CN105137073A

CN105137073A - 牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条

Info

Publication number: CN105137073A
Application number: CN201510477774.8A
Authority: CN
Inventors: 丁家波; 蒋卉; 徐磊; 张阁; 张玉洁; 朱良全; 王楠; 毛开荣
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明涉及一种快速、高效、准确的牛布鲁氏菌胶体金诊断方法。该胶体金使用布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为测试线包被抗原，提高了检测的敏感性；改进了LPS纯化和纯度测定方法，使开发的试剂盒具有良好的特异性；本发明利用鼠抗牛IgG？Fc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫，进一步提高了检测的特异性。本发明试纸条可用于检测牛血清中的布鲁氏菌抗体，具有特异性强，灵敏度高、方便快捷等特点。本发明对布鲁氏菌检测不需要复杂的检测仪器，特别适合牛场养殖人员和基层兽医使用。

Description

牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条

技术领域本发明涉及一种牛布鲁氏菌抗体诊断方法——牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条，属生物制品检测技术领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。

布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不断提高，随着动物布病的研究进展，动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝集试验(如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验)逐渐被敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)等新的检测技术所取代。

凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT)，以上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验(RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏菌监测的主要方法，该方法直接对牛乳进行检测，可以对奶牛群体进行筛检，该方法简便快速。

在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验(CFT)在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏感性下降。

ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛的布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种布鲁氏菌的ELISA检测方法也是研究的热点。目前，用于布鲁氏菌病检测的ELISA有间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种。

上述各种布病检测方法各有其自身的特点，但存在的共同缺陷是以上各种检验都必须在实验室内完成。一般先分离血清，然后按照各种方法的操作程序进行实验室检验。而免疫胶体金技术克服了上述缺陷，可以直接采血后，滴加到胶体金试纸条加样孔内，现场就能判定是否为布鲁氏菌感染。

虽然已有相关胶体金发明专利的报道，如中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所王兴龙等、吉林大学闫广谋等(申请号:CN200710055740.5，CN200710055741.X，CN200810051726.2)采用以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标抗体，由于SPA具有非特异性吸附IgG分子的能力，因此可用于对多种不同动物进行诊断，但对不同动物体内IgG吸附能力各不相同，因此对采用同一个试纸条对不同动物进行布病检测，其敏感性并不稳定。本发明使用的是针对牛IgGFc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫，只用于检测牛布鲁氏菌，提高了检测的敏感性和胶体金检测结果的稳定性。再如，杭州迪恩科技有限公司张明洲等(申请号:CN201310033074.0)，采用布鲁氏菌菌体抗原作为质控线包被抗原，再利用一种抗红细胞的单克隆抗体作为竞争用的单抗，吸附干燥的胶体金蛋白(流动带)，建立了夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，一方面该专利中并未明确阐述其核心技术特征，另一方面，由于布鲁氏菌与一些革兰氏阴性细菌，特别是耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157具有较强的菌体抗原相似性，而该专利中使用布鲁氏菌菌体抗原作为胶体金颗粒的吸附抗原，理论上其检测结果会存在一定的非特异性。

本发明以制备的光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)代替SPA，作为试纸条中测试线包被抗原(检测带)，提高了检测的敏感性；以鼠抗牛IgGFc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫(流动带)，提高了试纸条检测的特异性；以羊抗鼠IgG抗体作为检测试纸条的质控抗原(质控带)，开发建立的牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条克服了上述发明专利的不足，使建立的方法具有更好的特异性、敏感性和稳定性。

本发明专利具有操作简单，结果快捷，易于判断和保存等优点，同时无需任何仪器设备，非常适合临床快速诊断，特别是基层农村和小规模养殖场的布病检测。

发明内容

本发明的目的在于改变现有布鲁氏菌诊断技术均需要依靠实验室的现状，为我国牛布鲁氏菌的诊断提供一种方便快捷，并具有良好特异性和敏感性的诊断方法。

本发明的技术方案

1.一种牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条，该试剂条主要含有：以制备的光滑型猪种布鲁氏菌S2株的脂多糖(LPS)作为测试线包被抗原(检测带)，以鼠抗牛IgGFc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫(流动带)，以羊抗鼠IgG抗体作为检测试纸条的质控抗原(质控带)，同时含有试纸条样品吸收垫(样品垫)、玻璃纤维素膜(胶体金垫)、吸水纸；将喷有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上端贴上吸水垫，下端贴上金标垫及样品吸收垫，以上各组分首尾相连，完整衔接，其中：

(1)该胶体金试纸条中使用的包被抗原LPS来源于猪种布鲁氏菌(S2株)，该LPS对猪、牛、羊布鲁氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了试剂盒检测的敏感性；

(2)LPS提取过程中增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步骤，提高了LPS纯度，减少了LPS中阴杂蛋白含量过高导致的非特异性反应；本试剂盒不仅能有效排除常规革兰氏阴性细菌对布鲁氏菌的干扰，而且能排除一般布病间接ELISA试剂盒无法区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157干扰的技术缺陷，提高了检测的特异性；

(3)LPS的包被量基于对其纯度和质量的测定；

(4)本发明利用鼠抗牛IgGFc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫，进一步提高了检测的特异性。

2.本发明所述牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条中LPS抗原的纯度测定方法是：

将商品化LPS标准品稀释成1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml等不同稀释度；同时根据称重结果将LPS配制成1mg/ml的初始浓度，并稀释成100μg/ml的浓度；将上述各稀释度的LPS溶液取100μl/样品加入96孔酶标板上，在529nm波长下读取吸光度；建立LPS标准品各稀释度的OD529值，并建立浓度与吸光度之间的标准曲线；根据标准曲线以及布鲁氏菌LPS吸光度，计算LPS的浓度。LPS纯度为：LPS浓度×单位体积/单位质量。

3.本发明所述牛布鲁氏菌胶体金试纸条在对布鲁氏菌检测时不需要复杂的检测仪器，能在采血现场进行检测，特别适合牛场养殖人员和基层兽医使用。

本发明具体实施方式

本发明主要包含以下三个方面的内容：

1.检测抗原的制备。选取布鲁氏菌疫苗S2株作为抗原生产种子，将S2经TSA培养后，提取的LPS，经纯化和定量后，用于固定于胶体金试纸条的硝酸纤维素膜对应检测线的位置。

(1)本申请建立了LPS抗原制备用布鲁氏菌S2猪的质量标准。

1)菌落形态菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。

2)染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性，柯氏染色为红色。

3)纯粹按现行《中国兽药典》附录进行，应纯粹。

4)特异性

①血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应出现凝集，与粗糙型血清不出现凝集。

②PCR特异性合成如下4条引物，将其配成引物混合储存液，各引物浓度均为25μM。

Feri：5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’21(序列1)

Reri:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’20(序列2)

F_suis：5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’23(序列3)

R_IS711:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’24(序列4)

模板：S2培养菌落或试剂盒提取的S2基因组DNA。

PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA1μL(或挑取菌落少许)。

PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。

结果：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和285bp(见附图1)。

(2)本申请建立了S2LPS的提取方法。

1)菌悬液制备将鉴定合格的B.suisS2株二级种子接种于胰眎琼脂扁瓶中，37℃培养48小时后，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理盐水20ml浸泡菌体表面10min以上，洗下培养物，收集于无菌玻璃瓶中。

2)菌液灭活及灭活检验将收集好的菌悬液加热到80℃，维持120min，待其自然冷却后，存于4℃。对灭活菌液应进行灭活检验。取灭活菌液0.1ml涂布胰眎琼脂或TSA平板，37℃培养7天，不应无菌生长。

3)LPS的提纯将灭活检验合格的菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3(W/W)比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热到66℃，然后加入66℃预热的90％(V/V)苯酚溶液。在此温度下(66℃)持续搅拌15min，置室温自然冷却后，于4℃10000g离心15min。用一长管吸弃下层棕红色的酚相，将水相用Whatman1号滤纸过滤去除大菌体碎片。用量筒量取酚相体积，然后加入3倍体积-15℃以下预冷的甲醇(含1％甲醇饱和的醋酸钠)，4℃孵育2小时，4℃10000g离心10min，弃上清，将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，加入一定量的蛋白酶K，使其终浓度达50μg/ml，并用1NNaOH调节pH值至8.0，置56℃水浴消化2小时。加入等体积苯酚溶液抽提2遍后，4℃10000g离心10min。收集上清液于4℃保存，在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15min后，10000g离心15min,弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析过夜，换液2次(每一次至少4000ml)，收集透析袋内容物，此即提纯的LPS。

4)LPS纯度测定将制备的LPS冻干后称重，记录LPS净重M。将商品化LPS标准品稀释成1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml等不同稀释度；同时根据称重结果将LPS配制成1mg/ml的初始浓度，并稀释成100μg/ml的浓度。将上述各稀释度的LPS溶液取100μl/样品加入96孔酶标板上，在529nm波长下读取吸光度。建立LPS标准品各稀释度的OD529值，并建立浓度与吸光度之间的标准曲线。根据标准曲线以及布鲁氏菌LPS吸光度，计算LPS的浓度。LPS纯度为LPS浓度×单位体积/单位质量。

(3)本申请建立了LPS的检验程序

1)纯度测定根据标准曲线和吸光度计算出的纯度应不低于95％。

2)效价测定以抗原能满足对照血清成立的最大稀释度作为LPS的效价。将LPS抗原用0.05MpH9.6的碳酸缓冲液分别作1:1000、1:2000和1:4000倍稀释后，包被96孔ELISA板，用ELISA强阳性(中国兽医药品监察所提供，布病阳性血清国家参照品，批号：201001)、弱阳性(1：100稀释的强阳性血清)和阴性血清(中国兽医药品监察所提供)各1份作为参照，进行间接ELISA方法检测(见附注1)，终止反应后，测定OD450值。ELISA强阳性参考血清OD450≥1.0；ELISA弱阳性参考血清OD450为0.4～0.7，ELISA阴性参考血清OD450<0.1为合格。抗原效价应≥1:2000。

2.胶体金试纸条的主要工艺和检验方法。

主要包括胶体金的制备和检验、胶体金蛋白的制备和检验、胶体金试纸条的组装等主要生产工艺的研究和确定。

(1)胶体金的制备和检验

1)用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。取终浓度为0.01％氯金酸(HAuCl4)水溶液100ml，加热至沸腾，在不断搅动的条件下，快速加入1ml1％柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸5min，待金黄氯金酸水溶液变为稳定的紫红色(5—8min)后，用冰水浴冷却。按此程序制备的胶体金颗粒直径为41nm。制备的胶体金溶液，置4℃避光存放。

2)对制备的胶体金溶液，采用如下方法进行检测。在日光下观察胶体金溶液，应为紫红色清澈透明溶液。取100μl胶体金溶液加入96孔石英板上，用全波长紫外分光光度计进行扫描检测，应在519nm处有最高吸收峰，且峰型狭窄。

(2)胶体金蛋白的制备和检验

1)本发明中用于标记胶体金的蛋白为抗牛IgGFc单克隆抗体。将商品化的抗牛IgG单克隆抗体(CloneBG-18.Sigma,ProductNo.B6901)稀释至60μg/ml，按每毫升胶体金溶液加入100μl(含6μg)单抗的比例，在pH＝6.2的条件下(用0.1mol/LK₂CO₃溶液，或0.1mol/LHCl溶液条件pH值)，进行标记。将胶体金与单抗混合均匀，室温孵育30min后，加入100μl10％NaCl溶液，摇床震荡10min，室温静置2h。

2)胶体金蛋白的封闭。本发明使用PEG20000溶液作为稳定剂，封闭胶体表面未与特异性蛋白结合的位点，减少非特异性反应，形成更稳定的悬液。每100ml胶体金蛋白溶液中加入5ml1％PEG20000溶液，搅拌30min。将金标单抗蛋白复合物于4℃以3000r/min离心15min，弃去沉淀；再将上清于4℃以10000r/min离心30min，弃去上清，沉淀用含0.5mg/ml的PEG20000缓冲液溶液重悬；再次以12000r/min离心30min，将沉淀用同一缓冲液重悬，调节浓度使A540nm＝1.5±0.12。

3)胶体金蛋白溶液的检验。平均直径测量：用支持膜的镍网蘸取金标蛋白溶液，自然干燥后直接在透射电镜下观察，计算100个胶体金蛋白颗粒的平均直径，应在36±44nm之间。OD520nm值测定：用1×PBS缓冲液(含1％BSA)将胶体金蛋白溶液作1：20稀释，测定OD520nm值，应在0.2—0.3之间。

3.胶体金试纸条质量控制用参考血清及其质量标准的确定

主要包括质控阳性血清、质控阴性血清的检测方法及质量标准。用质控阳性血清和质控阴性血清对制备牛布病胶体金抗体检测试纸条进行特异性和敏感性验证，其中分别取质控阳性血清50μl滴加到胶体金试纸条的加样孔中，应于4min内均能在检测线位置出现特异性阳性条带；分别取质控阴性血清进行测试，所以质控阴性血清均应在胶体金试纸条中表现为阴性。

1)质控阳性血清

包括P1、p2、P3三种效价不同的阳性血清

[性状]均为淡黄色疏松团块，加入蒸馏水后能迅速溶解。

[无菌检验]按现行《中国兽药典》附录进行检验，均应无菌生长。

[效价测定]将质控阳性血清用蒸馏水复溶至1ml/管后作为待检血清，用牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒进行检测(附注)，计算P％。质控阳性血清P1应不低于60％，质控阳性血清P2应不低于40％，质控阳性血清P3应不低于20％。用牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条进行检测，P1应于1min内在检测线位置出现特异性阳性条带；P2应于2min内在检测线位置出现特异性阳性条带；P3应于4min内在检测线位置出现特异性阳性条带。

[规格]1ml/管。

2)质控阴性血清

包括N1—N5五种不同来源的阴性血清，其标准分别如下：

①质控阴性血清N1标准

[性状]为淡黄色疏松团块，加入蒸馏水后能迅速溶解。

[无菌检验]按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

[特异性检验]将质控阴性血清N1用蒸馏水复溶至1ml/管后作为待检血清，用牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条进行检测，N1应在检测线位置不出现特异性条带。将质控阴性血清N1作1:100稀释，与浓度为2×10⁹CFU/ml的大肠杆菌O157灭活抗原进行试管凝集试验，应判为阳性。

[规格]1ml/管。

②质控阴性血清N2标准

[性状]为淡黄色疏松团块，加入蒸馏水后能迅速溶解。

[特异性检验]将质控阴性血清N2用蒸馏水复溶至1ml/管后作为待检血清，用牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条进行检测，N2应在检测线位置不出现特异性条带。将质控阴性血清N2作1:100稀释，与浓度为2×10⁹CFU/ml的都柏林沙门氏菌灭活抗原进行试管凝集试验，应判为阳性。

[规格]1ml/管。

③质控阴性血清N3标准

[性状]为淡黄色疏松团块，加入蒸馏水后能迅速溶解。

[特异性检验]将质控阴性血清N3用蒸馏水复溶至1ml/管后作为待检血清，用牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条进行检测，N3应在检测线位置不出现特异性条带。将质控阴性血清N3作1:100稀释，与浓度为2×10⁹CFU/ml的粗糙型布鲁氏菌灭活抗原进行试管凝集试验，应判为阳性。

[规格]1ml/管。

④质控阴性血清N4及N5标准

[性状]均为淡黄色疏松团块，加入蒸馏水后能迅速溶解。

[特异性检验]将质控阴性血清N4、N5分别用蒸馏水复溶至1ml/管后作为待检血清，用牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条进行检测，N4、N5应在检测线位置不出现特异性条带。

[规格]1ml/管。

4.胶体金试纸条的组装及检验

(1)胶体金试纸条的组装。主要包括4个组分：1.吸水纸(样品垫)；2.玻璃纤维素膜(胶体金垫)，膜上吸附干燥的胶体金蛋白(流动带)；3.硝酸纤维素膜，膜上包被LPS抗原(检测带)，以及能与胶体金蛋白直接结合的抗鼠IgG抗体(质控带)；4.吸水纸。将喷有检测线、质控线的硝酸纤维素膜切成0.4×6cm长条，在其上端贴上吸水垫，下端贴上金标垫及样品吸收垫，以上各组分首尾相连，完整衔接。置于塑料卡中，加干燥剂密封后室温保存。完成胶体金试纸的结构示意图见附图2。

(2)胶体金试纸条的检验

[性状]试纸条的塑料外壳应无破损，试纸在外壳内的正确位置，应无偏移。

[敏感性检验]将阳性质控血清P1、P2、P3各吸取1滴，约50μl，滴加到加样孔上，均应于4min内，在检测线和质控线位置各出现一条清晰的红色条带。

[特异性检验]将质控阴性血清N1、N2、N3、N4、N5各吸取1滴，约50μl，滴加到加样孔上，4min内，在检测线无条带出现，在质控线位置出现一条质控条带。

附图说明

图1布鲁氏菌S2的PCR鉴定图图中1:DNAMarker；2:大肠杆菌阴性对照；3:S2菌株的PCR扩增结果。

图2牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条结构示意图

本发明微生物资源信息

本发明所涉及的微生物为：猪种布鲁氏菌(Brucellasuis)S2株(CVCC70502株)，系猪种布鲁氏菌生物1型，是布鲁氏菌病活疫苗生产用菌种，由北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心鉴定、保管和供应。

本发明的优点

本发明利用布鲁氏菌疫苗株S2提取的脂多糖(LPS)作为胶体试纸条的包被抗原，提高了检测的敏感性，并降低了制备过程中的生物安全风险。本研究改进了LPS纯化和定量的方法，使开发的试纸条具有良好的特异性，不仅能有效排除常规革兰氏阴性细菌对布鲁氏菌的干扰，而且能排除一般布病间接ELISA试剂盒无法区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157干扰的技术缺陷，提高了检测的特异性。发明利用鼠抗牛IgGFc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫，改变传统的利用SPA对抗体蛋白的非特异性吸附，将其作为胶体金标记蛋白，进一步提高了检测的特异性。本发明制备了一套用于对试纸条进行质控的血清，确保了试纸条的特异性和敏感性。本发明能在采样现场进行使用，克服了目前布病诊断均需依靠依靠实验室的困境，使用方便快捷，非常适合基层养殖场和基层兽医使用。本发明为我国布鲁氏菌病诊断提供了新的技术手段。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1

——不同条件对胶体金颗粒大小和颜色的影响研究

在99mlH₂O中，加入1ml1％氯金酸(HAuCl4)，使氯金酸终浓度为0.01％。将氯金酸水溶液继续加热至沸腾，加入1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml、2.0ml体积不等的1.05％柠檬酸三钠水溶液(还原剂)，继续加热5min后，用冰水浴冷却。制备的胶体金溶液，置4℃避光存放。取少量冷却后的胶体金溶液用紫外－可见光谱仪测定胶体金溶液的分散性和均一性，用透射电镜观察金颗粒粒径。

结果原剂的加入量与胶体金的粒径大小成反比，即还原剂的投入量越大，制备的胶体金粒径越小，颜色越偏橘红色。各种不同粒径大小的形成条件见表1。本发明选择粒径为41nm，颜色呈紫红色的条件作为本发明中胶体金颗粒制备的条件。

表1不同粒径大小的金溶胶制备结果

实施例2

——胶体金试纸条的敏感性研究

1.对梯度稀释的牛布鲁氏菌抗体阳性对照血清的灵敏度试验将牛布鲁氏菌抗体阳性对照血清(效价为320IU)进行2倍梯度稀释后，用3批实验室自制胶体金试纸条进行检测，确定该试纸条对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度，判断时间为4min之内，检验结果见表2。结果表明，本发明涉及的胶体金试纸条具有良好的灵敏度，能检测到效价为2.5IU的布鲁氏菌阳性血清，高于虎红平板凝集试验和补体结合试验。

表2对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度检测

2.对已知阳性样本的敏感性试验采用3批胶体金试纸条对176份牛布鲁氏菌抗体阳性血清进行检测。结果176份牛布鲁氏菌抗体阳性血清中，3批试纸条均有5份未检出，血清编号分别为30、48、122、132、171结果分析见表3。

表3对已知阳性血清的敏感性分析

研究表明本发明制备的3批胶体金试纸条对176份布病阳性样本的敏感性均为97.2％。

实施例3

——胶体金试纸条的特异性研究

1.对小肠结肠炎耶尔森氏菌O9阳性血清的特异性检测

采用本实验室制备的3批牛布鲁氏菌胶体金试纸条对小肠结肠炎耶尔森氏菌O9阳性血清进行检测，结果3min内，在检测线位置未能出现特异性条带，判为阴性。

2.对已知阴性血清的特异性检测

将132份已知背景的牛布鲁氏菌抗体阴性血清用3批胶体金试纸条进行检测，结果3批试剂盒均有5份未检出，血清编号分别为12、34、66、91和108，特异性均为95.5％，检测结果见表4。

表4不同批次试剂盒对阴性牛血清的特异性结果

实施例4

——胶体金试纸条对质控阳性血清的检测情况研究

将3种不同的质控阳性血清(P1、P2、P3)，各取50μl滴加到胶体金试纸条的加样孔中，4min内均能在检测线位置出现特异性阳性条带；其中P1于1min内在检测线位置出现特异性阳性条带，P2于2min内在检测线位置出现特异性阳性条带，P3于4min内在检测线位置出现特异性阳性条带。根据上述研究结果，确定质控阳性血清应满足在4min内均能在检测线位置出现特异性阳性条带，表示试剂盒具有足够的灵敏度，能检测到大约抗体水平为2.5IU血清，略高于虎红平板凝集试验(RBT),试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)的灵敏性。用20份经RBT,SAT和CFT确认的布病阳性血清25份，按胶体检测说明书要求进行检测，在规定的时间内，其检测出的阳性数量应不少于24个，敏感性不低于96％(24/25)。

将5种不同的质控阴性血清(N1、N2、N3、N4、N5)分别取说明书要求进行检测，结果5份血清在4min内均判为布鲁氏菌抗体阴性。5份质控阴性血清中包含了大肠杆菌O157阳性血清、都柏林沙门氏菌阳性血清、都柏林沙门氏菌阳性血清等易于与布鲁氏菌产生交叉反应的革兰氏阴性细菌的抗血清，结果均为阴性。为了进一步研究本胶体金试纸条的特异性，以小肠结肠炎耶尔森菌O:9(Y.E.O:9)、沙门氏菌(S.E.)045-2(D群)、C500(C1群)、AE616(B群)、乙型副伤寒杆菌(S.paratyphiB)及大肠杆菌O:157(933株)阳性血清，以及经RBT、SAT、CFT检测均阴性的参考血清30份(其中小肠结肠炎耶尔森菌O:9(Y.E.O:9)、沙门氏菌(S.E.)045-2(D群)、C500(C1群)、AE616(B群)、乙型副伤寒杆菌(S.paratyphiB)及阴性参考血清30份由中国兽用药品监察所细菌制品检测室提供，大肠杆菌O:157(933株)阳性血清由扬州大学兽医学院高菘教授提供。)作为检测样品进行胶体金检测，结果除小肠结肠炎耶尔森菌O:9(Y.E.O:9)在4min内出现阳性外，其余所有血清均检测为阴性，表明本试剂盒具有良好的特异性。

附注

牛布鲁氏菌间接ELISA方法

将纯化的LPS抗原用0.05M的碳酸盐缓冲液稀释成1μg/mL，按100μL/孔包被96孔酶标板(Corning，2592)，4℃作用18h以上。按100μL/孔加入5％明胶37℃封闭2h。弃去包被液，加入200μL1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。取1:3200稀释的ELISA强阳性参考血清、1:3200稀释的弱阳性参考血清和1:100稀释的阴性血清各100μL加入孔中，做一个平行孔，室温作用45min。弃去液体，加入200μL1×PBS-Tween洗涤液洗板4次，每次3min。加HRP标记抗牛二抗(A9425，Sigma)1：10000稀释，每孔100μL。室温孵育45min。弃去液体，加入200μL1×PBS-Tween洗涤液洗板4次，每次3min。加底物显色液(860336，Sigma)，每孔50μL，室温避光反应5～10min。

Claims

1.一种牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于该试剂条主要含有：以制备的光滑型猪种布鲁氏菌S2株的脂多糖(LPS)作为测试线包被抗原(检测带)，以鼠抗牛IgGFc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫(流动带)，以羊抗鼠IgG抗体作为检测试纸条的质控抗原(质控带)，同时含有试纸条样品吸收垫(样品垫)、玻璃纤维素膜(胶体金垫)、吸水纸；将喷有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上端贴上吸水垫，下端贴上金标垫及样品吸收垫，以上各组分首尾相连，完整衔接，其中：

(3)LPS的包被量基于对其纯度和质量的测定；

2.权利要求1所述牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于LPS抗原的纯度测定方法是：

3.权利要求1中所述牛布鲁氏菌胶体金试纸条的应用，其特征在于对布鲁氏菌检测不需要复杂的检测仪器，能在采血现场进行检测，特别适合牛场养殖人员和基层兽医使用。