CN108267577B - 一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条。它包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上设有含有抗原的检测线和人IgA抗体的对照线，标记垫中含有抗人IgA抗体量子微球标记物；所述的抗原包括EV71病毒VP2蛋白抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1。本发明比较适合幼儿园筛选手足口病毒，不需要专业的医务人员就可以筛查疑是感染幼儿，可以避免EV71病毒在幼儿园传播扩散。本发明也适合家庭诊断，家长可以提前了解子女的病情，并及早送至医院进行诊疗，缩短病程。

Description

一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体地公开了一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条。

背景技术

EV71病毒属于肠道病毒一员，一般感染6岁以下儿童，常见症状主要包括发绕、食欲不振、咽喉痛、口腔溃疡、手部脚部水泡等，严重的可导致无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹及神经源性肺水肿等严重的中枢神经系统并发症，并引起死亡。EV71病毒发病有一定的季节性，一般4-7月为病毒感染的高发期，其它月份有零星感染病例，是儿童群体中死亡人数最多的病毒。目前EV71病毒没有特殊的药物可以治疗，临床上基本是对症治疗，严重的病患一般采用丙球蛋白和激素保守治疗方案。EV71的预防主要方式还是通过早期诊断及早隔离病患防治病毒传播，因此有必要开发一种适合幼儿园早期诊断EV71病毒的检测方法。

EV71病毒早期诊断方法包括病毒分离培养、RT-PCR荧光检测方法、血清IgM抗体检测方法等。病毒分离培养方法是确证EV71病毒感染的金标准方法，但是由于实验条件和诊断时间等缺陷，目前该方法主要应用于实验室，无法在临床上使用该技术。RT-PCR荧光检测技术是EV71病毒检测临床上推广最好的检测方法，优点是灵敏度高。但是由于RT-PCR荧光检测技术需要严格认证的实验室条件、昂贵的荧光检测仪、专业培训的技术员，因此无法在社区诊所、幼儿园等基层单位推广。血清IgM抗体检测方法主要是检测患者血清中IgM抗体判断EV71病毒感染情况，主要的技术方式包括酶联免疫技术和胶体金快速层析技术，存在一定的假阳性和假阴性。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确性高，能高效快速检测EV71病毒的EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法。

本发明主要是利用量子点标记物信号放大的优势，提高免疫诊断的灵敏度。量子点具有灵敏度高、稳定性好、荧光寿命长等优势，是新一代荧光标记物最佳选择。量子点技术在2003年被Science杂志评为年度十大科学突破之一。本发明的检测对象是人唾液中IgA抗体，通过检测患者唾液中的EV71病毒IgA抗体判断EV71病毒感染的情况。

本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条，包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上设有包被抗原的检测线和人IgA抗体的对照线，标记垫中含有抗人IgA抗体量子微球标记物；

所述的抗原包括EV71病毒VP2蛋白抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1。

优选，所述的抗原的包被浓度为0.2-2mg/ml。

优选，所述的人IgA抗体包被浓度为0.5-3mg/ml。

优选，所述的抗原是EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。

进一步优选，所述的抗原是采用马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯作为交联剂，将EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白交联后的交联产物。

再进一步优选，所述的EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物是通过以下方法制备的：

称量3mg MBS溶解在二甲基酰胺中，配置成浓度为10mM的MBS溶液，将1-5mg BSA溶解在1ml 10mM PH7.2的PBS中，加入10mM MBS溶液5-200μl，搅拌均匀得到BSA/MBS溶液，采用sepharose G25层析柱纯化BSA/MBS溶液，使用50mM pH6.0的PBS平衡柱子和洗脱蛋白，收集BSA/MBS蛋白，将1-10mg EV71病毒VP2蛋白抗原多肽溶解在100μL二甲基酰胺中，然后加入1ml纯化的BSA/MBS蛋白，迅速混匀，马上加入10-50μl 2N NaOH溶液调整液体pH值在7.2，最后将反应完成的蛋白溶液室温透析3-6小时，透析缓冲液为10mM Ph7.2的PBS，中间换液2-5次，由此得到EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白分装，即为EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。-20℃保存备用

本发明还提供了一种EV71病毒IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括上述EV71病毒IgA抗体检测试纸条和唾液采集棒，所述的唾液采集棒包括采集杆和杆头的唾液吸附材料，所述的唾液吸附材料为聚酯棉、脱脂棉，优选聚酯棉。

优选，所述的EV71病毒IgA抗体检测试剂盒还含有样本稀释液，其配方是：质量分数0.2％BSA+质量分数0.1％酪蛋白+体积分数0.25％Tween-20+体积分数0.1％procline-300+10mM PBS，溶剂为水，pH7.2。

所述的抗人IgA抗体量子微球标记物优选为抗人IgA抗体CdTe/ZnSe量子点微球标记物。

所述抗人IgA抗体可以为羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体。

本发明研制的EV71病毒IgA抗体检测试纸条，其选取标记物为量子点，灵敏度可以比常见的胶体金标记物高10-100倍，从而在检测灵敏度方面保证了诊断的准确性。本发明检测的对象是患者的唾液，因此在采样方面方便简单。对患者而言唾液采集法没有创伤，对操作人员来说简单易学不用专业培训。本发明比较适合幼儿园筛选手足口病毒，不需要专业的医务人员就可以筛查疑是感染幼儿，可以避免EV71病毒在幼儿园传播扩散。本发明也适合家庭诊断，家长可以提前了解子女的病情，并及早送至医院进行诊疗，缩短病程。

附图说明：

图1为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。

图2为唾液采集棒释放唾液标本示意图，其中6、唾液采集棒；7、样品管；8、样品稀释液。图3为EV71病毒IgA抗体检测试纸条的测试示意图。

图4为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的阳性示意图。

图5为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的阴性示意图。

图6为本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的无效示意图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：诊断试纸条包被物制备

EV71病毒VP2蛋白抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用双功能剂马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)将BSA蛋白与EV71病毒VP2蛋白抗原多肽偶联，偶联物可用于诊断试纸条包被所用。称量3mg MBS溶解在二甲基酰胺(DMF)中，配置成浓度为10mM的MBS溶液。将3mg BSA溶解在1ml 10mM PBS(PH7.2)中，加入10mM MBS溶液100ul，室温下磁力搅拌10-30min，得到BSA/MBS溶液。采用sepharose G25层析柱纯化BSA/MBS溶液，使用50mM PBS(pH6.0)平衡柱子和洗脱蛋白，收集BSA/MBS蛋白。将5mg EV71病毒VP2蛋白抗原多肽(如SEQ ID NO.1所示)溶解在100uL二甲基酰胺(DMF)，然后加入1ml纯化的BSA/MBS蛋白，迅速混匀，马上加入30ul 2N NaOH溶液调整液体pH值在7.0-7.2。最后将反应完成的蛋白溶液室温透析3-6小时，透析缓冲液为10mM PBS(PH7.2)，中间换液2-5次。纯化物EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白分装，-20℃保存备用。

实施例2：羊抗人IgA抗体量子点标记垫制备

吸取30ul水溶性量子点(表面羧基修饰)，6000rpm离心8min，加入100ul 10mM PBS(pH 7.2)溶解。加入30ul体积的质量分数2％N-羟基硫代琥珀酸亚胺和质量分数2％1_(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐到量子点溶液中，再加入1000ul的5mg/ml羊抗人IgA抗体溶液，室温搅拌4小时。反应完全后，6000rpm离心8min，沉淀物加入质量分数1％BSA溶液封闭处理2小时。6000rpm离心8min，沉淀物加入10mM PBS(pH 7.2)溶解，得到羊抗人IgA抗体量子点微球标记物，4℃保存备用。将羊抗人IgA抗体量子点微球标记物喷涂到玻璃纤维膜上，稀释参数为30cm²/ml，并在相对湿度15％，温度30℃条件下干燥12小时以上，制备得到量子点标记垫，密封备用。

实施例3：硝酸纤维素膜包被

用包被液稀释人IgA抗体、EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白，其中人IgA抗体的浓度为1.5mg/ml，EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白浓度为1mg/ml。将两者均匀喷涂到NC膜上，其中人IgA抗体喷到NC膜上C(对照线)位置，EV71病毒VP2抗原多肽-BSA蛋白喷到NC膜上T(检测线)位置。将喷涂好的NC膜放置在相对湿度20％，温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上，烘干好的NC膜密封备用。

实施例4：组装、切条

请参阅附图1，附图1为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。将样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4依次粘附在PVC背板5上，然后调整切条机参数进行切条，切成3-5mm宽度的试纸条，得到EV71病毒IgA抗体检测试纸条。

EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结果说明：

如果唾液标本中含有EV71病毒IgA抗体，其会与标记垫中的羊抗人IgA抗体量子点微球标记物结合，上行到NC膜上检测线(T线)，并与其中的EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白的特异结合，形成红色条带(附图4)。如果唾液标本中不含有EV71病毒IgA抗体，那么标记垫中的羊抗人IgA抗体量子点微球标记物会越过检测线(T线)，继续上行到对照线，与其中的人IgA抗体(C线)结合，在对照线上形成红色条带(附图5)。如果对照线(C线)没有形成红色条带，说明试纸条失效，结果不可靠(附图6)。

实施例5：标本测试

本发明的唾液采集棒，包括采集杆和杆头的唾液吸附材料，所述的唾液吸附材料为聚酯棉。

本发明通过唾液采集棒在患者舌下、腮部，聚酯棉吸附唾液分泌物，将采集棒6放置到装有1-3ml标本稀释液8的样品管7中，充分挤压采集棒，然后弃去采集棒。将EV71病毒IgA抗体检测试纸条放置到样品管中，样品垫端接触标本，放置10-30分钟，选用紫外线手电筒照射，然后肉眼观察结果。请参阅附图2。

所述的样本稀释液，其配方是：质量分数0.2％BSA+质量分数0.1％酪蛋白+体积分数0.25％Tween-20+体积分数0.1％procline-300+10mM PBS，溶剂为水，pH7.2，按其组分和含量，将各组分混合均匀即可。

实施例6：本发明EV71病毒IgA抗体量子点诊断方法与荧光PCR方法结果对比

筛选临床手足口病患者100例，分别采集患者的唾液标本和咽拭子标本，分别用EV71病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与EV71病毒荧光PCR方法进行测试，结果如表1：

表1本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法比较结果

本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法比较，阳性率达到93.47％，特异性92.59％，可以符合临床检测的条件。

实施例7：本发明EV71病毒IgA抗体量子点检测方法特异性研究

临床上选择柯萨奇A16病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、柯萨奇B3病毒感染患者唾液标本各3份，分别用本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条进行测试，结果显示阴性，说明本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条与上述的病毒感染标本无交叉，特异性高。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (5)

1.一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条，包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上设有包被抗原的检测线和人IgA抗体的对照线，标记垫中含有抗人IgA抗体量子微球标记物；

所述的抗原包括EV71病毒VP2蛋白抗原多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1；所述的抗原的包被浓度为1mg/ml；

所述的人IgA抗体包被浓度为1.5mg/ml；

所述的抗原是EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物；

所述的抗原是采用马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯作为交联剂，将EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白交联后的交联产物；

所述的EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物是通过以下方法制备的：

称量3mg马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶解在二甲基酰胺中，配置成浓度为10mM的马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶液，将3mg BSA溶解在1ml 10mM pH7.2的PBS中，加入10mM马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶液100μl，室温下磁力搅拌10-30min得到BSA/马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶液，采用sepharose G25层析柱纯化BSA/马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯溶液，使用50mM pH6.0的PBS平衡柱子和洗脱蛋白，收集BSA/马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯蛋白，将5mg EV71病毒VP2蛋白抗原多肽溶解在100μL二甲基酰胺中，然后加入1ml纯化的BSA/马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯蛋白，迅速混匀，马上加入30μl 2N NaOH溶液调整液体pH值在7.0-7.2，最后将反应完成的蛋白溶液室温透析3-6小时，透析缓冲液为10mM pH7.2的PBS，中间换液2-5次，由此得到EV71病毒VP2蛋白抗原多肽-BSA蛋白分装，即为EV71病毒VP2蛋白抗原多肽与BSA蛋白的交联产物。

2.根据权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条，其特征在于，所述抗人IgA抗体为羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条，其特征在于，所述的抗人IgA抗体量子微球标记物为抗人IgA抗体CdTe/ZnSe量子点微球标记物。

4.一种EV71病毒IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条和唾液采集棒，所述的唾液采集棒包括采集杆和杆头的唾液吸附材料，所述的唾液吸附材料为聚酯棉或脱脂棉。

5.根据权利要求4所述的EV71病毒IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的EV71病毒IgA抗体检测试剂盒还含有样本稀释液，其配方是：质量分数0.2％BSA+质量分数0.1％酪蛋白+体积分数0.25％Tween-20+体积分数0.1％procline-300+10mM PBS，溶剂为水，pH7.2。

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