CN116547533A - 用于sars-cov-2中和抗体的免疫测定及其材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及开发新型免疫测定，用于检测患者样品中针对SARS‑CoV‑2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体和/或高亲合力中和抗体，以及任选地，一种或多种细胞因子。还提供了新型多重和单重免疫测定，用于检测患者样品中针对SARS‑CoV‑2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体和/或高亲合力中和抗体，以及任选地，一种或多种细胞因子。

Description

用于SARS-COV-2中和抗体的免疫测定及其材料

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年7月20日提交的美国临时申请系列号63/053,888、2020年10月6日提交的系列号63/088,195和2020年11月17日提交的系列号63/114,685的权益，其公开内容通过引用其全文(包括所有附图、表格和氨基酸或核酸序列)的方式纳入本文。

此申请的序列表被记为“Seq-List.txt”，其于2021年7月15日创建，大小为41KB。序列表的全部内容通过引用其全部内容纳入本文。

发明背景

冠状病毒SARS-CoV-2是COVID-19疾病的致病病毒剂，COVID-19疾病是一种高度传染性的人类呼吸道感染，威胁全球公共健康。截至2020年7月，已知该病毒已感染全球至少1020万人，已知死亡人数至少为502,000人。

冠状病毒(CoV)是包含单链正义RNA的包膜病毒。之前称之为2019-nCoV，SARS-CoV-2是一种新出现的冠状病毒，其主要影响呼吸道，可导致严重急性呼吸系统综合症(SARS)。由该病毒引起的基础疾病被命名为COVID-19。在过去的二十年中，冠状病毒是世界上数次严重爆发的罪魁祸首。2003年和2014年，冠状病毒分别主要在亚洲(SARS-CoV)和中东(MERS-CoV)爆发。在新型SARS-CoV-2出现之前，已知存在6种冠状病毒影响人类(SARS-CoV、MERS-CoV和导致轻度上呼吸道和下呼吸道综合征的其他四种冠状病毒)。

SARS-CoV-2病毒在全球传播迅速，2020年3月，WHO(世界卫生组)正式宣布COVID-19为大流行病。该病毒在人与人之间的传播导致COVID-19的快速传播，并且大量需要重症监护的患者导致采取了遏制措施。感染COVID-19的个体会在感染后约2-14天后出现疾病症状。

已在呼吸道分泌物中检测到该病毒，而呼吸道分泌物被认为是主要的传播途径。一旦病毒颗粒进入呼吸道，病毒就会通过ACE-2受体附着于肺细胞，然后被内吞。SARS-CoV-2也可以通过粪便途径传播。

SARS-CoV-2呈阳性且有症状的患者被诊断为COVID-19。症状可能千差万别，主要包括发烧、干咳、嗅觉丧失、咳痰、头痛、呼吸困难、疲劳、恶心和腹泻。虽然一些病例可能是无症状的，但是其他病例可能导致与“细胞因子风暴”甚至死亡相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

血清学检测在了解和抗击病毒爆发中发挥着关键作用。血清学检测可以提供可靠的流行病学数据，这些数据对于确定感染率以及因此而得的真实死亡率指标非常宝贵。此外，其还可以帮助确定产生强大免疫反应的个体，然后这些个体可以成为治疗剂(例如免疫(恢复期)血浆)的供体。血清学检测还可以帮助确定无症状个体和/或接种疫苗个体的免疫反应。

SARS-CoV-2基因组编码四个主要结构蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、核蛋白(N))和膜蛋白(M)。发现刺突糖蛋白与ACE-2受体结合以进入细胞。研究表明，IgG抗体主要针对S和N蛋白。刺突蛋白有两个主要亚基：亚基1(S1)，其包含将病毒附着于细胞膜从而与人ACE2受体结合的受体结合结构域(RBD)。亚基2(S2)，其介导病毒与细胞膜的融合。

来自受感染或接种疫苗个体的中和抗体可以阻断ACE2受体与刺突蛋白之间的结合。然而，已经发现，病毒刺突蛋白在其在人群中传播期间往往会发生突变，从而导致逃避针对野生型刺突蛋白产生的中和抗体，例如可能存在于疫苗中的那些抗体。本发明鉴定能够与ACE2受体相互作用的多个刺突蛋白的中和抗体。

发明内容

本发明涉及开发新型免疫测定，用于通过检测表达SARS-CoV-2的刺突蛋白变体和/或中和SARS-CoV-2刺突蛋白变体的抗体来检测感染SARS-CoV-2的个体。免疫测定可以通过标准免疫测定形式或在自动化平台上进行。在各种实施方式中，免疫测定使用一种或多种SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。可以将SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段固定在基材上并用于检测获自对象的生物样品(也称为“患者样品”)中的中和抗体，任选地，与生物样品中的一种或多种细胞因子组合。本发明的其他方面提供了用于本文所述的免疫测定的抗原/基材组合。

本发明还涉及开发用于检测中和和/或保护性抗体的新型单重和/或多重免疫测定。多重免疫测定可以进一步检测疑似病毒感染患者样品中针对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的高亲合力(avidity)中和和/或保护性抗体，以及任选地，一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。公开的单重和/或多重免疫测定旨在鉴定包含能够中和和/或阻断ACE2受体与特定SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的抗体的对象(患者样品)，以及任选地，受SARS-CoV感染、经中和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的抗体治疗的患者或用包含SARS-CoV2刺突蛋白或其片段(包括本文公开的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段)的疫苗免疫的对象中的一种或多种细胞因子的水平。本文公开的免疫测定可以用于评估针对SARS-CoV-2刺突蛋白及其变体的疫苗在产生中和抗体方面的有效性和/或评估待给予对象的恢复期血浆或抗体混合物中或在给予对象恢复期血浆或包含刺突蛋白中和抗体的抗体混合物后不同时间点的中和抗体的存在。

附图说明

图1显示了本发明的一个方面，其中鉴定了针对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。

图2显示了本发明的一个方面，其中针对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体阻断了hACE2与SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的结合。该测定使用生物素化hACE2和链霉亲和素-藻红蛋白来检测中和抗体。

图3显示了本发明的一个方面，其中鉴定了针对SARS-CoV刺突蛋白结构域、变体或其片段的高亲合力中和抗体；添加1M NaCl使低亲合力抗体结合不稳定。

图4显示了用两名COVID 19患者血清的RBD-生物素化ACE2相互作用的中和抗体抑制曲线。％抑制＝1-(各稀释样品的相对荧光强度(RFI)/矩阵RFI)。

图5A和5B证明了抗RBD结合IgG抗体和中和抗体之间的相关性。

图6-9说明了对于2020年3月前及2020年6月后获得的样品，在低盐条件(LS＝0.15M NaCl，图6和7)和高盐条件(HS＝1M NaCl，图8和9)下针对各种突变体的样品中存在的中和抗体。

图10-11说明了标准化至100％野生型后的抗体介导的抑制作用。RBD突变体对2020年6月前和后收集的样品表现出不同的nAb反应。

发明详述

如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，就在具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包括”，“包含”，“具有”，“含有”，“有”或其变化形式的程度而言，这些术语意在以类似术语“包含”的方式表示包含在内(inclusive)。过渡术语/短语“包含”、“包括”、“含有”、“基本上由……组成”、“基本上由……构成”、“由……组成”和“由……构成”(及其任何语法变体)，可互换使用。

术语“约”或“大约”表示就特定数值而言在本领域普遍技术人员能够确定的可接受的误差范围内，这将部分取决于该数值的测量或确定方式，例如，测量体系的极限。例如，根据本领域的实践，“约”可以指1个或超过1个标准偏差。获自，“约”可以指给定值的至多0-20％、0-10％、0-5％或至多1％的范围。

在本公开内容中，范围是简写形式，以避免不必要详细列出并描述范围内的每个值。适当时，可选择该范围内的任何合适值作为该范围的上限值，下限值或终点。例如，范围0.1-1.0表示终值0.1和1.0，以及中间值0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，并且所有中间范围都包含在0.1-1.0内，例如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。设想在一个范围内具有至少两个有效数字的值，例如，5-10的范围表示5.0和10.0之间以及5.00和10.00之间的所有值，包括端点值。

本公开可以根据数字或字母(例如，可检测标记物1、珠(ii)等)指代诸如标记物、固体支持物、珠、分析物等项目。在使用此命名法的情况下，这些数字和字母旨在将该项目与其他同类项目区分开来(例如，珠(i)相对珠(ii))，并不意味着将特定属性与数字或字母相关联。本发明的实施可采用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料。以下定义用来帮助理解本文中的一些常用术语但不对本文公开的范围构成限制。

多重测定是同时测量单个样品中超过一种分析物的水平的分析。多重测定方法和试剂述于例如美国专利号5,888,86和WO2008148883(其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在本申请的上下文中，待测量的分析物是对固定在本文公开的固体基材上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和和/或保护性抗体。

单重测定是测量单个样品中一种分析物的水平的分析。在本申请的上下文中，待测量的分析物是对固定在本文公开的固体基材上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和和/或保护性抗体。

术语“固体支持物”或“基材”(以及这些术语的语法等同形式)用于表示可以固定试剂，例如抗体或肽或蛋白质的固体惰性表面或物体。这些术语(“固体支持物”或“基材”(以及这些术语的语法等同形式))可以互换使用。固体支持物或基材的非限制性示例包括塑料、聚苯乙烯、硝化纤维素、膜、芯片和颗粒。如果使用了颗粒以外的固体支持物，例如玻璃、聚合物或二氧化硅芯片(例如微芯片)、板、载玻片等，本文公开的肽和/或蛋白质(目标分析物)可固定在支持物表面的特定位置处(例如，在板(例如，微量滴定板)的特定孔中或在芯片、微芯片、板或载玻片上的特定位置处)。因此，可以通过样品中的抗体与刺突蛋白变体或其片段在支持物表面发生特异性结合的位置来区分对样品中的刺突蛋白变体具有特异性的中和抗体。

或者，侧流免疫测定可以类似于美国专利号5,851,776和6,777,190中公开的方式进行(其各自通过引用其全部内容纳入本文，并且涉及在膜或其他多孔或无孔材料进行的横流色谱分析)。然后使用常规方法检测抗体进行刺突蛋白变体或其片段的特异性结合，所述刺突蛋白变体或其片段被固定在膜或其他多孔或无孔材料上的离散位置。术语“颗粒”在本文中用于指代任何形状或表面纹理的固体或半固体，通常具有微米级的线性尺寸(即，小于约100微米)。除非另有说明，该术语可与“颗粒”和“珠”互换使用，所述“颗粒”指微米级的颗粒，所述“珠”指球形或接近球形的颗粒，其组成通常为聚合物。在本申请中使用时，术语“颗粒”和“珠”(以及这些术语的语法等同形式)可以互换，不改变本申请中段落的上下文。

本文所用的术语“固定(的)”表示，在本文所述的测定的步骤期间施加的条件下不显著解偶联的基于分子的偶联。这种固定可以通过共价键、非共价键、离子键、亲和力(affinity)相互作用(例如亲和素-生物素或聚组氨酸-Ni⁺⁺)或任何其他化学键来实现。

本申请中公开的刺突蛋白变体或其片段的固定可以通过在基材上的共价或非共价固定来进行。例如，非共价固定可以是非特异性的(例如，一种或多种刺突蛋白变体或其片段的组合与聚苯乙烯表面的非特异性结合)。与基材的特异性或半特异性结合可以通过具有这样部分的刺突蛋白变体或其片段实现，所述部分能够使肽和/或蛋白质与涂覆有结合该部分的配体的基材共价或非共价结合。例如，该部分可以是与刺突蛋白变体或其片段的氨基酸基团结合的生物素或生物素基团或其类似物，例如6-氨基己酸，并且配体(生物素结合配体)是亲和素、链霉亲和素或其类似物。或者，该部分可以是His-His-His-His-His-His肽，并且基材可以用带有Ni⁺⁺离子的次氮基三乙酸衍生物(NTA)衍生化。

适用于所公开方法的各种基材包括但不限于，磁珠，聚苯乙烯珠，乳胶珠，包含共聚物的珠，例如苯乙烯-二乙烯基苯；羟基化苯乙烯-二乙烯基苯；聚苯乙烯；羧化聚苯乙烯；碳黑；未激活的聚苯乙烯或聚氯乙烯活性玻璃；或环氧激活多孔磁性玻璃。在其他实施例中，基材可以是微量滴定孔的底或壁；过滤表面或膜(例如，硝酸纤维素膜或PVDF(聚偏二氟乙烯)膜，例如Immobilon膜)；中空纤维；珠状层析介质(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶)；磁珠；纤维状纤维素基质；HPLC基质；FPLC基质；或任何其他合适的运载体、支持物或表面。在本发明的一个实施方式中，将公开的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段固定到聚苯乙烯珠(微球)上，其中将各种蛋白质固定到具有独特的可检测物理参数的珠，并通过能够区分可检测物理参数的平台进行分析。任选地，这类珠可以还包含磁芯。这类测定可以称为“多重免疫测定”，并在下文详细讨论。

用于进行特异性结合测定，特别是免疫测定的装置是已知的并且可以容易地适用于本方法。一般来说，固相测定比需要分离步骤(例如沉淀、离心、过滤、层析或磁力)的异相测定方法更容易执行，因为试剂的分离更快更简单。固相测定装置包括微量滴定板，流通测定装置，芯片，微芯片，侧流基材试纸和免疫毛细管或免疫层析免疫测定装置。

术语“器具”、“器皿”、“管”、“孔”等指可以容纳试剂或试验的容器。如果容器在试剂盒中并装有试剂，那么其通常将是闭合的或密封的。如果将容器用于试验，那么其通常在化验步骤期间是打开的或可及的。

术语“患者样品”或“生物样品”涵盖获自生物体(例如人)的多种样品类型。该术语涵盖体液，例如血液，血液成分，唾液，鼻粘液，血清，血浆，脑脊髓液(CSF)，尿液和其他生物来源的液体样品，实体组织活检，组织培养物或采集自培养的患者细胞的上清液。在本公开的上下文中，生物样品通常是具有可检测量抗体的体液，例如血液或血液成分(例如血浆或血清)或鼻分泌物(粘液)。可以在测定之前处理生物样品，例如，以去除细胞或细胞碎片。该术语包括在采购后经过处理的样品，例如通过试剂处理、溶解、沉淀或富集某些成分。

本文所用的术语“抗体”指由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(抗原)。公认的免疫球蛋白轻链分类为κ或λ。免疫球蛋白重链分类为γ、μ、α、δ或ε，进而确定了免疫球蛋白类型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白G(IgG抗体)结构单元的示例是四聚体。各个这类四聚体包含相同的两对多肽链，每对包含一条轻摂链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(V_L)和“可变重链”(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体以完整的免疫球蛋白形式或以由用多种肽酶消化而产生的已充分表征片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键附近的抗体，以产生Fab的二聚体F(ab)'₂，所述Fab本身是通过二硫键接合到VH-CH1的轻链。可以在温和条件下还原F(ab')₂二聚体，以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab')₂二聚体转化为两个Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分绞链区的Fab(参见Paul(编著),《基础免疫学》(FundamentalImmunology),第三版,瑞文出版社(Raven Press),纽约(1993))。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可利用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段。

抗体通常根据其靶标来命名。虽然命名法有所不同，但本领域技术人员将熟悉并理解的是，可以将多个名称应用于同一抗体。例如，对IgM具有特异性的抗体可称为“抗IgM”、“IgM抗体”、“抗IgM抗体”等。

术语“对……具有特异性”、“特异性”、“特异性结合”和语法上等同的术语指分子(例如抗体或抗体片段)与靶标结合的亲和性比与其与非靶标化合物结合的亲和性高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。例如，特异性结合给定抗体靶标的抗体通常以与非抗体靶标相比高至少2倍的亲和力结合抗原靶标。可以使用标准方法确定特异性，例如，固相ELISA免疫测定(参见例如，Harlow和Lane,使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies,A Laboratory Manual)(1998)，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。

关于抗体靶标(例如，抗原、分析物)的术语“结合”通常表示抗体结合纯的群体中的大多数抗体靶标(假定适当的摩尔比)。例如，结合给定抗体靶标的抗体通常结合溶液中至少2/3的抗体靶标(例如，75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)。本领域技术人员应理解，取决于测定结合的方法和/或阈值，可出现一些变化。

术语“标记物”、“可检测标记物”和“可检测部分”等指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染料(荧光团)，发光剂，电子致密试剂，酶(例如通常用于ELISA)，生物素，作用于基材的酶(例如，辣根过氧化物酶)，异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin)、³²P以及其他可检测的同位素，半抗原和蛋白质，其可以例如通过将放射性标记物掺入肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体来成为可检测的。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(signature)(例如，以特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可以使用本领域已知用于使标记物与所需试剂偶联的任何方法，例如，使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)圣地亚哥中所述的方法。

当述及结果或信号时，术语“阳性”表示样品中存在进行检测的分析物或项目。当述及结果或信号时，术语“阴性”表示样品中不存在进行检测的分析物或项目。阳性和阴性通常通过与至少一个对照(例如，确定样品呈阳性所需的阈值水平)或阴性对照(例如，已知的空白)进行比较来确定。“对照”样品或值是指用作参照的样品，通常是已知参照，用于与测试样品进行比较。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，在测试化合物存在的情况下，并与来自已知条件的样品进行比较，例如，在测试化合物(阴性对照)不存在的情况下，或在已知化合物(阳性对照)存在的情况下。对照还可以表示从多个测试或结果中收集的平均值。对于本发明中使用的测定，可以包括对照珠，例如，可以使用血清验证珠(SVB)和/或内标珠(ISB)。本领域技术人员将认识到的是，可以设计对照用于评估任何数量的参数，并且将理解何种对照在给定情况下是有价值的并且能够基于与对照值的比较来分析数据。控制对于确定数据的显著性也很有价值。例如，如果给定参数的值在对照中是呈变化性的，那么测试样品中的变化将不被视为是显著的。

“校准对照”类似于阳性对照，因其包括已知量的已知分析物。在多重测定的情况下，校准控制可以设计成包括已知量的多种已知分析物。校准对照中的一种或多种分析物的数量可以设置为最小截止量，例如，使得较之更高的数量将被视为对一种或多种分析物呈“阳性”，而较之更低的数量将被视为“对分析物”呈阴性。在某些情况下，可以使用多级校准控制，从而可以更准确地确定分析物量的范围。例如，测定可以包括处于已知低量和高量或已知最小量、中间量和最大量的校准对照。

术语“诊断”是指对象患有感染、病症或疾病的相对可能性。同样，“预后”一词是指对象可能出现的某种未来转归的相对概率。例如，在本公开的上下文中，预后可以指个体已经感染SARS-CoV-2并且已经或将会发展为疾病的可能性。这些术语并不是绝对的，医学诊断领域的任何一位技术人员都会理解。

“对象”、“患者”、“个体”及其语法等同形式可互换使用；除非另有说明，其指哺乳动物，如人和非人类灵长类动物，以及兔子、猫科动物、犬科动物、大鼠、小鼠、松鼠、山羊、猪、鹿和其他哺乳动物。该术语不一定表示受试者已被诊断出患有特定疾病，但通常是指在医疗或兽医监督下的个体。患者可以是正在寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。在本申请的上下文中，“对象”、“患者”或“个体”已经：a)暴露于或感染了SARS-CoV-2；b)用包含SARS-CoV-2刺突蛋白(或其片段)的疫苗或包含刺突蛋白变体或其片段的疫苗进行了免疫；c)用针对SARS-CoV-2刺突蛋白(或其片段)的中和抗体或针对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特异性中和抗体(例如，恢复期血浆或其他中和抗体)，例如包含中和SARS-CoV-2刺突蛋白或其变体的一种或多种抗体的组合物(抗体混合物)处理/治疗。本文公开的免疫测定能够检测对来自任何这些类型的对象的生物样品中的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具体有特异性的中和抗体的结合。

如本文所用，“离液试剂”或“离液剂”是指使蛋白质的三维结构不稳定的化合物。在某些实施方式中，离液试剂可以指离子离液剂(例如，离液离子或离液盐)或非离子离液剂。离液盐的非限制性示例包括：胍盐，例如氯化胍、硝酸胍、硫氰酸胍；硫氰酸盐，例如硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸锂、硫氰酸钙、硫氰酸胍；高氯酸盐，例如高氯酸铵、高氯酸钠、高氯酸锂、高氯酸镁、高氯酸钙；碘酸盐，例如碘酸铵、碘酸钾、碘酸钠、碘酸锂、碘酸镁、碘酸钙；氯酸盐，例如氯酸钠、氯酸锂、氯酸镁、氯酸钙；氯化物盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化铵。非离子离液剂包括但不限于，尿素和硫脲。

如本文所用，“亲合力”是包含各种抗原决定簇和抗体的抗原的整体结合强度的量度，即抗原和抗体之间形成的复合物的稳定性。亲合力是指抗原和抗体之间的总结合力；因此，短语“高亲合力抗体”或“低亲合力抗体”反映了抗体与抗原的相对结合力。如本文所用，高亲合力抗体在暴露于离液剂时可以保持与抗原的结合；同时，当暴露于相同浓度的相同离液剂时，低亲合力抗体可能无法保持与抗原的结合。

术语“ACE2受体”(ACE2R)包括截短的和/或修饰的ACE2受体，其可以具有1、2、3、4、5、10、50、100、250、500个或更多个氨基酸被移除、添加、和/或取代。修饰的ACE2受体包括ACE2受体融合蛋白，其中ACE2受体或其片段或变体与免疫球蛋白Fc结构域融合。例如，Fc结构域可以与ACE2受体或ACE2受体的片段或变体的C末端融合，以形成ACE2R-Fc融合蛋白。ACE2受体的片段或变体可以包含来自ACE2R的足以结合RBD的最小结构域，例如ACE2R的氨基酸Ser19-Asp615或ACE2R的氨基酸12-327。在各种实施方式中，可以使用人ACE2R(SEQ IDNO:4)。“标记的ACE2受体”包括经可检测标记(例如，用PE)的ACE2受体，或者是生物素化、亲和素化或链霉亲和素化的ACE2受体(包括截短和/或修饰的ACE2受体或ACE2融合蛋白)。在各种实施方式中，ACE2R-Fc融合蛋白可以在融合蛋白的Fc部分上进行生物素化、亲和素化或链霉亲和素化。

术语“结构蛋白”、“肽”、“抗原”、“分析物”和“片段”(及其语法等同形式)可以互换使用，并且指代所公开的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段和/或未突变的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段(SEQ ID NO:3)。如本文所讨论的，所公开的SARS-CoV-2刺突蛋白的片段、SARS-CoV-2刺突蛋白变体在给定的SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO 1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)的5到(n-1)个连续氨基酸之间。在各种情况下，刺突蛋白变体的片段将在其连续氨基酸范围内包括与突变体刺突蛋白相关的氨基酸突变(在表1和表2中确定)。氨基酸突变的编号与SEQ ID NO:1或2中的氨基酸编号有关。

对于位于位置683、685、986和987的氨基酸突变，刺突蛋白变体或其片段可以存在2、3或4个氨基酸突变的任意组合。在某些实施方式中，刺突蛋白变体或其片段内存在三个或所有四个氨基酸突变。因此，可以固定在固体支持物上的刺突蛋白变体的片段是S1的片段，并且长度可以在5-685个连续氨基酸之间，前提是该片段包括表1或表2中确定的一个或多个氨基酸取代(例如，SEQ ID NO:1或2的氨基酸13-685或氨基酸319-541)。优选的实施方式提供刺突蛋白变体或其片段，其包含如表1和2中确定的单个氨基酸取代。长度或片段可包括或排除经加工的信号肽(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸1-12)。在一些实施方式中，SEQ ID NO:2的位置354处的氨基酸是Asx(天冬氨酸或天冬酰胺)。因此，SEQ IDNO:2的刺突蛋白变体可以包含位于位置354处的天冬氨酸或天冬酰胺，以及表1和表2中确定的一个或多个其他突变(即在位置342、367、435、458、483、683、685、986和/或987)。因此，在刺突蛋白变体的情况下，该长度可以包括或排除蛋白质的信号肽。在一些实施方式中，“分析物”可以是对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体。在这类实施方式中，该术语在检测作为分析物的抗体的上下文中的使用将是清楚的。在其他实施方式中，包括下述趋化因子和细胞因子中的一种或多种作为待检测和/或定量的一种或多种“分析物”：IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。虽然IL-1β，IFN-γ，IFNγ型诱导蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α被归类为(多种)细胞因子或趋化因子(在IP-10的情况下)，但是细胞因子和趋化因子(IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎性蛋白-1A和TNF-α)的集合在本文中可称为“(一种)细胞因子”、“(多种)细胞因子”或“一种或多种细胞因子”。如上所述，该术语在检测或固定这些趋化因子和/或细胞因子(“(一种)细胞因子”、“(多种)细胞因子”或“一种或多种细胞因子”)的上下文中使用将是清楚的。

如上所述，本发明涉及开发新型多重免疫测定，用于检测疑似感染病毒的患者样品中针对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体，以及任选地，一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。所公开的免疫测定旨在识别包含抗体的那些对象(患者样品)，所述抗体能够阻断ACE2受体与特定SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的结合，以及任选地，用包含SARS-CoV2刺突蛋白或其片段的疫苗免疫的患者或对象中的一种或多种细胞因子的水平。免疫测定可通过使用利用手动或使用自动化平台的ELISA、侧流、磁性试验的标准免疫测定来进行。具体而言，所公开的免疫测定使用包含氨基酸取代的一种或多种SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，以及所公开的SARS-CoV-2刺突蛋白变体的任何组合(例如，2、3、4、5、6、7、8或9种SARS-CoV-2刺突蛋白变体)，以及任选地，选自下述的一种或多种细胞因子：IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种的任意组合)。

另一实施方式提供了这样的免疫测定，其中将单种SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段固定在基材上。因此，所公开的免疫测定包括在有效于结合生物样品中发现的抗体与固定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段的条件下，接触已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材。然后可以通过已经标记的物种特异性抗IgM、抗IgG、抗IgA、抗IgD、抗IgE、抗κ或抗λ抗体(例如，抗人、抗兔、抗犬、抗大鼠、抗小鼠、抗松鼠、抗山羊、抗猪或抗鹿抗体)检测与基材连接的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的抗体。例如，抗IgG-PE和/或抗IgM-PE报告物可以用于检测和/或定量获自疑似感染病毒的或用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗进行免疫的个体的生物样品中的SARS-CoV-2刺突蛋白变体特异性抗体。或者，可以利用物种特异性轻链特异性抗体(物种特异性κ或λ特异性抗体)作为检测试剂来鉴定含有与给定SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的抗体的样品。在某些优选实施方式中，物种特异性抗体是抗人抗体。

其他实施方式提供了标记的ACE2受体，包括标记的ACE2R融合蛋白(例如，ACE2R-Fc融合蛋白)和/或截短和/或修饰的ACE2受体，用以检测SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段所固定于其上且中和抗体未与其结合的基材的用途。截短和/或修饰的ACE2受体可以具有1、2、3、4、5、10、50、100、250、500个或更多个氨基酸被移除、添加和/或取代。或者，ACE2受体可以与免疫球蛋白Fc结构域融合。例如，Fc结构域可以与ACE2或ACE2受体蛋白的片段或变体的C末端融合。ACE2受体的片段或变体可以包含来自ACE2R的足以结合RBD的最小结构域。此外，ACE2受体、截短的或修饰的ACE2受体或ACE2R融合蛋白(例如，ACE2R-Fc)可以经生物素化或亲和素化。在优选的实施方式中，ACE2R-Fc融合蛋白的Fc结构域可以经生物素化或亲和素化。在这类实施方式中，通过标记的ACE2受体与已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材的结合的缺乏，有可能识别中和抗体与给定SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的结合。换言之，标记的ACE2受体将仅结合这样的基材，所述基材未通过固定在基材上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段与中和抗体特异性结合。

本文所公开的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段可以通过共价或非共价键合固定在固体支持物上。在将SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段或细胞因子共价固定在基材上的实施方式中，在添加SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段或细胞因子之前，将激活并酯化羧化基材，例如颗粒、塑料、聚苯乙烯或珠。羧基活化使用水溶性碳二亚胺，例如1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺(CMC)实现。酯化使用NHS、NHSS或HOBt或其他合适的试剂实现。羧基活化和酯化后，将SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段或细胞因子添加到pH值为6-10之间的缓冲液(例如，乙酸钠缓冲液pH 5.1、磷酸缓冲液pH 7.0，其具有或不具有清洁剂(例如，CHAPS))中的活性(actived)表面。偶联后，将基材(例如珠)在含有蛋白质阻断剂，例如BSA、小鼠IgG、牛γ球蛋白(BGG)或动物血清(山羊、马、鼠)的缓冲液中封闭。蛋白质阻断剂可以0.1-10重量/体积百分比的数量存在。然后可以用合适的缓冲液对与基材偶联的封闭的抗原进行洗涤并用于所需的免疫测定形式。

如上所述，所公开的发明涉及免疫测定，其包括采集可能含有抗体的体液或组织样品(例如，生物样品或患者样品)；在有效于形成特定蛋白质-抗体复合物的条件下使生物样品与SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段接触(反应)(有时称为特异性结合蛋白质和抗体或给定的蛋白质和特异性结合该蛋白质或其片段的抗体的“免疫复合物”)；并测定接触的(反应的)样品中抗体-分析物免疫复合物的存在。生物样品可以获自感染SARS-CoV2的个体，用对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段具有特异性的中和抗体治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗疫苗接种的个体。

在各种实施方式中，所公开的方法涉及这样的方法，其包括采集可能包含对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的抗体的体液或组织样品(生物样品或患者样品)，并检测和/或定量生物样品内抗体和/或一种或多种细胞因子的存在。通常，检测IgM、IgA和/或IgG抗体(尽管也可以检测其他同种型的抗体)。或者，可以使用对κ或λ轻链具有特异性的抗体来检测特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的抗体或固定在基材上的细胞因子。在各种实施方式中，生物样品是源自静脉血样品的血清或血浆样品。已知含有抗体的其他体液，例如唾液、胃分泌物、鼻腔分泌物、粘液等，也可称为生物样品并用于所公开的免疫测定中。如上所述，生物样品可以获自感染SARS-CoV2的个体，用对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段具有特异性的中和抗体治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白诸如本文所公开的刺突蛋白变体或其片段的疫苗疫苗接种的个体。

当前描述的多重测定涉及使用固体支持物，通常是颗粒或珠。对于流式细胞术检测，应避免发射高水平自发荧光的颗粒或珠，因为这会增加背景信号并有可能使其不适用。通过标准乳液聚合由各种不同的起始单体产生的颗粒或珠通常表现出低自发荧光，而那些已经改性以增加孔隙率的(“大孔”颗粒)表现出高自发荧光。这类颗粒或珠中的自发荧光随着尺寸的增加和二乙烯基苯单体百分比的增加而进一步增加。在这些限制内，颗粒或珠的尺寸范围可以变化，具体的尺寸范围并不重要。在大多数情况下，颗粒或珠的聚集尺寸范围在颗粒或珠直径为约0.3微米至约100微米的范围内，例如在约0.5微米至约40微米的范围内。

磁性颗粒或珠在本领域中是常用的，并且可以使分离和洗涤步骤对于目前描述的测定更方便。“磁性颗粒”、“磁性响应材料”、“磁珠”等术语表示响应磁场的材料。磁性响应材料包括顺磁材料(例如，铁、镍和钴，以及金属氧化物，例如Fe₃O₄、BaFe₁₂O₁₉、CoO、NiO、Mn₂O₃、Cr₂O₃和CoMnP)，铁磁材料，亚铁磁材料和变磁材料。磁性响应材料并不构成整个颗粒或珠，而是通常构成微粒或珠的一个组分，而其余部分由聚合材料组成，所述聚合材料可以经化学衍生以允许附着测定试剂(例如，抗原/分析物或抗体)。用于施加和移除作为测定的一部分的磁场的方法和仪器是本领域技术人员已知的并且在文献中有报道。文献报告的示例是Forrest等,美国专利号4,141,687；Ithakissios,美国专利号4,115,534；Vlieger等,Analytical Biochemistry 205:1-7(1992)；Dudley,Journal of Clinical Immunoassay14:77-82(1991)；和Smart,Journal of Clinical Immunoassay 15:246-251(1992)。

形成微粒或珠的聚合物基质可以是与当前描述的多重测定相容的任何材料。基质应该对生物样品的成分和测定试剂是惰性的，具有最小的自发荧光，是固体并且不溶于样品和测定中使用的任何其他试剂或洗涤液，并且能够将测定试剂固定到微粒。合适的聚合物的示例是聚酯、聚醚、聚烯烃、聚环氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚异戊二烯。交联能够用于许多聚合物，以赋予微粒结构完整性和刚性

可以通过常规方式将用于连接测定试剂(例如，抗原/分析物或抗体)的官能团掺入聚合物结构中。合适的官能团的示例是胺基、铵基、羟基、羧酸基和异氰酸酯基。测定试剂通常直接或间接地(例如通过连接基团)共价结合至固相表面，。连接基团可以用作增加固相表面上反应基团的密度和降低空间位阻以增加测定的范围和灵敏度的手段，或用作向固相表面添加特定类型反应基团以拓宽可以固定在固相的测定试剂类型的范围的手段。合适的有用的连接基团的示例是聚赖氨酸、聚甘氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚精氨酸。

多重测定中不同类型的颗粒或珠可以彼此区分，例如，通过尺寸、重量、光散射或吸光度、反射率、形状或标记，例如荧光(染料)标记物。当颗粒或珠大小用作区分因素(区分特征)时，选择尺寸子范围的宽度和介于相邻子范围的平均直径之间的间距，以允许通过流式细胞术区分不同类型的颗粒或珠，这对于使用流式细胞术以及针对流式细胞术的仪器的技术人员来说是显而易见的。通常，给定平均直径的子范围约为平均直径的±5％ CV或更小，其中CV是变异系数，定义为颗粒或珠直径的标准偏差除以平均颗粒直径乘以100％。不同类型的颗粒的子范围的平均直径通常间隔开子范围之一的平均直径的至少约6％，例如，子范围之一的平均直径的至少约8％或10％。

光散射也可用于区分不同类型的颗粒或珠。侧向角光散射随颗粒或珠尺寸、粒度、吸光度和表面粗糙度变化，而前向角光散射主要受尺寸和折射率影响。改变这些特性中的任何一个都会导致光散射差异，而这可以作为区分不同颗粒或珠组的手段。

区分参数的另一示例是吸光度。当将光施加到颗粒或珠时，颗粒或珠对光的吸收主要通过侧向(侧角)散射光强度的变化来表示，而前向散射光的强度相对不受影响。因此，通过观察横向散射光强度的差异来确定与颗粒或珠相关的各种有色染料之间的吸光度差异。

可以用作区分参数以将一组的颗粒或珠与另一组的颗粒或珠区分的其他物理参数包括赋予颗粒或珠不同的发射光谱和/或散射特性的可激发荧光染料或有色染料。或者，不同浓度的一种或多种荧光染料可用于区分或区别颗粒或珠。

当可区别特征是荧光染料或颜色时，可以将其涂覆在颗粒或珠的表面，包埋于颗粒或珠中，或与颗粒或珠材料的分子结合。因此，可以通过将聚合物材料与荧光染料结合，或通过用染料浸渍颗粒或珠来制造荧光颗粒或珠。具有已经掺入染料并因此适用于本发明的颗粒或珠可从供应商购得，例如Spherotech有限公司(美国伊利诺伊州利伯蒂维尔)和分子探针有限公司(Molecular Probes,Inc.)(美国俄勒冈州尤金市)。

标记物可以是直接或间接发出或生成可检测信号的任何物质或成分。在一些实施方式中，标记物是荧光团，其中许多已在文献中报道并因此为本领域技术人员所知，并且其中许多是易于商购的。关于荧光团的文献来源包括：Cardullo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8790-8794(1988)；Dexter,J.of Chemical Physics 21:836-850(1953)；Hochstrasser等,Biophysical Chemistry 45:133-141(1992)；Selvin,Methods in Enzymology 246:300-334(1995)；Steinberg,Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,Ann.Rev.Biochem.47:819-846(1978)；Wang等,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990)；和Wang等,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。下述是可以用作标记物的荧光团的非限制性示例：

4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'二磺酸；吖啶；异硫氰酸吖啶；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐/酯；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄(Brilliant Yellow)；香豆素；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)；7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青染料；氰苷；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5″-二溴邻苯三酚-磺萘酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸二氢茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红；伊红异硫氰酸酯；赤藓红B；异硫氰酸赤藓红；乙锭；5-羧基荧光素(FAM)；5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(TAF)；2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)；荧光素；异硫氰酸荧光素；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺；酚红；藻红蛋白((PE)包括但不限于B和R型)；邻苯二甲醛；芘；芘丁酸盐/酯；1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯；量子点；活性红4(Cibacron^TM亮红3B-A)；6-羧基-X-罗丹明(ROX)；6-羧基罗丹明(R6G)；丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明；罗丹明B；罗丹明123；罗丹明X异硫氰酸酯；磺胺B；磺胺101；磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸；和镧系螯合物衍生物。

用于所公开的免疫测定的特定荧光团包括荧光素、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白(PE)、罗丹明B和德克萨斯红(磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物)。本段前述列表中的任何荧光团均可用于当前描述的测定，以标记颗粒或珠，或标记结合剂(例如，抗体或链霉亲和素)。荧光色素可以通过常规共价键连接，在荧光团上和颗粒或珠或结合剂(例如，抗体或链霉亲和素)上使用合适的官能团。这些基团的识别以及形成连接的反应对本领域技术人员来说是显而易见的。可以用于代替荧光团的其他标记物是放射性标记物和酶标记物。这些同样是本领域已知的。流式细胞术方法和仪器是本领域已知的。仪器和方法的描述可以在例如细胞术简介：学习指南(Introduction to Flow Cytometry:A Learning Guide)(2000)BD公司(Becton,Dickinson,and Company)；McHugh,“用于定量和同时检测多种可溶性分析物的流式微球免疫测定(Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitativeand Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes),”细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)42,B部分(学术出版社(Academic Press),1994)中找到。

所公开的发明还涉及试剂盒和组合物，用于检测对象中对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体、保护性抗体、高亲合力中和抗体和/或高亲合力保护性抗体。本文公开的单重和/或多重测定提供了对于对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体(例如免疫球蛋白G(IgG)抗体、IgA和/或IgM抗体)的检测和/或定量。本文公开的多重测定还提供了对于对SARS-CoV-2刺突蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的高亲合力中和抗体的检测和/或定量。在某些实施方式中，用于检测中和抗体的试剂盒和组合物可以包含离液剂。离液剂可以是离子的，例如氯化钠和硫氰酸钠，或者是非离子的，例如尿素。

中和抗体可以是在受感染或接种疫苗的对象(例如人)体内产生的抗体。或者，中和和/或保护性抗体可以作为治疗剂给予，并且所公开的测定可以检测获自经治疗的对象的样品中这类抗体的存在。例如，人中和单克隆抗体B38和H4(公开于Wu等,Science,2020,368(5496):1274-1278，通过引用其全部内容纳入本文)或Wang等(NatureCommunications,https://doi.org/10.1038/s41467-020-16452-w，公开于2020年5月14日，“阻断SARS-CoV-2感染的的人单克隆抗体(A human monoclonal antibody blockingSARS-CoV-2infection)”，通过引用其全部内容纳入本文)中公开的47D11人单克隆抗体是可以给予受SARS-CoV2感染的对象的治疗性抗体，并且可以使用公开的多重免疫测定来检测这些中和和/或保护性抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的结合。或者，可以在所公开的多重免疫测定中检测的中和抗体包括：嵌合、人源化或其他形式的重组抗体，例如CDR移植抗体、纳米抗体或其任何的抗原结合部分。其他中和和/或保护性抗体包括：重组抗体形式，例如中和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的Fv，单域抗体(例如，VH或VL或VHH)，scFv，双价、三价或四价抗体，Bis-scFv，双抗体、三抗体、四抗体和它们的片段。这类抗体可根据本领域所熟知的方法产生。此外，如本领域技术人员所清楚的，二价抗体、三价抗体、四价抗体、双scFv、双抗体、三抗体、四抗体或片段的至少一个抗原结合部分特异性地结合并中和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

在某些实施方式中，可以使用离液剂将高亲和力中和和/或保护性抗体与低亲和力中和和/或保护性抗体区分开来。可以将离液剂添加到免疫测定反应中，以破坏抗体和抗原之间较弱的键，仅留下高亲和力的抗原-抗体复合物。添加离液剂后，低亲和力的抗原抗体复合物被破坏；因此剩余结合的抗原-抗体复合物表明存在高亲和力中和抗体。在某些实施方式中，高或低亲合力的指定是相对指定，并且不表示特定的结合强度。亲合力指定可以与多重测定中的其他抗体或与单独的测定中的抗体相关。可以通过将一种或多种离液剂添加到测定中并确定哪些抗体保持与抗原结合来确定指定。离液剂的浓度可以变化，以区分相对抗体亲合力。

本文公开的多重免疫测定可以检测和/或定量与固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材结合的特异性中和抗体的数量，以及任选地，检测和/或定量生物样品中存在的一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种)。在另一实施方式中，本申请提供了多重测定，其可以检测和/或定量与基材结合的特异性、中和性、高亲和力抗体的数量，所述基材固定有SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

当前描述的各种测定提供了至少两个维度的检测，例如，固定珠的特性(identity)(例如，带有单个SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的珠，以及与固定于珠上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的抗体和/或高亲合力中和抗体的存在和/或数量，以及任选地，一种或多种选自下述的细胞因子的存在和/或数量：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种)。这种多维方面允许多重形式，使得超过一种分析物可以在单一测定中检测。

因此，本发明的一个方面提供基材群体的组合。这些基材组合由两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7或更多个)不同且独特的可检测物理参数(例如染料特征)组成，各个不同且独特的可检测物理参数与单个基材群体相关联。

在一些实施方式中，在存在珠的情况下，在同一单一容器或器皿(管、孔、比色皿等)中测量对SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和/或SARS-CoV-特异性变体或其片段具有特异性的中和抗体、保护性抗体、高亲合力保护性抗体和/或高亲合力中和抗体的存在和/或量，以及任选地，一种或多种细胞因子的存在和/或量。如上所述，各个珠群体都携带特定可检测物理参数(例如，染料特征)和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，或者在一些实施方式中，SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。因此，珠可以携带单个SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。携带特定可检测物理参数(例如染料特征)的珠群体也可以用于检测细胞因子的存在。

为了检测样品中存在的细胞因子，可以将细胞因子特异性抗体固定在固体支持物(例如，微粒、珠或表面，例如芯片、微量滴定板、膜或玻璃)。在一些固定方案中，可以在添加抗体和/或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段之前激活和酯化羧化的珠。羧基活化可以使用水溶性碳二亚胺，例如1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺(CMC)实现。酯化可以使用NHS、NHSS或HOBt实现。羧基活化和酯化后，抗体和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段可以添加到pH值在6-10之间的缓冲液中的活化表面。例如，乙酸钠缓冲液pH 5.1，磷酸盐缓冲液pH 7.0，具有或不具有去污剂(例如，CHAPS，离子和两性离子去污剂)。偶联/固化后，可以将固体支持物封闭在含有蛋白质阻断剂(例如BSA、小鼠IgG、牛γ球蛋白(BGG)、动物血清(山羊、马、鼠))的缓冲液中。蛋白质阻断剂可以0.1-10重量/体积百分比的数量存在。

本发明的第一方面和第二方面提供了一对免疫测定。这些免疫测定形式用于检测对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体，以及任选地，一种或多种细胞因子的存在和/或量。在这些免疫测定中，用SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段涂覆固体支持物(例如，可以通过不同的荧光染料/特征相互区分的荧光标记珠(也称为染色珠))。在检测多种细胞因子的情况中，可以用对某一细胞因子具有特异性的一种或多种抗体涂覆另一染色珠(其经差异标记)。然后，将一种或多种涂覆的固体支持物与患者样品(例如，来自怀疑已暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品)以及样品稀释剂合并，并进行孵育，以促进能够特异性结合涂覆的固体支持物上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体的结合。任选地，标记的ACE2受体，包括截短的、修饰的ACE2受体或ACE2融合蛋白(例如，ACE2R-Fc)可以与样品一起孵育。在另一任选实施方式中，洗涤涂覆的固体支持物，以去除未结合的样品，然后将标记的ACE2受体添加到涂覆的固体支持物。其他实施方式省略了将标记的ACE2受体添加到涂覆的固体基材。孵育后，可以洗去未结合的样品，并且可以添加标记的抗Ig(抗IgG、IgM、IgA、抗κ或抗λ)抗体，以能够检测来自与固定于固体支持物上的SARSCoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的样品的中和抗体。当检测或定量一种或多种细胞因子以及中和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的抗体时，可以使用对所选的一种或多种细胞因子具有特异性的标记的抗体来检测一种或多种细胞因子的存在或定量。可以在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育和洗涤。各个测定的特性通过染色珠的荧光特征确定，而细胞因子或抗原捕获的中和抗体的数量通过附着的标记的抗Ig的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各涂覆的蛋白质的结果可以各自报告，作为一组或一些类型的预定义算法报告，或其任何组合形式报告。如上所述，生物样品可以获自感染SARS-CoV2的个体，用对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段具有特异性的中和抗体治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白(诸如本文所公开的刺突蛋白变体或其片段)的疫苗疫苗接种的个体。

在本发明的第二个方面，ACE2受体(优选人ACE2受体和/或包括截短的、修饰的ACE2受体或ACE2融合蛋白)可以用于识别其上固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段并且未结合中和抗体的基材。该多重测定如图1所示。在本发明的这个方面中，ACE2受体可以是标记的或未标记的。因此，一个实施方式提供了珠群体，其包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的一个或多个珠亚群。该珠群体与ACE2受体和样品的混合物混合(接触)，或者该珠群体首先与样品接触，洗涤该珠群体，然后将ACE2受体添加到经洗涤的珠群体。在将经洗涤的珠群体与ACE2受体孵育后，洗涤珠群体，然后与对ACE2受体具有特异性的生物素化抗体接触。将珠群体洗涤，以去除未结合的生物素化抗体，并将链霉亲和素-PE添加到珠群体中。可以洗涤珠群体，然后将其与对照样品进行比较。阴性信号(SARS-CoV2刺突蛋白、给定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的信号缺失或信号减弱)表明样品中存在中和抗体。生物样品可以获自感染SARS-CoV2的个体，用对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段具有特异性的中和抗体治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白(诸如本文所公开的刺突蛋白变体或其片段)的疫苗疫苗接种的个体。

第二实施方式利用标记的ACE2受体，包括截短和/或修饰的ACE2受体，或ACE2融合蛋白，用于检测未结合中和抗体的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。在该实施方式中，提供了珠群体，其包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的一个或多个珠亚群。该珠群体与标记的ACE2受体和样品的混合物混合(接触)，或者该珠群体首先与样品接触，洗涤该珠群体，然后将标记的ACE2受体添加到经洗涤的珠群体。洗涤珠群体，以去除未结合的标记的ACE2受体和血清蛋白(例如抗体)，然后与对照样品进行比较。阴性信号(SARS-CoV-2刺突蛋白、给定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的信号缺失或信号减弱)表明样品中存在中和抗体。生物样品可以获自感染SARS-CoV2的个体，用对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段具有特异性的中和抗体治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白(诸如本文所公开的刺突蛋白变体或其片段)的疫苗疫苗接种的个体。

本发明的第三方面提供了用于检测高亲合力抗体的免疫测定。在这些免疫测定中，用SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或者SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段涂覆固体支持物(例如，可以通过不同的荧光染料/特征相互区分的荧光标记珠(也称为染色珠))。然后将一种或多种涂覆的固体支持物与患者样品(例如，来自怀疑已暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品)以及样品稀释剂组合并进行孵育，以促进中和抗体的结合，所述中和抗体能够特异性结合涂覆的固体支持物上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。然后将生物样品从固体支持物上移除，并且任选地，洗涤以去除未结合的蛋白质和抗体。然后将一种或多种离液剂(例如，1M NaCL)添加到固体支持物以置换低亲合力抗体。孵育期后，将离液剂和未结合的低亲合力抗体从涂覆的固体支持物去除(例如，通过离心和抽吸)，并且可以洗涤涂覆的固体支持物。将一种或多种涂覆的固体支持物洗涤并标记，或者然后将生物素化ACE2受体添加到一种或多种涂覆的固体支持物并检测信号。高亲合力抗体的存在通过来自标记的ACE2受体(相对于对照)的信号降低或信号缺失来确定。当添加到抗体结合的涂覆的固体支持物时，一种或多种离液剂可以约0.1M-约8M的浓度使用。离液剂的非限制性示例是氯化钠、尿素、盐酸胍、硫氰酸胍和/或硫氰酸钠。尿素和/或硫氰酸钠的有效浓度可以在0.1M和8M之间。硫氰酸胍的有效浓度可以在0.1M和6M之间。氯化钠的有效浓度可以在0.1M和5M之间。然后，可以添加标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)以能够进行检测。

相对“高”或“低”亲合力可以通过比较两个或多个抗体亚群之间的信号来确定。两个或多个抗体亚群的信号可以在整个测定过程中测量，即在添加离液剂之前和之后。或者，可以在测定结束时测量两个或多个抗体亚群的信号。

其他实施方式省略了将标记的ACE2受体添加到一种或多种涂覆的固体基材并利用标记的抗Ig抗体来检测高亲合力抗体。在该实施方式中，在与一种或多种离液剂孵育后，去除和/或洗去低亲合力抗体和离液剂，并且可以添加标记抗Ig(抗IgG、IgM、IgA、抗κ或抗λ)抗体，以能够检测来自与固定于固体支持物上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的样品的高亲合力结合抗体。信号的存在表明样品内存在高亲合力抗体，这可以通过与对照样品进行比较来定量。当添加到抗体结合的涂覆的固体支持物时，一种或多种离液剂可以约0.1M-约10M的浓度使用。离液剂的非限制性示例是氯化钠、尿素、盐酸胍、硫氰酸胍和/或硫氰酸钠。

本发明的第四方面提供了用于检测中和抗体的单重免疫测定。在这些免疫测定中，用SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或者SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段涂覆固体支持物(例如，荧光标记珠(也称为染色珠)。然后将涂覆的固体支持物与患者样品(例如，来自怀疑已暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品)以及样品稀释剂组合并进行孵育，以促进中和抗体的结合，所述中和抗体能够特异性结合涂覆的固体支持物上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。然后将生物样品从固体支持物上移除，并且任选地，洗涤以去除未结合的蛋白质和抗体。将涂覆的固体支持物洗涤并标记，或者然后将生物素化ACE2受体添加到涂覆的固体支持物并检测信号。中和抗体的存在通过来自标记的ACE2受体(相对于对照)的信号降低或信号缺失来确定。

使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex平台，例如LX-200、Magpix、Flexmap360等进行标记的ACE2受体或标记的抗Ig的检测。各个测定的特性通过染色珠的荧光特征确定，而SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段捕获的高亲合力中和抗体的数量通过附着的标记的抗Ig或标记的ACE2受体的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。或者，抗体的中和浓度——50％的抗原被中和时的浓度——可以使用连续稀释来确定。各涂覆的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。如上所述，生物样品可以获自感染SARS-CoV2的个体，用对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段具有特异性的中和和/或保护性抗体治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白(诸如本文所公开的刺突蛋白变体或其片段)的疫苗疫苗接种的个体。如上所述，所公开的各种免疫测定可以利用SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段作为分析物。在本发明的上下文中，任何特定SARS-CoV-2刺突蛋白变体的片段可以包含约5至约50、约10至约40、约15至约30、约20、约10或约5个氨基酸，前提是氨基酸的范围包括表1中确定的一个或多个氨基酸突变。如上所述，SARS-CoV-2刺突蛋白变体的片段长度范围可以从5个氨基酸到(n-1)个连续蛋白质的氨基酸，其中n是SARS-CoV-2刺突蛋白的总长度、刺突蛋白的S1片段或刺突蛋白的S2片段。因此，对于刺突蛋白，片段长度在5到1272个连续氨基酸之间。在一个实施方式中，刺突蛋白的片段横跨刺突蛋白序列的氨基酸13-1213。在另一实施方式中，片段是S1蛋白的RBD或RBD的片段。对于S1蛋白(公开的刺突蛋白长度的氨基酸13-685)，片段是S1序列的5到672个连续氨基酸。对于S2蛋白(公开的刺突蛋白的氨基酸686-1273)，片段长度是5到588个连续氨基酸长度。

SEQ ID NO:1

SARS-CoV-2刺突蛋白(1273AA MW 141178)

SARS-CoV-2S1蛋白(AA 13-685)

SARS-CoV-2S2蛋白(AA 686-1273)

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVXNATRFASVYAWXRKRISNCVADYSXLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIXWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRXSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGXEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRXAXSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDXXEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

SEQ ID NO:2

>QJF75467.1表面糖蛋白[严重急性呼吸综合征冠状病毒2]

SARS-CoV-2刺突蛋白(1273 AA MW 141178)

SARS-CoV-2S1蛋白(AA 13-685)

SARS-CoV-2S2蛋白(AA 686-1273)

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVXNATRFASVYAWXRKRISNCVADYSXLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIXWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRXSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGXEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRXAXSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDXXEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAH

229841 1PWCN_说明书替换页

FPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

SEQ ID NO:3

YP_009724390.1表面糖蛋白[严重急性呼吸综合征冠状病毒2]

SARS-CoV-2刺突蛋白(1273AA MW 141178)

SARS-CoV-2S1蛋白(AA 13-685)

SARS-CoV-2S2蛋白(AA 686-1273)

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR/SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

SEQ ID NO:4

ACE2[智人(Homo sapiens)]

GenBank:BAB40370.1

>BAB40370.1 ACE2[智人]

MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDRAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF

各种非限制性实施方式包括：

1.一种包含颗粒或珠群体的基材，其包含颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群，各颗粒或珠亚群可以通过特异性可检测参数区分，并且各珠亚群包含固定在其上的不同的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，以及任选地，另一珠亚群包含固定在其上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。

2.如实施方式1所述的基材，其中，所述基材是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝化纤维。

3.如实施方式1或2所述的基材，其中，所述基材是颗粒。

4.如实施方式1或2所述的基材，其中，所述基材是珠。

5.如实施方式4所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

a)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变V367X，其中X是任何氨基酸或X是F；

b)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变F342X，其中X是任何氨基酸或X是L；

c)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变A435X，其中X是任何氨基酸或X是S；

d)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变K458X，其中X是任何氨基酸或X是L；

e)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变V483X，其中X是任何氨基酸或X是A；

f)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变V483X，其中X是任何氨基酸或X是A；

g)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第七特异性可检测物理参数的第七颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变N354X，其中X是任何氨基酸或X是D；

h)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第八特异性可检测物理参数的第八颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变R683X1和/或R685X2，其中X1和X2是任何氨基酸或X1和X2是A；

i)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第九特异性可检测物理参数的第九颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变K986X3和/或V987X4，其中X3和X4是任何氨基酸或X3和X4是P；

j)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第十特异性可检测物理参数的第十颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变R683X1、R685X2、K986X3和V987X4，其中X1是任何氨基酸或X1是A；X2是任何氨基酸或X2是A；X3是任何氨基酸或X3是P；X4是任何氨基酸或X4是P；和

k)SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，其固定在具有第十一特异性可检测物理参数的第十一颗粒或珠上。

6.如实施方式5所述的基材，其中，所述颗粒或珠群体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个颗粒或珠亚群，各亚群具有特异性可检测物理参数。

7.如实施方式4-6中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

8.如实施方式7所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

9.一种用于检测哺乳动物中的中和和/或保护性抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包含实施方式1-8中任一项所述的基材的基材接触，并且检测与所述基材表面上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的中和抗体的存在与否。

10.如实施方式9所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

11.如实施方式9-10中任一项所述的方法，其中，所述中和抗体的存在与否包括使所述基材与人ACE2受体接触并检测与基材亚群结合的ACE2受体的存在与否，所述基材亚群上已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，检测到与基材亚群结合的ACE2受体表明缺失对特定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体。

12.如实施方式11所述的方法，其中，与基材亚群结合的ACE2受体使用对经可检测标记的ACE2受体具有特异性的抗体检测。

13.如实施方式11所述的方法，其中，与基材亚群结合的ACE2受体使用对经可检测标记的ACE2受体检测。

14.如实施方式13所述的方法，其中，ACE2受体用藻红蛋白(PE)标记或经生物素化并使用链霉亲和素-PE检测。

15.如实施方式9或10所述的方法，其中，与包含给定SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材结合的中和抗体使用物种特异性抗免疫球蛋白(Ig)抗体检测。

16.如实施方式15所述的方法，其中，抗Ig抗体经生物素化，并且与中和抗体的结合用标记的亲和素或链霉亲和素检测。

17.如实施方式15所述的方法，其中，抗-Ig抗体经标记。

18.如实施方式16或实施方式17所述的方法，其中，所述标记物是荧光团。

19.如实施方式18所述的方法，其中，荧光团是PE。

20.如实施方式9-19中任一项所述的方法，所述方法进一步包括检测所述生物样品中选自下述的细胞因子的存在、不存在或数量：IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。

21.如实施方式20所述的方法，其中，所述检测一种或多种细胞因子包括接触一个或多个珠亚群，所述珠亚群上通过对各种选择的细胞因子具有特异性的抗体固定有细胞因子，并用对细胞因子具有特异性的抗体检测结合的细胞因子和确定细胞因子结合的各个珠亚群的荧光强度。

22.如实施方式21所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

23.如实施方式20-22中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗免疫球蛋白(抗Ig)抗体，和任选地，用荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂或放射性同位素可检测标记的细胞因子特异性抗体。

24.如实施方式23所述的方法，其中，所述抗-Ig抗体用荧光团可检测标记并且所述抗细胞因子抗体用荧光团标记，并且在测定时，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

25.如实施方式20-23中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗Ig抗体和细胞因子特异性抗体，在测定时，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与可检测标记的生物素结合配体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

26.如实施方式25所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

27.如实施方式20-26中任一项的方法，其中，所述一种或多种细胞因子是IL-6和/或IL-2R。

28.如实施方式20-27中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞因子选自：IL-6、IL-2R、粒细胞集落刺激因子、IP-10、MCP-1、巨噬细胞炎性蛋白-1A、TNF-α及其组合。

29.如实施方式9-28中任一项所述的方法，其中，中和抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

30.如实施方式29所述的方法，其中，多克隆抗体或单克隆抗体是人多克隆抗体或人单克隆抗体。

31.如实施方式29所述的方法，其中，中和抗体是选自下述的重组抗体：人源化抗体，嵌合抗体，CDR移植抗体，纳米抗体，Fv，单域抗体，例如VH、VL或VHH，scFv，二价抗体，三价抗体，四价抗体，bis-scFv，双抗体，三抗体，四抗体及其片段，前提是所述二价抗体、三价抗体、四价抗体、bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体或其片段的至少一个抗原结合部分中和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

32.一种用于检测哺乳动物中高亲合力中和抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包含实施方式1-8中任一项所述的基材的基材接触，并且检测与所述基材表面上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的高亲合力中和抗体的存在与否。

33.如实施方式32所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

34.如实施方式32-33中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：

a)使基材与生物样品接触；

b)任选地，从基材去除生物样品并洗涤基材以去除未结合的材料和抗体；

c)使基材与一种或多种离液剂接触；

d)从基材去除一种或多种离液剂；

e)任选地，洗涤基材；和

f)检测与基材亚群结合的高亲合力中和抗体的存在与否，所述基材亚群上已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

35.如实施方式34所述的方法，其中，离液剂是氯化钠、硫氰酸钠和/或尿素。

36.如实施方式32-35所述的方法，其中，所述方法包括检测存在于具有ACE2受体的基材上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

37.如实施方式36所述的方法，其中，与基材结合的ACE2受体使用经可检测标记的ACE2受体或用经可检测标记的ACE2受体特异性抗体检测。

38.如实施方式37所述的方法，其中，ACE2受体用藻红蛋白(PE)标记或经生物素化并使用链霉亲和素-PE检测。

39.如实施方式32-35中任一项所述的方法，其中，与包含给定SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材结合的高亲合力抗体使用物种特异性抗免疫球蛋白(Ig)抗体检测。

40.如实施方式39所述的方法，其中，抗Ig抗体经生物素化，并且与中和抗体的结合用标记的亲和素或链霉亲和素检测。

41.如实施方式39所述的方法，其中，抗-Ig抗体经标记。

42.如实施方式40或实施方式41所述的方法，其中，所述标记物是荧光团。

43.如实施方式42所述的方法，其中，荧光团是PE。

44.一种用于检测哺乳动物中的中和抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与实施方式1中所述的基材接触并检测与所述基材表面上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的中和抗体的存在与否，所述生物样品获自疑似感染病毒的个体，用SARS-CoV-2中和抗体或恢复期血浆治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗疫苗免疫的个体。

45.如实施方式44所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

46.如实施方式44-45中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：

a)使基材与生物样品接触；

b)任选地，从基材去除生物样品并洗涤基材以去除未结合的材料和抗体；和

c)检测与基材群体结合的中和抗体的存在与否，所述基材群体上已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

47.如实施方式44-46所述的方法，其中，所述方法包括检测存在于具有ACE2受体的基材上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

48.如实施方式47所述的方法，其中，与基材结合的ACE2受体使用经可检测标记的ACE2受体或用经可检测标记的ACE2受体特异性抗体检测。

49.如实施方式48所述的方法，其中，ACE2受体用藻红蛋白(PE)标记或经生物素化并使用链霉亲和素-PE检测。

50.如实施方式49所述的方法，其中，ACE2受体是生物素化ACE2-Fc融合体，并使用链霉亲和素-PE检测。

51.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，ACE2受体是截短的或修饰的ACE2受体或者是ACE2受体融合蛋白。

52.如实施方式51所述的方法，其中，ACE2受体融合蛋白包含与ACE2受体的羧基末端融合的免疫球蛋白Fc结构域。

53.如实施方式52所述的方法，其中，融合蛋白在Fc结构域上生物素化。

实施例

实施例1-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体的测量

将包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的多个荧光标记珠亚群的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品，并将生物素化人ACE2受体添加至经洗涤的珠并孵育。然后洗去未结合的生物素化人ACE2受体，并添加标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)。在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex200或Luminex LX-200平台进行检测前，对反应进行孵育，然后进行洗涤。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中没有中和抗体。

图4显示了通过两名COVID-19患者血清的RBD-生物素化ACE2相互作用的抑制百分比。将样品在基础基质中连续稀释，并通过Bio-Plex 2200试验测试中和抗体的存在。通过计算各个样品的半数最大抑制浓度(IC₅₀)对中和效力进行定量。使用下述公式计算抑制百分比：1-(各稀释样品的RFI/基质RFI)。样品1在原始样品0.135稀释度下显示出IC₅₀，样品2在原始样品0.110稀释度下显示出IC₅₀。这些结果支持Bio-Plex 2200试验在定量中和抗体方面的效用。

实施例2-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体的多重检测

将包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的多个荧光标记珠亚群的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品，并将人ACE2受体添加至经洗涤的珠并孵育。然后洗去未结合的人ACE2受体。添加对人ACE2受体具有特异性的生物素化抗体。孵育反应，然后洗涤，并将链霉亲和素-PE添加到经洗涤的珠群体中并孵育。孵育后，在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，洗涤珠群体。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中没有中和抗体。

实施例3–对IL-6和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体的多重检测

荧光标记珠群体包含：1)荧光标记珠亚群，其已固定有对IL-6具有特异性的抗体；2)一个或多个荧光标记珠亚群，其已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，将它们与患者样品合并，例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2的个体的生物样品-2病毒或来自用包含刺突蛋白的疫苗接种的对象的生物样品来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品或来自已经用包含刺突蛋白的疫苗疫苗接种的对象的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品。将生物素化人ACE2受体和IL-6特异性生物素化抗体添加至经洗涤的珠并允许进行孵育。生物素化抗体结合与珠结合的IL-6，所述珠上已固定有对IL-6具有特异性的抗体，而生物素化人ACE2受体结合固定在相关珠亚群(无中和抗体结合)上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。然后洗去未结合的生物素化试剂，并添加标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以能够检测样品中的IL-6以及其上中和抗体未与给定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或片段结合的珠。在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，对反应进行孵育，然后进行洗涤。珠亚群的特性通过染色珠的荧光特征确定，而IL-6的数量和/或存在通过接合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中没有中和抗体。

实施例4-对IL-6和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段特异性中和抗体的多重检测

荧光标记珠群体包含：1)一个或多个荧光标记珠亚群，其已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段；2)荧光标记珠亚群，其已固定有对IL-6具有特异性的单克隆和/或多克隆抗体，将它们与患者样品合并，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2病毒或已经用包含刺突蛋白的SARS-CoV-2疫苗进行免疫的个体的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品。将人ACE2受体添加到经洗涤的珠，并允许进行孵育。洗去未结合的人ACE2受体，并将对人ACE2具有特异性的生物素化抗体和对IL-6具有特异性的生物素化抗体添加到经洗涤的珠，并允许进行孵育。生物素化抗体与结合至固定在其各自的珠亚群上的抗体的IL-6结合，，而人ACE2结合至其上已固定有给定的刺突蛋白或其片段的一个或多个珠亚群，然后可通过添加链霉亲和素标记的PE来检测无中和抗体的珠。然后洗去未结合的生物素化试剂，并将标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)添加，以能够检测IL-6和对刺突蛋白变体或片段具有特异性的结合的中和抗体。在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，对反应进行孵育，然后进行洗涤。珠亚群的特性通过染色珠的荧光特征确定，而捕获的IL-6的数量通过接合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中没有中和抗体。

实施例5-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体的多重检测

将包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的多个荧光标记珠亚群的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品，并将对人免疫球蛋白具有特异性的生物素化抗体(抗IgA、抗IgM、抗IgG、抗κ链和/或抗λ链抗体)添加到经洗涤的珠中并孵育。然后洗去未结合的生物素化抗人抗体，并添加标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)。在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，对反应进行孵育，然后进行洗涤。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明样品中不存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中存在中和抗体并且还可以定量中和抗体的数量。可以将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成存在于该样品中的中和抗体数量的定性、半定量或定量结果。

实施例6-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的高亲合力抗体的多重检测

将包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的多个荧光标记珠亚群的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。SARS-CoV-2中和试验结合了等分的患者样品，不同浓度的离液剂样品稀释剂，和生物素化人ACE2蛋白。短暂孵育后，将包含偶联的SARS-CoV-2刺突蛋白变体、RBD和突变体变体或其片段的珠混合物添加到反应容器中。在约37℃下孵育一段时间后，洗涤混合物并将珠悬浮在链霉亲和素-PE偶联试剂中；将混合物在37℃下再次孵育。在另一个洗涤周期中去除多余的未结合的偶联物，并将经洗涤的珠重悬于洗涤缓冲液中。染色珠的特性通过染料的荧光和SARS-CoV-2刺突蛋白变体、RBD及其突变体变体或片段捕获的生物素化人ACE2的量确定。附着的藻红蛋白的荧光使用Bio-Plex2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台确定，以检测生物素化ACE2受体的结合。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成相对荧光强度(RFI)，以及后续定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白(或其片段)或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号或该信号降低表明存在高亲和力中和抗体并且可以定量高亲和力抗体的数量。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中没有中和抗体或存在低亲合力中和抗体。

表3显示了存在和不存在离液剂(氯化钠)的情况下的抑制百分比。虽然一些COVID-19样品在离液剂存在的情况下表现出中和效果的丧失，但其他样品没有效果。总的来说，这些结果表明存在不受1M氯化钠影响的高亲合力抗体。生物样品中高亲合力抗体的确定可以在区分保护性和/或灭菌抗体方面提供附加的诊断确定性。

实施例7-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的高亲合力抗体的多重检测

将包含固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的多个荧光标记珠亚群的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。未结合的样品从珠群体中去除并可以用缓冲液洗涤珠群体。然后将1M NaCl添加到珠中并与珠群体孵育。孵育一段时间后，将在孵育期间置换的抗体(低亲合力抗体)和1M NaCl从珠群体去除并可以用缓冲液洗涤珠群体。将对人免疫球蛋白具有特异性的生物素化抗体(抗IgA、抗IgM、抗IgG、抗κ链和/或抗λ链抗体)添加到经洗涤的珠中并孵育。然后洗去未结合的生物素化抗人抗体，并添加标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)。在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，对反应进行孵育，然后进行洗涤。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成相对荧光强度(RFI)，以及后续定性、半定量或定量结果。缺失已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白(或其片段)或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的低亲合力中和抗体和/或没有中和抗体。存在已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的特定珠亚群的信号表明该样品中存在高亲合力中和抗体并且还可以定量高亲合力中和抗体的数量。例如，可以将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成存在于该样品中的高亲合力中和抗体数量的定性、半定量或定量结果。

实施例8-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体的单重检测

将固定有个体SARS-CoV-2刺突蛋白、刺突蛋白变体或其片段的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品，并将生物素化人ACE2受体添加至经洗涤的珠并孵育。孵育反应，然后洗涤，并将链霉亲和素-PE添加到经洗涤的珠群体中并孵育。孵育后，在使用Bio-Plex 2200、Bio-Plex 200或LuminexLX-200平台进行检测前，洗涤珠群体。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成相对荧光强度(RFI)，以及后续定性、半定量或定量结果。信号缺失或信号降低(相对于一组标准品或校准品)表明该样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。

实施例9-对SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体的单重检测

将固定有个体SARS-CoV-2刺突蛋白、刺突蛋白变体或其片段的荧光标记珠群体与患者样品接触，例如，来自疑似已经暴露于SARS-CoV-2的个体或已经用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗以及样品稀释剂进行免疫的对象的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品。将生物素化融合蛋白添加到经洗涤的珠并孵育，所述生物素融合蛋白包含与免疫球蛋白Fc结构域融合的人ACE2受体(在Fc结构域上生物素化的hACE2R-Fc融合蛋白)。孵育反应，然后洗涤，并将链霉亲和素-PE添加到经洗涤的珠群体中并孵育。孵育后，在使用Bio-Plex2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，洗涤珠群体。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成相对荧光强度(RFI)，以及后续定性、半定量或定量结果。信号缺失或信号降低(相对于一组标准品或校准品)表明该样品中存在针对该SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的中和抗体。

实施例10-SARS-CoV2中和抗体测定-特异性

对总计583个样品进行了抗SARS-COV2中和抗体和IgG抗体检测，所述样品包括483个入院正常(接受常规检查的对象的样品)和100个孕妇样品。所有测试的样品在2019年11月之前采集。在高盐和低盐存在的情况下进行nAb(中和抗体)测定测试，以分别检测高亲合力抗体和低亲合力抗体。表4中提供的百分比指代不包含SARS-CoV-2抗原特异性IgG或中和抗体的样品百分比。

表4

HS：高盐(1M NaCl)；LS：低盐(0.15M NaCl)

nAb截止值：0.35ug/mL；血清学IgG测定截止值：10U/mL

实施例11-SARS-CoV2中和抗体测定-交叉反应性

血清学测试的分析特异性是衡量其识别特异性抗体同时排除其他非特异性抗体能力的量度。交叉反应性指代配体支持与非待测抗体结合并导致假阳性测试结果的能力。测试收集自32个患病组的283个样品在nAb和血清学IgG测定中的交叉反应性。列表仅显示了两种分析物RBD和S1的交叉反应性。在高盐(1M NaCl)和低盐(0.15M NaCl)存在的情况下进行nAb测定，以分别检测高亲合力抗体和低亲合力抗体。

表5

实施例12-SARS-CoV2中和抗体测定-阳性率

来自COVID患者的578个独特样品购自商业供应商。在578个样品中，453个(78.4％)带有完整的人口统计数据和PCR检测结果。所有样品通过BioPlex 2200血清学IgG测定和中和抗体(nAb)测定进行测试。虽然收集了所有四种分析物(RBD、S1、S2和N)的血清学IgG数据，但下表仅显示了RBD和S1分析物的数据。仅使用RBD和S1偶联的珠对高亲和力和低亲合力nAb的存在进行测试。在1M氯化钠(HS)和0.15M NaCL(LS)存在的情况下检测到高亲合力抗体。

表6：显示IgG和中和抗体的阳性样品数量

表7：显示IgG和中和抗体的阳性样品百分比

实施例13-SARS-CoV2中和抗体测定-一致性

为了进行方法比较，将BioPlex 2200中和抗体测定与血清学IgG测定和样品的临床状态进行了比较。临床状态根据与PCR检测结关联的临床发现确定。虽然无论亲合力状态如何，阴性一致性(％NA)在nAb(中和抗体)、血清学IgG和临床状态之间具有可比性，但是阳性一致性(％PA)显示在低盐存在的情况下，nAb、血清学IgG和临床状态之间存在更好的相关性。低盐(LS)指0.15M NaCl，高盐(HS)指1M NaCl)。阴性一致性在低盐和高盐条件下保持不变。然而，阳性一致性并不如此。这为抗体状态不能预测中和效力的假设提供了证据。

表8

实施例14-SARS-CoV2中和抗体测定-与血清学抗RBD IgG测定的相关性

对675份COVID19患者血清样品进行了SARS-CoV-2血清学IgG测定和中和抗体测定。在675例患者中，453例通过PCR阳性检测结果确诊。该测试结果证明了抗RBD结合IgG抗体和中和抗体之间的相关性。然而，如图5A和5B所示，大约5％的样品表现出高血清学IgG和低nAb反应，反之亦然。

实施例15-SARS-CoV2中和抗体测定-早期感染的患者样品缺乏对某些RBD突变体的中和作用

在中和抗体测定中测试十二种RBD突变体(F342L、N354D、V36F、E406Q、A435S、K458R、E471Q、S477N、V483A、P521R、P521S和A522V)以及野生型RBD，完整三聚体刺突蛋白和主要大流行突变体形式D614G。相较于野生型RBD、三聚刺突蛋白和D614G S1突变体，所有RBD突变体都表现出更高的ACE-2受体结合能力。COVID19患者血清样品对四种RBD突变体——N354D、V367F、S477N和V483A——的抑制作用显著降低，特别是在早期感染SARS-CoV2的患者中(参见表9和图6-11)。

图6-9说明了在低盐条件(LS＝0.15M NaCl，图6和7)和高盐条件(HS＝1M NaCl，图8和9)下对2020年3月前及2020年6月后获得的样品中针对各种突变体的样品中存在的中和抗体。当抗体介导的抑制标准化至100％野生型时，RBD突变体对2020年6月之前和之后收集的样品表现出不同的nAb反应(图10为低盐条件，图11为高盐条件)。虽然高盐表现出略微升高的抑制作用，但反应模式看起来相似。低盐条件为0.15M NaCl，高盐条件为1MNaCl。

参考文献

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序列表

<110> 生物辐射实验室股份有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.）

<120> 用于SARS-COV-2中和抗体的免疫测定及其材料

<130> BRL.144C2XPCT

<150> US 63/053,888

<151> 2020-07-20

<150> US 63/088,195

<151> 2020-10-06

<150> US 63/114,685

<151> 2020-11-17

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<170> PatentIn version 3.5

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305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 4

<211> 805

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

405 410 415

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

420 425 430

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

435 440 445

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

450 455 460

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

465 470 475 480

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe

500 505 510

Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala

515 520 525

Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile

530 535 540

Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu

545 550 555 560

Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala

565 570 575

Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe

580 585 590

Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr

595 600 605

Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu

610 615 620

Lys Ser Ala Leu Gly Asp Arg Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met

625 630 635 640

Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu

645 650 655

Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val

660 665 670

Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro

675 680 685

Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile

690 695 700

Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn

705 710 715 720

Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln

725 730 735

Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val

740 745 750

Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg

755 760 765

Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile

770 775 780

Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp

785 790 795 800

Val Gln Thr Ser Phe

805

Claims (21)

1.一种包含颗粒或珠群体的基材，其包含颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群，各颗粒或珠亚群能够通过特异性可检测参数区分，并且各珠亚群包含固定在其上的不同的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，以及任选地，另一珠亚群包含固定在其上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。

2.如权利要求1所述的基材，其中，所述基材是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝化纤维。

3.如权利要求1所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

a)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变V367X，其中X是任何氨基酸或X是F；

b)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变F342X，其中X是任何氨基酸或X是L；

c)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变A435X，其中X是任何氨基酸或X是S；

d)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变K458X，其中X是任何氨基酸或X是L；

e)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变V483X，其中X是任何氨基酸或X是A；

f)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变V483X，其中X是任何氨基酸或X是A；

g)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第七特异性可检测物理参数的第七颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变N354X，其中X是任何氨基酸或X是D；

h)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第八特异性可检测物理参数的第八颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变R683X1和/或R685X2，其中X1和X2是任何氨基酸或X1和X2是A；

i)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第九特异性可检测物理参数的第九颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变K986X3和/或V987X4，其中X3和X4是任何氨基酸或X3和X4是P；

j)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其固定在具有第十特异性可检测物理参数的第十颗粒或珠上，所述SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段包含突变R683X1、R685X2、K986X3和V987X4，其中X1是任何氨基酸或X1是A；X2是任何氨基酸或X2是A；X3是任何氨基酸或X3是P；且X4是任何氨基酸或X4是P；和

k)SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，其固定在具有第十一特异性可检测物理参数的第十一颗粒或珠上。

4.如权利要求3所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

5.如权利要求4所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

6.一种用于检测哺乳动物中的中和和/或保护性抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包含权利要求1所述的基材的基材接触，并且检测与所述基材表面上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的中和抗体的存在与否。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述中和抗体的存在与否包括使所述基材与人ACE2受体接触并检测ACE2受体与基材亚群的结合的存在与否，所述基材亚群上已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，检测到ACE2受体与基材亚群的结合表明缺失对特定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段具有特异性的中和抗体。

9.如权利要求8所述的方法，其中，ACE2受体与基材亚群的结合使用经可检测标记的ACE2受体的特异性抗体或经可检测标记的ACE2受体检测。

10.如权利要求6所述的方法，其中，与包含给定SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材结合的中和抗体使用物种特异性抗免疫球蛋白(Ig)抗体检测。

11.如权利要求6所述的方法，所述方法进一步包括检测所述生物样品中选自下述的细胞因子的存在、不存在或数量：IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述一种或多种细胞因子选自：IL-6、IL-2R、粒细胞集落刺激因子、IP-10、MCP-1、巨噬细胞炎性蛋白-1A、TNF-α及其组合。

13.一种用于检测哺乳动物中高亲合力中和抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包含权利要求1所述的基材的基材接触，并且检测与所述基材表面上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的高亲合力中和抗体的存在与否。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述方法包括：

a)使所述基材与所述生物样品接触；

b)任选地，从所述基材去除所述生物样品并洗涤所述基材以去除未结合的材料和抗体；

c)使所述基材与一种或多种离液剂接触；

d)从所述基材去除所述一种或多种离液剂；

e)任选地，洗涤所述基材；和

f)检测高亲合力中和抗体与基材亚群的结合的存在与否，所述基材亚群上已固定有SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述离液剂是氯化钠、硫氰酸钠和/或尿素。

16.如权利要求13所述的方法，其中，所述方法包括检测存在于基材上的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，所述基材具有经可检测标记的ACE2受体或具有经可检测标记的ACE2受体特异性抗体。

17.如权利要求13所述的方法，其中，与包含给定SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段的基材结合的高亲合力抗体使用物种特异性抗免疫球蛋白(Ig)抗体检测，其中，所述抗Ig抗体经生物素化，并且所述抗IgG抗体与中和抗体的结合用荧光团标记的亲和素或链霉亲和素或用荧光团标记的抗IgG抗体检测。

18.一种用于检测哺乳动物中中和抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与权利要求1中所述的基材接触并检测与所述基材表面上的SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段结合的中和抗体的存在与否，所述生物样品获自疑似感染该病毒的个体，用SARS-CoV-2中和抗体或恢复期血浆治疗的个体，或用包含SARS-CoV2刺突蛋白的疫苗疫苗免疫的个体。

19.如权利要求9所述的方法，其中，所述ACE2受体是截短的或修饰的ACE2受体或者是ACE2受体融合蛋白。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述ACE2受体融合蛋白包含与ACE2受体的羧基末端融合的免疫球蛋白Fc结构域。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述融合蛋白在Fc结构域上经生物素化并使用链霉亲和素-PE检测。