CN110376374A - 一种b族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒及其制备方法，涉及微生物检测。所述B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒设有盒体和设置于盒体内的检测试纸，所述检测试纸设有底衬、以及由左往右依次连接并设置在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和滤纸。制备：1)荧光颗粒预处理；2)活化荧光微球；3)结合B族链球菌抗体；4)标记垫制备；5)包被抗体制备；6)纸条组装。方便快捷：应用于检测样本时，只需加样后等待10～15min即获得检测结果，操作简单。可用于临床培养鉴定的B族链球菌纯菌菌落，增菌培养液和临床常规采样的分泌物标本的检测和分型。

Description

一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物检测，尤其是涉及一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

B族链球菌(group B streptococcal,GBS)又名无乳链球菌，是一种寄居于泌尿生殖道和下消化道的条件致病菌。有文献报道，孕妇感染GBS可能会引起早产、胎膜早破、羊膜腔感染、产褥感染等不良妊娠结局([1]Landwehr-Kenzel,S.and P.Henneke,Interactionof Streptococcus agalactiae and Cellular Innate Immunity in Colonization andDisease.Front Immunol,2014.5:p.519)；新生儿如发生GBS感染可引起新生儿肺炎、败血症、脑膜炎、中毒性休克，严重者可能会有死亡的危险([2]Nielsen,M.,N.Sheikh,E.Fitzgerald,et al.Screening for early-onset invasive group B Streptococcaldisease in neonates in an Irish hospital(2001-2014):a retrospectiveaudit.Infect Dis(Lond),2017.49(6):p.466-470)。根据荚膜多糖的特异性，目前已知可以检测到的B族链球菌有10种血清型(Ia、Ib、II-IX型)，不同血清型毒力情况不同，研究表明，GBS血清型与分子分型有一定的关系，不同分子型GBS对应毒力基因和耐药基因不同([3]苏锦珍、吴伟元.围生期孕产妇感染或定植的B族链球菌耐药情况、血清型、毒力基因及基因型分析[J].中华妇幼临床医学杂志，doi：10.3877/cma.j.issn.1673-5250.2016.05.017)，其中毒力最强的为III型，它可以导致严重感染，同时III型也是国内外临床感染的最常见血清型。

目前临床常用GBS检测方法主要有：微生物细菌培养检测方法、分子生物学检测方法、免疫学检测方法。传统血平板分离单个菌落进行细菌培养鉴定的方法操作比较复杂，人为干扰因素较多，阳性率低([4]时春艳，曲首辉，杨磊等，妊娠晚期孕妇B族链球菌带菌状况的检测及带菌对妊娠结局的影响[J].中华妇产科杂志，2010,45(1)12-16)；分子生物学检测方法中，常见应用PCR检测技术，该方法特异性强、灵敏度高，可批量操作，相对比常规微生物培养法，大大提高阳性检出率，可是PCR法对实验室要求高，需要专有的PCR实验室，特有的实验设备，无法获得GBS菌株和进行药敏试验等缺点([5]贾忠兰，卢新，许丽风.三种方法筛查孕妇B族链球菌的效果评价[J]标记免疫分析与临床，2017，24(3)：338-339)。免疫层析法相比较于前面两种方法，操作简单，出结果时间短，国内有采用胶体金免疫层析方法对GBS进行快速抗原检测，但是目前没有直接对其血清型进行检测的方法，而对于GBS的临床检测，能够快速鉴定其血清型，对于预防用药更有意义。因此，早期检测GBS感染并鉴定其血清型，可望有效降低孕妇不良妊娠的产生，并对预防孕妇围产期胎儿和新生儿的感染，降低新生儿死亡率有着重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供检测方便快捷、检测灵敏度高、特异性强、可重复性高和检测结果可靠，在B族链球菌体外诊断领域具有广阔应用前景的一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒及其制备方法。

本发明的第二目的在于提供一种B族链球菌快速血清学分型的检测方法。

所述B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒设有盒体和设置于盒体内的检测试纸，所述检测试纸设有底衬、样品垫、标记垫、包被膜和滤纸，所述样品垫由左往右依次连接并设置在底衬上；所述标记垫上含有荧光微球标记的兔抗B族链球菌抗体，包被膜上含有兔抗B族链球菌总抗体及其主要临床致病血清学亚型抗体，包被膜上由左往右依次设置有平行排列的检测T线和质控C线；所述检测T线上可分别包被B族链球菌总抗体及Ia、Ⅱ和Ⅲ三种亚型抗体，质控C线上包被有羊抗兔二抗。

所述包被膜的两端可分别与标记垫和滤纸相互交叠连接，所述包被膜上可压贴有标记垫，所述标记垫上可压贴有样品垫；所述样品垫可为玻璃纤维垫等；所述包被膜可为硝酸纤维素膜等，硝酸纤维素膜上同时包被主要致病血清学亚型B族链球菌的单克隆抗体，可实现一次检测鉴别出多种主要致病性病菌，同时通过不同包被方式实现其他用途，例如单独包被总抗体作为初筛，或单独包被Ia、Ⅱ或Ⅲ中任一种亚型抗体作为单一血清型B族链球菌的分型。

所述盒体上可开设有向样品垫添加样品的加样孔和用于观察检测结果的观察窗口。

所述B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)荧光颗粒预处理

取出荧光颗粒，超声混匀，再取出N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(简称EDC)，在室温平衡10～30min；取100μl荧光颗粒+900μl pH为5.0的2-吗啉乙磺酸(简称MES)溶液，涡旋混匀后离心，弃上清，再加入1ml 2-吗啉乙磺酸溶液，超声混匀后离心，弃上清；

在步骤1)中，所述涡旋混匀后离心的时间可为15min；所述超声混匀后离心的时间可为15min。

2)活化荧光微球

加入600～800μl MES溶液，100～200μl 10mg/mL NHS溶液及10～100μl 10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温活化10～30min，然后离心机离心后弃上清，加入1ml pH为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸,(简称HEPES)，超声混匀后离心，弃上清后再加1ml HEPES，超声混匀，得到活化的荧光微球；

在步骤2)中，所述离心机离心的时间可为15min；所述超声混匀后离心的时间可为15min。

3)结合B族链球菌抗体

向活化后的荧光微球中加入100～320μg抗体，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温反应4～5h，第1次用离心机离心后弃上清，再加1ml封闭液，超声混匀，第2次离心机离心弃上清后加1ml封闭液，超声混匀，置于旋转混合仪上室温封闭30～60min，封闭完成后，第3次离心机离心弃上清后，加入500μl封闭液，超声混匀，得到荧光微球标记兔抗B族链球菌抗体，置于4℃避光保存；

在步骤3)中，所述第1次离心机离心的时间可为15min；所述第2次离心机离心的时间可为15min；第3次离心机离心的时间可为15min。

4)标记垫制备

打开冻干机，预冷后将玻纤平铺于玻璃板上，均匀铺上1︰(30～100)的荧光微球工作液，冻干过夜放置于干燥间备用；

5)包被抗体制备

将硝酸纤维素膜NC膜均匀粘贴至PVC底板上，置于常温，50％湿度左右的环境中平衡1～4h待用，从-20℃取出B族链球菌的总抗体和Ia型抗体、Ⅱ型抗体、Ⅲ型抗体及羊抗兔抗体复溶；分别计算以及配置包被抗体，体系如下：GBS总抗体：用10mM磷酸盐缓冲液(简称PBS溶液)稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ia型抗体：用10mM磷酸盐缓冲液(简称PBS溶液)稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ⅱ型抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ⅲ型抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL，羊抗兔抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为0.2～1.0mg/mL；充分混匀后离心10min，上清液转移至另一根管子；用十二烷基硫酸钠(简称SDS)和超纯水清洗管路，各20～40个循环，分别在7mm，11mm，15mm，19mm，23mm位置包被Ia型抗体，Ⅱ型抗体，Ⅲ型抗体，总抗体和羊抗兔抗体；设置喷量为1μl/cm，运行仪器，将包被好的NC膜置于湿度<30％，温度为37℃的环境下干燥15h左右；

6)纸条组装

取出干燥后的NC膜，依次组装上吸水纸、标记垫和样品垫，用裁切机切成4mm的宽度，装至塑料卡壳中，利用压壳机压紧卡壳。

所述B族链球菌快速血清学分型检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：

1)配置样本处理液：碳酸盐缓冲液CB9.6：2.93g碳酸氢钠，1.59g碳酸钠，加入纯水定容至1L；

2)采集样本：取女性直肠或阴道分泌物至增菌管中培养，6～8h后，加300μl提取液，搅拌均匀后，静置30s，制成样本提取液；

3)加样反应：用移液枪吸取静置后的样本提取液70μl，加入到盒体的加样孔内，反应15min，样本提取液通过滤纸的吸水作用沿着样品垫依次向结合垫、包被膜移动；

4)结果读取：

定性判读：将反应完成后的检测试纸插入荧光免疫分析仪当中直接判读阴性、阳性及血清型。

本发明的基本原理如下：

本发明在免疫层析技术基础上应用了含有时间分辨荧光微球作为高敏感性和特异性的标记物质。利用双抗体夹心原理，当样本加入到加样孔时在毛细作用下向前层析，B族链球菌会先与荧光微球标记兔抗B族链球菌抗体结合，然后一起向前流动，若样本中含有B族链球菌，则会被包被膜处相对应亚型抗体和总抗体所捕获，多余的微球标记抗体流动到质控线被羊抗兔抗体所捕获。在激发光的作用下，荧光物质发射特定波的信号，荧光分析仪获取荧光信号从而判读出结果。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的技术效果：

1、本发明所述的B族链球菌的快速血清学分型检测试剂盒运用荧光微球作为标记示踪物，灵敏度高；同时包被GBS总抗体和主要致病性GBS血清亚型抗体，不仅可以快速判断GBS阴阳性，还可以快速确定所感染GBS血清型，能够给临床医生提供GBS感染更准确的信息，指导治疗用药。

2、方便快捷：本发明应用于检测样本时，只需加样后等待10-15min即可获得检测结果，操作简单。

3、应用范围广泛：本发明可用于临床培养鉴定的B族链球菌纯菌菌落，增菌培养液和临床常规采样的分泌物标本的检测和分型。本发明用于B族链球菌临床主要致病血清型的分型鉴定；通过不同抗体包被方案，还可以实现GBS初筛和某个特定GBS血清型的鉴定。

附图说明

图1为本发明所述B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒中检测试纸实施例的结构示意图之一。

图2为本发明所述B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒中检测试纸实施例的结构示意图之二。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

参见图1，所述B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，首先可实现培养的可疑纯菌菌落、增菌培养液和临床常规采样分泌物标本的快速鉴定，实施例设有盒体和设置于盒体内的检测试纸，所述检测试纸设有底衬1、以及由左往右依次连接并设置在底衬上的样品垫2、标记垫3、包被膜4和滤纸5，所述标记垫3上含有荧光微球标记的兔抗B族链球菌抗体，包被膜4上由左往右设置有平行排列的检测T线6和质控C线7；所述检测T线6上包被有鼠抗B族链球菌总抗体，质控C线7上包被有羊抗兔二抗。

参见图2，所述B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，更要实现培养的可疑纯菌菌落和增菌培养液的快速分型，实施例设有盒体和设置于盒体内的检测试纸，所述检测试纸设有底衬1、以及由左往右依次连接并设置在底衬上的样品垫2、标记垫3、包被膜4和滤纸5，所述标记垫3上含有荧光微球标记的兔抗B族链球菌抗体，包被膜4上由左往右依次设置有平行排列的检测T线6～9和质控C线10；所述检测T线6～9上依次包被有Ia、Ⅱ和Ⅲ三种GBS亚型和鼠抗B族链球菌总抗体，质控C线10上包被有羊抗兔二抗。包被膜4膜上同时包被主要致病血清亚型B族链球菌的单克隆抗体，可实现一次检测鉴别出多种常见致病性病菌，同时通过不同包被方式，例如单独包被Ia、Ⅱ或Ⅲ中任一种亚型抗体作为单一血清型B族链球菌的分型。

所述包被膜4的两端可分别与标记垫3和滤纸5相互交叠连接，所述包被膜4上可压贴有标记垫3，所述标记垫3上可压贴有样品垫2；所述样品垫2为玻璃纤维垫；所述包被膜4为硝酸纤维素膜等。

所述盒体上开设有向样品垫添加样品的加样孔和用于观察检测结果的观察窗口。

以下给出具体实施例。

在本发明中，如未作特殊说明，溶剂与相关试剂的用量为反应的常规用量，本领域的技术人员根据现有技术即可确定：本发明使用的试剂为常规试剂，可通过市场购买得到，所用起始原料和反应物均可通过现有技术或公开的现有文献制备得到，除特殊说明外，本发明所述的百分比含量均为质量百分比；除特殊说明外，本发明所述“室温”均为18～26℃。

本发明所述的一种B族链球菌的检测试剂盒，该试剂盒但括盒体和设置于盒体内的检测试纸，具体地，盒体上开设有用于添加样品的加样孔和用于观察检测结果的观察窗口.检测试纸包括底板，以及由左往右依次连接的样品垫、标记垫、包被膜和滤纸。样品垫上有标记荧光微球的兔抗B族链球菌抗体，包被膜上固定了鼠抗B族链球菌抗体和Ia，Ⅱ和Ⅲ三种B族链球菌亚型抗体，和用于质量控制的羊抗兔二抗。

标记垫上涂有时间分辨荧光微球标记的GBS抗体，微球的平均粒径为300nm，激发波长360nm，发射波长615nm；所用微球购于美国Bangs Lab公司，GBS抗体及羊抗兔抗体购于Abcam公司；样品垫，标记垫为玻璃纤维垫，购于上海金标公司；EDC，NHS购于Sigma公司。

B族链球菌检测试剂盒的制备方法

(1)荧光颗粒预处理

取出荧光颗粒，超声混匀，再取出N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(简称EDC)，在室温平衡10～30min。

取100μl荧光颗粒+900μl PH为5.0的2-吗啉乙磺酸(简称MES)溶液，涡旋混匀后离心15min，弃上清，再加入1ml MES溶液，超声混匀后离心15min，弃上清；

(2)活化荧光微球

加入600～800μl MES溶液，100～200μl 10mg/mL NHS溶液及10～100μl 10mg/mLEDC溶液，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温活化10～30min，然后离心机离心15min后弃上清，加入1ml PH为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(简称HEPES)，超声混匀后离心15min，弃上清后再加1ml HEPES，超声混匀，得到活化的荧光微球；

(3)结合B族链球菌抗体

向活化后的荧光微球中加入100～320μg抗体，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温反应4～5h。用离心机离心15min后弃上清，再加1ml封闭液，超声混匀，离心机离心15min，弃上清后加1ml封闭液，超声混匀，置于旋转混合仪上室温封闭30～60min。封闭完成后，离心机离心15min弃上清后，加入500μl封闭液，超声混匀，得到荧光微球标记兔抗B族链球菌抗体，置于4℃避光保存；

(4)标记垫制备

打开冻干机，预冷后将玻纤平铺于玻璃板上，均匀铺上1︰(30～100)的荧光微球工作液，冻干过夜放置于干燥间备用；

(5)包被抗体制备

将NC膜均匀粘贴至PVC底板上，置于常温，50％湿度左右的环境中平衡1～4h待用，从-20℃取出鼠抗B族链球菌抗体和Ia、Ⅱ、Ⅲ血清学亚型GBS抗体及羊抗兔抗体(用于C线)于常温中复溶；分别计算以及配置包被抗体，体系如下：鼠抗B族链球菌抗体：用10mM磷酸盐缓冲液(PBS溶液)稀释到终浓度为2～3mg/mL；抗体Ia：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL；抗体Ⅱ：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL；抗体Ⅲ：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL，C线抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为0.2～1.0mg/mL，充分混匀后离心10min，上清液转移至另一根管子；用十二烷基硫酸钠(简称SDS)和超纯水清洗管路，各20～40个循环，分别在7mm，11mm，15mm，19mm，23mm位置包被Ia型抗体，Ⅱ型抗体，Ⅲ型抗体，总抗体和羊抗兔抗体；设置喷量为1μl/cm，运行仪器，将包被好的NC膜置于湿度<30％，温度为37℃的环境下干燥15h左右；

(6)纸条组装

取出干燥后的NC膜，依次组装上吸水纸、标记垫和样品垫，用裁切机切成4mm的宽度，装至塑料卡壳中，利用压壳机压紧卡壳。

以下给出所述B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的检测方法的实施例：

1)配置样本处理液：碳酸盐缓冲液CB 9.6：2.93g碳酸氢钠，1.59g碳酸钠，加入纯水定容至1L。

2)采集样本：取女性直肠或阴道分泌物至增菌管中培养，6～8h后，加300μl提取液，搅拌均匀后，静置30s，制成样本提取液。

3)加样反应：用移液枪吸取静止后的样本提取液70μl，加入到盒体的加样孔内，反应15min，样本提取液通过滤纸的吸水作用沿着样品垫依次向结合垫、包被膜移动。

4)结果读取：

定性判读：将反应完成后的检测试纸插入荧光免疫分析仪当中直接判读阴阳性及血清型。

以下给出对比例1。

性能评估试验：

为了验证本发明的有效效果，做了确证实验及灵敏度和特异性试验，具体实验过程如下：

(1)确证实验

试验样本准备：将已知血清型的GBS进行培养，所培养菌落血清型分别为：Ia、Ⅱ、Ⅲ型，待培养出单个菌落，进行加样反应。

试验方法：实验重复3次，分型鉴定验证结果参见表1。

表1

样本	试剂盒检测结果
		Ia	Ia
Ⅱ	Ⅱ
		Ⅲ	Ⅲ

由表1可知，本发明所述的检测试剂盒能够在有效时间内准确检测GBS血清分型。

(2)灵敏度试验

实验样本制备：首先利用比浊仪将B族链球菌用样本处理液稀释至1.0MCF，用样本处理液以上1.0MCF的B组链球菌分别稀释为浊度为0.8、0.65、0.5、0.4、0.3、0.2的样本。

注：MCF为麦氏单位，是浊度的单位，0.5MCF的细菌浓度近似为1.5*10^e8CFU/ml；CFU/ml：表示每毫升含菌落数量。

实验方法：实验重复2次，灵敏度试验结果参见表2。

表2

样本浊度	检测结果
		1.0	+++
0.8	+++
		0.65	++
0.5	++
		0.4	++
0.3	+
		0.2	+

注：“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。

由表2可知，本发明所述的检测试剂盒的灵敏度可以达到0.2MCF。

(3)特异性试验

实验样本制备：准备好肺炎链球菌、A族链球菌、血清型分别为IV、V、IX型的GBS样本。

实验方法：将上述样本进行检测，每种实验样本重复2次，特异性实验结果参见表3。

表3

样本	检测结果
		肺炎链球菌	-
A族链球菌	-
		IV型B族链球菌	-
V型B组链球菌	-
		IX型B组链球菌	-

注：“-”：表示阴性结果；“+”表示阳性结果。

由表3可知，本发明的检测试剂盒特异性较好，对常见的链球菌属其他菌种以及其他血清学亚型的GBS无阳性结果。

Claims (10)

1.一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于设有盒体和设置于盒体内的检测试纸，所述检测试纸设有底衬、样品垫、标记垫、包被膜和滤纸；所述样品垫由左往右依次连接并设置在底衬上；所述标记垫上含有荧光微球标记的兔抗B族链球菌抗体，包被膜上含有兔抗B族链球菌总抗体及其主要临床致病血清学亚型抗体，包被膜上由左往右依次设置有平行排列的检测T线和质控C线；所述检测T线上可分别包被B族链球菌总抗体及Ia、Ⅱ和Ⅲ三种亚型抗体，质控C线上包被有羊抗兔二抗。

2.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述包被膜的两端分别与标记垫和滤纸相互交叠连接，所述包被膜上压贴有标记垫。

3.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述标记垫上压贴有样品垫，所述样品垫为玻璃纤维垫。

4.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述包被膜为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上同时包被主要致病血清学亚型B族链球菌的单克隆抗体，可实现一次检测鉴别出多种主要致病性病菌，同时通过不同包被方式实现其他用途，单独包被总抗体作为初筛，或单独包被Ia、Ⅱ或Ⅲ中任一种亚型抗体作为单一血清型B族链球菌的分型。

5.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清学分型的检测试剂盒，其特征在于所述盒体上开设有向样品垫添加样品的加样孔和用于观察检测结果的观察窗口。

6.如权利要求1所述一种B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)荧光颗粒预处理

取出荧光颗粒，超声混匀，再取出N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，在室温平衡10～30min；取100μl荧光颗粒+900μl pH为5.0的2-吗啉乙磺酸溶液，涡旋混匀后离心，弃上清，再加入1ml2-吗啉乙磺酸溶液，超声混匀后离心，弃上清；

2)活化荧光微球

加入600～800μl MES溶液，100～200μl 10mg/mL NHS溶液及10～100μl 10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温活化10～30min，然后离心机离心后弃上清，加入1ml pH为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸超声混匀后离心，弃上清后再加1ml HEPES，超声混匀，得到活化的荧光微球；

3)结合B族链球菌抗体

向活化后的荧光微球中加入100～320μg抗体，利用超声混匀，于旋转混合仪上室温反应4～5h，第1次用离心机离心后弃上清，再加1ml封闭液，超声混匀，第2次离心机离心弃上清后加1mL封闭液，超声混匀，置于旋转混合仪上室温封闭30～60min，封闭完成后，第3次离心机离心弃上清后，加入500μl封闭液，超声混匀，得到荧光微球标记兔抗B族链球菌抗体，置于4℃避光保存；

4)标记垫制备

打开冻干机，预冷后将玻纤平铺于玻璃板上，均匀铺上1︰(30～100)的荧光微球工作液，冻干过夜放置于干燥间备用；

5)包被抗体制备

将硝酸纤维素膜NC膜均匀粘贴至PVC底板上，置于常温，50％湿度左右的环境中平衡1～4h待用，从-20℃取出B族链球菌的总抗体和Ia型抗体、Ⅱ型抗体、Ⅲ型抗体及羊抗兔抗体复溶；分别计算以及配置包被抗体，体系如下：GBS总抗体：用10mM磷酸盐缓冲液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ia型抗体：用10mM磷酸盐缓冲液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ⅱ型抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL；Ⅲ型抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为2～3mg/mL，羊抗兔抗体：用10mM PBS溶液稀释到终浓度为0.2～1.0mg/mL；充分混匀后离心10min，上清液转移至另一根管子；用十二烷基硫酸钠和超纯水清洗管路，各20～40个循环，分别在7mm，11mm，15mm，19mm，23mm位置包被Ia型抗体，Ⅱ型抗体，Ⅲ型抗体，总抗体和羊抗兔抗体；设置喷量为1μL/cm，运行仪器，将包被好的NC膜置于湿度<30％，温度为37℃的环境下干燥15h左右；

6)纸条组装

取出干燥后的NC膜，依次组装上吸水纸、标记垫和样品垫，用裁切机切成4mm的宽度，装至塑料卡壳中，利用压壳机压紧卡壳。

7.如权利要求6所述一种B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述涡旋混匀后离心的时间为15min；所述超声混匀后离心的时间为15min。

8.如权利要求6所述一种B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述离心机离心的时间为15min；所述超声混匀后离心的时间为15min。

9.如权利要求6所述一种B族链球菌快速血清分型的检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述第1次离心机离心的时间为15min；所述第2次离心机离心的时间为15min；第3次离心机离心的时间为15min。

10.如权利要求1所述B族链球菌快速血清学分型检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)配置样本处理液：碳酸盐缓冲液CB9.6：2.93g碳酸氢钠，1.59g碳酸钠，加入纯水定容至1L；

2)采集样本：取女性直肠或阴道分泌物至增菌管中培养，6～8h后，加300μl提取液，搅拌均匀后，静置30s，制成样本提取液；

3)加样反应：用移液枪吸取静置后的样本提取液70μl，加入到盒体的加样孔内，反应15min，样本提取液通过滤纸的吸水作用沿着样品垫依次向结合垫、包被膜移动；

4)结果读取：

定性判读：将反应完成后的检测试纸插入荧光免疫分析仪当中直接判读阴性、阳性及血清型。