CN105527437B - 一种检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含两个抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV‑McAB1、PEDV‑McAB2、两个猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体、两个抗猪轮状病毒单克隆抗体的检测试剂盒，该试剂盒可用于非诊断目的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和/或猪轮状病毒的同时检测中的应用，并且同时检测两种或三种病毒的试剂盒的检测灵敏度高于单独检测一种病毒的灵敏度，避免了假阳性结果。

Description

一种检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、水样腹泻、脱水为特征，各年龄段猪均易感，其中哺乳仔猪、架子猪或育肥猪感染后的发病率可达100％，尤其以哺乳仔猪受害最为严重。近年，自2010年冬季，猪流行性腹泻在我国的大部分地区爆发流行，之后相继在韩国、日本、台湾等地区也大范围爆发此病。2013年上半年在北美地区也爆发此病，并迅速传播，给全球的养殖业造成了严重的损失。
猪传染性胃肠炎(porcine transmissble gastroenteritis,TGE)是由冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的传染性胃肠炎病毒(porcinetransmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染病，能感染不同年龄段和品种的猪，对新生仔猪具有高度致死率，可达50％-100％。1945年Doyle在美国首次报道了这一疾病后，世界上的许多国家相继报道了该病。1956年在我国广东首次发现该病，近年来疫区更为扩大，给养猪业带来严重危害并造成巨大的经济损失。
猪轮状病毒感染(porcine rotavirus infection)是由呼肠孤病毒科(reoviridae)的轮状病毒属(rotavirus)的轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)引起的一种急性消化道传染病，以呕吐、腹泻、厌食不安为特征，可感染各年龄段的猪，以2-5周龄的仔猪多发，仔猪出现脱水和死亡且死亡率达50％-100％。流行病学调查结果显示，猪群中PoRV的带毒率非常高，中猪和大猪多为亚临床感染和隐性感染。
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒感染是目前已经证实的、引起猪发生腹泻的重要的三种病毒传染性疾病，这三种疾病主要对仔猪的影响较大，是引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病。这三种疾病常常混合感染和继发感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常相似，很难区别到底是哪一种病毒感染，而且发病急速，在发病后近几个小时，就可波及全群，造成哺乳期仔猪的大批死亡，给养猪生产造成巨大的损失。特别是，随着集中化养猪的规模日益扩大，猪的腹泻疾病变得日趋严重。因此，亟需一种能同时实现猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒的检测方法。
目前，检测这几种疾病的方法包括病毒分离鉴定和血清检查，但操作过程繁琐、耗时过长；而PCR/RT-PCR检测虽然灵敏，但需要专门的仪器和专业的操作人员，这些方法均不适合基层或现场快速检测。
现有技术虽也有检测各自抗原的单一胶体金检测试纸条，但价格昂贵或检测灵敏度低。因而，亟需研制一种能简单、快速、准确、同时检测多种疾病的方法。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种检测试剂盒，该试剂盒可简单、快速、灵敏度高并同时检测出两种或三种病毒。
本发明涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或与有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；其中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，和/或轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.6，和/或轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8；所述单克隆抗体PEDV-McAB1固定在支持介质上，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶解于反应液中；所述抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3与TGEV-McAB4能同时与猪传染性胃肠炎病毒产生抗原抗体结合反应，所述单克隆抗体TGEV-McAB3固定在支持介质上，所述单克隆抗体TGEV-McAB4溶解于反应液中；所述抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5和PoRV-McAB6能同时与猪轮状病毒产生抗原抗体结合反应，所述单克隆抗体PoRV-McAB5固定在支持介质上，所述单克隆抗体PoRV-McAB6溶解于反应液中。
本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或与有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；其用于检测抗原抗体反应的检测试剂为胶体金。
本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；其用于检测抗原抗体反应的检测试剂为酶-底物。
本发明还涉及本发明所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和/或猪轮状病毒抗原检测中的应用。
本发明所提供的试剂盒可用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和/或猪轮状病毒检测中的应用，简单、快速并且灵敏度高。
附图说明
图1为SDS-PAGE凝胶电泳鉴定单克隆抗体PEDV-McAB1和单克隆抗体PEDV-McAB2的纯度，其中泳道1为蛋白Marker；泳道2为单克隆抗体PEDV-McAB1，包括上端的重链和下端的轻链，泳道3为单克隆抗体PEDV-McAB2，包括上端的重链和下端的轻链。
图2为酶免疫层析检测试纸条的侧向示意图，图中：(1)硝酸纤维素膜，(2)酶标垫，(3)底物垫，(4)吸水垫，(5)展开液垫，(6)检测线，(7)质控线，(8)底物缓冲液槽，(9)底物缓冲液，(10)支撑物，(11)检测样品。图2A为检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒或猪轮状病毒时的检测试纸条的侧向示意图；图2B为检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒时的检测试纸条的侧向示意图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的一个方面涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或与有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；其中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，和/或轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6，和/或轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8；所述单克隆抗体PEDV-McAB1固定在支持介质上，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶解于反应液中；所述抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3与TGEV-McAB4能同时与猪传染性胃肠炎病毒产生抗原抗体结合反应，所述单克隆抗体TGEV-McAB3固定在支持介质上，所述单克隆抗体TGEV-McAB4溶解于反应液中；所述抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5和PoRV-McAB6能同时与猪轮状病毒产生抗原抗体结合反应，所述单克隆抗体PoRV-McAB5固定在支持介质上，所述单克隆抗体PoRV-McAB6溶解于反应液中。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，而仍能够保持与猪流行性腹泻病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“有效量”当理解为“诊断有效量”时是指能够利用本发明所述单克隆抗体有效检测样品中是否存在猪流行性腹泻病毒的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够知晓，所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同，根据公知文献的教导，本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量，以用于诊断样品中是否存在猪流行性腹泻病毒。本领域技术人员知晓，适当地该试剂盒中还应当包括适当的载体，缓冲液/剂，和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。
术语“抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体”包括单克隆抗体C7C8B2、B5G8G7、E6D9A12(参见张赟硕.抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定.东北农业大学硕士学位论文,2007)，1A9、1G7、1H8(参见范秀萍.TGEV/PRCV鉴别诊断方法的建立及TGEVN蛋白单克隆抗体的制备.东北农业大学硕士论文,2009)，1B3、3C2、4A5(参见乔薪瑗.抗猪传染性胃肠炎M蛋白单克隆抗体制备及部分特性鉴定.东北农业大学硕士学位论文,2006)，1G6、2F8、3E5(参见邝爱丽.抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备及初步应用.河南农业大学硕士学位论文,2009)，2D6(参见杨百亮，冯力，赵翠萍等.抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立.中国兽医科技,2005,35(12):979-982)，E10F10D5(参见姜骞，李一经.抗猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及其部分特性鉴定.中国预防兽医学报,2005,27(2):102-104)，4E2(参见苏雪.猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定.内蒙古农业大学硕士学位论文,2014)，8D2、4H4、5D6、4C3、9G1、5C6、2D7、4D6、6B10(参见张煜迎，于洁，唐丽杰等.猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定.畜牧与兽医,2014,46(11):19-23)，7G7(参见孙雪娇.猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白单克隆抗体的制备与抗原表位的鉴定.东北农业大学硕士学位论文,2013)，JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3(参见李娜.猪传染性胃肠炎病毒SC-H株重组N蛋白单克隆抗体的制备.四川农业大学硕士学位论文,2008)，2D6(公开于中国专利CN101032621A)。
术语“抗猪轮状病毒单克隆抗体”包括单克隆抗体1D5、1B5、1G9、1C7、1F10、1D11、1F3(参见崔晓辰.A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备.东北农业大学硕士学位论文,2008)，A6、G8、H4、4B4、4E6、4C5、5G2(参见迟延斌.A群轮状病毒VP7蛋白单抗及其抗原表位鉴定.东北农业大学硕士学位论文,2014)，1E5、1F4、2E2、2H11、4H2、4C8、4G8、5F6、4D11、2G9、6F5(参见韩斅.猪A群轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定.中国农业科学院硕士学位论文,2014)，2B3、1C11(参见孟柳.抗猪轮状病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立.东北农业大学硕士学位论文,2014)，C5D10(参见边亚娟，林长水.猪轮状病毒VP6重组蛋白多克隆抗体与单克隆抗体间接免疫荧光试验的比较.检验检疫,2008,40(8):66-68)，3B6(参见秦昭恒.猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体制备与其抗原表位的初步鉴定.东北农业大学硕士学位论文,2014)。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2可以为嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和PoRV-McAB5含量为25-1000μg/ml，所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和PoRV-McAB6含量为50-2000μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4分别选自下列猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4为C7C8B2、B5G8G7、E6D9A12、1A9、1G7、1H8、1B3、3C2、4A5、1G6、2F8、3E5、2D6、E10F10D5、4E2、8D2、4H4、5D6、4C3、9G1、5C6、2D7、4D6、6B10、7G7、JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3、2D6，且所述单克隆抗体TGEV-McAB3与TGEV-McAB4不同。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6分别选自下列猪轮状病毒单克隆抗体1D5、1B5、1G9、1C7、1F10、1D11、1F3、A6、G8、H4、4B4、4E6、4C5、5G2、1E5、1F4、2E2、2H11、4H2、4C8、4G8、5F6、4D11、2G9、6F5、2B3、1C11、C5D10、3B6，且所述单克隆抗体PoRV-McAB5与PoRV-McAB6不同。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述单克隆抗体TGEV-McAB3为抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体4E2，所述单克隆抗体TGEV-McAB4为抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体JY(4)-3；所述单克隆抗体PoRV-McAB5为抗猪轮状病毒单克隆抗体G8，所述单克隆抗体PoRV-McAB6为抗猪轮状病毒单克隆抗体A6。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述支持介质为滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜中的任一种，所述用于检测抗原抗体反应的检测试剂可通过酶显色、胶体金、荧光、化学发光中的任一种方法进行测定。
本发明的一个方面涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或与有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体、抗原与所述单克隆抗体TGEV-McAB4的结合体和/或抗原与所述单克隆抗体PoRV-McAB6的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2、胶体金标记的所述单克隆抗体TGEV-McAB4和/或胶体金标记的所述单克隆抗体PoRV-McAB6，所述硝酸纤维素膜上包括两或三条检测线和一条质控线，所述检测线上分别固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明的一个方面涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2、酶标记所述单克隆抗体TGEV-McAB4和/或酶标记所述单克隆抗体PoRV-McAB6，所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和/或PoRV-McAB6上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和/或PoRV-McAB6溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区上不同检测线上分别固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5；其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)分别固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5，在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和/或PoRV-McAB6分别相对于固定在检测线(6)的固定所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中的所述酶免疫层析检测试纸条包括作为支持介质的硝酸纤维素膜1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10，其中2属于样品供应区，3属于底物供应区，5、8属于缓冲液供应单元，6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。所述检测试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段；吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端，且与硝酸纤维素膜1有重叠；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段，上面干燥有酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2、酶标记的所述单克隆抗体TGEV-McAB4和/或酶标记的所述单克隆抗体PoRV-McAB6；底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3，且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，其上有缓冲液按钮，按下缓冲液按钮可刺破铝箔纸，并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸纤维素膜1的中上端，其上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5。质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端、检测线6的上游，其上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
术语“检测样品”包括但不限于动物或患者的排泄物、口鼻腔分泌物、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。
本发明还涉及所述试剂盒检测样品中病毒的方法，所述方法包括：(1)将检测样品与所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，所述单克隆抗体TGEV-McAB3和TGEV-McAB4，和/或所述单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6进行接触，(2)检测所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，所述单克隆抗体TGEV-McAB3和TGEV-McAB4，和/或所述单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6与样品中病毒的反应；其中，所述方法步骤(1)中的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、所述单克隆抗体TGEV-McAB3和/或所述单克隆抗体PoRV-McAB5附着在支持介质上，所述支持介质优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜中的任一种；其中，所述方法步骤(2)中所述反应可通过酶显色、胶体金、荧光、化学发光中的任一种方法进行测定。
作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：将采集的微生物拭子插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将处理后的样品滴加至检测试纸条加样孔中心，10分钟或30分钟后判定结果：(1)若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，(2)在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带则为阳性，否则为阴性，即：质控线的有无决定了检测过程是否有效，若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带则为阳性，否则为阴性。
本发明的一个方面涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒、猪胃肠炎病毒和/或猪轮状病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2和有效量的所述单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒、猪胃肠炎病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2和有效量的所述单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，有效量的所述单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4和有效量的所述单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒、猪胃肠炎病毒、猪轮状病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，所述非诊断目的的检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和/或猪轮状病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的猪流行性腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和/或猪轮状病毒抗原的检测。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2的制备、纯化、鉴定及检验
1.1抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备和纯化
将猪流性腹泻病毒HN1301株按照张丽燕等(张丽燕.猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制.四川农业大学.硕士论文)中的方法纯化病毒，免疫小鼠，克隆获得杂交瘤细胞2株，分别制备2株单克隆抗体。
将制备的2株单克隆抗体按照陈丹等(陈丹,孙广瑞,柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学,2007,35(26):8105,8108)的辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体的操作方法分别纯化抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2。
1.2抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的鉴定
1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定。鉴定结果见表1：
表1各单克隆抗体类型的鉴定
注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。
由表1可知，单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2重链亚型都为IgG2a，轻链类型都为kappa。
1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定
将PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞分别包被反应板，测定单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2与PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞是否具有交叉反应性。
测定结果显示：单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2与TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞均无交叉反应，仅与PEDV反应呈阳性，表明单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2均是抗猪流行性腹泻病毒的特异性单克隆抗体。
1.3纯化后单克隆抗体的检验
1.3.1外观检验
室温下，肉眼观察可见纯化的单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2均呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。
1.3.2无菌检验
采用无菌检验法，分别取纯化后的单克隆抗体原料接种10ml/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5ml/管)。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。改良马丁培养基置于20-25℃培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未观察到培养基中有微生物生长，观察结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2原料均符合无菌要求。
1.3.3单克隆抗体的纯度
采用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，上样量为10μg，检测结果如图1所示。结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2的纯度均不低于95％。
1.3.4单克隆抗体相对亲和力的测定
将制备的单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2按照宋帅等(宋帅，林彤，邵军军，常惠芸.抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定.兽医免疫学，2009,25(4):333-335)中的操作方法测定其相对亲和力。其中抗原的包被浓度为5μg/ml，酶标二抗的稀释度为1:10000，测定纯化后的单克隆抗体的相对亲和力。计算结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1的相对亲和力为0.78μg/ml，单克隆抗体PEDV-McAB2的相对亲和力为0.44μg/ml。
1.3.5单克隆抗体中和活性的测定
2株单克隆抗体与500TCID50的不同来源的PEDV毒株中和后接种Vero细胞，通过中和试验测定该单克隆抗体具有中和疫苗株PEDV CV777株、疫苗株SM98株及流行毒株的代表毒株HN1301株的能力。测得单克隆抗体PEDV-McAB1中和抗体效价均不小于1:512，表明单克隆抗体PEDV-McAB1具有良好的中和活性，而单克隆抗体PEDV-McAB2的中和抗体效价均小于1:2，表明单克隆抗体PEDV-McAB2无中和活性。
表2用不同毒株与本发明PEDV-McAB1、PEDV-McAB2单克隆抗体中和后测得的中和抗体效价
1.4单克隆抗体含量的测定
用BCA蛋白定量试剂盒分别对单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2按照说明书进行定量分析，测定结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2的浓度分别为4、4.5mg/ml。
1.5单克隆抗体的配对
选择HN1301株猪流行性腹泻病毒，稀释到105.0TCID50/ml，对不同搭配模式进行检测，结果见表3：
表3单克隆抗体搭配
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
结果表明：标记单克隆抗体PEDV-McAB1和固定单克隆抗体PEDV-McAB2检测猪流行性腹泻病毒液为阴性，其余搭配检测结果均为阳性。因而选择固定单克隆抗体PEDV-McAB1、标记单克隆抗体PEDV-McAB2为搭配方式。
1.6单克隆抗体可变区序列的测定
1.6.1单克隆抗体重链和轻链可变区引物设计
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-ACTAGTTGACGTGGTCTCTAGGGTCACTTTAGTTTTCCT-3’
P2：5’-CGGAAGCTTCCAGCGRCCARKCCATATACIGRTGG-3’
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-GCCATCTCATGRAGWCATTKWCYCAAGTCTTT-3’
P4：5’-CGGACGCTTACTGCCTGGTAAGAAGATGGA-3’
1.6.2单克隆抗体可变区序列测定
按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001,15(2)：65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。
测定单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4；单克隆抗体PEDV-McAB2的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.8。
实施例2试剂盒的制备及应用
2.1试剂盒之胶体金检测试纸条
2.1.1试剂盒之胶体金检测试纸条的制备及应用
试剂盒包括胶体金检测试纸条、样品处理液(即含2％CHAPS的pH7.4的磷酸盐缓冲液)、样品处理管、样品保存液，样品保存液(即pH7.4的磷酸盐缓冲液)在样品保存瓶中，其中胶体金检测试纸条的制备如下：
按照中国CN101614737A建立的胶体金制备方法制备胶体金溶液，并分别标记单克隆抗体PEDV-McAB2(实施例1制备的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至标记浓度为250μg/ml)、单克隆抗体TGEV-McAB4(抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体JY(4)-3，标记浓度为200μg/ml)、单克隆抗体PoRV-McAB6(抗猪轮状病毒单克隆抗体A6，标记浓度为500μg/ml)，单克隆抗体PEDV-McAB1(实施例1制备的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1，固定包被浓度为200μg/ml)、单克隆抗体TGEV-McAB3(抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体4E2，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为150μg/ml)和/单克隆抗体PoRV-McAB5(抗猪轮状病毒单克隆抗体G8，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为400μg/ml)，以及羊抗鼠二抗(即羊抗鼠IgG,购自Sigma公司)喷涂固定在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜和浸润有胶体金标记的单克隆抗体PEDV-McAB2、胶体金标记的单克隆抗体TGEV-McAB4和/或胶体金标记的单克隆抗体PoRV-McAB6的金标垫用塑料外壳包装起来，做成胶体金检测试纸条。检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-3滴混匀后的样品(约80μl)至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
其中，当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3时作为胶体金检测试纸条1；当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5时作为胶体金检测试纸条2；当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5时作为胶体金检测试纸条3。
2.1.2胶体金检测试纸条的特性研究
灵敏度：将PEDV HN1301株用pH7.4磷酸盐缓冲液进行逐级稀释得106.0、105.0、104.0、103.0TCID50/ml溶液，将TGEV华毒株(将购自哈兽研的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联疫苗分离得猪传染性胃肠炎病毒，含量为105.0TCID50/ml)用pH7.4磷酸盐缓冲液进行逐级稀释得104.0、103.0、102.0、10TCID50/ml溶液，将PoRV NX株(将购自哈兽研的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联疫苗分离得猪轮状病毒，含量为105.5TCID50/ml)用pH7.4磷酸盐缓冲液进行10倍倍比稀释得104.5、103.5、102.5、101.5TCID50/ml溶液，然后分别用胶体金检测试纸条进行检测，分别确定胶体金检测试纸条1、2、3对三种病毒的检测下限。
结果表明，胶体金检测试纸条1、2、3对PEDV的检测下限均为104.0TCID50/ml；胶体金检测试纸条1、3对TGEV的检测下限均为102.0TCID50/ml；胶体金检测试纸条2、3对PoRV的检测下限均为102.5TCID50/ml。
特异性：用胶体金检测试纸条1、2、3分别检测猪源其它病毒，包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪大肠杆菌、沙门氏菌，结果均为阴性，说明试纸条特异性良好。
重复性：取同批胶体金检测试纸条1、2、3，每批各抽15条，分别检测PEDV、TGEV、PoRV三种病毒液各5次，结果：各样品检测均为阳性，且同批试纸条间显色强度一致，批内重复性良好。分别取3批胶体金检测试纸条1、2、3，每批试纸条各抽5条，分别检测PEDV、TGEV、PoRV三种病毒液，结果，不同批试纸条间检测结果均为阳性，且显色强度一致，批间重复性良好。
2.1.3样品检测及比对试验
将PEDV HN1301株、TGEV华毒株、PoRV NX株用pH7.4磷酸盐缓冲液配制成10份已知病毒的溶液(即样品1-10)，分别经实施例2.1.1制备的胶体金检测试纸条1、2、3进行检测，检测结果见表4-6。
将采集的10份临床样品(即样品11-20)即微生物拭子(约含样品100mg)插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液(即pH7.4的磷酸盐缓冲液)中，最后使微生物拭子头这段留于管中；然后将含有临床样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-3滴混匀后的样品(约80μl)至胶体金检测试纸条加样孔中心；10分钟后在胶体金检测试纸条的检测区观察记录结果(见表4-6)。结果判定标准：若质控线显色即为阳性，检测线显色即可判为阳性，检测线不显色即可判为阴性；若对照线未显色即为阴性，无论检测线是否显色，则均判定为无效结果，需重测。
同时，20份样品分别用邹勇等建立的RT-PCR(邹勇,钱永清,唐永兰等.猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒RT-PCR鉴别诊断技术研究.上海农业学报，2003，02:82-84)分别对PEDV、TGEV、PoRV进行定量检测，同时分别用Bionote猪流行性腹泻病毒抗原快速检测试剂盒(购自韩国安捷公司，参照试剂盒参考说明书进行操作)、猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条(作为TGEV对比试纸条，制备方法参见畅丹.猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制.东北农业大学硕士学位论文,2008)、猪轮状病毒免疫胶体金试纸条(作为PoRV对比试纸条，制备方法参见崔晓辰.A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备.东北农业大学硕士学位论文,2008)进行对比检测，结果见表4-6。
表4胶体金检测试纸条1、酶免疫层析检测试纸条1检测及对比结果
表5胶体金检测试纸条2、酶免疫层析检测试纸条2检测及对比结果
表6胶体金检测试纸条3、酶免疫层析检测试纸条3检测及对比结果
注：样品1-10为病毒液，样品11-20为临床样品；“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性，“/”表示临床粪便样品的未知浓度；金标1、2、3依次表示胶体金检测试纸条1、2、3，酶免1、2、3依次表示酶免疫层析检测试纸条1、2、3。
由表4可知：胶体金检测试纸条1可同时检测PEDV、TGEV两种病毒，并且胶体金检测试纸条1检测PEDV的结果与RT-PCR检测结果接近，优于安捷Bionote试纸条的检测结果；检测TGEV的结果与RT-PCR检测结果接近，优于现有技术中TGEV对比试纸条的检测结果。
由表5可知：胶体金检测试纸条2可同时检测PEDV、PoRV两种病毒，并且胶体金检测试纸条2检测PEDV的结果与胶体金检测试纸条1的结果相当，与RT-PCR检测结果接近，优于安捷Bionote试纸条的检测结果；检测PoRV的结果与RT-PCR检测结果接近，优于现有技术中PoRV对比试纸条的检测结果。
由表6可知：胶体金检测试纸条3可同时检测PEDV、TGEV、PoRV三种病毒，并且胶体金检测试纸条3检测PEDV的结果与胶体金检测试纸条1、2的结果相当，与RT-PCR检测结果接近，优于安捷Bionote试纸条的检测结果；检测TGEV的结果与胶体金检测试纸条1的结果相当，与RT-PCR检测结果接近，优于现有技术中TGEV对比试纸条的检测结果；检测PoRV的结果与胶体金检测试纸条2的结果相当，与RT-PCR检测结果接近，优于现有技术中PoRV对比试纸条的检测结果。
2.2试剂盒之酶免疫层析检测试纸条的制备及应用
2.2.1试剂盒之酶免疫层析检测试纸条的制备
试剂盒包括酶免疫层析检测试纸条、样品处理液(即含2％CHAPS的pH7.4的磷酸盐缓冲液)、样品处理管、样品保存液，样品保存液(即pH7.4的磷酸盐缓冲液)在样品保存瓶中，其中胶体金检测试纸条的制备如下：
按照中国CN104062430A制备酶免疫层析检测试纸条，先将单克隆抗体PEDV-McAB2(实施例1制备的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至标记浓度为250μg/ml)、单克隆抗体TGEV-McAB4(抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体JY(4)-3，标记浓度为200μg/ml)、单克隆抗体PoRV-McAB6(抗猪轮状病毒单克隆抗体A6，标记浓度为500μg/ml)分别用辣根过氧化物酶HRP进行标记，将单克隆抗体PEDV-McAB1(实施例1制备的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1，固定包被浓度为200μg/ml)、单克隆抗体TGEV-McAB3(抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体4E2，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为150μg/ml)和/或单克隆抗体PoRV-McAB5(抗猪轮状病毒单克隆抗体G8，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为400μg/ml)，以及羊抗鼠二抗(即羊抗鼠IgG,购自Sigma公司)喷涂固定在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜和浸润有酶标记的单克隆抗体PEDV-McAB2、酶标记的单克隆抗体TGEV-McAB4和/或酶标记的单克隆抗体PoRV-McAB6的酶标垫用塑料外壳包装起来，做成酶免疫层析检测试纸条。检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-3滴混匀后的样品(约80μl)至试纸条加样孔中心；30分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
其中，当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3时作为酶免疫层析检测试纸条1，如示意图2A所示；当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5时作为酶免疫层析检测试纸条2，如图2A所示；当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5时作为酶免疫层析检测试纸条3，如示意图2B所示。
2.2.2酶免疫层析检测试纸条的特性研究
灵敏度：将实施例2.1制备的含PEDV HN1301株的不同浓度病毒溶液、含TGEV华毒株的不同浓度病毒溶液、含PoRV NX株的不同浓度病毒溶液分别用酶免疫层析检测试纸条进行检测，分别确定酶免疫层析检测试纸条1、2、3对三种病毒的检测下限。
结果表明，酶免疫层析检测试纸条1、2、3对PEDV的检测下限均为103.0TCID50/ml；酶免疫层析检测试纸条1、3对TGEV的检测下限均为101.5TCID50/ml；酶免疫层析检测试纸条2、3对PoRV的检测下限均为102.0TCID50/ml。
特异性：用酶免疫层析检测试纸条1、2、3分别检测猪源其它病毒，包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪大肠杆菌、沙门氏菌，结果均为阴性，说明试纸条特异性良好。
重复性：取同批酶免疫层析检测试纸条1、2、3，每批各抽15条，分别检测PEDV、TGEV、PoRV三种病毒液各5次，结果：各样品检测均为阳性，且同批试纸条间显色强度一致，批内重复性良好。分别取3批酶免疫层析检测试纸条1、2、3，每批试纸条各抽5条，分别检测PEDV、TGEV、PoRV三种病毒液，结果，不同批试纸条间检测结果均为阳性，且显色强度一致，批间重复性良好。
2.2.3样品检测及比对试验
将2～3滴(约80μl)实施例2.1制备的20份样品分别滴加于酶免疫层析检测试纸条的加样孔处，同时迅速按下缓冲液按钮，静置30分钟后在酶免试纸条的检测区观察记录结果。结果判定标准：若质控线显色即为阳性，检测线显色即可判为阳性，检测线不显色即可判为阴性；若质控线未显色即为阴性，无论检测线是否显色，均判定为无效结果，需重测。
由表4可知：酶免疫层析检测试纸条1可同时检测PEDV、TGEV两种病毒，并且酶免疫层析检测试纸条1检测PEDV的结果略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条1、2、3以及安捷Bionote试纸条的检测结果；检测TGEV的结果略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条1、3以及现有技术中TGEV对比试纸条的检测结果。
由表5可知：酶免疫层析检测试纸条2可同时检测PEDV、PoRV两种病毒，并且酶免疫层析检测试纸条2检测PEDV的结果与酶免疫层析检测试纸条1的结果相当，略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条1、2及安捷Bionote试纸条的检测结果；检测PoRV的结果略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条2、3以及现有技术中PoRV对比试纸条的检测结果。
由表6可知：酶免疫层析检测试纸条3可同时检测PEDV、TGEV、PoRV三种病毒，并且酶免疫层析检测试纸条3检测PEDV的结果与酶免疫层析检测试纸条1、2的结果相当，略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条1、2、3以及安捷Bionote试纸条的检测结果；检测TGEV的结果与酶免疫层析检测试纸条1的结果相当，略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条1、3以及现有技术中胶体金免疫层析试纸条的检测结果；检测PoRV的结果与酶免疫层析检测试纸条2的结果相当，略差于RT-PCR检测结果，优于胶体金检测试纸条2、3现有技术中PoRV对比试纸条的检测结果。
综上所述，本发明制备的胶体金检测试纸条、酶免疫层析检测试纸条可同时检测两种或三种病毒；并且所制备的试纸条同时检测两种或三种病毒时所检测各病毒的灵敏度高于单独检测时的灵敏度，推测是由于多种单克隆抗体混合使用具有协同效应。
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或与有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；
其中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8；所述单克隆抗体PEDV-McAB1固定在支持介质上，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶解于反应液中；
所述抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3与TGEV-McAB4能同时与猪传染性胃肠炎病毒产生抗原抗体结合反应，所述单克隆抗体TGEV-McAB3固定在支持介质上，所述单克隆抗体TGEV-McAB4溶解于反应液中；
所述抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5和PoRV-McAB6能同时与猪轮状病毒产生抗原抗体结合反应，所述单克隆抗体PoRV-McAB5固定在支持介质上，所述单克隆抗体PoRV-McAB6溶解于反应液中。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2可以为嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和PoRV-McAB5含量为25-1000μg/ml，所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和PoRV-McAB6含量为50-2000μg/ml。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4分别选自下列猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4为C7C8B2、B5G8G7、E6D9A12、1A9、1G7、1H8、1B3、3C2、4A5、1G6、2F8、3E5、2D6、E10F10D5、4E2、8D2、4H4、5D6、4C3、9G1、5C6、2D7、4D6、6B10、7G7、JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3、2D6，且所述单克隆抗体TGEV-McAB3与TGEV-McAB4不同；
所述猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6分别选自下列猪轮状病毒单克隆抗体1D5、1B5、1G9、1C7、1F10、1D11、1F3、A6、G8、H4、4B4、4E6、4C5、5G2、1E5、1F4、2E2、2H11、4H2、4C8、4G8、5F6、4D11、2G9、6F5、2B3、1C11、C5D10、3B6，且所述单克隆抗体PoRV-McAB5与PoRV-McAB6不同。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述单克隆抗体TGEV-McAB3为抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体4E2，所述单克隆抗体TGEV-McAB4为抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体JY(4)-3；所述单克隆抗体PoRV-McAB5为抗猪轮状病毒单克隆抗体G8，所述单克隆抗体PoRV-McAB6为抗猪轮状病毒单克隆抗体A6。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述支持介质为滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜中的任一种，所述用于检测抗原抗体反应的检测试剂可通过酶显色、胶体金、荧光、化学发光中的任一种方法进行测定。
7.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或与有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQID No.8；
其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体、抗原与所述单克隆抗体TGEV-McAB4的结合体和/或抗原与所述单克隆抗体PoRV-McAB6的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2、胶体金标记的所述单克隆抗体TGEV-McAB4和/或胶体金标记的单克隆抗体PoRV-McAB6，所述硝酸纤维素膜上包括两条或三条检测线和一条质控线，所述检测线上分别固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
8.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体PEDV-McAB1、PEDV-McAB2，以及用于检测猪流行性腹泻病毒抗原抗体反应的检测试剂；有效量的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-McAB3、TGEV-McAB4，以及用于检测猪传染性胃肠炎病毒抗原抗体反应的检测试剂；和/或有效量的抗猪轮状病毒单克隆抗体PoRV-McAB5、PoRV-McAB6，以及用于检测猪轮状病毒抗原抗体反应的检测试剂；所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.8；
其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2、酶标记所述单克隆抗体TGEV-McAB4和/或酶标记所述单克隆抗体PoRV-McAB6，所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和/或PoRV-McAB6上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和/或PoRV-McAB6溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区上不同检测线上分别固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5；
其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)分别固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5，在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2、TGEV-McAB4和/或PoRV-McAB6分别相对于固定在检测线(6)的固定所述单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB3和/或PoRV-McAB5而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在支撑物(10)上，所述支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
9.权利要求1～8中任一项所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和/或猪轮状病毒抗原检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述非诊断目的的检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和/或猪轮状病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的猪流行性腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原和/或猪轮状病毒抗原的检测。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110128533B (zh) * 2016-06-28 2022-02-15 河南农业大学 抗猪流行性腹泻病毒猪源化单链抗体及其制备方法
CN106868214A (zh) * 2017-03-22 2017-06-20 中国农业科学院上海兽医研究所 荧光定量rt‑pcr检测鼠轮状病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
CN109232736B (zh) * 2017-07-10 2021-11-09 洛阳普泰生物技术有限公司 特异性结合猪传染性胃肠炎病毒的单克隆抗体、药物组合物、试剂盒及其应用
CN110320364B (zh) * 2018-03-30 2023-03-31 洛阳普泰生物技术有限公司 一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用
CN109061159A (zh) * 2018-05-24 2018-12-21 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 Pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN110967480A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 洛阳普泰生物技术有限公司 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
CN111665362B (zh) * 2019-03-07 2023-10-17 北京中科基因技术有限公司 一种制备含量子点标记的抗猪病毒抗体免疫层析试纸条的方法、制备的试纸条及应用
CN110187097B (zh) * 2019-05-28 2021-09-14 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用
CN110470829A (zh) * 2019-09-07 2019-11-19 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种氨基酸序列发生变异的轮状病毒vp6基因及免疫层析试纸条
CN110607402B (zh) * 2019-10-11 2023-01-03 扬州大学 猪传染性胃肠炎病毒pla检测试剂盒
CN111596064B (zh) * 2020-04-28 2023-03-31 江苏省农业科学院 同时检测pedv和tgev的速测卡及其制备、使用方法
CN112903637B (zh) * 2021-01-18 2022-06-03 江西英大生物技术有限公司 尿胰蛋白酶原-2的检测试剂盒、适配的检测装置及检测方法
CN116643050A (zh) * 2023-04-17 2023-08-25 新希望六和股份有限公司 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100331177B1 (ko) * 1999-06-29 2002-04-06 대한민국(관리청:특허청장, 승계청:국립수의과학검역원장) 돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단 방법 및 진단키트
CZ2001709A3 (cs) * 2001-02-26 2002-06-12 Výzkumný Ústav Veterinárního Lékařství Myąí lymfocytární hybridom PED 3C8/2H6
KR20080040942A (ko) * 2006-11-06 2008-05-09 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트 및 진단 방법
CN101339192B (zh) * 2008-08-28 2012-07-04 河南省农业科学院 一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条
CN103033626B (zh) * 2012-12-27 2017-02-01 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 猪tgev抗体与猪pedv抗体胶体金试纸条
CN103454419B (zh) * 2013-07-22 2015-03-25 东北农业大学 一种用于检测猪流行性腹泻病毒的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN104862285B (zh) * 2015-05-12 2018-03-06 华中农业大学 猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用

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Applicant after: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co., Ltd

Applicant after: Luoyang Zhongke gene detection and Diagnosis Center Co., Ltd.

Address before: 471000 Henan city of Luoyang province high tech Zone Cuiwei Road

Applicant before: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co., Ltd

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Address after: Room 1010, Commune No. 6, Huaxia Road, No. 6, High-tech Zone, Luoyang China (Henan) Free Trade Experimental Zone, Henan Province

Co-patentee after: Luoyang Zhongke gene detection and Diagnosis Center Co., Ltd.

Patentee after: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 471003 Huaxia Road, hi tech Zone, Luoyang, Henan

Co-patentee before: Luoyang Zhongke gene detection and Diagnosis Center Co., Ltd.

Patentee before: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co., Ltd

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Address after: Room 1010, Commune No. 6, Huaxia Road, No. 6, High-tech Zone, Luoyang China (Henan) Free Trade Experimental Zone, Henan Province

Patentee after: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee after: Luoyang Zhongke gene detection and Diagnosis Center Co.,Ltd.

Patentee after: Luoyang Zhongke Biochip Technology Co.,Ltd.

Address before: Room 1010, Commune No. 6, Huaxia Road, No. 6, High-tech Zone, Luoyang China (Henan) Free Trade Experimental Zone, Henan Province

Patentee before: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co.,Ltd.

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