CN115855779A - 一种定量检测nk细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法，涉及体外诊断技术领域，一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒包括细胞因子刺激物、γ‑干扰素抗体磁性微球溶液、吖啶酯标记的抗γ‑干扰素抗体、γ‑干扰素校准品、γ‑干扰素质控品，本发明通过对全血样本进行刺激培养后，使NK细胞活化并释放γ‑干扰素，取上层血浆样本通过磁微粒化学发光免疫诊断法进行定量检测γ‑干扰素的含量，大大缩短了检测时间，具有抗干扰性强、灵敏度高、再现性好、线性范围广的优点，相比其他方法，本试剂盒可对NK细胞的活性实现更准确快速的动态监测，对临床诊断和药物疗效监测具有重要的临床价值。

Description

一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒及其检测 方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体的说，涉及一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞（包括部分细胞系）、病毒感染细胞、某些自身组织细胞（如血细胞）、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK细胞活性减低；宿主抗移植物反应者，NK细胞活性升高。

NK细胞的活性可以直接反应机体的免疫力，相比NK细胞的数量测定，NK细胞的活性测定更直接有效，相关性更强。

NK细胞活性预示着机体先天免疫细胞抵御致病性细胞的免疫能力。NK细胞活性检测可以帮助临床医师评估机体免疫系统通过先天免疫细胞抵御受感染细胞及肿瘤细胞的能力；作为一种评估机体固有免疫状态改变的有效工具，可以用于疾病的预后评估、疗效监测及复发转移监控。目前主要的检测方法有同位素标记法、乳酸脱氢酶释放法、流式细胞法、酶联免疫法。

同位素标记法检测NK细胞活性将用同位素3H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。实验包括靶细胞的标记、脾细胞悬液的制备和NK细胞活性的检测三步，该方法的局限性在于使用放射性同位元素、再现性差、靶细胞使用肿瘤细胞K562、复杂的实验过程、时间长（5-7天）、成本高、难以处理大量试料，结果根据检查者的不同有很大偏差。

乳酸脱氢酶（LDH）释放法与同位素标记法类似，活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H^＋被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。该方法的局限性在于再现性差、靶细胞使用肿瘤细胞K562、复杂的实验过程、时间长成本高，且结果根据检查者的不同有很大偏差。

流式细胞检测法，可以通过对细胞计数在PBMC后对NK细胞计数，但不能检测NK细胞的活

性，近年来流式细胞检测法可对NK细胞毒性进行检测，但同样需要使用放射性同位素标记，再现性差，且结果根据检查者的不同也会有很大偏差。

酶联免疫法存在灵敏度不足、抗干扰性差、操作繁琐、时间长、重复性差的缺点，尤其在临床动态检测上存在准确性不足的问题，可能影响治疗和药物疗效评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法，通过对全血样本进行刺激培养后，使NK细胞活化并释放γ-干扰素，取上层血浆样本通过磁微粒化学发光免疫诊断法进行定量检测γ-干扰素的含量，检测过程全自动化，具有抗干扰性强、灵敏度高、再现性好、线性范围广的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，包括细胞因子刺激物、γ-干扰素抗体磁性微球溶液、吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体、γ-干扰素校准品、γ-干扰素质控品。

作为上述技术方案的进一步改进：

所述细胞因子刺激物的制备方法为：用0.01mol/L pH7.5的含有BSA的Tris-HCl溶液配制10ng/mL的白介素2-融合蛋白溶液。

所述γ-干扰素抗体磁性微球溶液的制备方法包括以下步骤：

（1）磁珠洗涤

在室温条件，将购买的羧基磁珠预先涡旋混匀，直至羧基磁珠混匀，吸取0.25mL磁珠包被缓冲液到包被管中，加入10μL羧基磁珠，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体，完成清洗；

（2）磁珠包被

在室温条件，从磁分离架上取下包被管，向包被管中加入0.1mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加0.05mg γ-干扰素抗体拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加入0.1mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应14小时；

（3）磁珠洗涤

从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠洗涤缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀；重复上述洗涤操作一次，将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应7小时；

（4）磁珠封闭

从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠封闭液，拧紧管盖，涡旋混匀；重复洗涤操作一遍；将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应16小时；

（5）清洗

封闭完成后，从恒温培养箱取下包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠洗涤缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；重复清洗两次；向包被管中加入0.4mL磁珠贮存液，拧紧管盖，涡旋混匀1min，γ-干扰素磁性微球混悬液母液包被完成，用0.01M PBS溶液将γ-干扰素磁性微球混悬液母液按1:10稀释，制得γ-干扰素抗体磁性微球溶液。

所述磁珠包被缓冲液为PBS缓冲液。

所述磁珠洗涤缓冲液为含有1% tween-20的PBS缓冲液。

所述磁珠封闭液为含有5% BSA的PBS缓冲液。

所述磁珠贮存液为含有1% BSA、1%酪蛋白钠盐、0.2% proclin300的PBS缓冲液。

所述吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体的制备方法包括以下步骤：

1）取1.0mg γ-干扰素抗体用碳酸盐缓冲液稀释为1.0mg/mL，振荡混匀，加入到透析袋中，用透析夹将透析袋两端固定好，将透析袋放入1000 mL 0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，磁力搅拌器200 r/min 4℃旋转，透析24小时；

2）将0.05mg吖啶酯用20.0uL DMSO进行充分溶解混匀；取出透析后的γ-干扰素抗体于离心管中，加入溶解好的吖啶酯，振荡混匀后37℃旋转混匀反应1小时；加入赖氨酸溶液0.07mL终止反应，振荡混匀后37℃旋转混匀反应30min；

3）将上述混匀的溶液装入用纯水清洗过的透析袋中，用透析夹将透析袋两端固定好，放入2000 mL碳酸盐缓冲液中，磁力搅拌器200r/min 4℃旋转透析18~36小时，每隔2-4小时更换一次碳酸盐缓冲液，过夜时换液时长可延长至15小时，监测透析液中游离吖啶酯的浓度RLU低于10000时，取出标记物于离心管中，1:1加入甘油，使其终浓度为0.2mg/mL，振荡混匀，吖啶酯标记γ-干扰素母液标记完成，20℃保存；将吖啶酯标记γ-干扰素母液用0.05M pH6.5的碳酸盐缓冲液按照1：2000配置得到吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体。

所述γ-干扰素校准品、质控品的制备方法为：用含有10%新生牛血清、1%BSA的Tris-HCl缓冲液，将γ-干扰素抗原分别配制为0、800、2500pg/mL的溶液，依次得到校准品Cal0、Cal1、Cal2，分别配制为500、2000pg/mL的溶液，得到质控品Q1、Q2。

一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1、血液样品的刺激培养：

将细胞因子刺激物加入肝素钠抗凝采血管采集的全血1mL混合培养，37度孵育24小时，然后静置分离，取上层血浆作为样本用于后续检测。

2、γ-干扰素的定量检测：

将抗γ干扰素抗体包被的磁性微球溶液与样本中的γ-干扰素反应，形成免疫复合物；用含有1% tween-20、0.2% proclin300的PBS缓冲液清洗将免疫复合物与其它物质的分离，加入吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体与免疫复合物继续反应形成免疫夹心复合物；再次用含有1% tween-20、0.2% proclin300的PBS缓冲液清洗，向免疫夹心复合物中加入含双氧水的预激发液，使吖啶环与不发光取代基部分分离，加入含氢氧化钠的激发液，吖啶酯在有H₂O₂的稀碱性溶液中即能发光，通过全自动化学发光免疫分析仪读取发光数值，并自动计算样本中γ-干扰素的含量。

本发明采取以上技术方案，具有以下优点：通过对全血样本进行刺激培养后，使NK细胞活化并释放γ-干扰素，取上层血浆样本通过磁微粒化学发光免疫诊断法进行定量检测γ-干扰素的含量，检测过程全自动化，30min可出结果，大大缩短了检测时间，具有抗干扰性强、灵敏度高、再现性好、线性范围广的优点，相比其他方法，本试剂盒可对NK细胞的活性实现更准确快速的动态监测，对临床诊断和药物疗效监测具有重要的临床价值。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为根据表1数据，以浓度值为X轴，发光值（RLU）平均值为Y轴作的图。

实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，包括细胞因子刺激物、γ-干扰素抗体磁性微球溶液、吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体、γ-干扰素校准品、γ-干扰素质控品。

细胞因子刺激物的制备方法为：用0.01mol/L pH7.5的含有BSA的Tris-HCl溶液配制10ng/mL的白介素2-融合蛋白溶液（SP-IL2）。

γ-干扰素抗体磁性微球溶液的制备方法包括以下步骤：

（1）磁珠洗涤

在室温条件，将购买的羧基磁珠预先涡旋混匀，直至羧基磁珠混匀，吸取0.25mL磁珠包被缓冲液到包被管中，加入10μL羧基磁珠，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体，完成清洗；

（2）磁珠包被

在室温条件，从磁分离架上取下包被管，向包被管中加入0.1mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加0.05mg γ-干扰素抗体拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加入0.1mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应14小时；

（3）磁珠洗涤

从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠洗涤缓冲液（溶液温度需平衡至室温），拧紧管盖，涡旋混匀；重复上述洗涤操作一次，将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应7小时；

（4）磁珠封闭

从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠封闭液（溶液温度需平衡至室温），拧紧管盖，涡旋混匀；重复洗涤操作一遍；将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应16小时；

（5）清洗

封闭完成后，从恒温培养箱取下包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠洗涤缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；重复清洗两次；向包被管中加入0.4mL磁珠贮存液，拧紧管盖，涡旋混匀1min，γ-干扰素磁性微球混悬液母液包被完成，用0.01M PBS溶液将γ-干扰素磁性微球混悬液母液按1:10稀释，制得γ-干扰素抗体磁性微球溶液。

磁珠包被缓冲液为PBS缓冲液；磁珠洗涤缓冲液为含有1% tween-20的PBS缓冲液；磁珠封闭液为含有5% BSA的PBS缓冲液；磁珠贮存液为含有1% BSA、1%酪蛋白钠盐、0.2%proclin300的PBS缓冲液。

吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体的制备方法包括以下步骤：

1）取1.0mg γ-干扰素抗体用碳酸盐缓冲液稀释为1.0mg/mL，振荡混匀，加入到透析袋中，用透析夹将透析袋两端固定好，将透析袋放入1000 mL 0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，磁力搅拌器200 r/min 4℃旋转，透析24小时；

2）将0.05mg吖啶酯用20.0uL DMSO进行充分溶解混匀；取出透析后的γ-干扰素抗体于离心管中，加入溶解好的吖啶酯，振荡混匀后37℃旋转混匀反应1小时；加入赖氨酸溶液0.07mL终止反应，振荡混匀后37℃旋转混匀反应30min；

3）将上述混匀的溶液装入用纯水清洗过的透析袋中，用透析夹将透析袋两端固定好，放入2000 mL碳酸盐缓冲液中，磁力搅拌器200 r/min 4℃旋转透析18~36小时，每隔2-4小时更换一次碳酸盐缓冲液，过夜时换液时长可延长至15小时，监测透析液中游离吖啶酯的浓度RLU低于10000时，取出标记物于离心管中，1:1加入甘油，使其终浓度为0.2mg/mL，振荡混匀，吖啶酯标记γ-干扰素母液标记完成，20℃保存；将吖啶酯标记γ-干扰素母液用0.05M pH6.5的碳酸盐缓冲液按照1：2000配置得到吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体。

γ-干扰素校准品、质控品的制备方法为：用含有10%新生牛血清、1%BSA的Tris-HCl缓冲液，将Fitzgerald购买的γ-干扰素抗原分别配制为0、800、2500pg/mL的溶液，依次得到校准品Cal0、Cal1、Cal2，分别配制为500、2000pg/mL的溶液，得到质控品Q1、Q2。

本发明试剂盒适用于仪器机型为山东康华生物Aurora-2000i、Aurora-1000i、Aurora-500i全自动化学发光仪。

实施例2

一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法包括以下步骤：

1、血液样品的刺激培养：

把人血液样本与细胞因子刺激物混合后进行培养，刺激NK细胞活化，使其分泌细胞因子γ-干扰素。将细胞因子刺激物加入肝素钠抗凝采血管采集的全血1mL混合培养，37度孵育24小时，然后静置分离，取上层血浆作为样本用于后续检测。

本发明采用包含有IL-2的融合蛋白对血液样本中的NK细胞进行刺激活化，该融合蛋白在不影响白介素活性的情况下提升了刺激物的稳定性，有利于长期保存。

γ-干扰素的定量检测：

将抗γ干扰素抗体包被的磁性微球溶液与样本中的γ-干扰素反应，形成免疫复合物；用含有1% tween-20、0.2% proclin300的PBS缓冲液清洗将免疫复合物与其它物质的分离，加入吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体与免疫复合物继续反应形成免疫夹心复合物；再次用含有1% tween-20、0.2% proclin300的PBS缓冲液清洗，向免疫夹心复合物中加入含双氧水的预激发液，使吖啶环与不发光取代基部分分离，加入含氢氧化钠的激发液，吖啶酯在有H₂O₂的稀碱性溶液中即能发光，通过全自动化学发光免疫分析仪读取发光数值，并自动计算样本中γ-干扰素的含量。

试剂无需平衡室温，整个检测过程只需30min；传统的酶促化学发光法需要通过辣根过氧化物酶来催化鲁米诺实现发光，整个反应过程漫长，至少需要40-60min才能出结果，而且试剂组分多，操作繁琐，多为手工加样，效率低且结果的准确度不够，检测范围窄，本发明与酶促化学发光法试剂盒相比具有速度快、检测灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性好等特点。

实施例3

本发明试剂盒性能测试

1.主曲线校准品测试及定标

本发明使用采购自Fitzgerald的γ-干扰素抗原，用含有1% BSA的Tris-HCl缓冲液（pH=8.0）分别稀释浓度为1、15、50、150、500、1500、2500、3500、5000、5500 pg/mL的主曲线校准品，使用本发明试剂盒，配套仪器为山东康华生物生产的Aurora-1000i全自动化学发光仪，上机进行全自动化检测，每个点重复两次，所得发光值信号如下表所示：

如图1所示，本试剂盒线性范围为1-5500pg/mL，R²为0.9993，由此可看出本试剂盒具有检测灵敏度高、线性范围宽的优点。

根据预先录入Aurora-1000i全自动化学发光仪的主曲线信息，本发明试剂盒在进行实验前只需测定校准品Cal0、Cal1、Cal2进行定标即可，测定质控品Q1、Q2各重复三次，均在控，如下表所示，质控品偏差范围为±10%内。

序号	质控品1（Q1）（500pg/mL）	质控品2（Q2）（2000pg/mL）
			1	485	1945
2	502	1903
			3	493	2056
靶值范围	450-550	1800-2200

批内精密度

对本试剂盒的质控品，浓度分别为500、2000pg/mL，采用本发明的同批次试剂盒上机各重复测试10次，得出测试结果，计算平均值（X）和标准差（S），根据公式CV=X/S×100%计算得出变异系数（CV），结果如下表：

本发明试剂盒的批内精密度≤10%，由此可看出本试剂盒具有重复性好的优点。

批间精密度

采用三个批号的试剂盒，每个批号的试剂盒分别对质控品1、质控品2分别重复测定10次，得出相应数据，计算每批试剂盒测定结果的平均值(X)和标准差(S)，根据公式CV＝S/X×100％得出变异系数(CV)：

使用3个不同批次的产品测定结果的变异系数CV(％)≤15％，由此可看出，本试剂盒批间差重复性好，再现性好，可实现对NK细胞活性水平的动态监测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：包括细胞因子刺激物、γ-干扰素抗体磁性微球溶液、吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体、γ-干扰素校准品、γ-干扰素质控品。

2. 根据权利要求1所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述细胞因子刺激物的制备方法为：用0.01mol/L pH 7.5的含有BSA的Tris-HCl溶液配制10ng/mL的白介素2-融合蛋白溶液（SP-IL2）。

3. 根据权利要求1所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述γ-干扰素抗体磁性微球溶液的制备方法包括以下步骤：

（1）磁珠洗涤

在室温条件，将购买的羧基磁珠预先涡旋混匀，直至羧基磁珠混匀，吸取0.25mL磁珠包被缓冲液到包被管中，加入10μL羧基磁珠，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体，完成清洗；

（2）磁珠包被

在室温条件，从磁分离架上取下包被管，向包被管中加入0.1mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加0.05mg γ-干扰素抗体拧紧管盖，涡旋混匀1min；向包被管中加入0.1mL磁珠包被缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应14小时；

（3）磁珠洗涤

从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠洗涤缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀；重复上述洗涤操作一次，将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应7小时；

（4）磁珠封闭

从恒温培养箱中取出包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠封闭液，拧紧管盖，涡旋混匀；重复洗涤操作一遍；将混匀后的包被管置于恒温培养箱中，设定温度37℃，设定转速150 r/min，反应16小时；

（5）清洗

封闭完成后，从恒温培养箱取下包被管，在室温条件，将包被管置于磁分离架上1min后吸尽液体；向包被管中加入0.4mL磁珠洗涤缓冲液，拧紧管盖，涡旋混匀1min；重复清洗两次；向包被管中加入0.4mL磁珠贮存液，拧紧管盖，涡旋混匀1min，γ-干扰素磁性微球混悬液母液包被完成，用0.01M PBS溶液将γ-干扰素磁性微球混悬液母液按1:10稀释，制得γ-干扰素抗体磁性微球溶液。

4.根据权利要求3所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述磁珠包被缓冲液为PBS缓冲液。

5. 根据权利要求3所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述磁珠洗涤缓冲液为含有1% tween-20的PBS缓冲液。

6. 根据权利要求3所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述磁珠封闭液为含有5% BSA的PBS缓冲液。

7. 根据权利要求3所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述磁珠贮存液为含有1% BSA、1%酪蛋白钠盐、0.2% proclin300的PBS缓冲液。

8.根据权利要求1所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体的制备方法包括以下步骤：

1）取1.0mg γ-干扰素抗体用碳酸盐缓冲液稀释为1.0mg/mL，振荡混匀，加入到透析袋中，用透析夹将透析袋两端固定好，将透析袋放入1000 mL 0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，磁力搅拌器200 r/min 4℃旋转，透析24小时；

2）将0.05mg吖啶酯用20.0uL DMSO进行充分溶解混匀；取出透析后的γ-干扰素抗体于离心管中，加入溶解好的吖啶酯，振荡混匀后37℃旋转混匀反应1小时；加入赖氨酸溶液0.07mL终止反应，振荡混匀后37℃旋转混匀反应30min；

3）将上述混匀的溶液装入用纯水清洗过的透析袋中，用透析夹将透析袋两端固定好，放入2000 mL碳酸盐缓冲液中，磁力搅拌器200r/min 4℃旋转透析18~36小时，每隔2-4小时更换一次碳酸盐缓冲液，过夜时换液时长可延长至15小时，监测透析液中游离吖啶酯的浓度RLU低于10000时，取出标记物于离心管中，1:1加入甘油，使其终浓度为0.2mg/mL，振荡混匀，吖啶酯标记γ-干扰素母液标记完成，20℃保存；将吖啶酯标记γ-干扰素母液用0.05MpH6.5的碳酸盐缓冲液按照1：2000配置得到吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体。

9.根据权利要求1所述的一种定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于：所述γ-干扰素校准品、质控品的制备方法为：用含有10%新生牛血清、1%BSA的Tris-HCl缓冲液，将γ-干扰素抗原分别配制为0、800、2500pg/mL的溶液，依次得到校准品Cal0、Cal1、Cal2，分别配制为500、2000pg/mL的溶液，得到质控品Q1、Q2。

10.一种根据权利要求1所述的定量检测NK细胞活性的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1、血液样品的刺激培养：

将细胞因子刺激物加入肝素钠抗凝采血管采集的全血1mL混合培养，37度孵育24小时，然后静置分离，取上层血浆作为样本用于后续检测；

2、γ-干扰素的定量检测：

将抗γ干扰素抗体包被的磁性微球溶液与样本中的γ-干扰素反应，形成免疫复合物；用含有1% tween-20、0.2% proclin300的PBS缓冲液清洗将免疫复合物与其它物质的分离，加入吖啶酯标记的抗γ-干扰素抗体与免疫复合物继续反应形成免疫夹心复合物；再次用含有1% tween-20、0.2% proclin300的PBS缓冲液清洗，向免疫夹心复合物中加入含双氧水的预激发液，使吖啶环与不发光取代基部分分离，加入含氢氧化钠的激发液，吖啶酯在有H₂O₂的稀碱性溶液中即能发光，通过全自动化学发光免疫分析仪读取发光数值，并自动计算样本中γ-干扰素的含量。

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