CN105158464A - 诺如病毒抗体eilisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，属于生物医药技术领域。该试剂盒包括重组诺如病毒VLPs作为抗原包被的酶标板。本发明制得的诺如病毒检测试剂盒特异性好，灵敏度高，耗时短，使用成本低且操作简便，对待检样品纯度要求低，特别适用于诺如病毒感染的临床检测。

Description

诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒。

背景技术

诺如病毒（诺瓦克病毒）是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的代表株。诺如病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻患者粪便中分离得到。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒。诺如病毒(Norovirus)是导致急性胃肠炎最主要的病原之一。诺如病毒在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，但每年10月到次年3月是暴发流行的高发季，老年人和学龄儿童为易感人群。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，亦可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，因此常在学校、医院、托儿所、孤老院等人群密集处，尤其是学校引起集体暴发。感染症状为恶心、呕吐、腹部痉挛性腹泻，儿童患者呕吐为多，成人患者普遍表现为腹泻，一般在感染病毒后12-48小时出现症状，症状通常持续1-2天。据统计,在我国仅在2014年2月至2015年7月间，北京、上海、浙江、广东等地区先后暴发超过7起诺如病毒疫情。

诺如病毒直径约26-35nm，无包膜；其基因组为单股正链RNA,全长约7.7kb，包含3个开放阅读框。ORF1编码RNA聚合酶等非结构蛋白；ORF2编码主要衣壳蛋白VP1，ORF3编码次要衣壳蛋白VP2。VP1蛋白结构上可分为S和P区两个相邻的区域，P区可进一步分为P1和P2两个亚区，其中S区形成内壳，P区形成拱样结构突出于内壳外P2位于VP1的最外层，高度变异，目前被认为是免疫识别和受体结合的关键部位。根据VP1序列的同源性，诺如病毒可分为GI，GII，GIII，GIV，GV五个基因群，其中GI和GII群是引起人类感染的主要基因群。基因群可进一步分为不同的基因型，其中GII群中的第4基因型GII.4一直是世界范围内最主要的流行株。

目前主要采用real-timeRT-PCR检测诺如病毒。real-timeRT-PCR法能够准确检出标本中的诺如病毒，并且可以进一步对病毒进行基因型的研究，但real-timeRT-PCR检测诺如病毒存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此往往需要富集浓缩病毒，样品浓缩后的病毒回收率和核酸提取的完整程度及纯度会对检测结果影响很大，且real-timeRT-PCR所需的实时荧光定量PCR仪价格昂贵，难以普及。而酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，检测时仅需一台普通酶标仪，是可广泛推广的检测方法。因此，本发明中的诺如病毒抗体ELISA试剂盒就是为了解决这一问题。

发明内容

针对现有诺如病毒检测技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒及其制备方法、应用的技术方案。

所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于包括重组诺如病毒VLPs作为抗原包被的酶标板。

所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于所述的重组诺如病毒VLPs通过以下步骤得到：

1）用引物NoV-1F和NoV-1R对诺如病毒基因组RNA扩增得到诺如病毒ORF2阅读框，所述的NoV-1F序列如SEQIDNO.3所示，所述的NoV-1R序列如SEQIDNO.4所示；

2）用引物NoV-2F和NoV-2R对诺如病毒ORF2阅读框扩增得到诺如病毒衣壳蛋白编码序列，并将该诺如病毒衣壳蛋白编码序列用同源重组的方法连接至pFastBac1载体获得pFastBac1-Nov，所述的NoV-2F序列如SEQIDNO.5所示，所述的NoV-2R序列如SEQIDNO.6所示；

3）用pFastBac1-Nov质粒转化DH10Bac菌株转座获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov；

4）用重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，然后用重组杆状病毒感染Sf9细胞并收获重组诺如病毒VLPs。

所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用pH=7.2的PBS缓冲液将重组诺如病毒VLPs稀释至3μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；

2）用PBST洗液洗涤3次，用封闭液37℃湿盒封闭1h,PBST洗液洗涤3次,干燥后即为反应板。

所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒在诺如病毒检测中的应用。

利用所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒检测诺如病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用pH=7.2的PBS缓冲液将VLPs稀释至3μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；

2）向上述已包被抗原的孔中加入一定稀释的代检样品0.1mL，置37℃孵育1h，洗涤，同时做空白，阴性，阳性对照；

3）于反应孔中加入新鲜的酶标二抗0.1mL，37℃孵育1h，洗涤；

4）于各反应孔中加入临时配置的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10-30min；

5）于各反应孔中加入2M硫酸0.05mL终止反应；

6）终止反应后30min内在酶标仪上，以空白对照孔调零后加测各孔450nm处读数，若大于规定的阴性对照孔OD值的2倍，即可判定为阳性。

本发明的诺如病毒检测试剂盒特异性好，灵敏度高，耗时短，使用成本低且操作简便，对待检样品纯度要求低，特别适用于诺如病毒感染的临床检测。

附图说明

图1为PCR扩增ORF2阅读框及T克隆的鉴定。图1中：泳道1：DNAmarkerDL5000，泳道2：诺如ORF2基因片段，泳道3：pCloneEZ空载体，泳道4：pCloneEZ-Nov。

图2为pFastBac1-Nov载体构建。图2中：泳道1：DNAmarkerDL10000,泳道2：引物P2扩增的VP1片段，泳道3：pFastBac1载体，泳道4：pFastBac1-Nov。

图3为蓝白斑筛选含重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov的菌株。

图4为凝胶电泳鉴定杆粒。图4中泳道1：DNAmarkerDL5000,泳道2：PCR扩增产物。

图5为重组杆状病毒感染症状。图5中：5(a)：未用重组杆状病毒感染的Sf9细胞对照，5(b)：重组杆状病毒感染的Sf9细胞。

图6为考马斯亮蓝染色凝胶。图6中：泳道1：Marker,泳道2:未用重组杆状病毒感染的Sf9细胞上清，泳道2:用重组杆状病毒感染的Sf9细胞上清。

图7为westernblot鉴定重组诺如Nov的表达。图7中：泳道1：未用重组杆状病毒感染的Sf9细胞上清，泳道2-5:用重组杆状病毒感染的Sf9细胞上清。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

材料和方法

1.基因，质粒，菌株和细胞

诺如病毒基因组RNA为本室从诺如病毒感染者粪便标本中提取，质粒pCloneEZ载体购自中美泰和公司，DH5α菌株购自日本Takara公司。Sf9细胞，pFastBac1载体购自Invotrogen公司，DH10Bac菌株购自上海超研公司。

2、主要试剂

高保真聚合酶购自fermentas；同源克隆试剂SeamLessAssemblyCloning购自中美泰和；CellfectII转染试剂，cDNA合成试剂盒，SF900IISFM培养液，Grace培养液,购自Invotrogen；质粒提取试剂盒购自Omega；诺如病毒VP1一抗（兔抗诺如病毒多克隆抗体），二抗（鼠抗兔）购自Abcam；CsCl购自上海生工公司；超滤管购自Millipore；BamHI和HindIII限制性内切酶购自NEB。

3.引物设计和合成

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物见表1。

表1.引物序列

注：W:A/T，NoV-2F,NoV-2R中加下划线序列为pFastBac1载体中的同源序列

实施例1：诺如病毒ORF2阅读框基因片段的扩增及T克隆的构建

1）用引物NoV-1F和NoV-1R扩增目的产物，PCR反应条件为：94℃，2min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min；

2）切胶回收目的片段；

3）将目的片段5μL，pCloneEZcloningvector1μL，10×Enhancer1μL,ddH2O3μL混匀；

4）取5μL转化DH5α，冰上孵育2min,42℃热休克30s，冰上孵育2min，直接取菌液涂布含氨苄的平板；

5）次日挑选单克隆，接种于LB培养基中，菌落PCR鉴定，抽取部分菌液送上海生工进行DNA测序。ORF2阅读框基因如SEQIDNO.1，T克隆构建如图1所示，ORF2阅读框基因编码的VLPs的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

实施例2：pFastBac1-Nov载体构建

1）依据测序结果利用DNAman找到ORF2阅读框；

2）然后利用Primer5程序，设计引物。于上游下游分别加入pFastBac1载体同源臂序列CCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCC和TCCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTT；

3）PCR获得诺如病毒VP1编码序列，PCR反应条件为：94℃，2min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min；

4）将PCR产物20ng和线性化载体pFastBac160ng,2×SeamLessMasterMix混匀，加水补足到10μL，50℃反应连接15min，置于冰上；

5）取5μL连接液加入50μL刚刚融化的DH5α感受态细胞，轻柔混匀，冰浴2-30min；

6）42℃热激30s；

7）立即放置于冰上2min；

8）加入500μL不含抗生素的SOC或LB培养液，37℃，250rpm震荡培养1h；

9）1000×g离心2min,弃200μL上清，剩余部分用移液器轻柔混匀后涂布含30ng/mL卡那霉素的平板,37℃培养过夜；

10）挑取菌落做PCR鉴定，阳性菌落测序验证，构建完成的pFastBac1-Nov载体鉴定如图2。

实施例3:DH10Bac感受态的制备

1）将DH10Bac涂布于含50μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素的LB平板，37℃培养过夜；

2）从平板上挑取一个单菌落，接种到3mL含50μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素的LB培养液中，37℃，250rpm培养菌液OD值至0.4时停止；

3）转接1mL至40mL含50μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素的LB培养液中，37℃，250rpm培养菌液OD值至0.4；

4）冰浴10min；

5）将菌液倒入预冷的50mL离心管中，4℃，4000rpm，离心5min；

6）弃上清，加入预冷的20mL的0.1M的CaCl2重悬，4℃，4000rpm，离心5min；

7）重复步骤6）；

8）加入2mL预冷的0.1M的CaCl2重悬，然后加入0.5mL预冷的甘油，每管100μL分装，保存于-80℃。

实施例4:转座获得含重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov的菌株

1）-80℃取出DH10Bac感受态冰上融化；

2）取1ngpFastBac1-Nov质粒加入到100μL感受态细胞中；

3）冰浴30min；

4）42℃热激60s；

5）加入900μLLB培养基混匀，37℃，200rpm震荡培养5h；

6）菌液涂布前2h用40μLX-Gal，4μLIPTG储液涂布平板；

7）吸取菌液涂布含50μg/mL卡那霉素，10μg/mL四环素，7μg/mL庆大霉素的平板；

8）48h后挑取白色菌落划线接种至新平板，再过48h，挑取白色菌落(图3)接种至5mLLB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL，庆大酶素7μg/mL，四环素10μg/mL)中培养并提取杆粒。

实施例5:重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov的提取及鉴定

1）将携带有重组杆粒的DH10Bac单菌落接种于5mLLB培养液(含卡那霉素50μg/mL，庆大酶素7μg/mL,四环素10μg/mL)中，37℃震荡培养12-16h；

2）取5mL的菌液，室温下10000×g离心1min收集细菌；

3）倒弃培养基。加入250μLSolutionI混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；

4）往重悬混和液中加入250μLSolutionII，轻轻颠倒混匀4-6次；

5）加入350μLSolutionIII，温和颠倒数次至形成白色絮狀沉淀；

6）于室温下12000×g离心10min；

7）小心转移上清至新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，12000×g离心10min；

8）弃上清，加入500μL的70%乙醇，12000g离心10min；

9）重复步骤8；

10）弃上清，开盖室温静置10min；

11）沿管壁缓慢加入50μL的ddH₂O，用200μL移液枪轻柔混匀杆粒悬液一次；

12）用Nanodrop测定杆粒浓度后将杆粒分装至200μL管于-80℃冻存待用；

13）以提取的杆粒为模板，用M13F(-40),M13R引物进行PCR反应，PCR反应条件为PCR反应条件为：94℃，2min；94℃，30s，58℃，4min，72℃，2min，35个循环；72℃，10min；

14）凝胶电泳及测序鉴定，凝胶电泳鉴定如图4。

实施例6：重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov转染Sf9细胞获得重组杆状病毒

1）用SF900IISFM（无血清，无抗生素）培养液接种8×106个Sf9细胞至6孔板，27℃静置0.5-1h；

2）用100μL无任何添加的SF900IISFM培养液稀释1μg的杆粒，轻柔混匀；

3）用100μg无任何添加的SF900IISFM培养液稀释8μLcellfectII转染试剂，轻柔混匀；

4）将步骤4中的悬液滴加到步骤3中的悬液中，轻柔混匀，室温静置30min；

5）将步骤5中的悬液逐滴滴加至6孔板中的细胞培养液中,混匀，置27℃培养。

实施例7：重组杆状病毒的扩增

1）实施例3中细胞转染后培养72h，收集上清液，800×g离心10min，弃沉淀，上清保存于4℃，此为P1代毒株；

2）取适量步骤1中的病毒上清加入到新的Sf9细胞培养孔中，观察细胞形态变化，待细胞出现感染症状后，收集上清液，800×g离心10min，弃沉淀，上清保存于4℃，此为P2代毒株；

3）取适量步骤1中的病毒上清加入到新的Sf9细胞培养孔中，观察细胞，待细胞出现感染症状（图5），收集上清液，800×g离心10min，弃沉淀，上清保存于4℃，此为P3毒株。

实施例8：重组诺如病毒VLPs的表达及鉴定

1）接种2×106Sf9细胞至6孔板中，培养24h；

2）接种20μL的P2病毒液至步骤1中的细胞培养液中；

3）27℃培养72h，收集细胞上清，离心弃沉淀，取上清保存于-80℃；

4）测定步骤2中的上清液中的蛋白浓度；

5）取步骤2中的上清液（蛋白含量20μg），与4×loadingbuffer,2μLDTT混匀；

6）100℃煮沸10min；

7）12%SDS-PAGE用恒压100V电泳120min；

8）用考马斯亮蓝染色凝胶鉴定目的蛋白的表达情况（图6）；

9）重复步骤1-7,然会进行westernblot鉴定目的蛋白的表达情况（图7）。

实施例9：重组诺如病毒VLPs的大量表达及纯化

1）用20mLSF900IISFM培养液稀释1×107个Sf9细胞并将其接种至100mL的锥形瓶中，27.5℃，115rpm培养24h；

2）测定细胞密度及活力，待细胞密度达到2×106cell/mL时，补加培养液，将细胞密度稀释至1×106cell/mL，并将细胞悬液转移至250mL的锥形瓶中27.5℃，115rpm继续培养；

3）以此类推，直至获得500mL密度为2×106cell/mL的Sf9细胞悬液；

4）用MOI=8的重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9细胞，27.5℃，115rpm悬浮培养7天；

5）800×g离心去除细胞及细胞碎片，取培养液上清，30%(W/V)蔗糖垫底，4℃，27000rpm，BeckmanSW40Ti转子离心2h,弃上清；

6）沉淀用1.36g/mL的CsCl重悬，蛋白悬液加入SW40Ti转子配套离心管中，蛋白悬液上端用矿物油覆盖，4℃，35000rpm，BeckmanSW40Ti转子离心18-24h，穿刺取出蛋白条带，westernblot确定目的条带；

7）目的蛋白用25kD的透析袋过夜透析；

8）目的蛋白用30kDa的Millipore超滤管4000×g离心15min超滤浓缩；

9）目的蛋白用10kDa的Millipore超滤管4000×g离心15min超滤浓缩，蛋白浓缩液-80℃保存待用。

实施例10：重组诺如VLPs制备诺如病毒检测试剂盒的方法

1）用pH=7.2的PBS缓冲液将VLPs稀释至3μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；

2）用PBST洗液洗涤3次，用封闭液37℃湿盒封闭1h,PBST洗液洗涤3次,干燥后即为反应板；

3）按照ELISA反应条件不断摸索并优化条件，确定试剂盒的灵敏性和特异性，并通过大量阴性样品检测确定试剂盒检测的临界值。通过不断优化制作成稳定的诺如病毒感染IgM和IgG抗体检测试剂盒。

实施例11、利用诺如病毒检测试剂盒检测诺如病毒

1）用pH=7.2的PBS缓冲液将VLPs稀释至3μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；

2）向上述已包被抗原的孔中加入一定稀释的代检样品0.1mL，置37℃孵育1h，洗涤，同时做空白，阴性，阳性对照；

3）于反应孔中加入新鲜的酶标二抗0.1mL，37℃孵育1h，洗涤；

4）于各反应孔中加入临时配置的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10-30min；

5）于各反应孔中加入2M硫酸0.05mL终止反应；

6）终止反应后30min内在酶标仪上，以空白对照孔调零后加测各孔450nm处读数，若大于规定的阴性对照孔OD值的2倍，即可判定为阳性。

SEQUENCELISTING

<110>杭州庆正鸿科技有限公司

<120>诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒

<130>11

<160>6

<170>PatentInversion3.3

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<211>1623

<212>DNA

<213>诺如病毒

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<213>诺如病毒

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<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

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<210>6

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

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Claims (5)

1.诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于包括重组诺如病毒VLPs作为抗原包被的酶标板。

2.如权利要求1所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于所述的重组诺如病毒VLPs通过以下步骤得到：

1）用引物NoV-1F和NoV-1R对诺如病毒基因组RNA扩增得到诺如病毒ORF2阅读框，所述的NoV-1F序列如SEQIDNO.3所示，所述的NoV-1R序列如SEQIDNO.4所示；

2）用引物NoV-2F和NoV-2R对诺如病毒ORF2阅读框扩增得到诺如病毒衣壳蛋白编码序列，并将该诺如病毒衣壳蛋白编码序列用同源重组的方法连接至pFastBac1载体获得pFastBac1-Nov，所述的NoV-2F序列如SEQIDNO.5所示，所述的NoV-2R序列如SEQIDNO.6所示；

3）用pFastBac1-Nov质粒转化DH10Bac菌株转座获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov；

4）用重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，然后用重组杆状病毒感染Sf9细胞并收获重组诺如病毒VLPs。

3.如权利要求2所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用pH=7.2的PBS缓冲液将重组诺如病毒VLPs稀释至3μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；

2）用PBST洗液洗涤3次，用封闭液37℃湿盒封闭1h，PBST洗液洗涤3次,干燥后即为反应板。

4.如权利要求2所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒在诺如病毒检测中的应用。

5.利用如权利要求2所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒检测诺如病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）用pH=7.2的PBS缓冲液将VLPs稀释至3μg/mL,包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；

2）向上述已包被抗原的孔中加入一定稀释的代检样品0.1mL，置37℃孵育1h，洗涤，同时做空白，阴性，阳性对照；

3）于反应孔中加入新鲜的酶标二抗0.1mL，37℃孵育1h，洗涤；

4）于各反应孔中加入临时配置的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10-30min；

5）于各反应孔中加入2M硫酸0.05mL终止反应；

6）终止反应后30min内在酶标仪上，以空白对照孔调零后加测各孔450nm处读数，若大于规定的阴性对照孔OD值的2倍，即可判定为阳性。