JP2021172642A - SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシド断片および該断片を用いて抗SARS−CoV−2抗体を検出する方法およびキット - Google Patents
SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシド断片および該断片を用いて抗SARS−CoV−2抗体を検出する方法およびキット Download PDFInfo
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Abstract
Description
コロナウイルスの検出方法としてはPCR法等により、ウイルス中の複数の領域を標的とした遺伝子検査法が知られている。また、コロナウイルスのヌクレオカプシド(以下、「NP」と記す場合がある)を標的として、抗体を用いたウイルス抗原タンパク質の検出や、感染した患者に産生される抗ウイルス抗体を調べる抗体検出による2種類の免疫学的検査法も知られている(特許文献1および非特許文献1)。
現在、SARS−CoV−2の感染拡大について、WHOがパンデミック(世界的流行)相当との認識を示している。しかしながら、SARS−CoV−2感染患者の治療法は確立されていない。したがって、適切な感染拡大防止策を講じるために、迅速な検査法によりSARS−CoV−2感染患者を発見するとともに、免疫学的検査を用いて血清中の抗体保有率を調べることで、感染率や感染経路を調査することは極めて重要である。
[1]SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシドの断片であって、配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、前記断片。
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる、[1]の断片。
[3]抗SARS−CoV−2抗体をヒト由来の血液、血漿および/または血清から検出する方法であって、ヒト由来の血液、血漿および/または血清を[1]または[2]の断片と接触させる工程を含む、前記方法。
[4][1]または[2]の断片および/または抗SARS−CoV−2抗体を認識する抗体またはその断片が標識物質により標識された、[3]の方法。
[5]標識物質が、酵素、化学発光物質、蛍光発光物質、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される1以上のものである、[4]の方法。
[6]抗SARS−CoV−2抗体が、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEから選択される1以上のものである、[3]〜[5]のいずれかの方法。
[7]抗SARS−CoV−2抗体が、ELISA法および/またはイムノクロマト法等の抗原抗体反応に基づいた方法によって検出される、[3]〜[6]のいずれかの方法。
[8][1]または[2]の断片を含む、抗SARS−CoV−2抗体を検出するためのキット。
[9]イムノクロマトストリップの形態である、[8]のキット。
本発明の一側面は、配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシドの断片(以下、「本発明の断片」と記す場合がある)に関する。
本発明において、「SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシドの断片」は、SARS−CoV−2由来NPのアミノ酸配列(配列番号1)における、SARS−CoV−2由来NPのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来NPのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域(配列番号1で表されるアミノ酸配列の121〜419番目の領域)からなるタンパク質の断片を指す。SARS−CoV−2由来NPの断片は、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有する。正確、簡便、かつ迅速に抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点から、SARS−CoV−2由来NPの断片は、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して、95%以上の配列同一性を有することが好ましく、98%以上の配列同一性を有することが特に好ましく、100%の配列同一性を有することがさらに好ましい。一態様において、SARS−CoV−2由来NPの断片は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるものである。
本発明の別の側面は、ヒト由来の血液、血漿および/または血清を本発明の断片と接触させる工程を含む、抗SARS−CoV−2抗体をヒト由来の血液、血漿および/または血清から検出する方法(以下、「本発明の方法」と記す場合がある)に関する。一態様において、本発明の方法は、本発明の断片と抗SARS−CoV−2抗体との間で抗原抗体反応を行う工程、および/または、抗SARS−CoV−2抗体と抗SARS−CoV−2抗体を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の断片および/または抗SARS−CoV−2抗体を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
急性期において、正確、簡便、かつ迅速に抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点から、ヒト由来の血液、血漿および/または血清は、発病後7日以内に採取されたものが好ましく、発病後3日以内に採取されたものが特に好ましく、発病後1日以内に採取されたものがさらに好ましい。また、回復期において、正確、簡便、かつ迅速に抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点から、ヒト由来の血液、血漿および/または血清は、発病後14〜28日以内に採取されたものが好ましく、発病後14〜25日以内に採取されたものが特に好ましく、発病後14〜20日以内に採取されたものがさらに好ましい。正確、簡便、かつ迅速に抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点から、採取したヒト由来の血液、血漿および/または血清を、−20℃以下の温度で保存するのが好ましく、−80℃以下の温度で保存するのが特に好ましい。
例えば、血清は、非特許文献2に記載のとおり、分離後の血清を密栓できるプラスティックチューブに1〜2ml入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。凝固剤が入っていてもよく、血清分離剤入りの採血管を用いた場合は、遠心後の血清1〜2mlをプラスチックチューブ(滅菌チューブが望ましい)に移し蓋をした後、パラフィルムでシールする。
また、例えば、全血は、非特許文献2に記載のとおり、血液凝固阻止剤(EDTA−NaまたK)入りの採血管に採取し、1〜2mlを密栓できるプラスティックチューブに分注し、蓋をした後、パラフィルムでシールする。可能であれば、血球分離し、末梢血単核球を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。末梢血単核球の分離はBDバキュテイナ(登録商標)CPT(商標)単核球分離用採血管を使うと簡便である。また、採血後の分注や血球分離ができない場合は、PAXgene(登録商標)RNA採血管を用いて採血し、そのまま凍結保存しておいてもよい。
本発明において、「抗SARS−CoV−2抗体」は、SARS−CoV−2の感染による免疫応答の結果生じた生体由来の抗体を指し、ヒト由来の血液、血漿および/または血清において存在する。正確、簡便、かつ迅速に抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点から、抗SARS−CoV−2抗体は、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEからなる群から選択される1以上のものであることが好ましく、IgGおよび/またはIgMであることが特に好ましく、IgGであることがさらに好ましい。
本発明の別の側面は、本発明の断片を含む、抗SARS−CoV−2抗体を検出するためのキット(以下、「本発明のキット」と記す場合がある)に関する。正確、簡便、かつ迅速に抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点、医療従事者が感染現場および防疫現場等の設備が十分とはいえない場所で抗SARS−CoV−2抗体を検出する観点、疫学調査をする観点等から、本発明のキットは、イムノクロマトストリップの形態であることが好ましい。
本発明の別の側面は、本発明の断片を含む、抗SARS−CoV−2抗体を検出するための組成物(以下、「本発明の組成物」と記す場合がある)に関する。
[SARS−CoV−2感染の診断方法]
本発明の別の側面は、ヒト由来の血液、血漿および/または血清を本発明の断片と接触させる工程を含む、SARS−CoV−2感染の診断方法(以下、「本発明の診断方法」と記す場合がある)に関する。一態様において、本発明の診断方法は、本発明の断片と抗SARS−CoV−2抗体との間で抗原抗体反応を行う工程、および/または、抗SARS−CoV−2抗体と抗SARS−CoV−2抗体を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の断片および/または抗SARS−CoV−2抗体を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるSARS−CoV−2由来NPの断片を以下の方法により調製した。なお、SARS−CoV−2由来NPは配列番号1で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列に対応するRNA配列は配列番号3で表され、該RNA配列に対応するDNA配列は配列番号4で表される。なお、該DNA配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
まず、配列番号4で表されるDNA配列を用いて、該DNA配列を鋳型とするPCR法により、配列番号1で表されるアミノ酸配列の121〜419番目の領域(図1)に対応する配列番号4で表されるDNA配列の361〜1260番目の領域をPCR法により増幅し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用説明書に従って、Hisタグが付加されたSARS−CoV−2由来NPの断片(配列番号1で表されるアミノ酸配列の121〜419番目の領域(図1))を小麦胚芽抽出液により無細胞タンパク質合成した。
SARS−CoV−2由来NPの断片の発現を、ウエスタンブロット法によって確認した。まず、Hisタグが付加されたSARS−CoV−2由来NPの断片を2×SDSサンプル緩衝液(125mM Tris−HCl、4%SDS、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、および10%2−メルカプトエタノール)と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをPVDFメンブレンに転写した。メンブレンを2%スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識された抗Hisタグ抗体と反応させた。その後、HRP標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、Hisタグが付加されたSARS−CoV−2由来NPの断片の分子量は33.7kDaであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから(図2A)、SARS−CoV−2由来NPの断片の発現を確認することができた。
無細胞タンパク質合成の反応液からNiカラムを用いてHisタグが付加されたSARS−CoV−2由来NPの断片を精製した。転写、無細胞タンパク質合成、および精製の一連の工程は、自動合成装置(セルフリーサイエンス社)を使用して行った。Hisタグが付加されたSARS−CoV−2由来NPの断片を3回にわたって精製し、1〜3回目の精製画分をそれぞれE1〜E3とした。E1〜E3を2×SDSサンプル緩衝液(125mM Tris−HCl、4%SDS、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、および10%2−メルカプトエタノール)と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動し、Rapid CBB KANTO 3S(関東化学株式会社)によって染色した。
その結果、精製前の溶液(S:可溶性画分)と比較してE1〜E3では夾雑タンパク質の存在量が低減されたことから(図2B)、SARS−CoV−2由来NPの断片が精製されたことを確認することができた。
例1で得たSARS−CoV−2由来NPの断片を使用するウエスタンブロット法によってSARS−CoV−2のヒト血清からの検出が可能であるか否かを検討した。具体的には、SARS−CoV−2由来NPの断片が、SARS−CoV−2感染患者血清に含まれるIgM抗体およびIgG抗体に対して抗原抗体反応を示すか否かをウエスタンブロット法によって評価した。また、比較のために、SARS−CoV−2由来NPの断片の代わりに、SARS−CoV−2由来NPおよび他のコロナウイルス(SARS−CoV、MERS−CoV、HKU1、および229E)由来NPを使用した。
まず、SARS−CoV、MERS−CoV、HKU1、および229E由来NPをコードする各DNA配列を合成した(ジーンウィズ社に委託)(それぞれ配列番号5、6、7、および8で表される)。なお、各DNA配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
次に、SARS−CoV−2由来NPおよび他のコロナウイルス(SARS−CoV、MERS−CoV、HKU1、および229E)由来NPを、それぞれ例1に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成し、精製した。
まず、SARS−CoV−2由来NPの断片およびSARS−CoV−2由来NPおよび他のコロナウイルス(SARS−CoV、MERS−CoV、HKU1、および229E)由来NPを2×SDSサンプル緩衝液(125mM Tris−HCl、4%SDS、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、および10%2−メルカプトエタノール)と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをPVDFメンブレンに転写した。メンブレンを2%スキムミルク溶液でブロッキングした後、健常者血清または患者血清と反応させた。そして、さらにペルオキシダーゼ標識された抗IgM抗体または抗IgG抗体(HRPヤギ抗ヒトIgM抗体またはIgG抗体)と反応させ、その後、ペルオキシダーゼ基質溶液(1-Step(商標)Ultra TMB-ELISA Substrate Solution、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を加えて発色させ、波長450nmでの吸光度を測定した。なお、健常者血清および患者血清は、56℃で30分間加熱し、等量の2%NP−40/PBSを加え、室温で15分間静置したものを使用した。
以上から、ウエスタンブロット法によるSARS−CoV−2のヒト血清からの検出が可能であることが示された。
例1で得たSARS−CoV−2由来NPの断片を使用するELISA法によってSARS−CoV−2のヒト血清からの検出が可能であるか否かを検討した。具体的には、SARS−CoV−2由来NPの断片が、SARS−CoV−2感染患者血清に含まれるIgM抗体およびIgG抗体に対して抗原抗体反応を示すか否かをELISA法によって評価した。
以上から、ELISA法によるSARS−CoV−2のヒト血清からの検出が可能であることが示された。
例1で得たSARS−CoV−2由来NPの断片を使用するイムノクロマト法によって、抗SARS−CoV−2抗体(IgG)をヒト血清から検出可能であるか否かを検討した。
よって、当該イムノクロマト法によって、ヒト血清中からSARS−CoV−2感染を示す抗SARS−CoV−2抗体を検出可能であることが示された。
Claims (9)
- SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシドの断片であって、配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、前記断片。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の断片。
- 抗SARS−CoV−2抗体をヒト由来の血液、血漿および/または血清から検出する方法であって、ヒト由来の血液、血漿および/または血清を請求項1または2に記載の断片と接触させる工程を含む、前記方法。
- 請求項1または2に記載の断片および/または抗SARS−CoV−2抗体を認識する抗体またはその断片が標識物質により標識された、請求項3に記載の方法。
- 標識物質が、酵素、化学発光物質、蛍光発光物質、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される1以上のものである、請求項4に記載の方法。
- 抗SARS−CoV−2抗体が、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEから選択される1以上のものである、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 抗SARS−CoV−2抗体が、ELISA法および/またはイムノクロマト法等の抗原抗体反応に基づいた方法によって検出される、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の断片を含む、抗SARS−CoV−2抗体を検出するためのキット。
- イムノクロマトストリップの形態である、請求項8に記載のキット。
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