KR20140132410A - 간섭 펩티드 및 미생물 검출 방법 - Google Patents

간섭 펩티드 및 미생물 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 M의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의, 펩티드 서열 S를 갖는 신규 간섭 펩티드에 관한 것으로서, 상기 서열 S는 미생물 M과 상이한 미생물 M'의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의, 펩티드 서열 S'에 대해 정렬되고, 단: 상기 서열 S 및 S'가 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며; 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 상이한 아미노산을 갖는다.
본 발명은 또한 특이성을 개선시키기 위해, 생물학적 샘플 내 미생물 M' 또는 M의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

간섭 펩티드 및 미생물 검출 방법{INTERFERING PEPTIDES AND METHOD FOR DETECTING MICRO-ORGANISMS}
본 발명은 진단 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생물학적 샘플 내 미생물의 존재의 시험관 내 면역학적 어세이-기재 검출이라는 문맥에서 간섭 문제를 제거하는데 특히 유용한 신규 펩티드에 관한 것이다(간섭 문제는 시험된 샘플과 연관됨).
면역학적 어세이-기재 검출 방법은 진단 분야에서 널리 사용된다. 상기 방법은 펩티드 및 합텐(예를 들어 스테로이드 또는 비타민)의 단백질의 형태의 분석물(항원/항체)을 검출하는 것을 가능하게 만든다. 면역어세이 방법 또는 면역효소적 시험으로도 공지된 면역학적 어세이는 검출하고자 하는 분석물과 상기 분석물에 결합하기 위한 하나 이상의 파트너(들) 사이의 면역학적 반응을 수반하는, 당업자에게 널리 공지된 방법이다. 이러한 면역어세이 방법의 예로서, "샌드위치" 원리에 따라, 또는 그 밖에 "경쟁" 원리에 따라 작동될 수 있는 ELISA, ELFA, CLIA, ECLIA, IRMA 및 RIA와 같은 방법, 및 면역검출 방법, 예를 들어, 면역조직화학, 면역세포화학, 면역형광, 웨스턴 블롯(Western blot) 및 닷블롯(Dot blot)이 언급될 수 있다.
상기 면역학적 어세이의 결과는, 실험실에 의해 병리학적 상태를 진단하고 이어서 환자에게 적합한 치료를 제공하기 위해 이들을 해석할 의사에게 공급된다. 그러므로 상기 어세이가, 이들이 위-음성 결과를 제공하지 않는 측면에서 고도로 민감하고, 이들이 위-양성 결과를 제공하지 않는 측면에서 고도로 특이적인 것이 특히 중요하다.
상기 어세이의 민감성 및 특히 특이성을 손상시키는 원인 중 하나는 시험된 샘플과 연관된 간섭의 존재이다. 간섭은 시험하고자 하는 샘플의 성분이 시험 신호를 변경하는 반응을 생성하여, 결과의 올바른 값을 변경시키는, 예를 들어 분석물의 신호와 구별이 불가능한 신호를 제공함으로써, 위 양성을 제공하거나, 또는 이를 감쇠시켜, 신호가 사용되는 키트의 검출 역치 미만일 때 잠재적으로 위 음성을 제공하는 그러한 때마다 일어난다(Tate and Ward, 2004).
면역학적 어세이의 문맥에서, 위-양성 반응은, 어세이에 사용되는 결합 파트너에 결합되는 항체와 같은, 어세이와 관련하여 간섭하는 성분의, 시험된 샘플 내에서의 존재로 인해 매우 종종 비특이적 항원-항체 반응과 연관된다. 예를 들어, 특정 환자의 혈청은 예를 들어 백신화 후 생성되는 동물 단백질에 대항하는 인간 항체를 함유할 수 있고, 이것이 사용된 어세이 키트의 조성의 일부인 동물 면역글로불린과 반응할 수 있다. 그러므로 이들은 비정상적 어세이 결과를 생성할 수 있다(Kricka, 1999). 간섭하는 내생 성분은 건강한 대상으로부터 수득된 샘플 및 병리학적 상태를 가지고 있거나 감염을 가지고 있는 대상으로부터 수득된 샘플 모두에 존재할 수 있다. 간섭 현상은 환자의 임상적 상태와는 독립적이다.
시험된 샘플과 연관된 간섭 반응을 감소시키기 위한 다양한 방법은 이미 기재되어 있다. 그러므로, 예를 들어, 탄수화물 화합물, 단백질 화합물, 단백질 혼합물 또는 가수분해물을 사용하는 것이 공지된 실시이다(EP 0 260 903; US 4 931 385). 개질된 단백질의 사용, 특히 숙시닐화 또는 아세틸화 단백질의 사용(EP 0 525 916), 또는 고유의 서열과 관련하여 본질적으로 개질된 아미노산의 서열을 가진 그밖의 펩티드, 예를 들어 D-(아미노산)으로 본질적으로 이루어지는 펩티드(US 6 153 393)의 사용이 또한 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법 중 어느 것도 어세이 중의 위 양성의 존재를 완전히 제거시키는 것을 가능하게 할 수 없고, 상기 성분의 첨가는 종종 심지어 다른 간섭을 일으켜, 시험의 민감성을 감소시킨다.
다른 위-양성 반응은 시험된 샘플 때문이 아니라 시험에 사용되는 결합 파트너 그 자체 때문일 수 있는데, 예를 들어, 특허 출원 WO 2008/027942에 기재된 바와 같이 동일한 샘플 내의 항원 및 항체 모두를 검출하는 것이 요망되는 경우에 일어난다. 그러나, 상기 결합-파트너-연관 간섭은 어세이된 샘플과 연관된 간섭과 상이하고, 상기 유형의 간섭을 감소시키기 위해 사용된 방법은 어세이된 샘플과 연관된 갑섭을 감소시키는데 사용된 것과 상이하다.
모든 간섭이 제거되지는 않으므로, 실험실은 종종 이들의 진단 시험의 결과를 입증하기 위해, 대안적인 어세이 또는 부가적인 측정을 실시하는 것을 의무로 한다. 그러므로, 특히 위 양성이 의문일 때 간섭이 감소되거나 심지어 제거되는 어세이가 되도록 하는 것이 가장 특히 중요한데, 환자가 이들이 필요로 하지 않는 약물을 받을 것이기 때문이다.
본 출원인은 모든 예상과 반대로, 미생물의 존재의 시험관 내 검출의 문맥에서의 면역학적 어세이 동안, 시험되는 샘플과 연관된 간섭으로 인한, 시험되는 샘플 내의 위 양성의 검출을 제거하기 위해, 시험의 민감성의 감소 없이, 상기 미생물 유래의 특정 펩티드, 및 또한 상기 첫번째 펩티드와 50% 이상의 일치성을 나타내나, 검출되는 미생물과 상이한 미생물로부터 유래되는 펩티드를 사용하는 것이 가능하다는 것을 입증하였다.
실제로, 본 출원인은 위 음성이 검출하고자 하는 미생물 M2와 상이한 미생물 M1에 대항하는 항체의 존재와 연관될 수 있고, 중화가 요망되는 검출 및 간섭을 담당하는 상기 미생물 M1은 제한된 길이에 대해 검출하고자 하는 미생물 M2와 것과 특정 펩티드 서열 일치성을 나타내며, 미생물 M1 또는 M2에 속하는 상응하는 특정 펩티드의 첨가가, 시험의 민감성을 손상시키지 않으면서 상기 위 양성을 제거하는 것을 가능하게 만든다는 것을 입증하였다.
그러므로, 본 발명은 서열이 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드에 관한 것이다:
(i) 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1, 및
(ii) 미생물 M1과 상이한 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2,
상기 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬되고, 이들은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내는 것으로 이해됨.
하나의 주제는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출하고자 하는 미생물 M2의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체 AbM2를 검출함으로써, 생물학적 샘플 내 미생물 M2의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법에 관한 것이다:
a) 면역어세이에 필요한 검출하고자 하는 상기 하나 이상의 항체 AbM2에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계, 상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래되거나 표적 단백질 그 자체임,
b) 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공함:
- (i) 미생물 M2와 상이한 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1, 및
- (ii) 상기 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래이고 상기 하나 이상의 결합 파트너의 펩티드 서열을 포함하는 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2,
- 상기 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬되고, 이들은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내는 것으로 이해됨,
c) 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 항체 AbM2와 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M2의 존재를 검출하는 단계.
또다른 주제는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출하고자 하는 미생물 M2의 하나 이상의 표적 단백질을 검출함으로써, 생물학적 샘플 내 미생물 M2의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법에 관한 것이다:
a) 면역어세이에 필요한 상기 미생물 M2의 상기 하나 이상의 표적 단백질에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계,
b) 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계:
- (i) 미생물 M2와 상이한 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1, 및
- (ii) 상기 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래이고 상기 하나 이상의 표적 단백질의 펩티드 서열을 포함하는 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2,
- 상기 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬되고, 이들은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내는 것으로 이해됨,
c) 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 표적 단백질과 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M2의 존재를 검출하는 단계.
또다른 주제는 생물학적 샘플에서, 검출하고자 하는 미생물 M2의 분석 대표물의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법에서의, 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 간섭 펩티드의 용도에 관한 것이다:
(i) 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1, 및
(ii) 상기 미생물 M1과 상이한 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2,
상기 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬되고, 이들은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내는 것으로 이해됨.
또다른 주제는 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드의, 면역어세이의 실행 동안의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서, 검출하고자 하는 미생물 M2의 분석 대표물의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법의 특이성을 개선시키기 위한 방법에 관한 것이다:
(i) 미생물 M2와 상이한 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1, 및
(ii) 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2,
상기 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬되고,
이들은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내는 것으로 이해됨.
본 출원인은, 모든 예상과 반대로, 미생물 M2의 검출을 위한 면역어세이의 실행 동안, 시험된 샘플과 연관된 위 양성의 검출이, 하기 특징을 갖는 특정 펩티드의 사용을 통해 감소, 또는 심지어 제거될 수 있다는 것을 보여주었다:
- 이들은 미생물 M2와 상이한 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1을 가지거나, 이들은 검출하고자 하는 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2를 가짐,
- 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬됨,
- 서열 S1 및 S2는 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타냄,
- 서열 S1 및 S2는 일치하는 길이를 갖거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 길이에 있어 차이를 나타냄.
명확성을 위해, 일반화되는 것이 요망되는 경우, 본 발명의 목적을 위한 용도의 간섭 펩티드는 상기 펩티드가 서열 S1 또는 S2를 갖는지, 그러므로 이것이 미생물 M1 또는 M2 유래인지에 따라 서열 S를 갖는 펩티드로서 언급될 것이다. 서열 S를 갖는 펩티드를 단리하는데 사용되었던 펩티드는, 상기 선택이 서열 S1 및 S2를 갖는 2개의 펩티드, 그러므로 S 및 S'를 갖는 2개의 펩티드가 사용가능하고, 본 발명에 따른 간섭 펩티드로서 사용되기 때문에 완전히 임의적인 것이고, 따라서 서열 S'를 갖는 펩티드로서 서열 S1 또는 S2를 갖는 간섭 펩티드를 언급하는 것으로 선택될 수 있을 것이라는 지식에 의해, 서열 S'를 갖는 펩티드로서 언급될 것이다.
다른 말로는, 본 발명의 목적을 위한 용도의 간섭 펩티드는 미생물 M의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S를 갖는 간섭 펩티드로서, 상기 서열 S는 미생물 M과 상이한 미생물 M'의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 상이한 펩티드 서열 S'에 대해 정렬되고, 상기 서열 S 및 S'은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내는 것으로 이해된다.
서열 S를 갖는 상기 펩티드는 검출이 요망되지 않는 미생물(M 또는 M')과 관련하여 샘플을 중화시키는데 특히 유용하고, 상기 미생물은 검출하고자 하는 미생물(각각 M' 또는 M)에 대해 간섭을 야기한다. 그러면 검출이 요망되지 않는 상기 미생물은 간섭 미생물로서 언급될 수 있다.
다른 말로는, 검출하고자 하는 표적 미생물이 미생물 M인 경우, 표적 미생물로부터 유래된 서열 S를 갖는 펩티드는 간섭 미생물 M'를 중화시키는 역할을 한다. 한편, 검출하고자 하는 표적 미생물이 미생물 M'인 경우, 간섭 미생물로부터 유래된 서열 S를 갖는 펩티드는 간섭 미생물 M을 중화시키는 역할을 한다.
명확성을 위해, 검출이 요망되는 미생물은 물론, 상기 이름은 무작위적이고 이것이 상기 미생물 M1을 부르는 것으로 선택될 수 있을 것이라는 지식에 의해, 미생물 M' 또는 M을 나타내는 미생물 M2로서 본원에서 표시될 것이다.
다른 말로는, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 서열 S를 갖는 간섭 펩티드는 미생물 M 또는 미생물 M'를 검출하기 위한 용도의 것이다.
미생물 M2(M' 또는 M)는(이의 존재가 검출이 요망됨) 병리학적 상태를 야기하고 치료 또는 팔로우-업(follow-up)을 실행하거나 이의 증식을 제한하기 위해 신뢰성있는 진단을 실시하는 것이 필요한 임의의 미생물이다. 미생물은 바이러스, 박테리아 또는 효모일 수 있으며, 이들은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
바이러스의 비제한적인 예로서, 간염 바이러스, 예컨대 A, B, C, E 및 G형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대 HIV-1 및 HIV-2, 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV), 인플루엔자 바이러스 예컨대 H1N1 및 H5N1, 사이토메갈로바이러스(CMV), 홍역 바이러스, JC 바이러스 등이 언급될 수 있다.
박테리아의 비제한적인 예로서, 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 예컨대 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 및 바실리(Bacilli)가 언급될 수 있다.
효모의 비제한적인 예로서, 칸디다(Candida)가 언급될 수 있다.
용어 "미생물 M2의 표적 단백질"은 상기 미생물의 게놈에 의해 코딩되고 상기 미생물에 의한 감염 동안 생성되는 단백질을 의미하는 것으로 의도되며, 이들은 면역어세이 방법에 의해 검출될 수 있고, 또는 그밖에 또한 면역어세이 방법에 의해 검출가능한 감염된 숙주의 일부에 대한 항체 반응을 발생시킨다. 그러므로, 예를 들어, C형 간염 바이러스(HCV)의 경우에는, 표적 단백질은 예를 들어, Core, NS3, NS4 또는 NS5 단백질일 수 있다. HIV-1 바이러스와 관련하여, 예를 들어, Env (gp160, gp120, gp41), Gag(p55 및 이의 성숙 가공 형태: p24 캡시드, p17 매트릭스 등), Pol(연전사효소 및 인테그라아제), Tat, Nef 및 Rev 단백질이 언급될 수 있다. 또다른 예로서, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 박테리아의 Emp(세포외부 매트릭스 단백질-결합 단백질) 또는 PVL(Panton-Valentine leukocydin) 단백질, 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 박테리아의 리보솜 작은 서브유닛 메틸트랜스페라아제 H, 신장 인자 P 또는 그 밖의 DnaK 샤페론이 언급될 수 있다. 물론, 당업자는 검출을 바라는 미생물의 다양한 표적 단백질을 완전히 알고 있다.
표현 "검출하고자 하는 미생물 M2(각각 M' 또는 M)와 상이한 미생물 M1(M 또는 M')"은 미생물 M2 그 자체가 아닌 임의의 미생물을 의미하는 것으로 의도된다. 미생물 M1 및 M2는 동일한 특성의 미생물(바이러스, 박테리아, 효모) 및 동일한 족에 속하는(예를 들어 검출하고자 하는 미생물 M2가 HCV 바이러스일 수 있고, 다른 미생물은 HBV 바이러스임) 또는 또다른 족에 속하는(예를 들어, 검출하고자 하는 바이러스가 HCV 바이러스이고, 다른 미생물은 HIV-1 바이러스임) 미생물일 수 있다. 미생물 M1 및 M2는 상이한 특성의 미생물 (바이러스/박테리아, 바이러스/효모, 박테리아/효모) 일 수 있다. 상기 미생물은 각각의 환자가 마주할 수 있고 이에 대항하여 항체 반응을 발달시킬 미생물이다.
하나의 구현예에 따르면, 미생물 M2는 바이러스 또는 박테리아이다. 또다른 구현예에 따르면, 미생물 M2는 바이러스이고, 미생물 M1은 박테리아이거나, 또는 그밖에 미생물 M2는 박테리아이고, 미생물 M1은 바이러스이다.
하나의 구현예에 따르면, 바이러스는 C형 간염 바이러스, HCV이고, 바이러스와 상이한 미생물은 박테리아, 특히 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(GB-1 균주)로부터 선택되는 박테리아이다.
또다른 구현예에 따르면, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스, HIV-1이고, 바이러스와 상이한 미생물은 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)이다.
표현 "검출하고자 하는 미생물 M2와 상이한 미생물 M1 (또는 간섭 미생물)의 항원 단백질"은 또한 생물학적 샘플이 취해지는 환자인 감염된 숙주의 일부에 대해 항체 반응을 유도하는 상기 미생물 M1의 단백질을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 다시, 당업자는 검출에 대한 의심이 있는 경우 상기 기재된 표적 단백질에 상응하는 미생물 M1의 항원 단백질을 알고 있으며, 항원성인 또는 그 밖에 표적 단백질로서 언급되는 미생물의 단백질과, 비-항원성인 또는 그 밖에 비-표적 단백질로서 언급되는 미생물의 단백질을 용이하게 구별할 수 있을 것이다.
당업자는 또한 상기 지시된 바와 같이, 표현 "항원 단백질" ? 표현 "표적 단백질"이 검출 방법에서 미생물을 참조할 때만, 즉, 검출을 요망하는 것을 참조로 하여 (참조는 표적 단백질에 대해 이뤄짐) 또는 중화를 요망하는 것을 참조로 하여 (참조는 항원 단백질에 대해 이뤄짐) 구별될 필요가 있다는 것을 알고 있다. 그러므로 상기 2가지 용어는 차별 없이 사용되고, 이의 용도에 대한 참조 없이 서열 S를 갖는 간섭 펩티드 그 자체에 대해 일치하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따라 서열 S 및 S'를 갖는, 그러므로 서열 S1 또는 S2를 갖는 펩티드는 7 내지 12개의 아미노산을 가지며, 이것은 항체의 파라토프(paratope)에 의해 인지되는 아미노산 길이에 상응한다. 하나의 구현예에 따르면, 서열 S1 및 S2는 8 내지 10개의 아미노산을 갖는다.
또다른 구현예에 따르면, 서열 S를 갖는 간섭 펩티드는 하기로부터 선택된다:
- 서열 SEQ ID N°1을 갖는 Y7E-1, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°2를 갖는 펩티드 V7E임,
- 서열 SEQ ID N°2를 갖는 V7E, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°1을 갖는 펩티드 Y7E-1임,
- 서열 SEQ ID N°3을 갖는 A8E, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°4를 갖는 펩티드 E8E임,
- 서열 SEQ ID N°5를 갖는 Y7E-2, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°4를 갖는 펩티드 E8E임,
- 서열 SEQ ID N°6을 갖는 D8E, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°4를 갖는 펩티드 E8E임,
- 서열 SEQ ID N°4를 갖는 E8E, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°3을 갖는 펩티드 A8E 또는 서열 SEQ ID N°5를 갖는 Y7E-2 또는 서열 SEQ ID N°6을 갖는 D8E임,
- 서열 SEQ ID N°7을 갖는 E8L-1, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°8을 갖는 펩티드 E8L-2임, 및
- 서열 SEQ ID N°8을 갖는 E8L-2, 서열 S'를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°7을 갖는 펩티드 E8L-1임.
상기 다양한 펩티드 중에서, 서열 SEQ ID N°2를 갖는 HCV 펩티드 V7E는 특허 출원 EP 0 582 243 A에 이미 기재되어 있다. 그러나, 상기 펩티드는 면역원으로서 기재되어 있지 않다. 이것은 시험된 샘플과 연관된 위 양성을 제거하기 위한 용도의 간섭 펩티드로서 기재된 적이 없었다. 다른 펩티드는 신규하고 본 발명의 주제를 구성한다.
그러므로, 본 발명은 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 간섭 펩티드에 관한 것이다:
(i) 미생물 M1의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S1, 및
(ii) 상기 미생물 M1과 상이한 미생물 M2의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S2,
상기 서열 S1 및 S2는 서로에 대해 정렬되고, 이들은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내고, 서열 SEQ ID N°2를 갖는 펩티드 V7E는 제외되는 것으로 이해됨.
다른 말로는, 본 발명은 미생물 M의 항원 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 서열 S를 갖는 간섭 펩티드에 관한 것으로서, 상기 서열 S는 미생물 M과 상이한 미생물 M'의 표적 단백질의 펩티드 서열 유래의 7 내지 12개의 아미노산의 펩티드 서열 S'에 대해 정렬되고, 상기 서열 S 및 S'은 7 내지 12개의 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성을 나타내고 4개 이상의 일치하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내며, 이들의 길이가 일치하거나 또는 이들이 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타내고, 서열 SEQ ID N°2를 갖는 펩티드 V7E는 제외되는 것으로 이해된다.
하나의 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 하기 펩티드에 관한 것이다: 서열 SEQ ID N°1을 갖는 Y7E-1, 서열 SEQ ID N°3을 갖는 A8E, 서열 SEQ ID N°4를 갖는 E8E, 서열 SEQ ID N°5를 갖는 Y7E-2, 서열 SEQ ID N°6을 갖는 D8E, 서열 SEQ ID N°7을 갖는 E8L-1 및 서열 SEQ ID N°8을 갖는 E8L-2.
용어 "50% 이상의 일치성"은 각각의 서열의 아미노산의 절반 이상이 일치하거나 유사한 것을 의미하는 것으로 의도되며, 상기 2개의 서열이 4개 이상의 일치하거나 또는 유사한 인접 아미노산을 나타내는 것으로 이해된다.
일반적으로, 용어 "유사한 아미노산"은 이것을 서열 내 고유의 아미노산으로 대체하는 경우 또는 이것이 부재하는 경우, 상기 서열의 항원 반응성의 임의의 파괴를 야기하지 않는 아미노산을 말한다.
특히 바람직한 유사체는 특성의 보존적 치환, 즉, 아미노산 계열에서 일어나는 치환을 포함한다. 당업자에게 잘 공지되어 있듯이 계열에 있어서는 여러 가지 아미노산 분류가 있다. 그러므로, 하나의 분류 예시에 따르면, 아미노산은 4가지 계열로 나뉠 수 있다, 즉 (1) 산성 아미노산, 예컨대 아스파테이트 및 글루타메이트, (2) 염기성 아미노산, 예컨대 라이신, 아르기닌 및 히스티딘, (3) 무극성 아미노산, 예컨대 류신, 이소류신 및 메티오닌, 및 (4) 극성 비전하 아미노산, 예컨대 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 종종 방향족 아미노산으로서 분류된다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의, 아스파테이트의 글루타메이트로의, 트레오닌의 세린으로의 단리된 대체, 또는 하나의 아미노산의 구조적인 연관성을 갖는 또다른 아미노산으로의 유사한 보존적 대체가 생물학적 활성에 대해 큰 영향을 주지 않을 것으로 합리적으로 예측될 수 있다. 생물학적 활성에 대한 아미노산 치환의 효과를 예측하는 방법의 또다른 예는 Ng and Henikoff, 2001에 의해 기재되었다.
서열 S 및 S'(S1 및 S2)는 일치하는 길이를 가지고 서로에 대해 정렬되거나 또는 이들은 상기 서열의 하나 및/또는 다른 말단에 분포되는 1 또는 2개의 아미노산의 차이를 나타낸다. 다른 말로는, 서열 S 및 S'(S1 및 S2)는 상기 기재된 바와 같은 보존적 치환 또는 결실에 의해, 일치하거나 유사한 아미노산을 갖는 7개 이상의 아미노산의 공통의 서열을 갖고, 이들의 길이가 상이한 경우, 상기 공통의 서열과 관련된 부가적인 아미노산은 하나의 말단에 (1 또는 2개의 아미노산), 다른 말단에 (1 또는 2개의 아미노산), 또는 양 말단에 (각각의 측면에 차별없이 1 또는 2개의 아미노산) 있다. 그러므로, X가 공통 서열인 경우, An은 말단에 위치한 아미노산의 차이이고, n은 1 내지 4의 정수이고, 본 발명의 펩티드의 정렬은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00001
그러므로 아미노산의 최대 차이는 4이다.
당업자는 당업자에게 잘 공지된, Hopp/Woods 및 Kyte-Doolite 플롯을 참조로 하여, 생물학적 활성에 큰 영향을 주지 않으면서 변화를 용인할 수 있는 서열 영역을 쉽게 결정할 것이다.
하나의 구현예에 따르면, 서열 S 및 S'(S1 및 S2)와 공통인 서열의 아미노산은 하기 특징 중 하나 이상을 따른다:
- 이들은 일치한다,
- 이들이 유사체를 나타내는 경우, 이들은 최대 1 또는 2개의 유사체를 나타낸다,
- 이들은 보존적 치환에 의해 최대 3개의 유사체를 나타낸다,
- 이들은 결실에 의해 최대 1 또는 2개의 유사체를 나타낸다.
또다른 구현예에 따르면, 4개 이상의 인접 아미노산은 하기 특징 중 하나 이상을 따른다:
- 이들은 보존적 치환에 의해 일치하거나 유사하다,
- 이들이 유사체를 나타내는 경우, 최대 1 또는 2개의 유사체가 있다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 2개의 서열 S 및 S'(S1 및 S2)는 펩티드 분자의 미리 정의된 길이에 대해 50% 이상, 바람직하게는 55-60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80-90% 이상의 서열 일치성, 및 또한 50% 초과 내지 100% 까지 중 임의의 값을 나타낸다.
본 발명의 펩티드는 위 양성을 제공할 수 있는 생물학적 샘플 내의 미생물 M2(M' 또는 M)의 존재의 측정 동안 면역학적 어세이 방법의 위 양성을 감소, 또는 심지어 제거하는데 특히 유용하며, 상기 위 양성은 검출하고자 하는 미생물 M2(M' 또는 M)과 상이한 미생물 M1(각각 M 또는 M')에 대항하는 항체(이것은 AbM1 또는 각각 AbM 또는 AbM'로서 언급될 것임)의 존재에 의해 야기된다 .
검출하고자 하는 미생물 M2(M' 또는 M)의 존재의 검출을 실행하기 위해, 검출하고자 하는 미생물 M2의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체(상기 항체는 AbM2 또는 각각 AbM' 또는 AbM으로서 언급될 것임)의 검출이 실행되거나, 또는 상기 기재된 하나 이상의 표적 단백질의 검출이 실행되거나 또는 둘 다 실행될 것이다. 마지막 경우, 조합 방법 또는 콤보 방법을 참조한다.
생물학적 샘플 내 미생물 M2(M' 또는 M)의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법이, 검출하고자 하는 미생물 M2의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체 AbM2의 검출을 포함하는 또는 이것으로 이루어지는 경우, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 또는 이것으로 이루어진다:
a) 면역어세이에 필요한 검출하고자 하는 상기 하나 이상의 항체 AbM2에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계, 상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래되거나 표적 단백질 그 자체임,
b) 상기 정의된 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계, 서열 S1은 검출하고자 하는 미생물 M2와 상이한 미생물 M1에 속하고 서열 S2는 상기 하나 이상의 결합 파트너의 펩티드 서열에 포함되는 것으로 이해됨,
c) 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 항체 AbM2와 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M2의 존재를 검출하는 단계.
검출하고자 하는 미생물 M2가 서열 S를 갖는 펩티드가 속하는 미생물인 경우(이것은 그러므로 미생물 M임), 생물학적 샘플 내 미생물 M의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법은 하기 단계를 포함하는 또는 이것으로 이루어지는, 검출하고자 하는 미생물 M의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체 AbM의 검출을 포함하는 또는 이것으로 이루어진다:
a) 상기 정의된 펩티드 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계,
b) 면역어세이에 필요한 검출하고자 하는 상기 하나 이상의 항체 AbM에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계, 상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래되거나 표적 단백질 그 자체이고, 펩티드 서열 S를 포함함,
c) 펩티드 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 항체 AbM과 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M의 존재를 검출하는 단계.
검출하고자 하는 미생물 M2가 서열 S를 갖는 펩티드가 속하는 미생물이 아니지만, 서열 S'가 속하는 미생물인 경우(이것은 그러므로 미생물 M'임), 생물학적 샘플 내 미생물 M'의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법은 하기 단계를 포함하는 또는 이것으로 이루어지는, 검출하고자 하는 미생물 M'의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체 AbM'의 검출을 포함하는 또는 이것으로 이루어진다:
a) 상기 정의된 펩티드 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계,
b) 면역어세이에 필요한 검출하고자 하는 상기 하나 이상의 항체 AbM'에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계, 상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래되거나 표적 단백질 그 자체이고, 상기 정의된 펩티드 서열 S'를 포함함,
c) 펩티드 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 항체 AbM'와 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M'의 존재를 검출하는 단계.
표현 "상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래되거나 표적 단백질 그 자체임"은 결합 파트너가 어세이하고자 하는 샘플의 항체에 결합할 수 있는 이전에 기재된 표적 단백질 또는 그 밖의 이의 단편인 것을 의미하는 것으로 이해된다.
생물학적 샘플 내 미생물 M2(M' 또는 M)의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법이, 검출하고자 하는 미생물 M2의 하나 이상의 표적 단백질의 검출을 포함하는 또는 이것으로 이루어지는 경우, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 또는 이것으로 이루어진다:
a) 면역어세이에 필요한, 상기 미생물 M2의 하나 이상의 표적 단백질에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계,
b) 상기 정의된 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계, 서열 S1은 검출하고자 하는 미생물 M2와 상이한 미생물 M1에 속하고 서열 S2는 상기 하나 이상의 표적 단백질의 펩티드 서열에 포함되는 것으로 이해됨,
c) 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 표적 단백질과 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M2의 존재를 검출하는 단계.
검출하고자 하는 미생물 M2가 서열 S를 갖는 펩티드가 속하는 미생물인 경우(이것은 그러므로 미생물 M임), 생물학적 샘플 내 미생물 M의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법은 하기 단계를 포함하는 또는 이것으로 이루어지는, 검출하고자 하는 미생물 M의 하나 이상의 표적 단백질의 검출을 포함하는 또는 이것으로 이루어진다:
a) 면역어세이에 필요한, 상기 미생물 M의 상기 하나 이상의 표적 단백질에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계,
b) 상기 정의된 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계, 상기 서열 S는 상기 하나 이상의 표적 단백질의 펩티드 서열에 포함됨,
c) 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 표적 단백질과 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M의 존재를 검출하는 단계.
검출하고자 하는 미생물 M2가 서열 S를 갖는 펩티드가 속하는 미생물이 아니지만, 서열 S'가 속하는 미생물인 경우(이것은 그러므로 미생물 M'임), 생물학적 샘플 내 미생물 M'의 존재의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법은 하기 단계를 포함하는 또는 이것으로 이루어지는, 검출하고자 하는 미생물 M'의 하나 이상의 표적 단백질의 검출을 포함하는 또는 이것으로 이루어진다:
a) 면역어세이에 필요한, 상기 미생물 M'의 상기 하나 이상의 표적 단백질에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계,
b) 상기 정의된 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계, 상응하는 서열 S'는 상기 하나 이상의 표적 단백질의 펩티드 서열에 포함되는 것으로 이해됨,
c) 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재 하에 면역어세이를 실행하는 단계, 및
d) 표적 단백질과 결합 파트너(들) 사이에 형성되는 복합체를 측정함으로써 미생물 M'의 존재를 검출하는 단계.
추구하고자 하는 표적 단백질에 대한 결합 파트너로서, 항체, 항체 분획, 나노피틴(nanofitin), 상기 항원에 대한 수용체 또는 추구하고자 하는 표적 단백질과 상호작용을 갖는 것으로 공지된 임의의 기타 단백질이 언급될 수 있다.
결합-파트너 항체는 예를 들어, 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체이다.
폴리클론 항체는 표적 단백질 또는 미생물 M2(M' 또는 M)가 바이러스인 경우 비활성화된 및/또는 분획화된 바이러스 입자, 또는 그 밖에 미생물 M2(M' 또는 M)가 박테리아인 경우 박테리아 용리물 또는 박테리아 단백질의 추출물로의 동물의 면역화 이후, 상기 동물로부터 혈청 샘플을 채취함에 의한 원하는 항체의 정제된 형태로의 회수, 및 다른 혈청 성분으로부터 상기 항체의 분리, 특히 항체, 특히 상기 표적 단백질에 의해 특이적으로 인지되는 항원에 부착된 컬럼 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 수득될 수 있다.
단일클론 항체는 하이브리도마 기법에 의해 수득될 수 있고, 이의 기본 원리는 본원에 이후 요약된다.
먼저, 동물(일반적으로 마우스)을 관심의 표적 단백질 또는 미생물 M2(M' 또는 M)가 바이러스인 경우 비활성화된 및/또는 분획화된 바이러스 입자, 또는 그 밖에 미생물 M2(M' 또는 M)가 박테리아인 경우 박테리아 용리물 또는 박테리아 단백질의 추출물로 면역화하고, 그러면 상기 동물의 B 림프구는 상기 항원에 대항하는 항체를 생성할 수 있다. 이후 상기 항체-생성 림프구를 "불멸" 골수종 세포(예에서는 뮤린)와 융합시켜 하이브리도마를 산출하도록 한다. 이후 특정 항체를 생성할 수 있고 무기한으로 증식할 수 있는 세포의 선별을 그렇게 수득된 세포의 이종 혼합물을 사용하여 실시한다. 각각의 하이브리도마는 클론의 형태로 증식하고, 각각은 상기 표적 단백질과 관련하여 이의 인지 특성이, 예를 들어 ELISA에 의해, 1차원 또는 2차원 면역이동(immunotransfer)(웨스턴 블롯)에 의해, 면역형광에 의해, 또는 바이오센서(biosensor)를 사용하여 시험될 수 있는 단일클론 항체의 생성을 야기한다. 그렇게 선별된 단일클론 항체는 이어서, 특히 상기 기재된 친화성 크로마토그래피 기법에 따라 정제된다.
단일클론 항체는 또한 당업자에게 잘 공지된 기법을 사용하는 유전 공학에 의해 수득된 재조합 항체일 수 있다.
항체 단편의 예로는, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편 및 또한 scFv (단쇄 가변 단편) 및 dsFv (이중-사슬 가변 단편) 사슬이 언급될 수 있다. 상기 기능적 단편은 특히 유전 공학에 의해 수득될 수 있다.
나노피틴(Nanofitins, 상표명)은 항체와 같이, 생물학적 표적에 결합할 수 있어 유기체 내에서 이를 검출하고 포획하거나 또는 이것을 꽤 간단히 표적화할 수 있는 작은 단백질이다.
단백질 및/또는 항체(또한 검출하고자 하는 미생물 M2(M' 또는 M)의 분석 대표물로서 언급됨)가 검출되는지와 관계 없이, 결합 파트너는 이들이 검출하고자 하는 분석물에 특이적이거나 비특이적일 수 있다는 사실을 공통으로 갖는다. 이들이 상기 분석물에 배타적으로 또는 사실상 배타적으로 결합할 수 있는 경우 이들은 특이적이라고 불린다. 상기 분석물에 대한 결합 선택성이 약하고 이들이 다른 리간드, 예컨대 다른 단백질 또는 항체에 결합할 수 있는 경우 이들은 비특이적이라고 불린다. 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 특이적 결합 파트너가 바람직하다.
본 발명의 방법에서 추구되는 분석물에 대해 특이적인 또는 비특이적인 상기 결합 파트너는 실행되는 면역어세이의 문맥에서 포획 시약으로서, 검출 시약으로서, 또는 포획 및 검출 시약으로서 사용될 수 있다.
물론, 용어 "면역어세이"에서의 "면역"은 예를 들어 본 출원에서 결합 파트너가 면역학적 파트너, 예컨대 항체인 것을 엄격하게 나타내는 것으로 고려되어서는 안된다. 실제로, 당업자는 또한 결합 파트너(또한 리간드로 불림)가 면역학적 파트너는 아니지만, 예를 들어, 어세이하도록 디자인된 분석물에 대한 수용체인 경우에도 상기 용어를 폭넓게 사용한다. 그러므로, 심지어 용어 "면역"이 두문자어 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 포함되더라도, 또한 "리간드 결합 어세이(Ligand Binding Assays)"로서 널리 언급되는 비-면역학적 결합 파트너를 사용하는 어세이에 대해 ELISA 어세이를 언급하는 것이 통상의 실시이다. 명확성을 위해, 본 출원인은 본 명세서 전반적으로, 결합 파트너(심지어 이것이 면역학적 파트너가 아닌 경우에도)를 사용하는 임의의 어세이에 대해 용어 "면역"을 사용할 것이다.
면역어세이의 실행은 검출하고자 하는 미생물 M2(M' 또는 M) 및 사용하고자 하는 결합 파트너에 따라 이들의 시험을 채택하는 당업자에게 널리 공지된 단계이다.
상기 방법 동안, 본 발명의 하나 이상의 펩티드가 첨가될 것이고 당업자는 이에 따라 시험의 조건을 채택할 것이다. 면역어세이 방법은 바람직하게는 본 발명에 따른 간섭 펩티드의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 사용을 포함할 것이다.
간섭 펩티드(들)은 면역어세이 시작 전 또는 면역어세이의 항원-항체 반응 단계 중 임의의 하나 동안 어세이하고자 하는 생물학적 샘플에 첨가될 것이다. 1-단계 면역어세이의 경우에서, 간섭 펩티드는 생물학적 샘플이 포획 상과 반응하는 경우 존재할 것이거나 첨가될 것이다. 2-단계 면역어세이의 경우에서, 간섭 펩티드는 포획 동안 또는 노출 동안, 또는 둘다 동안 첨가될 것이다. 임의의 경우에서, 간섭 펩티드는 노출 단계 전에 첨가될 것이다(기질의 첨가 및 신호의 가시화 또는 검출).
분석물과 결합 파트너 사이에 형성되는 복합체를 측정함에 의한 미생물 M2(M' 또는 M)의 존재의 검출은 당업자에게 공지된 면역어세이의 가시화의 임의의 방법, 예컨대 직접 또는 간접 수단에 의해 실행될 수 있다.
직접 검출, 즉 표지화에 의해 실행되지 않는 검출의 경우, 면역학적 반응은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명에 의해 또는 전도성 중합체를 가진 전극에 대한 순환 전압전류법에 의해 관찰된다.
간접 검출은 검출 시약이라는 용어의 결합 파트너, 또는 표적 단백질 그 자체, 또는 하나 이상의 이의 단편의 표지화에 의해 실행된다.
용어 "표지화"는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있는 표지 시약의 부착을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 표지 시약의 비제한적인 목록은 하기로 이루어진다:
Figure pct00002
예를 들어 비색법, 형광 또는 인광에 의해 검출가능한 신호를 생성하는 효소, 예를 들어 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나아제,
Figure pct00003
발색단, 예를 들어 형광, 인광 또는 염료 화합물,
Figure pct00004
방사능 분자, 예를 들어 32P, 35S 또는 125I, 및
Figure pct00005
형광 분자, 예컨대 Alexas 또는 피코시아닌.
간접 검출 시스템, 예를 들어, 항-리간드와 반응할 수 있는 리간드가 또한 사용될 수 있다. 리간드/항-리간드 쌍이 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 이것은 예를 들어, 하기 쌍을 가진 경우이다: 비오틴/스트렙타비딘, 합텐/항체, 항원/항체, 펩티드/항체, 당/렉틴, 폴리뉴클레오티드/상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열. 이 경우, 이것은 결합 파트너를 가지고 있는 리간드이다. 항-리간드는 이전 단락에 기재된 표지 시약을 사용하여 직접적으로 감출될 수 있거나, 리간드/항-리간드를 사용하여 그 자체가 검출가능할 수 있다.
상기 간접 검출 시스템은 특정 조건 하에서, 신호의 증폭을 야기할 수 있다. 상기 신호 증폭 기법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 본 출원인의 종래 특허 출원 FR 98/10084 또는 WO-A-95/08000 또는 논문 Chevalier et al., 1997을 참조할 수 있다.
사용되는 표지화 유형에 따라, 당업자는 임의의 유형의 측정 장치, 예를 들어 분광광도계, 분광형광계 또는 그 밖의 고화질 카메라를 사용하여 검출가능한 신호의 방출 또는 표지화의 가시화를 가능하게 하는 시약을 첨가할 것이다.
본 발명의 방법을 실행할 수 있는 생물학적 샘플은 미생물의 분석 대표물(항원, 항체)을 함유할 수 있는 임의의 생물학적 샘플로, 여기서 면역어세이가 실행될 수 있다. 상기 샘플은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 샘플의 예로서, 생물학적 유체, 예컨대 혈청, 혈장, 혈액, 전혈액, 소변 또는 뇌척수액 뿐 아니라 조직, 대변 등도 언급될 수 있다. 생물학적 샘플은 병원성 미생물의 존재를 검출하는 것이 필수적인 임의의 동물, 예컨대 인간을 비롯한 포유동물, 양 종류, 소, 염소과 일원, 개과 일원, 생선 및 조류 종으로부터 유래된다. 본 출원인은 모든 예상과 반대로, 상기 샘플이 또한 검출하고자 하는 미생물 M2와 상이한 미생물에 대항하는 항체 AbM1을 함유할 수 있고 이것이 시험의 위-양성 결과를 산출하는 상기 항체인 것을 보여주었다.
생물학적 샘플은 이전 단계에서 처리될 수 있다. 예를 들어, 검출하고자 하는 항원의 노출을 촉진하는 산성 조건이 사용될 수 있다. 이온성 또는 비이온성 유형의 세제, 예를 들어 triton X100 또는 SDS(소듐 도데실 술페이트) 또는 폴리(옥시에틸렌) 유도체, 예를 들어 NP40이 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 사용은 그러므로 임의의 면역어세이 방법에서 특히 유용하다. 그러므로, 본 발명의 또다른 주제는 생물학적 샘플에서, 검출하고자 하는 미생물의 분석 대표물의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법에서의, 상기 정의된 서열 S를 갖는 간섭 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드의 유용성은 위 양성의 제거, 따라서 시험의 특이성을 향상시키는데 있으므로, 또다른 주제는 상기 정의된 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드의, 면역어세이의 실행 동안의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서, 검출하고자 하는 미생물의 분석 대표물의 시험관 내 면역어세이-기재 검출 방법의 특이성을 개선시키기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 비제한적인 설명에 의해 제공되는 하기 실시예에 의해, 또한 하기와 같은 도 1 내지 4에 의해 더욱 명백하게 이해될 것이다:
- 도 1은 HCV 펩티드 V7E-1과 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 펩티드 Y7E-1 사이의 정렬을 보여주고,
- 도 2는 HCV 펩티드 E8E와 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 펩티드 A8E (도 2A), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 펩티드 Y7E-2 (도 2B)와 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) (GB-1 균주) 펩티드 D8E (도 2C) 사이의 정렬을 보여주고,
- 도 3은 HIV-1 펩티드 E8L-2와 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 펩티드 E8L-1 사이의 정렬을 보여주고,
- 도 4는 HCV 펩티드 E8E와 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 펩티드 A6M 사이의 정렬을 보여준다.
도면에서, " . "는 상기 위치에 존재하는 아미노산과 관련된 아미노산 일치를 나타내고, " -°"는 제시된 위치에서의 결실을 나타낸다.
실시예 1: 간섭 펩티드 Y7E -1 (스타필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus )) 및 V7E ( HCV )
HCV 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염을 진단하기 위한 면역어세이의 특이성을 개선하기 위해, 본 발명에 따른 2개의 간섭 펩티드를 정의하였다.
펩티드 Y7E-1은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세포외부 매트릭스 단백질-결합 단백질 Emp(UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 Q8NXI8) 의 아미노산 322-330에 상응하는, 펩티드 서열 YSPTHYVPE (SEQ ID N°1)를 갖는다. 상기 펩티드 Y7E를, VSPTHYVPE (SEQ ID N°2) 이고 HCV의 NS4B 단백질(NCBI RefSeq 참조 서열에 따른 넘버링, 접근 번호는 NP_751926임)의 아미노산 218-226에 상응하는 펩티드 서열인 HCV 펩티드 V7E와 정렬시킨다.
펩티드 Y7E-1과 V7E의 정렬은 도 1에 제시된다. 펩티드 Y7E-1 및 V7E는 9개의 아미노산의 공통 길이에 대해 89%의 일치성을 갖는다.
실시예 2: 간섭 펩티드 E8E ( HCV ) 및 A8E (스트렙토코쿠스 뉴모니아에( Streptococcus pneumoniae )), Y7E -2 (바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis )) 및 D8E (슈도모나스 엔토모필라( Pseudomonas entomophila ) 또는 퓨티다( putida ) GB-1 균주)
HCV, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila) 또는 퓨티다(putida) GB-1 균주에 의한 감염을 진단하기 위한 면역어세이의 특이성을 개선하기 위해, 본 발명에 따른 여러 개의 간섭 펩티드를 정의하였다.
펩티드 A8E는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 리보솜 작은 서브유닛 메틸트랜스페라아제 H 단백질(UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 C1CPL0)의 아미노산 64-73에 상응하는, 펩티드 서열 AQKRLAPYIE (SEQ ID N°3)을 갖는다. 상기 펩티드를, HCV의 NS4B 단백질(NP_751926)의 아미노산 1-8에 융합된, ECSQHLPYIE (SEQ ID N°4) 이고 HCV의 NS4A 단백질(NP_751925)의 아미노산 53-54에 상응하는 펩티드 서열인 HCV 펩티드 E8E와 정렬시킨다.
펩티드 A8E 및 E8E의 정렬은 도 2A에 제시된다. 펩티드 A8E 및 E8E는 10개의 아미노산의 공통 길이에 대해 50%의 일치성을 갖는다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 이외의 미생물의 펩티드는 또한 본 발명의 HCV 펩티드 E8E와 정렬될 수 있다. 펩티드 Y7E-2는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 메티오닌-결합 지단백질 metQ(UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 O32167)의 아미노산 84-92에 상응하는, 펩티드 서열 YFQHIPYLE (SEQ ID N°5)을 갖는다. 펩티드 Y7E-2 및 E8E의 정렬은 도 2B에 제시된다. 펩티드 Y7E-2 및 E8E는 9개의 아미노산의 공통 길이에 대해 55%의 일치성을 갖는다.
펩티드 D8E는 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila) (UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 Q1ID35) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) (GB-1 균주) (UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 B0KUN5)의 신장 인자 P 단백질의 아미노산 97-106에 상응하는, 펩티드 서열 DIDAVLPYIE (SEQ ID N°6)을 갖는다. 펩티드 D8E 및 E8E의 정렬은 도 2C에 제시된다. 펩티드 D8E 및 E8E는 10개의 아미노산의 공통 길이에 대해 50%의 일치성을 갖는다.
실시예 3: 간섭 펩티드 E8L -1 (마이코플라즈마 뉴모니아에( Mycoplasma pneumoniae )) 및 E8L -2 ( HIV -1)
HIV-1 또는 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)에 의한 감염을 진단하기 위한 면역어세이의 특이성을 개선하기 위해, 본 발명에 따른 간섭 펩티드를 정의하였다.
펩티드 E8L-1은 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) M129 tRNA (구아닌-N(1)-)-메틸트랜스페라아제 단백질(UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 P75132)의 아미노산 200-209에 상응하는, 펩티드 서열 EAYRKEQQLL (SEQ ID N°7)을 갖는다. 상기 펩티드를, ERYLKDQQLL (SEQ ID N°8) 이고 HIV-1의 gp160 외피 당단백질(NCBI RefSeq 참조 서열에 따른 넘버링, 접근 번호는 NP_057856임)의 아미노산 584-593에 상응하는 펩티드 서열인 HIV-1 펩티드 E8L-2와 정렬시킨다. 정확한 위치는 HIV-1 균주마다 상이할 수 있어, 상기 바이러스의 큰 유전적 변이성을 제공한다. 펩티드 E8L-1 및 E8L-2의 정렬은 도 3에 제시된다. 펩티드 E8L-1 및 E8L-2는 10개의 아미노산의 공통 길이에 대해 70%의 일치성을 갖는다.
실시예 4: 본 발명에 따른 간섭 펩티드의 사용을 통한 항-HCV 항체에 대한 면역어세이의 특이성의 개선
C형 간염 바이러스 감염의 진단은 현재 3세대 면역효소적 혈청학 시험이고 단백질 Core, NS3, 및 NS4, 및 특정 시험의 경우 NS5에 대항하는 항체를 나타내는 면역어세이를 사용하여 시행된다. 상기 검출된 항-HCV 항체는 현재의 또는 과거의 감염의 증거이다.
항-바이러스 항체를 입증하는 것을 가능하게 하는 면역효소적 혈청학 시험은 마이크로플레이트에서, 자동화 방식으로 또는 수동으로, 또는 그 밖에 자동화된 면역분석 장치, 예컨대 Vidas®(bioMerieux)을 사용하여 실행될 수 있다. 이 경우에서, 모든 시험 단계는 기구에 의해 자동으로 실행된다. 다양한 면역효소적 기법, 및 특히 ELISA는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 주요 원리 및 또한 프로토콜 예는 서적 "The ELISA Guidebook", 제2판, 저자: John R. Crowther, Humana Press 출판(DOI: 10.1007/978-1-60327-254-4)에 기재되어 있다.
일회용 팁(SPR®)은 고상으로서 그리고 파이펫팅 시스템으로서 모두 작용한다. 팁의 표면을 HCV Core, NS3 및 NS4 단백질에 대항하는 항체의 검출을 위한 항원으로 코팅한다. 제 1 단계에서, 샘플을 희석한 다음, 팁 내부로 위 아래로 흡입시킨다. 샘플에 존재하는 항-HCV 항체는 팁 내부에 존재하는 항원에 결합할 것이다. 세정 단계는 비결합된 화합물을 제거한다. 제 2 단계 동안, 재조합 알칼리 포스파타제에 공액된, Fab' 형태의 (마우스) 항-인간 면역글로불린(항-IgG) 단일클론 IgG를 팁 내부로 위 아래로 흡입시키고, 고상의 항원에 결합된, 시험된 샘플로부터의 항-HCV 인간 Ig에 결합할 것이다. 세정 단계는 비결합된 화합물을 제거한다. 최종 노출 단계 동안, 기질(4-메틸움벨리페릴 포스페이트)을 팁 내에서 위 아래로 흡입시킨다; 공액체의 효소는 상기 기질의 가수분해에 대한 반응을 촉매화하여 생성물(4-메틸움벨리페론)을 산출하고, 이의 방출된 형광은 450 nm에서 측정된다. 형광 신호의 값은 샘플에 존재하는 항체의 농도에 비례한다. 시험 종료시에, 결과는 1 (기계에 저장된 값)로 돌아가는 표준 S1의 값에 의해 수득된 값을 나눔으로써, 기계에 의해 지수의 형태로 자동으로 계산된다. 따라서, 지수가 1 이상인 샘플은 면역효소적 시험에 의해 양성인 것으로(항-HCV 항체의 존재), 지수가 1 미만인 샘플은 음성인 것으로(항-HCV 항체의 부재) 고려된다. 이어지는 단락에서, 상기 HCV-항체 어세이 절차는 간섭 펩티드가 없는 항-HCV 항체를 어세이하는 것에 상응하는 "작동 모드 1"로서 언급될 것이다.
시험된 샘플 내에 함유된 요소로 인해, 항-NS4 항체의 검출을 위한 작동 모드 1의 항원의 비특이적 인지와 연관된 간섭을 감소시키기 위해, 실시예 1 및 2에서 정의된 다양한 간섭 펩티드를 사용하였다. 이들은 검출하고자 하는 바이러스(미생물 M의 검출을 위해 본 발명의 서열 S를 갖는 펩티드의 사용), 또는 검출하고자 하는 바이러스와 상이한 미생물(미생물 M'의 검출을 위해 본 발명의 서열 S를 갖는 펩티드의 사용)에 속하는 펩티드이다. 상기 펩티드는 당업자에게 잘 공지된 절차에 따른 화학적 합성, 예컨대 0.1-1.0mmol 아민/중합체 g을 함유하는 폴리스티렌 유형의 중합체를 사용하는, Merrifield, 1962 및 Fields and Noble, 1990에 의해 기재된 고상 펩티드 합성에 의해 제조되었다. 화학적 합성 종료시에, 펩티드는 대략 2시간 동안 트리플루오로아세트산-에탄디티올-트리이소프로필실란-물(94/2.5/1/2.5 V/V/V/V) 혼합물의 존재 하에 탈보호되고 중합체로부터 분할될 수 있다. 중합체의 제거 후, 펩티드는 0℃에서, 디에틸 에테르로부터의 침전에 의해 추출된다. 이들은 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기법에 의해 정제될 수 있다. 적합한 정제 분획의 동결건조는 표준 물리화학 기법, 예컨대 질량 분광분석, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 아미노산 분석에 의해 특징화될 수 있는 균질 펩티드를 산출한다.
HCV 감염에 대해 음성이고 Rhone-Alpes "Centres de Transfusion Sanguine" [Blood Banks]로부터 유래하는 수 백개의 혈청 샘플을, 간섭 문제를 제기하는 샘플을 확인하기 위해 스크리닝하였다. 이를 위해, 샘플을 Vidas 자동화 장비를 사용하는 작동 모드 1에 따라 어세이하였다. 작동 모드 1에 따라 양성이었던(지수 > 1) 혈청만을 선별하였다.
작동 모드 1의 결과와 "Centres de Transfusion Sanguine" [Blood Banks]에 의해 성립된 음성 상태의 결과 사이의 이러한 차이는 간섭 문제를 제기하는 위-양성 혈청을 선택하는 것을 가능하게 만든다.
본 발명에 따른 간섭 펩티드의 사용이 시험의 민감성을 손상시키지 않는다는 것을 보여주기 위해, 시판 혈청 풀(Trina Bioreactives AG)로부터 유래된 양성 대조군 샘플 C1을 또한 어세이하였다.
표 1은, 간섭 문제를 야기하는 7개의 혈청 및 양성 대조군 C1에 대해, 펩티드 V7E (SEQ ID N°2) 또는 펩티드 Y7E (SEQ ID N°1)의 존재 하에 또는 부재 하에 "작동 모드 1"에 따라 실행된 어세이의 결과를 제공한다. 상기 펩티드를 시험하고자 하는 샘플의 희석 및 고상에 존재하는 항원과의 이의 인큐베이션에 상응하는 면역효소적 시험 프로토콜의 제 1 단계 동안 5 μg/ml의 농도로 첨가하였다.
작동 모드 1 작동 모드 1 + V7E 작동 모드 1 + Y7E
간섭이 있는 샘플 pos 지수
>1
175 1811 1.44 0.49 0.47
498 1.65 0.35 0.14
F53 3009 1.19 0.39 0.32
M43 1.73 0.42 0.17
H48 7.12 1.17 0.88
801 1409 1.91 1.04 0.71
284 2408 2.33 1.51 0.86
양성 대조군 pos 지수
>1
C1 3.02 3.06 3.02
어세이 동안 펩티드 Y7E의 첨가는 모든 혈청에서 간섭을 완전히 중화시키는 것을 가능하게 한다. 펩티드 V7E는 혈청의 4/7에서 간섭을 중화시키는 것을, 이의 일부에 대해 가능하게 한다. 게다가, 시험의 민감성은 간섭 펩티드의 사용에 의해 손상되지 않는다.
마찬가지로, 표 2는 간섭 문제를 야기하는 2개의 다른 혈청 및 양성 대조군에 대해, 펩티드 E8E (SEQ ID N°4), 펩티드 A8E (SEQ ID N°3), 또는 그 밖의 펩티드 A6M (SEQ ID N°9)의 존재 하에 또는 부재 하에 항-HCV 항체 검출 프로토콜의 작동 모드 1에 따라 실행된 어세이의 결과를 제공한다. 상기 펩티드를 시험하고자 하는 샘플의 희석 및 고상에 존재하는 항원과의 이의 인큐베이션에 상응하는 면역효소 시험 프로토콜의 제 1 단계 동안 1μg/ml의 농도로 첨가하였다.
APYIEKGM (SEQ ID N°9)인 펩티드 서열인 펩티드 A6M은 또한 리보솜 작은 서브유닛 메틸트랜스페라아제 H 단백질(UniProtKB 데이터베이스의 접근 번호 C1CPL0)의 아미노산 69-76에 상응하는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 펩티드이다. 상기 펩티드는 본 발명에 따른 간섭 펩티드가 아닌데, 이것이 청구된 정렬의 정의에 상응하지 않기 때문이다 (도 4 참조). 실제로, 심지어 상기 펩티드가 HCV 펩티드 E8E와 일치하는 4개의 인접 아미노산을 갖고 8개의 아미노산 길이일지라도, 이의 서열은 E8E와 관련하여 정렬되지 않는다. 이와 관련하여, 상기 펩티드 A6M은 표 2에 제시되는 실험에서 음성 대조군으로서 사용된다.
작동 모드 1 작동 모드 1 + E8E 작동 모드 1 + A8E 작동 모드 1 + A6M
간섭이 있는 샘플 지수 지수 지수 지수
F25 4.32 0.85 0.41 2.90
295 1.02 0.90 0.95 1.04
양성 대조군 pos 지수
>1
C1 3.03 2.92 3.02 3.05
어세이 동안 펩티드 E8E 또는 그 밖의 펩티드 A8E의 첨가는 혈청의 2/2에서 간섭을 완전히 중화시키는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 펩티드가 아닌 펩티드 A6M은 어떠한 혈청에서도 간섭을 중화시키지 못한다. 여기서 다시, 시험의 민감성은 손상되지 않는다.
참조 문헌
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> BIOMERIEUX <120> Interfering peptides and method for detecting micro-organisms <130> IP20142545FR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> staphylococcus <400> 1 Tyr Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> HCV <400> 2 Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Streptoccus <400> 3 Ala Gln Lys Arg Leu Ala Pro Tyr Ile Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> HCV <400> 4 Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus <400> 5 Tyr Phe Gln His Ile Pro Tyr Leu Glu 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas <400> 6 Asp Ile Asp Ala Val Leu Pro Tyr Ile Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Mycoplasma <400> 7 Glu Ala Tyr Arg Lys Glu Gln Gln Leu Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> HIV <400> 8 Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 9 Ala Pro Tyr Ile Glu Lys Gly Met 1 5

Claims (27)

  1. 미생물 M의 항원 단백질의 펩티드 서열에서 유래된 7 내지 12개 아미노산의 펩티드 서열 S를 갖는 간섭 펩티드로서,
    상기 서열 S는 미생물 M과 상이한 미생물 M'의 표적 단백질의 펩티드 서열에서 유래된 7 내지 12개 아미노산의 펩티드 서열 S'에 대해 정렬되며; 상기 서열 S 및 S'는 7 내지 12개 아미노산의 길이에 대해 50% 이상의 일치성, 및 4개 이상의 동일하거나 유사한 인접 아미노산을 나타내고; 상기 서열 S 및 S'의 길이가 동일하거나, 또는 상기 서열 S 및 S'가 상기 서열의 한쪽 말단 및/또는 다른 말단에 분포된 1개 또는 2개 아미노산의 차이를 나타내고; 서열 SEQ ID N°2를 갖는 펩티드 V7E는 제외되는 것을 특징으로 하는; 간섭 펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열 S 및 S'는 8 내지 10개의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 미생물 M'은 바이러스 또는 박테리아인 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 M'은 바이러스이고, 상기 미생물 M은 박테리아인 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 M'은 박테리아이고, 상기 미생물 M은 바이러스인 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 C형 간염 바이러스(HCV: hepatitis C virus)인 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  7. 제6항에 있어서,
    HCV 바이러스와 상이한 미생물이 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(GB-1 균주)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열 S를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°1을 갖는 Y7E-1, 서열 SEQ ID N°3을 갖는 A8E, 서열 SEQ ID N°5를 갖는 Y7E-2, 서열 SEQ ID N°6을 갖는 D8E 및 서열 SEQ ID N°4를 갖는 E8E로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  9. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 HIV-1인 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  10. 제9항에 있어서,
    검출대상인 바이러스와 상이한 미생물이 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)인 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 서열 S를 갖는 펩티드는 서열 SEQ ID N°7을 갖는 E8L-1 및 서열 SEQ ID N°8을 갖는 E8L-2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 간섭 펩티드.
  12. 검출대상인 미생물 M의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체 AbM의 검출을 포함하거나 이러한 검출로 구성되는 생물학적 샘플내 미생물 M의 존재의 시험관내 면역어세이-기재 검출 방법으로서,
    하기 단계를 포함하거나 하기 단계로 구성된 방법:
    a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 펩티드 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계;
    b) 면역어세이에 필요한 검출대상인 상기 하나 이상의 항체 AbM에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계, 이때 상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래된 것이거나 또는 표적 단백질 그 자체이고, 펩티드 서열 S를 포함함;
    c) 펩티드 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재하에 면역어세이를 실행하는 단계; 및
    d) 항체 AbM과 결합 파트너 사이에 형성되는 복합체를 측정하여, 미생물 M의 존재를 검출하는 단계.
  13. 검출대상인 미생물 M'의 표적 단백질에 대항하는 하나 이상의 항체 AbM'의 검출을 포함하거나 이러한 검출로 구성되는 생물학적 샘플내 미생물 M'의 존재의 시험관내 면역어세이-기재 검출 방법으로서,
    하기 단계를 포함하거나 하기 단계로 구성된 방법:
    a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 펩티드 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계;
    b) 면역어세이에 필요한 검출대상인 상기 하나 이상의 항체 AbM'에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계, 이때 상기 하나 이상의 결합 파트너는 항체에 대항하는 상기 표적 단백질로부터 유래된 것이거나 또는 표적 단백질 그 자체이고, 상기 정의된 펩티드 서열 S'를 포함함;
    c) 펩티드 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재하에 면역어세이를 실행하는 단계; 및
    d) 항체 AbM'와 결합 파트너 사이에 형성되는 복합체를 측정하여, 미생물의 존재를 검출하는 단계.
  14. 검출대상인 미생물 M의 하나 이상의 표적 단백질의 검출을 포함하거나 이러한 검출로 구성되는 생물학적 샘플내 미생물 M의 존재의 시험관내 면역어세이-기재 검출 방법으로서,
    하기 단계를 포함하거나 하기 단계로 구성된 방법:
    a) 면역어세이에 필요한 상기 미생물 M의 상기 하나 이상의 표적 단백질에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계;
    b) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계, 이때 상기 서열 S는 상기 하나 이상의 표적 단백질의 펩티드 서열에 포함됨;
    c) 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재하에 면역어세이를 실행하는 단계; 및
    d) 표적 단백질과 결합 파트너 사이에 형성되는 복합체를 측정하여, 미생물 M의 존재를 검출하는 단계.
  15. 검출대상인 미생물 M'의 하나 이상의 표적 단백질의 검출을 포함하거나 이러한 검출로 구성되는 생물학적 샘플내 미생물 M'의 존재의 시험관내 면역어세이-기재 검출 방법으로서,
    하기 단계를 포함하거나 하기 단계로 구성된 방법:
    a) 면역어세이에 필요한 상기 미생물 M'의 상기 하나 이상의 표적 단백질에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 제공하는 단계;
    b) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 서열 S를 갖는 하나 이상의 간섭 펩티드를 제공하는 단계, 이때 상응하는 서열 S'는 상기 하나 이상의 표적 단백질의 펩티드 서열에 포함되는 것임;
    c) 서열 S를 갖는 상기 하나 이상의 간섭 펩티드의 존재하에 면역어세이를 실행하는 단계; 및
    d) 표적 단백질과 결합 파트너 사이에 형성되는 복합체를 측정하여, 미생물 M'의 존재를 검출하는 단계.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 펩티드 서열 S를 갖는 간섭 펩티드를 생물학적 샘플 중 검출대상인 미생물 M 또는 M'을 나타내는 분석물의 시험관내 면역어세이-기재 검출 방법에 사용하는 방법.
  17. 생물학적 샘플 중 검출대상인 미생물 M 또는 M'을 나타내는 분석물의 시험관내 면역어세이-기재 검출 방법의 특이성을 개선시키기 위한 방법으로서,
    면역어세이의 실행 동안 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 펩티드 서열 S를 갖는 하나 이상의 펩티드를 사용하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출대상인 미생물 M 또는 M'은 바이러스 또는 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출대상인 미생물 M 또는 M'이 바이러스이고, 상응하는 미생물 M' 또는 M이 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출대상인 미생물 M 또는 M'이 박테리아이고, 상응하는 미생물 M' 또는 M이 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 서열 SEQ ID N°1을 갖는 펩티드 Y7E-1.
  22. 서열 SEQ ID N°3을 갖는 펩티드 A8E.
  23. 서열 SEQ ID N°4를 갖는 펩티드 E8E.
  24. 서열 SEQ ID N°5를 갖는 펩티드 Y7E-2.
  25. 서열 SEQ ID N°6을 갖는 펩티드 D8E.
  26. 서열 SEQ ID N°7을 갖는 펩티드 E8L-1.
  27. 서열 SEQ ID N°8을 갖는 펩티드 E8L-2.
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