CN104017909A - 用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列。具体地,本发明涉及一种用于检测来自患者的生物样品中两种或更多种病原体的目标核酸的方法。本发明还描述了一种用于检测检验样品中病原体的目标核酸的试剂盒。所述试剂盒包括至少一对引物和含有至少一种探针的寡核苷酸微阵列。
Description
本申请是申请日为2006年12月29日,申请号为200680053490.5的,发明名称为“用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求于2005年12月30日提交的美国临时专利申请60/755,504的权益。
技术领域
本发明涉及用于检测检验样品中病原体存在情况的检验试剂盒和方法。检验样品可以获自患者或者来自可能含有病原体的食物或饮料的来源。
背景技术
诸如脑炎、脑膜炎、脑(脊)膜炎、肺炎、肠胃炎、心内膜炎、尿道感染的疾病由病原体感染引起。病原体包括不同的细菌、病毒、真菌和原生动物。不同的致病性感染往往具有类似的症状,这致使难以提供感染或疾病的起因的确诊。例如,脑炎和脑(脊)膜炎患者一般都会出现发烧、头痛和惊厥。快速而准确地鉴定引起这些症状的病原体对于确定开出什么药方至关重要。当前用于鉴定病原体的诊断方法包括:镜检、微生物培养、血清免疫测试和聚合酶链式反应(PCR)。这些方法需要经过严格训练的人员而且非常费时。
按照常规的PCR方法,将含有起模板作用的基因的检验样品与设计成用于扩增具有特定长度的至少一种基因的至少一对PCR引物混合。通过使所扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并使其染色,就可使PCR产物显现。按照PCR方法,根据所显现的PCR产物长度来鉴定检验样品中所含的基因。在同一样品中可以扩增多对引物以便更有效地筛选多种基因。
然而,随着引物试剂中所含PCR引物的数量增多,在电泳凝胶上的“噪声”也随之增多。当由于非特异性退火产生PCR产物时,“噪声”就会出现。出于此原因,当使用PCR反应时,难以确定不只是仅少数基因存在。
此外,有必要设计好引物,以使经PCR反应扩增出的PCR产物在分辨率有限的电泳凝胶上可以辨别。要设计出可产生适当的可分辨PCR产物且噪声低的引物并不容易并且耗时。因此,严格的基于PCR/电泳的方法对于筛选大量基因表达是低效的。
发明内容
本发明涉及用于检测生物样品或检验样品中的目标核酸的方法和检验试剂盒。使用寡核苷酸微阵列快速地高通量筛选病原体的存在情况。寡核苷酸微阵列含有已知病原体的各种聚核苷酸(探针),并且以一个杂交测定来鉴别病原体。
一方面,本发明涉及一种简易而快速地确定生物样品或检验样品中是否存在含有目标核酸的多核苷酸的方法。
另一方面,本发明涉及一种用于检测生物样品或检验样品中病原体的目标核酸的方法,所述方法包括:利用与不止一种病原体中的保守区结合的一对或更多对引物来扩增样品中的目标核酸;使扩增的目标核酸与寡核苷酸微阵列接触;且检测目标核酸与探针的结合情况,其中与特定病原体探针结合则表明样品中存在该病原体。所述微阵列包括含与不同病原体互补的多核苷酸序列的两种或以上的探针或者探针组。
又一方面,本发明涉及一种辨别样品中的大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌的方法。所述方法包括:利用与大肠杆菌和沙门氏菌中的保守区结合的一对或更多对引物扩增样品中的核酸;使扩增的目标核酸与寡核苷酸微阵列接触;且检测核酸与作为指示样品中存在大肠杆菌和/或沙门氏菌的探针的结合情况。所述微阵列包括含与大肠杆菌和沙门氏菌中的可变区互补的多核苷酸序列的两种或以上探针。
在另一方面,本发明涉及一种用于检测在生物样品或检验样品中病原体的目标核酸的试剂盒,所述试剂盒包括:至少一对引物和寡核苷酸微阵列,所述微阵列包含固定化在固相支持体上的至少一种探针。
根据以下的说明且结合附图,并通过例示阐明本发明原理,本发明的其他方面和优点将显而易见。
附图说明
图1A和图1B显示了16SrDNA的细菌DNA序列的保守引物区和可变探针区。
图2A和图2B显示了18SrDNA的真菌DNA序列的保守引物区和可变探针区。
图3是本发明实施方案的图式概述。
具体实施方式
1.病原体
术语“病原体”指的是疾病因子或致病因子。术语病原体最通常是指感染性生物体。它们包括但不限于:细菌、病毒、真菌和原生动物。本发明的方法和试剂盒可用于鉴定已经引起传染病或食物中毒的病原体和微生物。病原体的实例包括但不限于:立克次氏体、衣原体、支原体、螺旋体、链球菌、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌、支原体、单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides)、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体、变形菌、厌氧菌(anaecrobacter)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌、脊髓灰质炎病毒1、肠道病毒71、肠道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯萨奇病毒A13、柯萨奇病毒A15、柯萨奇病毒A18、柯萨奇病毒A20、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3-A、柯萨奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。
2.生物样品和检验样品
文中所用的术语“生物样品”是指取自生物体或生物体的组分(例如细胞)的样品。在一个实施方案中,生物体是哺乳动物。在另一个实施方案中,生物体是人类。样品可以是任何生物组织或生物液体。通常生物样品取自患者。这些样品包括但不限于:组织、细胞、血液、血清、脑脊液、尿、细胞裂解物、血浆、粪便、唾液、血细胞、细针活检样品、腹膜液和胸膜液,或来自以上样品的细胞。生物样品同样包括组织切片,例如用于组织学用途的冰冻切片。
在某些实施方案中,本发明涉及一种方法,其中生物样品选自组织、细胞、血液、血清、脑脊液、尿、细胞裂解物、血浆、粪便、唾液、血细胞、细针活检样品、腹膜液和胸膜液,或来自以上样品的细胞。
本文所用的术语“检验样品”是指取自非活体来源的样品。检验样品的来源包括但不限于:食物、饮料、土壤、地下水、海水和湖底沼泽水。在这些检验样品中通常含有病原体和被病原体感染的细胞。
根据是否存在特定病原体的目标核酸来鉴定生物样品和检验样品的病原体。在某些实施方案中,目标核酸包括:病原体的基因组材料、线粒体DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA、质粒DNA以及它们的片段。
根据症状和感染途径,病原体被分类成众多组别。为了对应多个组别,制备出多种目标核酸检测试剂和寡核苷酸微阵列。使用目标核酸检测试剂和寡核苷酸微阵列,它们根据症状而选择。因此,可以在根据症状和感染途径所预测的病原体之中高度准确地鉴定出真正的病原体。
3.目标核酸
目标核酸是待检验的病原体所固有的多核苷酸。此多核苷酸是遗传材料,其包括:基因组DNA/RNA、线粒体DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA和质粒DNA。通过检测病原体特有的目标核酸的存在情况,可以推断病原体自身的存在情况。类似地,存在对病原体的属特异性的目标核酸则表明了存在该属成员。
术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”可交换使用并且指的是核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。“寡核苷酸”指的是约50个或以下核苷酸的多核苷酸。这些术语同样指的是DNA或RNA,它们可以是单链或双链的,并且可以相对于cDNA而言代表正义链或负义链。本文的序列中,A是腺嘌呤,C是胞嘧啶,T是胸腺嘧啶,G是鸟嘌呤,而N是A、C、G或T(U)。可以预期,若多核苷酸是RNA,那么本文所提供的序列中的T(胸腺嘧啶)以U(尿嘧啶)来代替。
术语“互补的”或“互补性”指的是通过碱基配对多核苷酸的自然结合。例如,序列5’-AGT-3’与互补的序列3’-TCA-5’结合。两条单链分子之间的互补性可以是“部分的”,致使只有某些核酸结合;或者可以是“完全的”,致使在单链分子之间存在完全互补性。核酸链之间的互补程度显著地影响核酸链之间杂交的效率和强度。
本文所用的术语“纯化的”或“基本上纯化的”指的是:所指示的核酸或多肽以基本上不存在其他生物大分子(诸如多核苷酸、蛋白质等)的情况下存在。
本文所用的术语“分离的”指的是:核酸与在该核酸天然来源中与其一起存在的至少一种其他组分分离。在一个实施方案中,所述核酸仅在(如果有的话)溶剂、缓冲剂、离子或正常地存在于核酸溶液中的其他组分存在的情况下存在。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于它们的天然来源中的核酸。
本文所使用的“基本上等同的”或“基本上类似的”指的是:由于一个或更多个置换、缺失或添加而不同于参比序列的核苷酸序列,而所述置换、缺失或插入的实际结果并不导致参比序列与被试序列之间不利的功能相异。通常此基本上等同的序列有不超过约35%的不同(即与相应的参比序列相比,基本上等同序列中个别核苷酸的置换、添加和/或缺失的数量除以基本上等同序列中核苷酸的总数量约等于0.35或更少)。这种序列被认为与所示序列具有65%的序列同一性。在一个实施方案中,本发明的基本上等同的序列与参比序列有不超过30%不同(70%序列同一性);在此实施方案的变体中,有不超过25%不同(75%序列同一性);在此实施方案的又一个变体中,有不超过20%不同(80%序列同一性);在此实施方案的又一个变体中,有不超过10%不同(90%序列同一性);在此实施方案的又一个变体中,有不超过5%不同(95%序列同一性)。在一个实施方案中,所述核苷酸序列具有至少约65%的同一性。在其它实施方案中,所述核苷酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
在某些方面,本发明涉及制备“目标核酸检测试剂”。目标核酸检测试剂可以或是目标核酸自身或是扩增的目标核酸。
使用常规的技术将目标核酸序列从生物样品和检验样品中分离。根据要分离的是什么类型的多核苷酸(DNA还是RNA)来确定所用的技术。分离技术也可以根据待调查的病原体的类型和生物/检验样品的量来作出修改。
4.检测试剂
在某些实施方案中,在与寡核苷酸微阵列杂交之前,目标核酸先被扩增以产生“目标核酸检测试剂”。在其他实施方案中,在与寡核苷酸微阵列杂交之前,目标核酸不被扩增,这时“目标核酸检测试剂”和目标核酸是等同的。在一个实施方案中,用一种或更多种标记分子标记目标核酸或所扩增的目标核酸。标记分子的附着有利于在与寡核苷酸微阵列杂交时检测目标核酸或所扩增的目标核酸。可以通过本领域技术人员所知熟的许多方法中的任一种掺入标记分子。在一个实施方案中,可以在制备样品的目标核酸中的扩增步骤时,同时掺入标记分子。因此,例如使用包含标记分子的引物或核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)将提供含有所述标记分子的扩增产物。在某些实施方案中,标记分子包括:生物素、磁珠、荧光染料、放射性标记、酶、比色标记、有色玻璃或塑料珠。在一个实施方案中,如前文所述,使用含有标记分子的核苷酸(荧光素标记的UTP和/或CTP)进行转录扩增,致使标记掺入到所转录的核酸中。
作为选择,标记分子可以直接加到原始目标核酸(例如:mRNA、polyA、mRNA、cDNA等)中。使标记分子附着核酸的方法为本领域的技术人员所熟知,这些方法包括:例如通过经由激酶反应使目标核酸磷酸化来进行切口平移或末端标记,随后通过核酸接头使样品核酸与标记分子连接。
适用于本发明的可检测标记分子包括:通过波谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学的方法可检测的任何组合物。本发明的有用标记分子包括:生物素,用标记的链霉抗生物素缀合物染色;磁珠(例如DynabeadsTM);荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等);放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P);酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中通常使用的其他酶);以及比色标记,诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、橡胶等)珠。教导使用这些标记的专利包括:美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。在一个实施方案中,标记分子是含掺入所扩增目标核酸中的标记分子的核苷酸。
含标记分子的核苷酸可以是用荧光物质(Cy3、Cy5等)或生物素标记的核苷酸(单体),因为它具有高检测灵敏度而且易于操作。含标记分子的核苷酸被带入通过PCR反应扩增的多核苷酸中,并对扩增的多核苷酸进行标记。在用生物素标记核苷酸的情况下,被标记的多核苷酸通过酶联免疫吸附测定(ELISA)显现。
在某些实施方案中,本发明包括:通过PCR扩增目标核酸的扩增步骤,以及检测在PCR反应扩增产物中是否存在含目标核酸的多核苷酸的基因检测步骤。在基因检测步骤中,例如使用寡核苷酸微阵列来检测多核苷酸的存在情况。
5.目标核酸扩增步骤
在某些实施方案中,目标核酸检测试剂通过扩增目标核酸来提供。在一个实施方案中,使用PCR扩增目标核酸检测试剂。在目标核酸扩增步骤中,使用样品提取物、用于扩增含目标核酸的多核苷酸的基因检测引物试剂以及标记性核苷酸进行PCR反应。样品提取物是如下获得的提取物:按照用于提取并纯化DNA或RNA的已知的多核苷酸提取方法来提取并纯化检验样品中所含的多核苷酸。样品提取物在PCR反应中作为模板使用。
如果一种核酸与第二种核酸两者在严格条件下与同一探针核酸杂交,则此核酸与第二种核酸基本上相同。基本上相同的核酸之间的同源性可以为80%、90%、95%或以上。
为了进行基因扩增步骤,让样品提取物、病原体鉴定引物试剂、被标记的核苷酸以及PCR反应所必需的其他试剂和酶于一个反应管中进行PCR反应。通过RCR反应扩增多核苷酸。
通常,理想的是在与寡核苷酸微阵列杂交之前扩增核酸样品。合适的扩增方法包括但不限于:聚合酶链式反应(PCR)(Innis等,PCRProtocols.A guide to Methods and Application.Academic Press,Inc.SanDiego,(1990))、连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace,Genomics,4:560(1989);Landegren等,Science,241:1077(1988);和Barringer等,Gene,89:117(1990))、转录扩增(Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173(1989))、自动维持序列扩增(Guatelli等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1874(1990))。在一个实施方案中,使用PCR扩增目标核酸。在另一个实施方案中,使用反转录酶(RT)-PCR扩增目标核酸。在又一实施方案中,使用Tth DNA聚合酶(可得自例如Promega(Cat.No.M210A))进行PT-PCR。Tth DNA聚合酶是取自嗜热真细菌嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8的酶的重组体形式,是在74℃下复制DNA的热稳定酶,并且在95℃下表现出20分钟的半衰期。Tth DNA聚合酶在镁存在下催化核苷酸沿5’→3’的方向聚合成双链DNA,而在锰存在下使用RNA模板沿5’→3’的方向使核苷酸聚合成DNA。TthDNA聚合酶经常用于PCR、RT-PCR、反转录以及在升高温度下的引物延伸反应。
本发明的扩增方法利用了以下酶活性:DNA聚合酶和依赖DNA的RNA聚合酶。用于本发明方法和组合物的DNA聚合酶能够按照本发明的方法实施引物延伸。因此,所选聚合酶是能够使核酸引物沿着目标核酸模板延伸的聚合酶,所述目标核酸模板至少主要由脱氧核糖核苷酸组成。聚合酶能够从多核苷酸置换核酸链,其中所述多核苷酸是所述置换链与之结合的多核苷酸。
任何反转录酶皆可用于本发明的实施中,包括但不限于:Superscript RTII、“regular”MMLV-RT、AMV RT或者它们的组合。
当样品提取物中不存在预测的病原体时,以及当样品提取物中不存在多核苷酸时,则在PCR产物中不存在扩增的多核苷酸,并且在随后的检测基因步骤中检测不出多核苷酸。
当样品提取物中存在预测的病原体时,来源于所述病原体的多核苷酸则在PCR反应中充当模板。通过病原体鉴定引物试剂中的相应扩增引物与模板结合,PCR反应得以进行,由此扩增出含病原体所固有的目标核酸的多核苷酸。标记性核苷酸被带入所扩增的多核苷酸(DNA)中,即被带入PCR反应产物中。由此PCR反应产物被标记。
用于扩增目标核酸的引物根据从选自以下的病原体中分离的多核苷酸来设计:细菌、病毒、真菌和原生动物。在其他实施方案中,用于扩增目标核酸的引物根据从选自以下的病原体中分离的多核苷酸来设计:立克次氏体、衣原体、支原体、螺旋体、链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、支原体、单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides)、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体、变形菌、厌氧菌、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌、脊髓灰质炎病毒1、肠道病毒71、肠道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯萨奇病毒A13、柯萨奇病毒A15、柯萨奇病毒A18、柯萨奇病毒A20、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3-A、柯萨奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。在一些实施方案中,PCR利用了含从以上所列病原体的至少一种中分离的多核苷酸序列的引物。
在某些实施方案中,特定的引物对能够与不止一种病原体的多核苷酸退火。此引物对可退火至某些病原体中保守的区域。然而,引物对邻接的核苷酸序列是可变区。使用此引物对使多种病原体的核酸序列能够被扩增,而且还允许这些病原体在与寡核苷酸微阵列杂交时能够得以辨别。当使用来自许多细菌和真菌的16S/18SrDNA基因的两个相同区作为引物时,这两个区通过PCR扩增提供了197个碱基对(细菌)或248个碱基对(真菌)的DNA片段。在引物区之间的DNA片段中发现许多低保守区,这些低保守区提供了探针以根据其特定序列通过杂交来辨别病原体。参见出示了16S rDNA的细菌DNA序列的图1A和1B。出示了这两个保守的引物区以及这两个保守区之间的可变的探针区。图2A和2B出示了真菌DNA序列的所述18S rDNA片段中的引物区和探针区。
在一个实施方案中,PCR利用含选自SEQ ID NO:1-12(表1)的多核苷酸的引物。引物对的一些组合包括:SEQ ID NO:1和2;SEQ IDNO:1和4;SEQ ID NO:1和6;SEQ ID NO:3和2;SEQ ID NO:3和4;SEQ ID NO:3和6;SEQ ID NO:5和2;SEQ ID NO:5和4;SEQ ID NO:5和6;SEQ ID NO:5和6;SEQ ID NO:7和8;SEQ ID NO:9和10和/或SEQ ID NO:11和12。
表1
引物来源 | 序列(5’→3’) | SEQ ID NO |
细菌+ | actcctacgggaggcagcag | 1 |
细菌- | attaccgcggctgctggcac | 2 |
细菌+ | ccagactcctacgggaggcagcag(353) | 3 |
细菌- | gattaccgcggctgctggcac(553) | 4 |
细菌+ | ccatactcctacgggaggcagcag(353) | 5 |
细菌- | tattaccgcggctgctggcac(553) | 6 |
肠道病毒: | ctccggcccctgaatgcgg(372) | 7 |
肠道病毒: | acccaaagtagtcggttccg(478) | 8 |
HSV | ggaactcctccaccgccca(74869) | 9 |
HSV | gtaccagggcgtcctgggc(75086) | 10 |
真菌 | ggccgttcttagttggtggagt | 11 |
真菌 | atgctctatccccagcacgac | 12 |
序列后面的数字指的是在各种模板上引物退火的核苷酸位置。
6.微阵列
“微阵列”是在固相支持体表面上形成的离散区的线性或者二维微点阵,每一个离散区都具有确定的区域。使用下文描述的展示策略中的一种,将与目标核酸序列或其亚序列互补的寡核苷酸探针微阵列固定在固相支持体上。本发明的方法使用含展现与一种或更多种目标核酸序列互补性的探针的寡核苷酸微阵列。通常这些探针是DNA,并且以高密度的微阵列(即“基因芯片”)的方式固定在固体表面上。基本上任何可能的基片(substrate)都可为本发明所利用。基片可以是以颗粒、链、沉淀物、凝胶、薄片、管、球体、容器、毛细管、垫、切片、薄膜、平皿、载玻片等存在的生物基片、非生物基片、有机基片、无机基片或它们的任何组合。基片可以具有任何适宜的形状,例如圆盘、方形、球形、环形等。基片通常是平的,但可以呈现多种可供选择的表面结构。例如,基片可以含有于其上进行合成的凸起区或凹陷区。基片及其表面可以形成在上面进行本文所述反应的刚性支持体。同样选择基片及其表面来提供合适的光吸收特征。例如,基片可以是聚合的朗缪尔-布罗杰特膜、功能化玻璃(functionalized glass)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅或者众多种类的凝胶或聚合物中的任一种,诸如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或他们的组合。其他基片材料将在本领域技术人员查阅此公开内容时显而易见。在一个实施方案中,基片是平片玻璃。
各种策略可用于使寡核苷酸探针微阵列定制和展现在基片上,藉此使杂交图谱和可推断出的关于目标核酸的序列信息最大化。例示性展现和定制策略在PCT专利公开说明书WO94/12305中描述,该文献在此引作参考。
探针可以是寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸,或者是能够通过互补碱基配对与目标核酸序列杂交的以上核苷酸聚合物的修饰形式。修饰形式包括2’-O-甲基寡核糖核苷酸和所谓的PNA,在PNA中寡脱氧核糖核苷酸通过肽键而非通过磷酸二酯键连接。探针可以通过任何键与支持体连接(例如3’、5’或通过碱基)。3’连接更常用,因为这样定位与用于寡核苷酸固相合成的化学法相一致。众多的单个探针被固定在基片上的离散位置中,以便辨别目标核酸检测试剂与每种类型探针的杂交。众多离散的单一探针中的每一个被称为“点”。点的尺寸可以在直径0.7mm至1mm左右,在每个点中有0.35μM至40μM DNA。例如,用于检验链球菌和沙门氏菌两种病原体的多核苷酸存在情况的DNA微阵列可具有两个点:一个由链球菌探针组成,另一个由沙门氏菌探针组成。在某些实施方案中,有6、12、24、36、56、64、96、108或384个不同的探针点固定在一个基片上。在一个实施方案中,微阵列可以是1.5mm2。
在一些微阵列中,所有探针的长度都相同。其他微阵列使用不同长度的探针。探针的长度可以变化以优化特定的杂交条件。优化杂交条件以减少“噪声”。通过改变杂交反应的pH、温度和离子条件来修改杂交条件。术语“严格”用来指明通常在本领域中理解为核酸序列之间需要高度互补性以便杂交得以发生的条件。严格条件可以包括高度严格条件,例如于65℃下,在0.5M NaHPO4、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中进行杂交。在寡核苷酸杂交的情况下,其他例示性的严格杂交条件包括于37℃下,在6×SSC/0.05%焦磷酸钠中洗涤。更高温度例如48℃、55℃、60℃和64℃可用于更长的寡核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明涉及进一步包括洗涤寡核苷酸微阵列和检测标记分子存在情况的方法。例如于68℃下在0.1×SSC/0.1%SDS中进行洗涤,和在适度的严格条件下进行洗涤(即于42℃下在0.2×SSC/0.1%SDS中进行洗涤)。
在一些实施方案中,探针被设计成与从病原体中分离的多核苷酸互补,所述病原体选自:细菌、病毒、真菌、原生动物。在其他实施方案中,探针被设计成与从选自以下的病原体中分离的多核苷酸互补:立克次氏体、衣原体、支原体、螺旋体、链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、支原体、单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides)、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体、变形菌、厌氧菌、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌、脊髓灰质炎病毒1、肠道病毒71、肠道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯萨奇病毒A13、柯萨奇病毒A15、柯萨奇病毒A18、柯萨奇病毒A20、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3-A、柯萨奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。在另一个实施方案中,探针选自SEQ ID NO:13-52(表2)。
表2
业已开发出若干技术来设计、合成、杂交和解释上文所述类型的高密度寡核苷酸微阵列。
可以使用光引导合成(light directed synthesis)以在基片表面建立寡核苷酸探针(Fodor等,Science,251:767-73(1991))。光引导合成使基于半导体的光刻法与固相化学合成相联合。该方法起始于当用光化学可移除的保护基团修饰的接头与固体基片即基片表面连接的时候。已经合成了带光不稳定的保护基的接头与亚磷酰胺,并由Pease等,PNAS,91:11241-11245(1994)描述。光通过光刻掩膜被引导到合成表面的特定区域,并激活这些区域以便进行随后的化学偶联。将具有光不稳定保护基的一系列核苷酸中的第一个与基片一起温育,化学偶联发生在在前述步骤中已被阐明的那些位置上。然后光通过掩膜的不同部分被定向到下一个合成位置,构建出化学步骤,即规定合集的聚核苷酸探针,而每一种探针在基片的表面上都具有它自己唯一的地址。寡核苷酸微阵列与扩增产生的荧光标记DNA或RNA杂交,杂交通过落射荧光共焦显微镜(epi-fluorescence confocal microscopy)进行检测(Fodor等,1993)。
在一个实施方案中,寡核苷酸微阵列具有含被测的每一种病原体所固有的全部探针的点。
因此,本发明涉及用于检测生物样品或检验样品中的病原体的目标核酸的方法。所述方法包括:制备目标核酸检测试剂;并使目标核酸检测试剂与寡核苷酸微阵列接触。在一些实施方案中,病原体选自链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、支原体、单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides)、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体、变形菌、厌氧菌、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌、脊髓灰质炎病毒1、肠道病毒71、肠道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯萨奇病毒A13、柯萨奇病毒A15、柯萨奇病毒A18、柯萨奇病毒A20、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3-A、柯萨奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。在一些实施方案中,寡核苷酸微阵列包含探针,所述探针包含从以上列举的病原体的至少一种中分离的多核苷酸序列。在另一个实施方案中,探针包含选自SEQ ID NO:13-52的多核苷酸序列。
7.试剂盒
在某些方面,本发明还涉及用于检测检验样品中病原体的目标核酸的试剂盒。所述试剂盒包括至少一对引物,和包含至少一种探针的寡核苷酸微阵列。在一个实施方案中,所述引物对包含选自ID NO:1-12的引物。在另一个实施方案中,探针包含选自SEQ ID NO:13-52的多核苷酸序列。
本发明将通过以下实施例进行更详细的解释。本发明的实施例和实施方案应该被认作是阐述性而非限制性的,本发明并非旨在受限于文中所给出的细节,而是可以在所附权利要求书的范围和等同范围内作出修改。
8.实施例
实施例1
DNA微阵列制备方法
1.玻璃表面洗涤
将洁净的载玻片浸入H2SO4/H2O22:1中30分钟。用H2O洗涤3次,然后用甲醇洗涤2次。在加压空气流中吹干,然后在80℃下烘10分钟。
2.玻璃的硅烷化
在2%N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷(EDA)的1mM醋酸溶液中于室温(RT)下超声处理30分钟。用H2O洗涤3次,然后用甲醇洗涤2次。在N2气流中吹干,然后在110℃下烘15分钟。
3.用异双官能交联剂修饰硅烷化载玻片
于室温下浸入交联剂溶液(含384mg PDITC(2mmol)的80ml含10%无水吡啶的DMF)2小时。用DMF冲洗3次,然后用二氯乙烷冲洗2次。在N2中吹干。
4.微阵列印迹和DNA固定化
于60%湿度下在活化的载玻片上点上含40μM NH2-寡脱氧核苷酸(ODN)的0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.0)。于37℃饱和湿度下反应1小时以上。用水冲洗并浸没在含6-氨基己醇(100mM)的水溶液中。用100℃的水洗涤2-3分钟,然后在加压空气下吹干。
DNA固定化结构
实施例2
DNA微阵列杂交方法
1.PCR扩增和标记
将1μl DNA样品加入到100μl PCR反应缓冲液中,所述反应缓冲液含有10mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、3.75mM MgCl2、0.1%Triton X-100、0.1mM dNTP(每种)和0.2μM Cy5标记的引物(每种)。然后加入5u Taq DNA聚合酶,按以下温度条件进行PCR扩增:
i).96℃ 2分钟
ii).95℃ 20秒
iii).60℃ 20秒
iv).72℃ 30秒
回到步骤ii),28个循环
v).72℃ 2分钟
总反应时间约1小时20分钟。
2.DNA微阵列杂交
用5倍体积的含0.75M NaCl、75mM柠檬酸钠和0.1%SDS pH7.2的杂交缓冲液稀释PCR溶液。于61℃下杂交1小时。
3.DNA微阵列洗涤
将杂交后的载玻片用0.3M NaCl、30mM柠檬酸钠和0.1%SDS在50℃下洗涤15分钟,共洗涤3次,然后用0.3M NaCl、30mM柠檬酸钠在50℃下洗涤15分钟。用水冲洗然后在加压空气中干燥。
4.微阵列读取
DNA微阵列杂交结果通过FuJiFilmTM荧光扫描仪FLA3000读取,用HeNe激光(633nm)激发Cy5。用打包软件ArrayGuageTM分析信号密度。
实施例3
从由患者分离的组织切片中直接收集细胞。使用任何已知的方案从这些细胞中提取DNA。使用两对引物SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:7-8通过PCR扩增约2-10ng的DNA。将[32P]-dCTP包括在PCR反应中,以标记扩增的DNA,从而产生带标记分子的目标核酸检测试剂。
带标记分子的目标核酸检测试剂经由离心柱(spin column)纯化以除去多余的[32P]-dCTP,在95℃下温育变性,随后直接在冰上冷却。然后在高严格条件下,使变性的带标记分子的目标核酸检测试剂在含探针的寡核苷酸微阵列存在下温育,所述探针含SEQ ID NO:13-52。杂交在0.5M NaHPO4、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃下进行2小时,随后在0.1×SSC/0.1%SDS中于68℃下洗涤3次。此微阵列曝光于X射线胶片并显影出放射自显影图。
实施例4
从任何一般的饮用水源(例如来自贮水池或来自水龙头)中分离饮用水样品。将样品浓缩和/或过滤以分离任何病原体。使用任何已知的方案从这些细胞中提取DNA。使用两对引物SEQ ID NO:1-2和SEQID NO:7-8通过PCR扩增约2-10ng的DNA。将[32P]-dCTP包括于PCR反应中,以标记扩增DNA,从而产生带标记分子的目标核酸检测试剂。
带标记分子的目标核酸检测试剂经过离心柱纯化以除去多余的[32P]-dCTP,在95℃下温育变性,随后直接在冰上冷却。然后在高严格条件下,使变性的带标记分子的目标核酸检测试剂在含探针的寡核苷酸微阵列存在下温育,所述探针含有SEQ ID NO:13-52。杂交在0.5M NaHPO4、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃下进行2小时,随后在0.1×SSC/0.1%SDS中于68℃下洗涤3次。此微阵列曝光于X射线胶片并显影放射自显影图。
尽管已用了至少一个说明性实施例来描述本发明,但在阅读本说明书时,许多变更和修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。因此,意图在于:所附权利要求书应考虑现有技术尽可能宽泛地被解释为包括所有的这些变更和修改。
Claims (8)
1.一种用于检测来自患者的生物样品中两种或更多种病原体的目标核酸的方法,所述方法包括:
利用结合两种或更多种不同病原体的保守区的至少第一和第二引物对来扩增样品中的目标核酸;其中所述第一和第二引物对为分别对应于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的SEQ ID NO:1-2,和对应于肠道病毒的SEQ ID NO:7-8;
使扩增的目标核酸与寡核苷酸微阵列接触,所述微阵列包括含与两种或更多种不同病原体互补的多核苷酸序列的两种或以上的探针或两个或以上的探针组,其中所述探针包括选自以下的多核苷酸序列:SEQ ID NO:13-21,其对应于链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、支原体、单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides),和SEQ ID NO:23-52,其对应于大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体、变形菌、厌氧菌、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌、脊髓灰质炎病毒1、肠道病毒71、肠道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯萨奇病毒A13、柯萨奇病毒A15、柯萨奇病毒A18、柯萨奇病毒A20、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3-A、柯萨奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2;和
检测扩增的目标核酸与探针的结合情况,其中与探针结合则意味着在样品中存在与所述探针互补的多核苷酸序列。
2.权利要求1的方法,其中所述目标核酸中的两种是大肠杆菌和沙门氏菌,而所述探针选自用于沙门氏菌的SEQ ID NO:14-17和用于大肠杆菌的SEQ ID NO:23-26。
3.权利要求1的方法,其中所述生物样品选自组织、细胞、血液、血清、脑脊液、尿、细胞裂解物、血浆、粪便、唾液、血细胞、细针活检样品、腹膜液和胸膜液,或来自以上样品的细胞。
4.权利要求1的方法,其中所述微阵列包括与普通症状有关的病原体的探针。
5.权利要求1的方法,其中所述微阵列包括与普通感染途径有关的病原体的探针。
6.一种检测取自患者的样品中的大肠杆菌和/或沙门氏菌的目标核酸的方法,所述方法包括:
利用结合大肠杆菌和沙门氏菌中的保守区的一对或更多对引物扩增患者样品中的核酸,其中至少一对引物是SEQ ID NO:1和2,其中其他的引物对选自SEQ ID NO:1-6;
使扩增的目标核酸与寡核苷酸微阵列接触,所述微阵列包括含与大肠杆菌和沙门氏菌中的可变区互补的多核苷酸序列的两种或以上探针,其中至少一种探针选自对应于沙门氏菌的SEQ ID NO:14-17,且至少一种探针选自对应于大肠杆菌的SEQ ID NO:23-26;和
检测扩增的核酸与探针的结合情况,其中与选自SEQ ID NO:14-17的至少一个探针的结合表示所述样品中存在沙门氏菌,且与选自SEQ ID NO:23-26的至少一个探针的结合表示所述样品中存在大肠杆菌。
7.权利要求6的方法,其中所述其他的引物对选自下述引物对:SEQ ID NO:1和4;SEQ ID NO:1和6;SEQ ID NO:3和2;SEQ ID NO:3和4;SEQ ID NO:3和6;SEQ ID NO:5和2;SEQ ID NO:5和4;以及SEQ ID NO:5和6。
8.一种用于检测在检测样品中的至少一种病原体的目标核酸的试剂盒,所述试剂盒包括:
结合两种或更多种不同病原体的保守区的至少第一和第二引物对;其中所述第一和第二引物对为分别对应于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的SEQ ID NO:1-2,和对应于肠道病毒的SEQ ID NO:7-8;
寡核苷酸微阵列,所述微阵列包括含与两种或更多种不同病原体互补的多核苷酸序列的两种或以上的探针或两个或以上的探针组,其中所述探针包括选自以下的多核苷酸序列:SEQ ID NO:13-21,其对应于链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、支原体、单核细胞增生李斯特氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌,和SEQ ID NO:23-52,其对应于大肠杆菌、流感嗜血杆菌、布氏疏螺旋体、钩端螺旋体、变形菌、厌氧菌、结核分支杆菌、肠球菌、脊髓灰质炎病毒1、肠道病毒71、肠道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯萨奇病毒A13、柯萨奇病毒A15、柯萨奇病毒A18、柯萨奇病毒A20、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3-A、柯萨奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2;和
其中所述探针固定化在固相支持体上。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140903 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |