CN116083502A - 用于布鲁氏菌检测的抗原及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物病检测试剂技术领域，尤其涉及一种用于布鲁氏菌检测的抗原及其制备方法、应用。具体的，该抗原的制备方法为：(1)提供猪种布鲁氏菌S2的脂多糖，将其采用蛋白酶K在1‑10℃消化1‑30h，得到消化后脂多糖；其中，蛋白酶K的用量为所述脂多糖的0.05‑0.4wt％；(2)将消化后脂多糖与免疫彩色微球混合，在1‑35℃致敏1‑30h，即得到用于布鲁氏菌检测的抗原成品。本发明的制备方法有效提升了脂多糖的纯度，且提升了制备得到抗原的特异性，具体的，本发明的抗原能够有效区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157等阳性血清。此外，本发明的制备方法简单、稳定性好、安全性高。

Description

用于布鲁氏菌检测的抗原及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及动物病检测试剂技术领域，尤其涉及一种用于布鲁氏菌检测的抗原及其制备方法、应用。

背景技术

布鲁氏菌病简称布病，是由布鲁氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病。除少数发达国家以外，布病在全球160多个国家流行。目前我国布病流行形势尤为严峻。十多年来，布病在我国死灰复燃，畜群和人间布病感染率逐年上升，并维持在较高水平，持续对我国畜牧业的健康发展和公共卫生安全构成危害。

“检疫-淘汰”模式是有效控制布鲁氏菌病在动物群体中发展扩散的最为重要的措施之一，而快速准确的诊断是有效防控的前提。目前布病的诊断方法主要以血清学检测为主，而常用的布病血清学诊断方法主要有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合实验和ELISA实验等。其中由于虎红平板凝集试验由于其操作简单、结果判定相对方便、使用成本低廉、适用于临床现场诊断和相对准确等优势，被广泛用于临床一线和动物群体布病初筛中。

然而，虎红凝集试验及其诊断抗原存在一定缺点。首先作为快速凝集类试验，其抗原生产使用灭活菌体抗原进行染色，由于布鲁氏菌与其他细菌如大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等存在一定的血清学交叉反应，对于一些样本尤其是饲养环境相对恶劣的动物个体导致检测结果可能存在一定的假阳性反应。有研究报道指出，虎红平板凝集试验与补体结合试验的符合率仅为70-90％之间。其次，虎红平板凝集试验抗原再产时需要大量生产布鲁氏菌活菌并灭活后使用，在日益加强生物安全防范意识的背景下，在制备菌体抗原时存在一定的生物安全风险。此外，由于制备虎红抗原时需要对灭活菌液进行多次离心洗涤，损耗了大量灭活菌体，带来一定损失，且在每次标定时均需要对抗原进行标定，对生产制备人员的专业要求较高，可能存在标定不准等情况，影响产品的质量。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种用于布鲁氏菌检测的抗原及其制备方法，其制备得到的抗原的特异性强，且制备方法简单，稳定性好，安全性高。

本发明还要解决的技术问题在于，提供上述用于布鲁氏菌检测的抗原在布鲁氏菌检测中的应用。

为了解决上述问题，作为本发明的第一方面，本发明提供了一种用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其包括以下步骤：

(1)提供猪种布鲁氏菌S2的脂多糖，将其采用蛋白酶K在1-10℃消化1-30h，得到消化后脂多糖；其中，蛋白酶K的用量为所述脂多糖的0.05-0.4wt％；

(2)将消化后脂多糖与免疫彩色微球混合，在1-35℃致敏1-30h，即得到用于布鲁氏菌检测的抗原成品。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，蛋白酶K的用量为所述脂多糖的0.2wt％。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，将所述脂多糖溶于磷酸盐缓冲液中，加入蛋白酶K，在2-8℃消化12-30h。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，在2-8℃消化24h。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：

(2.1)将消化后脂多糖加入含有EDC-HCl和免疫彩色微球的醋酸盐缓冲液中，在2-8℃致敏1-30h，得到致敏后脂多糖；

(2.2)将致敏后脂多糖采用醋酸盐缓冲液洗涤，得到用于布鲁氏菌检测的抗原成品；

其中，步骤(2.1)中，所述醋酸盐缓冲液中，免疫彩色微球的含量为0.01-0.05wt％，EDC-HCl的含量为1-2wt％；

所述消化后脂多糖的加入重量与所述醋酸盐缓冲液的体积之比为(0.05-0.2):1。

作为上述技术方案的改进，步骤(2.1)中，所述醋酸盐缓冲液中，免疫彩色微球的含量为0.02wt％，EDC-HCl的含量为1.5wt％；

所述消化后脂多糖的加入重量与所述醋酸盐缓冲液的体积之比为0.1:1。

作为上述技术方案的改进，步骤(2.1)中，在2-8℃致敏12h。

作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种用于布鲁氏菌检测的抗原，其由上述的制备方法制备而得。

作为本发明的第三个方面，本发明提供了上述的抗原在检测布鲁氏菌中的应用。

作为上述技术方案的改进，通过凝集试验进行检测，检测时，所述抗原与血清的体积比为(4-5):2，凝集反应时间为5-6min。

实施本发明，具有如下有益效果：

在本发明实施过程中，为了有效优化布鲁氏菌彩色免疫微球的致敏能力、反应效果和敏感性特异性分析，我们对布鲁氏菌LPS提取方法进行优化，使用了0.2％蛋白酶K对提取了LPS进行低温过夜处理。使LPS纯度从原有的92％提高至98％以上；同时确定了在反应浓度(w/v)1:10时，在2-8℃致敏12小时为LPS与彩色微球的最优致敏条件；40μL抗原加入20μL血清混匀后震荡摇匀反应5分钟为免疫微球与血清的最佳反应条件；并且其特异性明显提高。

匀后震荡摇匀反应5分钟后观察结果。。

本发明在通过将脂多糖与彩色微球进行结合，优化了目前使用的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原，其特异性更强，能够有效区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157等阳性血清。

本发明提供的免疫微球抗原制备方便，性质稳定，使用方法简单。

1、本发明的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，先将脂多糖(LPS)采用蛋白酶K进行消化处理，然后与免疫彩色微球进行致敏。基于上述方法，有效提升了LPS的纯度，提升了抗原的特异性，具体的，本发明的抗原能够有效区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157等阳性血清。

2、本发明的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法具有方法简单、稳定性好、安全性高的优点，可大规模生产利用。有效解决了现有虎红平板凝集试验抗原制备复杂、生产环境要求较高的问题。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度蛋白酶K对LPS纯度的影响图；

图2为实施例2中不同温度和致敏时间的致敏效果比较图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。需要说明的是，实施例所用试剂，如无说明，均可从商业途径购买。本发明涉及的猪种布鲁氏菌(Brucella Suis)S2株(CVCC70502)，来自国家兽医微生物菌种保藏中心)，系猪种布鲁氏菌生物1型，是布鲁氏菌病弱毒活疫苗参考株，由北京市大兴区庆丰路33号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心鉴定、保管和供应。

实施例1布鲁氏菌脂多糖的提取和纯化

(1)将灭活的菌液(猪种布鲁氏菌(Brucella Suis)S2株)以10000g离心20分钟，收集沉淀。

(2)称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3(W/W)比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热至66℃，然后加入等体积66℃预热的90％(V/V)苯酚溶液。

(3)在此温度下(66℃)持续搅拌15分钟，置室温自然冷却后，置4℃以10000g离心15分钟。用吸管吸取下层棕红色的酚相，用滤纸过滤去除大菌体碎片。

(4)定量酚相体积，然后加入3倍体积2-8℃预冷的甲醇(含1％饱和醋酸钠冷甲醇)，2-8℃孵育2小时，置4℃以10000g离心10分钟

(5)弃上清，将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，4℃以10000g离心10分钟。收集上清溶液于2-8℃保存。将沉淀再用等体积灭菌蒸馏水重悬，2-8℃再搅拌2小时，依上法离心获上清液，并与前述上清液混合。

(6)随后，在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15分钟后，10000g离心15分钟，弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析过夜，换液2次(每一次至少4000mL)，收集透析袋内容物，此即提取的LPS。

(7)将提取后的LPS干燥后称取重量，取1g脂多糖溶于磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)，分别加入终浓度0.05％、0.1％、0.2％和0.4％的蛋白酶K分别在室温消化2小时和2-8℃消化24小时。

(8)将消化后的LPS使用“苯酚-硫酸法”测定多糖含量，并与未经蛋白酶K消化的LPS比较，结果发现在终浓度为0.2％蛋白酶K消化24小时后，其LPS纯度由原有的92.4％上升至98.7％，而在室温消化的LPS含量提升不显著，使用0.4％蛋白酶K消化的LPS其纯度与0.2％浓度无明显区别。

实施例2布鲁氏菌彩色免疫微球凝集试验抗原致敏条件的确定

致敏条件时抗原与彩色微球发生致敏反应最为重要的因素之一，一般而言致敏时间越长致敏效果越好。但是，如果致敏时间过长或者致敏温度过高可能会出现抗原与微球解离的情况。本发明针对不同致敏条件进行比较分析，其基本步骤如下：

(1)取已纯化后的0.05mg LPS分别加入到含有1.5％ EDC-HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.02％彩色微球的醋酸盐缓冲液(pH5.0)中。

(2)分别将加入LPS的商品化红色聚苯乙烯微球放入室温和2-8℃致敏6、12和24小时。

(3)将致敏的微球抗原加入到1mL醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中混悬洗涤，相同条件离心15min后弃上清。

(4)重新加入1mL醋酸盐缓冲液重悬制得致敏微球，使用“苯酚-硫酸法”测定其中的脂多糖含量。

(5)选择能够实现基本结合的致敏条件作为最佳致敏反应条件，结果发现，在室温中结合6、12和24小时的结合效率分别只有71.3％、87.9％和96.7％。在2-8℃致敏结合效率可达到71.9％、98.2％和98.4％，考虑到结合效率与时间，我们选择2-8℃致敏12小时作为最佳致敏条件。

实施例3LPS致敏浓度的确定

诊断试剂中抗原的有效含量，对于血清凝集类实验敏感性和特异性的影响至关重要。如果诊断试剂中的抗原有效含量不足，导致敏感性提高而特异性下降，引起出现假阳性现象；反之，如果抗原含量过高，则会出现敏感性下降的情况，引起假阴性反应。所以本发明对LPS的不同致敏浓度进行比较分析，基本步骤如下：

(1)分别取1mL醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)稀释成不同浓度(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL)的LPS溶液。

(2)分别加入到1mL含有1.5％ EDC-HCL和0.02％彩色微球的醋酸盐缓冲液(pH5.0)中。

(3)各成分混匀后在2-8℃下振荡孵育12h(100r/min)，8000r/min离心15min，弃上清。

(4)加入到1mL醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中混悬洗涤，相同条件离心15min后弃上清。

(5)重新加入1mL醋酸盐缓冲液重悬制得致敏微球，4℃保存。

(6)将不同浓度致敏的彩色微球分别与不同效价布鲁氏菌阳性血清进行反应，选择与布鲁氏菌阳性血清反应良好且与虎红抗原反应基本一致的的LPS浓度作为免疫微球的致敏浓度。

(7)通过实验发现，使用0.1mg和0.15mg LPS进行致敏其敏感性与虎红抗原敏感性基本相同，0.2mg进行致敏其敏感性略有下降，0.05mg致敏时敏感性明显提高。出于节省抗原的目的，本发明最终选择0.1mg加入到含有1.5％EDC-HCL和0.02％彩色微球的1mL醋酸盐缓冲液中，即1:10的(w/v)比例进行致敏作为最佳致敏浓度。

表1不同致敏浓度对抗原敏感性的影响

实施例4免疫彩色微球抗原与血清反应体系和反应条件的确定

诊断抗原与血清的反应体系对于诊断结果的判定十分重要，如果反应体系不合理可能会出现结果不准的情况。同时，反应时间对于凝集类实验尤其是快速凝集类实验的实验结果有着重大影响。由于原有虎红平板凝集抗原由菌体制备而成，其存在大量凝集类颗粒性抗原。本发明对所制备的免疫微球抗原的反应体系和反应条件进行比较分析，其步骤如下：

(1)分别将20μL、30μL、40μL、50μL和60μL分别与20μL阳性血清在白瓷板上进行混合，涂布呈约4cm²的圆形液面，振荡混匀4分钟后观察结果。其抗原抗体的最终比例为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1和3:1。选择反应良好且适于使用的反应体系作为最佳反应体系。

(2)结果发现添加20μL抗原与20μL血清的液面无法涂布均匀，无法进行有效反应；30μL抗原与20血清在3分钟左右液面边缘开始干燥颗粒，至4分钟时液面已出现液体挥发现象，且抗原与血清反应过于迅速；60μL抗原与20μL血清混合液液体体积过大，试验时无法正常振荡混匀；而40μL、50μL抗原和20μL血清的反应体系就能有效进行反应，且反应体积合适。考虑到节省抗原的目的，本发明选择40μL+20μL血清作为布鲁氏菌彩色免疫微球凝集试验抗原的最佳使用体系。

(3)在确定最佳反应体系的基础上，本发明使用1/10、1/20、1/45和1/55稀释的布病阳性血清国家标准品对最佳反应时间进行了分析比较。分别在3分钟、4分钟、5分钟和6分钟观察结果，按照与虎红反应抗原一致的反应强度确定反应时间。

(4)根据结果，在反应3分钟后期反应强度较弱，4分钟时敏感性较差，反应5分钟和6分钟其抗原抗体反应性良好，但6分钟敏感性略有升高，所以选择5分钟作为最佳反应时间。

表2不同反应时间下各血清反应性的比较

实施例5免疫彩色微球抗原与虎红平板凝集试验抗原敏感性与特异性的比较分析

在传统虎红平板凝集试验抗原制备中，选用灭活的布鲁氏菌菌液进行染色标定，由于布鲁氏菌与小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157等存在一定的血清学交叉反应，所以其无法对某些细菌病的阳性血清进行鉴别诊断。所以，本发明通过分析比较制备的免疫微球抗原与相关敏感性血清和特异性血清进行反应，确定本发明制备的相关抗原的敏感性与特异性。其基本步骤如下：

(1)将制备的抗原分别与不同效价(100IU/50IU/25IU/10IU/5IU)的布病阳性血清按照确定的反应条件进行反应，判断其检出限。

(2)将抗原分别与小肠结肠炎耶尔森氏菌O9阳性血清、大肠杆菌O157阳性血清、都柏林沙门氏菌阳性血清等进行反应，判断其结果。

(3)使用已知阴阳性的临床血清分别用本发明制备的抗原和虎红平板凝集试验抗原进行检测，比较分析荧光微球的敏感性与特异性。

(4)根据结果，本发明制备的免疫微球其检出限为10IU，略高于虎红平板凝集试验，与补体结合实验接触线基本一致；其与小肠结肠炎耶尔森氏菌O9阳性血清、大肠杆菌O157阳性血清、都柏林沙门氏菌阳性血清等无反应，可以与布鲁氏菌阳性血清做到有效区分；根据敏感性和特异性分析，其敏感性为95.74％(90/94)，特异性为96.22％(102/106)，明显高于虎红平板凝集试验抗原(敏感性88.29％(83/94)，特异性81.13％(86/106))。

以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供猪种布鲁氏菌S2的脂多糖，将其采用蛋白酶K在1-10℃消化1-30h，得到消化后脂多糖；其中，蛋白酶K的用量为所述脂多糖的0.05-0.4wt％；

(2)将消化后脂多糖与免疫彩色微球混合，在1-35℃致敏1-30h，即得到用于布鲁氏菌检测的抗原成品。

2.如权利要求1所述的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，蛋白酶K的用量为所述脂多糖的0.2wt％。

3.如权利要求1至3任一项所述的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述脂多糖溶于磷酸盐缓冲液中，加入蛋白酶K，在2-8℃消化12-30h。

4.如权利要求1至3任一项所述的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在2-8℃消化24h。

5.如权利要求1所述的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：

(2.1)将消化后脂多糖加入含有EDC-HCl和免疫彩色微球的醋酸盐缓冲液中，在2-8℃致敏1-30h，得到致敏后脂多糖；

(2.2)将致敏后脂多糖采用醋酸盐缓冲液洗涤，得到用于布鲁氏菌检测的抗原成品；

其中，步骤(2.1)中，所述醋酸盐缓冲液中，免疫彩色微球的含量为0.01-0.05wt％，EDC-HCl的含量为1-2wt％；

所述消化后脂多糖的加入重量与所述醋酸盐缓冲液的体积之比为(0.05-0.2):1。

6.如权利要求5所述的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2.1)中，所述醋酸盐缓冲液中，免疫彩色微球的含量为0.02wt％，EDC-HCl的含量为1.5wt％；

所述消化后脂多糖的加入重量与所述醋酸盐缓冲液的体积之比为0.1:1。

7.如权利要求1所述的用于布鲁氏菌检测的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2.1)中，在2-8℃致敏12h。

8.一种用于布鲁氏菌检测的抗原，其特征在于，由如权利要求1-7任一项所述制备方法制备而得。

9.如权利要求7所述的抗原在检测布鲁氏菌中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过凝集试验进行检测，检测时，所述抗原与血清的体积比为(4-5):2，凝集反应时间为5-6min。

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