CN115943309A

CN115943309A - 用于多个免疫球蛋白同种型的双多重测定

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Publication number: CN115943309A
Application number: CN202180035904.6A
Authority: CN
Inventors: G·陈; S·沙巴航; H·刘
Original assignee: Aditex Co ltd
Current assignee: Aditex Co ltd
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2023-04-07
Also published as: IL298290A; JP2023526204A; US20210364530A1; AU2021277232A1; EP4154005A1; KR20230011318A; MX2022014580A; WO2021236688A1; CA3181179A1

Abstract

本公开内容提供了用于测定抗体的方法和相关的组合物、系统和试剂盒。更具体地说，本公开内容涉及同时检测针对多种不同抗原的多种免疫球蛋白同种型的双多重测定。所述双多重测定可使用单个测试样品进行。

Description

用于多个免疫球蛋白同种型的双多重测定

技术领域

背景技术

目前，大多数抗体或免疫球蛋白检测是在每次针对每个同种型的单独反应中进行的，并且针对单个抗原进行。该过程需要多个反应来检测多于一种同种型的抗体或针对多于一种抗体。目前用于检测抗体的测试主要基于ELISA(酶联免疫吸附测定)或LFA(侧向流动测定)平台，这些平台相对昂贵且耗时，特别是当需要检测多种免疫球蛋白同种型或针对多种抗原的抗体时。其他测定，例如Luminex销售的基于珠子的平台，是单多重性的并允许检测针对多种抗原的抗体，但不能区分免疫球蛋白同种型，或仅允许一次检测一种免疫球蛋白同种型。

发明内容

根据一个实施方案，本公开内容提供了用于检测测试样品中针对至少两种抗原的抗体的至少两种同种型的双多重测定方法。该方法包括将含有测试抗体的测试样品与至少两种类型的可识别标记的微颗粒的混合物组合，其中每种类型的可识别标记的微颗粒与不同的抗原缀合，以与特异性结合抗原的测试抗体形成微颗粒-免疫球蛋白复合物。该方法接下来包括将微颗粒-免疫球蛋白复合物与针对至少两种不同免疫球蛋白同种型的可检测标记的抗Ig同种型抗体组合，以形成微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物。该方法还包括检测微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物的可识别标记的微颗粒类型和抗Ig同种型抗体类型，以生成检测数据。该方法还包括组合或分析检测数据以生成至少四个不同的数据点，每个数据点对应于测试抗体同种型和抗原特异性的不同组合。该方法还包括使用数据点确定测试样品特性。

本公开内容提供了具有一个或多个以下附加特征的更具体的实施方案，其可以彼此组合并且与本说明书的其他元件组合，包括实施例。

不同的抗原可以来自单个生物源，测试样品特性可以是受试者对于针对所述生物源的抗体是阳性还是阴性。

至少三种不同的抗原可缀合到至少三种类型的可识别标记的微颗粒上，并且可使用针对至少三种不同免疫球蛋白同种型的可检测标记的抗Ig同种型抗体生成至少九种不同类型的数据点。

测试样品可来自人类受试者。

测试样品的体积可为0.1-20.0μL。

测试样品可以是全血、血清、血浆、鼻分泌物、痰、支气管灌洗液、尿液、粪便或唾液，特别是全血、血清或血浆，更具体地说是通过手指针刺获得的全血、血清或血浆。

可在与至少两种类型的可识别标记的微颗粒的混合物组合之前稀释测试样品。更具体地说，稀释的生物样品的体积为20-50μl。

可识别标记的微颗粒可以是微球。

微颗粒能够具有长度为0.001μm至1000μm的横截面。

可识别标记的微颗粒能够通过大小、磁特性、荧光、紫外激发荧光波长、紫光激发荧光波长、荧光强度、金属同位素或其任何组合来识别。

可检测标记的抗Ig同种型抗体可以通过荧光特性、发光特性或比色特性或其任何组合来识别。

抗Ig同种型抗体可以包括抗IgG、IgM、IgA的抗体或其任何组合，更具体地，抗原可以来自病毒、细菌、移植器官或组织、肿瘤或癌症。

抗Ig同种型抗体可以包括抗IgG亚型的抗体，更具体地，抗原可以来自病毒、细菌、移植器官或组织、肿瘤或癌症。

抗Ig同种型抗体可以包括抗IgE亚型的抗体，更具体地说，抗原可以来自变应原。

微颗粒-免疫球蛋白复合物可与可检测标记的抗Ig同种型抗体的混合物组合。

可替代地，微颗粒-免疫球蛋白复合物可以在连续步骤中分别与每种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体组合，或者微颗粒-免疫球蛋白复合物可以在连续步骤中分别与一些但不是所有抗Ig同种型抗体的子混合物组合，其中每个子混合物进行一个步骤。

检测步骤可以使用流式细胞术或质谱流式细胞术进行。

通过生成数据点步骤的第一组合可以在约30分钟至3小时的时间段内进行。

所述方法还可以包括确定每个数据点的至少一个准确度指标，其中所述准确度指标是灵敏度、特异性、一致性(相关性)、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率或假阴性率。

测试样品特性可以是测试样品对于特定抗体同种型的测试抗体的阳性或阴性，并且通过针对所有抗原的抗体同种型的数据点的一致性来确定阳性或阴性。

可替代地或另外，测试样品特性可以是测试样品对于针对特定抗原的测试抗体的阳性或阴性，并且通过所有抗体同种型的针对所述抗原的抗体的数据点的一致性来确定阳性或阴性。

所述方法还可以包括确定所述测试样品特性的至少一个准确度指标，其中所述准确度指标是灵敏度、特异性、一致性(相关性)、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率或假阴性率。

与仅使用单一类型数据点来确定测试样品特性的相应测定相比，测试样品特性的特异性增加而灵敏度不降低。

可替代地或另外，与仅使用单一类型数据点来确定测试样品特性的相应测定相比，测试样品特性的特异性可增加至少10倍。

在另一个实施方案中，本公开内容进一步提供了用于对测试样品的针对至少两种抗原的抗体的至少两种同种型进行双多重测定的系统。该系统包括与至少两种抗原缀合的至少两种类型的可识别标记的微颗粒，其中每种类型的可识别标记的微颗粒缀合到不同的抗原，至少两种类型的微颗粒-免疫球蛋白复合物，其中每种类型的微颗粒-免疫球蛋白复合物包括与抗原缀合的可识别标记的微颗粒和与抗原特异性结合的来自测试样品的测试抗体，和至少两种类型的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物，其中每种类型的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物包含与抗原缀合的可识别标记的微颗粒、与抗原特异性结合的来自测试样品的测试抗体和与测试抗体结合的至少一种可检测标记的抗Ig同种型抗体。

在该系统的更具体的实施方案中，每种类型的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物包含与测试抗体结合的至少两种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体。

可操作该系统以执行任何上述方法或本文公开的任何其他方法，并且可以包括本文公开的任何组合物。

在另一个实施方案中，本公开内容还提供了一种用于对测试样品的针对至少两种抗原的抗体的至少两种同种型进行双多重测定的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种类型的可识别标记的微颗粒，其中每种类型的微颗粒与不同的抗原缀合，以及两种或更多种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体，其中每种类型的抗Ig同种型抗体结合不同的免疫球蛋白同种型或亚型。试剂盒还可以包括用于根据任何上述方法或本文公开的任何其他方法或根据形成任何上述系统或本文公开的任何其他系统或组合物的使用说明。

附图简述

图1是根据本公开内容的示例性双多重测定的流程图。

图2是可用于双多重测定的材料的示意图。

图3描述了SARS-CoV-2暴露阴性测试样品和SARS-CoV-2阳性测试样品中使用用于针对一种SARS-CoV-2抗原(病毒刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD))的三种免疫球蛋白同种型(IgG、IgM和IgA)的比较性单多重测定获得的中位荧光强度(MFI)测量值。显示了与三种免疫球蛋白同种型相对应的3份个体样品。

图4描述了ELISA和如本文所述的双多重测定(DM-Ab)之间的测定灵敏度的比较。在用于针对三种SARS-CoV-2抗原(刺突蛋白S1(S1)、RBD和核蛋白(NP))中的每一种的三种免疫球蛋白同种型(IgG、IgM和IgA)的双多重测定中定量信噪比(S/N)。

图5描述了包括通过本公开内容的双多重测定确定的信息的示例性报告。

发明详述

本公开内容提供了用于测定抗体的方法和相关的组合物、系统和试剂盒。更具体地，本公开内容涉及同时检测针对多种不同抗原的多种免疫球蛋白同种型以提供不同抗原和免疫球蛋白同种型组合的不同类型的数据点的双多重测定。可在单次测定中使用受试者的单个测试样品进行双多重测定。双多重测定可使用数据点提供关于测试样品特性的信息。

在特定实施方案中，不同抗原来自单个生物源，并且测试样品特性是受试者对于针对所述生物源的抗体是阳性还是阴性。

然后，关于测试样品特性的信息可进一步用于诊断受试者。例如，它可以用于确定受试者是否先前已经暴露于与至少两种不同抗原相关联的感染原，或者如果是，在暴露后数天，是否已经产生了稳健的免疫应答，是否已经产生了保护性免疫应答，是否可能存在多次暴露，感染原是否已导致受试者的实际感染，或如果是，感染是否是当前感染，感染的阶段或严重程度，感染是否已消退，或感染已消退多久。

此外，从同一受试者的不同测试样品中采集的测试样品特性(无论是同一类型或不同类型、同时采集还是随时间推移采集)也可用于诊断受试者。例如，从同一受试者同时采集的不同类型的测试样品可以指示感染的程度(特别是如果样品是从受试者中的不同位置获得的或具有不同类型(例如，血液和痰作为单独的样品))或暴露于感染原的免疫应答的程度，或者在任一情况下免疫应答是稳健的还是保护性的。作为另一个示例，随着时间的推移从同一受试者中采集的相同类型的测试样品可以指示感染是否已经扩散，是否正在发生有效的免疫应答，免疫应答是否正在适当地消退，或者是否已经建立或正在维持稳健或保护性免疫应答。

例如，免疫球蛋白同种型在体内对抗原的抗体应答过程中表现出不同的功能、定位和动力学。因此，在区分免疫球蛋白同种型时，与非特异性测量总免疫球蛋白的测定相比，本公开内容的双多重测定可以提供独特的全面数据。

如本文所述的一些双多重测定的另一个益处是能够定量存在于测试样品中的不同抗原的不同免疫球蛋白同种型的量，这可以提供许多常规检测方法未提供的关于免疫质量和持续时间的信息。

尽管本文中呈现的实施方案通常集中于用于检测传染病抗原的双多重测定，但应当理解，也可以检测其他抗原。例如，可以检测针对癌症抗原的抗体以诊断癌症、癌症的进展或缓解、对癌症的免疫应答的细节或对癌症的治疗的反应。作为另一个示例，可以检测针对自身抗原的自身抗体以诊断自身免疫性疾病、自身免疫应答的细节或对自身免疫性疾病的治疗的反应。抗体可类似地用于检测免疫调节治疗的不良反应，例如在接受检查点阻断抑制剂的癌症患者中形成的自身抗体。作为另一个示例，可以检测针对变应原的抗体，特别是IgE同种型的抗体，以诊断对治疗的过敏或反应，例如耐受性的产生。作为又一个示例，可以检测针对用于移植的器官和组织的抗体，以确定移植的适用性、排斥相关免疫应答的产生(可能在这种应答导致实际排斥之前)，或对抗排斥治疗的反应，例如产生耐受性的产生。在每种情况下可以选择抗原的合适的单一生物源。例如，病毒、细菌、真菌、寄生虫、肿瘤、癌细胞、变应原、自体组织、移植器官或疫苗抗原或其他疫苗组分可以是单一的生物源。在其他测定中，进行一次检测来自多种生物源的抗原的单一测定可能是有益的。

从双多重测定获得的数据点的类型的总数可以大于使用相同大小的测试样品通过单独的ELISA或LFA评价一些不同抗原和免疫球蛋白同种型组合所获得的数量，因为适合于本公开内容的双多重测定的测试样品大小可能太小以至于不允许对所有抗原和免疫球蛋白同种型组合进行对应的单独ELISA或LFA。

关于每种类型的数据点或测试样品特性的信息可能具有至少与通过单独的ELISA或LFA评价每种不同抗原和免疫球蛋白同种型组合获得的预测值相同或更好的预测值。

如本文所述的双多重测定的另一个潜在益处是使用多种类型的数据点来确定测试样品特性可能增加测定特异性，而无需相应地牺牲灵敏度。特异性是正确识别的阳性测试样品的数量的度量。评估更多类型的数据点增加了测定将正确识别真实阳性的概率，从而增强了特异性。灵敏度是正确识别的阴性测试样品的数量的度量。通常，测定识别真实阳性结果的最大数量的能力是以假阴性结果数量增加为代价的。换句话说，特异性的增加通常导致灵敏度的降低。然而，在本文公开的方法中，单独地确定了针对多种类型的数据点中的每一种的阳性阈值。因此，与不以多重方式操作的许多常规测定不同，本文描述的双多重测定提供了优异的灵敏度和优异的特异性。

与传统方法相比，本公开内容的一些双多重测定还可以通过进行单次测定而不是多次测定来评估针对多种病原体的各种免疫球蛋白同种型或抗体的存在来减少确定测试样品特性的时间或成本。

此外，与常规测定相比，在本公开内容的一些双多重测定中使用小体积测试样品的能力可促进更频繁和更低侵入性的样品采集。使用小体积的测试样品，特别是亚微升的测试样品也有助于将测定调整为直接面向消费者的应用和非医疗环境中的样品采集。

现在参考图1-2中呈现的实施方案(其可以与本公开内容的所有其他方面组合)，图1提供了根据本公开内容的双多重测定100的流程图。图2提供了在图1的双多重测定中使用或由其创建的组合物的示意图。尽管图1-2的实施方案使用三种抗原并检测三种免疫球蛋白同种型以获得九种类型的数据点，但是该实施方案可以容易地使用本公开内容的教导来适配为使用少至两种抗原来检测少至两种免疫球蛋白同种型以获得四种类型的数据点，或检测更多不同的抗原或免疫球蛋白同种型以获得更多类型的数据点。

如本文所用，术语“抗原”是指能够触发受试者的免疫应答的蛋白质多肽、肽、DNA、RNA、多核酸、核酸或变应原。抗原可以与致病因子(例如细菌、病毒或真菌)相关联，或者抗原可以是能够触发受试者的过敏或自身免疫反应的蛋白质或肽。

如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”是可互换的，并且是指在宿主受试者体内产生或通过组织培养方法开发以对靶抗原具有亲和力的免疫蛋白。抗体或免疫球蛋白被称为“针对/抗”或“结合”与其具有亲和力的抗原。免疫球蛋白(Ig)有多种同种型，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。某些同种型进一步分为亚型。例如，IgG同种型包括亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。如本文所用，术语“同种型”包括同种型和同种型的亚型。

如本文所用，术语“表位”是指与抗体结合的任何抗原的部分。一种抗原可包括多个表位，针对同一抗原的不同抗体可结合该抗原的相同或不同表位。虽然本文的讨论集中于使用不同抗原的双多重测定，但当获得对表位而不是整个抗原特异的数据点类型有用时，也可以使用相同抗原的两个或更多个不同表位进行类似的测定。

如本文所用，术语“测试样品”是指待针对结合一种或多种靶抗原的免疫球蛋白的存在进行测定的样品。测试样品为来自受试者的生物样品。测试样品的示例包括但不限于全血、血清、血浆、鼻分泌物、痰、支气管灌洗液、尿液、粪便、唾液、汗液和具有膜免疫球蛋白的细胞(例如记忆B细胞)。

如本文所用，术语“约”是指指示范围、值或结构的±20％，除非另有说明。

应当理解，本文所用术语“一个”和“一种”是指所枚举的组分的“一个或多个/一种或多种”。应理解替代物(例如，“或”)的使用是指替代物的一种、两种或其任何组合。

如本文所用，“测定”有时也可称为“测试”。

图1的双多重测定100检测测试样品中的测试抗体。在步骤110中，将来自受试者的测试样品在允许测试样品中的测试抗体特异性结合可识别标记的微颗粒上的测试抗体与之具有亲和力的任何抗原以形成微颗粒-免疫球蛋白复合物的条件下与至少两种类型的可识别标记的微颗粒(每种微颗粒具有不同的缀合抗原)组合。

在一些实施方案中，将可识别标记的微颗粒与测试样品组合一段时间，以促进微颗粒-免疫球蛋白复合物的形成。例如，步骤110的时间段可以是1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟或这些时间中的任一时间之间的时间间隔。

在一些实施方案中，测试样品是来自受试者的全血、血清、血浆、间质液、鼻分泌物、痰、支气管灌洗液、尿液、粪便、唾液或汗液。在某些实施方案中，测试样品是全血、血清或血浆。测试样品的体积可为0.1μl或更大，例如0.1-0.5μl、0.1-0.7μl、0.1-0.9μl、0.1-2.0μL、0.1-3.0μL、0.1-5.0μL、0.1-10.0μL、0.1-15.0μL或0.1-20.0μL的体积。在一些实施方案中，生物样品体积为0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1.0μl、1.1μl、1.2μl、1.3μl、1.4μl、1.5μl、1.6μl、1.7μl、1.8μl、1.9μl、2.0μl、2.1μl、2.2μl、2.3μl、2.4μl、2.5μl、2.6μl、2.7μl、2.8μl、2.9μl、3.0μl、3.1μl、3.2μl、3.3μl、3.4μl、3.5μl、3.6μl、3.7μl、3.8μl、3.9μl、4.0μl、4.1μl、4.2μl、4.3μl、4.4μl、4.5μl、4.6μl、4.7μl、4.8μl、4.9μl、5.0μl、5.5μl、10μl、10.5μl、11μl、11.5μl、12μl、12.5μl、13μl、13.5μl、14μl、14.5μl、15μl、15.5μl、16μl、16.5μl、17μl、17.5μl、18μl、18.5μl、19μl、19.5μl或20μl。测试样品可不作改变地使用，或在采集过程中可将收集瓶中存在的诸如稳定剂的组分与测试样品混合。在采集过程中组分与测试样品混合的情况下，测试样品体积是实际从受试者处获得的体积，而不是采集过程中与组分混合后的体积。在这种情况下，可通过从这样混合后存在的体积中减去估计在采集过程中与样品混合的组分所贡献的任何体积来估计测试样品体积。

在一些实施方案中，在测定之前稀释测试样品。例如，测试样品可以以1:40、1:30、1:20、1:10、1:5、1:2或1:1稀释。用于样品稀释的适当缓冲液在本领域中是众所周知的。在一些实施方案中，用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液稀释测试样品。测试样品体积不包括任何稀释剂体积。

测试样品可在从受试者中采集测试样品后立即、约5分钟内、约10分钟内、约30分钟内、约60分钟内、约2小时内、约12小时内、约24小时内、约48小时内或这些时间点中的约任一时间点之间的时间间隔内用于双多重测定的步骤110中。可向测试样品中加入适当的稳定剂或防腐剂组分，特别是如果在双多重测定的步骤110中的采集和使用之间将需要更长的时间段时。如果需要，可冷冻测试样品。

测试样品也可能来自直接从患者获得的样品的处理。例如，如果测试样品为血浆，则可通过离心直接从患者获得的全血样品来获得。

可使用任何合适的方法和容器采集测试样品。例如，全血、血清或血浆可通过静脉穿刺在真空管中采集。全血、血清或血浆也可通过手指针刺和毛细血管作用装置采集。全血、血清、血浆或间质液可以使用替代的部位针刺(例如通常用于血糖监测的手臂针刺)和毛细血管作用装置采集。受试者分泌或排出的样品可简单地使用标准实验室工艺和设备采集。可使用支气管镜采集支气管肺泡灌洗样品。在支气管肺泡灌洗液的有限情况下，测试样品体积可包括引入气道中的液体，以获得测试样品。

可在与可识别标记的微颗粒组合前稀释测试样品。在一些实施方案中，可将其稀释至20-50μl的体积。

步骤110中使用的微颗粒可以包括图2所示的微颗粒200。微颗粒200可以具有用于双多重测定100的任何合适的尺寸和形状，并且可以具有微米或纳米尺度的横截面尺寸。微颗粒也可称为珠子。在某些实施方案中，微颗粒200具有长度为0.001μm至1000μm、0.01μm至100μm、0.1μm至50μm、0.1μm至10μm、1μm至10μm、1μm至6μm、1μm至5μm或1μm至3μm的横截面。在某些实施方案中，微颗粒是球形或近似球形的，在这种情况下，横截面可以是直径横截面，并且微颗粒可以被称为微球。微颗粒具有可与分子附着的表面。这种附着的分子被称为与微颗粒缀合。

如本文所用，术语“可识别标记”是指具有允许区分不同类型的微颗粒或分子的化学或物理特征的微颗粒或分子。例如，给定类型的每个可识别标记的微颗粒可与不同类型的可识别标记的微颗粒区分开来。可使用任何适当的可识别标记，包括尺寸、磁特性、荧光特性(例如激发或发射波长或强度，例如使用紫外激发或紫光激发)和金属同位素特性。可识别的标记可以是微颗粒或分子本身的特性，或其可以由标记与微颗粒或分子的缀合而产生。具有与其结合的不同抗原的每种不同类型的微颗粒具有不同和明显的可识别标记。

在图2所示的实施方案中，示出了三种类型的可识别标记的微颗粒，200a类型、200b类型和200c类型。可识别标记的200a类型微颗粒具有与可识别标记的200b类型微颗粒和可识别标记的200c类型微颗粒不同的可识别标记。可识别标记的200b和200c类型微颗粒类似地具有不同和明显的可识别标记。

每种类型的可识别标记的微颗粒可以具有抗原210附着在其上的表面。在一些实施方案中，每种类型的可识别标记的微颗粒可具有附着的不同抗原。例如，图2中不同类型的可识别标记的微颗粒200a、200b和200c各自分别具有不同类型的抗原210a、210b和210c。在一些实施方案中，诸如图2所示的实施方案中，每种类型的可识别标记的微颗粒仅具有附着的一种不同的抗原。

抗原210可以直接地或通过附着到表面的肽或多肽缀合到可识别标记的微颗粒200的表面上。抗原210可以通过任何类型的结合相互作用(包括离子键合、氢键合、共价键合、范德华和亲水/疏水相互作用)缀合到表面。每个可识别标记的微颗粒可与其抗原的多个拷贝缀合。可缀合至微颗粒200的抗原210的类型包括多肽、蛋白质和核酸。

在一些实施方案中，用于可识别标记的微颗粒200的不同和明显的标记可通过在抗原210缀合至微颗粒200之前或之后附着到抗原210而缀合至微颗粒。

在双多重测定步骤110中，将具有至少两种不同抗原的至少两种类型的可识别标记的微颗粒200与测试样品组合。在一些实施方案中，在双多重测定步骤110中，将3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至20、2至50、2至100、2至500种类型的可识别标记的微颗粒200与测试样品组合。在一些实施方案中，在双多重测定步骤110中，将2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至20、2至50、2至100、2至500种不同抗原210缀合至与测试样品组合的可识别标记的微颗粒200。

在双多重测定步骤110期间，测试样品中针对可识别标记的微颗粒上的抗原的测试抗体220与该抗原特异性结合，以形成微颗粒-免疫球蛋白复合物230。

测试样品中的测试抗体220可以仅具有一种同种型或具有多种同种型。在图2所示的实施方案中，测试抗体220包括IgG 220a、IgM 220b和IgA 220c。其他可能的同种型(未示出)包括IgE和IgD。微颗粒免疫球蛋白复合物230均含有与相应抗原210结合的三种同种型的测试抗体220。然而，如果测试样品不包含其他同种型，则微颗粒免疫球蛋白复合物230可能仅含有一种同种型的测试抗体220。例如，在受试者对含有抗原的感染原的免疫应答早期，测试样品可能仅含有IgM同种型，因为该同种型可由B细胞表达，而无需同种型转换。

取决于抗原210，可能的是一种类型的可识别标记的微颗粒可能形成仅含有一种抗体同种型的微颗粒-免疫球蛋白复合物230，而具有不同抗原的不同类型的可识别标记的微颗粒可形成含有额外抗体同种型的微颗粒-免疫球蛋白复合物。例如，如果第一种类型的可识别标记的微颗粒上的抗原是受试者仅最近暴露于并且因此仅产生针对其的IgM的感染原特有的，而第二种类型的可识别标记的微颗粒上的抗原对于最近的感染原和受试者过去暴露较长时间的另一种感染原是共同的(从而允许B细胞同种型转换)，可能导致这种情况。

通常，每个可识别标记的微颗粒200含有足够拷贝数的抗原210，以允许在形成的大多数微颗粒-免疫球蛋白复合物230中也存在测试样品中发现的针对抗原210的所有同种型的测试抗体220。

在步骤110完成后，在双多重测定的一些实施方案中，在基本上不破坏复合物的条件下洗涤微颗粒-免疫球蛋白复合物。例如，微颗粒-免疫球蛋白复合物可以用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。这可能从微颗粒-免疫球蛋白复合物中去除未结合的测试样品组分，然后可以将微颗粒-免疫球蛋白复合物置于适当的液体(例如额外的PBS)中以维持复合物。

在双多重测定100的其他实施方案中，双多重测定在不洗涤的情况下直接从步骤110进行至步骤120。

在步骤120中，将微颗粒-免疫球蛋白复合物与针对两种不同Ig同种型的抗Ig同种型抗体在允许抗Ig同种型抗体特异性结合微颗粒-免疫球蛋白复合物中抗Ig同种型抗体对其具有亲和力的测试抗体以足以形成或允许形成微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物的条件下组合。

抗Ig同种型抗体可以在单个步骤中作为抗体的混合物、在多个连续步骤中作为多种混合物或在连续步骤中每次一个地与微颗粒-免疫球蛋白复合物组合。例如，微颗粒-免疫球蛋白复合物可以首先与抗IgG抗体组合，然后与抗IgM抗体组合，然后与抗IgA抗体组合，等等，直到所有所需的抗Ig同种型抗体已与微颗粒-免疫球蛋白复合物组合。在连续步骤的情况下，在一些实施方案中，可以在步骤之间洗涤微颗粒-免疫球蛋白复合物。

在一些实施方案中，将微颗粒-免疫球蛋白复合物与抗Ig同种型抗体(作为混合物或如果使用连续步骤则在每个步骤中)组合一段时间以促进微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物的形成。例如，步骤120的时间段可以是1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟或这些时间中的任一时间之间的时间间隔。

在图2所示的实施方案中，提供了三种不同类型的抗Ig同种型抗体240。抗Ig抗体240a特异性结合IgM抗体。抗Ig抗体240b特异性结合IgG抗体。抗Ig抗体240c特异性结合IgA抗体。然而，步骤120的抗Ig同种型抗体240可针对至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种免疫球蛋白同种型或亚型。

示例性微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物250也在图2中示出。在这些示例中，对于步骤110中使用的每个可识别标记的微颗粒200，形成了微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物250，该微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物250也含有三种同种型的测试抗体220和三种不同的抗Ig抗体240c。然而，取决于抗原210，可能的是一种类型的可识别标记的微颗粒可能形成仅含有一种测试抗体同种型和因此仅一种类型的抗Ig抗体的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物250，而具有不同抗原的不同类型的可识别标记的微颗粒可形成含有额外测试抗体同种型和因此额外抗Ig抗体的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物。

通常，每个可识别标记的微颗粒200含有足够拷贝数的抗原210，以允许测试样品中发现的针对抗原210的所有同种型的测试抗体220和特异性结合的抗Ig同种型抗体也存在于形成的大多数微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物250中。

抗Ig同种型抗体240在步骤120中在使用前可检测地标记。如本文所用，术语“可检测标记”是指具有允许检测颗粒或分子的存在或数量的化学或物理特征的颗粒或分子。可检测标记包括但不限于荧光特性、发光特性和比色特性。可区分的标记可以是例如特定的荧光强度、频率或频率的组合。具有荧光特性的标记的实例是绿色荧光蛋白、荧光素和藻红蛋白。每种不同类型的抗Ig同种型抗体具有不同和明显的可检测标记，从而允许区分抗体。

在图2所示的实施方案中，示出了三种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体240：240a类型、240b类型和240c类型。可检测标记的抗Ig同种型抗体240a类型具有与可检测标记的抗Ig同种型抗体240b类型和抗Ig同种型抗体240c类型不同的可检测标记。可检测标记的抗Ig同种型抗体200b类型和200c类型类似地具有不同和明显的可识别标记。

在步骤120完成后，在一些实施方案中，在基本上不破坏复合物的条件下洗涤微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物。例如，微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物可以用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。这可以从微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物中去除未结合的抗Ig同种型抗体，然后可将微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物放置在适当的液体(例如额外的PBS)中以维持复合物或允许在步骤130中进行检测。

在双多重测定100的其他实施方案中，双多重测定在不洗涤的情况下直接从步骤120进行至步骤130。

在步骤130中，将微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物置于检测器中，对于单个微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物，该检测器通过检测可识别标记来检测微颗粒类型，并且通过检测可检测标记来检测抗Ig同种型，以生成检测数据。每个检测到的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物中可识别标记的微颗粒的身份以及针对所测定的每个同种型的抗Ig同种型抗体的存在或不存在或更典型地其数量可以针对每个复合物单独收集或储存，或基于可识别标记的微颗粒类型收集或储存在聚集体中。可替代地或另外地，在每个检测到的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物中抗Ig同种型抗体的身份以及用于双多重测定中的每种类型的可识别标记的微颗粒的存在或不存在或更典型地其数量可以针对每个复合物单独收集或储存，或基于抗Ig同种型抗体类型收集或储存在聚集体中。在此上下文中，收集和存储涉及使用与检测器或检测器的一部分通信的处理器或存储器。

在某些实施方案中，对微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物进行分类或计数。在一些实施方案中，检测器是流式细胞仪。例如，可以基于每种类型的可识别标记的微颗粒的区分特性来区分每种类型的可识别标记的微颗粒，并且与给定类型的可识别标记的微颗粒的复合物中的一种或多种抗Ig同种型抗体可以基于其可检测的标记来识别。在一些实施方案中，通过荧光特性可识别地标记微颗粒，并且抗Ig同种型抗体被荧光标记，以及使用多色流式细胞术进行分析。在一些实施方案中，通过紫外激发或紫光激发的荧光特性可识别地标记微颗粒，抗Ig同种型抗体被荧光标记，以及使用多色流式细胞术进行分析。

在一些实施方案中，通过金属同位素可识别地标记微颗粒，并且抗Ig同种型抗体是金属同位素标记的，并且检测器是多金属同位素质谱流式细胞仪。

在一些实施方案中，检测器使用质谱流式细胞术方法，例如

(Fluidigm，California)。

也称为飞行时间细胞术，是一种基于电感耦合等离子体质谱和飞行时间质谱的技术。在该技术中，同位素纯的元素(例如重金属)与抗体缀合。然后通过飞行时间质谱仪分析独特的质量特征。

如本文所用，术语“对照”是指参考标准品。已知阳性对照提供阳性测试结果。已知阴性对照提供阴性测试结果。阳性对照样品和阴性对照样品、微颗粒和抗Ig同种型抗体也可包括在双多重测定中，并酌情在步骤130或单独的双多重测定中进行检测，以提供额外的检测数据。

在步骤140中，组合或分析检测数据以生成不同抗原和抗体同种型的至少四种不同类型的数据点。组合或分析可通过配备有检测数据的适当编程的处理器执行。数据点可以存储在与处理器相关联的存储器中。

用于不同抗原的不同的可识别标记的微颗粒和可检测标记的抗Ig同种型抗体的组合不仅允许检测测试样品中存在的与一个或多个靶抗原结合的测试抗体，并且还允许检测存在的那些测试抗体的同种型或亚型。此外，本公开内容的方法不仅检测免疫球蛋白的存在，而且提供关于与每种测试抗原结合的每种同种型或亚型的免疫球蛋白的水平的定量或半定量数据，作为单独的数据点。

抗原和免疫球蛋白同种型的每种可能组合产生不同类型的数据点。在其最简单的形式中，双多重测定检测针对至少两种不同抗原的测试抗体，并且其同时也检测测试抗体的至少两种不同的免疫球蛋白同种型。这种双多重测定提供了关于测试样品中存在的测试抗体的总共四种类型的数据点。在示例性的更复杂的变型中，诸如使用图2的材料的双多重测定中，该测定可以检测针对三种不同抗原的测试抗体，而同时检测抗体的至少三种不同免疫球蛋白同种型。这种双多重测定提供了关于测试样品中存在的测试抗体的总共9种类型的数据点。

一般来说，可获得的数据点的类型的数量＝可识别的微颗粒上不同抗原的数量×检测到的不同免疫球蛋白同种型的数量。数据点类型的最大数量主要受限于检测器的检测能力，并且可以相当高，例如50、100或1000。尽管双多重测定可生成与每个可获得的数据点相对应的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物，但该测定不一定必须在步骤130中检测每个微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物，或在步骤140中提供每个此类复合物的数据点。例如，在一些情况下，某些抗原-抗体同种型组合可能根本没有价值，并且可以是未检测到的或不用于生成数据点。这可能提高感兴趣的数据点类型的准确性，或允许更快的测定结果。

在一些实施方案中，步骤130和140可以通过检测器或检测器以及与检测器通信的处理器和存储器同时、几乎同时或以不可解析的方式执行。

在一些特定实施方案中，在步骤130或组合步骤130和140中，每种类型的可识别标记的微颗粒均根据其独特的特征(例如尺寸或荧光强度或重金属同位素)进行区分和门控，并测量多个荧光色素的荧光强度(FI)或微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物的重金属强度(HMI)，并且其与针对相同抗原的相应同种型的测试抗体的浓度成比例相关。

步骤110至140的时间段可以是约5分钟、约10分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或在这些时间点的约任一时间点之间的时间间隔内。在特定实施方案中，步骤110至140的时间段可以为1小时至2小时或30分钟至3小时。

接下来，在步骤150中，使用数据点来确定测试样品特性。可通过对数据点进行进一步的数学分析来确定测试样品特性，例如与阈值进行比较以确定阳性或阴性状态。

例如，如果测试样品来自可能已暴露于感染性疾病的受试者，则可对数据点进行进一步的数学分析，以确定数据点是否与实际已暴露于该疾病的受试者一致。其他相关测试样品特性包括受试者是否对疾病产生了稳健的免疫应答，或受试者是否对疾病产生了保护性免疫应答。

作为另一个示例，测试样品特性可以是受试者是否含有自身抗体，或者自身抗体是否以可能与有害的自身免疫应答相关的量和类型存在。

也可确定本文所述的其它测试样品特性。

关于测试样品特性的双多重测定准确度，本文中可以使用几个度量作为描述符，包括“灵敏度”、“特异性”、“一致性”、“阳性预测值”、“阴性预测值”、“假阳性率”和“假阴性率”。使用给定测定确定的简单阳性或阴性测试样品特性的这些度量可通过以下公式定义为“真阳性”(TP)、“真阴性”(TN)、“假阳性”(FP)和“假阴性”(FN)病例数的函数：

灵敏度＝TP/(TP+FN)；

特异性＝TN/(TN+FP)；

一致性(相关性)＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)，

阳性预测值＝TP/(TP+FP)；

阴性预测值＝FN/(FN+TN)；

假阳性率＝FP/(TP+FP)；和

假阴性率＝FN/(TN+FN)。

如本文所用，“预测值”包括阳性预测值和阴性预测值。

可选择在双多重测定中可获得或在进一步的数学分析中使用的数据点的数量和类型，使得可以以至少最小的准确度确定测试样品特性。在一些实施方案中，测试样品可以小于使用非多重ELISA或LFA以及相同类型的测试样品、抗原和免疫球蛋白同种型检测方法在确定测试样品特性时提供相同准确度或具有在确定测试样品特性时提供相同准确度的能力的情况下获得相同数量的类型的数据点所需的测试样品。

在另一个示例中，可以选择数据点的数量和类型，使得双多重测定具有至少最小预测值。在一些实施方案中，该最小准确度可至少与使用相同类型的测试样品、抗原和免疫球蛋白同种型检测方法的非多重ELISA或LFA提供的准确度一样高。在测试样品特性为简单阳性或阴性的一些示例中，本公开内容的双多重测定可具有比相应组的ELISA或LFA或其中使用单一类型数据点确定测试样品特性的其他相应测定高10倍或100倍的特异性。一般来说，与仅使用单一类型数据点确定测试样品特性的相应测定相比，测试样品特性的特异性增加，而灵敏度未降低。

还可以使用数据点来确定更复杂的测试样品特性，例如针对不同抗原的样品抗体的比率、样品抗体的同种型的比率以及更复杂的特性，例如组合的数据点的比率。

可以使用步骤140中生成的所有数据点或比所有数据点少的一个或多个集合来确定样品测试特性。例如，通常仅使用由含有给定抗原的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物生成的一组数据点来确定与该给定抗原相对应的测试样品特性。作为另一个示例，可以仅使用满足准确度指标的给定阈值的数据点来确定测试样品特性。

尽管在一些实施方案中，在步骤150中仅确定单个测试样品特性，但在其他实施方案中，在步骤150中确定两个或更多个测试样品特性。如果在步骤150中确定了两个或更多个测试样品特性，则它们可以在一些实施方案中使用相同的数据点或在其他实施方案中使用不同的数据点集来确定。

例如，可使用相同的数据点集来确定测试样品对针对特定抗原的抗体是阳性还是阴性，并且作为单独的测试样品特性，还确定针对特定抗原的抗体同种型的相对量，针对特定抗原的普遍抗体同种型，自提供测试样品的受试者首次暴露于抗原以来的估计时间量，或如果再次暴露于抗原，提供测试样品的受试者是否可能产生有效的免疫应答。

在另一个示例中，针对给定抗原的IgG、IgA和IgM免疫球蛋白同种型的数据点均可用于确定测试样品对针对抗原的抗体是阳性还是阴性，但在一些实施方案中，只有IgA和IgG的数据点可用于确定如果再次暴露于抗原，提供测试样品的受试者是否可能产生有效的免疫应答。

在另一个示例中，针对给定变应原的多种抗体同种型的数据点可用于确定受试者是否已经暴露于变应原，但只有IgE或IgE和其他特定同种型的组合可用于确定患者是否可能对变应原具有有害的过敏反应。

此外，可依赖于其他测试样品特性确定测试样品特性。例如，对应于所有针对相同抗原的不同抗体同种型的数据点可用于通过将数据点相关联来确定该抗原的阳性或阴性状态的测试样品特性。双多重测定中每种抗原的阳性和阴性状态可确定为单独的测试样品特性，然后那些测试样品特性可用于确定受试者是否具有针对所有抗原的共同来源(例如表达所有抗原的病毒或肿瘤)的抗体的最终测试样品特性。

在该方法的每次迭代中，还可针对阳性和阴性状态计算各种准确度指标并用于生成最终准确度数据，用于最终阳性或阴性暴露确定。计算的准确度指标为一致性结果、不一致结果、相对灵敏度、相对特异性、一致性、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率(100％-阳性预测值)和假阴性率(100％阴性预测值)。准确度指标可用于更复杂的数学分析，例如计算中数据点的加权或数据点的类型。它们也可用于从任何测试样品特性确定中排除不符合准确度阈值的某些数据点。最后，可进一步处理准确度指标，以得出从数据点或其他测试样品特性计算的测试样品特性的准确度指标。

数据点的相关性可能涉及多种类型的数学分析中的任何一种，这些数学分析可能考虑到数据点的原始数据、该数据点的简单阳性或阴性指标以及一个或多个准确度指标。

在一个实施方案中，数据点可以反映针对第一抗原的免疫球蛋白同种型。基于数据点的一致性，可认为测试样品对第一抗原是阳性或阴性的。例如，如果测定了三种免疫球蛋白同种型，则基于每个免疫球蛋白同种型的阳性或阴性状态的简单一致性，可认为测试样品对第一抗原是阳性或阴性的。因此，如果免疫球蛋白同种型中的两种的数据点为阴性，则认为测试样品对于针对第一抗原的抗体为阴性。

还可以进行更复杂的分析，其中例如一种免疫球蛋白同种型的结果比另一种免疫球蛋白同种型的结果加权更重。可以预先设定加权，或可以调整加权，以反映每个同种型的数据点的相对准确度。这种加权可在偶数数量的数据点或数据点类型的一致性确定中特别有用。

使用样品示例性实施方案，可认为测试样品对于暴露于所测定的多种抗原的来源为阳性或阴性。例如，如果存在第二种抗原，则可确定对于该抗原的阳性或阴性状态。如果测试样品对于针对任一抗原的抗体呈阳性，则可认为测试样品对于暴露于两种抗原的来源为总体阳性或阴性。在另一种变型中，可对第三种抗原进行测定，并且基于抗原特异性结果的一致性，可认为样品对于暴露于所有三种抗原的来源为总体阳性或阴性。也可使用与上文关于单个抗原的免疫球蛋白同种型特异性结果所描述的那些相似的更复杂的分析。

确定测试样品特性可以通过提供检测数据或数据点的适当编程的处理器来执行。测试样品特性可以存储在与处理器相关联的存储器中。

在步骤160中，其在一些实施方案中可以省略，使用在步骤150中确定的至少一个测试样品特性来诊断受试者。例如，受试者可能被诊断为患有感染性疾病、已暴露于感染性疾病、对感染性疾病产生了稳健的免疫应答或对感染性疾病产生了保护性免疫应答。本文所述的其他诊断也可以使用测试样品特性进行。

在另一个示例中，诊断可以涉及在同一时间或不同时间从受试者采集的多个测试样品的分析。这种分析可能涉及使用适当编程的处理器的进一步数学分析。例如，诊断可涉及确定患者中针对抗原的测试抗体的持续时间或确定患者中随时间进程的针对抗原的测试抗体的同种型或量。

在一些实施方案中，本公开内容提供试剂盒以同时检测针对多种不同抗原的多种免疫球蛋白同种型，从而为不同抗原和免疫球蛋白同种型组合提供不同类型的数据点。此类试剂盒可包含如上文在双多重测定的背景下描述和更具体地如图2所示的材料。在一些实施方案中，试剂盒包括至少两种类型的可识别标记的微颗粒。在一些实施方案中，每种类型的可识别标记的微颗粒可缀合到不同的抗原。不同的抗原可以包括在试剂盒中或由用户提供。用于这种缀合的试剂可以在试剂盒中提供。在其他实施方案中，每种类型的可识别标记的微颗粒缀合到不同的抗原。该试剂盒还包括至少两种针对至少两种免疫球蛋白同种型的抗Ig同种型抗体。在一些实施方案中，每种类型的抗Ig同种型抗体具有不同的可检测标记。在其他实施方案中，每种类型的抗Ig同种型抗体可缀合至可检测标记。可检测标记可以包括在试剂盒中或由用户提供。用于这种缀合的试剂可以在试剂盒中提供。

在一些实施方案中，试剂盒还可包括阳性或阴性对照样品、手指针刺针或刀片、样品采集容器、用于返回用于分析的样品的用品，诸如适于快递员运输的邮寄试剂盒或容器，使用说明或其任何组合。

在特定实施方案中，双多重测定检测受试者SARS-CoV-2的暴露、对SARS-CoV-2产生稳健的免疫应答或对SARS-CoV-2产生保护性免疫应答。此处未特别讨论的该实施方案的方面可以以本说明书中描述的任何方式。在SARS-CoV-2测定中，抗原包括SARS-CoV-2的至少两种抗原。更具体地说，抗原是S1、RBD和NP。可识别标记的微颗粒为荧光标记的微球。抗Ig同种型抗体为抗IgG、抗IgM和抗IgA，并进行荧光标记。检测使用流式细胞仪，其能够检测微球和抗Ig抗体上所有荧光标记的荧光。分别针对每个可识别标记的微球的独特荧光特征对检测期间获得的荧光数据进行门控，从而将数据限制在与一种类型的可识别标记的微球和从而单一抗原和针对该抗原的测试抗体相关的数据。在对应于每种类型的可识别标记微球的门控数据集中，识别与每种类型的抗Ig同种型抗体复合物相关的荧光强度，并用于生成与特定类型的可识别标记的微球和抗Ig同种型和从而特定抗原和免疫球蛋白同种型相关的数据点。然后将数据点与该数据点类型的阈值进行比较，并认为测试样品对具有特定免疫球蛋白类型的针对特定抗原的测试抗体为阳性或阴性。

然后将数据点与针对三种抗原的相同抗体同种型的数据点相关联，并基于结果的一致性，认为测试样品对针对SARS-CoV-2的该同种型的抗体为阳性或阴性。例如，如果测试样品的对于S1 IgG的数据点为阴性，对于RBD IgG的数据点为阴性，和对于NP IgG的数据点为阳性，则由于一致性，将认为测试样品对于针对SARS-CoV-2的IgG抗体为阴性。

然后将测试样品的对于三种同种型抗原的测试抗体的阳性或阴性状态与测试样品的对于受试者先前暴露于SARS-CoV-2的总体阳性或阴性状态相关联。例如，如果测试样品对针对SARS-CoV-2的三种抗体同种型中的任何一种为阳性，则可将测试样品指定为对于SARS-CoV-2抗体为总体阳性，表明患者暴露于SARS-CoV-2。

对SARS-CoV-2的稳健免疫应答或针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答的阳性或阴性状态可以以相似的方式确定，但与单纯IgM抗体相比，对于IgG和IgA抗体具有更高的所需的抗体水平阈值量或更高的要求。

该SARS-CoV-2测定中的抗体水平可使用在不同时间获得的样品上的至少两次测定进行比较，以确定受试者是否正在产生更成熟或更稳健的免疫应答，通常是由于总体IgM抗体水平的降低、总体IgG或IgA水平或IgG或IgA水平相对于IgM水平的升高或针对其他抗原的抗体的产生。

与传统ELISA相比，该测定的灵敏度提高，因为虽然一种免疫球蛋白同种型的水平对于一种抗原可能较低，但该同种型的水平对于另两种抗原可能较高，从而降低了假阴性的机会。

在该方法的每次迭代中，还针对阳性和阴性状态计算各种准确度指标并用于生成最终准确度数据，用于最终阳性或阴性暴露确定。计算的准确度指标为一致性结果、不一致结果、相对灵敏度、相对特异性、一致性、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率和假阴性率。

在相关的特定实施方案中，提供了用于检测暴露于SARS-CoV-2的试剂盒，其包括用第一种不同的荧光标记进行标记并与SARS-CoV-2S1抗原缀合的第一类型的微球、用第二种不同的荧光标记进行标记并与SARS-CoV-2RBD抗原缀合的第二类型的微球，以及用第三种不同的荧光标记进行标记的第三种类型的微球。该试剂盒还包括具有第四种不同的荧光标记的抗IgG抗体、具有第五种不同的荧光标记的抗IgA抗体和具有第六种不同的荧光标记的抗IgM抗体。该试剂盒可与测试样品一起使用以生成与针对每种抗原的每种抗体同种型的阳性或阴性状态相关的9种类型的数据点，表明提供测试样品的受试者是否暴露于SARS-CoV-2。

试剂盒还可包括洗涤液、缓冲液和样品采集工具。

在具体实施方案中，试剂盒可以包括：

·使用说明，包括对照制备的说明

·进行100次测试的试剂

ο试剂#1：SARS-CoV-2抗原包被的微球

ο试剂#2：样品稀释缓冲液

ο试剂#3：荧光标记的二抗

试剂盒中需要但未提供的组分包括：

·流式细胞仪

·标准洗涤缓冲液

·标准流式细胞术悬浮缓冲液

·微量滴定板

·移液器

·阳性和阴性对照样品

实施例

实施例1

同时检测针对单一抗原的多种免疫球蛋白同种型

将具有荧光特征的单个抗原缀合的微球(其中抗原为RBD)与测试样品共同孵育，从而允许样品中存在的免疫球蛋白与微球表面上的抗原结合。测试样品为来自SARS-CoV-2患者(n＝5，通过RT-PCR确认的阳性状态)或阴性对照患者(n＝5，在SARS-CoV-2出现前2年采集的样品)的血浆样品。

洗涤后，将微球依次与具有不同荧光色素的抗Ig同种型抗体孵育，形成微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物。进一步洗涤后，在多色流式细胞仪上采集微球。适当的流式细胞仪包括FACSLyric^TM或FACSCanto II^TM流式细胞术系统(Becton Dickinson，NewJersey)。此处使用FACSCanto II。数值测量为0至75,000单位范围内的MFI。

单个抗原缀合的微球通过其荧光特性进行门控，并测量每种类型的抗原-免疫球蛋白-荧光抗Ig同种型抗体复合物的荧光色素的荧光强度，并且其与针对相同抗原的其他Ig-同种型抗体复合物的荧光强度成比例相关。

结果见图3。显示了对应于各自响应于RBD SARS-CoV-2抗原产生的三种免疫球蛋白同种型的3份个体样品。这些结果证实，微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物如预期地在测定条件下形成，并可用于获得准确反映样品中测试抗体的预期的存在或不存在的荧光数据。

实施例2

针对SARS-COV-2暴露的双多重测定

受试者暴露于SARS-COV-2后，由于免疫应答，血液中可能出现抗SARS-COV-2抗体。通常IgM抗体可在暴露或症状出现后5～10天检测到，而IgG和IgA可在数天后检测到。

如本文所述的双多重测定可使用单一测试在同一孔中同时检测针对三种不同SARS-CoV-2抗原(RBD、S1和NP)的三种抗体同种型(IgM、IgG和IgA)的存在。结果通过流式细胞仪测量，并以每种抗体同种型和抗原组合的中位荧光强度(MFI，范围为0-262,144MFI)数据点表示。

所有外周血样品均在斯坦福大学使用静脉穿刺采集。在COVID-19大流行前2年收集了79份阴性样品，并从使用提交至RT-PCR检测的鼻咽拭子确认SARS-CoV-2感染后送交用于测试的患者中采集30份阳性样品。使用的30份阳性样品通过在斯坦福健康中心临床病毒学实验室(Stanford Health Center Clinical Virology Lab)使用的EUA批准的RT-PCR测试进行确认。从使用RT-PCT确认SARS-CoV-2感染的受试者中采集41份恢复期样品。

将血液采集在标准EDTA管中；分离血浆并等分用于测试。将可识别标记的微球的混合物与测试样品组合，从而允许测试样品中的测试抗体与微球表面上的SARS-CoV-2抗原结合。简而言之，向96孔板的每个测试孔中加入5μl微球混合物。然后，向每个孔中加入50μl稀释的测试样品，并混匀。将平板在室温下孵育30分钟，以形成微颗粒-免疫球蛋白复合物。用150μl PBS缓冲液洗涤复合物三次后，向每个孔中加入藻红蛋白(PE)-抗IgG抗体、别藻蓝蛋白(APC)-抗IgM抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)-抗IgA抗体的100μl混合物，以形成微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig-同种型复合物。用150μl PBS缓冲液洗涤复合物三次后，将复合物重悬于150μl PBS缓冲液中，并在BD FACSLyric^TM流式细胞仪上采集。

通过其独特的特征(尺寸或强度荧光)区分和门控每种类型的可识别标记的微球，并测量抗原-免疫球蛋白-荧光抗Ig同种型抗体复合物的多个荧光色素的荧光强度，并与针对相同抗原的相应Ig-同种型的浓度成比例相关。使用BD FACSuite^TM软件进行该分析，该软件要求每种类型的可识别标记的微球的至少25个微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物，并基于微球类型读取每个复合物群的PE、APC和FITS的荧光强度。

具体来说，荧光值测量为范围为0-250,000单位的平均荧光强度(MFI)。建立了基于已知阴性样品的平均值+3SD计算的针对每个抗原的每个免疫球蛋白的阈值MFI水平。

双多重测定提供了总共9个数据点——各自响应于三种SARS-CoV-2抗原(RBD、S1和NP)产生的3种免疫球蛋白同种型(IgM、IgG、IgA)的单个值。数值测量为范围为0至262,144单位的中位荧光强度(MFI)。建立了基于已知阴性样品的平均值+3SD计算的针对每个抗原的每个免疫球蛋白的阈值。

测试样品的数据点提供于表1-3。在表1-3中，NPA％表示阴性预测值，PPA％表示阳性预测值。

表1:阴性组的数据点

表2：阳性组的数据点

表3：阳性恢复组的数据点

对每种类型数据点的结果进行汇总，并计算灵敏度、特异性、一致性和预测值，如表4-12所示。表中的结果为平均值+3SD。

表4：S1 IgG

150份测试样品中有139份一致结果，和11份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：85.9％

特异性：98.7％

一致性(相关性)：0.927

阳性预测值：98.4％

阴性预测值：88.6％

假阳性率：1.6％

假阴性率：11.4％

表5：S1 IgM

150份测试样品中有101份一致结果，和49份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：32.4％

特异性：98.7％

一致性(相关性)：0.673

阳性预测值：95.8％

阴性预测值：61.9％

假阳性率：4.2％

假阴性率：38.1％.

表6：S1 IgA

150份测试样品中有125份一致结果，和25份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：67.6％

特异性：97.5％

一致性(相关性)：0.833

阳性预测值：96.0％

阴性预测值：77.0％

假阳性率：4.0％

假阴性率：23.0％

表7：RBD IgG

150份测试样品中有147份一致结果，和3份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：98.6％

特异性：97.5％

一致性(相关性)：0.980

阳性预测值：97.2％

阴性预测值：98.7％

假阳性率：2.8％

假阴性率：1.3％

表8：RBD IgM

150份测试样品中有138份一致结果，和12份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：87.3％

特异性：96.2％

一致性(相关性)：0.920

阳性预测值：95.4％

阴性预测值：89.4％

假阳性率：4.6％

假阴性率：10.6％

表9：RBD IgA

150份测试样品中有142份一致结果，和8份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：91.5％

特异性：97.5％

一致性(相关性)：0.947

阳性预测值：97.0％

阴性预测值：92.8％

假阳性率：3.0％

假阴性率：7.2％

表10：NP IgG

150份测试样品中有148份一致结果，和2份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：98.6％

特异性：98.7％

一致性(相关性)：0.987

阳性预测值：98.6％

阴性预测值：98.7％

假阳性率：1.4％

假阴性率：1.3％

表11:NP IgM

150份测试样品中有111份一致结果，和39份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：46.5％

特异性：98.7％

一致性(相关性)：0.740

阳性预测值：97.1％

阴性预测值：67.2％

假阳性率：2.9％

假阴性率：32.8％

表12：NP IgA

灵敏度：49.3％

特异性：96.2％

一致性(相关性)：0.740

阳性预测值：92.1％

阴性预测值：67.9％

假阳性率：7.9％

假阴性率：32.1％

进一步使用数据点确定测试样品对给定同种型的特定抗SARS-CoV-2抗体是否为阳性或阴性。该测定基于三种单独抗原的数据点的一致性。如果两种抗原的特定同种型结果为阳性，则确定测试样品对于针对SARS-Co-V2的该同种型的抗体为阳性。如果两种抗原的特定同种型结果为阴性，则确定测试样品对于针对SARS-Co-V2的该同种型的抗体为阴性。因此，针对三种单独病毒抗原的免疫球蛋白同种型水平的测量增强了特异性，因为推测针对三种抗原的交叉反应的机会小于一种抗原。由于虽然免疫球蛋白同种型水平对于一种抗原可能较低，但这些水平对于其他两种抗原可能较高，因此增强了灵敏度，从而降低了假阴性的机会。该方法的优点是允许同时增强特异性和灵敏度，而不是以特异性或灵敏度中的一种为代价。

用于COVID-19的双多重测定的总体特异性和灵敏度的评价显示于表13。

表13：SARS-CoV-2暴露

150份测试样品中有150份一致结果，和1份不一致结果。其他准确度指标如下：

灵敏度：98.6％

特异性：100.0％

一致性(相关性)：0.993

阳性预测值：100.0％

阴性预测值：98.8％

假阳性率：0.0％

假阴性率：1.3％

双多重测定的总体灵敏度较高，因为该测定测量了针对三种不同抗原的三种不同免疫球蛋白同种型的水平。通过要求针对至少两种抗原中的每一种的至少一种免疫球蛋白同种型的MFI值高于截断值以识别任何个体患者的结果为阳性，进一步提高了特异性。由于该方法的高灵敏度和特异性，因此无需模棱两可的范围。

为9种可能类型的数据点中的每一种建立了双多重测定的阴性对照。使用对于每种类型数据点具有<MFI阈值水平的50％的MFI结果的血清样品。使用对于每种类型数据点具有最低的可能MFI的样品。使用最少5份样品来创建合并液。小心混合样品，避免形成泡沫。从该血清合并液制备至少200μL的等分试样，并在-20℃或更低温度下冷冻储存。使用这些等分试样进行定期质控。使用Westgard规则确定对照范围并监测测定对照。解冻后，如果冷藏储存，等分试样可稳定储存1周。

还为9种可能类型的数据点中的每一种建立了双多重测定的阳性对照。合并9份可报告结果的每一种的具有>5倍截断值水平的MFI结果的血清样品。使用最少5份样品创建合并液。小心混合样品，避免形成泡沫。必要时，通过加入合并的阴性血清(对于合并标准见上文的阴性对照)稀释测定合并液，以获得9种类型数据点的每一种的阈值的3至20倍的MFI值。从该样品合并液制备至少200μL的等分试样，并在-20℃或更低温度下冷冻储存。使用Westgard规则建立对照范围并监测测定对照。解冻后，如果冷藏储存，等分试样可稳定1周。

基于标准操作方案和QC系统生产可识别标记的微球和测试缓冲液。

对微颗粒、抗原和二抗进行稳定性测试。下表1-4显示了稳定性测试的结果。基于这些结果，在4℃或-80℃下储存长达4个月后，未观察到活性损失。

实施例3

比较分析：与ELISA比较的双多重技术的特异性和灵敏度

ELISA是一种常用于检测和定量抗病毒抗体的基于平板的技术。该方法利用包被在塑料微量滴定板上的病毒蛋白抗原来捕获样品中的抗病毒抗体，该样品可能来源于许多体液，包括血液、血清和痰等。将样品与包被的抗原接触，以允许结合相关抗体，之后将平板洗涤数次。捕获的抗体通过与报告酶复合的第二物种特异性抗体检测，当与适当的底物一起提供时，该报告酶产生可测量的输出。

将实施例2的双多重测定的灵敏度和特异性与ELISA的灵敏度和特异性进行比较。

使用常规ELISA格式检测针对两种SARS-CoV-2抗原RBD和NP的Ig同种型(IgG、IgM和IgA)，其中不存在多重性，且每个样品中仅存在单一抗原和抗Ig同种型。结果示于表14。–组，n＝70，+组，n＝30。指示的百分比是结果的预测值。粗体和斜体表示不符合FDA紧急使用授权(EUA)要求的值。PPA表示阳性预测值，NPA表示阴性预测值。

表14：ELISA结果

如这些结果表明，基于ELISA的测试可能无法产生足够准确的结果，特别是对于暴露于SARS-CoV-2后不久可能存在的IgM抗体。

实施例2的结果以缩略形式提供在表15中。–组，n＝70，+组，n＝30，恢复期患者组(C组)，n＝41。指示的百分比是结果的预测值。粗体和斜体表示在+组和-组背景下不符合FDA紧急使用授权(EUA)要求的值。

表15：双多重测定结果

测定灵敏度的比较示于图4。

如这些结果表明的，本公开内容的双多重测定可检测阳性样品中针对SARS-CoV-2抗原的抗体，至少与ELISA一样好。此外，通过在单次测定中单独检测针对多种抗原的多种免疫球蛋白同种型，该测定比ELISA更有可能对已暴露于SARS-CoV-2的患者，特别是恢复期患者产生阳性结果。

实施例4

在接种疫苗的受试者中进行的双多重测定

在接种SARS-CoV-2之前和接种后3周，使用来自受试者的额外患者样品进行如实施例2所述的双多重测定。所得数据提供于表16和表17。数据进一步证实了该测定的特异性和灵敏度，并证明其可在接种疫苗的受试者中检测抗体。

表16：疫苗接种前

表17：疫苗接种后

该数据证明了双多重测定检测接种疫苗的受试者中的抗体产生的能力。

实施例5

SARS-COV-2测定报告

图5是针对SARS-CoV-2的抗体的双多重测定的示例性报告。报告可用于向提供测试样品的受试者提供诊断。示例报告以报告的“针对不同SARS-CoV-2抗原的抗体”部分中“未检测到”和“检测到”列下的测量结果的形式提供了与测试样品相关的数据点。还列出了这些数据点的阳性或阴性的阈值。还提供了数据点的类型(例如，抗SARS-CoV-2RBD IgG)和测量类型(MFI)，以帮助理解和识别纳入的数据点。

示例性报告进一步以两种测试样品特性的阳性(“是”)或阴性(“否”指标)、“是否有先前暴露于SARS-CoV-2病毒或疫苗的证据？”和“是否有产生了稳健的应答的证据？”的形式提供信息。通过参考数据点确定这些测试样品特性。示例性报告还包括以“注释”的形式的诊断信息。此类诊断信息可被受试者直接使用，或与医学专业人员的进一步建议结合使用。

示例性测试报告中包含的附加信息可进一步用于提供诊断或推导进一步的测试样品特性。例如，可以将提供的“先前结果”与当前结果进行比较，以确定其他诊断信息或测试样品特性。

在图5的示例中，还提供了额外测试(特别是RT-PCR测试和中和抗体测试)的结果，并且可以与双多重测定的结果合并，以向受试者提供诊断信息。

上述各种实施方案可以组合以提供进一步的实施方案。本说明书中提及或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括2020年5月19日提交的美国临时专利申请号63/027,102和2020年11月23日提交的美国临时专利申请号63/117,400，均以引用方式整体并入本文。如果需要，可以修改实施方案的方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念，以提供进一步的实施方案。

这些和其他变化可以根据上述详细描述对实施方案进行。一般来说，在以下权利要求中，使用的术语不应解释为将权利要求限制在说明书和权利要求中公开的特定实施方案，而是应解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求书有权享有的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。

Claims

1.一种检测测试样品中针对至少两种抗原的抗体的至少两种同种型的双多重测定方法，所述方法包括：

a)将含有测试抗体的测试样品与至少两种类型的可识别标记的微颗粒的混合物组合，其中每种类型的可识别标记的微颗粒与不同的抗原缀合，以与特异性结合抗原的测试抗体形成微颗粒-免疫球蛋白复合物；

b)将微颗粒-免疫球蛋白复合物与针对至少两种不同免疫球蛋白同种型的可检测标记的抗Ig同种型抗体组合，以形成微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物；

c)检测微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物的可识别标记的微颗粒类型和抗Ig同种型抗体类型，以生成检测数据；

d)组合或分析检测数据以生成至少四个不同的数据点，每个数据点对应于测试抗体同种型和抗原特异性的不同组合；

e)使用数据点确定测试样品特性。

2.权利要求1的方法，其中不同抗原来自单个生物源，并且所述测试样品特性是受试者对于针对所述生物源的抗体是阳性还是阴性的。

3.权利要求1或2的方法，其中至少三种不同抗原与至少三种类型的可识别标记的微颗粒缀合，并且使用针对至少三种不同免疫球蛋白同种型的可检测标记的抗Ig同种型抗体生成至少9种不同类型的数据点。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述测试样品来自人类受试者。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述测试样品的体积为0.1-20.0μL。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述测试样品是全血、血清、血浆、鼻分泌物、痰、支气管灌洗液、尿液、粪便或唾液。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物样品是全血、血清或血浆。

8.权利要求7的方法，其中所述全血、血清或血浆通过手指针刺获得。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中在与至少两种类型的可识别标记的微颗粒的混合物组合之前稀释所述测试样品。

10.权利要求9的方法，其中所述稀释的生物样品的体积为20-50μl。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述可识别标记的微颗粒是微球。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述微颗粒具有长度为0.001μm至1000μm的横截面。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述可识别标记的微颗粒可通过大小、磁特性、荧光、紫外激发荧光波长、紫光激发荧光波长、荧光强度、金属同位素或其任何组合来识别。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述可检测标记的抗Ig同种型抗体可通过荧光特性、发光特性或比色特性或其任何组合来识别。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗Ig同种型抗体包括抗IgG、IgM、IgA的抗体或其任何组合。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗Ig同种型抗体包括抗IgG亚型的抗体。

17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述抗原来自病毒、细菌、移植器官或组织、肿瘤或癌症。

18.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述抗Ig同种型抗体包括抗IgE亚型的抗体。

19.权利要求18的方法，其中所述抗原来自变应原。

20.前述权利要求中任一项的方法，其中将微颗粒-免疫球蛋白复合物与可检测标记的抗Ig同种型抗体的混合物组合。

21.权利要求1-19中任一项的方法，其中将微颗粒-免疫球蛋白复合物在连续步骤中分别与每种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体组合。

22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述检测步骤使用流式细胞术或质谱流式细胞术进行。

23.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)-c)在约30分钟至3小时的时间段内进行。

24.前述权利要求中任一项的方法，还包括确定每个数据点的至少一个准确度指标，其中所述准确度指标是灵敏度、特异性、一致性(相关性)、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率或假阴性率。

25.前述权利要求中任一项的方法，其中所述测试样品特性是所述测试样品对于特定抗体同种型的测试抗体的阳性或阴性，并且通过针对所有抗原的抗体同种型的数据点的一致性来确定阳性或阴性。

26.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述测试样品特性是所述测试样品对于针对特定抗原的测试抗体的阳性或阴性，并且通过所有抗体同种型的针对所述抗原的抗体的数据点的一致性来确定阳性或阴性。

27.权利要求24或权利要求25的方法，还包括确定所述测试样品特性的至少一个准确度指标，其中所述准确度指标是灵敏度、特异性、一致性(相关性)、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率或假阴性率。

28.权利要求27的方法，其中与仅使用单一类型的数据点来确定测试样品特性的相应测定相比，测试样品特性的特异性增加而灵敏度不降低。

29.权利要求28的方法，其中与仅使用单一类型的数据点来确定测试样品特性的相应测定相比，特异性增加至少10倍。

30.一种用于对测试样品的针对至少两种抗原的抗体的至少两种同种型进行双多重测定的系统，所述系统包括：

a)与至少两种抗原缀合的至少两种类型的可识别标记的微颗粒，其中每种类型的可识别标记的微颗粒与不同的抗原缀合；

b)至少两种类型的微颗粒-免疫球蛋白复合物，其中每种类型的微颗粒-免疫球蛋白复合物包含与抗原缀合的可识别标记的微颗粒和与抗原特异性结合的来自测试样品的测试抗体；和

c)至少两种类型的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物，其中每种类型的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物包含与抗原缀合的可识别标记的微颗粒、与抗原特异性结合的来自测试样品的测试抗体和与测试抗体结合的至少一种可检测标记的抗Ig同种型抗体。

31.权利要求30的系统，其中每种类型的微颗粒-免疫球蛋白-抗Ig同种型复合物包含与测试抗体结合的至少两种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体。

32.一种用于对测试样品的针对至少两种抗原的抗体的至少两种同种型进行双多重测定的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)一种或多种类型的可识别标记的微颗粒，其中每种类型的微颗粒与不同的抗原缀合；和

b)两种或更多种类型的可检测标记的抗Ig同种型抗体，其中每种类型的抗Ig同种型抗体结合不同的免疫球蛋白同种型或亚型。