CN113092755A - 一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条。所述该检测试纸条由布鲁氏菌抗原检测试纸条和塑料吸头组成，检测试纸条由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。采用4株结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体夹心法，其中金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌单克隆抗体4D7，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液，质控线包被山羊抗鼠IgG抗体。本发明的布鲁氏菌抗原的检测试纸条能现场快速检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌，并有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌抗原检测的干扰。试纸条灵敏度和敏感性高，特异性好，使用简便，适用于临床组织、环境、奶液等样本的检测，也适用于纯培养布鲁氏菌的鉴定。

Description

一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条
技术领域
本发明涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，属免疫检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，WHO将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。布病主要是通过直接或间接接触染病动物或动物产品而感染。人类患布病后，会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力；家畜感染布病则引起流产和不育，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。
准确诊断是布病防控极为重要的环节。布病诊断又分为血清学诊断和病原学诊断，相对于常用的布病血清学诊断方法，布病病原学诊断对实验室生物安全级别和实验人员要求都比较高。目前布病病原学诊断方法主要包括细菌分离、生化鉴定分型、核酸检测等，其中核酸检测又有AMOS-PCR、Bruce-ladder PCR、real-time PCR、MLVA等方法。而上述病原学诊断方法的开展都需要在专业布病实验室完成，操作人员必须经过专门培训，一次检测至少需要2小时以上。因此开发针对布病的病原学现场快速诊断方法十分必要。
胶体金免疫层析技术因具有操作简单、快速灵敏、易于判定的优点，在疾病的病原学现场快速诊断中得到了广泛应用。虽然已有布鲁氏菌抗原检测试纸条发明专利的报道，如中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所端青等(申请号200610076701.9)以免疫布鲁氏菌抗原的家兔多抗血清标记胶体金，并以此多抗血清包被检测线，众所周知，以多抗夹心法检测抗原，存在的主要问题是特异性下降，如果多抗血清的效价不高，同时可导致敏感性下降。北京庄迪浩禾生物医学科技有限公司刘明(申请号200810112730.5)采用布鲁氏菌bp26单抗标记胶体金，bp26多抗包被检测线捕获布鲁氏菌抗原。根据文献报道，布鲁氏菌感染羊/牛，其产生针对bp26(编码OMP28外膜蛋白)的抗体具有不确定性，提示针对bp26编码蛋白的单抗对布鲁氏菌的反应性同样具有不确定性。另一方面，仅仅由bp26单克隆抗体捕获完整的布鲁氏菌颗粒抗原，显然存在因捕获能力不足导致的敏感性不高的问题。杭州迪恩科技有限公司张明洲等(申请号201310033074.0)采用牛布鲁氏菌抗体标记胶体金仅能检测牛血液样品中的布鲁氏菌抗原，不能实现对其他易感动物的检测是该方法的局限。杭州奥泰生物技术股份有限公司陈金树等(申请号201911398504.2)采用布鲁氏菌单抗与多抗夹心法检测布鲁氏菌，和上述其他方法一样其方法的敏感性与特异性均不高。
噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘洗的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的特异性结合噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合与扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。
本发明人针对上述现有技术中存在的不足，创新性地开发了一种基于4株针对布鲁氏菌不同结合位点的单抗所建立的检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条。其核心是制备筛选了4株结合不同抗原表位布鲁氏菌单克隆抗体，其中1株单克隆抗体4D7标记胶体金颗粒置于金标垫上，再以3株单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液(1∶1∶1)作为检测线，其最低能检出1×106CFU/mL布鲁氏菌菌液为阳性，灵敏度比检测线包被1株单抗提高100倍，比包被2株单抗混合液(1∶1)提高5倍，比包被阳性血清提高了50倍。利用4株单克隆抗体的夹心法使试纸条在检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌时具有理想的灵敏度和敏感性；同时对大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌检测均为阴性，比较理想地解决了布鲁氏菌抗原胶体金检测方法中敏感性和特异性的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、敏感性高、操作简便的利用结合不同抗原表位的单克隆抗体夹心法检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌抗原的现场快速检测试纸条及其检测方法。
本发明的技术方案为：
1一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于该试纸条由布鲁氏菌抗原检测试纸条和塑料吸头组成；检测试纸条由PVC底板(7)、样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)组成，其中金标垫(2)包被胶体金标记的布鲁氏菌单克隆抗体4D7，检测线(5)包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液，质控线(6)包被山羊抗鼠IgG抗体。
2.本发明所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述胶体金标记垫包被布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。
3.本发明所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物的制备方法为：
(1)将单克隆抗体4D7株制备的小鼠腹水使用Protein A亲和层析柱进行纯化。
(2)取10mL胶体金溶液至离心管中，加入适量0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至8.0。加入用0.01M PBS稀释1∶160的单克隆抗体4D7 1mL，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白至终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬至1mL，制得布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。
4.本发明所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述检测线包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液。
5.本发明所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体4D7、2B5，5F3，6C2的制备与抗原表位鉴定方法为：
(1)用S2株猪种布鲁氏菌灭活菌液(1×1010CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫。加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与S2株猪种布鲁氏菌、M5株羊种布鲁氏菌、A19株牛种布鲁氏菌的LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157菌株、小肠结肠炎耶尔森菌O9菌株的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株，并通过Western-blot试验筛选出4株针对不同反应位点的细胞株4D7、2B5、5F3、6C2。将其扩大培养并纯化，制得4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2。
以上猪种布鲁氏菌S2株(CVCC70502)、羊种布鲁氏菌M5株(CVCC18)、牛种布鲁氏菌A19株(CVCC70202)、大肠杆菌O157(CVCC1489)、炭疽芽孢杆菌(CVCC3)、伤寒沙门氏菌(CVCC2212)、志贺氏菌(CVCC3914)，以上微生物均来自国家兽医微生物菌种保藏中心；小肠结肠炎耶尔森氏菌O9(CMCC52218)、鼠疫耶尔森菌(CMCC52006)、霍乱弧菌(CMCC18001)，以上微生物均来自中国医学细菌保藏管理中心。
(2)利用噬菌体肽库展示技术，将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2用0.1M NaHCO3稀释至100μg/mL，包被ELISA板，每孔加入150μL，4℃孵育过夜。弃去包被液，加入封闭液4℃作用1h，洗板后加入100μL含有4×1010噬菌体TBST缓冲液，室温摇动孵育1h。弃去未结合噬菌体后洗板。加入100μL含100μg/mL相应单克隆抗体溶液，竞争性洗脱结合的噬菌体，转入大肠杆菌扩增培养后提取噬菌体。按上述方法经过5轮淘洗后，分别获得4株单抗筛选富集的噬菌体，滴定后，每株随机挑选10个单个噬菌斑扩增培养并提取DNA测序。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合的抗原表位核心序列分别为：KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI、TQRIHMRLTTQS、NLSSMSTRSQRR。将以上蛋白序列在NCBI进行BLAST，分别与猪种布鲁氏菌的γ-谷氨酰γ-氨基丁酸水解酶家族蛋白、3-氧基-(酰基载体蛋白)还原酶、ABC-F家族ATP结合蛋白质、双鸟苷酸环化酶蛋白序列同源，均为布鲁氏菌保守序列。
(3)将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2稀释至5μg/mL并包被ELISA板，每孔加入100μL，经封闭洗涤后，分别加入不同抗原核心序列的4株噬菌体100μL(含5×104个噬菌体)，即每株单抗均分别与4株噬菌体反应，洗板后每孔加入10000倍稀释HRP-羊抗M13单克隆抗体，经显色后读取OD450nm值。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2仅与表达其抗原表位核心序列的噬菌体具有强反应，与其他3株噬菌体几乎无反应，证实4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合不同抗原表位。
6.本发明所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述质控线包被山羊抗鼠IgG抗体。
7.本发明所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条的检测方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样品的处理：组织样本经研磨后制成组织悬液；环境、阴道、口腔等棉拭子用1mL0.01M PBS浸泡1h，然后12000r/min离心10min，弃上清，用200μL 0.01M PBS重悬沉淀；羊水、奶液等可直接检测。
(2)取处理好的样品100μL，滴入样品垫。
(3)待样品流过检测线和质控线后，判定样品是否含有布鲁氏菌抗原，判定标准为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
8.本发明所述的一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述试纸条采用4株结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体夹心法，能对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌进行抗原现场快速检测，并有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌抗原检测的干扰。
本发明的有益效果
本发明的夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条可用于临床组织、环境、奶液等样本中布鲁氏菌的检出，也可用于纯培养布鲁氏菌的鉴定。本发明试纸条的优势在于通过4株结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体以夹心法捕获布鲁氏菌抗原，提高试纸条敏感性的同时又保持了较高特异性，能有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌抗原检测的干扰。
附图说明
图1一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条的结构示意图，图中，1为样品垫，2为金标垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为检测线(T线)，6为质控线(C线)，7为PVC板。
图2一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条结果判定示意图。
图3 4株单克隆抗体的Western-blot图片，图中，M为蛋白Maker，A为单克隆抗体4D7与S2裂解抗原在55～70KD处发生结合反应，B为单克隆抗体2B5与S2裂解抗原在40～55KD处发生结合反应，C为单克隆抗体5F3与S2裂解抗原在25～35KD处发生结合反应，D为单克隆抗体6C2与S2裂解抗原在35KD处发生结合反应。
具体实施方式
1.本发明建立了一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条
其核心是制备筛选了4株结合不同抗原表位布鲁氏菌单克隆抗体4D7、2B5，5F3，6C2，将纯化的单克隆抗体4D7经定量后标记胶体金颗粒，再以纯化的单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液作为检测线(T线)，以山羊抗鼠IgG抗体作为质控线(C线)，将PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸等组分组装成试纸条，用于检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌抗原。
本发明所提供的上述夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条的制备与检测方法，包括以下步骤：
(1)所述金标垫标记单克隆抗体4D7，其与检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体2B5、5F3、6C2的制备与抗原表位鉴定方法为：
1)将猪种布鲁氏菌S2菌液，置80℃水浴灭活2小时，调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/mL，作为免疫小鼠所用抗原。取免疫抗原0.1mL溶于生理盐水并和弗氏完全佐剂按1∶1.1混合，腹腔注射0.3mL于8周龄BALB/c小鼠。再次免疫时抗原剂量按0.1mL递增，且与弗氏不完全佐剂按1∶1.5混合；经过3次常规免疫后进行加强免疫。
2)加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19的LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株。
3)从获得的19株阳性杂交瘤细胞株中通过Western-blot试验筛选出4株针对不同反应位点的细胞株4D7、2B5、5F3和6C2，将这4个细胞株扩大培养，制备腹水并使用ProteinA亲和层析柱进行纯化，制得4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2。
4)利用噬菌体肽库展示技术，将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2用0.1M NaHCO3稀释至100μg/mL，包被ELISA板，每孔加入150μL，4℃孵育过夜。弃去包被液，加入封闭液4℃作用1h，洗板后加入100μL含有4×1010噬菌体TBST缓冲液，室温摇动孵育1h。弃去未结合噬菌体后洗板。加入100μL含100μg/mL相应单克隆抗体溶液，竞争性洗脱结合的噬菌体，转入大肠杆菌扩增培养后提取噬菌体。按上述方法经过5轮淘洗后，分别获得4株单抗筛选富集的噬菌体，滴定后，每株随机挑选10个单个噬菌斑扩增培养并提取DNA测序。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合的抗原表位核心序列分别为：KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI、TQRIHMRLTTQS、NLSSMSTRSQRR。将以上蛋白序列在NCBI进行BLAST，分别与猪种布鲁氏菌的γ-谷氨酰γ-氨基丁酸水解酶家族蛋白、3-氧基-(酰基载体蛋白)还原酶、ABC-F家族ATP结合蛋白质、双鸟苷酸环化酶蛋白序列同源，均为布鲁氏菌保守序列。
5)将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2稀释至5μg/mL并包被ELISA板，每孔加入100μL，经封闭洗涤后，分别加入不同抗原核心序列的4株噬菌体100μL(含5×104个噬菌体)，即每株单抗均分别与4株噬菌体反应，洗板后每孔加入10000倍稀释HRP-羊抗M13单克隆抗体，经显色后读取OD450nm值。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2仅与表达其抗原表位核心序列的噬菌体具有强反应，与其他3株噬菌体几乎无反应，进一步证实了4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合不同抗原表位。
(2)所述胶体金标记垫包被有布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物，其制备方法为：取10mL胶体金溶液至离心管中，加入适量0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至8.0。加入用0.01M PBS稀释1∶160的单克隆抗体4D7 1mL，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白至终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬至1mL，制得布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。
(3)所述质控线包被山羊抗鼠IgG抗体，其制备方法为：用划膜包被液将山羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，备用。将稀释后的山羊抗鼠IgG抗体用点膜仪以0.1μL/mm的体积分别喷到黏附在PVC板上的硝酸纤维素膜的质控线上，固定。
(4)所述夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条的检测方法，按照如下步骤进行：
1)样品的处理：组织样本经研磨后制成组织悬液；环境、阴道、口腔等棉拭子用1mL0.01MPBS浸泡1h，然后12000r/min离心10min，弃上清，用200μL 0.01M PBS重悬沉淀；羊水、奶液等可直接检测。
2)取处理好的样品100μL，滴入加样孔。
3)待样品流过检测线和质控线后，判定样品是否含有布鲁氏菌抗原，判定规则为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
2.本发明的检测原理
当含有布鲁氏菌抗原的样品流经胶体金标记垫时，胶体金标记垫上的布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物与布鲁氏菌抗原结合。继续流经检测线时布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物与布鲁氏菌抗原结合物与布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2相结合，显示紫红色条带。再流经质控线布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物与山羊抗鼠IgG抗体结合显示紫红色条带。若样品中没有布鲁氏菌抗原，则检测线不显示紫红色条带。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——检测线包被抗体的优化选择
1.将猪种布鲁氏菌S2分别划线接种TSA培养基，37℃培养72小时后用生理盐水洗下培养物，活菌计数计算菌液浓度后分别置80℃水浴灭活2小时，按活菌计数结果使用0.01M PBS将布鲁氏菌菌液稀释成1×108CFU/mL、5×107CFU/mL、1×107CFU/mL、5×106CFU/mL、1×106CFU/mL、5×105CFU/mL备用。
2.将大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9各自接种适宜生长的培养基，在适宜温度下培养后收获，活菌计数计算菌液浓度后灭活，按活菌计数结果使用0.01M PBS将各菌液稀释成1×108CFU/mL备用。
3.制备8批试纸条(编号S1～S8)，检测线包被结合不同抗原表位的单克隆抗体组合或阳性血清(具体见表1)。取上述稀释的猪种布鲁氏菌S2、大肠杆菌O157和小肠结肠炎耶尔森菌O9的稀释菌液各100μL分别滴入8批试纸条样品垫。待样品各自流过检测线和质控线后判定结果。判定标准为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
4.表2结果表明检测线包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5、5F3、6C2混合液(1∶1∶1)时，试纸条检测灵敏度最高，最低能检出1×106CFU/mL布鲁氏菌菌液为阳性，灵敏度比检测线包被1株单抗提高100倍，比包被2株单抗混合液(1∶1)提高5倍，比包被阳性血清提高了50倍。因此，选择布鲁氏菌单克隆抗体2B5、5F3、6C2混合液作为试纸条检测线的包被物。
表1检测线包被抗体类型
Figure BDA0003071816070000081
表2检测线包被抗体的优化选择结果
Figure BDA0003071816070000082
Figure BDA0003071816070000091
实施例2——利用4株结合不同抗原表位的单克隆抗体夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条结构
利用夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条，如图1所示，试纸条由PVC底板(7)和在底板上依次粘贴的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)组成，其中金标垫(2)包被胶体金标记的布鲁氏菌单克隆抗体4D7，检测线(5)包被布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液，质控线(6)包被山羊抗鼠IgG抗体。
实施例3——夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条的制备
1.猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9等不同菌株LPS的提纯和定量方法。
(1)菌悬液制备与灭活将鉴定合格的猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9分别接种适宜的培养基，37℃培养72小时后，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理盐水10ml浸泡菌体表面10min以上，洗下培养物，80℃灭活2h，并进行灭活检验。
(2)LPS的粗提将灭活检验合格的菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1∶3(W/W)比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热到66℃，然后加入66℃预热的90％(V/V)苯酚溶液。在此温度下持续搅拌15min，置室温自然冷却后，于4℃10000g离心15min。用一长管吸弃下层棕红色的酚相，将水相用Whatman 1号滤纸过滤去除大菌体碎片。用量筒量取酚相体积，然后加入3倍体积-15℃以下预冷含1％甲醇饱和的醋酸钠，4℃孵育2小时，4℃10000g离心10min，弃上清。
(3)蛋白酶消化、苯酚抽提和PEG浓缩将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，加入一定量的蛋白酶K，使其终浓度达50μg/mL，并用1N NaOH调节PH值至8.0，置56℃水浴消化2小时。加入等体积苯酚溶液抽提2遍后，4℃10000g离心10min。收集上清液于4℃保存，在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15min后，10000g离心15min，弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析过夜，换液2次，用PEG20000浓缩10倍，再次置于蒸馏水透析过夜，分别收集各透析袋内容物，此即提纯的猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS。
(4)LPS纯度测定精密称取105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖10mg置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度摇匀，得0.1mg/mL的储备溶液。精确吸取葡萄糖标准液0、1、2、3、4、5mL，分别置于10mL容量瓶中，以蒸馏水补至10mL摇匀，依次吸取2mL加入试管中，加入80％苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，混匀，在室温放置30min后，于波长490nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线；同时精密称取已提纯的猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS抗原10mg，加入10mL蒸馏水充分溶解后，吸取2mL加入试管中，加入苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，混匀，在室温放置30min后，于波长490nm处测定吸光度值，按标准曲线制备的方法测定吸光度值，并根据回归方程，求得其浓度，计算样品中LPS的含量和纯度。
2.对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌LPS均具有良好亲和力的抗布鲁氏菌单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2株的制备方法。
(1)免疫抗原及单抗筛选抗原的制备用生理盐水洗下TSA培养基上生长的猪种布鲁氏菌S2，置80℃水浴灭活2小时，调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/mL，作为免疫小鼠所用抗原，2～8℃保存备用。单抗筛选抗原即为上述方法制备的猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS。
(2)单克隆抗体制备和筛选取上述免疫抗原0.1mL溶于生理盐水并和弗氏完全佐剂按1∶1.1混合，腹腔注射0.3mL于8周龄BALB/c小鼠。再次免疫时抗原剂量按0.1mL递增，且与弗氏不完全佐剂按1∶1.5混合；经过3次常规免疫后进行加强免疫，72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照标准程序进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS分别包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验，筛选与猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19的LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS几乎无反应的19株阳性杂交瘤细胞株，并通过Western-blot试验筛选出4株针对不同反应位点的细胞株4D7、2B5、5F3、6C2。按照有限稀释法进行2次亚克隆获得单克隆抗体细胞株。
(3)腹水制备与纯化将计数为1×106阳性杂交瘤细胞稀释于不含血清的DMEM中，腹腔注射0.3mL于10周龄的BALB/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水。制备的小鼠腹水使用Protein A亲和层析柱进行纯化。
3.布鲁氏菌单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2株抗原表位鉴定方法。
(1)利用噬菌体肽库展示技术，将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2用0.1M NaHCO3稀释至100μg/mL，包被ELISA板，每孔加入150μL，4℃孵育过夜。弃去包被液，加入封闭液4℃作用1h，洗板后加入100μL含有4×1010噬菌体TBST缓冲液，室温摇动孵育1h。弃去未结合噬菌体后洗板。加入100μL含100μg/mL相应单克隆抗体溶液，竞争性洗脱结合的噬菌体，转入大肠杆菌扩增培养后提取噬菌体。按上述方法经过5轮淘洗后，分别获得4株单抗筛选富集的噬菌体，滴定后，每株随机挑选10个单个噬菌斑扩增培养并提取DNA测序。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合的抗原表位核心序列分别为：KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI、TQRIHMRLTTQS、NLSSMSTRSQRR。将以上蛋白序列在NCBI进行BLAST，分别与猪种布鲁氏菌的γ-谷氨酰γ-氨基丁酸水解酶家族蛋白、3-氧基-(酰基载体蛋白)还原酶、ABC-F家族ATP结合蛋白质、双鸟苷酸环化酶蛋白序列同源，均为布鲁氏菌保守序列。
(2)将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2稀释至5μg/mL并包被ELISA板，每孔加入100μL，经封闭洗涤后，分别加入不同抗原核心序列的4株噬菌体100μL(含5×104个噬菌体)，即每株单抗均分别与4株噬菌体反应，洗板后每孔加入10000倍稀释HRP-羊抗M13单克隆抗体，经显色后读取OD450nm值。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2仅与表达其抗原表位核心序列的噬菌体具有强反应，与其他3株噬菌体几乎无反应，验证4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合不同抗原表位。
4.布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物与金标垫的制备。
(1)取250ml圆底烧瓶，量取100ml蒸馏水并加1mL 1％氯金酸溶液，搅拌加热至煮沸。加入1.5mL 1％柠檬酸钠水溶液至上述氯金酸水溶液中，搅拌混匀，并保持沸腾10min，此间溶液颜色将由透明变黑，再逐渐变红，最终溶液呈酒红色。10min后停止加热，待溶液冷却后，补加蒸馏水定容至100mL，此即胶体金溶液。将制备好的胶体金溶液置于2～8℃保存。
(2)取10mL胶体金溶液至离心管中，加入适量0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至8.0。加入用0.01M PBS稀释1∶160稀释单克隆抗体4D7 1mL，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白至终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬至1mL。该溶液即为布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。
(3)将布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物用0.22μm的滤膜过滤除菌，于2～8℃环境冷藏保存，备用。
(4)将制备好的单克隆抗体4D7金标溶液使用喷金仪按0.2μL/mm均匀的喷在处理好的金垫上，置于37℃恒温箱中干燥16小时，备用。
5.检测线(T线)和质控线(C线)的制备。
(1)布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2按1∶1∶1的比例混合，混合液作为硝酸纤维素膜上检测线的包被抗体。将制备好的布鲁氏菌单抗混合液用划膜包被液作1:200稀释，用点膜仪以0.1μL/mm喷到黏附在PVC板上硝酸纤维素膜的检测线(T线)的位置，固定。
(2)山羊抗鼠IgG抗体作为硝酸纤维素膜上的质控线包被抗体。用划膜包被液将山羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，备用。将稀释后的山羊抗鼠IgG抗体用点膜仪以0.1μL/mm的体积分别喷到黏附在PVC板上的硝酸纤维素膜的质控线(C线)上，固定。
6.试纸条的组装。
将硝酸纤维素膜粘贴到PVC板的相应位置，然后将样品垫，金标垫，吸水纸依次粘贴到PVC板的相应位置。使金标垫与硝酸纤维素膜部分接触，约1～2mm；使吸水纸与硝酸纤维素膜部分接触，约2～3mm。用切条机将其切成3mm宽的小条，放置上下盖板内，即为夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条。
实施例4——夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条的灵敏度测试试验
1.将羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2分别划线接种TSA培养基，37℃培养72小时后用生理盐水洗下培养物，活菌计数计算菌液浓度后分别置80℃水浴灭活2小时，按活菌计数结果使用0.01M PBS将各布鲁氏菌菌液稀释成1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL备用。
2.取1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL不同稀释度菌液各100μL滴入样品垫。待样品各自流过检测线和质控线后判定结果。判定标准为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
3.试纸条的灵敏度测试结果见表3。结果表明夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条的灵敏度为牛种、羊种、猪种布鲁氏菌含量为1×106CFU/mL均检测为阳性，含量为1×105CFU/mL均检测为阴性。
表3夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条的灵敏度测试结果
Figure BDA0003071816070000121
Figure BDA0003071816070000131
实施例5——夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条的敏感性和特异性测试试验
1.将2017～2019年实验室分离的布鲁氏菌50株(其中牛种布鲁氏菌22株，羊种布鲁氏菌28株)分别划线接种TSA培养基，37℃培养72小时后用生理盐水洗下培养物，活菌计数计算菌液浓度后分别置80℃水浴灭活2小时，按活菌计数结果使用0.01M PBS将各布鲁氏菌菌液稀释成1×106CFU/mL备用。
2.将大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌各自接种适宜生长的培养基，在适宜温度下培养后收获，活菌计数计算菌液浓度后灭活，按活菌计数结果使用0.01M PBS将各菌液稀释成1×108CFU/mL备用。
3.取制备好的各稀释度菌液100μL滴入样品垫。待样品各自流过检测线和质控线后判定结果。判定标准为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
试纸条的敏感性测试结果为：50株布鲁氏菌菌液稀释成1×106CFU/mL，均检测为阳性，表明试纸条敏感性高。试纸条的特异性测试结果为：7株易与布鲁氏菌发生交叉反应的其他细菌菌液稀释成1×108CFU/mL，均检测为阴性，表明试纸条特异性好，能有效排除大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9等对布鲁氏菌抗原检测的干扰。
实施例6——夹心法检测布鲁氏菌抗原的检测试纸条的临床样品验证试验
1.将2017～2019年实验室采集的阳性临床样品142份：牛、羊组织样品61份(其中羊脾脏11份、牛脾脏12份、羊淋巴结9份、牛淋巴结10份、奶牛阴道拭子19份)，牛奶样品28份，羊奶样品17份，环境拭子36份。经检测上述样品布鲁氏菌含量均高于1×106CFU/mL。
2.将2017～2019年实验室采集的阴性临床样品191份：牛、羊组织样品109份(其中羊脾脏25份、牛脾脏21份、羊淋巴结17份、牛淋巴结15份、奶牛阴道拭子31份)，牛奶样品32份，羊奶样品27份，环境拭子23份。经检测上述样品均为布鲁氏菌阴性样品。
3.脾脏、淋巴结等组织样本经研磨后制成组织悬液；阴道、环境拭子用1mL 0.01MPBS浸泡1h，然后12000r/min离心10min，弃上清，用200μL 0.01M PBS重悬沉淀；奶液直接检测。取处理好的样品100μL，滴入加样孔。待样品流过检测线和质控线后，判定样品是否含有布鲁氏菌抗原，判定规则为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
4.临床样品检测结果：阳性临床样品142份，均检测为阳性；阴性临床样品191份，均检测为阴性；表明本试纸条适用于临床组织、环境、奶液等样本中布鲁氏菌的检出。

Claims (8)

1.一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于该试纸条由布鲁氏菌抗原检测试纸条和塑料吸头组成；检测试纸条由PVC底板(7)、样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)组成，其中金标垫(2)包被胶体金标记的布鲁氏菌单克隆抗体4D7，检测线(5)包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液，质控线(6)包被山羊抗鼠IgG抗体。
2.如权利要求1所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述胶体金标记垫包被有布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。
3.如权利要求2所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物的制备方法为：
(1)将单克隆抗体4D7株制备的小鼠腹水使用Protein A亲和层析柱进行纯化；
(2)取10mL胶体金溶液至离心管中，加入适量0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至8.0。加入用0.01M PBS稀释1∶160的单克隆抗体4D7 1mL，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白至终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬至1mL，制得布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。
4.根据权利要求1所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述检测线包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液。
5.根据权利要求2和4所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体4D7、2B5，5F3，6C2的制备与抗原表位鉴定方法为：
(1)用猪种布鲁氏菌S2灭活菌液(1×1010CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫。加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19的LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株，并通过Western-blot试验筛选出4株针对不同反应位点的细胞株4D7、2B5、5F3、6C2。将其扩大培养并纯化，制得4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2；
(2)利用噬菌体肽库展示技术，将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2用0.1M NaHCO3稀释至100μg/mL，包被ELISA板，每孔加入150μL，4℃孵育过夜。弃去包被液，加入封闭液4℃作用1h，洗板后加入100μL含有4×1010噬菌体TBST缓冲液，室温摇动孵育1h。弃去未结合噬菌体后洗板。加入100μL含100μg/mL相应单克隆抗体溶液，竞争性洗脱结合的噬菌体，转入大肠杆菌扩增培养后提取噬菌体。按上述方法经过5轮淘洗后，分别获得4株单抗筛选富集的噬菌体，滴定后，每株随机挑选10个单个噬菌斑扩增培养并提取DNA测序。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合的抗原表位核心序列分别为：KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI、TQRIHMRLTTQS、NLSSMSTRSQRR。将以上蛋白序列在NCBI进行BLAST，分别与猪种布鲁氏菌的γ-谷氨酰γ-氨基丁酸水解酶家族蛋白、3-氧基-(酰基载体蛋白)还原酶、ABC-F家族ATP结合蛋白质、双鸟苷酸环化酶蛋白序列同源，均为布鲁氏菌保守序列；
(3)将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2稀释至5μg/mL并包被ELISA板，每孔加入100μL，经封闭洗涤后，分别加入不同抗原核心序列的4株噬菌体100μL(含5×104个噬菌体)，即每株单抗均分别与4株噬菌体反应，洗板后每孔加入10000倍稀释HRP-羊抗M13单克隆抗体，经显色后读取OD450nm值。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2仅与表达其抗原表位核心序列的噬菌体具有强反应，与其他3株噬菌体几乎无反应，证实4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合不同抗原表位。
6.根据权利要求1所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述质控线包被山羊抗鼠IgG抗体。
7.应用权利要求1所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条的检测方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样品的处理：组织样本经研磨后制成组织悬液；环境、阴道、口腔等棉拭子用1mL0.01M PBS浸泡1h，然后12000rpm离心10min，弃上清，用200μL 0.01M PBS重悬沉淀；羊水、奶液等可直接检测；
(2)取处理好的样品100μL，滴入样品垫；
(3)待样品流过检测线和质控线后，判定样品是否含有布鲁氏菌抗原，判定标准为：仅质控线出现一条紫红色条带，检测线无紫红色条带出现，判为阴性(－)；出现两条紫红色条带，一条位于检测线，另一条位于质控线，判为阳性(+)；质控线未出现紫红色条带，判为无效。
8.根据权利要求1所述的一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述试纸条采用4株结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体夹心法，能对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌进行抗原现场快速检测，并有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌抗原检测的干扰。
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