置28℃培养箱中静置培养4-6天。
C)收获P0代病毒
收集培养皿中的培养基(上清)，4℃避光保存。此即为P0代病毒。
本发明所述重组杆状病毒的构建方法的优选实施方式，如上述重组质粒pQB3S-P30-P54、表达质粒Bacmid DNA的摩尔比为7.5:1。
第五个方面，本发明提供了上述杆状病毒在非洲猪瘟病毒疫苗制备中的应用。
本发明的杆状病毒携带表达非洲猪瘟病毒P30-P54重组融和蛋白的基因，感染昆虫细胞可获得非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白，表达量高，可达1MG/mL。
第六个方面，本发明提供的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白可用于检测非洲猪瘟病毒抗体，基于该非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白的特异性，可将其应用于非洲猪瘟病毒抗体检测的研发，从而推动我国非洲猪瘟病毒抗体检测事业的发展。利用非洲猪瘟阳性血清(由南方医科大学提供)和阴性血清进行Western blot鉴定，该非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白与非洲猪瘟标阳性血清反应，出现特异性条带，而与阴性血清不反应。过程中所涉及到的方法采用本领域所熟知的方法即可。
与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
本发明的重组融合蛋白具有与天然非洲猪瘟病毒的病毒类型相同的生物学特性，并且重组融合蛋白的表达量高，可以提高抗原的抗原性，与商品化试剂盒的检测相符，可以对洲猪瘟病毒进行血清抗体检测，检测灵敏度高。
附图说明
图1为本发明pQB3S-P30-P54的质粒图谱；
图2为本发明pQB3S-P30-P54的酶切鉴定结果图，M：Marker；泳道1：pQB3S-P30-P54的酶切鉴定；
图3为显微镜下荧光显色的pQB3S-P30-P54的杆状病毒图；
图4为杆状病毒感染Sf9细胞第四天的显微镜下荧光显色图；左图为P54-P30序列包装得到的杆状病毒感染SF9第四天图；右图为P30-P54序列包装得到的杆状病毒感染SF9第四天图；
图5为P54-P30蛋白电泳图；泳道1：P54-P30蛋白；泳道2:Marker；泳道3-7：BSA0.8mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml；
图6为P30-P54蛋白的电泳图；泳道1：P30-P54蛋白；泳道2：Marker；泳道3-7：BSA0.8mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml；
图7表示纯化后的P54-P30蛋白和P30-P54蛋白的电泳图；泳道1：P30-P54蛋白；泳道2：P54-P30蛋白；泳道3-5：BSA0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml；
图8为P30-P54蛋白的Western Blot鉴定结果图；泳道1、4：P30-P54蛋白；泳道6：Marker。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
在本发明中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组基因的设计与合成
在P30、P54基因序列的基础上进行序列设计并优化表达，将优化好的P54-P30序列进行了前后顺序置换，本发明中，pQB3S-P30-P54设计中，P30基因序列在前、P54基因序列在后，在表达框的起始密码子之前和终止密码子之后加入HindIII和Nhe I酶切位点，得到如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
AAGCTTATGGATAGCGAGTTTTTCCAGCCTGTGTACCCCAGGCACTACGGCGAGTGTCTGTCCCCCGTGACCACCCCTAGCTTTTTCTCCACCCACCACCACCACCATCACGGATCCGGCGGCTCCAGCGGCGGAATGGACTTTATCCTGAACATCAGCATGAAGATGGAGGTCATTTTCAAGACCGATCTGAGAAGCAGCAGCCAGGTGGTGTTTCACGCCGGCAGCCTGTACAACTGGTTCAGCGTGGAGATCATCAATAGCGGCAGGATCGTGACCACCGCCATCAAGACCCTGCTGTCCACCGTGAAGTACGACATCGTGAAGTCCGCCAGGATCTACGCCGGCCAGGGCTACACCGAGCACCAGGCTCAGGAGGAGTGGAATATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAGGAGACCGAGAGCAGCGCCTCCTCCGAGAACATCCACGAGAAGAATGATAACGAGACCAATGAGTGTACCAGCAGCTTCGAGACCCTGTTTGAGCAGGAGCCCAGCTCCGAGGTGCCCAAGGACTCCAAGCTGTACATGCTGGCCCAGAAGACCGTGCAGCACATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCTGACTTTAACAAGGTCATTAGAGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTACGGCACCCCTCTGAAGGAGGAGGAGAAGGAGGTGGTGAGACTGATGGTCATTAAGCTGCTGAAGAAGATCAGCTTTTACCTGACCTACATCGGATCCGGCGGCTCCAGCGGCGGATGAGCTAGC。
按SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列委托安徽通用生物技术有限公司采用基因合成仪人工合成，得到本发明的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白，重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHHHHHHGSGGSSGGMDFILNISMKMEVIFKTDLRSSSQVVFHAGSLYNWFSVEIINSGRIVTTAIKTLLSTVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKISFYLTYIGSGGSSGG。
实施例2构建重组质粒和包装杆状病毒
将非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白的核苷酸序列插入至pQB3S载体上构成载体I，将载体I与pQB3S质粒连接转化后得到的重组质粒命名为pQB3S-P30-P54，质粒图谱如图1所示；将得到的载体测序，771bp为P30-P54基因序列，其中pQB3S-P30-P54的酶切鉴定结果如图2所示。将构建好的pQB3S-P30-P54及Bacmid DNA(陕西杆粒生物科技有限公司生产)按摩尔比为7.5:1共转染昆虫细胞SF9，28℃培养箱中细胞转染48小时后在荧光显微镜下观察可见绿色荧光(如图3所示)代表病毒重组成功。细胞静置培养4-6天后，收集细胞培养上清获得杆状病毒。
实施例3获得表达产物-非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白
上述实施例2制备的包装用杆状病毒，用杆状病毒以3MOI感染Sf9细胞，至感染后4-5天收集非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白。
对比试验
分别用P30和P54序列未前后置换的核苷酸序列(简称P54-P30序列)和本发明的P30和P54序列前后置换的核苷酸序列(简称P30-P54序列)包装好的P1代杆状病毒，以3MOI感染Sf9细胞(图4)，至感染后4天收集表达蛋白。
将Sf9细胞进行裂解，并进行纯化得到表达蛋白。将P54-P30序列的表达蛋白(简称P54-P30蛋白)与本发明的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白(简称P30-P54蛋白)分别进行SDS-PAGE电泳：图5为P54-P30蛋白电泳图；图6为本发明的P30-P54蛋白的电泳图，通过定量测算，表达量高达0.8mg/ml；图7为纯化后的P54-P30蛋白和P30-P54蛋白的电泳图。图8为P30-P54蛋白的Western Blot鉴定结果图。
上述对比试验结果说明，经过序列置换后的核苷酸序列的蛋白表达量更高。
实施例4利用非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白检测非洲猪瘟病毒抗体
通过采用上述技术方案提供了非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白，以该非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白为抗原，其能够特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，故能够对待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体进行检测。通过检测以及对检测结果的分析，能够计算出待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体。因此，本申请提供的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白可用于检测非洲猪瘟病毒抗体，基于该非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白的特异性，可将其应用于非洲猪瘟病毒抗体检测的研发。
包被抗原。包被液50mM碳酸氢钠(PH＝9.6)梯度稀释P30-P54融合蛋白，涡旋混匀，100ul/孔，4℃，15小时。
洗涤。PBST(1xPBS+1‰Tween-20)洗5次，250ul/孔，每次洗涤完将96孔酶标板在吸水纸上反复拍打，保证孔内无液体。
封闭。PBST作稀释液配置5％脱脂牛奶，涡旋混匀，250ul/孔，37℃2h。
洗涤。PBST洗5次，250ul/孔，酶标板在吸水纸上反复拍打。
一抗。含5％脱脂牛奶的PBST稀释一抗(非洲猪瘟病毒阳性血清)，涡旋混匀，100ul/孔，37℃45min。
洗涤。PBST洗5次，250ul/孔，洗涤完将96孔酶标板在吸水纸上反复拍打，保证孔内无液体。
二抗。含5％脱脂牛奶的PBST稀释二抗(HRP抗鼠1：10000，HRP抗猪1：10000，对应一抗的抗体)，涡旋混匀，100ul/孔，37℃45min。
洗涤。PBST洗5次，250ul/孔，酶标板在吸水纸上反复拍打。
显色。TMB双组分显色液，TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)：过氧化氢，A液：B液＝1：1，涡旋混匀，100ul/孔，37℃避光10min。
终止。每孔加入50μL终止液2M硫酸，终止显色；
读数。酶标仪OD450nm测量结果。保证ELISA酶标板底部干净，放入酶标仪中，读取450nm波长下的吸光度值，将待测抗体孔OD450数值比阴性对照孔OD450数值的2.1倍大，判为阳性。
对ASFV间接ELISA方法的检测条件优化，其优化为：将P30-P54抗原梯度稀释，分别为25ng、50ng、100ng、200ng、400ng、800ng、1600ng和3200ng，一抗阳性血清以及阴性血清分别以1：50、1:100、1：200稀释，并把P/N最大稀释倍数作为最佳浓度。
为了找出最佳诊断试剂条件，进一步对封闭液浓度和时间进行优化，分别选择商品用脱脂奶粉、进口脱脂奶粉作为封闭液，并且各封闭45分钟，通过检测分析，把P/N最大值确定为最佳封闭液。
通过ELISA检测已知背景的阴性和阳性血清OD450nm。确定ELISA判定的临界值。
具体方法：
1、确定一抗稀释倍数与包被浓度
将血清一抗和抗原P30-P54包被浓度分别进行倍比稀释建立方阵。根据P/N的最大值和经济效益的角度，最终确定血清一抗的稀释倍数是1:100，抗原V022的包被浓度最适为200μg/ML孔，结果见表1。
表1ELISA方阵检测OD450nm结果
2、确定酶标二抗的最佳稀释倍数
根据P/N的最大值和经济效益的角度，确定酶标二抗的最佳稀释倍数为1：10000，结果见表2。
表2ELISA酶标二抗稀释P/N结果
3、间接ELISA方法临界值的确定(ROC曲线法)
通过ELISA检测已知背景的阴性和阳性血清OD450nm，结果见表3，表4。确定ELISA判定的临界值。S/P＝(样本值-阴性平均对照值)/(阳性平均对照值-阴性平均对照值)，S/P大于等于0.259为阳性，S/P小于0.259为阴性。
表3间接ELISA检测123份已知阴性背景血清OD450nm
表4间接ELISA检测60份已知阳性背景血清OD450nm
4、封闭奶粉的确定
封闭采用的牛奶均用PBST稀释成10％的量，采用不同来源的封闭奶粉进行对比，根据P/N的最大值，进口脱脂奶粉封闭的效果比生工脱脂奶粉要好，因此采用进口脱脂奶粉作为ELISA的封闭奶粉，结果见表5。
表5ELISA不同封闭奶粉检测OD450nm结果
5、与商品化试剂盒检测结果相符
将待测血清56管用P30-P54以及商品化试剂盒进行了检测，结果如表6，从表上可见47份ASFV抗体阳性，9份ASFV抗体阴性，与商品化试剂盒检测结果相符。
表6检测结果
综上，从表1、2数据可以得出，抗原包被浓度为2.00μg/mL为最佳包被浓度，血清一抗稀释最佳浓度为1：100，二抗的最佳稀释倍数为1：10000。
确定了ELISA判定的临界值。S/P＝(样本值-阴性平均对照值)/(阳性平均对照值-阴性平均对照值)，S/P大于等于0.259为阳性，S/P小于0.259为阴性。
该重组抗原可以有效检出ASFV，且与商品化试剂盒检测结果相符，为非洲猪瘟防控提供了新的技术手段，检测快速、准确且特异性强，对猪瘟病毒抗原、蓝耳病毒抗原及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原均无反应，对非洲猪瘟的精准防控有重大的意义。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白，其特征在于，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求2所述的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的一种重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白的核苷酸序列插入至pUC57载体上构成载体I；
将载体I和pQB3S质粒分别进行HindIII和Nhe I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别胶回收小片段和大片段；
将载体I和pQB3S质粒连接转化后，得到重组质粒。
5.一种杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求4所述的重组质粒、表达质粒Bacmid DNA共转染宿主细胞，培养收集上清，离心去细胞碎片，得到杆状病毒。
6.如权利要求5所述的杆状病毒的构建方法，其特征在于，所述转染宿主细胞用到的转染试剂为Promega FuGENE HD Transfection Reagent转染试剂，所述宿主细胞为Sf9细胞。
7.如权利要求5所述的杆状病毒的构建方法，其特征在于，转染包括以下步骤：
A)准备转染DNA混合物
1.向无菌离心管中加入ddH2O或无血清培养基，再向离心管中加入转染试剂，充分混匀；2.向无菌离心管中加入ddH2O或无血清培养基，再向离心管中加入Bacmid DNA，再向离心管中加入重组质粒DNA，充分混匀；将两根离心管中的溶液充分混匀，室温静置；
B)将DNA混合物加到宿主细胞中
1.将DNA混合物逐滴均匀加入细胞培养皿中；2.静置培养；
C)收获P0代病毒
收集培养皿中的培养基上清，4℃避光保存，此即为P0代杆状病毒。
8.如权利要求7所述的杆状病毒的构建方法，其特征在于，加入的重组质粒、表达质粒Bacmid DNA的摩尔比为7.5:1。
9.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白在非洲猪瘟病毒疫苗制备中的应用。
10.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P30-P54重组融合蛋白在制备检测非洲猪瘟病毒抗体产品中的应用。
CN202310033146.5A 2023-01-10 2023-01-10 一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用 Active CN116082524B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310033146.5A CN116082524B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310033146.5A CN116082524B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116082524A CN116082524A (zh) 2023-05-09
CN116082524B true CN116082524B (zh) 2023-08-08

Family

ID=86202114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310033146.5A Active CN116082524B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116082524B (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647971A (zh) * 2016-03-02 2016-06-08 青岛农业大学 一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法
CN107937349A (zh) * 2017-11-27 2018-04-20 中国检验检疫科学研究院 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN110759973A (zh) * 2019-10-30 2020-02-07 广州伯尼兹生物科技有限公司 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
CN111004330A (zh) * 2019-12-13 2020-04-14 天津大学 一种制备非洲猪瘟病毒p30、p54酵母疫苗的方法
CN111593072A (zh) * 2020-05-12 2020-08-28 深圳海关动植物检验检疫技术中心 一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用
CN111662916A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 畜科生物工程有限公司 表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法
CN112472801A (zh) * 2020-12-22 2021-03-12 华南农业大学 非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN113150171A (zh) * 2021-04-25 2021-07-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用
CN114262381A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 扬州大学 表面展示非洲猪瘟病毒抗原p30蛋白的重组杆状病毒、制备方法及其应用
CN114344456A (zh) * 2021-11-30 2022-04-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟病毒多基因串联dna疫苗及应用
CN115073557A (zh) * 2021-03-10 2022-09-20 浙江海隆生物科技有限公司 一种重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白及其制备方法和应用
CN115386556A (zh) * 2022-05-05 2022-11-25 中国农业科学院上海兽医研究所 一株串联表达非洲猪瘟病毒p30、p54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647971A (zh) * 2016-03-02 2016-06-08 青岛农业大学 一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法
CN107937349A (zh) * 2017-11-27 2018-04-20 中国检验检疫科学研究院 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN110759973A (zh) * 2019-10-30 2020-02-07 广州伯尼兹生物科技有限公司 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
CN111004330A (zh) * 2019-12-13 2020-04-14 天津大学 一种制备非洲猪瘟病毒p30、p54酵母疫苗的方法
CN111593072A (zh) * 2020-05-12 2020-08-28 深圳海关动植物检验检疫技术中心 一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用
CN111662916A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 畜科生物工程有限公司 表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法
CN112472801A (zh) * 2020-12-22 2021-03-12 华南农业大学 非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN115073557A (zh) * 2021-03-10 2022-09-20 浙江海隆生物科技有限公司 一种重组高纯度的非洲猪瘟病毒pK205R亚单位蛋白及其制备方法和应用
CN113150171A (zh) * 2021-04-25 2021-07-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用
CN114344456A (zh) * 2021-11-30 2022-04-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟病毒多基因串联dna疫苗及应用
CN114262381A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 扬州大学 表面展示非洲猪瘟病毒抗原p30蛋白的重组杆状病毒、制备方法及其应用
CN115386556A (zh) * 2022-05-05 2022-11-25 中国农业科学院上海兽医研究所 一株串联表达非洲猪瘟病毒p30、p54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张德华.《蛋白质与酶工程》.合肥工业大学出版社,2015,第69-71也. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116082524A (zh) 2023-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111793128B (zh) 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110759973B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
CN111234036B (zh) 非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用
CN111848786B (zh) 一种单克隆抗体、其制备方法及用途
CN110698543A (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接elisa试剂盒
CN106518990B (zh) 一种寨卡病毒抗原及其应用
CN113607952B (zh) 非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN113943375A (zh) 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
CN111999497A (zh) 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN110257339A (zh) 表达抗新城疫病毒融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用
CN113817753A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
CN116082524B (zh) 一种非洲猪瘟病毒p30-p54重组融合蛋白及其构建方法和应用
WO2008147799A1 (en) A live attenuated antigenically marked classical swine fever vaccine
CN110156878B (zh) 猪伪狂犬病毒gE-gI蛋白及其表达质粒、制备方法和应用
CN111575315A (zh) 一种兔病毒性出血症病毒ⅱ型vlp疫苗
CN105296507B (zh) 拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用
CN113045673B (zh) 一种基于嵌合p54抗原表位的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒及应用
AU2020103723A4 (en) A Porcine Intestinal Epithelial Cell Line and Its Application
Qiao et al. A split NanoLuc complementation-based human norovirus-like particle entry assay facilitates evaluation of anti-norovirus antibodies in live cells
CN114966052A (zh) 基于非洲猪瘟p30和p22两种蛋白的间接ELISA检测试剂盒
CN114113634A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用
CN114560929A (zh) 针对冠状病毒np蛋白的单克隆抗体及其应用
CN109295014B (zh) 一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN115806594B (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用
CN113444153B (zh) 非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant