CN115806594B

CN115806594B - 用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用

Info

Publication number: CN115806594B
Application number: CN202211572722.5A
Authority: CN
Inventors: 周末; 朱善元; 曹世诺; 卢会鹏; 吴植
Original assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Current assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority date: 2022-12-08
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-12-08
Also published as: CN115806594A

Abstract

本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用。所述重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。所述制备方法包括：S10、将如SEQ ID No:2所示的编码基因克隆至载体上，构建形成重组表达质粒；S20、将得到的重组表达质粒转化感受态细胞后，经培养纯化，得到重组抗原蛋白；其中，所述载体为pET28a载体，所述感受态细胞为大肠杆菌。所述检测试剂盒包括ELISA反应液和包被有上述所述的重组抗原蛋白的抗体检测板。通过上述技术方案，达到了表达量高，特异性强，亲和力高，与其它相近的猪病毒感染血清无交叉反应，能够特异性地快速实现对非洲猪瘟病毒病毒的检测效果。

Description

用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体地，涉及用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的急性、高度传染性和致死性的传染病。强毒株感染后发病率和死亡率几乎为100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。自2018年8月3日中国首次确诊非洲猪瘟病例以来，已给我国畜牧业造成巨大经济损失，经B646L/p72基因进化树分析显示，我国发现的病毒属于基因Ⅱ型，与俄罗斯和东欧流行的Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。由于缺乏具有保护性的疫苗，非洲猪瘟对世界养猪业构成严重威胁。

非洲猪瘟病毒是一种巨大的有囊膜病毒，具有二十面体形态，平均直径为200纳米。病毒基因组由一个单分子的线性共价闭合双链DNA组成。不同菌株的基因组长度在170-190kbp之间，编码150-200种蛋白质，包括68个结构蛋白和超过100多个非结构蛋白。ASFV中某些序列的重复和丢失基因组是造成来自不同来源或同一株不同世代ASFV毒株差异的因素之一。P72是主要的衣壳蛋白，因为它的保守性，P72被用于ASFV毒株的血清分型。内化的病毒颗粒依赖于的宿主细胞内体系统从细胞边缘移动到中心。随着逐渐酸化的核内体，ASFV去除外壳和内膜，将病毒基因组释放到细胞质中进入病毒复制阶段。病毒首先在细胞核中短暂停留，然后是大量的病毒DNA片段是在核周区域的病毒工厂(VF)中合成。病毒基因表达分为四个阶段，即：极早、早期、中期和晚期。ASFV有一套独立于宿主的复制和转录机制，翻译过程仍然依赖于宿主。基因组复制和转录依赖于许多ASFV基因组的编码相关蛋白。ASFV还进行转录后和翻译后修饰，如5’-mRNA的mRNA加帽和蛋白质的乙酰化，这有利于细胞内病毒基因组的表达。合成的病毒蛋白在病毒工厂附近聚集，保持不变将子代病毒运送到细胞的内体系统成膜，然后出芽和释放病毒。因此，开发更方便和经济的检测方法，有利于增强养猪业整体预防以及在世界范围内控制非洲猪瘟。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种表达量高，特异性强，亲和力高，与其它相近的猪病毒感染血清无交叉反应，能够特异性地快速实现对非洲猪瘟病毒病毒的检测的用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示。

本发明还提供了一种如上述所述的重组抗原蛋白的制备方法，所述制备方法包括：

S10、将如SEQ ID No:2所示的编码基因克隆至载体上，构建形成重组表达质粒；

S20、将得到的重组表达质粒转化感受态细胞后，经培养纯化，得到重组抗原蛋白；其中，

所述载体为pET28a载体，所述感受态细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括ELISA反应液和包被有根据上述所述的重组抗原蛋白的抗体检测板。

优选地，重组抗原蛋白的包被浓度为0.4-0.6μg/mL。

优选地，包被的所述重组抗原蛋白由重组抗原蛋白包涵体提供。

优选地，所述重组抗原蛋白包涵体包括所述重组抗原蛋白和包涵体抗原稀释液；其中，

所述包涵体抗原稀释液包括二硫苏糖醇、Triton X-100和CBS缓冲液，且，相对于100mL的CBS缓冲液，二硫苏糖醇的含量为0.8-1.2g，Triton X-100的含量为0.3-0.6mL。

本发明还提供了一种根据上述所述的检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

优选地，所述应用具体包括：

S100、采用包涵体抗原稀释液稀释并冻存所述重组抗原蛋白，得到冻存重组抗原蛋白，采用包被液稀释所述冻存重组抗原蛋白后包被过夜；

S200、将包被后的所述冻存重组抗原蛋白经封闭后，将ELISA反应液和待测样品加入混合显色后，读取在450nm波长处的吸光度值；

S300、根据获取的吸光度值进行结果的判定。

优选地，当待测样品D450≥0.713时，则待测样品为非洲猪瘟病毒阳性。

本发明提供的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，其与其它相近的非洲猪瘟阴性血清无血清学交叉反应，而与非洲猪瘟病毒抗体具有极高的亲和力，在用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有高灵敏性、高特异性的优势。进一步应用于间接ELISA检测试剂盒中，通过ELISA检测结果与阴性对照及阳性对照比较，以快速地得到检测结论，该结论可以检测ASFV隐性感染猪群，为ASFV的临床诊断与预防控制提供参考依据；根据检测结果有选择性地对感染猪群进行扑杀，保护未感染猪群，能减少免疫的盲目性，有效地避免经济损失。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是预测的重组抗原蛋白三维结构；

图2是重组抗原蛋白的抗原表位预测；

图3是实施例1中用于表达重组抗原蛋白的表达菌株和对照菌株的SDS-PAGE电泳图；其中，M为分子量标记，1号条带为重组抗原蛋白表达菌株表达上清，2号条带为对照菌株表达上清，3号条带为重组抗原蛋白表达菌株表达沉淀，4号条带为对照菌株表达沉淀；

图4是实施例1中纯化后的重组抗原蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，M为分子量标记，1号条带为重组抗原蛋白；

图5是验证例1中Western Blot法检测重组蛋白与非洲猪瘟阳性血清及阴性血清的反应原性结果图；其中，M为分子量标记，1号条带为非洲猪瘟病毒阳性血清；2号条带为非洲猪瘟病毒阴性血清；

图6是验证例3中采用ELISA法检测重组抗原蛋白特异性的试验结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1、目的基因的原核表达及纯化(即重组抗原蛋白的制备)

合成经过密码子优化后的目的基因片段(如SEQ ID No:2所示的目的基因)并连接到原核表达载体(原核表达载体选用pET28a)中，这一过程由擎科生物(南京)股份有限公司合成构建，得到含有目的基因片段的重组表达质粒，记为pET28a-A151R。

将得到的pET28a-A151R转入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落，培养细菌OD600至0.4-0.6后，加入1mmol/L的IPTG于37℃诱导12h后收集菌体，表达产物的SDS-PAGE电泳结果如图3所示。将表达蛋白的菌以上述方法大量诱导，收集的菌体超声破碎后，以10000r/min离心15min，菌体沉淀用1.5mol/L尿素反复洗后，溶解到8mol/L尿素中，利用Ni-NTA His·Bind Resin亲合层析纯化重组抗原蛋白，纯化产物的SDS-PAGE电泳结果如图4所示。重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1，具体为：Asp Asn His Asp Leu Ile SerLys Glu Asp Leu Lys Gly Ala Thr Ser Lys Asn Ile Ala Lys Met Ile TyrAsn TrpIle Ile Lys Asn Pro Gln Asn Asn Lys Ile Trp Ser Gly Glu Pro ArgThr Gln IleTyr Phe Glu Asn Asp Leu Tyr His Thr Asn Tyr Asn His LysCys Ile。

实施例2、重组抗原蛋白包涵体的制备

1、包涵体抗原稀释液的配置：包涵体抗原稀释液为含1％DTT(二硫苏糖醇)和0.5％Triton X-100的CBS缓冲液(CBS缓冲液按照本领域技术人员能够理解和采用的方式进行制备，例如，将1.59g的Na₂CO₃，2.94gNaHCO₃加蒸馏水定容至1000mL；0.05M，pH9.6，4℃保存)。

2、包涵体抗原冻存：使用4倍稀释实施例1中得到的纯化后的含有溶剂的重组抗原蛋白液体(即，包涵体抗原稀释液与纯化后的含有溶剂的重组抗原蛋白液体按照4:1的体积比进行混合)，即得到包涵体抗原，将得到的包涵体抗原分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。需要注意的是，这里必须由少到多逐渐加入包涵体抗原稀释液，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。

3、包涵体抗原稀释及包被：取出包涵体抗原，4℃融化。使用CBS缓冲液加入稀释至重组抗原蛋白至5μg/mL(即，将含有CBS缓冲液的重组抗原蛋白稀释液命名为重组抗原蛋白包涵体，在1mL的重组抗原蛋白包涵体中，重组抗原蛋白的含量为5μg)，在ELISA板每孔加入50μL。而后置于4℃过夜。弃去孔内溶液，用PBST洗涤3次(洗涤方法：在ELISA孔中加350μL的PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次)。

进一步通过上述方式，将重组抗原蛋白制备成重组抗原蛋白包涵体，解决了因制备过程中含有高浓度尿素溶液，而使得重组抗原蛋白不易包被到ELISA板上的问题。进一步地，通过采用独特的包涵体抗原稀释液，解决了包涵体抗原不易包被到ELISA板上的难题。

实施例3、非洲猪瘟病毒的检测方法

向实施例2中经过PBST洗涤后的ELISA板中的每孔再加入封闭液，而后于37℃封闭后，再用洗涤液洗涤晾干后，得到抗体检测板。将用封闭液稀释后的非洲猪瘟病毒阴性血清或阳性血清分别加入各孔中，于37℃孵育后用洗涤液洗涤；将HRP标记的羊抗猪IgG二抗加入到各孔中37℃孵育后用洗涤液洗涤；最后每孔加入TMB显色液，于37℃避光显色后，并向每孔加入反应终止液，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值。

验证例1、重组抗原蛋白的免疫学鉴定

将纯化的重组抗原蛋白以SDS-PAGE电泳后，转膜至PVDF膜，并以5％的脱脂奶粉封闭1h。以PBST洗涤后，加入稀释的非洲猪瘟阳性血清，室温孵育1h后，加入HRP标记的山羊抗猪IgG二抗，室温孵育1h，以同样方法洗涤后，加入DAB显色液。如图5所示，为重组抗原蛋白与非洲猪瘟阳性血清及阴性血清的反应原性结果图。其中，条带M为分子量标记，条带1为非洲猪瘟病毒阳性血清，条带2为非洲猪瘟病毒阴性血清。通过图5可以看出，Western blot鉴定重组抗原蛋白与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应。

验证例2、特异性试验

以实施例3建立的间接ELISA方法对猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清，猪圆环病毒(PCV)阳性血清进行检测，同时用非洲猪瘟阳性血清和阴性血清做对照，确定检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法的特异性。结果如图6所示，以A151R重组蛋白建立的间接ELISA方法分别检测CSFV，PCV，PRRSV的阳性血清，结果只有非洲猪瘟阳性血清检测为阳性，而CSFV，PCV，PRRSV感染后的阳性血清检测为阴性，表明所建立的间接ELISA方法均具有良好的特异性。

验证例3、批内和批间可重复性试验

以实施例3建立的间接ELISA方法检测3份非洲猪瘟阳性血清和3份阴性确定试验的批内和批间重复性。根据测定的OD450值，计算标准差与差异系数。3份阳性血清(编号为No.P1-No.P3)和3份阴性血清(编号为No.N1-No.N3)，根据测的OD450值分别计算板间和板内平均值、标准差和变异系数，结果见表1，阳性血清和阴性血清的板内变异系数(CV)为1.74％-3.56％，板间重复系数为4.83％-7.55％，说明该方法具有较好的重复性。

表1

应用例1

采用实施例3建立的间接ELISA方法对36份猪瘟阴性血清样品进行检测，重复3次。应用统计学方法计算样品的平均值(x)和标准差(s)。当被检样品的OD450值≥阴性样本OD450值的平均值(X)+3(标准差)、并且阳性对照/阴性对照>2判定为阳性。据此，样本OD450值≥阴性样本OD450值的平均值(X)+3(标准差)，可在99％的水平上判为阳性，当样本OD450值＜阴性样本OD450值的平均值(X)+3(标准差)时，判为阴性。

进一步地，通过检测，其结果显示，以实施例1中得到的重组抗原蛋白为包被抗原，被检测样品D450≥0.713时判定为阳性，否则判定为阴性。

通过上述实施例、验证例和应用例可以进一步看出，对于本发明的重组抗原蛋白，其具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的非洲猪瘟阴性血清无血清学交叉反应，而与非洲猪瘟病毒抗体具有极高亲和力。在本发明的实施例中，通过将表达获得的重组抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，验证了本发明的重组抗原蛋白具有极高的反应原性，并获取了能高效表达非洲猪瘟病毒特异性重组抗原的基因工程菌株，同时结合采用了该重组抗原蛋白的非洲猪瘟病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白在用于检测非洲猪瘟病毒抗体时表现出的高灵敏度、高特异性的优势。

对于本发明的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了非洲猪瘟病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白预测其具有较高的抗原性。该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表达效果。另外，在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，同时结合采用了该重组抗原蛋白的非洲猪瘟病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白的制备方法在高效表达可溶性重组抗原蛋白、以及保证本发明重组抗原蛋白的高灵敏度、高特异性方面表现出的优势。

通过上述阐述，可以进一步看出本发明的具体技术方案具有如下优点：

(1)本发明选择原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒进行融合表达并纯化包涵体抗原，与可溶蛋白部分相比较，包涵体蛋白部分抗体表达量大纯度高，能大大降低生产成本。

(2)本发明提供的重组抗原蛋白只与非洲猪瘟病毒阳性血清特异结合，不与其它病毒阳性血清发生交叉反应，具有良好抗原性，因此具有很高的特异性。

(3)本发明检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了非洲猪瘟血清学诊断的效率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白，其特征在于，所述重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1 所示。

2.一种用于检测非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括ELISA反应液和包被有根据权利要求1 所述的重组抗原蛋白的抗体检测板。

3.根据权利要求2 所述的检测试剂盒，其特征在于，重组抗原蛋白的包被浓度为4-6μg/mL。

4.根据权利要求2 或3 所述的检测试剂盒，其特征在于，包被的所述重组抗原蛋白由重组抗原蛋白包涵体提供。

5.根据权利要求4 所述的检测试剂盒，其特征在于，所述重组抗原蛋白包涵体包括所述重组抗原蛋白和包涵体抗原稀释液；其中，所述包涵体抗原稀释液包括二硫苏糖醇、Triton X-100 和CBS 缓冲液，且，相对于100mL 的CBS 缓冲液，二硫苏糖醇的含量为0.8-1.2g，Triton X-100的含量为0.3-0.6mL。

6.一种根据权利要求1 所述的重组抗原蛋白在制备检测非洲猪瘟病毒试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6 所述的应用，其特征在于，所述应用中的检测过程具体包括：

S200、将包被后的所述冻存重组抗原蛋白经封闭后，将ELISA 反应液

和待测样品加入混合显色后，读取在450nm 波长处的吸光度值；S300、根据获取的吸光度值进行结果的判定。

8.根据权利要求7 所述的应用，其特征在于，当待测样品OD450≥0.713时，则待测样品为非洲猪瘟病毒阳性。