CN114217067A - 一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种SARS‑CoV‑2抗体的定量检测方法，能够结合S1RBD蛋白多肽，或者ACE2蛋白多肽及它们对应的抗体混合物，以及使用这些抗体和抗原多肽进行的分析检验。

Description

一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法。
背景技术
血管紧张素转化酶2(ACE2)是附着于位于肺、动脉、心脏、肾脏和肠的细胞的细胞膜上的酶。一方面，ACE2可以通过催化血管紧张素II(一种血管收缩肽)水解为血管紧张素(1-7)(一种血管扩张剂)来降低血压。另一方面，可以ACE2通过减少血管紧张素II的量和增加Ang(1-7)来对抗相关血管紧张素转化酶(ACE)的活性。由此，使ACE2成为治疗心血管疾病的有希望的药物靶标。特别地，ACE2还充当某些冠状病毒的细胞进入点，上述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV和SARS-CoV-2。
在2002年之前，冠状病毒仅被称为人类的次要病原体，约占普通感冒的15-25％。然而，由新型冠状病毒SARS-CoV引起的2002年SARS严重暴发的出现，促使公众对由冠状病毒引起的疾病保持警惕。迄今为止，存在七种已知的人畜共患病冠状病毒，它们可引起人类疾病，其中冠状病毒MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV-2被确定为严重急性呼吸系统综合症的病因。COVID-19的病原体是SARS-CoV-2(急性呼吸综合症冠状病毒2)，属于冠状病毒科病毒的成员，该病毒会在哺乳动物中引起呼吸系统，肝脏，肠道和神经系统疾病。
如上，COVID-19由SARS-CoV-2病毒引起，感染的关键步骤是病毒进入人宿主细胞时，由病毒颗粒表面上的SARS-CoV-2Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)与人体细胞表面上的血管紧张素I转换酶2(ACE2)受体相互作用所致。SARS-CoV-2对人体细胞上的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)具有足够的亲和力，可将其用作细胞进入的机制。研究表明，SARS-CoV-2与原始SARS病毒株相比对人ACE2具有更高的亲和力。跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)引发的初始刺突蛋白引发对于SARS-CoV-2的进入至关重要。SARS-CoV-2病毒体附着到靶细胞后，该细胞的蛋白酶TMPRSS2切开病毒的刺突蛋白，使S2亚基中的融合肽和宿主受体ACE2暴露。融合后，内体在病毒体周围形成，将其与宿主细胞的其余部分分离。当内体的pH降低或宿主组织半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶将其裂解时，病毒粒子会逸出。然后，病毒体将RNA释放到细胞中，并迫使细胞产生并传播病毒的拷贝，从而感染更多的细胞。
新型冠状病毒具有传染性强、传播速度快、潜伏期长等特点，目前关于新型冠状病毒的研究主要集中在快速检测、疫苗和药物等方面。当前，可以使用的一种针对SARS-CoV-2病毒的测试是Barnhizer&Faro的测试(美国专利序列号10/844,442)。该测试是经典的酶联免疫球蛋白夹心测定法，为将源自人ACE2蛋白的多肽片段固定在微量滴定板的表面上，利用细菌表达的SARS-CoV-2Spike(S)蛋白受体结合域的片段(S1RBD)与其接触，在去除未结合的S1RBD之后，使用标记的抗S1RBD抗体检测ACE2-S1RBD复合体。但是，该测试的灵敏度较低，需要微克数量的主要目标才能获得可检测的信号。在COVID-19防治工作中，检测和评价疫苗免疫后血清中抗体水平是一个关键的环节。疫苗注射后体内抗体的含量根据注射次数变化而不一致，目前，广泛应用于检测SARS-CoV-2抗体的方法一般是定性检测或者半定量检测，检测结果不能真实反映体内新冠病毒抗体的水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，以准确地反映受检样品中的SARS-CoV-2抗体水平。
根据本发明的一个方面，提供一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，包括以下步骤：S1.将梯度稀释的受检抗体标准品分别与ACE2蛋白多肽混合形成梯度标准液,将样品与ACE2蛋白多肽混合形成待测溶液，ACE2蛋白多肽为血管紧张素转化酶2蛋白或其衍生物；S2.分别将梯度标准液、待测溶液与包被于固相载体表面的S1RBD蛋白共同孵育，S1RBD蛋白为SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽；S3.孵育结束后，洗涤除去游离的ACE2蛋白多肽；S4.利用抗ACE2蛋白多肽抗体和酶标二抗以检测已被固定在固相载体表面的ACE2蛋白多肽，以对应梯度标准液的信号值为标准信号值，以对应待测溶液的信号值为测试信号值；S5.利用一系列标准信号值与其对应的受检抗体标准品的浓度拟合标准曲线；S6.将测试信号值代入标准曲线计算样品的受检抗体含量。
优选地，ACE2蛋白多肽包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
优选地，ACE2蛋白多肽通过哺乳动物细胞表达获得。
优选地，S1RBD蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
优选地，S1RBD蛋白的糖基化位点包括N343-糖基化位点。
优选地，S1RBD蛋白通过哺乳动物细胞表达获得。
优选地，抗ACE2蛋白多肽抗体为抗ACE2特异性lgG抗体，酶标二抗为酶标抗lgG抗体。
优选地，酶标二抗的标记物为辣根过氧化物酶；在S4中，使酶标二抗在显色底物存在的情况下发生显色反应，显色反应完毕后，添加终止液，以对应梯度标准液的反应产物颜色强度为标准信号值，以对应待测溶液的反应产物颜色强度为测试信号值。
优选地，显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，反应终止液为0.2M硫酸；在S4中，以对应梯度标准液的反应产物在450nm下的黄色强度为标准信号值，以对应待测溶液的反应产物在450nm下的黄色强度为标准信号值。
本发明基于ACE2蛋白多肽和S1RBD蛋白多肽之间优异的结合特性，应用于SARS-CoV-2抗体的定量检测，能够达到优良的灵敏度和准确度。将本发明提供的SARS-CoV-2抗体的定量检测方法应用于评估注射SARS-CoV-2疫苗后的体内抗体水平，能够真实地反映抗体在人体内的含量及变化趋势，由此便于判断是否需要补打疫苗。
在一些实施方案中，本文中提供的试剂盒含有至少一种(例如至少两种、三种、四种或五种)本文中所述的SARS-CoV-2抗体或抗原结合片段，和一种或多种用于通过固相分析检测SARS-CoV-2的固相免疫测定组分。固相免疫测定使用固体支持物，其上结合配体受体对的一个成员，例如抗体或其抗原结合片段。固体支持物的非限定性实例包括平板，试管，聚苯乙烯珠，和多种多孔材料如例如尼龙、硝酸纤维素、醋酸纤维素、和玻璃纤维。
在一些实施方案中，试剂盒含有用于流过物固相免疫测定的组分。流过物固相免疫测定消除了对其它类型固相免疫测定涉及的温育和洗涤步骤的需要。多种流过物固相免疫测定在本领域中是已知的。举例而言，美国专利号4,632,901公开了流过物免疫测定，其中将抗体(对靶抗原分析物具特异性)结合于多孔膜或滤纸，并对其添加液体样品。当液体流动过膜时，靶分析物结合于抗体。添加样品之后，添加标记的抗体。标记的抗体的肉眼检测提供对样品中是否存在靶抗原分析物的指示。而且美国专利号5,229,073描述了半定量的竞争性免疫测定侧流方法，其采用多个含有固定化的抗体的捕捉区或线以供测量血浆脂蛋白水平。本领域技术人员会知道其它合适的固相免疫测定方法或装置，并能够在此类方法和装置中使用一种或多种本文中所述的ACE2蛋白多肽和S1RBD蛋白多肽之间结合片段。
在一些实施方案中，可使用其它检测方法，例如，比色法测定，放射免疫分析，或化学发光测定。
附图说明
图1为对应实施例1构建的包被有不同来源蛋白与重组人ACE2的结合情况统计图；
图2为对应实施例1的大肠杆菌中表达与人HEK293T培养细胞表达的S1RBD与ACE2的结合情况图；
图3为对应实施例2的微量滴定板的450nm OD值统计条形图；
图4为实施例3中不同突变位点的S1RBD与ACE2的结合情况统计图；
图5为实施例3的同突变位点的S1RBD蛋白的SDS-PAGE图；
图6为实施例4提供的SARS-CoV-2抗体作用原理示意图；
图7为实施例4单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、0ng/mL；
图8为实施例4单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、0ng/mL；
图9为实施例4单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签1600ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、0ng/mL；
图10为实施例4单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、0ng/mL；
图11为实施例6的方法一拟合得到的标准曲线；
图12为实施例6的方法二拟合得到的标准曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。在下述实施例中，所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而并非旨在进行限制。
针对以下实施例所提供数值范围，则每个干预值到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限与该所述范围内任何其他声明值或干预值之间，都包括在披露范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小范围中，并且也应包括在本公开内容之内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本公开中。
在详细描述本公开的实施例之前，应理解，除非另外指出，否则本公开不限于特定的材料，试剂，反应材料，制造工艺，尺寸，频率范围，应用或用途。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于限制。在本公开中，还可能以逻辑上可能的不同顺序执行步骤。还可以将本公开的实施例应用于涉及超出本文描述的示例的测量的附加实施例，这并不旨在进行限制。此外，除了本文描述的示例之外，本公开的实施例可以与其他测量技术组合或集成，这并非旨在进行限制。
应当注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”，“一种”和“该”并不旨在对数量进行限制，还包括复数对象，除非上下文另外明确排除。
在描述各种实施例之前，除非另外指出，否则所涉及的技术术语按照如下的定义：
ELISA，酶联免疫球蛋白夹心分析；TMB，3,3,5,5'-四甲基联苯胺；SARS-CoV-2，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2；COVID-19，冠状病毒病2019；S1RBD，SARS-CoV-2病毒刺突蛋白(S1)的刺突受体结合结构域。
如本文所用，术语“特异性结合”是指与其他分子的识别相比明显少的一种分子中的两种不同分子的特异性识别。通常，分子在其表面上或在空腔中具有引起两个分子之间的特异性识别的区域。特异性结合的示例是抗体-抗原相互作用。
本文所用的术语“抗体”是指与另一分子的特定空间和极性组织特异性结合并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白。该抗体可以是单克隆抗体，多克隆抗体或重组抗体，并且可以通过本领域众所周知的技术来制备，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或者通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌的蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变形式，至少编码天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段，该免疫球蛋白包括各种类型和同种型，例如IgA，IgD，IgE，IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3，IgM，IgY等。其片段可以包括Fab，Fv和F(ab')2，Fab'，scFv等。另外，可以适当地使用免疫球蛋白或其片段的聚集体，聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。
抗体可以源自任何来源，包括但不限于鼠种，大鼠，兔，鸡，人或任何其他来源(包括人源化抗体)。产生可以特异性识别并结合的抗体的技术是本领域已知的。
如本文所用，术语“抗原”是指与抗体结合并诱导抗体上的至少一个共享构象表位的任何实体。抗原可以是蛋白质，肽，抗体，小分子，脂质，碳水化合物，核酸和过敏原。抗原可以是纯净形式，也可以是抗原与其他成分混合在一起的样品。特别地，本公开的方法旨在检测特异性识别并结合SARS-CoV-2病毒的S和/或N多肽的表位的人或动物免疫球蛋白。
如本文所用，术语“表面”是指固体支持物，例如微量滴定板的孔的底部的表面。所涉及的固体载体可以是多孔的或无孔的，平面的或非平面的，并且包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯载体。作为另一个实例，本发明的多肽可以有效地连接至用于ELISA的微量滴定板的表面。
如本文所用，术语“标记”是指与分子例如肽或多肽缀合的部分，其需要标记但不一定具有连接的标记。标签可以允许标签或标记的部分特异性结合标签。标签可以是被标记部分可以结合的小分子，例如肽的较大分子，肽可以但不限于六组氨酸链、多肽链如的多肽或组合，抗体的Fc区的任何其可通过适当选择的标记部分。
如本文所用，术语“可检测标记”是指连接至特异性结合伴侣(例如抗体或分析物)的部分，例如以引起特异性结合对的成员(例如抗体和分析物)之间的反应。如此标记的特异性结合伴侣，例如抗体或分析物，被称为“可检测标记的”。因此，本文所用的术语“标记的结合蛋白”是指掺有标记的蛋白，在一些实施方式中，标记物是可检测的标记物，其可以产生可通过视觉或仪器手段检测到的信号，例如掺入放射性标记的氨基酸或与可检测的生物素部分的多肽结合通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有荧光标记或酶活性的链霉亲和素，可以通过光学或比色法检测到)。多肽标记的例子包括但不限于d至以下各项：放射性同位素或放射性核素，色原，荧光标记物(例如FITC，若丹明和镧系元素磷光体)，酶标记物(例如辣根过氧化物酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)；化学发光标记生物素基；被二级报告分子识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列，二级抗体的结合位点，金属结合域和表位标签)；和磁性试剂，例如ado螯合物。通常用于免疫测定的标记物的代表性实例包括产生光的部分，例如a啶鎓化合物，和产生荧光的部分，例如荧光素，其反应结果可以用肉眼观测或通过诸如而不限于色度计，UV分光光度计等设备检测。“可检测标记”的使用旨在涵盖后一种类型的可检测标记。
如本文所用，术语“包被于微孔表面”是指在特定位置附着于底物的多肽，使得其可以经受洗涤或其他物理或化学处理而不会脱落。作为微孔表面的固体支持物及其固定方法是本领域已知的。
如本文所用，术语“表达的”和“表达”是指从基因转录以产生至少部分地与基因的两条核酸链之一的区域互补的RNA核酸分子。如本文所用，术语“表达的”或“表达的”也指从所述RNA核酸分子的翻译以产生蛋白质，氨基酸序列或其一部分。如本文所用，术语蛋白质或核酸的“片段”是指氨基酸序列的任何部分。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。
术语“Fc区”可以结合许多效应分子和其他蛋白质，包括提供体液免疫应答和细胞介导的效应系统之间联系的细胞Fe受体(Hamano等人，(2000)J.Immunol.164：6113-6119；Coxonet等，(2001)Immunity 14：693-704；Fossatiet等，(2001)Eur。J.Clin。Invest。31：821-831)。Fc 1受体对IgG分子具有特异性，包括Fc 3 RI，Fc 3 R IIa，Fc 3 R IIb和Fc 3RIII。这些同种型以不同的亲和力与单体和免疫复合的IgG结合。术语“多肽”包括蛋白质及其片段。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。
本文所用的术语“重组”是指核酸分子，是指基因组，cDNA，半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，其：(1)与所有或全部不相关与多核苷酸天然相关的部分；和/或(2)与除其本质上所连接的多核苷酸以外的多核苷酸连接。就蛋白质或多肽而言，术语“重组”是指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。
本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合物链。术语“肽”和“蛋白质”与术语多肽可互换使用，并且还指氨基酸的聚合物链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。除非另有说明，否则本文中“多肽”的使用旨在涵盖多肽及其片段和变体(包括变体的片段)。
如本文所用，术语“样品”以其最广义使用。如本文所用，“生物样品”包括但不限于来自生物或先前生物的任何数量的物质。这些生物包括但不限于人类，小鼠，大鼠，猴子，狗，兔子和其他动物。这类物质包括但不限于血液(例如全血)，血浆，血清，尿液，羊水，滑液，内皮细胞，白细胞，单核细胞，其他细胞，器官，组织，骨髓，淋巴结和脾脏。
实施例1
实验设置方式：本实施例所采用的蛋白分别由人HEK293T培养细胞和大肠杆菌表达获得，分别采用重组SARS-CoV-2S蛋白S1RBD结构域、重组SARS-CoV-2S蛋白S2结构域、重组SARS-CoV-2S核衣壳(N)蛋白、P24蛋白包被微量滴定板，制作SARS-CoV-2S蛋白S1RBD结构域包被的微量滴定板、SARS-CoV-2S蛋白S2区域包被的微量滴定板、N蛋白包被的微量滴定板、P24蛋白包被的微量滴定板。分别使上述制得的微量滴定板与重组人ACE2温育。
实验结果：如图1所示，通过比对利用来自不同来源细胞表达得到的不同重组蛋白包被的微量滴定板与ACE2的结合情况，无论是来自人HEK293T培养细胞表达得到的重组蛋白还是来自大肠杆菌表达得到的重组蛋白，由重组SARS-CoV-2S蛋白S1结构域包被的微量滴定板与ACE2结合的信号值最高，由此证明，SARS-CoV-2S蛋白与ACE2特异性结合的区域是S1结构域(S1RBD)。此外，在参加本实施例设置的温育实验的微量滴定板中，由哺乳动物细胞表达的重组SARS-CoV-2S蛋白S1RBD包被的微量滴定板所获得的结合信号值明显高于由其他蛋白(区域)包被的微量滴定板所获得的结合信号值，从而说明通过在人HEK293T培养细胞中表达产生的重组SARS-CoV-2S1RBD与人ACE2结合，具有显着更强的亲和力。分别将利用来自人HEK293T培养细胞、大肠杆菌表达得到的SARS-CoV-2S1RBD包被的微量滴定板与不同剂量的ACE2经过温育后得到的产物进行吸光度测试(入射光为450nm)，结果如图2所示，与大肠杆菌表达的S1RBD相比，人HEK293T培养细胞表达的S1RBD显示出明显的依赖于剂量的结合活性。这些数据表明真核生物特异性翻译后修饰影响ACE2/S1RBD结合亲和力。
实施例2
实验设置方式：从登录号为：Q9BYF1的人AVE2中分离出在本发明的方法中有利的ACE2的一个片段，其为表达的区域Gln18-Ser740(胞外域)(SEQ ID NO.1)。利用该蛋白多肽片段制备重组ACE2蛋白，并将上述重组ACE2蛋白按照不同的剂量包被于不同的微量滴定板(96孔ACE2微孔板)的微孔表面。将HIVP24蛋白包被于微量滴定板的微孔表面，作为对照。向微孔滴定板中加入HRP偶联的S1RBD蛋白(人HEK293T培养细胞表达得到的重组蛋白)，孵育。孵育完毕后，采用洗涤液洗涤微量滴定板，除去未被固定于微孔表面的S1RBD蛋白，向微孔中依次加入显色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、反应终止液为0.2M硫酸。测试反应产物在450nm下的吸光度。在本实施例中，每个剂量各设置3个重复，每块微量滴定板为1个重复。
实验结果：受检的各微量滴定板的吸光度测试数据统计结果如图3所示。实验结果说明S1RBD蛋白与ACE2蛋白之间具有优良的结合性能，整体呈现显著的浓度依赖特性，即使在低剂量范围内也能够体现浓度依赖特性，由此说明S1RBD蛋白与ACE2蛋白结合的灵敏度较高。与此相比，作为对照组的微量滴定板表面包被的HIVP24蛋白的剂量达到25ng，其信号响应值依然低于表面包被的ACE2蛋白剂量仅0.096ng所对应的信号响应值，由此说明，S1RBD蛋白与ACE2蛋白的结合具有优良的特异性。
实施例3
实验设置方式：在S1RBD上的Asn343糖基化位点对于与ACE2结合作用是必不可少的：SARS-CoV-2S蛋白具有22个假定的糖位点，这取决于NXS/T，X≠P基序序列的存在(Zhanget等人，(2020)Mol。细胞蛋白质组学)。在这些位点中，N331和N343位于RBD上，并已被证明是n-糖基化突变为谷氨酰胺时，可显着降低病毒的感染性(Li等人，(2020)Cell182：1284-1294)。为了确定这些残基在结合过程中是否在ACE2/S1RBD分子相互作用中起作用，采用具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的S1RBD蛋白多肽制备了三个突变的S1 RBD重组体：N343Q，N331Q和N343Q/N331Q双突变。利用这些突变体以及野生型S1 RBD分别与ACE2进行温育，测量ACE2/S1RBD结合活性。
实验结果：如图4所示，ACE2/S1RBD的结合力在采用S1 RBD的N343Q突变体和N331Q/N343Q突变体的实验组中基本丧失，而在采用N331Q突变体的实验组与采用野生型的实验组所对应的ACE2/S1RBD结合活性变化不大。通过SDS-PAGE分析对纯化的重组S1RBD和ACE2蛋白进行去糖基化情况，结果如图5所示。
实施例4
在本实施例所构建的实验模型中，对ACE2蛋白多肽与S1RBD蛋白多肽的结合具有抑制作用的SARS-CoV-2抗体的作用原理如下：将哺乳动物细胞表达的糖基化S1RBD蛋白多肽(SEQ ID NO.2)固定在固相载体的表面，向固相载体表面添加含有ACE2和待测抑制剂的混合物，孵育，混合物中的抑制剂将和ACE2相互竞争与S1RBD多肽复合，活性较高的抑制剂将阻止ACE2与S1RBD多肽复合，参见图6所示。
实验设置方式：分别将每种参试抗体的系列稀释液(1600、800、400、200、100、0ng/ml)与ACE2蛋白混合，然后添加到S1RBD蛋白多肽包被的96孔板中。洗涤除去未结合的ACE2，并用抗ACE2抗体和酶标二抗，本实施例中，抗ACE2抗体为抗ACE2特异性lgG抗体，酶标二抗为HRP偶联的抗lgG抗体，洗涤微孔。然后依次向微孔中加入显色底物和终止液，在450nm处测量样品呈黄色的强度，对比出样品与单独的ACE2对照的信号比(OD)，并计算两者的差值。
实验结果：参试抗体的450nm OD值如图7～10所示，据此可得编号为13010807、13010844、13010845的受检抗体可以竞争组织S1RBD蛋白多肽与ACE2蛋白多肽的结合。
实施例5
实验设置方式：基于实施例4的筛选结果，采用实施例4中的编号为13010807、13010844、13010845的受检抗体作为本实施例的参试抗体，选用296例待测样本检测参试抗体的SARS-CoV-2判断准确率，本实施例所采用的阳性样本包括S1RBD蛋白液和SARS-CoV-2患者样本。分别将参试抗体与待测样本混合形成受检样本液，将受检样本液添加到ACE2蛋白多肽包被的96孔板中。洗涤微孔，并用抗S1RBD抗体和HRP偶联二抗。然后依次向微孔中加入显色底物和终止液，在450nm处测量样品呈黄色的强度。对比受检样本液与没有与参试抗体混合的待测样本液对照的信号比(OD)，若OD值下降则标记为阳性。同时以PCR金标准的方法作为对照，同时对待测样本进行测试。
测试结果：如表1，在本实施例所采用的两种SARS-CoV-2鉴定方法所得出的阳性率和阴性率的吻合度都达到100％(296/296,95％CI:98.76～100％)。然而，随着症状发作时间延长，采用SARS-CoV-2抗体的SARS-CoV-2鉴定方法所得出的阳性率和阴性率发生了不同程度的变化。表2为采用依据表1的结果筛查得到的阳性样本进行抽检复检的结果，与初始的检测结果相比，随着时间的延长，阳性率呈下降趋势，而阴性样本的阴性率没有发生变化。由此可以说明，SARS-CoV-2抗体的定性检测无法准确地反应样本情况。
表1 本实施例所采用的两种SARS-CoV-2鉴定方法所得出的样本定性统计数据(“+”表示阳性，“－”表示阴性)
Figure BDA0003033268780000121
表2 SARS-CoV-2抗体检测抽检阳性样本定性统计数据
Figure BDA0003033268780000122
实施例6
本实施例提供一种试剂盒，包括：
固定有重组哺乳动物细胞生成的(糖基化)COVID19 S蛋白RBD结构域的微量滴定板(A项)，上述微量滴定板为96孔(12条x 8孔)ACE2微孔板；
25ml洗涤缓冲液(B项)，上述洗涤缓冲液为20x浓缩溶液(20x：氯化钾，0.4％；氯化钠，16％；磷酸二氢钾；0.4％，磷酸二钠；吐温20，1.0％)；
检测抗体，山羊抗ACE2抗体(C-1项)；
25μL HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物(D-1项)，上述抗体浓缩物为1000x浓缩的HRP偶联的抗山羊IgG；
15mL分析稀释剂(E2项)，所述分析稀释剂为5x浓缩磷酸盐缓冲盐水(PBS)，用于稀释测试试剂，其中含有0.15％5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷(BND)；7.5％牛血清白蛋白(BSA)；1.25％Tween-20；
ACE2蛋白(F项)，2小瓶纯化的人重组ACE2蛋白(1小瓶足以测定一半微孔板)；
12m标志物反应液(H项)，上述标志物反应液为3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)一步底物试剂；
8mL反应终止液(I项)，上述反应终止液为0.2M硫酸。
本实施例所提供的试剂盒的最佳储存方式为：
试剂盒应保存在-20℃或更低的温度下，并在装运之日起6个月内使用。初次使用后，应将洗涤缓冲液(B项)，分析稀释剂(E2项)，标志物反应液(H项)，反应终止液(I项)保存在4℃下，以避免重复的冻融循环。将未使用的孔放回装有干燥剂包的袋中，沿整个边缘重新密封并在-20℃下储存。ACE2蛋白(F项)应存储在-80℃下。检测抗体(C项)和HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物(D项)在2-8℃下最多可保存1个月(在-20℃下最多可保存6个月，避免重复冻融循环)。
上述试剂盒与以下设备配合使用：能够测量450nm吸光度的酶标仪、摇床、移液器(可输送2μl至1ml的体积)、1-25毫升用于调试或校准移液器的试剂、(100毫升和1升)量筒、蒸馏水或去离子水、准备样品稀释液的试管。
以下是基于化学发光法测试样本中的SARS-CoV-2抗体含量的流程：
方法一：采用针对抗人IgG抗体标记吖啶脂，磁性微球上包被刺突蛋白(S1RBD)。标本、标准品与吖啶脂标记抗体、包被S1RBD的磁性微球混合，形成抗原、吖啶脂标抗、S1RBD磁性微球的免疫复合物，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入标本测定室，仪器自动泵入底物液，自动测量化学发光反应的结果，以相对光单位(RLUs)表示。SARS-CoV-2抗体浓度与RLUs成一定的比例关系，仪器自动拟合计算SARS-CoV-2抗体浓度。
方法二：采用针对受体蛋白(ACE2)标记吖啶脂，磁性微球上包被刺突蛋白(S1RBD)。标本、标准品与吖啶脂标记抗体、包被S1RBD的磁性微球混合，形成抗原、吖啶脂标抗、ACE2磁性微球的免疫复合物，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入标本测定室，仪器自动泵入底物液，自动测量化学发光反应的结果，以相对光单位(RLUs)表示。SARS-CoV-2抗体浓度与RLUs成一定的比例关系，仪器自动拟合计算SARS-CoV-2抗体浓度。
基于化学发光法间接法检测SARS-CoV-2抗体的浓度，集合雅培I 2000全自动化学发光免疫分析仪(预激发液：雅培-100μL；激发液：雅培-100μL)评估疫苗注射后的抗体递增或递减情况，判断是否需要补打疫苗。
方法一测试结果：本实施例采用方法一测得的样本中的抗体浓度c与IOD450(450nm下的发光强度)数据统计如表3所示，利用表3中的数据进行拟合，得到的标准曲线如图11所示，其R2达到0.9999，拟合结果优异。
表3 样本浓度c与IOD450(450nm下的发光强度)数据统计表
Figure BDA0003033268780000141
Figure BDA0003033268780000151
表4中的样本数据由第一批参试志愿者提供，表格中的“抗体浓度”数据为根据图11中的标准曲线拟合得到。在参试的志愿者中：在进行第一次疫苗注射后，样本编号14、15、32、33、34分别对应的志愿者的体内抗体浓度就已经达到较高的水平；在进行了第二次疫苗注射后，样本编号23、24分别对应的志愿者的体内抗体浓度值依然偏低，除此之外，参与第二次疫苗注射的志愿者基本上都具有较高的体内抗体水平。
表4 第一批参试志愿者进行疫苗注射后的体内抗体浓度情况
Figure BDA0003033268780000152
Figure BDA0003033268780000161
表5中的数据为第二批志愿者提供的样本采用方法一测试得到的结构，数据显示编号5经过两次疫苗注射，体内抗体含量较低，其余经过第二次注射，体内抗体含量基本达到要求。
表5 第二批参试志愿者在注射疫苗前后的体内抗体浓度情况
Figure BDA0003033268780000162
Figure BDA0003033268780000171
方法二测试结果：对本实施例通过方法二测得的样本中的抗体浓度c与IOD450(450nm下的发光强度)数据进行拟合，得到的标准曲线如图12所示，其R2达到0.9999，拟合结果优异。
选取第三批参试志愿者提供测试样本，分别通过方法一、方法二对样本进行测试，并通过图11、图12得到的标准曲线计算样本中的抗体浓度。结果如表6所示，说明方法一和方法二具有一定的相关性，R平方值达0.88。此外通过对比表4提供的数据，可以知道经过两个疫苗注射后，志愿者体内的抗体不一定能达到理想值：如第40，59，78，84号的抗体水平未达到阈值。
表6 第三批参试志愿者进行疫苗注射后的体内抗体浓度情况
Figure BDA0003033268780000181
Figure BDA0003033268780000191
Figure BDA0003033268780000201
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Figure BDA0003033268780000221
Figure BDA0003033268780000231
Figure BDA0003033268780000241
Figure BDA0003033268780000251
Figure BDA0003033268780000261
Figure BDA0003033268780000271
Figure BDA0003033268780000281
SEQUENCE LISTING
<110> 瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司
<120> 一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法
<130> 123
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
625 630 635 640
Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
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690 695 700
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Pro Val Ser
<210> 2
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
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130 135 140
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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
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Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
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245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
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Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
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Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
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645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
660 665 670

Claims (10)

1.一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将S1RBD蛋白包被于固相载体表面，所述S1RBD蛋白为SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽；
S2.采用被标记物标记的ACE2蛋白多肽，将梯度稀释的受检抗体标准品与所述ACE2蛋白多肽混合形成梯度标准液，将样品与所述ACE2蛋白多肽混合形成待测溶液；所述ACE2蛋白多肽为血管紧张素转化酶2蛋白或其衍生物；
S3.将所述梯度标准液与包被于固相载体表面的S1RBD蛋白共同孵育，得到第一免疫复合物；将所述待测溶液与包被于固相载体表面的S1RBD蛋白共同孵育，得到第二免疫复合物；
S4.孵育结束后，洗涤除去游离的所述所述ACE2蛋白多肽；
S5.以第一免疫复合物和第二免疫复合物的信号差表征受检抗体含量。
2.如权利要求1所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：所述ACE2蛋白多肽包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
3.如权利要求5所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：所述ACE2蛋白多肽通过哺乳动物细胞表达获得。
4.如权利要求1所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：所述S1RBD蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：所述S1RBD蛋白的糖基化位点包括N343-糖基化位点。
6.如权利要求4所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：所述S1RBD蛋白通过哺乳动物细胞表达获得。
7.如权利要求1所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：所述抗ACE2蛋白多肽抗体为抗ACE2特异性lgG抗体，所述酶标二抗为酶标抗lgG抗体。
8.如权利要求7所述SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：
所述酶标二抗的标记物为辣根过氧化物酶；
在S4中，使所述酶标二抗在显色底物存在的情况下发生显色反应，显色反应完毕后，添加终止液，以对应所述梯度标准液的反应产物颜色强度为所述标准信号值，以对应所述待测溶液的反应产物颜色强度为所述测试信号值。
9.如权利要求8SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于：
所述显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，所述反应终止液为0.2M硫酸；
在S4中，以对应所述梯度标准液的反应产物在450nm下的黄色强度为标准信号值，以对应所述待测溶液的反应产物在450nm下的黄色强度为标准信号值。
10.一种SARS-CoV-2抗体的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将S1RBD蛋白包被于固相载体表面，所述S1RBD蛋白为SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽；
S2.采用被标记物标记的抗S1RBD蛋白单克隆抗体作为中和抗体，将梯度稀释的受检抗体标准品与所述中和抗体混合形成梯度标准液，将样品与所述中和抗体混合形成待测溶液；
S3.将所述梯度标准液与包被于固相载体表面的S1RBD蛋白共同孵育，得到第一免疫复合物；将所述待测溶液与包被于固相载体表面的S1RBD蛋白共同孵育，得到第二免疫复合物；
S4.孵育结束后，洗涤除去游离的所述中和抗体；
S5.以第一免疫复合物和第二免疫复合物的信号差表征受检抗体含量。
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