CN108267577A - 一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条。它包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板,其特征在于,所述的硝酸纤维素膜上设有含有抗原的检测线和人IgA抗体的对照线,标记垫中含有抗人IgA抗体量子微球标记物;所述的抗原包括EV71病毒VP2蛋白抗原多肽,其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1。本发明比较适合幼儿园筛选手足口病毒,不需要专业的医务人员就可以筛查疑是感染幼儿,可以避免EV71病毒在幼儿园传播扩散。本发明也适合家庭诊断,家长可以提前了解子女的病情,并及早送至医院进行诊疗,缩短病程。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域,具体地公开了一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条。
背景技术
EV71病毒属于肠道病毒一员,一般感染6岁以下儿童,常见症状主要包括发绕、食欲不振、咽喉痛、口腔溃疡、手部脚部水泡等,严重的可导致无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹及神经源性肺水肿等严重的中枢神经系统并发症,并引起死亡。EV71病毒发病有一定的季节性,一般4-7月为病毒感染的高发期,其它月份有零星感染病例,是儿童群体中死亡人数最多的病毒。目前EV71病毒没有特殊的药物可以治疗,临床上基本是对症治疗,严重的病患一般采用丙球蛋白和激素保守治疗方案。EV71的预防主要方式还是通过早期诊断及早隔离病患防治病毒传播,因此有必要开发一种适合幼儿园早期诊断EV71病毒的检测方法。
EV71病毒早期诊断方法包括病毒分离培养、RT-PCR荧光检测方法、血清IgM抗体检测方法等。病毒分离培养方法是确证EV71病毒感染的金标准方法,但是由于实验条件和诊断时间等缺陷,目前该方法主要应用于实验室,无法在临床上使用该技术。RT-PCR荧光检测技术是EV71病毒检测临床上推广最好的检测方法,优点是灵敏度高。但是由于RT-PCR荧光检测技术需要严格认证的实验室条件、昂贵的荧光检测仪、专业培训的技术员,因此无法在社区诊所、幼儿园等基层单位推广。血清IgM抗体检测方法主要是检测患者血清中IgM抗体判断EV71病毒感染情况,主要的技术方式包括酶联免疫技术和胶体金快速层析技术,存在一定的假阳性和假阴性。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确性高,能高效快速检测EV71病毒的EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法。
本发明主要是利用量子点标记物信号放大的优势,提高免疫诊断的灵敏度。量子点具有灵敏度高、稳定性好、荧光寿命长等优势,是新一代荧光标记物最佳选择。量子点技术在2003年被Science杂志评为年度十大科学突破之一。本发明的检测对象是人唾液中IgA抗体,通过检测患者唾液中的EV71病毒IgA抗体判断EV71病毒感染的情况。
本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板,其特征在于,所述的硝酸纤维素膜上设有包被抗原的检测线和人IgA抗体的对照线,标记垫中含有抗人IgA抗体量子微球标记物;
所述的抗原包括EV71病毒VP2蛋白抗原多肽,其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1。
优选,所述的抗原的包被浓度为0.2-2mg/ml。
优选,所述的人IgA抗体包被浓度为0.5-3mg/ml。
优选,所述的抗原是EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。
进一步优选,所述的抗原是采用马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯作为交联剂,将EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白交联后的交联产物。
再进一步优选,所述的EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物是通过以下方法制备的:
称量3mg MBS溶解在二甲基酰胺中,配置成浓度为10mM的MBS溶液,将1-5mg BSA溶解在1ml 10mM PH7.2的PBS中,加入10mM MBS溶液5-200μl,搅拌均匀得到BSA/MBS溶液,采用sepharose G25层析柱纯化BSA/MBS溶液,使用50mM pH6.0的PBS平衡柱子和洗脱蛋白,收集BSA/MBS蛋白,将1-10mg EV71病毒VP2蛋白抗原多肽溶解在100μL二甲基酰胺中,然后加入1ml纯化的BSA/MBS蛋白,迅速混匀,马上加入10-50μl 2N NaOH溶液调整液体pH值在7.2,最后将反应完成的蛋白溶液室温透析3-6小时,透析缓冲液为10mM Ph7.2的PBS,中间换液2-5次,由此得到EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白分装,即为EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。-20℃保存备用
本发明还提供了一种EV71病毒IgA抗体检测试剂盒,其特征在于,包括上述EV71病毒IgA抗体检测试纸条和唾液采集棒,所述的唾液采集棒包括采集杆和杆头的唾液吸附材料,所述的唾液吸附材料为聚酯棉、脱脂棉,优选聚酯棉。
优选,所述的EV71病毒IgA抗体检测试剂盒还含有样本稀释液,其配方是:质量分数0.2%BSA+质量分数0.1%酪蛋白+体积分数0.25%Tween-20+体积分数0.1%procline-300+10mM PBS,溶剂为水,pH7.2。
所述的抗人IgA抗体量子微球标记物优选为抗人IgA抗体CdTe/ZnSe量子点微球标记物。
所述抗人IgA抗体可以为羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体。
本发明研制的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其选取标记物为量子点,灵敏度可以比常见的胶体金标记物高10-100倍,从而在检测灵敏度方面保证了诊断的准确性。本发明检测的对象是患者的唾液,因此在采样方面方便简单。对患者而言唾液采集法没有创伤,对操作人员来说简单易学不用专业培训。本发明比较适合幼儿园筛选手足口病毒,不需要专业的医务人员就可以筛查疑是感染幼儿,可以避免EV71病毒在幼儿园传播扩散。本发明也适合家庭诊断,家长可以提前了解子女的病情,并及早送至医院进行诊疗,缩短病程。
附图说明:
图1为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。
图2为唾液采集棒释放唾液标本示意图,其中6、唾液采集棒;7、样品管;8、样品稀释液。图3为EV71病毒IgA抗体检测试纸条的测试示意图。
图4为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的阳性示意图。
图5为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的阴性示意图。
图6为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的无效示意图。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:诊断试纸条包被物制备
EV71病毒VP2蛋白抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用双功能剂马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)将BSA蛋白与EV71病毒VP2蛋白抗原多肽偶联,偶联物可用于诊断试纸条包被所用。称量3mg MBS溶解在二甲基酰胺(DMF)中,配置成浓度为10mM的MBS溶液。将3mg BSA溶解在1ml 10mM PBS(PH7.2)中,加入10mM MBS溶液100ul,室温下磁力搅拌10-30min,得到BSA/MBS溶液。采用sepharose G25层析柱纯化BSA/MBS溶液,使用50mM PBS(pH6.0)平衡柱子和洗脱蛋白,收集BSA/MBS蛋白。将5mg EV71病毒VP2蛋白抗原多肽(如SEQ ID NO.1所示)溶解在100uL二甲基酰胺(DMF),然后加入1ml纯化的BSA/MBS蛋白,迅速混匀,马上加入30ul 2N NaOH溶液调整液体pH值在7.0-7.2。最后将反应完成的蛋白溶液室温透析3-6小时,透析缓冲液为10mM PBS(PH7.2),中间换液2-5次。纯化物EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白分装,-20℃保存备用。
实施例2:羊抗人IgA抗体量子点标记垫制备
吸取30ul水溶性量子点(表面羧基修饰),6000rpm离心8min,加入100ul 10mM PBS(pH 7.2)溶解。加入30ul体积的质量分数2%N-羟基硫代琥珀酸亚胺和质量分数2%1_(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐到量子点溶液中,再加入1000ul的5mg/ml羊抗人IgA抗体溶液,室温搅拌4小时。反应完全后,6000rpm离心8min,沉淀物加入质量分数1%BSA溶液封闭处理2小时。6000rpm离心8min,沉淀物加入10mM PBS(pH 7.2)溶解,得到羊抗人IgA抗体量子点微球标记物,4℃保存备用。将羊抗人IgA抗体量子点微球标记物喷涂到玻璃纤维膜上,稀释参数为30cm2/ml,并在相对湿度15%,温度30℃条件下干燥12小时以上,制备得到量子点标记垫,密封备用。
实施例3:硝酸纤维素膜包被
用包被液稀释人IgA抗体、EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白,其中人IgA抗体的浓度为1.5mg/ml,EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白浓度为1mg/ml。将两者均匀喷涂到NC膜上,其中人IgA抗体喷到NC膜上C(对照线)位置,EV71病毒VP2抗原多肽-BSA蛋白喷到NC膜上T(检测线)位置。将喷涂好的NC膜放置在相对湿度20%,温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上,烘干好的NC膜密封备用。
实施例4:组装、切条
请参阅附图1,附图1为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。将样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4依次粘附在PVC背板5上,然后调整切条机参数进行切条,切成3-5mm宽度的试纸条,得到EV71病毒IgA抗体检测试纸条。
EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结果说明:
如果唾液标本中含有EV71病毒IgA抗体,其会与标记垫中的羊抗人IgA抗体量子点微球标记物结合,上行到NC膜上检测线(T线),并与其中的EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白的特异结合,形成红色条带(附图4)。如果唾液标本中不含有EV71病毒IgA抗体,那么标记垫中的羊抗人IgA抗体量子点微球标记物会越过检测线(T线),继续上行到对照线,与其中的人IgA抗体(C线)结合,在对照线上形成红色条带(附图5)。如果对照线(C线)没有形成红色条带,说明试纸条失效,结果不可靠(附图6)。
实施例5:标本测试
本发明的唾液采集棒,包括采集杆和杆头的唾液吸附材料,所述的唾液吸附材料为聚酯棉。
本发明通过唾液采集棒在患者舌下、腮部,聚酯棉吸附唾液分泌物,将采集棒6放置到装有1-3ml标本稀释液8的样品管7中,充分挤压采集棒,然后弃去采集棒。将EV71病毒IgA抗体检测试纸条放置到样品管中,样品垫端接触标本,放置10-30分钟,选用紫外线手电筒照射,然后肉眼观察结果。请参阅附图2。
所述的样本稀释液,其配方是:质量分数0.2%BSA+质量分数0.1%酪蛋白+体积分数0.25%Tween-20+体积分数0.1%procline-300+10mM PBS,溶剂为水,pH7.2,按其组分和含量,将各组分混合均匀即可。
实施例6:本发明EV71病毒IgA抗体量子点诊断方法与荧光PCR方法结果对比
筛选临床手足口病患者100例,分别采集患者的唾液标本和咽拭子标本,分别用EV71病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与EV71病毒荧光PCR方法进行测试,结果如表1:
表1本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法比较结果
本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法比较,阳性率达到93.47%,特异性92.59%,可以符合临床检测的条件。
实施例7:本发明EV71病毒IgA抗体量子点检测方法特异性研究
临床上选择柯萨奇A16病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、柯萨奇B3病毒感染患者唾液标本各3份,分别用本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条进行测试,结果显示阴性,说明本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条与上述的病毒感染标本无交叉,特异性高。
本发明并不局限于上述实施方式,如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围,倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变形。
序列表
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 肠道病毒71型(Human enter ovirus 71)
<400> 1
Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser
1 5 10 15
Gly Phe Cys Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser
20 25
Claims (10)
1.一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条,包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板,其特征在于,所述的硝酸纤维素膜上设有包被抗原的检测线和人IgA抗体的对照线,标记垫中含有抗人IgA抗体量子微球标记物;
所述的抗原包括EV71病毒VP2蛋白抗原多肽,其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述的抗原的包被浓度为0.2-2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述的人IgA抗体包被浓度为0.5-3mg/ml。
4.根据权利要求1、2或3所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述的抗原是EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。
5.根据权利要求4所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述的抗原是采用马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯作为交联剂,将EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白交联后的交联产物。
6.根据权利要求5所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述的EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物是通过以下方法制备的:
称量3mg MBS溶解在二甲基酰胺中,配置成浓度为10mM的MBS溶液,将1-5mg BSA溶解在1ml 10mM pH7.2的PBS中,加入10mM MBS溶液5-200μl,搅拌均匀得到BSA/MBS溶液,采用sepharose G25层析柱纯化BSA/MBS溶液,使用50mM pH6.0的PBS平衡柱子和洗脱蛋白,收集BSA/MBS蛋白,将1-10mg EV71病毒VP2蛋白抗原多肽溶解在100μL二甲基酰胺中,然后加入1ml纯化的BSA/MBS蛋白,迅速混匀,马上加入10-50μl 2N NaOH溶液调整液体pH值在7.0-7.2,最后将反应完成的蛋白溶液室温透析3-6小时,透析缓冲液为10mM pH7.2的PBS,中间换液2-5次,由此得到EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白分装,即为EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。
7.根据权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述抗人IgA抗体为羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条,其特征在于,所述的抗人IgA抗体量子微球标记物为抗人IgA抗体CdTe/ZnSe量子点微球标记物。
9.一种EV71病毒IgA抗体检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条和唾液采集棒,所述的唾液采集棒包括采集杆和杆头的唾液吸附材料,所述的唾液吸附材料为聚酯棉或脱脂棉。
10.根据权利要求9所述的EV71病毒IgA抗体检测试剂盒,其特征在于,所述的EV71病毒IgA抗体检测试剂盒还含有样本稀释液,其配方是:质量分数0.2%BSA+质量分数0.1%酪蛋白+体积分数0.25%Tween-20+体积分数0.1%procline-300+10mM PBS,溶剂为水,pH7.2。
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