KR20130128348A - 비피막성 바이러스의 분리, 검출 방법 및 이와 박테리아의 분리, 측정 방법 및 장치 - Google Patents

비피막성 바이러스의 분리, 검출 방법 및 이와 박테리아의 분리, 측정 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저농도의 비피막성 바이러스를 분리 검출하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 하나의 장치나 칩에서 연속적으로 노로바이러스와 박테리아를 흡착 분리하여 측정하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 저농도로 존재하는 시료 내 비피막성 바이러스를 농축 및 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 방법 및 장치는 저농도로 존재하는 시료 내 노로바이러스와 박테리아를 하나의 장치에서 연속적으로 분리 농축할 수 있으며, 또한, 노로바이러스 핵산의 손실 없이 곧바로 증폭하여 측정의 감도를 효과적으로 높일 수 있다.
더 나아가, 본 발명에 의하면 박테리아와 노로바이러스의 분리, 농축, 용해, 증폭 및 검출을 하나의 장치나 칩에서 인시튜(in - situ)로 연속적으로 수행함으로써 공정을 단순화하였고, 또한 다중 측정(multi-sensing)이 가능하게 되었다.

Description

비피막성 바이러스의 분리, 검출 방법 및 이와 박테리아의 분리, 측정 방법 및 장치{Method for Separation and Detection of Non-enveloped Virus and Method and Device for Separation and Detection of Non-enveloped Virus and Bacteria}
본 발명은 저농도의 비피막성 바이러스를 분리 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 노로바이러스와 박테리아의 분리, 측정 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로 하나의 장치에서 연속적으로 노로바이러스와 박테리아를 흡착 분리하여 측정하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
미생물에 의한 식중독은 박테리아성 식중독과 바이러스성 식중독으로 분류되는데 박테리아성 식중독은 일정량(수백 이상) 이상의 균을 섭취 시 발병되며, 외부에서 증식이 가능하기 때문에 전파속도가 매우 빠르다. 그러나, 항생제 처방에 의해 일부 박테리아를 제외하고 완치율이 높으며 2차 감염의 위험이 없다.
바이러스성 식중독은 체외에서 증식이 불가능하여 전파속도는 비교적 느리나, 미량(10~100)의 개체로도 발병이 가능하며, 일반적인 치료법이나 백신이 없다. 또한 2차 감염을 방지하기 위해 환자가 완치하더라도 최소 3일에서 2주 가량은 지속적인 감시 또는 격리조치가 필요하다.
박테리아성 식중독과 바이러스 식중독은 치료 방법과 환자의 조치가 다르기 때문에, 환자의 발생시 그 원인을 신속하게 진단하는 것이 필요하나 두 원인의 식중독은 그 증상이 매우 유사하고, 감염 경로가 같아 구분이 않아 무분별한 항생제의 남용 및 2차 감염의 발병 등의 어려움을 겪고 있다. 그러므로 식중독 환자의 발생시 음식물이나 주변 환경에 대하여 그 원인을 신속하게 밝혀내는 것은 매우 중요한 일이다.
박테리아성 식중독의 원인균으로 가장 많이 알려진 것은 E. coli O157:H7으로 실제 박테리아성 식중독 발병사례 중 E. coli O157:H7이 원인균으로 밝혀진 것이 83.4%를 차지하고 있으며, 미국에서 매년 약 20,000명의 환자가 발생하며 210명 정도가 사망하는 것으로 추정된다(CDCP 추정치).
바이러스성 식중독의 원인균으로는 노로바이러스가 가장 많이 알려져 있다. 식중독을 일으키는 바이러스의 종류는 박테리아에 비해서 그 수가 적은데, 이중 겨울철에 발생하는 식중독에 대해서는 노로바이러스가 주요 원인으로 꼽히며, 또한 집단감염을 유발한다.
노로바이러스는 약 7.6kb 크기의 단일 양성가닥 RNA를 가지며 비피막성 바이러스로 외각에 세포막과 비슷한 인지질과 당단백질로 이루어진 외막이 없고 단백질만이 정이십면체 모양으로 유전자를 감싸고 있어 그 크기가 27~40nm로 매우 작다. 그러므로 바이러스 전체의 약 40%가 유전자에 해당하며 나머지 60%는 단백질로 이루어진 가장 간단한 형태를 취하고 있다.
노로바이러스의 capsid 단백질은 내부에 핵산을 보유하기 위하여 단백질과 단백질 사이의 교차 반응(cross linking)에 의해 단단하게 구조체를 형성하고 있다. 단백질과 단백질 사이의 고정화나 공유결합에 의해 단백질 접합체 구조의 화합과 해리에 의한 기능이 발휘되는 구조체에 의하여 노로바이러스의 외각의 성질은 일반적인 단백질의 성질과는 차이가 발생하기도 한다.
노로바이러스를 검측하는 방법으로는 항체 검사법이나 핵산 증폭방법이 있는데 대용량의 환경 시료 속에서 노로바이러스는 매우 극소량으로 존재하며, 10~100의 적은 개체만으로도 발병을 일으키는데 항체 검사법은 매우 극소량인 노로바이러스의 측정하는 것에 있어서 그 민감도가 충분하지 못하다.
핵산 증폭 방법은 현재까지 개발된 기술 중에서 가장 민감도가 뛰어난 기술 중에 하나로 손꼽히는 방법이지만 그러나 인체로 유입되는 대용량의 음식이나 음용수에 대하여 극소량 존재하는 노로바이러스를 측정하기 위해서는 노로바이러스의 농축 공정으로 민감도를 한층 증가시킬 방법이 필요하다.
많이 알려진 노로바이러스를 농축하는 방법으로는 물리적인 방법과 생물학적인 방법이 있다. 물리적인 방법으로는 원심분리 방법을 이용하여 바이러스를 적은 양의 부피에 농축하는 방법이 있고, 생물학적인 방법으로는 항체반응에 의해 노로바이러스를 고정하여 농축하는 방법이 있다.
원심분리법의 경우 바이러스의 크기가 매우 작아 10,000xg와 같이 높은 에너지를 소모하는 ultra-centrifuge를 사용하며 그 방법이 매우 번거롭기 때문에 소형화 및 간편화의 장점을 갖는 칩에서의 구현이 불가능하고, 항체 반응법에 의한 노로바이러스의 농축방법은 높은 가격의 항체 사용에 의해 경제적이지 못하며, 항체 고정에 의한 시간이 필요로 하여, 대용량에는 무리가 있다.
따라서, 노로바이러스와 같은 비피막성 바이러스를 고농도로 농축하여 이를 분리 검출하는 방법이 요구된다.
또한 시료(특히, 환경 샘플과 같은 대용량의 저농도 노로바이러스와 박테리아 시료)에서 노로바이러스와 박테리아를 연속적으로 분리 고정(흡착)할 수 있고, 더 나아가 세포 용해, 증폭(핵산 증폭) 및 검출이라는 일련의 프로세스를 단일 장치에서 고효율로 수행할 수 있는 방법 및 장치가 요구된다.
본 발명은 저농도의 비피막성 바이러스를 분리 검출하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 저농도의 박테리아와 노로바이러스를 연속적으로 분리 농축할 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명은 더 나아가 단일 장치에서 노로바이러스와 박테리아의 분리, 농축, 용해, 증폭 및 검출 작업을 모두 수행할 수 있는 방법 및 장치를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 완충용액을 사용하여 pH 7 이상으로 조절된 시료를 수접촉각이 60° 이하인 친수성 제 1 고체 표면에 접촉하는 단계; 및 상기 고체 표면에 흡착된 바이러스를 검출하는 단계;를 포함하는 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 완충용액을 사용하여 pH 7이상으로 조절된 시료를 제 1 고체 표면에 접촉하는 단계; 상기 제 1 고체 표면으로부터 유출되는 혼합용액을 pH 5이하로 조절한 후 수접촉각이 50° 이하인 친수성 제 2 고체 표면에 접촉하는 단계를 포함하되, 상기 제 1 고체 표면에는 노로바이러스가 흡착되고, 제 2 고체표면에는 박테리아가 흡착되는 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 노로바이러스와 박테리아를 분리 농축하는 단계; 상기 농축된 노로바이러스 및 박테리아를 세포 용해(lysis)시키는 단계; 및 상기 세포 용해물에 증폭 용액을 첨가하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 노로바이러스 및 박테리아 측정 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 시료주입부; 상기 시료로부터 노로바이러스를 흡착하는 제 1 챔버; 상기 제 1 챔버 후단에 위치하고, 시료의 pH를 조절하기 위한 제 1 완충액 주입부; 상기 제 1 챔버 후단에 위치하고, 완충액과 시료의 혼합용액으로부터 박테리아를 흡착하는 제 2 챔버; 및 상기 시료주입부, 상기 제 1 챔버 및 상기 제 2 챔버를 연결하여 시료가 이들을 경유하도록 하는 채널;을 포함하는 노로바이러스 및 박테리아 측정장치를 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 저농도로 존재하는 시료 내 비피막성 바이러스를 농축 및 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 방법 및 장치는 저농도로 존재하는 시료 내 노로바이러스와 박테리아를 하나의 장치에서 연속적으로 분리 농축할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 방법 및 장치는 농축 후 노로바이러스의 핵산의 손실 없이 곧바로 증폭하여 측정의 감도를 효과적으로 높일 수 있다.
더 나아가, 본 발명에 의하면 박테리아와 노로바이러스의 분리, 농축, 용해, 증폭 및 검출을 하나의 장치나 칩에서 인시튜(in - situ)로 연속적으로 수행함으로써 공정을 단순화하였고, 또한 다중 측정(multi-sensing)이 가능하게 되었다.
도 1은 노로바이러스의 흡착조건에 대한 실험결과이다.
도 2는 박테리아의 흡착조건에 대한 실험결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일구현예인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치의 평면도이다.
도 4는 본 발명의 일구현예인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치를 나타낸다.
도 5는 도 3의 장치에서 차단부를 추가한 노로바이러스 및 박테리아 측정장치를 나타낸다.
도 6은 제 1 챔버 및 제 2 챔버에 흡착된 노로바이러스, 박테리아, 단백질(BSA)의 흡착율을 나타낸다.
도 7은 실시예 2에서 노로바이러스만을 함유하고 있는 굴 용액과 굴 용액에 박테리아를 첨가하였을 경우의 흡착율을 나타낸다.
도 8은 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2의 측정감도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 pH에 따른 노로바이러스 농축을 보여주는 실시예 3의 실험 결과이다.
도 10은 수접촉각에 따른 노로바이러스의 농축을 보여주는 실시예 3의 실험 결과이다.
도 11은 노로바이러스의 신선도 상태에 따른 농축을 보여주는 실시예 3의 실험 결과이다.
도 12는 A형 간염 바이러스의 pH에 따른 농축을 보여주는 실시예 4의 실험 결과이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 완충용액을 사용하여 pH 7 이상으로 조절된 시료를 수접촉각이 60°이하인 친수성 제 1 고체 표면에 접촉하는 단계; 및 상기 고체 표면에 흡착된 바이러스를 검출하는 단계;를 포함하는 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 발명자들은, 종래 배양이 어려워 분리 검출하기 어려웠던 비피막성 바이러스의 검출 방법에 대해 연구하던 중, 비피막성 바이러스의 고체 표면 흡착, 농축능이 고체의 수접촉각과 시료의 수소이온농도에 의존적임을 확인하고, 비피막성 바이러스의 농축능이 우수한 조건을 최적화 한 후, 상기 농축 및 검출이 2시간 내에 우수하게 이루어짐을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 비피막성 바이러스(non-enveloped virus)는 피코나바이러스 과, (Picornaviridae ), 칼리시바이러스 과(Caliciviridae ), 레오바이러스 과(Reoviridae ) 및 아데노바이러스 과(Adenoviridae )로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 본 발명의 비피막성 바이러스는 피코나바이러스 과의 A형 간염 바이러스 또는 칼리시바이러스 과의 노로바이러스 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 시료는 비피막성 바이러스를 함유한 수계(aqueous) 시료로서 완충용액을 사용하여 pH를 7이상으로 조절한다. 상기 시료에는 단백질 등의 기타 성분들도 포함될 수 있다.
본 발명에 사용되는 완충 용액의 종류가 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 인산나트륨 트리스(tris) 완충액, 붕산염 완충액, 탄산염 완충액 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 비피막성 바이러스를 흡착하기 위해 상기 시료의 pH를 7이상, 바람직하게는 8~9로 조절한다. 비피막성 바이러스의 외각을 이루는 캡시드 단백질은 외부로부터 핵산을 안전하게 보관하기 위해서 단백질 구조체가 단단하게 접합(fold)되어 있다. 그러나, 상기 pH 범위(특히 강염기)에서 캡시드 단백질의 안정성이 떨어지게 되어 단백질 접합구조가 붕괴된다. 그 결과, 단백질 고유의 작용기가 돌출하게 되며, 단단한 외벽을 이루고 있던 단백질의 표면이 상대적으로 유연성을 가지게 되어 표면에 보다 유연하게 흡착될 수 있다.
이하의 실시예 3 및 실시예 4를 참조하면, 비피막성 바이러스인 노로바이러스 및 A형 간염 바이러스는 시료 내 pH가 증가함에 따라 흡착능이 증가함을 알 수 있었으며, 노로바이러스의 경우 고체 표면의 수접촉각이 60°이하인 경우 흡착능이 증가함을 알 수 있었다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 제 1 고체 표면은 챔버 내에 충진된 비드 또는 단일체 와이어의 표면일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용가능한 비드는 구, 타원, 디스크 또는 다각 형상을 갖는 복수의 비드, 또는 단일체 와이어(예를 들면, 나선형 구조)일 수 있으나, 특정 형상의 충진 구조물로 반드시 한정되는 것은 아니다.
상기 챔버의 구조나 형상도 반드시 한정된 것은 아니다. 예를 들면, 상측 단부에 유입구, 그리고 하측 단부에 배출구를 구비한 튜브 타입의 챔버를 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 코니컬 형상의 단일 튜브 타입의 챔버를 사용할 수 있다.
한편, 상기 제 1 고체 표면은 챔버 내의 바닥면에 형성된 복수개의 돌출부의 표면일 수 있다. 좀 더 구체적으로, 본 발명에서는 챔버 내에 기둥형상의 돌출부를 다수 구비할 수 있다. 시료가 챔버내에 유입되어 돌출부의 표면에 접촉하게 되고, 상기 돌출부 표면에 비피막성 바이러스가 흡착된다.
앞에서 상술한 바와 같이 본 발명의 고체 표면에서 고체는 비피막성 바이러스가 대부분 흡착되는 비드, 와이어, 돌출부 등의 구조물을 나타내는 것으로 이해할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 비피막성 바이러스는 친수성인 제 1 고체 표면에 흡착되며, 이때 고체 표면은 수접촉각이 60°이하인 친수성일 수 있다.
또한, 상기 제 1 고체 표면의 재질은 글래스, 실리콘 웨이퍼, 실리카, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 폴리디메틸실록산일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 재질의 표면에 친수화 처리를 수행함으로써 수접촉각을 60°이하로 낮출 수 있다. 이러한 친수화 처리 물질로서 TEOS(테트라에톡시 실란)를 비롯하여 APTS(3-아미노프로필트리에톡시 실란), HMTS(하이드록시메틸트리메톡시실란), CETES(카르복시메틸티오에틸트리메틸 실란), n-부틸트리메톡시 실란(n-Butyltrimethoxy silane), n-옥틸트리메톡시 실란(n-Octyltrimethoxy silane) 등과 같은 아민기, 히드록시기 또는 카르복실기를 갖는 실란계열 화합물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 TEOS를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 고체 표면에 흡착된 바이러스를 검출하는 단계는 흡착된 바이러스의 핵산을 증폭하여 검출하는 방법 또는 항원-항체 반응으로 검출하는 방법이 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
흡착된 바이러스의 핵산을 증폭하여 검출하는 방법은, 바이러스의 추출된 핵산을 PCR 또는 NASBA법을 통해 증폭하고, 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브 등의 형광을 이용하여 검출하는 방법이 수행될 수 있다. 이는 이하 더욱 자세히 설명한다.
항원-항체 반응으로 검출하는 방법은, 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 항원-항체 반응에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 본 발명의 비피막성 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있다. 이를 위해, 비피막성 바이러스의 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액을포함하는 키트가 사용될 수 있다.
상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충용액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.
세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다
또한 본 발명은 노로바이러스와 박테리아를 포함하는 시료를 제 1고체 표면에 접촉하는 단계 및 제 2 고체표면에 접촉하여 노로바이러스 및 박테리아를 분리 농축하는 방법을 제공한다.
제 1 고체표면에 접촉하는 단계
상기 단계는 완충용액을 사용하여 pH 7이상으로 조절된 시료를 제 1 고체 표면에 접촉하여 노로바이러스를 흡착하는 단계이다.
본 발명에서 사용되는 시료는 노로바이러스와 박테리리아를 함유한 수계(aqueous) 시료로서 완충용액을 사용하여 pH를 7이상으로 조절한다. 상기 시료에는 단백질 등의 기타 성분들도 포함될 수 있다.
본 발명에 사용되는 완충 용액의 종류가 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 인산나트륨 트리스(tris) 완충액, 붕산염 완충액, 탄산염 완충액 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 노로바이러스를 흡착하기 위해 상기 시료의 pH를 7이상, 바람직하게는 8~9로 조절한다. 노로바이러스의 외각을 이루는 캡시드 단백질은 외부로부터 핵산을 안전하게 보관하기 위해서 단백질 구조체가 단단하게 접합(fold)되어 있다. 그러나, 상기 pH 범위(특히 강염기)에서 캡시드 단백질의 안정성이 떨어지게 되어 단백질 접합구조가 붕괴된다. 그 결과, 단백질 고유의 작용기가 돌출하게 되며, 단단한 외벽을 이루고 있던 단백질의 표면이 상대적으로 유연성을 가지게 되어 표면에 보다 유연하게 흡착될 수 있다.
도 1은 노로바이러스의 흡착조건에 대한 실험결과이다. 도 1을 참고하면, 노로바이러스는 pH 변화에 가장 민감함을 확인할 수 있다. 그 외 염(salt로서 SO4 사용), 첨가제(PEG)에는 변화가 없거나 오히려 흡착율이 감소한다.
본 발명에서는 노로바이러스를 흡착하기 위해 특정 염(예를 들면, 코스트로픽 염)이나, 첨가제(예를 들면 에틸렌글리콜 등)를 추가로 사용하지 않는다. 예를 들면, 코스모트로픽 염인 SO4는 일반적으로 단백질의 변성을 막아 안정성을 높이는 동시에 단백질의 용해도를 낮추어 단백질의 응집을 유도하여 염석 효과를 발생시킨다. 그러나, 노로바이러스의 외각을 이루는 캡시드 단백질은 용해도가 매우 낮아 스스로 안정성을 유지할 수 있으므로, 단백질의 용해도를 낮추어 단백질간의 응집을 유도하는 코스모트로픽 염을 굳이 사용할 필요가 없기 때문이다.
상기 제 1 고체 표면은 챔버 내에 충진된 비드 또는 단일체 와이어의 표면일 수 있다. 본 발명에 사용가능한 비드는 구, 타원, 디스크 또는 다각 형상을 갖는 복수의 비드, 또는 단일체 와이어(예를 들면, 나선형 구조)일 수 있으나, 특정 형상의 충진 구조물로 반드시 한정되는 것은 아니다.
상기 챔버의 구조나 형상도 반드시 한정된 것은 아니다. 예를 들면, 상측 단부에 유입구, 그리고 하측 단부에 배출구를 구비한 튜브 타입의 챔버를 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 코니컬 형상의 단일 튜브 타입의 챔버를 사용할 수 있다.
한편, 상기 제 1 고체 표면은 챔버 내의 바닥면에 형성된 복수개의 돌출부의 표면일 수 있다. 좀 더 구체적으로, 본 발명에서는 챔버 내에 기둥형상의 돌출부를 다수 구비할 수 있다. 시료가 챔버내에 유입되어 돌출부의 표면에 접촉하게 되고, 상기 돌출부 표면에 노로바이러스가 흡착된다.
앞에서 상술한 바와 같이 본 발명의 고체 표면에서 고체는 노로바이러스나 박테리아가 대부분 흡착되는 비드, 와이어, 돌출부 등의 구조물을 나타내는 것으로 이해할 수 있다.
상기 시료는 앞에서 상술한 바와 같이 비드 또는 돌출부의 고체표면에 흡착될 수 있는데, 이 경우 시료는 약 10 ㎖/min 정도의 높은 로딩 유속(loading flow rate)에서도 적용 가능한 바, 이때 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 10 ㎖/min, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 2 ㎖/min의 로딩 유속으로 조절할 수 있다. 따라서, 대용량의 시료 농축에 유리할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 고체 표면적(예를 들면, 충진된 구조물이나 돌출부의 전체 표면적)이 증가할수록 농축에 유리할 수는 있으나, 후속 단계, 예를 들면 핵산 증폭 과정 등을 고려하면 바람직하게는 약 10 내지 500 ㎟, 10 내지 300 ㎟ 또는 10 내지 150 ㎟, 보다 바람직하게는 약 50 내지 100㎟ 범위일 수 있다. 상기 수치 범위는 예시적 목적으로 제시되는 것으로서, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
제 2 고체 표면에 접촉하는 단계
상기 단계는 제 1 고체 표면으로부터 유출되는 시료를 pH 5이하로 조절한 후 수접촉각이 50°이하인 친수성 고체 표면에 접촉하는 단계이다. 상기 단계에 의해 제 2 고체 표면에 박테리아가 흡착된다.
상기 제 2 고체 표면은 앞에서 상술한 제 1 고체 표면과 같이 챔버 내에 충진된 비드 또는 단일체 와이어의 표면이거나, 챔버 내의 바닥면에 형성된 복수개의 돌출부의 표면일 수 있다.
도 2는 박테리아의 흡착조건에 대한 실험결과를 나타낸다. 도 2를 참조하면, 박테리아의 흡착은 pH, PEG, 수접촉각(surface) 및 고체 표면적에 의존한다. 다만, 코스트로픽 염, 예를 들면 Na2SO4을 첨가하는 경우에 박테리아의 흡착율은 크게 변화하지 않는다.
본 발명의 구현예에 따르면, 시료 내 박테리아는 친수성 제 2 고체 표면 상에 고정(흡착)되는 바, 이때 "친수성"의 정도는 수접촉각으로 정량화할 수 있다. 즉, "수접촉각"은 액체(물)가 고체 표면 상에서 열역학적으로 평형을 이루는 경우에 고체 표면과 액체 표면이 형성하는 각으로 정의할 수 있다. 고체 표면의 특성에 따라 접촉각이 변화하며, 측정된 접촉각으로부터 친수성의 정도를 확인할 수 있다. 예를 들면, 고체 표면의 친수성이 증가할수록 고-액 계면 에너지가 작아 수접촉각이 감소하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 제 2 고체 표면의 수접촉각은 약 50° 이하, 보다 바람직하게는 약 30° 미만일 수 있다. 수접촉각이 증가할수록 친수성이 낮아지므로 소수성 상호작용에 의한 박테리아의 흡착 메커니즘은 감소하게 된다.
제 2 고체 표면의 친수성이 증가할수록 보다 많은 박테리아가 흡착하게 되는데, 세포와 고체 표면의 소수성(hydrophobicity)이 부착 프로세스 중 초기의 비특이적(non-specific) 상호작용을 지배하는 주요 파라미터로 작용하는 것으로 판단된다. 따라서, 1차적으로는 박테리아 세포와 고체 표면 간의 상호 작용에 관계되는 힘을 증가시킬 필요가 있는데, 이는 고농도의 박테리아 시료에 대한 실험에 의하여 뒷받침된다. 그러나, 저농도 박테리아 시료의 경우, 고농도 시료에서의 흡착 거동과는 구별되는바, 특히 단순히 고체 표면의 친수성을 증가시키는 것만으로는 박테리아를 효과적으로 흡착할 수 없다.
본 발명에서 박테리아는 친수성 고체 표면에 흡착되는데, 이때 주목할 점은 박테리아가 응집 또는 군집된 상태(aggregation) 또는 클러스터링된 상태(clustering)로 흡착된다는 것이다. 특히, 단일 개체보다는 박테리아 간의 응집물이 친수성 표면에 더욱 상호작용하는 것으로 판단된다. 이러한 현상에 대한 근거는 명확하지는 않지만 박테리아가 친수성 표면에 흡착되기에 앞서 산성 조건 하에서 응집되거나, 또는 박테리아는 친수성 표면에 예상치 않게 흡착된 다른 박테리아에만 흡착할 수 있다는 원리로 설명될 수 있다.
본 발명에서는 앞에서 설명한 바와 같이 박테리아 간의 응집물이 친수성 표면에 더욱 잘 흡착된다는 점에 착안하여 시료의 pH를 약 5 이하, 바람직하게는 약 3 내지 5의 범위로 조절할 수 있다.
더 나아가, 친수성 고체 표면, 특히 TEOS로 개질되거나, 실리콘 웨이퍼(silicon wafer), 글래스(glass) 재질 등으로 이루어진 고체 표면은 실란올기(Si-OH)를 갖는데, 이와 같이 표면에 존재하는 히드록시기(OH-)는 수소이온농도가 높아짐에 따라(즉, 산성 조건 하에서) 수소 이온과 OH-가 결합하여 (-) 하전이 감소함으로써 흡착이 더욱 잘 일어날 수 있다.
한편, 상기 고체 표면(제 1 고체, 제 2 고체 표면)의 재질은 글래스, 실리콘 웨이퍼, 실리카, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 폴리디메틸실록산등의 플라스틱류가 사용될 수 있다. 본 발명에서는 상기 제 1 고체표면에 친수화 처리를 수행함으로써 수접촉각을 60° 이하로 낮출 수 있으며, 제 2 고체표면에 친수화 처리를 수행함으로써 수접촉각을 50° 이하로 낮출 수 있다. 이러한 친수화 처리 물질로서 TEOS(테트라에톡시 실란)를 비롯하여 APTS(3-아미노프로필트리에톡시 실란), HMTS(하이드록시메틸트리메톡시실란), CETES(카르복시메틸티오에틸트리메틸 실란), n-부틸트리메톡시 실란(n-Butyltrimethoxy silane), n-옥틸트리메톡시 실란(n-Octyltrimethoxy silane) 등과 같은 알킬기, 아민기, 히드록시기 또는 카르복실기를 갖는 실란계열 화합물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 TEOS를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 제 1 고체 표면으로부터 유출되는 시료에 폴리에틸렌글리콜을 더 첨가할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜은 친수성 물질에 대한 친화성(dipole)으로 인하여 세포에 흡착되어 박테리아 세포 간 응집을 더욱 촉진할 수 있는 것으로 판단된다. 좀 더 구체적으로, PEG는 물과의 뛰어난 친화성으로 수화에 의해서 흡착을 위한 표면을 순간적인 건조 상태로 만들어 박테리아와 표면과의 직접적인 상호작용을 유도하여 표면에 박테리아 흡착률을 증가시킨다. 이것은 PEG의 첨가에 의해서 흡착을 위한 표면적이 넓어지면서 기하급수적으로 흡착률이 증가한다. 상기 폴리에틸렌글리콜의 평균분자량(특히, Mw)은 약 10,000 이하, 바람직하게는 약 2,000 내지 10,000, 보다 바람직하게는 약 4,000 내지 10,000 범위일 수 있다. 이때, 폴리에틸렌글리콜의 농도는 바람직하게는 약 0.1 내지 15%(w/v), 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 10%(w/v) 범위일 수 있다.
다른 양상에서 본 발명은 상기 노로바이러스 및 박테리아를 분리 및 농축하는 단계 ; 상기 농축된 박테리아를 세포 용해(lysis)시키는 단계; 및 상기 세포 용해물에 증폭 용액을 첨가하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 분리 농축단계는 앞에서 상술한 내용을 참고할 수 있다.
제 1 및 제 2 고체 표면 상에 농축된 노로바이러스 및 박테리아는 후속 증폭 단계에 앞서 핵산 성분을 추출하기 위하여 세포 용해(cell lysis) 과정을 거치게 된다. 이러한 세포 용해 과정은 당업계에서 알려진 다양한 기계적(기계적 마찰이나 분쇄), 화학적(효소 이용), 레이저 방식(레이저빔을 이용한 열적, 화학적 용해), 초음파, 열적 용해, 고전압 이용 방법 등이 특별한 제한 없이 채택 가능하다. 이외에도, 이와 관련하여, 국내특허공개번호 제2010-27698호 등에 개시된 마이크로파에 의한 가열 방식 등도 이용 가능하며, 상기 선행문헌은 본 발명의 참고자료로서 포함된다.
본 발명에서는 농축된 박테리아를 별도의 단계, 예를 들면, 세척을 통한 박테리아 정제를 통하여 별도로 분리하는 단계를 거치지 않을 수 있다.
후술하는 바와 같이 인시츄(in-situ)로 하나의 장치에서 농축-세포 용해-증폭-검출을 일괄 수행하고자 할 경우, 농축된 박테리아에 대한 별도의 분리 단계를 거치지 않고도 간편하게 세포를 용해할 수 있는 히터를 이용한 직접가열, 또는 인덕션을 이용한 유도가열 방식을 사용하여 용해단계를 수행할 수 있다.
상술한 박테리아의 세포 용해 과정 이후에는 당업계에서 알려진 방법에 따라 추출된 핵산(DNA, RNA 등)에 대한 증폭 반응을 수행한다.
상기 방법 중 핵산, 특히 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)이라는 강력한 증폭기술에 의하여 측정의 감도를 높일 수 있어 널리 이용되고 있다. 일반적으로, PCR법은 체외에서 DNA 유전자 시료를 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 시료의 양 및 농도를 높이는 기술인데, 온도 조절이 매우 중요한 화학반응으로서, 대상 시료를 3가지 온도 프로파일(통상, 각각 53℃, 72℃ 및 92℃)로 반복하여 가열 및 냉각시키는 방법이다. 따라서, 신속한 온도 응답, 정확한 온도 및 균일한 온도 분포를 정밀하게 제어하는 것이 중요하다.
한편, DNA를 이용한 종래의 검출방법의 정확성에 한계가 존재할 수 있기 때문에, RNA, 특히 mRNA를 이용한 증폭 반응 역시 이용될 수 있다. 이와 관련하여, EP0 329822B1은 Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA)법 등의 RNA 등온 증폭(isothermal amplification) 방식을 개시하고 있는 바, 상기 증폭 방식은 통상 3가지 효소, 즉 RNase H, AMV 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 T7 RNA 폴리머라제가 사용된다. 또한, 전형적으로 약 41± 0.5℃의 등온 조건 하에서 증폭 반응이 수행된다. NASBA 방식의 세부 원리는 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있으며, 본 발명의 개시내용에 포함된다.
다만, NASBA법과 같이 RNA를 이용한 방법의 경우, 수질 시료뿐만 아니라 식품에서 살균 후, 감염성 병원체의 생존율 측정에도 사용하고 있을 뿐만 아니라, 병원체의 생존율을 확실하게 검증할 수 있고, 인체 감염 시에도, 박테리아 측정도 가능하므로 DNA를 대상으로 하는 PCR 법보다 유리하다. 특히, 복잡한 온도 컨트롤러를 요하지 않기 때문에, 간단한 장치 구성이 가능하므로 본 발명에서는 NASBA 법이 바람직하게 적용 가능하다.
한편, 상술한 바와 같이 증폭 산물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 검출(detection)될 수 있는데, 예를 들면 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent) 등을 이용할 수 있다. 그러나, 상기 방식은 증폭 반응의 결과를 확인하기 위하여 각 샘플에 대하여 검출 단계를 별도로 수행해야 하는 불편한 점이 있기 때문에 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브 등의 형광을 이용한 검출 방법을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 구체예에 있어서, 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브를 이용한 형광 검출 방식이 특히 유리한데, 이는 단일 챔버 내에서 샘플의 농축, 증폭 및 검출을 모두 수행할 수 있기 때문이다.
분자 비콘 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5’말단을 형광체(fluorescent dye)로, 3’말단을 소광제(quencher)로 결합시킨 것이다. 올리고뉴클레오타이드 스트랜드는 타겟서열에 상보적인 루프형 프로브 부분과 그 양쪽 끝에 5 내지 6개의 뉴클레오타이드의 자기상보(self-complementary) 영역으로 구성되는데, 타겟이 없을 경우에는 프로브의 상보부분이 인접된 머리핀 형태로 형광체와 소광제가 인접하여 강한 소광 효과를 나타낸다. 반면, 타겟과 반응하면 루프형의 배열이 펴지며 직선으로 되어 형광체와 소광제의 거리가 멀어지게 되어 형광이 관찰된다.
TaqMan 프로브의 경우, 5’말단은 형광체(FAM 등)로, 3’말단은 소광제(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 다만, 검출 특이성 면에서 분자 비콘을 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.
전술한 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용하는데, 이와 같이 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성한다. 즉, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가한다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있는 것이다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다. NASBA 방식을 예로 들면, 형광에 의한 검출 효과를 높이기 위하여, 예를 들면 증폭 용액 내의 프로브(특히, 분자 비콘 프로브)의 농도를 바람직하게는 약 10 내지 200 nM 범위 내에서 선정하고, 바람직하게는 약 90 분 내지 3 시간 범위에서 실험을 통하여 최적 반응 시간을 조절할 수 있다.
본 발명의 노로바이러스 및 박테리아 측정장치는 분리, 농축, 용해, 증폭 및 검출을 하나의 장치에서 연속적으로 수행할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일구현예인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치의 평면도이다. 도 4는 본 발명의 일구현예인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치를 나타낸다. 도 3 및 도 4를 참고하면, 본 발명의 측정장치(100)는 시료주입부(10), 제 1 챔버(20), 완충액 주입부(30), 제 2 챔버(40) 및 채널(50)을 포함한다.
상기 시료주입부(10), 제 1 챔버(20), 완충액 주입부(30), 제 2 챔버(40) 및 채널(50) 등이 글래스, 실리콘 웨이퍼, 실리카, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 폴리디메틸실록산등의 플라스틱류에 형성될 수 있다. 상기 측정장치(100)는 예를 들면, 사진제판(photolithography) 공정으로 만들어진 SU-8 마스터몰드(시료주입부, 챔버, 채널이 형성됨)에 PDMS(polydimethylsiloxane)(110)를 부어서 주조한 후 상기 PDMS(110)와 글래스(120)를 합지하여 형성할 수 있다.
상기 시료주입부(10)에는 노로바이러스와 박테리리아를 함유한 시료를 주입하거나 시료의 pH를 7이상으로 조절하는 완충용액을 시료와 함께 혼합하여 주입할 수 있다. 한편, 상기 완충용액은 별도의 완충액 주입부(60)를 통해 상기 장치에 주입할 수 있다. 상기 완충용액에 대해서는 앞에서 상술한 내용을 참고할 수 있다.
본 발명의 장치는 제 1 챔버 및 제 2 챔버를 구비한다. 앞에서 상술한 바와 같이 제 1 챔버는 노로바이러스를 흡착하고 제 2 챔버는 박테리아를 흡착한다. 상기 제 1 및 제 2 챔버(20, 40)는 그 바닥면에 형성된 복수개의 돌출부(21, 41)를 포함한다.
도 3 및 도 4를 참고하면, 상기 챔버에 유입된 시료가 돌출부와 충분히 접촉한 후 유출될 수 있도록 복수개의 돌출부를 챔버 내부에 형성한다. 상기 돌출부(21, 41)의 개수, 사이즈, 높이는 시료의 유량 등에 따라 변경될 수 있다. 상기 돌출부는 바람직하게는 시료가 충분히 접촉하고 유속을 크게 방해받지 않도록 기둥(pillar)형상인 것이 바람직하다.
상기 돌출부(21, 41)의 표면적은 바람직하게는 약 10 내지 500 ㎟, 10 내지 300 ㎟ 또는 10 내지 150 ㎟, 보다 바람직하게는 약 50 내지 100㎟ 범위일 수 있다.
한편, 앞에서 상술한 바와 같이 상기 제 1 챔버는 수접촉각이 60°이하로 친수화 처리되며, 제 2 챔버는 수접촉각이 50°이하로 친수화 처리될 수 있다.
상기 측정장치는 상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버에 증폭용액을 제공하는 증폭용액 공급부(70, 80)를 추가로 포함한다.
상기 채널(50)은 상기 시료주입부, 상기 제 1 챔버 및 상기 제 2 챔버를 연결하여 시료가 이들을 경유하도록 한다.
상기 채널(50)은 상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버 전단에 시료와 완충액을 혼합하는 곡선유로부(51)를 포함한다. 상기 곡선유로부(51)는 시료와 완충액의 혼합을 유도하도록 채널이 곡선으로 형성되거나 채널내에 시료의 흐름을 가로막는 구조물(52)을 구비하여 와류를 유도하는 구조일 수 있다.
상기 측정장치는 상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버에서의 시료나 증폭용액의 유출을 방지하기 위한 차단부(90)를 구비할 수 있다. 상기 차단부의 종류나 차단방법에 특별한 제한이 있는 것은 아니다.
도 5는 차단부(90)를 포함한 본 발명의 노로바이러스 및 박테리아 측정장치를 나타낸다. 도 3 및 도 5를 참고하면, PDMS(130)에 물(질소가스로 압력을 주어 밸브 채널 내부에 있는 액체가 밸브 역할)이 흐를수 있는 약 0.5~1mm 두께의 채널을 형성한 후 PDMS(110)과 글래스(120) 사이에 삽입한 후 합지하여 형성할 수 있다. 상기 차단부(90)의 채널은 그 양 단부가 챔버에 연결되는 채널(50, 70)에 겹치게 되는데, 상기 차단부(90)에 가스로 압력을 가하면 채널 내부 물의 압력에 의해 채널들이 겹치는 양 단부에서만 팽창되므로 챔버에 연결되는 채널(50, 70)을 차단할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다.
사용물질
Norovirus 는 연구를 위하여 질병관리본부(korea center for disease control and prevention)에서 지원받았으며, 환자번호 874, 875, 877에서 채취된 norovirus를 사용하였다.
E.coli O157:H7(ATCC 43895)는 American Type Culture Collection (Washington DC, USA)에서 구입하였다. 박테리아 및 노로바이러스의 농축량 측정은 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen, 네덜란드)와 iQTM SYBR Green Supermix (BIO-RAD, USA)를 이용한 rt-PCR을 사용하였다. NASBA 증폭은 NucliSensBasic Kit (Biomerieux, France)를 사용하였다.
Bovine Serum Albumin(BSA)와 buffer 제작을 위한 glycine, Tris-HCl과 흡착 최적화를 위한 물질로 사용된 PEG, Na2SO4는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
Tetraethoxysilane (TEOS), n-butyltriethoxysilane, (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trimethoxysilane (TDF)는 Gelest, Inc.(Morrisville, PA, USA)에서 구입하였으며, 직경 100㎛과 250㎛의 마이크로 bead는 Daehan scientifics (South Korea)에서 구입하였다.
Chip 제작을 위한 PDMS는 SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT (DOW CORNING, USA)에서 구입하였다.
측정장치의 제조
photolithography 공정으로 SU-8 마스터몰드에 시료주입부, 제 1 챔버, 제 2 챔버 및 채널을 형성하였다. 여기에 PDMS(polydimethylsiloxane)(110)를 부어서 주조하였다. 이어서, 같은 방법으로 SU-8 마스터몰드에 밸브 채널을 형성하여 PDMS를 부어 차단부(130)를 형성하였다. PDMS(110), 차단부(130), 글래스를 합치하여 본 발명의 측정장치를 제조하였다.
여기서, 제 1 챔버 및 제 2 챔버의 부피는 각각 10mm3, 챔버 내부에 형성된 돌출부의 총 표면적은 100mm2으로 하였다(돌출부는 각 챔버에 400개 형성).
상기 제 2 챔버에 TEOS 용액(99.99% 에탄올에 TEOS 0.5%(v/v), NH4OH 0.5% 함유)을 주입한 후 제 2 챔버 주변의 차단부를 가동한 다음, 상온에서 1시간 동안 PDMS를 개질시켰다. 이어서, TEOS 개질된 PDMS를 n-butyltriethoxysilane 용액(100mM, 95% 에탄올)으로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 세척 및 건조 후에 표면접촉각을 측정하였다(사용장치: PHX300, S.E.O, Korea).
흡착 조건 테스트를 위해 노로바이러스 및 E.coli O157를 포스페이트 버퍼(pH7, 10mM)에 spike하였다.
노로바이러스의 genomic RNA를 증폭하기 위한 primer를 디자인하고, primer에 의해 증폭될 target sequence를 ssDNA로 합성하였다. 노로바이러스에서 정제된 RNA를 cDNA를 합성 후 rt-PCR을 하였으며, 결과값인 C(t)값을 농도를 알고 있는 ssDNA 를 이용하여 정량하였다. 이렇게 정량된 노로바이러스의 농도는 2x108 PFU (± 5.96x106)/ml 이다.
노로바이러스의 흡착 및 측정
먼저 노로바이러스의 흡착조건을 판단하기 위해 pH, 염의 첨가, PEG첨가, 수접촉각(surface), 접촉표면적을 달리하여 하기 실험을 수행하였다.
이를 위해, 두 가지 다른 농도의 노로바이러스 시료(포스페이트 완충용액 내의 105PFU/mL와 102PFU/10mL의 농도)를 준비하였다. 또한, 100, 101, 102 PFU로 노로바이러스에 의해 오염된 굴을 준비하였다.
노로바이러스 흡착율을 측정하기 위하여 2가지 방법이 사용되었다. 노로바이러스에 적합한 프라이머 셋(하기 표 1)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
Figure pat00001
굴의 노로바이러스를 측정하기 위해 세척 단계없이 제조사에 의하여 제공된 수정 프로토콜을 이용한 NucliSens Basic Kit(Biomerieux, France)를 사용하여 NASBA 증폭 프로세스를 수행하였다(상기 표 1의 NASBA 증폭용 프라이머 셋을 사용).
증폭 단계는 랩 칩(Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 사용하여 모니터링되었다.
NASBA 증폭용액에 SYBR Green Ⅱ(1:10,000)를 첨가하였다. 증폭은 3시간 동안 수행되었다. 형광 신호는 자외선 조사 하에서 측정되었다. 형광 신호를 정량화하기 위하여, CW-램프 필터(485 nm)를 구비한 VICTOR 3TM 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, USA)를 사용하였다. 노로바이러스 흡착 결과를 도 1에 나타내었다.
박테리아의 흡착조건 측정(테스트용 박테리아 흡착율 측정 방법 기재)
박테리아의 흡착조건을 판단하기 위해 pH, 염의 첨가, PEG첨가, 수접촉각(surface), 접촉표면적을 달리하여 하기 실험을 수행하였다. (하기 박테리아의 흡착 및 측정에 대해서는 본 출원인의 특허출원번호 10-2010-70793을 참고할 수 있다).
박테리아 흡착을 최적화하기 위하여, 2가지 다른 농도의 박테리아 시료(각각 포스페이트 완충 용액 내에 105 c.f.u/mL(고농도) 및 102 c.f.u/10mL(저농도))를 제조하였다. 테스트를 위하여, 각각 100, 101 및 102 c.f.u의 E.coli O157:H7가 첨가된 1g의 쇠고기를 사용하였다.
박테리아 흡착율을 측정하기 위하여 2가지 방법이 사용되었다. E.coli O157:H7에 적합한 프라이머 셋을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 저농도 박테리아의 경우, 마이크로 비드 상에 흡착된 박테리아를 아가 플레이팅(agar plating)함으로써 직접 카운팅하였다. 니켈 비드 상의 박테리아 흡착을 관찰하기 위하여 주사전자 현미경(SEM; Field Emission Scanning Electron Microscope Cathode Luminescence System, S-4700 Mono CL, HITACHI GATAN, Japan)을 사용하였다.
쇠고기 내의 활성 E.coli O157:H7를 측정하기 위하여, 챔버(돌출부상에 쇠고기 내 박테리아가 흡착되어 있음) 내에서 세척 단계없이 제조사에 의하여 제공된 수정 프로토콜을 이용한 NucliSensㄾ Basic Kit(Biomerieux, France)를 사용하여 NASBA 증폭 프로세스를 수행하였다. E.coli O157:H7에 특이적인 염기서열을 갖는 NASBA 증폭용 프라이머 셋을 사용하였는 바, 상기 표 1에 나타내었다. 이어서 형광신호를 검출하여 박테리아 흡착결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
<실시예 1> 노로바이러스 , 박테리아, 단백질 분리능 검토
본 발명의 측정장치(도 3)를 사용하여 노로바이러스, 박테리아, 단백질를 분리하였다.
먼저 1% 단백질 BSA, 105 CFU의 박테리아 및 노로바이러스를 함께 혼합하여 시료를 제작하였다.
노로바이러스 흡착 조건은 pH9, 박테리아 흡착 조건인 PEG 15%가 포함된 pH3 용액을 이용하여 친수성 표면을 이용하여 흡착 실험을 하였다.
우선, 시료주입구(10)에 상기 시료가 포함된 굴 용액 75ml을 0.5 ml/min의 속도로 흘려주었다. 같은 속도로 노로바이러스 흡착 버퍼인 Tris-HCl(pH9, 100mM) 75ml를 완충액 주입부(60)에 로딩하였다.
박테리아 흡착 버퍼인 글라이신 버퍼(pH3, 100mM)에 15% PEG를 혼합한 용액 150ml를 1ml/min의 속도로 완충액 주입부(30)에 로딩하였다. 제 2 챔버를 통과한 용액은 외부로 배출시켰다.
이후 굴 용액을 제외한 박테리아/바이러스 흡착 버퍼를 추가적으로 각각 5ml씩 흘려주어 세척한다. 이때 용액의 누출을 막기 위해 V1을 사용하여 채널을 차단하였다.
용액이 모두 빠져나간 칩은 95℃ hot plate 에 10분간 올려두어 칩 내에 흡착된 박테리아와 바이러스를 용해(lysis)한 후 이후 5분간 상온에 두어 식힌 후 증폭용액 공급부를 통하여 NASBA mixture 를 삽입하였다. 이때 V2를 이용한 valving으로 NASBA mixture가 챔버 내부에만 머물도록 한후 41℃ 수온조에서 90분간 인큐베이팅(incubating) 하였다.
NASBA mixture 에 포함되어 있던 SYBR Green II에 의해 증폭된 RNA를 확인하기 위해 측정장치를 이미지 장비에 올려놓고 측정하였다.
도 6은 제 1 챔버 및 제 2 챔버에 흡착된 노로바이러스, 박테리아, 단백질(BSA)의 흡착율을 나타낸다. 도 6을 참고하면, 제 1 챔버에서 노로바이러스의 흡착률은 약 98%에 해당하며 박테리아의 흡착율은 2% 미만이며, 제 2 챔버에서 박테리아의 흡착률은 약 87% 이며 동시에 노로바이러스의 흡착률은 20% 미만이다. 도 6을 참고하면, 본 발명의 장치는 노로바이러스와 박테리아를 효과적으로 분리가 가능함을 보여주고 있다.
<실시예 2> 박테리아 유무에 따른 노로바이러스 흡착능 검토
바이러스에 감염되지 않은 굴 용액에 노로바이러스만을 첨가한 경우와, 박테리아가 감염된 굴 용액에 노로바이러스를 첨가하였을 경우를 각각 실시예 1과 같은 방법으로 실시하여 흡착율을 도 7에 나타내었다.
<비교예 1>
노로바이러스를 함유하는 굴용액을 정제하지 않고 PCR을 수행하였다.
<비교예 2>
노로바이러스를 함유하고 있는 굴용액을 정제하여 PCR을 수행하였다.
도 7은 실시예 2에서 노로바이러스만을 함유하고 있는 굴 용액과 박테리아가 감염된 굴 용액에 노로바이러스를 첨가하였을 경우의 흡착율을 나타낸다. 비교예 2와 비교하면, 실시예 2에서 노로바이러스만 존재하는 경우(Oyster에 노로바이러스만 첨가)는 99.37%의 흡착율을 보이고, 박테리아가 첨가된 경우(Oyster with bacteria)에도 99.22% 이상의 높은 흡착률을 보여준다. 따라서, 실시예 2는 굴 용액의 박테리아가 감염 여부에 상관없이 본 발명의 장치는 노로바이러스를 매우 효과적으로 흡착 분리함을 알 수 있다.
도 8은 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2의 측정감도를 보여주는 그래프이다. 굴은 전해질과 무기질, 다량의 염을 포함하고 있는 바닷물에서 생존하고 있으며, 굴 자체가 가지는 단백질의 양이 전체 영양성분 중 44%에 해당하는 매우 많은 양을 가지고 있기 때문에 굴 용액을 사용할 시 비교예 1과 같이 정제를 거치지 않고는 PCR이 수행되지 않는다(Original sample). 비교예 2(refined sample)와 같은 경우 측정감도가 103 PFU/ml로서 측정이 필요한 농도인 10 PFU에 훨씬 못 미친다. 이에 반해, 실시예 1에 의하면 측정 감도가 100배 증가하여 10 PFU의 극 저농도인 노로바이러스에서도 측정이 가능하다. 따라서 본 발명의 방법 및 장치는 비교예 2와 달리 굴 샘플을 정제하지 않아도 노로바이러스를 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
< 실시예 3> 노로바이러스 농축능의 구체적 검토
1. pH에 따른 농축능 검토
본 발명 방법에 따른 노로바이러스의 농축능을 확인하기 위해, 이하의 프라이머로 각 조건을 달리하여 하기 실험을 수행하였다.
우선, 동량의 마이크로 비드(D: 100um, 표면적: 300mm2) 및 글리신 버퍼(pH 3, 100mM), 포스페이트 버퍼 (pH 6, 100mM), 트리스-HCl 버퍼 (pH 9, 100mM)를 각각 준비하였다. 각 pH의 버퍼 1ml에 노로바이러스 1μl와 마이크로 비드를 혼합한 후 10분간 상온에서 배양하였다. 이후 버퍼 제거 후 남은 비드를 흡착시와 같은 pH 버퍼 1ml를 주입하여 부드럽게 세척하였다. 세척에 사용된 버퍼 제거 후 노로바이러스가 흡착된 비드를 이하의 프라이머 세트(하기 표 3)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
Primer Sequence(5'→3') Reference
Fw-ORF1/ORF2 CACGCCACCGATCTGTTCTG APPL. ENVIRON. MICROBIOL.
2008, vol. 74, 543-546
Rv-ORF1/ORF2 GCGCTGCGCCATCACTC
RNA prep kit는 Qiagen 사에서 판매하는 QIAamp Viral RNA mini kit 를 사용하였고, cDNA 합성 kit는 invitrogen 사에서 판매하는 Superscript II RNase H Rever 사용하였다. 실시간 PCR에는 TaKaRa 사에서 판매하는 SYBR premix Ex Taq 를 사용하였고, 제조사의 지침에 따라 실시하였다.
결과를 도 9에 나타내었다. 도 9를 참조하면, 노로바이러스는 버퍼의 수소이온농도가 높을수록 비드에의 흡착이 증가함을 알 수 있었다. 이는 pH가 증가할수록 노로바이러스를 구성하는 단백질 캡시드의 연성과 연축성이 증가하여 캡시드 내부에 있던 작용기들을 끌어내어 마이크로비드 표면에 더 잘 흡착시킴에 기인한 것으로 판단된다.
2. 수접촉각에 따른 농축능 검토
동량의 마이크로 비드(D: 100um, 표면적: 300mm2) 에 각각 TEOS(contact angle 20˚), n-butyltrimethoxy silane(contact angle 40˚), n-octyltrimethoxy silane(contact angle 60˚), TDF(contact angle 80˚)의 silane 용액을 이용하여 표면 처리하였고, 각각의 수접촉각에 따른 노로바이러스 농축능을 검토하였다.
표면처리는 95%의 EtOH를 이용하여 10% 의 silane solution을 만든 후 1시간 동안 비드와 혼합하며 배양하고, 100%의 ETOH를 이용하여 3번 세척한 후, 1시간 동안 70℃에서 배양하는 방법으로 수행되었다.
이후, 트리스-HCl 버퍼(pH 9, 100mM) 1ml 에 노로바이러스 1μl와 상기 각각의 표면처리된 마이크로 비드를 혼합한 후 10분간 상온에서 배양하였다. 이후 버퍼 제거 후 남은 비드를 흡착시와 같은 pH 버퍼 1ml를 주입하여 부드럽게 세척하였다. 세척에 사용된 버퍼 제거 후 노로바이러스가 흡착된 비드에 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 실시간 PCR을 수행하였고, 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 참조하면, 노로바이러스(MNV)는 넓은 범위의 표면 접촉각에서 높은 수준의 흡착률을 보이나, 40˚와 60˚에서 가장 높은 흡착률을 보임을 알 수 있었다. 소수성 표면인 80˚의 마이크로 비드에서 상대적으로 낮은 흡착률을 보인 것은 노로바이러스가 녹아있는 수용액의 시료와 비드의 표면이 접촉하여 노로바이러스가 흡착할 확률이 낮아지는 것으로 판단된다.
3. 노로바이러스의 신선도 상태에 따른 농축능 검토
살아있는 노로바이러스(Live)와, 상온에서 3일간 방치된 노로바이러스(Deactivation), 상온에서 30분 배양, -20℃에서 30분 배양을 5시간 반복한 노로바이러스(Dead) 및 오토클레이브를 실시한 경우(Sterilization)을 대상으로 농축능을 확인하였다.
글리신 버퍼(pH3, 100mM), 트리스-HCl 버퍼(pH 9, 100mM)의 각 버퍼 1ml에 상기 각각의 노로바이러스 1μl와 n-부틸 실란(접촉각 40°)로 표면처리된 마이크로 비드를 혼합한 후 10분간 상온에서 배양하였다. 이후 버퍼 제거 후 남은 비드를 흡착시와 같은 pH 버퍼 1ml를 주입하여 부드럽게 세척하였다. 세척에 사용된 버퍼 제거 후 노로바이러스가 흡착된 비드에 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 실시간 PCR을 수행하였고, 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 참조하면, 온전한 상태의 노로바이러스의 경우(Live), 높은 pH에서 흡착률이 우수하며, 노로바이러스의 신선도가 떨어질수록 높은 pH에서의 흡착률은 점점 감소함을 알 수 있었다. 또한 낮은 pH에서의 흡착률은 신선한 상태에서는 흡착률이 낮으나, 노로바이러스의 신선도가 떨어질수록 흡착률이 증가함을 알 수 있었다. 이는 노로바이러스의 신선도가 떨어질수록 노로바이러스 캡시드의 안정성이 감소하여 RNA가 방출되는 것에 기인한 것으로 판단된다. 따라서, 노로바이러스의 신선도가 떨어질 때 방출된 RNA는 낮은 pH에서 흡착된 것으로 판단되며, 상기 결과는 본 발명의 방법이 노로바이러스의 live/dead 측정에 활용될 수 있음을 시사한다.
< 실시예 4> A 형 간염 바이러스( Hepatitis A Virus )의 농축능 검토
본 발명 방법에 따른 A형 간염 바이러스의 농축능을 확인하기 위해, 이하의 프라이머로 각 조건을 달리하여 하기 실험을 수행하였다.
우선, 내부를 n-부틸 실란으로 처리한 마이크로 칩 및 글리신 버퍼(pH 3, pH 5, 각각 100mM), 트리스-HCl 버퍼 (pH7, pH 9, 각각 100mM)를 각각 준비하였다. 각 pH의 버퍼 1ml에 A형 간염 바이러스(HAV) 10μl와 QIAamp Viral RNA mini kit로 추출한 HAV RNA 10μl를 각각 넣고, 10분간 상온에서 배양한 후, 이를 마이크로 칩에 1ml/min의 속도로 주입하였다. 이후 버퍼 제거 후 남은 비드를 흡착시와 같은 pH 버퍼 1ml를 주입하여 부드럽게 세척하였다. 세척에 사용된 버퍼 제거 후 노로바이러스가 흡착된 칩을 이하의 프라이머 세트(하기 표 4)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
Primer Sequence Reference
UC1 GCACAGCTCTCATCAATACTA APPL. ENVIRON. MICROBIOL.
2005, vol. 71 7113-7116
T7KH2 TAAAACATCATCTCCATAACA
RNA prep kit는 Qiagen 사에서 판매하는 QIAamp Viral RNA mini kit 를 사용하였고, cDNA 합성 kit는 invitrogen 사에서 판매하는 Superscript II RNase H Rever 사용하였다. 실시간 PCR에는 TaKaRa 사에서 판매하는 SYBR premix Ex Taq 를 사용하였고, 제조사의 지침에 따라 실시하였다.
결과를 도 12에 나타내었다. 도 12를 참조하면, A형 간염 바이러스는 버퍼의 수소이온농도가 높을수록 비드에 흡착이 증가함을 알 수 있었다. 그러나, A형 간염 바이러스의 RNA는 낮은 pH에서 높은 흡착률을 보임을 알 수 있었다. 이는 pH가 증가할수록 A형 간염 바이러스를 구성하는 단백질 캡시드의 연성과 연축성이 증가하여 캡시드 내부에 있던 작용기들을 끌어내어 마이크로비드 표면에 더 잘 흡착시킴에 기인한 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
10 : 시료주입부 20 : 제 1 챔버
30, 60 : 완충액 주입부 40 : 제 2 챔버
50 : 채널

Claims (25)

  1. 완충용액을 사용하여 pH 7 이상으로 조절된 시료를 수접촉각이 60° 이하인 친수성 제 1 고체 표면에 접촉하는 단계; 및 상기 고체 표면에 흡착된 바이러스를 검출하는 단계;를 포함하는 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비피막성 바이러스는 피코나바이러스 과, (Picornaviridae ), 칼리시바이러스 과(Caliciviridae ), 레오바이러스 과(Reoviridae ) 및 아데노바이러스 과(Adenoviridae )로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비피막성 바이러스는 노로바이러스 또는 A형 간염 바이러스인 것인 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면은 챔버 내에 충진된 비드 또는 단일체 와이어의 표면인 것인 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면의 재질은 글래스, 실리콘 웨이퍼, 실리카, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 폴리디메틸실록산인 것인 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 고체 표면에 흡착된 바이러스를 검출하는 단계는
    흡착된 바이러스의 핵산을 증폭하여 검출하는 방법 또는 항원-항체 반응으로 검출하는 방법이 수행되는 것인 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것인 비피막성 바이러스의 분리 검출 방법.
  8. 완충용액을 사용하여 pH 7이상으로 조절된 시료를 제 1 고체 표면에 접촉하는 단계;
    상기 제 1 고체 표면으로부터 유출되는 시료를 pH 5이하로 조절한 후 수접촉각이 50° 이하인 친수성 제 2 고체 표면에 접촉하는 단계를 포함하되, 상기 제 1 고체 표면에는 노로바이러스가 흡착되고, 제 2 고체표면에는 박테리아가 흡착되는 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면 및 제 2 고체 표면은 챔버 내에 충진된 비드 또는 단일체 와이어의 표면인 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면 및 제 2 고체 표면의 재질은 글래스, 실리콘 웨이퍼, 실리카, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 폴리디메틸실록산인 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면의 수접촉각은 60°이하인 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면 및 제 2 고체 표면은 챔버 내의 바닥면에 형성된 복수개의 돌출부의 표면인 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면 및 제 2 고체 표면의 표면적은 각각 10 내지 150㎟ 범위인 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면으로부터 유출되는 혼합용액에 폴리에틸렌글리콜을 더 첨가하여 제 2 고체 표면에 접촉하는 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  15. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체 표면으로부터 유출되는 혼합용액에 코스트로픽 음이온을 더 첨가하여 제 2 고체 표면에 접촉하는 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  16. 제8항에 있어서,
    상기 제 1 고체표면 및 제 2 고체표면과 접촉하는 시료의 로딩 유속은 0.01 내지 10 ㎖/min 범위인 것인 노로바이러스 및 박테리아 분리 농축 방법.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따라 노로바이러스 및 박테리아를 분리 및 농축하는 단계;
    상기 농축된 노로바이러스 및 박테리아를 세포 용해(lysis)시키는 단계; 및
    상기 세포 용해물에 증폭 용액을 첨가하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 노로바이러스 및 박테리아 측정 방법.
  18. 시료주입부 ;
    상기 시료로부터 노로바이러스를 흡착하는 제 1 챔버;
    상기 제 1 챔버 후단에 위치하고, 시료의 pH를 조절하기 위한 완충액 주입부;
    상기 제 1 챔버 후단에 위치하고, 완충액과 시료의 혼합용액으로부터 박테리아를 흡착하는 제 2 챔버; 및
    상기 시료주입부, 상기 제 1 챔버 및 상기 제 2 챔버를 연결하여 시료가 이들을 경유하도록 하는 채널;을 포함하는 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버는 챔버 내에 충진된 비드 또는 단일체 와이어를 구비하거나 챔버 내에 형성된 복수개의 돌출부를 포함하는 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 비드, 단일체 와이어 또는 돌출부들의 총 표면적이 10 내지 150㎟ 범위인 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 제 1 챔버는 수접촉각이 60°이하로 친수화처리 된 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 제 2 챔버는 수접촉각이 50°이하로 친수화처리 된 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 측정장치는 상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버에 증폭용액을 제공하는 증폭용액 공급부를 포함하는 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  24. 제18항에 있어서,
    상기 채널은 상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버 전단에 시료와 완충액을 혼합하는 곡선유로부를 포함하는 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
  25. 제18항에 있어서,
    상기 측정장치는 상기 제 1 챔버 및 제 2 챔버에서의 시료나 증폭용액의 유출을 방지하기 위한 차단부를 포함하는 것인 노로바이러스 및 박테리아 측정장치.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105158464A (zh) * 2015-08-28 2015-12-16 杭州庆正鸿科技有限公司 诺如病毒抗体eilisa检测试剂盒
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