CN113624977A - SARS-CoV-2感染诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过检测唾液中SARS‑CoV‑2特异性IgA从而诊断SARS‑CoV‑2感染的方法，诊断的方法可以是利用任何能够检测IgA的方法，如ELISA、免疫共沉淀、化学发光法及胶体金法。本发明证明COVID‑19患者的唾液中存在SARS‑CoV‑2特异性IgA，可用于临床诊断SARS‑CoV‑2感染。

Description

SARS-CoV-2感染诊断方法
技术领域
本发明属于抗体检测领域，特别涉及通过检测唾液中抗SARS-CoV-2 的IgA进行SARS-CoV-2感染诊断的方法。
背景技术
目前，对于SARS-CoV-2或2019-nCoV引起的肺炎COVID-19，准确 的诊断和隔离仍然是控制疫情的主要方法。全球范围内检测诊断 SARS-CoV-2感染的主要方法依然是采用反转录实时定量PCR(RT-qPCR) 检测口咽及鼻咽拭子上的病毒RNA。该方法取样不方便，不容易被接受， 需要专业的医护人员参与，且有传染疾病的风险；另外由于咽部病毒载量 会随着感染时间的增加而显著减少，特别是在感染15天后，容易出现假 阴性检测结果，诊断准确率较差。
除以上正在通用的RT-qPCR检测方法外，通过检测血清中 SARS-CoV-2特异性的抗体，如IgM和IgG，来诊断SARS-CoV-2感染的 方法也在兴起，但采血是一种侵入行为，且需要专业护理人员的参与，很 难应用于需要快速大量检测的场所，如机场和海关等。
所以需要一种取样方便快捷、无侵入性的准确性高的检测方法。
发明内容
发明人发现在COVID-19康复患者的唾液中存在特异性结合 SARS-CoV-2的IgA，且含量较高，所以本专利提供一种方便快捷且容易 接受的检测方法，即通过检测唾液中的SARS-CoV-2特异性IgA来诊断SARS-CoV-2感染，该方法取样方便快捷，不需要医护人员参与，无侵入 性；另外发明人发现，较高水平的SARS-CoV-2特异性IgA能在被感染者 体内维持至少1个月以上，因此检测准确性高。
目前尚未发现有关检测唾液中的SARS-CoV-2特异性IgA来诊断 SARS-CoV-2感染的报道。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明提供诊断SARS-CoV-2感染的方法，其包括在受试者的唾液中 检测SARS-CoV-2特异性IgA的存在，其中所述特异性IgA的存在指示 SARS-CoV-2的感染。
在一个实施方案中，唾液中SARS-CoV-2特异性IgA的检测包括用 SARS-CoV-2抗原提取所述受试者的唾液中的SARS-CoV-2特异性IgA， 形成复合物，其中所述SARS-CoV-2抗原为SARS-CoV-2中的在人或哺乳 动物体内具有抗原性的病毒蛋白，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、 ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白，或SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、 ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白的在人或哺乳动物体内具有抗原性的一部 分，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD。
在一个实施方案中，所述方法还包括使用具有可检测标记(例如化学 发光基团或材料(如吖啶酯)或酶)的抗IgA的抗体(例如抗人IgA Fc的 抗体))检测所述复合物中的IgA的存在。
在一个实施方案中，所述SARS-CoV-2抗原偶联在固相载体(例如琼脂 糖珠子、磁珠、硝酸纤维素膜、免疫板)上。所述固相载体用于将 SARS-CoV-2抗原和SARS-CoV-2特异性IgA形成复合物从溶液中分离和 鉴定。
在一个实施方案中，其中唾液中SARS-CoV-2特异性IgA的检测可以 通过化学发光、免疫共沉淀、ELISA、胶体金等方法完成。这些方法用于 检测所述复合物中是否存在SARS-CoV-2特异性IgA。
在一个实施方案中，所述受试者为人或哺乳动物。
在另一个方面，本发明提供试剂盒，其包括连接有SARS-CoV-2抗原 的固相载体(例如琼脂糖珠子、磁珠、硝酸纤维素膜、免疫板等)和具有可 检测标记的抗IgA抗体(例如抗人IgA Fc的抗体)，其中述SARS-CoV-2抗 原为SARS-CoV-2中的在人或哺乳动物体内具有抗原性的病毒蛋白，例如 SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白，或SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白的在人 或哺乳动物体内具有抗原性的一部分，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白的 RBD。
在一个实施方案中，所述试剂盒用于与化学发光、免疫共沉淀、ELISA 或胶体金等方法联合使用。
在一个实施方案中，其中所述抗IgA抗体是由化学发光基团或材料(例 如，吖啶酯)或者酶标记的。
在一个实施方案中，如上述试剂盒，其用于在受试者的唾液中检测 SARS-CoV-2特异性IgA的存在或检测受试者的SARS-CoV-2感染，优选 地，所述受试者为人或哺乳动物。
本发明至少具有以下技术效果：
1)本发明采用唾液作为检测对象，相比咽拭子，整个取样过程可由 被检测者自行完成，在取样过程中传染疾病的风险很低。
2)本发明采用唾液作为检测对象，整个取样过程可由被检测者自行 完成，全程无需专业的医护人员参与，能节约大量的医护成本。
3)本发明采用唾液作为检测对象，相比咽拭子及血液，取样特别的 方便和快捷，适合需要快速检测的场所，如海关和机场等。
4)本发明采用唾液作为检测对象，相比咽拭子及血液，取唾液是一 种无侵入性的行为，更容易被被检测者接受。
5)本发明通过检测唾液中SARS-CoV-2特异性IgA，相比咽拭子，具 有更高的准确率。
本说明书中提及的所有文献均通过引用以其整体并入本文。
附图说明
图1采用免疫共沉淀分别检测健康人及COVID-19康复患者唾液中的 IgA。泳道1和2是2个健康人唾液的检测结果；泳道3-6是4个COVID-19 康复患者唾液的检测结果。
图2是采用化学发光法分别检测健康人及COVID-19康复患者唾液中 IgA的结果。
图3采用接受者操作特性(ROC)曲线分析采用化学发光法检测唾液 中SARS-CoV-2特异IgA的诊断结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明中所涉及的所有健康人或COVID-19康复患者均签署了知情同 意书。
实施例1：唾液样本的收集和处理
1)随机选取两个健康人，以及四个COVID-19康复患者依次作为本 实验的被检测者1、2、3、4、5、6。告知被检测者，在取唾液样本前至少 10分钟内不能进行饮食、漱口等会影响唾液质量的活动。同时发放唾液收 集容器给被检测者，收集容器开口最好大于5厘米，且带有密封盖。
2)由被检测者自行收集自己的唾液，大约1mL的唾液量即可，盖好 密封盖后，将容器表面清理干净。
3)收集被检测者的唾液样本，采用75％酒精对器皿外表面进行消毒 处理。
4)-20℃储存，检测时在生物安全柜中打开。
实施例2.采用免疫共沉淀法检测唾液样本中的SARS-CoV-2特异性 IgA
1)表达纯化SARS-CoV-2突刺蛋白的受体结合区域RBD蛋白 (Sequence ID：MT322424.1，具体核酸序列SEQ ID NO.1见说明书最后一 页)，并将其偶联到CNBr-activated SepharoseTM 4B琼脂糖珠子上(购自 GE公司)。
2)取上述2位健康人及4位COVID-19康复患者(即被检测者1、2、 3、4、5、6)的唾液各1mL，分别加入4mL PBS稀释并转移到10mL离 心管中，各加入100μl本实施例步骤1中制备的偶联RBD的琼脂糖珠子， 混匀，室温颠倒混匀孵育30min。
3)1000g离心1min，弃上清。随后加入4mL PBS，混匀颠倒20次 以清洗珠子。
4)1000g离心1min，重复本实施例2步骤3)4次。
5)每管加入300μL 0.1M醋酸，涡旋10s以洗脱结合的蛋白。
6)1000g离心1min，上清转移至新的离心管中，加入60μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)中和酸性。
7)取20μL制备SDS-PAGE电泳样品，随后进行还原性SDS-PAGE 电泳。然后采用如下步骤完成Western blotting鉴定。
8)转膜：将SDS-PAGE中的蛋白通过湿转至PVDF膜上。
9)将膜转入含有5％(质量/体积)牛奶的PBS溶液中，室温封闭1h。 随后加入HRP偶联的抗人IgA Fc的抗体(Boster biological technology)， 室温孵育1h。
10)采用含有0.1％Tween-20的PBS洗膜5次。将膜转移至bio-rad 凝胶成像系统的照胶板上，随后加入一定量的底物显色(abpbiotech)至 覆盖膜表面，在bio-rad凝胶成像系统中拍取照片，结果如图1所示。可 见，除2个健康人唾液样本对照未检测出IgA条带外，其它4个康复患者 的唾液中均成功检测到了SARS-CoV-2的RBD特异性IgA重链条带。
以上结果显示康复患者的唾液中存在SARS-CoV-2特异性的IgA，因 此唾液中存在SARS-CoV-2特异性的IgA也可以用ELISA、胶体金及化学 发光法等方法检测。
实施例3.采用化学发光法检测唾液样本中的SARS-CoV-2特异性IgA 利用化学发光法进行的检测原理如下：将唾液待测样本与包被有 SARS-CoV-2 RBD的磁珠一起孵育，经磁性分离洗涤未结合物质后，加入 抗人IgA抗体吖啶酯标记物一起孵育，再次洗涤后，加入底物液，随后检 测吖啶酯的发光反应。若样本中存在新型冠状病毒IgA抗体，则可形成磁珠包被物-新型冠状病毒IgA抗体-吖啶酯标记物复合物，吖啶酯的发光强 度与新型冠状病毒IgA抗体的含量成正相关的关系，检测结果以临界值指 数(COI)表示。
本实施例的化学发光检测使用放入全自动检测机器Kaeser 1000，阴阳 性对照的发光值，用于筛选时的校正。
具体步骤为：
1)将实施例2中纯化得到的SARS-CoV-2 RBD与磁珠(购自无锡百迈 格生物科技有限公司，2.8微米羧基修饰磁珠，货号：BMS2800-2A-2ml)， 按照磁珠说明书，EDC一步法和EDC/SNHS两步法，形成磁珠抗原包被 物。
2)按照实施例1的取样方法分别收集随机选取的24个健康人及10个 COVID-19康复患者的唾液样本。分别用PBS稀释至40x。
3)在装机前，需要将磁珠包被物轻轻颠倒翻转约30次，使磁珠微粒分 散均匀。首次装载磁珠包被物后不需要继续混匀。
4)在全自动检测机器Kaeser 1000的仪器操作介面选取试剂位，扫描 试剂架上的二维码，将试剂架放入试剂仓中。
5)按全自动检测机器Kaeser 1000的样本稀释液说明书准备样本稀释 液。
6)按清洗液说明书准备清洗液。
7)按全自动检测机器Kaeser 1000用底物液说明书准备底物液A和底 物液B。
8)将阴性对照(为SARS-CoV-2 IgA阴性血清)和阳性对照(为人源性 纯化SARS-CoV-2 IgM抗体)放在样本架上并推入样本仓中，在“样本申请” 界面，分别设置样本类型为阴性对照和阳性对照，设置运行程序如下，命 名为SARS-CoV-2 IgA项目，选取SARS-CoV-2IgA项目，阴性对照和阳 性对照应做2个复孔，确定后点击“运行”。
上述运行程序为：
总孵育时间15分钟。
将待测物(在此步骤中为阴、阳性对照)传送至吸液点。
将反应杯载入运行通道。
分别吸取30μL待测物到反应杯。
运送反应杯到试剂仓位，加入50μL试剂R1。
震荡混合后，将反应杯运送至孵育仓，37℃孵育10分钟。
将反应杯运送至洗涤通道，进行磁分离，用洗液清洗反应混合 物，再重复磁分离-清洗3次。
再次运送反应杯到试剂仓位，加入50μL试剂R2。
震荡混合后，将反应杯运送至孵育仓，37℃孵育5分钟。
将反应杯运送至洗涤通道，进行磁分离，用洗液清洗反应混合 物，再重复磁分离-清洗3次。
将反应杯运送至底物通道，加入100μL底物液A，震荡混合。
将反应杯运送至检测通道，抓取反应杯至检测仓，加入100μL 底物液B，并立即检测发光信号，计算IgA的COI值。
抓取反应杯到废料仓。
9)检测：将唾液样本放入样本架上(样本量大于300μL)，推入样本 架，在操作界面上编辑样本信息，选取SARS-CoV-2 IgA项目，确定后点 击“运行”，待测物在此步骤中为唾液样本，此检测过程20分钟左右即可 完成。
10)结果判定
当COI＜0.8时，样本中的SARS-CoV-2 IgA无反应性；
当0.8≤COI＜1.0时，样本中的SARS-CoV-2 IgA不确定；
当COI≥1.0时，样本中的SARS-CoV-2 IgA有反应性。
结果如图2所示，大部分COVID-19康复患者的SARS-CoV-2特异性 IgA信号显著高于健康人的信号。
随后我们采用MedCalc软件，依据检测结果，进行接受者操作特性 (ROC)曲线分析，结果如图3所示，通过对10个COVID-19患者和24 健康人的唾液检测结果分析发现，以SARS-CoV-2特异性IgA检测感染 SARS-CoV-2的敏感度为100％，特异度为91.7％。
由于被检测者是COVID-19康复患者，此时他们的体内SARS-CoV-2 特异性IgA含量已远低于发病进程中的含量，如果针对正在发病中的 COVID-19患者进行检测，诊断的准确性会进一步增加。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
RBD的核酸序列(SEQ ID NO：1)：
Figure BDA0002484048650000091

Claims (10)

1.诊断SARS-CoV-2感染的方法，其包括在受试者的唾液中检测SARS-CoV-2特异性IgA的存在，其中所述特异性IgA的存在指示SARS-CoV-2的感染。
2.权利要求1所述的方法，其中唾液中SARS-CoV-2特异性IgA的检测包括用SARS-CoV-2抗原提取所述受试者的唾液中的SARS-CoV-2特异性IgA，形成复合物，其中所述SARS-CoV-2抗原为SARS-CoV-2中的在人或哺乳动物体内具有抗原性的病毒蛋白，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白，或SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白的在人或哺乳动物体内具有抗原性的一部分，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD。
3.权利要求2所述的方法，其还包括使用具有可检测标记(例如化学发光基团或材料(如吖啶酯)或酶)的抗IgA的抗体(例如抗人IgA Fc的抗体)检测所述复合物中的IgA的存在。
4.权利要求2或3所述的方法，所述SARS-CoV-2抗原偶联在固相载体(例如琼脂糖珠子、磁珠、硝酸纤维素膜、免疫板)上。
5.权利要求1-4中任一项所述方法，其中唾液中SARS-CoV-2特异性IgA的检测通过化学发光、免疫共沉淀、ELISA或胶体金的方法完成。
6.权利要求1-5中任一项所述方法，所述受试者为人或哺乳动物。
7.试剂盒，其包括连接有SARS-CoV-2抗原的固相载体(例如琼脂糖珠子、磁珠、硝酸纤维素膜、免疫板)和具有可检测标记的抗IgA抗体(例如抗人IgA Fc的抗体)，其中，所述SARS-CoV-2抗原为SARS-CoV-2中的在人或哺乳动物体内具有抗原性的病毒蛋白，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白，或SARS-CoV-2的刺突蛋白、N蛋白、ORF3b蛋白、M蛋白或E蛋白的在人或哺乳动物体内具有抗原性的一部分，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD。
8.权利要求7所述的试剂盒，其用于与化学发光、免疫共沉淀、ELISA或胶体金的方法联合使用。
9.权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述抗IgA抗体是由化学发光基团或材料(例如，吖啶酯)或者酶标记的。
10.权利要求7-9中任一项所述的试剂盒，其用于在受试者的唾液中检测SARS-CoV-2特异性IgA的存在，优选地，所述受试者为人或哺乳动物。
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