CN1328391C - B组链球菌检测基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒 - Google Patents

B组链球菌检测基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种B组链球菌(Group B Streptococcus，GBS)检测基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，基因芯片包括载体及固定在载体表面的探针；载体表面固定有数条检测B组链球菌(GBS)的寡核苷酸探针和数条检测B组链球菌各种血清型寡核苷酸探针；寡核苷酸探针在载体上的排布形式为形成数个n×n的阵列，每一阵列均具有检测B组链球菌的探针和检测B组链球菌各种血清型的全部探针；利用设计的引物将待检测样品的基因组DNA扩增并标记处理后，用上述基因芯片进行杂交，根据杂交信号，可检测出B组链球菌及B组链球菌不同血清型；上述基因芯片、引物可制成用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，具有操作使用方便，准确性高、重复性强的效果。

Description

B组链球菌检测基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒
一、技术领域
本发明涉及基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，尤其涉及一种B组链球菌检测基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒。
二、背景技术
B组链球菌(Group B Streptococcus，GBS)是世界范围内围产期产妇和新生儿严重感染性疾病的重要致病菌，同时也是老人及自身免疫低下人群的感染性疾病致病菌。近二十年来，美国、英国、芬兰等国家的GBS感染为新生儿感染的首位，发生率分别高达61％、28％、30％，病死率达20％～50％，而且有逐渐增多的趋势，已成为对新生儿生命构成威胁的感染。因此，B组链球菌感染日益受到重视和关注，美国CDC在2002年发表的修订后的指导方针中，建议每个孕妇都应在怀孕的第35周到第37周进行这项检查。在我国，随着医疗条件的提高和体制的完善，B组链球菌亦已得到一些医疗条件较好地区的关注和研究，如北京天坛医院的张景华等(600名健康妊娠妇女及其所娩新生儿B族链球菌带菌情况的研究，中华流行病学杂志，1995年2月第16卷，第一期)，可见，该菌在我国也已逐渐引起业内人士的重视。
检测GBS血清型，对于临床研究及疫苗研制具有重要意义。众所周知，GBS感染与致病菌本身毒力有关，荚膜多糖与细菌侵入有关，是细菌毒力的主要成分，根据各型的荚膜多糖抗原不同将GBS分为Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII等9个主要血清型。此外，不同国家和地区GBS血清型流行特征不同。因此，血清型检测对进一步研究GBS感染以及研制优势菌型疫苗进行预防等方面均具重要价值。近年国内外很多学者都在通过不同方法研究GBS各血清型在不同国家和地区的分布。如1998年申阿东等报道了北京地区的分布情况(Experimental study on distribution of serotypes and antimicrobial patterns of Group BStreptococcus strains，Chinese Medical Journal，1998；111(7)；615-618)：2005年Fluegge K等人报道了德国的分布情况(Serotype distribution of invasive group B streptococcal isolatesin infants：results from a nationwide active laboratory surveillance study over 2 years in Germany，Clin Infect Dis.2005 Mar 1；40(5)：760-3)；2005年AI-Sweih N等人报道了科威特的分布情况(Serotype distribution and mother-to-baby transmission rate of Streptococcus agalactiaeamong expectant mothers in Kuwait，Arch Gynecol Obstet.2005 Feb 9)。
目前，主要有两大类分型方法被用于GBS的分型检测，一类主要为一些免疫学方法，如immunoprecipitation，enzyme immunoassay，coagglutination，counterimmunoelectrophoresis and capillary precipitation，latex agglutination，fluorescencemicroscopy以及inhibition enzyme-linked immunosorbent assay，但这些方法费时费力且需要高浓度的血清，众所周知，血清鉴定存在5-10％的错率，且高浓度血清价格昂贵，很难获得，而且GBS的商业化血清只有6型(Ia，Ib，II-V)，不能满足分型检测的需要。另一类主要为一些区分基因型的分子生物学方法，如pulsed-field gel electrophoresis和restriction endonuclease analysis，但这类方法主要应用于流行病学研究，不适合用于常规血清型鉴别。
1997年7月Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人公布了US6,228,575号专利，发明了以基因芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展逐步发展起来。该技术综合运用了分子生物学技术，集成电路制造技术，计算机技术，半导体技术，共聚焦激光扫描技术，荧光标记技术，使检测过程具有敏感性高，特异性强，大规模集成化，自动化，操作简便快捷，效率高等特点，受到科研人员的青睐，并在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌血清型鉴定，不仅可以大大简化技术平台，而且有望实现高准确性，高灵敏度，高通量，可重复性强等优点。
2000年8月Donald O.Chaffin等人报导了GBS荚膜多糖(CapsularPolysaccharide，CPS)基因簇中的一个基因(cpsH)可以决定血清型特异性(Theserotype of type Ia and III group B streptococci is determined by the polymerase gene within thepolycistronic capsule operon，Journal of Bacteriology，Aug.2000.p.4466-4477)。荚膜多糖与细菌的毒力直接相关，这是因为它可以使细菌突破宿主的免疫防御系统，引起感染的发生。Chaffin等人的研究发现，在GBS中，荚膜多糖的血清型特异性是由编码聚合酶的一个基因cpsH决定的。经过对Ia和III荚膜多糖全基因簇的测序和比对，结果显示cpsH段在各型之间的同源性为26％，而基因簇的其他部分的同源性均在95％以上。因此，选取cpsH段用于设计探针区分GBS的全部9个血清型是可行的。
三、发明内容
本发明的主要目的在于提供一种B组链球菌检测基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，将基因芯片技术引入B组链球菌(GBS)及其分型检测领域，填补芯片技术对B组链球菌(GBS)，尤其是GBS分型鉴定的空白，丰富GBS分型检测的方法，该方法操作简便，准确性高，重复性强，对于常规血清型鉴定和流行病学研究都具有重要的意义。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明B组链球菌检测基因芯片，包括载体及固定在载体表面的探针；其特征在于，所述载体表面固定有数条检测B组链球菌的寡核苷酸探针和数条检测B组链球菌各种血清型的寡核苷酸探针。
前述的B组链球菌检测基因芯片，其中载体为固相载体，包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜。
前述的B组链球菌检测基因芯片，其中寡核苷酸探针在固相载体上的排布形式为形成数个n×n的阵列，每一阵列均具有检测B组链球菌的探针和检测B组链球菌各种血清型的全部探针。
前述的B组链球菌检测基因芯片，其中用于B组链球菌及其血清型检测的寡核苷酸探针序列为35条，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：35所示；该寡核菅酸探针序列由5’端至3’端的组成及其功能是：
NO.1 TGGTGCATTGTTATTTTCACCAGCTGTATTAGAAGTAC    用于检测B组链球菌
NO.2 ACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATCAAGTGAC      用于检测B组链球菌
NO.3 TGATCAAGTGACAACTCCACAAGTGGTAAATCATGTAA    用于检测B组链球菌
NO.4 AAATGGCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTG    用于检测B组链球菌
NO.5 GGTAGAGATTTGATTGGGTCAGACTGGATTAATGGTAT    用于检测B组链球菌的Ia型
NO.6 GGGCTGGAATAGTAGCTATATTGGCGCAGATGTTTATT    用于检测B组链球菌的Ia型
NO.7 CGTATAATTAATTTGCGATCCGGGAGTAGTGAATCCAG    用于检测B组链球菌的Ia型
NO.8 ATTTAGAAGTCCAGAATTTCATAGAGTCATTGCTGCA     用于检测B组链球菌的Ib型
NO.9 GGTCTGGATCTAGAGCTGGTATTATAGTTGTGCTACTA    用于检测B组链球菌的Ib型
NO.10 GTCGGGAAGTAGTGAATCTAGATTTTCTTTGTACAAGG   用于检测B组链球菌的Ib型
NO.11 TACCGTACACTCAGTAATTACTGACTCACTATTTCTGG   用于检测B组链球菌的Ib型
NO.12 AGTAGTAGCAAGGTATGCGTATGGATTTAATCATCCCA    用于检测B组链球菌的II型
NO.13 AATAGCACCGTATGTACAGTTTATTGCGATGTTTAGTT    用于检测B组链球菌的II型
NO.14 AGTGGTAGAATTTATTACGCGAAGCTTATCTTAACAGA    用于检测B组链球菌的II型
NO.15 CCTATGCTGAAGCCAACTTTATTTGGAAGAGAATTGTT    用于检测B组链球菌的III型
NO.16 TGGAAGAGAATTGTTTTCAATAGAGTGGTTTCCACATA    用于检测B组链球菌的III型
NO.17 TAGAGTGGTTTCCACATATGAGAATAAGACTTGCGGC     用于检测B组链球菌的III型
NO.18 TGGTTTCCACATATGAGAATAAGACTTGCGGCATATTT    用于检测B组链球菌的III型
NO.19 ATAGTTGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATT    用于检测B组链球菌的IV型
NO.20 AGTTGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTTA    用于检测B组链球菌的IV型
NO.21 GCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTTACTTT    用于检测B组链球菌的IV型
NO.22 GATAGCCTTTTGACAGGTAGGTTAAACTATGCTCATTT    用于检测B组链球菌的IV型
NO.23 TACTCAATTATAAACGACTAAAGCCTGTTGTGATGGTT    用于检测B组链球菌的V型
NO.24 TGAATGGATTCCTTCTATGAAAGTTAGACTTACTGCAT    用于检测B组链球菌的VI型
NO.25 GTGCATATTTGACAGGGGCAAGAATTTTCCTAATTTGT    用于检测B组链球菌的VI型
NO.26 TAAGAGCGATTTTAGATGGGAATTTCCTTATTGGGCAA    用于检测B组链球菌的VI型
NO.27 TTTCCTTATTGGGCAAGGTATAAGAGTTCCCTCC        用于检测B组链球菌的VI型
NO.28 AAGAAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGA    用于检测B组链球菌的VII型
NO.29 GAAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACT    用于检测B组链球菌的VII型
NO.30 AAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTAT    用于检测B组链球菌的VII型
NO.31 ACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTATTT    用于检测B组链球菌的VII型
NO.32 TAGTGATTATCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAG    用于检测B组链球菌VIII型
NO.33 GATTATCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGAACT    用于检测B组链球菌VIII型
NO.34 CCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGAACTATATCG    用于检测B组链球菌VIII型
NO.35 TGTCGGCAACTGTTGAGAACTATATCGTAAATGTAAAT    用于检测B组链球菌VIII型
本发明提供的一种检测B组链球菌血清型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中聚合酶基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按革兰氏阳性细菌的常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列并纯化标记后的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与B组链球菌检测基因芯片杂交；
(5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
前述的B组链球菌检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用的引物为13条，SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：48所示；各条引物的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是：
P-1 GATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG  用于检测B组链球菌的上游引物
P-2 TTTTTCCACGCTAGTAATAGCCTC   用于检测B组链球菌的下游引物
P-3 GAACCTCAGAATTGTCAGTGGTCA   用于检测B组链球菌Ia-VII型上游通用引物
P-4 ATTATTTATAACGATGTTTACTGTA  用于检测B组链球菌Ia型的下游引物
P-5 AGGTCGAATGCGATCCTAGTGG       用于检测B组链球菌Ib型的下游引物
P-6 CTTAGTGCAAGTGTTGAAGAATA      用于检测B组链球菌II型的下游引物
P-7 TTGGGGTTTCAAAAAAAGTATGG      用于检测B组链球菌III型的下游引物
P-8 CAACTACATTGACTTTTTTACTAT     用于检测B组链球菌IV型的下游引物
P-9 ATAATACCCTGTCCTTGAAAA        用于检测B组链球菌V型的下游引物
P-10 TACTAATGTATGATGAATGTGAACC   用于检测B组链球菌VI型的下游引物
P-11 GTTCAACTATTCTTATTTCTTTAC    用于检测B组链球菌VII型的下游引物
P-12 GGTGCCACTTCTTTAGGTT         用于检测B组链球菌VIII型的上游引物
P-13 TCACAAATCGCTTCTTCAT         用于检测B组链球菌VIII型的下游引物
本发明提供的一种用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，其特征在于，其包括：基因芯片，其包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从B组链球菌cfb基因中选取的DNA片段和从B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段，共35条，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：35所示；PCR扩增引物，根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中基因序列设计，共13条，如SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：48所示。
前述的用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，其特征是还包括杂交盒、盖片、杂交液。
本发明的技术内容包括以下几个方面：
第一，本发明提供用于B组链球菌(GBS)检测及其分型检测的35条寡核苷酸探针序列。利用Oligoarray 2.0等生物信息学软件分析GenBank等公共数据库内的序列资源，设计了用于检测GBS及其不同血清型的寡核苷酸探针205条，并通过生物信息学分析以及296次杂交实验进行探针筛选，最终得到4条适用于检测GBS的探针和31条适用于检测GBS全部9个血清型的探针。寡聚核苷酸探针包括从B组链球菌cfb基因中选取的DNA片段和从B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段；寡核苷酸探针合成时均进行5’端氨基和poly(T)修饰，这些探针序列及其对应的检测作用如下表1所示。
表1：GBS检测芯片上所有探针及其检测作用
探针号     序列(5’-3’)     检测作用(血清型)
 NO.1NO.2NO.3NO.4NO.5NO.6NO.7NO.8NO.9NO.10NO.11NO.12NO.13NO.14NO.15NO.16NO.17NO.18NO.19NO.20NO.21NO.22NO.23NO.24NO.25NO.26  TGGTGCATTGTTATTTTCACCAGCTGTATTAGAAGTACACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATCAAGTGACTGATCAAGTGACAACTCCACAAGTGGTAAATCATGTAAAAATGGCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGGGTAGAGATTTGATTGGGTCAGACTGGATTAATGGTATGGGCTGGAATAGTAGCTATATTGGCGCAGATGTTTATTCGTATAATTAATTTGCGATCCGGGAGTAGTGAATCCAGATTTAGAAGTCCAGAATTTCATAGAGTCATTGCTGCAGGTCTGGATCTAGAGCTGGTATTATAGTTGTGCTACTAGTCGGGAAGTAGTGAATCTAGATTTTCTTTGTACAAGGTACCGTACACTCAGTAATTACTGACTCACTATTTCTGGAGTAGTAGCAAGGTATGCGTATGGATTTAATCATCCCAAATAGCACCGTATGTACAGTTTATTGCGATGTTTAGTTAGTGGTAGAATTTATTACGCGAAGCTTATCTTAACAGACCTATGCTGAAGCCAACTTTATTTGGAAGAGAATTGTTTGGAAGAGAATTGTTTTCAATAGAGTGGTTTCCACATATAGAGTGGTTTCCACATATGAGAATAAGACTTGCGGCTGGTTTCCACATATGAGAATAAGACTTGCGGCATATTTATAGTTGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTAGTTGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTTAGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTTACTTTGATAGCCTTTTGACAGGTAGGTTAAACTATGCTCATTTTACTCAATTATAAACGACTAAAGCCTGTTGTGATGGTTTGAATGGATTCCTTCTATGAAAGTTAGACTTACTGCATGTGCATATTTGACAGGGGCAAGAATTTTCCTAATTTGTTAAGAGCGATTTTAGATGGGAATTTCCTTATTG  GBSGBSGBSGBSIaIaIaIbIbIbIbIIIIIIIIIIIIIIIIIIIVIVIVIVVVIVIVI
NO.27NO.28NO.29NO.30NO.31NO.32NO.33NO.34NO.35  GGCAATTTCCTTATTGGGCAAGGTATAAGAGTTCCCTCCAAGAAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGAGAAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTATACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTATTTTAGTGATTATCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGGATTATCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGAACTCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGAACTATATCGTGTCGGCAACTGTTGAGAACTATATCGTAAATGTAAAT VIVIIVIIVIIVIIVIIIVIIIVIIIVIII
第二，本发明提供一种B组链球菌(GBS)检测方法，包括以下步骤：
(1)根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中聚合酶基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按革兰氏阳性细菌的常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列并纯化标记后的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与B组链球菌检测基因芯片杂交；
(5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
其中，步骤(1)中可用于多聚酶链式反应(Multiplex PCR)的13条引物序列是利用Primer 5.0等生物信息学软件分析GenBank等公共数据库内的序列资源，设计了用于扩增GBS不同血清型的引物43条，为适应MultiplexPCR经生物信息学初筛并通过大量Multiplex PCR实验筛选，最终得到13条适用引物，这些引物的序列及其对应扩增作用如下表2所示。
表2扩增所用全部引物
引物号   序列(5’-3’)   扩增作用
P-1P-2P-3P-4P-5P-6P-7   GATGTATCTATCTGGAACTCTAGTGTTTTTCCACGCTAGTAATAGCCTCGAACCTCAGAATTGTCAGTGGTCAATTATTTATAACGATGTTTACTGTAAGGTCGAATGCGATCCTAGTGGCTTAGTGCAAGTGTTGAAGAATATTGGGGTTTCAAAAAAAGTATGG   GBS上游引物GBS下游引物Ia-VII型上游通用引物Ia型下游引物Ib型下游引物II型下游引物III型下游引物
P-8P-9P-10P-11P-12P-13   CAACTACATTGACTTTTTTACTATATAATACCCTGTCCTTGAAAATACTAATGTATGATGAATGTGAACCGTTCAACTATTCTTATTTCTTTACGGTGCCACTTCTTTAGGTTTCACAAATCGCTTCTTCAT   IV型下游引物V型下游引物VI型下游引物VII型下游引物VIII型上游引物VIII型下游引物
第三、本发明还提供一种用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，包括：基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从B组链球菌cfb基因中选取的DNA片段和从B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段；PCR扩增引物，根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中基因序列设计。此外，该试剂盒还包括杂交盒、盖片、杂交液。
第四、对本发明B组链球菌血清型检测基因芯片的特异性进行评价如下：
用不同B组链球菌血清型以及其他细菌来鉴定本发明的B组链球菌血清型检测基因芯片的特异性。在该特异性评价试验中，使用了B组链球菌全部9型菌株88株和7种阴道其他常见菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、德氏乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、白色念珠菌)，利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均得到正确的杂交结果证明了本发明的基因芯片具有良好的特异性。
本发明的有益技术效果是：本发明解决的技术问题是公开了一种基于荚膜多糖基因簇型专一序列的B组链球菌及其分型检测基因芯片，以补充现有B组链球菌(GBS)及其分型检测技术中存在的不足。由上述公开的技术方案，利用本发明的基因芯片可以达到检测GBS及其全部血清型的目的，由于本发明涉及的实验操作大部分为本领域常规操作，故操作过程简单易学，并且有望在大部分实验室实现；本发明主要基于Southern杂交的原理，Southern杂交是分子生物学的经典实验方法，其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号；通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术由于准确性高、重复性强，被广泛应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。本发明将已知具有血清型特异性的寡核苷酸固定在固相载体上与标记的待检样品进行杂交，通过杂交信号判断待检样品的血清型，既适用于常规血清型检测，又适用于实验室研究，将会具有深远意义。
四、附图说明
图1为本发明的基因芯片结构外形示意图。
图2为本发明芯片的单一点阵结构示意图。
图3为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌III型的扫描结果图。
图4为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌Ia型的扫描结果图。
图5为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌Ib型的扫描结果图。
图6为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌II型的扫描结果图。
图7为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌IV型的扫描结果图。
图8为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌V型的扫描结果图。
图9为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌VI型的扫描结果图。
图10为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌VII型的扫描结果图。
图11为本发明基因芯片杂交后检测B组链球菌VIII型的扫描结果图。
图中标号说明：A为芯片、1为芯片标签区、2为芯片点样区、Cy为Cy3表示一种荧光素、0代表50％DMSO、1-36依次代表探针编号。
五、具体实施方式
本发明提供了一种基因芯片(或称DNA微阵列)，特别是基于荚膜多糖基因簇血清型专一序列的B组链球菌检测基因芯片。
本发明主要基于Southern杂交的原理，Southern杂交是分子生物学的经典实验方法，其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号；通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段。按照实施例四提供的方法，得到实验结果，由附图2(单一点阵结构示意图)结合表1(GBS检测芯片上所有探针及其检测作用)可以对实验结果扫描图进行分析，依据荧光信号的出现位置对应表1中的检测作用，就可以顺利判断出待检样品是否是GBS及其血清型。该方法操作简便，准确性高，重复性强，对于常规血清型鉴定和流行病学研究都具有重要的意义。
本发明提供一种用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，以及一种利用该试剂盒检测B组链球菌血清型的方法。本发明所述B组链球菌血清型检测试剂盒包括：一个基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核菅酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从B组链球菌cfb基因中选取的DNA片段和从B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段；PCR扩增引物，根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中基因序列设计；还需要杂交盒(购自博奥公司)、盖片(购自博奥公司)、杂交液(配方见实施例四)。使用本发明试剂盒检测B组链球菌血清型的方法包括以下步骤：按革兰氏阳性细菌的常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用试剂盒中的引物扩增、标记待测样品的基因组DNA并纯化标记后的靶序列，将标记后的靶序列与B组链球菌检测基因芯片杂交，然后用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。本发明所述的B组链球菌血清型检测试剂盒是一种操作简便，准确性高，重复性强的检测B组链球菌血清型的工具，对于常规血清型鉴定和流行病学研究都具有重要的意义。
实施例一，寡核苷酸探针的制备和筛选。
1、序列下载：从Genbank上将用于设计检测GBS的cAMP基因的序列和用于设计检测GBS各血清型的GBS荚膜多糖基因簇中cpsH基因的序列全部下载；
2、探针设计：将已下载的序列导入探针设计软件Oligoarray 2.0中，利用软件分析得到探针序列；
3、探针合成：将选定的探针序列送探针合成公司委托合成，备用。
4、探针筛选：利用制备好的基因芯片(点制方法见实施例三)按实施例四的操作方法进行296次杂交实验筛选，最终从205条探针中得到适用探针35条，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：35所示。
实施例二，引物的制备和筛选。
1、序列下载：从Genbank上将用于设计检测GBS引物的cAMP基因的序列和用于设计检测GBS各血清型引物的GBS荚膜多糖基因簇的序列全部下载；
2、引物设计：利用引物设计软件Primer 5.0在已下载的序列上选取包含探针所在位点的位置设计引物；
3、引物选择：利用引物设计软件Primer 5.0给出的分析结果，调整选择适合用于Multiplex PCR的引物；
4、引物合成：将选定的引物序列送引物合成公司委托合成，备用。
5、引物筛选：利用制备好的基因芯片(点制方法见实施例三)按实施例四的操作方法进行296次杂交实验筛选，最终从43条引物中得到适用于Multiplex PCR的引物13条，如SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：48所示。
实施例三，B组链球菌及其分型检测基因芯片的通用制备方法。
1、利用自动基因芯片点样仪(SpotArray Microarry Printing System，SpotArray72)点样：
在点样仪的载物台上放置洁净的醛基化玻片。取每个探针溶液10微升，依次加入一新的384孔板相应孔中。将384孔板安放在点样仪的样品台处。使用的控制软件为SpotArray，使用TeleChem SMP3 Stealth Pin，以210um点间距完成全部点样。启动SpotArray software，开始点样，机械臂控制针头，每点一个样品要经过上样、清洗、干燥几个过程。点样完毕后，芯片在室温下自然干燥24小时，在芯片白色磨沙面处用铅笔标记。点好的芯片放在清洁的玻片盒中，待交联。
2、交联：为使探针与醛基化玻片更为有效的结合，达到探针的较好固定效果，使用紫外交联仪(UVP CL-1000M Ultraviolet Crosslinker)进行紫外交联处理，并置于阴凉干燥处保存，备用。
参阅图1所示的本发明的基因芯片结构外形示意图，该芯片A以57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的玻片为固相载体，1区为标签区；将35条寡核苷酸探针点在玻片上3mm×4mm的点样区2内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的四个点样区2内阵列排布规律相同。
参阅图2所示的本发明基因芯片单一点阵结构示意图，每个点样区内为10(行)×15(列)个探针点；位于中部的4条为GBS通用探针，两侧的为各型特异探针。图中Cy代表Cy3(荧光素的一种)这些点用于在扫描过程中判断阵列起止位置；0代表50％DMSO，用于填充阵列的矩形结构；1-36依次代表探针编号，对应作用如表1所示。
图2仅是一种探针排布方式的示例，并不是唯一的一种排布方式。点阵中的探针可以按照实际应用中的需要任意排布，探针的排布方式不影响实验结果。
实施例四，检测B组链球菌血清型的方法。
1、将获得的阴道拭子涂板(使用2×YT平板，配制方法详见分子克隆实验指南)置于二氧化碳培养箱中培养，挑取培养分离到的单菌落，过夜培养，提取基因组；本实施例按照革兰阳性菌提取基因组的常规方法均可；
2、扩增靶序列：取0.5ul(DNA含量＞10ng)基因组加入Multiplex PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示；
表3 Multiplex PCR反应混合液配方
成分     浓度     加样量(ul)
ddH2O10×PCR bufferMg2+dNTP MixtureWl-1至Wl-13Taq     -10×25mM10mM7uM5U/ul     29.2511各10.3
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
95℃ 10min
95℃ 30sec
52℃ 45sec
72℃ 1min回到第二步，共30个循环
72℃ 10min
4℃  20min
3、标记：取16.4ul PCR产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示：
表4 标记混合液配方
成分   浓度     加样量(ul)
10×PCR bufferMg2+dNTP MixtureWl-2，Wl-4至Wl-11，Wl-13Cy3-dUTPTaq   10×25mM10mM7uM25nM5U/ul     311各0.80.30.3
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
95℃  10min
95℃  30sec
50℃  45sec
72℃  1min回到第二步，共35个循环
72℃  10min
4℃   20min
4、纯化：取标记产物，加入纯化柱(MILLIPORE公司)内，补水至400ul，6000rpm，离心15分钟，弃液，在纯化柱膜上加30ul ddH2O，室温静置5分钟，将纯化柱倒扣在套管上，6000rpm，离心2分钟，弃纯化柱，将套管中的收集液置于65℃烘干；
5、杂交：用12ul杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物，取制作好的本基因芯片置于杂交盒(博奥公司)内，盖上定制的盖片(博奥公司)，将回溶后的产物点在本芯片的探针阵列区域，注意盖片和芯片之间不能有气泡，盖紧杂交盒，放入40℃水浴锅中15-18h。杂交结束后，取出杂交盒，去除盖片，分别依次在洗液A中洗涤3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤90sec，并在空气中风干：
杂交液配方：25％甲酰胺；  0.1％SDS；  6×SSPE
洗液A：1×SSC；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6、扫描：用LuxScan-10K/A基因芯片扫描仪(博奥公司)的绿色激光(532nm)扫描，设定激光强度为80％，PMT Gain为70％，扫描分辨率为5um。扫描结果存为JPG，TIF格式的文件；
7、结果分析：根据荧光信号出现的位置和强度对照探针排布规律对结果进行分析，即可判断待检样品的血清型。比如：待测样品扫描结果如图3所示，那么由图2所示的探针排布规律可知，扫描结果图中收集到荧光信号的探针号为NO.1，NO.2，NO.3，NO.4，NO.15，NO.16，NO.17，NO.18，对应表1(GBS分型检测芯片上所有探针及其检测作用)所示的检测作用，可知该待检样品为GBS且血清型为III型，参阅图3所示(由于特异探针荧光强度较用于定位的Cy3点(白框内)约高3个数量级，故在结果图中较暗)。
采用同样的分析方法，可以得到如图4至图11所示的GBS及其Ia、Ib、II、IV、V、VI、VII、VIII血清型的扫描结果。
实施例五，对基因芯片进行特异性评价实验
对实施例三中制备的基因芯片按照实施例四所述的操作方法进行特异性评价如下：
用不同B组链球菌血清型以及其他细菌来鉴定本发明的B组链球菌血清型检测基因芯片的特异性。在该特异性评价试验中，使用了临床分离到的B组链球菌88株和7种阴道其他常见菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、德氏乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、白色念珠菌)，利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，检测结果为：B组链球菌Ia型10株，B组链球菌Ib型8株，B组链球菌II型10株，B组链球菌III型30株，B组链球菌IV型10株，B组链球菌V型9株，B组链球菌VI型2株，B组链球菌VII型8株，B组链球菌VIII型1株，阴性结果即非B组链球菌7株。经过将上述结果与血清学和分子生物学方法(详见Fanrong Kong，journalof clinical microbiology，jan.2002，p.216-226)检测结果比对，符合率达到100％，证明了本发明的基因芯片具有良好的特异性。
实施例六，对基因芯片进行双盲实验检测
对实施例三中制备的基因芯片按照实施例四所述的操作方法进行双盲实验检测如下：
双盲实验是指在参加试验或评价的研究人员或研制工作人员不知道也不能识别菌株提供者所提供菌株的血清型的情况下，通过杂交实验检测得到结果；同时菌株提供者不参与芯片检测实验过程，而是利用血清检测或者分子生物学检测的方法得到结果；然后将双方的结果进行比对，以评价芯片的检测效果的实验方法。在试验实施过程中一直保持盲态，只有在试验结束、完成数据整理后由指定人员揭盲。采用盲法技术是为了防止由于对菌株血清型的了解而引起的有意识和无意识的在实施和评价试验中的偏差。共随机选取28株未知血清型的B组链球菌进行杂交实验检测，其检测实验结果整理后(详见表5)与血清检测以及分子生物学检测方法(详见Fanrong Kong，journal ofclinical microbiology，jan.2002，p.216-226)得到的结果完全一致，从而证明了本发明基因芯片的应用效果。
表5
样品编号 基因芯片检测结果 血清及分子生物学检测结果
HK-18 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
HK-23 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
HK-29 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
HK-45 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
HK-66 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
HK-116 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
UK-12 为GBS且血清型为II型 B组链球菌II型
UK-8 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-10 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-19 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-22 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-28 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-11 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-24 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
UK-32 为GBS且血清型为III型 B组链球菌III型
 UK-37UK-38HK-62HK-67HK-108KOREA-37KOREA-52SG97/659UK-17HK-83HK-122GBS-108GBS-138SAG     为GBS且血清型为III型为GBS且血清型为III型为GBS且血清型为IV型为GBS且血清型为IV型为GBS且血清型为IV型为GBS且血清型为IV型为GBS且血清型为IV型为GBS且血清型为IV型为GBS且血清型为V型为GBS且血清型为VII型为GBS且血清型为VII型为GBS且血清型为VII型为GBS且血清型为VII型 B组链球菌III型B组链球菌III型B组链球菌IV型B组链球菌IV型B组链球菌IV型B组链球菌IV型B组链球菌IV型B组链球菌IV型B组链球菌V型B组链球菌VII型B组链球菌VII型B组链球菌VII型B组链球菌VII型
实施例七，B组链球菌血清型检测试剂盒的制备。
本发明所述B组链球菌血清型检测试剂盒包括：一个基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从B组链球菌cfb基因中选取的DNA片段和从B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段，如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：35所示；PCR扩增引物，根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中基因序列设计，如SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：48所示；还需要杂交盒(购自博奥公司)、盖片(购自博奥公司)、杂交液(配方见实施例四)。使用本发明试剂盒检测B组链球菌血清型的方法如实施例四所示。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
           SEQUENCE LISTING
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>B组链球菌检测基因芯片及其检测方法利检测用试剂盒
<130>TBC2005001-CN
<160>48
<170>Patentln version 3.2
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>Group B Streptococcus
<400>1
tggtgcattg ttattttcac cagctgtatt agaagtac                             38
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>Group B Streptococcus
<400>2
 accagctgta ttagaagtac atgctgatca agtgac                              36
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus
<400>3
tgatcaagtg acaactccac aagtggtaaa tcatgtaa                             38
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus
<400>4
 aaatggctca aaagcttgat caagatagca ttcagttg                            38
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ia
<400>5
 ggtagagatt tgattgggtc agactggatt aatggtat                            38
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ia
<400>6
 gggctggaat agtagctata ttggcgcaga tgtttatt                            38
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ia
<400>7
cgtataatta atttgcgatc cgggagtagt gaatccag                             38
<210>8
<211>37
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ib
<400>8
atttagaagt ccagaatttc atagagtcat tgctgca                              37
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ib
<400>9
ggtctggatc tagagctggt attatagttg tgctacta                             38
<210>10
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ib
<400>10
gtcgggaagt agtgaatcta gattttcttt gtacaagg                              38
<210>11
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ib
<400>11
taccgtacac tcagtaatta ctgactcact atttctgg                              38
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus II
<400>12
agtagtagca aggtatgcgt atggatttaa tcatccca                              38
<210>13
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus II
<400>13
aatagcaccg tatgtacagt ttattgcgat gtttagtt                              38
<210>14
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus II
<400>14
agtggtagaa tttattacgc gaagcttatc ttaacaga                              38
<210>15
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus III
<400>15
cctatgctga agccaacttt atttggaaga gaattgtt                              38
<210>16
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus III
<400>16
tggaagagaa ttgttttcaa tagagtggtt tccacata                              38
<210>17
<211>37
<212>DNA
<213>group B streptococcus III
<400>17
tagagtggtt tccacatatg agaataagac ttgcggc                               37
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus III
<400>18
tggtttccac atatgagaat aagacttgcg gcatattt                              38
<210>19
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus IV
<400>19
atagttgctc cgtacataca actgttcttg ttagcatt                              38
<210>20
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus IV
<400>20
agttgctccg tacatacaac tgttcttgtt agcattta                              38
<210>21
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus IV
<400>21
gctccgtaca tacaactgtt cttgttagca tttacttt                              38
<210>22
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus IV
<400>22
gatagccttt tgacaggtag gttaaactat gctcattt                              38
<210>23
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus V
<400>23
tactcaatta taaacgacta aagcctgttg tgatggtt                              38
<210>24
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VI
<400>24
tgaatggatt ccttctatga aagttagact tactgcat                              38
<210>25
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VI
<400>25
gtgcatattt gacaggggca agaattttcc taatttgt                              38
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VI
<400>26
taagagcgat tttagatggg aatttcctta ttgggcaa                              38
<210>27
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VI
<400>27
tttccttatt gggcaaggta taagagttcc ctcc                                  34
<210>28
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VII
<400>28
aagaaaactc gttactatct tcttgttatt tgtcgcga                              38
<210>29
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VII
<400>29
gaaaactcgt tactatcttc ttgttatttg tcgcgact                              38
<210>30
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VII
<400>30
aaactcgtta ctatcttctt gttatttgtc gcgactat                              38
<210>31
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VII
<400>31
actcgttact atcttcttgt tatttgtcgc gactattt                              38
<210>32
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VIII
<400>32
tagtgattat cccattattg atgtcggcaa ctgttgag                              38
<210>33
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VIII
<400>33
gattatccca ttattgatgt cggcaactgt tgagaact                              38
<210>34
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VIII
<400>34
cccattattg atgtcggcaa ctgttgagaa ctatatcg                              38
<210>35
<211>38
<212>DNA
<213>group B streptococcus VIII
<400>35
tgtcggcaac tgttgagaac tatatcgtaa atgtaaat                              38
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>group B streptococcus
<400>36
gatgtatcta tctggaactc tagtg                                            25
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>group B streptococcus
<400>37
tttttccacg ctagtaatag cctc                                             24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ia Ib II III IV V VI VII
<400>38
gaacctcaga attgtcagtg gtca                                             24
<210>39
<211>25
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ia
<400>39
attatttata acgatgttta ctgta                                            25
<210>40
<211>22
<212>DNA
<213>group B streptococcus Ib
<400>40
aggtcgaatg cgatcctagt gg                                               22
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>group B streptococcus II
<400>41
cttagtgcaa gtgttgaaga ata                                              23
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>group B streptococcus III
<400>42
ttggggtttc aaaaaaagta tgg                                              23
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>group B streptococcus IV
<400>43
caactacatt gactttttta ctat                                             24
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>group B streptococcus V
<400>44
ataataccct gtccttgaaa a                                                 21
<210>45
<211>25
<212>DNA
<213>group B streptococcus VI
<400>45
tactaatgta tgatgaatgt gaacc                                            25
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>group B streptococcus VII
<400>46
gttcaactat tcttatttct ttac                                             24
<210>47
<211>19
<212>DNA
<213>group B streptococcus VIII
<400>47
ggtgccactt ctttaggtt                                                   19
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>group B streptococcus VIII
<400>48
tcacaaatcg cttcttcat                                                   19

Claims (8)

1、一种B组链球菌检测基因芯片，包括载体及固定在载体表面的探针；其特征在于，所述载体表面固定有数条检测B组链球菌的寡核苷酸探针和数条检测B组链球菌各种血清型的寡核苷酸探针共35条，为SEQ ID NO：1-SEQID NO：35所示。
2、根据权利要求1所述的B组链球菌检测基因芯片，其特征在于，所述载体为固相载体，包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜。
3、根据权利要求1所述的B组链球菌检测基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针在固相载体上的排布形式为形成数个n×n的阵列，每一阵列均具有检测B组链球菌的探针和检测B组链球菌各种血清型的全部探针。
4、根据权利要求1所述的B组链球菌检测基因芯片，其特征在于，所述用于B组链球菌及其血清型检测的寡核苷酸探针序列为35条，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：35所示；该寡核苷酸探针序列由5’端至3’端的组成及其功能是：
NO.1 TGGTGCATTGTTATTTTCACCAGCTGTATTAGAAGTAC用于检测B组链球菌；
NO.2 ACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATCAAGTGAC  用于检测B组链球菌；
NO.3 TGATCAAGTGACAACTCCACAAGTGGTAAATCATGTAA用于检测B组链球菌；
NO.4 AAATGGCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTG用于检测B组链球菌；
NO.5 GGTAGAGATTTGATTGGGTCAGACTGGATTAATGGTAT用于检测B组链球菌的Ia型；
NO.6 GGGCTGGAATAGTAGCTATATTGGCGCAGATGTTTATT用于检测B组链球菌的Ia型；
NO.7 CGTATAATTAATTTGCGATCCGGGAGTAGTGAATCCAG用于检测B组链球菌的Ia型；
NO.8 ATTTAGAAGTCCAGAATTTCATAGAGTCATTGCTGCA用于检测B组链球菌的Ib型；
NO.9 GGTCTGGATCTAGAGCTGGTATTATAGTTGTGCTACTA用于检测B组链球菌的Ib型：
NO.10 GTCGGGAAGTAGTGAATCTAGATTTTCTTTGTACAAGG用于检测B组链球菌的Ib型；
NO.11 TACCGTACACTCAGTAATTACTGACTCACTATTTCTGG用于检测B组链球菌的Ib型；
NO.12 AGTAGTAGCAAGGTATGCGTATGGATTTAATCATCCCA用于检测B组链球菌的II型；
NO.13 AATAGCACCGTATGTACAGTTTATTGCGATGTTTAGTT用于检测B组链球菌的II型；
NO.14 AGTGGTAGAATTTATTACGCGAAGCTTATCTTAACAGA用于检测B组链球菌的II型；
NO.15 CCTATGCTGAAGCCAACTTTATTTGGAAGAGAATTGTT用于检测B组链球菌的III型；
NO.16 TGGAAGAGAATTGTTTTCAATAGAGTGGTTTCCACATA用于检测B组链球菌的III型；
NO.17 TAGAGTGGTTTCCACATATGAGAATAAGACTTGCGGC 用于检测B组链球菌的III型；
NO.18 TGGTTTCCACATATGAGAATAAGACTTGCGGCATATTT用于检测B组链球菌的III型；
NO.19 ATAGTTGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATT用于检测B组链球菌的IV型；
NO.20 AGTTGCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTTA用于检测B组链球菌的IV型；
NO.21 GCTCCGTACATACAACTGTTCTTGTTAGCATTTACTTT用于检测B组链球菌的IV型；
NO.22 GATAGCCTTTTGACAGGTAGGTTAAACTATGCTCATTT用于检测B组链球菌的IV型；
NO.23 TACTCAATTATAAACGACTAAAGCCTGTTGTGATGGTT用于检测B组链球菌的V型；
NO.24 TGAATGGATTCCTTCTATGAAAGTTAGACTTACTGCAT用于检测B组链球菌的VI型；
NO.25 GTGCATATTTGACAGGGGCAAGAATTTTCCTAATTTGT用于检测B组链球菌的VI型；
NO.26 TAAGAGCGATTTTAGATGGGAATTTCCTTATTGGGCAA用于检测B组链球菌的VI型；
NO.27 TTTCCTTATTGGGCAAGGTATAAGAGTTCCCTCC    用于检测B组链球菌的VI型；
NO.28 AAGAAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGA用于检测B组链球菌的VII型；
NO.29 GAAAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACT用于检测B组链球菌的VII型；
NO.30 AAACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTAT用于检测B组链球菌的VII型；
NO.31 ACTCGTTACTATCTTCTTGTTATTTGTCGCGACTATTT用于检测B组链球菌的VII型；
NO.32 TAGTGATTATCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAG用于检测B组链球菌VIII型；
NO.33 GATTATCCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGAACT用于检测B组链球菌VIII型；
NO.34 CCCATTATTGATGTCGGCAACTGTTGAGAACTATATCG用于检测B组链球菌VIII型；
NO.35 TGTCGGCAACTGTTGAGAACTATATCGTAAATGTAAAT用于检测B组链球菌VIII型。
5、一种利用权利要求1所述的B组链球菌检测基因芯片检测B组链球菌血清型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中聚合酶基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按革兰氏阳性细菌的常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列并纯化标记后的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与B组链球菌检测基因芯片杂交；
(5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
6、根据权利要求5所述的B组链球菌检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用的引物为13条，SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：48所示。各条引物的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是：
P-1 GATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG用于检测B组链球菌的上游引物；
P-2 TTTTTCCACGCTAGTAATAGCCTC用于检测B组链球菌的下游引物；
P-3 GAACCTCAGAATTGTCAGTGGTCA用于检测B组链球菌Ia-VII型上游通用引物；
P-4 ATTATTTATAACGATGTTTACTGTA用于检测B组链球菌Ia型下游引物；
P-5  AGGTCGAATGCGATCCTAGTGG用于检测B组链球菌Ib型下游引物；
P-6CTTAGTGCAAGTGTTGAAGAATA用于检测B组链球菌II型下游引物；
P-7 TTGGGGTTTCAAAAAAAGTATGG用于检测B组链球菌III型下游引物；
P-8 CAACTACATTGACTTTTTTACTAT用于检测B组链球菌IV型下游引物；
P-9 ATAATACCCTGTCCTTGAAAA用于检测B组链球菌V型下游引物；
P-10 TACTAATGTATGATGAATGTGAACC用于检测B组链球菌VI型下游引物；
P-11 GTTCAACTATTCTTATTTCTTTAC用于检测B组链球菌VII型下游引物；
P-12 GGTGCCACTTCTTTAGGTT用于检测B组链球菌VIII型上游引物；
P-13 TCACAAATCGCTTCTTCAT用于检测B组链球菌VIII型下游引物。
7、一种用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，其特征在于，其包括：基因芯片，其包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从B组链球菌cfb基因中选取的DNA片段和从B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段，共35条，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：35所示；PCR扩增引物，根据B组链球菌cfb基因和B组链球菌不同血清型荚膜多糖基因簇中基因序列设计，共13条，为SEQ ID NO：36-SEQ IDNO：48所示。
8、根据权利要求7所述的用于B组链球菌血清型检测的试剂盒，其特征是还包括杂交盒、盖片、杂交液。
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Structural and genetic diversity of group B streptococcuscapsular polysaccharides. Cieslewicz,Michael J.等,Infection and Immunity,Vol.73 No.5 2005 *
Structural and genetic diversity of group B streptococcuscapsular polysaccharides. Cieslewicz,Michael J.等,Infection and Immunity,Vol.73 No.5 2005;应用核酸杂交Ribotyping技术对B组链球菌的研究 申阿东等，中华围产医学杂志，第4卷第2期 2001 *
应用核酸杂交Ribotyping技术对B组链球菌的研究 申阿东等，中华围产医学杂志，第4卷第2期 2001 *

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