CN115166238A - 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条。所述该试纸条由初筛试纸条(试纸条1)和确诊试纸条(试纸条2)组成，均分别由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。试纸条1金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS和胶体金标记的鼠源抗Flag标签单克隆抗体，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，质控线包被羊抗鼠IgG抗体。试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，检测线包被兔抗羊IgG抗体，质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4。使用时，取待检血清滴入加样孔，根据试纸条1和试纸条2呈现的结果，可现场快速对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定。

Description

羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条
技术领域
本发明涉及一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸，属生物制品检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。2016年，WHO将布病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。
我国是布病高负担国家，根据农业农村部“兽医公报”发布的动物疫情，分析近6年我国牛羊报告新增病例情况：布病每年报告的新增病例占牛羊所有疾病报告病例总数的88.2％，其余8种相对重要的疫病报告新发病例总和只占11.2％。按照国家统计局公布的牛羊养殖规模和中国动物疫病预防控制中心公布的布病阳性率基数，测算2019年我国仅仅因动物布病导致的产仔数减少、产奶量下降和动物利用胎次减少三项损失高达到770亿，2021年三项损失超过830亿元。
人感染布病是由于接触了感染布病的家畜或其制品，我国家畜布病严重流行状况导致人间布病疫情同样十分严重。卫健委官方网站报道2021年度我国人间布病新增病例为69767例，创历史最高水平，按照国际认可的实际发病人数是报道病例的10～25倍测算，我国2021年人间实际新增布病的人数达到惊人的69万人～172万人，健康和生产力损失无法计算。
布病对公共卫生和畜牧业生产构成了十分严重威胁，防控布病已刻不容缓。世界布病防控实践反复证实，控制好动物布病是防控人间布病最经济最有效的策略。“检测—淘汰”(“检-淘”)是国际上布病防控的基本策略，其核心要义在于首先要能准确诊断、快捷诊断，实现既快又准。
随着科学技术的进步，动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝集试验(如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验)逐渐被敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)等新的检测技术所取代。在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验(CFT)在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，但补体结合试验所需要的补体、溶血素等制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用。
ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。目前，用于检测布病的ELISA方法包括间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种。其中iELISA主要检测血清中IgG类抗体，检测结果基本等效于CFT方法，可作为布病确诊方法；cELISA方法需要使用布鲁氏菌特异性单抗，竞争血清中布鲁氏菌特异性抗体，因此可以同时检测血清中的IgG和IgM类抗体，由于IgM类抗体指征了急性感染早期(感染尚未明确)，且IgM存在一定的非特异性，因同时检测IgG和IgM的cELISA方法则可以作为临床上布病的初筛方法。上述各种布病检测方法各有其自身的特点，但存在的共同缺陷是以上各种检验都必须在实验室内完成。一般先分离血清，然后按照各种方法的操作程序进行实验室检验。
免疫胶体金技术克服了ELISA试验需要在实验室中进行的缺陷，可以直接采血后，滴加到胶体金试纸条加样孔内，现场就能判定是否为布鲁氏菌感染。虽然已有关于布鲁氏菌胶体金诊断试纸条的发明专利报道，但都有各自不足之处，如中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所王兴龙等、吉林大学闫广谋等(申请号：CN200710055740.5，CN200710055741.X，CN200810051726.2)采用以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标抗体，由于SPA具有非特异性吸附IgG分子的能力，因此可用于对多种不同动物进行诊断，但对不同动物体内IgG吸附能力各不相同，因此对采用同一个试纸条对不同动物进行布病检测，其敏感性并不稳定。再如，杭州迪恩科技有限公司张明洲等(申请号：CN201310033074.0)，采用布鲁氏菌菌体抗原作为质控线包被抗原，再利用一种抗红细胞的单克隆抗体作为竞争用的单抗，吸附干燥的胶体金蛋白(流动带)，建立了夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡，一方面该专利中并未明确阐述其核心技术特征，另一方面，由于布鲁氏菌与一些革兰氏阴性细菌，特别是耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157具有较强的菌体抗原相似性，而该专利中使用布鲁氏菌菌体抗原作为胶体金颗粒的吸附抗原，理论上其检测结果会存在一定的非特异性。
对于布病检测，当前最紧缺的是能解决现场快速准确检测问题，这对牛羊的跨地区调拨尤为重要。虽然已有一些商品化试纸条用于布病的检测，但其检测结果一般只作为参考，确认仍然需要进行实验室诊断。针对临床诊断的实际困难，本发明通过将两种不同检测原理的胶体金检测试纸条集成在一起，其中1根试纸条采用布鲁氏菌单抗竞争法原理，同时检测待检羊血液中IgG和IgM，另一根试纸条采用间接法原理仅待检羊血液中IgG。2根试纸条共享一个加样孔，共置于同一个外壳框内，形成一个检测整体。使用时，只需取待检血清滴入加样孔，根据2根试纸条呈现出的条带情况，便可对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定，解决了长期困扰布病临床一线的布病准确诊断的技术难题。
本发明专利具有操作简单快捷，结果易于判断的优点，同时无需任何仪器设备，适合于临床快速诊断。
发明内容
本发明通过筛选到的一株布鲁氏菌高亲和力单克隆抗体(M4株)，建立了能同时检测动物血清中针对布鲁氏菌的IgG和IgM免疫扩散胶体金试纸条(试纸条1)，与建立的检测羊血清中布鲁氏菌IgG类抗体的胶体金试纸条(试纸条2)集成在一起，共置于同一个外壳框内，形成一个新的检测单元。在该检测单元中，两个试纸条的检测临界值被精确控制到与布鲁氏菌补体结合试验(CFT)同一水平，确保检测敏感度一致。使用时，取待检血清滴入加样孔，根据2根试纸条呈现的结果，便可对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定。本发明的目的在于提供一种方便、准确、快捷的羊布病现场快速诊断方法。
本发明技术方案为：
1.一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于将初筛试纸条(试纸条1)和确诊试纸条(试纸条2)共置于同一个外壳框内，形成一个新的检测单元。其中试纸条1和试纸条2均分别由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。使用时，取待检血清滴入加样孔，根据试纸条1和试纸条2呈现出的结果，对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定。
2.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条1金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS和胶体金标记的鼠源抗Flag标签单克隆抗体，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
3.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，检测线包被兔抗羊IgG抗体，质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4。
4.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述胶体金标记的布鲁氏菌LPS制备方法为：
(1)将灭活布鲁氏菌S2菌悬液(含菌量不少于1×1010CFU/mL)以10000g离心20分钟，收集沉淀。采用热酚水法提取布鲁氏菌LPS，提取的上清液用蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，此即纯化的LPS。
(2)取胶体金溶液10mL至离心管中，加入20～60μL的0.1M K2CO3溶液，使pH值约为7.5。取制备的LPS溶液140μL加入到上述胶体金溶液中，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀。4℃条件下，10000r/min离心40min，弃上清。用2mL 0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀，此即胶体金标记的LPS。
5.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体M4制备方法为：
用猪种布鲁氏菌S2株灭活菌液(1×1010CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫。加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与布鲁氏菌LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157菌株、小肠结肠炎耶尔森菌O9菌株的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株M4，将其扩大培养并纯化，制得单克隆抗体M4。
以上猪种布鲁氏菌S2株(CVCC70502)、大肠杆菌O157(CVCC1489)均来自国家兽医微生物菌种保藏中心；小肠结肠炎耶尔森氏菌O9(CMCC52218)来自中国医学细菌保藏管理中心。
6.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于采用布病阳性血清标准品(羊源，含量1000IU/mL)对试纸条1和试纸条2的检测灵敏度进行定量，检测灵敏度均为50IU/mL。
7.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条1和试纸条2的检测灵敏度的定量方法为：
用生理盐水将羊源布病阳性血清标准品进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等4个不同稀释度备用，即血清抗体含量为100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL。滴加2滴各稀释度阳性血清(约100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果。确定试纸条1和试纸条2检测灵敏度结果：羊源布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50IU/mL)，试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为阳性；羊源布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)，试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为阴性。
8.本发明所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样本处理：取动物全血，分离血清，血清应清亮，无溶血。
(2)操作方法：滴加2滴血清(约100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果。
(3)判定标准：当试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病阴性(－)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为布病阳性(+)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病可疑(±)；当试纸条1或试纸条2出现质控线无条带，判为无效。
本发明的有益效果
本发明通过集成竞争法初筛试纸条和间接法确诊试纸条实现对羊布病现场快速准确诊断的方法。本发明的优势在于通过羊源布病阳性血清标准品对竞争法初筛试纸条和间接法确诊试纸条的检测灵敏度进行定量，使两种试纸条的检测灵敏度与布病诊断金标准CFT方法的检测灵敏度一致，提高了方法的准确性。在同一检测灵敏度条件下，通过两种试纸条分别检测血清样品中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM的含量，达到现场快速判定布病可疑羊、阳性羊、阴性羊的目的。
附图说明
图1一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条结构示意图。
图2试纸条1结构及工作原理示意图。
图3试纸条2结构及工作原理示意图。
具体实施方式
1.本发明建立了一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条。
其核心是由两种不同检测原理的胶体金检测试纸条集成在一起，即竞争法初筛试纸条(试纸条1)和间接法确诊试纸条(试纸条2)组成，其中试纸条1和试纸条2均分别由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。试纸条1金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS和胶体金标记的鼠源抗Flag标签单克隆抗体，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，质控线包被羊抗鼠IgG抗体。试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，检测线包被兔抗羊IgG抗体，质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4。采用布病阳性血清标准品(羊源，含量1000IU/mL)将试纸条1和试纸条2的检测灵敏度精确控制到与布鲁氏菌补体结合试验(CFT)一致。使用时，取待检血清滴入加样孔，根据试纸条1和试纸条2呈现的结果，可现场快速对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定。
本发明所提供的上述羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条的制备与检测方法，包括以下步骤：
(1)所述试纸条1和试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，其制备方法为：①将灭活布鲁氏菌S2菌悬液以10000g离心20分钟，收集沉淀。采用热酚水法提取布鲁氏菌LPS，提取的上清液用蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，此即纯化的LPS。②取胶体金溶液10mL至离心管中，加入适量的0.1M K2CO3溶液，使pH值约为7.5。取制备的LPS溶液140μL加入到胶体金溶液中，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀。4℃条件下，10000r/min离心40min，弃上清。用2mL 0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀，此即胶体金标记的LPS。
(2)所述试纸条1金标垫标记鼠源抗Flag标签单克隆抗体，其制备方法为：取胶体金溶液10mL至离心管中，加入适量0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至7.5。以10μg/mL的量加入商品化鼠源抗Flag标签单克隆抗体，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬，此溶液即为标记好的Flag单克隆抗体胶体金溶液。
(3)所述试纸条1检测线和所述试纸条2质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，其制备方法为：用猪种布鲁氏菌S2株灭活菌液(1×1010CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫。加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与布鲁氏菌LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157菌株、小肠结肠炎耶尔森菌O9菌株的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株M4，将其扩大培养并纯化，制得单克隆抗体M4。用划膜包被液作1：200稀释，用点膜仪以0.1μL/mm划到试纸条1检测线和试纸条2质控线的位置，固定。
(4)所述试纸条1质控线包被羊抗鼠IgG抗体，其制备方法为：用划膜包被液将商品化羊抗鼠IgG抗体稀释至0.5mg/mL，用点膜仪以0.1μL/mm划到试纸条1的质控线上，固定。
(5)所述试纸条2检测线包被兔抗羊IgG抗体，其制备方法为：用划膜包被液将商品化兔抗羊IgG抗体稀释至1mg/mL，用点膜仪以0.1μL/mm划到试纸条2的检测线上，固定。
(6)所述试纸条1和试纸条2的检测灵敏度的定量方法为：用生理盐水将羊源布病阳性血清标准品进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等4个不同稀释度备用，即血清抗体含量为100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL。滴加2滴各稀释度阳性血清(约100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果。确定试纸条1和试纸条2检测灵敏度结果：羊源布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50IU/mL)，试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为阳性；羊源布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)，试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为阴性。
(7)所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，按照如下步骤进行：①样本处理：取动物全血，分离血清，血清应清亮，无溶血。②操作方法：滴加2滴血清(约100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果。③判定标准：当试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病阴性(－)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为布病阳性(+)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病可疑(±)；当试纸条1或试纸条2出现质控线无条带，判为无效。
2.本发明的检测原理
当含有布鲁氏菌抗体的样品经加样孔流经试纸条1的胶体金标记垫时，胶体金标记垫上的布鲁氏菌LPS-胶体金标记物与布鲁氏菌抗体结合，继续流经检测线时由于布鲁氏菌LPS-胶体金标记物已经与样品中抗体结合，而不能再与检测线单克隆抗体M4结合，不显示条带。再流经质控线时鼠源抗Flag标签单克隆抗体-胶体金标记物与羊抗鼠IgG抗体结合显示紫红色条带。同时含有布鲁氏菌抗体的样品经加样孔流经试纸条2的胶体金标记垫时，胶体金标记垫上的布鲁氏菌LPS-胶体金标记物与布鲁氏菌抗体结合，继续流经检测线时与兔抗羊IgG抗体结合，形成布鲁氏菌LPS-胶体金标记物-布鲁氏菌抗体-兔抗羊IgG抗体复合物，显示紫红色条带。再流经质控线时未与样品中布鲁氏菌抗体结合的布鲁氏菌LPS-胶体金标记物与质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4结合，显示紫红色条带。
若样品中没有布鲁氏菌抗体，样品流经试纸条1的胶体金标记垫时，不能与胶体金标记垫上的布鲁氏菌LPS-胶体金标记物结合，继续流经检测线时布鲁氏菌LPS-胶体金标记物与检测线单克隆抗体M4结合，显示紫红色条带。再流经质控线时鼠源抗Flag标签单克隆抗体-胶体金标记物与羊抗鼠IgG抗体结合显示紫红色条带。同时样品经加样孔流经试纸条2的胶体金标记垫时，不能与胶体金标记垫上的布鲁氏菌LPS-胶体金标记物结合，继续流经检测线时也不能与兔抗羊IgG抗体结合，不显示紫红色条带。再流经质控线时布鲁氏菌LPS-胶体金标记物与质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4结合，显示紫红色条带。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——胶体金标记条件的优化
1.胶体金颗粒大小的选择取250mL圆底烧瓶，量取100mL蒸馏水并加1mL 1％氯金酸溶液，搅拌加热至煮沸。加入0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL等不同体积1％柠檬酸钠水溶液至上述氯金酸水溶液中，搅拌混匀，并保持沸腾10min。10min后停止加热，待溶液冷却后，补加蒸馏水定容至100mL，此即胶体金溶液。将制备好的胶体金溶液置于2～8℃保存。用支持膜的镍网蘸取金标溶液，自然干燥后直接在透射电镜下观察，计算100个胶体金蛋白颗粒的平均直径，同时用1×PBS缓冲液(含1％BSA)将胶体金溶液作1:20稀释后测定OD520nm值。
2.胶体金标记最佳pH值的确定取1mg/mL的光滑型布鲁氏菌S2株LPS和商品化Flag单抗10μL，分别加入pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的1mL胶体金中，混匀，室温下放置10～15分钟；再分别加入10％NaCl溶液20μL，混匀，2～8℃静置2小时后观察结果，确定金标记最适pH值。
3.胶体金溶液最佳标记量的确定分别取待标记的布鲁氏菌S2株LPS和商品化Flag单抗(浓度均为1mg/mL)0μL、4μL、8μL、12μL、16μL及20μL加入1mL胶体金中，室温作用45分钟后加入100μL 10％NaCl，2～8℃静置2小时，在胶体金颜色没有发生改变、LPS或Flag单抗加入量最少的基础上，增加20％为最佳标记量。
4.结果(1)胶体金颗粒大小与柠檬酸钠的加入量成反比(表1)。加入1.5mL 1％柠檬酸钠于100mL 0.01％的氯金酸溶液中制备的胶体金颜色为酒红色，颗粒大小比较均一，胶体金颗粒平均直径约为40nm(40±4nm)，胶体金溶液OD520nm在0.2～0.3之间，符合要求。(2)用pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的胶体金标记布鲁氏菌S2株LPS和商品化Flag单抗，结果表明，pH值为7.5时两种免疫胶体金溶液稳定，颜色鲜艳，故确定胶体金标记时pH值为7.5。(3)分别取待标记的光滑型布鲁氏菌S2株LPS和商品化Flag单抗(浓度均为1mg/mL)0μL、4μL、8μL、12μL、16μL及20μL加入1mL胶体金中，作用45分钟后加入100μL 10％NaCl，2～8℃静置2小时。酒红色LPS胶体金溶液未发生颜色改变的最少含量为12μL，因此，在此基础上加20％，即每毫升胶体金溶液中含LPS 14μL(1mg/mL)。酒红色商品化Flag单抗胶体金溶液未发生颜色变化的最少含量为8μL，即含商品化Flag单抗8μg，因此，在此基础上加20％，即每毫升胶体金溶液中含Flag单抗10μg。
表1胶体金制备过程中柠檬酸三钠加入量与胶体金颗粒大小之间的关系
Figure BDA0003777533000000081
Figure BDA0003777533000000091
实施例2——羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条结构
羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条如图1所示，由初筛试纸条(试纸条1)和确诊试纸条(试纸条2)组成，试纸条1和试纸条2均分别在PVC底板上依次粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。如图2所示试纸条1金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS和胶体金标记的鼠源抗Flag标签单克隆抗体，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，质控线包被羊抗鼠IgG抗体。如图3所示试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，检测线包被兔抗羊IgG抗体，质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4。
实施例3——羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条的制备
1.LPS的制备与胶体金标记
(1)LPS提取将灭活布鲁氏菌S2菌悬液以10000g离心20分钟，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3(W/W)比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热至66℃，然后加入66℃预热的90％(V/V)苯酚溶液。在此温度下(66℃)持续搅拌15分钟，置室温自然冷却后，置4℃以10000g离心15分钟。用一长管吸取下层棕红色的酚相，用滤纸过滤去除大菌体碎片。用量筒量取酚相体积，然后加入3倍体积-15℃以下预冷的甲醇(含1％甲醇饱和的醋酸钠)，4℃孵育2小时，置4℃以10000g离心10分钟，弃上清，将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，4℃以10000g离心10分钟。收集上清溶液于2～8℃保存。将沉淀再用等体积灭菌蒸馏水重悬，4℃再搅拌2小时，依上法离心获上清液，并与前述上清液混合。随后，在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15分钟后，10000g离心15分钟，弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析过夜，换液2次(每一次至少4000mL)，收集透析袋内容物，此即提取的LPS。将提取的LPS抗原冻干，-20℃以下保存备用。
(2)LPS纯度测定取出LPS冻干抗原，称重，按绝对质量用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.6)将其溶解，使其浓度为1mg/mL。用无菌生理盐水作1:10000稀释，用商品化LPS检测试剂盒进行检测，绘出标准曲线，计算标准曲线的回归方程，以样品OD570nm值计算出样品浓度，再按纯度＝(LPS测定浓度/1mg/mL)×100％公式计算样品纯度。
(3)胶体金标记LPS取胶体金溶液10mL至离心管中，加入适量的0.1M K2CO3溶液，使pH值约为7.5。取制备的LPS溶液140μL加入到胶体金溶液中，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀。4℃条件下，10000r/min离心40min，弃上清。用2mL 0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀，此即胶体金标记的LPS。
2.胶体金标记鼠源抗Flag标签单克隆抗体的制备。
取胶体金溶液10mL至离心管中，加入适量0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至7.5。以10μg/mL的量加入商品化鼠源抗Flag标签单克隆抗体，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬，此溶液即为标记好的Flag单克隆抗体胶体金溶液。
3.布鲁氏菌单克隆抗体M4的制备。
用猪种布鲁氏菌S2株灭活菌液(1×1010CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫。加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与布鲁氏菌LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157菌株、小肠结肠炎耶尔森菌O9菌株的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株M4，将其扩大培养并纯化，制得单克隆抗体M4。
4.试纸条1的制备与组装。
(1)金标垫的制备将制备的胶体金标记LPS溶液和胶体金标记Flag单抗溶液以1:1的比例混合，使用喷金仪按0.2μL/mm均匀的喷在处理好的金垫上，置于37℃恒温箱中干燥16小时，备用。
(2)检测线(T线)和质控线(C线)的制备将布鲁氏菌单抗M4用划膜包被液作1:200稀释，用点膜仪以0.1μL/mm划到硝酸纤维素膜的检测线(T线)的位置。羊抗鼠IgG抗体用划膜包被液稀释至0.5mg/mL，用点膜仪以0.1μL/mm划到硝酸纤维素膜质控线(C线)位置，置于37℃恒温干燥箱中，烘干16小时，室温干燥贮存。
(3)试纸条1的组装将硝酸纤维素膜粘贴到PVC板的相应位置，然后将样品垫，金标垫，吸水纸依次粘贴到PVC板的相应位置。使金标垫与硝酸纤维素膜部分接触，约1～2mm；使吸水纸与硝酸纤维素膜部分接触，约2～3mm。用切条机将其切成3mm宽的小条，即为试纸条1。
5.试纸条2的制备与组装。
(1)金标垫的制备制备的胶体金标记LPS溶液使用喷金仪按0.2μL/mm均匀的喷在处理好的金垫上，置于37℃恒温箱中干燥16小时，备用。
(2)检测线(T线)和质控线(C线)的制备用划膜包被液将商品化兔抗羊IgG抗体稀释至1mg/mL，用点膜仪以0.1μL/mm划到硝酸纤维素膜的检测线(T线)的位置上，布鲁氏菌单抗M4用划膜包被液作1:200稀释，用点膜仪以0.1μL/mm划到硝酸纤维素膜的质控线(C线)的位置，置于37℃恒温干燥箱中，烘干16小时，室温干燥贮存。
(3)试纸条2的组装将硝酸纤维素膜粘贴到PVC板的相应位置，然后将样品垫，金标垫，吸水纸依次粘贴到PVC板的相应位置。使金标垫与硝酸纤维素膜部分接触，约1～2mm；使吸水纸与硝酸纤维素膜部分接触，约2～3mm。用切条机将其切成3mm宽的小条，即为试纸条2。
6.羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条的组装。
将试纸条1与试纸条2分别放入检测卡盖板的相应位置内，使试纸条1和试纸条2样品垫相连接，封闭上下盖板，即为羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条。
实施例4——羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条灵敏度测试试验
1.用生理盐水将羊源布病阳性血清标准品进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等4个不同稀释度备用，即血清抗体含量为100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL，备用。
2.取各稀释度阳性血清，分别滴加2滴(约100μL)于加样孔内，待样品各自流过检测线和质控线后判定结果。判定标准为：当试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病阴性(－)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为布病阳性(+)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病可疑(±)；当试纸条1或试纸条2出现质控线无条带，判为无效。
3.试纸条的灵敏度测试结果见表2。结果表明羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条的灵敏度为羊源布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；羊源布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测判为阴性。
表2羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条灵敏度测试结果
Figure BDA0003777533000000111
注：T(+)：检测线有条带；T(－)：检测线无条带；C(+)：质控线有条带；C(－)：质控线无条带。
实施例5——羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条敏感性与特异性测试试验
1.将2018～2021年实验室收集的羊血清402份，其中189份布病阳性血清经虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、竞争ELISA试验(CELISA)、间接ELISA试验(IELISA)检测均为阳性；213份布病阴性血清经上述试验检测均为阴性。
2.取上述血清样品各约100μL，滴入加样孔中。待样品各自流过试纸条1和试纸条2的检测线和质控线后判定结果。判定标准为：当试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病阴性(－)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为布病阳性(+)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病可疑(±)；当试纸条1或试纸条2出现质控线无条带，判为无效。
3.试纸条的敏感性测试结果为：189份羊布病阳性血清均检测为阳性，表明试纸条敏感性高。试纸条的特异性测试结果为：213份羊布病阴性血清均检测为阴性，表明试纸条特异性好。
实施例6——羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条临床样品验证试验
1.将2018～2021年实验室收集的临床羊血清样品657份，分别采用补体结合试验(CFT)与本试纸条进行检测，计算本试纸条检测结果与补体结合试验的符合率。
2.结果见表3，本试纸条检测657份临床羊血清样品，检测结果与布病血清学确诊的金标准补体结合试验的符合率为98.02％，表明本试纸条适用于临床羊布病的现场快速初筛与确诊。
表3羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条临床样品验证试验结果
Figure BDA0003777533000000121

Claims (8)

1.一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于将初筛试纸条(试纸条1)和确诊试纸条(试纸条2)共置于同一个外壳框内，形成一个新的检测单元；其中试纸条1和试纸条2均分别由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；使用时，取待检血清滴入加样孔，根据试纸条1和试纸条2呈现出的结果，对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定。
2.如权利要求1所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条1金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS和胶体金标记的鼠源抗Flag标签单克隆抗体，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
3.如权利要求1所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，检测线包被兔抗羊IgG抗体，质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4。
4.如权利要求2、3所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述胶体金标记的布鲁氏菌LPS制备方法为：
(1)将灭活布鲁氏菌S2菌悬液(含菌量不少于1×1010CFU/mL)以10000g离心20分钟，收集沉淀，采用热酚水法提取布鲁氏菌脂多糖(LPS)，提取的上清液用蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，此即纯化的LPS；
(2)取胶体金溶液10mL至离心管中，加入20～60μL的0.1MK2CO3溶液，使pH值为7.5，取制备的LPS溶液140μL加入到上述胶体金溶液中，室温孵育20min，加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀，4℃条件下，10000r/min离心40min，弃上清，用2mL0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀，此即胶体金标记的LPS。
5.如权利要求2、3所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体M4制备方法为：
用猪种布鲁氏菌S2株灭活菌液(1×1010CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫，加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与布鲁氏菌LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157菌株、小肠结肠炎耶尔森菌O9菌株的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株M4，将其扩大培养并纯化，制得单克隆抗体M4；
以上猪种布鲁氏菌S2株(CVCC70502)、大肠杆菌O157(CVCC1489)均来自国家兽医微生物菌种保藏中心；小肠结肠炎耶尔森氏菌O9(CMCC52218)来自中国医学细菌保藏管理中心。
6.如权利要求1所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于采用布病阳性血清标准品(羊源，含量1000IU/mL)对试纸条1和试纸条2的检测灵敏度进行定量，检测灵敏度均为50IU/mL。
7.如权利要求6所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条1和试纸条2的检测灵敏度的定量方法为：
用生理盐水将羊源布病阳性血清标准品进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等4个不同稀释度备用，即血清抗体含量为100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL，滴加2滴各稀释度阳性血清(100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果，确定试纸条1和试纸条2检测灵敏度结果：羊源布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50IU/mL)，试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为阳性；羊源布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)，试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为阴性。
8.如权利要求1所述一种羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样本处理：取动物全血，分离血清，血清应清亮，无溶血；
(2)操作方法：滴加2滴血清(100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果；
(3)判定标准：当试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病阴性(－)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为布病阳性(+)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病可疑(±)；当试纸条1或试纸条2出现质控线无条带，判为无效。
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