CN111848749A - 猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用 - Google Patents

猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用 Download PDF

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孙世琪
白满元
韩世充
董虎
宋品
魏衍全
张韵
殷宏
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Abstract

本发明公开了猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用，其检测试剂盒包括预包被猪细小病毒VLPs的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明是首次采用猪细小病毒的病毒样颗粒作为包被抗原，建立了可检测猪细小病毒的试剂盒，还试剂盒可对血清中的猪细小病毒的抗体水平进行快速检测；本发明试剂盒检测敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。同时所采用的病毒样颗粒对操作者和环境安全无害、无传染性。另外本发明试剂盒应用大肠杆菌表达系统开发，因而具有经济、廉价的优点。

Description

猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
背景技术
猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是一种耐受性极强且具有高度传染性的病毒，是导致母猪繁殖障碍的病原之一，猪细小病毒病的临床主要特征是妊娠母猪流产、胎儿死亡和木乃伊化。该病与断奶仔猪多系统衰弱综合征以及猪渗出性皮炎等疾病有关，易感成年猪如果在交配期间或者妊娠期间暴露在PPV存在的环境中，该病毒会很容易穿过胎盘屏障感染胚胎和胎儿。调查发现该病呈全球性分布，特别对妊娠母猪和仔猪危害较大，阻碍了猪养殖产业化进程，经济损失巨大。所以对于PPV的预防、诊断就显得尤为重要。
病毒样颗粒(VLPs)是由病毒的衣壳蛋白形成的空心颗粒，具有和天然病毒粒子相同或相似的形态，但不含病毒遗传物质，不能自主复制，因此不会产生任何可能导致感染的遗传成分。并且衣壳蛋白组装成VLPs时，通过各亚单位之间的相互作用可以形成单个蛋白不具有的立体构象，而且可以重复并高密度的展示抗原位点。因此相对于单个病毒蛋白，使用VLPs对血清抗体检测具有更强的免疫原性和更高特异性。VLPs的天然生物学结构类似于亲本病毒颗粒，可以近乎完美的展示诱导中和抗体的抗原表位，因此免疫性强，不但能激发体液免疫反应，还可以激发细胞和粘膜免疫。VLPs具备安全、高效的特点，是未来具有广阔发展前景的候选疫苗或传递抗原的载体。
目前PPV的诊断方法主要有免疫过氧化酶单层细胞实验(IPMA)、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA以及竞争ELISA等，但由于IPMA和IFA要求比较高，不适合大规模的PPV抗体检测。目前用于检测PPV抗体的ELISA方法大多是以灭活病毒、重组病毒、单个蛋白或多肽等作为抗原，但是以完整病毒粒子作为抗原存在安全风险，单个蛋白或多肽的免疫原性相对较差。
因此，现有技术有待于进一步发展。
发明内容
本发明申请的目的在于解决现有技术的缺陷和不足，提供一种特异性强、敏感性高、稳定性好的用于猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
为实现上述发明目的，本发明提供一种猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，包括预包被猪细小病毒VLPs的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述猪细小病毒VLPs通过以下步骤制得：
1)对猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，并基于优化后基因序列制备pUC-VP2重组质粒；
2)利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2；
3)将重组质粒pSMK-VP2转化大肠杆菌并诱导表达得到VLPs。
所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，合成后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2具体为：
1)将pUC-VP2重组质粒按照如下酶切体系进行酶切：pUC-VP2质粒35μL，Bsa I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O5μL；
将pSMK载体质粒按照以下体系进行酶切：pSMK载体质粒35μL，Bsa I 2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O7.5μL；
上述两酶切体系通过琼脂糖凝胶电泳确认pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒切开后，回收基因VP2目的片段和pSMK表达载体；
2)将基因VP2目的片段和pSMK表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接，反应体系为：VP2目的片段4μL、pSMK表达载体1μL、5μL Solution I，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接；
3)将连接产物转化Trans5a克隆菌；
4)将Trans5a克隆菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养16h，将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pSMK-VP2。
5、根据权利要求4所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将连接产物转化Trans5a克隆菌具体为：
1)将5μL连接产物加入100μL Trans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，立即冰浴3min；
3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h；
4)离心机4500rpm离心3min；
5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有50mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上；
6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。
所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pSMK-VP2具体为：将过夜培养后的菌液接种于10μL PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定，将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定，其双酶切体系如下：pSMK-VP2重组质粒6μL，Xba I 1.5μL，Xho I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h，重组质粒pSMK-VP2双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为重组质粒pSMK-VP2。
所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将重组质粒pSMK-VP2转化大肠杆菌并诱导表达得到VLPs具体为：
1)将测序结果正确的阳性质粒转化入DE3-RIL感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μL均匀涂布于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的双抗性固体LB平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h；
2)挑取单个菌落于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1：100的接种量转接于含50mg/mL卡那霉素和34mg/mL氯霉素的LB液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液OD600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.6mM，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀；
用10-20mL冰浴处理的缓冲液A重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞；4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液；His-SUMO-VP2蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液A预平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，4℃条件下结合1h，轻摇确保树脂与靶蛋白结合；上清液过滤两次，然后用缓冲液A洗涤蛋白，接着用缓冲液A与缓冲液B按19∶1，9∶1配成不同浓度的咪唑浓度洗脱杂蛋白，最后使用缓冲液B洗脱目的蛋白，每次洗脱1mL，其中，缓冲液A的pH 8.0，由20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5mM Imidazol，0.1％Triton-100，2mM DTT组成；缓冲液B的pH8.0，由50mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mMImidazol组成。
一种如上所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其中，
封闭液为10％牛奶；
酶标板的制备：
将VLPs按包被量为每孔0.5ug/mL均匀的包被在酶标板孔上，37℃1h+4℃过夜；然后每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔加入100μL的10％牛奶37℃封闭1h；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗猪IgG酶结合物；
所述样品稀释液为含有体积浓度0.1％Tween-20的0.01mol/L及pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液；
浓缩洗涤液通过在1000mL的0.01M磷酸盐缓冲液中加1mL Tween-20制得；
酶底物溶液为四甲基联苯胺溶液；
终止液：取54.34mL浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至1000mL制得2N H2SO4。
一种如上所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒的应用，其中，所述猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒应用于血清中猪细小病毒的抗体水平检测。
所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒的应用，其中，所述猪细小病毒VLPsELISA抗体检测试剂盒的操作步骤如下：
将待检测样本用样本稀释液1∶200稀释，每孔加100μL，，同时加入阳性和阴性对照液，置于37℃孵育1h，每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔按1∶3000加入酶标二抗100μL，置于37℃孵育1h；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔50μL，37℃避光显色15min，加入终止液50μL，。利用酶标仪在450nm测定光吸收值OD450；
当血清OD450值大于0.36时，判定为阳性；血清OD450值小于0.31时，判定为阴性；血清OD450值介于0.31-0.36之间时，判定为可疑。
本发明的有益效果：
本发明首次用猪细小病毒的病毒样颗粒作为包被抗原，建立了可检测猪细小病毒的试剂盒，可对血清中的猪细小病毒的抗体水平进行快速检测；
本发明敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。可应用于猪细小病毒的抗体水平监测，了解整个猪群猪细小病毒病抗体的状况；
本发明采用的病毒样颗粒对操作者和环境安全无害、无传染性；
本发明应用大肠杆菌表达系统具有经济、廉价的优点。
附图说明
图1为本发明具体实施例中对表达的猪细小病毒VLPs的SDS-PAGE检测结果图。
图2为本发明具体实施例中对表达的猪细小病毒VLPs的Western blotting检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明提供一种用于检测猪细小病毒抗体的ELISA检测试剂盒，同时提供这种病毒样颗粒的制备方法及ELISA检测试剂盒的制备和使用方法。
本发明的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，包括预包被猪细小病毒VLPs的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
其中、猪细小病毒VLPs的制备步骤如下：
1、PPV主要免疫性基因VP2的人工修饰合成
基于已公布的PPV毒株结构蛋白VP2基因序列(GenBank登录号：AY459350.1)，根据大肠杆菌密码子偏爱性，对PPV-VP2基因序列(1757bp)进行密码子优化合成，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。含有pUC-VP2质粒的甘油菌由金斯瑞生物科技有限公司制备。
2、重组质粒pSMK-VP2的构建合成目的质粒
a.pUC-VP2的抽提
将含有pUC-VP2质粒的甘油菌液以1：100接种于5mL含Amp(100mg/L)的新鲜LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，然后提取质粒。
b.载体及目的片段的酶切
将pUC-VP2质粒和pSMK载体质粒按照如下酶切体系进行酶切：pUC-VP2质粒35μL，Bsa I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 5μL。将pSMK载体质粒按照以下体系进行酶切：pSMK质粒35μL，Bsa I 2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O7.5μL。上述酶切体系在37℃条件下水浴3h，使用10g/L琼脂糖凝胶电泳确认pUC-VP2质粒和pSMK载体质粒切开后。采用TransGen公司EasyPureQuick Gel Extraction kit回收基因VP2目的片段和pSMK表达载体。
c.连接反应
将VP2目的片段和pSMK表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接。反应体系为：目的片段4μL、载体1μL、5μL Solution I，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接。
d.转化Trans5a克隆菌
(1)将5μL连接产物加入100μL Trans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min。
(2)42℃热激90s后，立即冰浴3min。
(3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h。
(4)离心机4500rpm离心3min。
(5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有卡那霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上。
(6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。
e.重组质粒pSMK-VP2鉴定
用无菌枪尖或接种针挑取生长在LB平皿上大小均匀的单一菌落接种于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中并进行编号，37℃、220rpm振荡培养16h。将不同编号过夜培养后的菌液接种于10μL PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定。将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应编号扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定。双酶切体系如下：pSMK-VP2重组质粒6μL，Xba I 1.5μL，Xho I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h。重组质粒pSMK-VP2双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为pSMK-VP2。
f.重组质粒转化RIL(DE3)感受态细胞
将测序结果正确的阳性质粒按步骤d的方法转化入RIL(DE3)感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μL均匀涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)双抗性的固体LB平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h。
g.VP2的表达以及纯化
挑取单个菌落于含有卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1∶100的接种量转接于含卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(34mg/mL)的LB液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液OD600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀。用10～20mL(50～100倍浓缩菌液)冰浴处理的缓冲液A(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5mMImidazol，0.1％Triton-100，2mM DTT，pH 8.0)重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞(超声时间3s，间隔时间3s，共6min，功率200W)。4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液。His-SUMO-VP2蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液A预平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，4℃条件下结合1h左右，轻轻摇动确保树脂与靶蛋白充分结合。上清液过滤两次，然后用缓冲液A洗涤蛋白，接着用缓冲液A与缓冲液B(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mM Imidazol，pH8.0)按19∶1，9∶1配成不同浓度的咪唑浓度洗脱杂蛋白，最后使用缓冲液B洗脱目的蛋白，每次洗脱1mL，然后通过SDS-PAGE鉴定目的蛋白的纯化效果，结果如图1所示，其中，图中数字1对应条带：沉淀；数字2-5对应条带：洗液；数字6-7对应条带：洗脱液；数字8对应条带：蛋白标准分子量；(箭头所指为目标蛋白)
通过Western blotting鉴定目的蛋白的免疫原性，结果如图2所示，其中，图中数字1对应条带：纯化的His-SUMO-VP2蛋白；数字2对应条带：切除His-SUMO标签后的VP2蛋白。
3、猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒的制备
1)ELISA方法的建立及条件优化：
a.应用Bradford蛋白定量试剂盒检测浓缩蛋白的浓度：
首先将标准品BSA稀释为0、1、2、3、4、6、8、10μg/μL，每孔加入100μL，混匀后室温放置5-10min。用酶标仪测定595nm的吸光值，绘制标准曲线。然后将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，测定样品吸收值OD595。
b.ELISA方法的建立及条件优化过程：
抗原包被量及一抗稀释度的优化：
用0.05％pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将定量的PPVVLPs稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2μg/mL，一抗阴、阳性血清稀释为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，经方阵法在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定抗原最佳包被量为0.5μg/mL，一抗最佳稀释度为1∶200。
抗原最佳包被时间的优化：
将抗原用最佳包被量分别于37℃2h+4℃过夜、37℃1h+4℃过夜、4℃过夜包被酶标板，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定抗原最佳包被时间37℃1h+4℃过夜。
封闭剂的优化：
用5％牛奶(milk)+5％小牛血清、5％milk+0.5％BSA、5％milk、10％milk、5％小牛血清、10％小牛血清、0.5％BSA和1％BSA对包被的酶标板分解进行封闭，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定最佳封闭剂为10％milk。
封闭时间的优化：
用最佳封闭剂对包被好的酶标板分别封闭37℃2h、37℃1h、37℃2h+4℃过夜、37℃1h+4℃过夜，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定最佳封闭时间为37℃1h。
一抗作用时间的优化：
将阴、阳性对照血清分别按最佳浓度稀释后，37℃分别作用30、45、60、90min，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定最佳一抗作用时间为30min。
二抗最佳稀释度的优化：
将HRP标记的二抗作1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000稀释，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定二抗最佳稀释度为1∶3000。
二抗作用时间的优化：
将最佳稀释度的酶标二抗37℃分别作用15、30、45、60、90min，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定二抗最佳作用时间为30min。
显色时间的确定：
将TMB溶液在其他条件相同的情况下，加入反应体系，分别在37℃条件下避光显色5、10、15、30、60min，根据P/N值确定最佳显色时间为15min。
c.ELISA方法阴阳性判定标准的建立：
用建立的ELISA方法对30份阴性猪血清分别检测3次，计算出阴性血清OD450值的平均值和标准差。得到血清OD450值大于0.36时，可判定为阳性；血清OD450值小于0.31时，可判定为阴性的判定标准。
d.交叉反应试验：
用包被好的酶标板同时检测猪细小病毒、猪圆环病毒1型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒阳性血清，分析本方法与其他的猪病毒没有交叉反应。
e.敏感性、特异性和符合率分析：
用建立的ELISA方法检测50份不同抗体效价的血清样本，与荷兰赛迪公司生产的猪细小病毒抗体ELISA检测试剂盒的检测结果相比，其敏感性为96％、特异性为98％、符合率为97.56％。
f.批内、批间重复性试验：
分别用同一批次组建的试剂盒和3个不同批次组建的试剂盒检测同样的10份血清，根据计算的标准差和变异系数，结果显示其变异系数分别小于15％、20％，表明本试剂盒具有很好的可重复性。
2)酶标板的制备：
将VLPs按包被量为每孔0.5ug/mL均匀的包被在酶标板孔上，37℃1h+4℃过夜；然后每孔加入300μg/mL洗涤液洗板3次，甩干，每孔加入100μg/mL的10％milk 37℃封闭1h。包被缓冲液为0.05M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液，即1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3；
3)获得辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG酶结合物：
本发明中使用的辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG酶结合物购自SIGMA公司。
4)试剂盒其他溶液配制：
①样品稀释液：含有体积浓度0.1％Tween-20的0.01mol/L及pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液：在1000mL的0.01M PBS溶液中加1mL Tween-20；③酶底物：四甲基联苯胺溶液；④终止液：取54.34mL浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至1000mL即可得2N H2SO4。
3.猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤：
1)操作过程：
将待检测样本用样本稀释液1∶200稀释，每孔加100μL，同时加入阳性和阴性对照液，每孔建议设置2孔。置于37℃孵育1h，每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔按1∶3000加入酶标二抗100μL，置于37℃孵育1h；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔50μL，37℃避光显色15min，加入终止液50μL。利用酶标仪在450nm测定光吸收值OD450。
2)结果判定：
当血清OD450值大于0.36时，可判定为阳性；血清OD450值小于0.31时，可判定为阴性；血清OD450值介于0.31、0.36之间时，可判定为可疑。
本发明具有如下优点：
本发明首次用猪细小病毒的病毒样颗粒作为包被抗原，建立了可检测猪细小病毒的试剂盒，可对血清中的猪细小病毒的抗体水平进行快速检测；
本发明敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。可应用于猪细小病毒的抗体水平监测，了解整个猪群猪细小病毒病抗体的状况。
本发明采用的病毒样颗粒对操作者和环境安全无害、无传染性。
本发明应用大肠杆菌表达系统具有经济、廉价的优点。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种猪细小病毒VLPs的重组蛋白，其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸。
2.如权利要求1所示的猪细小病毒VLPs的重组蛋白，其是对猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，并基于优化后基因序列制备pUC-VP2重组质粒，利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2；将重组质粒pSMK-VP2转化大肠杆菌并诱导表达得到重组蛋白VLPs。
3.权利要求1或2所示的重组蛋白在制备猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
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