CN115201465A - 基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法及其筛选的多肽的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法及其筛选的多肽的应用。该筛选方法包括封闭及非封闭的条件下分别使用多肽芯片对含抗体的样本稀释液和不含抗体的样本稀释液进行第一次筛选，获得封闭条件下的第一种子肽库和非封闭条件下的第一种子肽库；对两种条件下的第一种子肽库中的多肽取交集得到第二种子肽库；在封闭的条件下使用多肽芯片对含抗体的血清样本和不含抗体的血清样本进行第二次筛选，得到第三种子肽库；取第三种子肽库与第二种子肽库的交集得到第四种子肽库；抗体为一个或多个单一抗体，或为多混合抗体。该方法排除了不同条件下的干扰多肽，获得的多肽集合特异性更高，适合用于临床复杂样本中抗体的检测。

Description

基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法及其筛选 的多肽的应用

技术领域

本发明涉及多肽芯片领域，具体而言，涉及一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法及其筛选的多肽的应用。

背景技术

生物芯片技术起源于二十世纪八十年代，也被称为“微流控技术”“芯片实验室”等。生物芯片技术能够在邮票大小的芯片上，进行较为复杂的生物、化学、物理等实验。生物芯片技术为制作成本低、样本少、时间短、操作简单的医疗仪器提供了技术支持。根据固定在芯片上的分子不同，生物芯片可分为寡核苷酸芯片、蛋白芯片、小分子芯片和多肽芯片等。蛋白芯片可用于蛋白水平互作研究、酶底物分析以及小分子蛋白靶点分析等，但由于表达和纯化大量蛋白、定向固定于支持物表面形成高通量芯片且保持蛋白活性在技术实现以及转化应用的成本控制均具有不小的挑战，因此多肽芯片因其易合成、稳定性好等优势，成为高通量蛋白质研究的有利工具。

多肽芯片，根据固相支持物选取、表面化学处理和固定方法及阵列肽合成方法等不同，有多种技术实现方式。根据实现技术的不同，可分为Merrifield synthesis、SPOT、光刻合成、SAMDI以及基于颗粒的合成等几种技术路线。目前可商业化获取多肽芯片机器技术比对如下。其中基于光刻原位合成的技术单个特征点物理尺寸小，可实现高密度芯片制备，更匹配生物分子互作的复杂度。

多肽芯片可用于抗原表位分析、蛋白及多肽配基结合分析以及酶活性底物分析等。其中抗体结合的映射表位(即多肽芯片上与抗体特异性结合的多肽，其可能是线性表位，也可能是构象表位)分析为多肽芯片最基础应用之一。基于PEPperPRINT多肽芯片，Loeffler及其同事以PEPperPRINT多肽芯片进行了针对莱姆病感染性特征蛋白VlsE的抗体表位分析。沿VlsE序列设计15个氨基酸长度的重叠肽，共335个肽段形成肽阵列。以该阵列对17名感染莱姆病患者的血清和7名未感染的患者的血清进行检测分析，以鉴定抗体可以识别的多肽。结果发现感染患者的血清分为两大类，第一组抗体主要是结合到VlsE抗原的N端或C末端区域。第二组抗体主要识别可变区域。

基于抗原序列而设计的多肽芯片包含多个部分重叠肽段从而整体覆盖抗原序列，适用于线性表位检测的情况。而B细胞及其来源的抗体主要识别位于抗原分子表面的抗原决定簇，在空间结构上临近，但序列上相连或者不相连，即除线性表位外，抗体识别表位还包括构象表位/不连续表位。

Stafford等人在前期使用随机多肽芯片筛选球虫病患者特异多肽的基础上，使用Merrifield合成法制备随机多肽芯片和基于抗原序列设计多肽，两种多肽芯片分别检测球虫病患及对照样本。一种芯片包含96个随机20-mer多肽(基于前期工作10000条随机多肽芯片筛选)，第二种包含83个基于已知球虫抗原表位序列设计的20-mer重叠多肽，用于检测患者的血清中球虫抗体结合。两种多肽芯片均已以球虫病感染和非感染血清样本处理进行结合信号检测，并均使用已知的球虫病IgG和IgM抗体检测，比较两种多肽芯片检测球虫病相关抗体的灵敏度和特异性。结果表明，随机多肽阵列比基于表位序列设计多肽阵列能更准确地诊断不同阶段的感染。

如上述，随机多肽阵列中与抗体结合的非线性表位的多肽，其与抗原序列不相关，但抗体的结合可能与原始抗原一样强、甚至更强。上述试验也间接证实了以随机多肽芯片可以发现更可代表真实表位结合情况的多肽序列，用于临床样本抗体检出和抗体阳性相关疾病的判断。

但目前基于多肽芯片法进行抗体检测及表位分析的主要存在以下几方面问题：

1.基于序列信息设计的多肽芯片可以较为明确地检测线性表位，相应地，表位对应肽段可用于抗体检测。但该方法无法满足对于普遍存在的非线性表位的检测需求。目前虽然有通过一个或者多个二硫键来约束多肽模拟不连续和构象依赖的表位，但依然是仅仅增加了少量非线性表位检测的可能性。

2.随机序列多肽芯片肽段数目多，且目标抗体构象表位核心识别位点可能仅为几个氨基酸，当肽段中有4～5个氨基酸残基完美匹配时即可结合抗体，因此随机序列芯片与抗体孵育后的信号肽段中可能包含了1)包括线性表位和/或构象表位的抗原表位；2)含线性表位和/或构象表位的核心识别氨基酸的序列；3)非特异性结合肽段等，但无法通过序列比对等方法排除非特异干扰信号。

3.临床上抗体检测以血清/血浆样本为主，成分复杂，以纯抗体在多肽芯片上孵育后分析得到的特异性肽段可能受到血清/血浆中其它蛋白的干扰，不一定可以用于目标抗体在血清中的信号检测。此外，机体内抗体为多克隆抗体，抗原表位不唯一，使用肽段模拟单一表位进行抗体检测容易漏检。

因此，基于多肽芯片检测抗原表位的方法仍需要进行改进。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法及其筛选的多肽的应用，以提高所筛选的多肽对抗体结合的灵敏度。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，该筛选方法包括：在封闭及非封闭的条件下，分别使用多肽芯片对第一抗体阳性样本和第一抗体阴性样本进行特异性结合多肽的第一次筛选，对应获得封闭条件下的第一种子肽库和非封闭条件下的第一种子肽库；对封闭条件下的第一种子肽库和非封闭条件下的第一种子肽库中的多肽取交集，得到第二种子肽库；在封闭的条件下，使用多肽芯片对第二抗体阳性样本和第二抗体阴性样本进行特异性结合多肽的第二次筛选，得到第三种子肽库；取第三种子肽库与第二种子肽库的交集，得到第四种子肽库；其中，第一抗体阳性样本为一个或多个含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为一个或多个含单一抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含单一抗体的血清样本；或者第一抗体阳性样本为一组或多组含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为一组或多组含混合抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含混合抗体的血清样本。

进一步地，第一抗体阳性样本为多个含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为多个含单一抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含单一抗体的血清样本，筛选方法还包括排除多个不同的单一抗体之间存在交集的多肽；优选地，在以下任意一个或多个时机排除多个不同的单一抗体之间存在交集的多肽：a.在非封闭条件下进行第一次筛选之后；b.在封闭条件下进行第一次筛选之后；c.在进行第二次筛选之后。

进一步地，第一抗体阳性样本为多组含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为多组含混合抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含混合抗体的血清样本，且任意两组含混合抗体的样本稀释液和/或任意两组含混合抗体的血清样本之间所含的抗体种类不重叠，则筛选方法还包括排除多组不同的混合抗体之间存在交集的多肽；优选地，在以下任意一个或多个时机排除多组不同的混合抗体之间存在交集的多肽：a.在非封闭条件下进行第一次筛选之后；b.在封闭条件下进行第一次筛选之后；c.在进行第二次筛选之后。

进一步地，在非封闭条件下和/或非封闭条件下，均采用两个或两个以上不同抗体浓度的第一抗体阳性样本进行第一次筛选；优选地，在非封闭条件下采用两个以上不同抗体浓度的第一抗体阳性样本进行第一次筛选，并确定两个不同抗体浓度的第一抗体阳性样本进行封闭条件下的第一次筛选；优选地，第一抗体阳性样本中所含的单一抗体的浓度或混合抗体中每个单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL；优选地，采用两个或两个以上不同抗体浓度的第二抗体阳性样本进行第二次筛选，更优选地，第二抗体阳性样本中所含的单一抗体的浓度或混合抗体中每个单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，进一步优选为50ng/mL-500ng/mL。

进一步地，样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，D-甘露醇在PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％；优选地，在封闭条件下是指采用封闭液对多肽芯片进行封闭，使用封闭后的多肽芯片进行筛选，更优选地，封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；进一步优选地，封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且封闭液的pH为7.4。

进一步地，抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，多个单一抗体或者混合抗体中的每个单一抗体均为多克隆抗体；优选地，多个单一抗体或者混合抗体中的每个单一抗体具有相同或不同的物种来源；优选地，物种来源为兔、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠或人；优选地，多个单一抗体或者混合抗体选自如下抗体中的多个：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。

进一步地，在使用多肽芯片进行第一次筛选和第二次筛选均包括依次进行的抗体样本孵育和二抗孵育，其中二抗带有荧光标记；优选地，二抗的物种来源根据第一次筛选和第二次筛选步骤中各单一抗体或混合抗体中的单一抗体的物种来源进行选择。

根据本申请的第二个方面，提供了一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，该筛选方法包括：在非封闭条件下，使用多肽芯片对多种单一抗体或多组混合抗体的第一阳性样本及相应的第一阴性样本进行特异性结合多肽的第一次筛选，得到每种单一抗体或每组混合抗体各自对应的第一抗干扰肽库；其中，第一阳性样本为含单一抗体的样本稀释液或者为含混合抗体的样本稀释液，第一阴性样本为不含单一抗体或混合抗体的样本稀释液；去除多种单一抗体或多组混合抗体各自对应的第一抗干扰肽库中存在交集的多肽，得到每种单一抗体或多组混合抗体对应的第二抗干扰肽库。

进一步地，该筛选方法进一步包括：在封闭条件下，使用多肽芯片对第一阳性样本及相应的第一阴性样本进行特异性结合多肽的第二次筛选，得到第三抗干扰肽库；取第二抗干扰肽库和第三抗干扰肽库中的多肽的交集，得到第四抗干扰肽库。

进一步地，筛选方法进一步包括：在封闭条件下，使用多肽芯片对第二阳性样本及相应的第二阴性样本进行特异性结合多肽的第三次筛选，得到第五抗干扰肽库；其中，第二阳性样本为含单一抗体的血清样本或含混合抗体的血清样本，第二阴性样本为不含单一抗体或混合抗体的血清样本；取第五抗干扰肽库与第四抗干扰肽库的交集，得到每种单一抗体或每组混合抗体对应的第六抗干扰肽库。

进一步地，在得到每种单一抗体或每组混合抗体对应的第三抗干扰肽库和/或第五抗干扰肽库后，筛选方法还包括：去除多种单一抗体或多组混合抗体在各第三抗干扰肽库和/或第五抗干扰肽库中存在交集的多肽。

进一步地，多种单一抗体或混合抗体中的每一种单一抗体采用两个或两个以上不同的抗体浓度进行第一次筛选；优选地，第一阳性样本中所含的单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL；优选地，样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，D-甘露醇在PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％；优选地，在非封闭条件下，采用两个以上不同抗体浓度的第一阳性样本进行第一次筛选，进而确定两个不同抗体浓度的第一阳性样本，然后在封闭条件下进行第二次筛选；优选地，每种单一抗体采用两个或两个以上不同抗体浓度的第二阳性样本进行第三次筛选；优选地，第二阳性样本中所含的单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL；优选地，在封闭条件下是指采用封闭液对多肽芯片进行封闭，使用封闭后的多肽芯片分别进行第二次筛选和第三次筛选；优选地，封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；进一步优选地，封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且封闭液的pH为7.4；优选地，单一抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，多种单一抗体或混合抗体中的每一种单一抗体均为多克隆抗体；优选地，多种单一抗体或混合抗体中的每一种单一抗体具有相同或不同的物种来源；优选地，物种来源为兔、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠或人；优选地，多种单一抗体或混合抗体选自如下抗体中的多个：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。

根据本申请的第三个方面，提供了一种待测样本中目标抗体的检测方法，该检测方法包括：利用目标抗体特异性结合的靶标多肽，对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测，得到各自对应的检测结果；若待测样本和阴性对照对应的检测结果存在显著差异，则表明待测样本含有目标抗体；靶标多肽为上述任一种筛选方法所筛选到的与目标抗体特异性结合的多肽。

进一步地，在对多肽芯片进行封闭的条件下，利用含靶标多肽的多肽芯片，对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测，得到各自对应的靶标多肽的检测结果；若靶标多肽在待测样本和阴性对照对应的检测结果之间存在显著差异，则表明待测样本含有目标抗体；优选地，待测样本为样本稀释液稀释后的血清样本，阴性对照为样本稀释液，靶标多肽为上述任一种筛选方法所筛选到的与目标抗体特异性结合的多肽集合中的任意多种多肽；优选地，目标抗体选自如下任意一种或多种：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体；优选地，样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，D-甘露醇在PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％；优选地，在对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测之前，该检测方法还包括：采用封闭液对多肽芯片进行封闭；优选地，封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；更优选地，封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且封闭液的pH为7.4。

进一步地，在对多肽芯片进行封闭的条件下，利用含靶标多肽的多肽芯片，对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测包括：将样本稀释液以及样本稀释液稀释后的血清样本与封闭后的多肽芯片进行孵育，得到第一孵育产物；将第一孵育产物与带荧光标记的二抗进行共孵育，得到第二孵育产物；对第二孵育产物进行荧光扫描，得到样本稀释液的荧光信号和血清样本的荧光信号；检测靶标多肽在样本稀释液中的荧光信号和血清样本的荧光信号之间是否存在显著差异，若存在，则表明血清样本中存在目标抗体；优选地，二抗根据血清样本的物种来源选择。

进一步地，通过多个已知目标抗体存在与否的临床样本队列，所检测到的靶标多肽在目标抗体阳性人群和目标抗体阴性人群中的荧光信号进行预测模型的构建，通过预测模型预测靶标多肽在样本稀释液的荧光信号和血清样本的荧光信号之间是否存在显著差异，即通过预测模型输出血清样本中是否为目标抗体阳性样本。

应用本发明的技术方案，通过使用高密度随机多肽芯片在抗原表位分析方面的优势(可兼容线性表位和非线性表位抗体的结合)在对多肽芯片未进行封闭的条件下，以不含抗体样本稀释液作为背景信号，对样本稀释液稀释的抗体中特异性结合的多肽进行检测，从而筛选得到每种抗体高于背景信号的肽段集，这些肽段与相应抗体的亲和力高，去除多种抗体的肽段集之间存在交集的肽段，从而获得每种抗体特异性的高亲和力肽段。这些肽段在应用于潜在的药物(靶点)、疫苗或抗体检测时，灵敏度和特异性均较高。进一步地，排除封闭干扰的非特异性结合的多肽以及血清中其他杂质蛋白引起的多肽，从而能够获得适用于临床血清样本中抗体有无检测的多肽及其组合。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例所提供的多肽芯片检测抗体的原理示意图；

图2示出了根据本发明的实施例所提供的基于多肽芯片检测单一抗体和混合抗体的热图；

图3示出了根据本发明的实施例所提供的基于多肽芯片检测临床血清样本中GAD抗体的结果与真实结果的统计图；

图4示出了根据本发明的实施例所提供的基于多肽芯片检测临床血清样本中GAD抗体的ROC曲线分析图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

抗体：是血液和组织液中的一类糖蛋白，由B细胞接受抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，是介导体液免疫的重要效应分子。接受抗原刺激活化的B细胞能够在1周内产生10¹¹拷贝的单一特异性抗体。

抗原表位(epitope)：又叫抗原决定簇(antigenic determinant)指被抗原受体TCR和BCR特异性识别的抗原部分。表位的结构有两类，一类是线性表位(序列上连续的表位)；另一类是构象表位(空间结构上邻近，但序列上不连续)。

多肽：本申请中的多肽或肽段的涵义相同，两者可以互换使用，均指氨基酸序列片段。

多肽芯片：是一种基于衬底材料的芯片，芯片上包括预先设计数量、位置和序列的特征，一个特征是一簇序列相同的多肽，特征与特征之间的多肽序列往往是不一样的，这些特征组成一个高密度多肽阵列。

多肽芯片技术：是基于多肽芯片的检测技术，其利用多肽芯片上的种类繁多的多肽与样本的接触，然后利用图像采集技术采集多肽芯片上各个特征信号(具体可表现为携带各个特征信号的荧光图像)，进而输出芯片中每个特征的信号强度，即多肽芯片检测结果数据。输出样本检测信号，基于多肽芯片检测结果数据输出的样本检测信号，可实现对与多肽芯片上的多肽结合的样本中的待测物的分析，样本的分析等。

ROC工作曲线：反映敏感性与特异性之间关系的曲线。横坐标X轴为1-特异性，也称为假阳性率，X轴越接近零准确率越高；纵坐标Y轴称为敏感度，也称为真阳性率，Y轴越大代表敏感度越好。根据曲线位置，把整个图划分为两部分，曲线下方部分的面积被称为AUC(Area Under Curve)，用来表示预测准确性，AUC值越高，表明预测准确率越高。曲线越接近左上角(X越小，Y越大)，预测准确率越高。

多肽芯片抗体检测技术是生物芯片行业较为前沿的技术，主要是基于多肽特异性捕获体液样本中抗体，从而实现高通量检测样本中的抗体。相比于传统的抗体检测方法，芯片检测技术可以一次实验检测多种抗体指标，样本用量少，分析检测速度快，检测方法更加安全环保，以及可实现先进的自动化和一体化。而相比于蛋白芯片抗体检测技术，多肽芯片的制作工艺更加稳定，所采集的数据也更加可靠准确，价格也更具优势。

比如，本申请中所使用的一种多肽芯片(HealtTell V13)，该多肽芯片上包含超过13万种已知序列的合成多肽，每条多肽含有5-13个氨基酸,多肽的氨基酸组合是一种无偏差的随机组合，遵照抗原-抗体竞争结合，以及氨基酸-氨基酸作用的免疫学原理来测量体液中游离抗体的整体水平。多肽芯片检测抗体的原理示意图如图1所示。

如背景技术所提到的，抗体所识别的构象表位难于基于序列信息尽数设计，多肽芯片(HealthTell的V13芯片)包含13万种已知序列的合成多肽，其氨基酸组合涵盖99.9％的4mer氨基酸组合(4mer是指4个氨基酸组成的多肽序列的集合，且相邻的多肽序列之间相差一个氨基酸，例如，MGAS、GAST、ASTC等，类似地，5mer是指5个氨基酸组成的多肽序列，相邻的多肽序列之间相差一个氨基酸)以及48.3％的5mer氨基酸组合，更适于线性及构象表位的抗体结合分析。

然而，随机多肽芯片上肽段数量大，且检测灵敏度高，当芯片与抗体孵育后加入荧光标记二抗，其信号可能包含以下几种情况：1)包括线性表位和/或构象表位的抗原表位；2)含线性表位和/或构象表位的核心识别氨基酸的序列；3)非特异性结合肽段；4)二抗自身本底信号等。对于非线性表位，目标抗原序列比对的方法不适用于在众多结合信号肽中判断是否抗体对应的抗原表位肽。此外，对于多克隆抗体，抗原表位不唯一，尽量尽数检出目标抗原表位，对于后续复杂样本中目标抗原对应抗体检出的敏感度至关重要。再者，从后续临床抗体检测应用角度看，通常使用血清/血浆等复杂样本，增加了样本中其它蛋白和抗体的干扰，信号复杂，传统的基于单一抗体直接检测的特异性肽段并不一定可以指示临床样本中抗体的有无，因此，只有特异性强，且在复杂样本中不受其它蛋白干扰的特异性肽段才能够用于后续的诊断试剂盒等的开发。为此，本申请基于随机多肽芯片的检测原理对现有方法进行了改进，以提供一种抗干扰能力强的抗体特异性结合肽段，以用于复杂样本中抗体的稳定检出。此外，在本申请的抗干扰能力强的抗体特异性结合肽段的筛选过程中，开发了一种标准化的筛选流程，对此类抗体特异性结合肽段的筛选鉴定提供了指导意义。

因此本申请的筛选方法重点在于逐级排除干扰信号，尤其是模拟血清样本中复杂信号对抗体检测的干扰情况，定义特异性抗干扰肽段集合，以用于复杂样本中抗体的稳定检出。

为了开发出适合应用于临床疾病辅助诊断中的一种或多种抗体的相关检测产品，本申请利用多肽芯片技术，在多肽芯片封闭或非封闭的条件下，通过使用不同浓度、不同溶液背景下的抗体样本进行多肽芯片检测，筛选出与目标抗体特异性结合灵敏度和特异性强的肽库。经临床上的抗体阴性或阳性已知的人群队列的血清样本验证，按照本申请的方法所筛选到的与抗体特异性结合的多肽(既包括了线性抗原表位，也包括了构象表位，其中线性表位可以通过与相应抗原的蛋白序列进行比对确定，而构象表位与抗原序列无关，但能够模拟抗原与抗体结合的状态)，与现有的抗体检测方法(比如主流的IVD抗体检测试剂盒，即ELISA方法)相比，不仅针对含有单一抗体的样本进行检测时，灵敏度更高，而且对含有多个抗体的样本进行检测时，特异性也更高(经最低检测限测试，本申请的多肽芯片的检测方法的最低检出限可达0.05ng/mL,而参比ELISA的最低检出限为1.56ng/ml)。这些肽库中的多肽可作为检测对应抗体的抗原表位肽，用于检测患者血清样本中相应抗体的有无。在此基础上，申请人提出了本申请的技术方案。

为了更清楚地表述本申请的方案，此处对本申请中所涉及的样本的类型进行说明：

阳性样本包括：含有单一抗体或混合抗体的样本稀释液(如含单一抗体或混合抗体的PBST样本)以及含单一抗体或混合抗体的血清样本，含单一抗体或混合抗体的血清样本进一步包括：单一抗体或混合抗体+阴性血清配制的模拟临床阳性血清样本，已知的人群队列中的含单一抗体或混合抗体的真实临床阳性血清样本。

阴性样本包括：不含单一抗体或混合抗体的样本稀释液(如不含单一抗体或混合抗体的PBST样本)以及不含单一抗体或混合抗体的血清样本，不含单一抗体或混合抗体的血清样本进一步优选为健康人血清样本。

在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：

封闭及非封闭的条件下，使用多肽芯片对第一抗体阳性样本和第一抗体阴性样本进行特异性结合多肽的第一次筛选，对应获得封闭条件下的第一种子肽库和非封闭条件下的第一种子肽库；

对在封闭条件下的第一种子肽库和在非封闭条件下的第一种子肽库中的多肽取交集，得到第二种子肽库；

在封闭的条件下，使用多肽芯片对第二抗体阳性样本和第二抗体阴性样本进行特异性结合多肽的第二次筛选，得到第三种子肽库；

取第三种子肽库与第二种子肽库的交集，得到第四种子肽库；

其中，第一抗体阳性样本为一个或多个含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为一个或多个含单一抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含单一抗体的血清样本；或者

第一抗体阳性样本为一组或多组含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为一组或多组含混合抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含混合抗体的血清样本。

该实施例中，通过选择在对多肽芯片进行非封闭和封闭条件下，在样本稀释液体系中时与待测目标抗体(一种或多种单一抗体，或者一组或多组混合抗体，此处混合抗体指在一个测试样本中同时含有两个或两个以上单一抗体)结合的多肽的交集，并进一步与在封闭条件下待测目标抗体在血清溶液体系中时与待测目标抗体特异性结合的多肽的集合取交集，从而获得了排除了在不同干扰条件下与待测目标抗体结合的多肽，获得了抗干扰能力较强的特异性结合的多肽集合，应用于临床血清样本(复杂样本)中抗体检测时检测结果更准确。

下面根据抗体的多少，分情况对上述方案进行说明：

当抗体为一个单一抗体时，在对多肽芯片未进行封闭或封闭的条件下，采用样本稀释液稀释的抗体和不含抗体样本稀释液作为背景信号的对照(即在非封闭和封闭的条件下，抗体处于样本稀释液体系中进行第一次筛选)，从而筛选得到单一抗体高于背景信号(即样本稀释液结合的肽段的信号)的肽段集和抗封闭液干扰的肽段集，两者的交集即为抗样本稀释液干扰和抗封闭液干扰的特异性结合肽段集，进一步于抗体在血清体系中筛选到的肽段集取交集，则获得同时还抗血清中其他蛋白干扰的特异性多肽集合。经过逐级多肽芯片筛选过程排除不同的背景干扰多肽，从而获得该单一抗体特异性较强的多肽集合。

当抗体为多个单一抗体时(此处的一个单一抗体指一种不同的抗体，多个单一抗体指分别为多种不同的单一抗体)，每个抗体经历上述相同的三种条件下的干扰多肽的去除，即可获得每种单一抗体对应的特异性较强的多肽集合。

当抗体为一组或多组多种单一抗体的混合抗体时，每组混合抗体经历上述三种条件下的非特异性结合多肽的排除，即可获得该组混合抗体对应的特异性结合的多肽集合。混合抗体可以是具有相同或相似生物学功能的抗体混合而成(比如，同属于自身免疫类疾病的抗体，或者同属于感染类疾病的抗体，或者同属于肿瘤疾病相关抗体)，也可以是不同生物学功能的抗体混合而成。以混合抗体分组的形式进行抗体特异性多肽的筛选，有助于提高筛选效率，一次性获得多种抗体的特异性结合多肽集合。

如上述，无论是一个或多个单一抗体，还是一组或多组混合抗体，通过上述不同干扰条件下非特异性结合多肽的排除，均能获得特异性相对较高的多肽集合。以多个单一抗体进行筛选为例，上述筛选步骤获得的每个单一抗体的特异性结合多肽，在用于对相应的单一抗体进行单独检测时，该筛选方法筛选到的特异性多肽不仅特异性较高，而且数量多(包括了潜在的线性表位和非线性表位)因而检测灵敏度也较常规的诊断试剂盒高。在此基础上，为了进一步提高所筛选的多肽集合的特异性，针对多个单一抗体或分组的混合抗体进行特异性多肽筛选时，该筛选方法还包括进一步去除交集的步骤。

在一种优选的实施例中，上述第一抗体阳性样本为多个含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为多个含单一抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含单一抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含单一抗体的血清样本，上述筛选方法还包括排除多个不同的单一抗体之间存在交集的多肽；优选地，在以下任意一个或多个时机排除多个不同的所述单一抗体之间存在交集的多肽：a.在所述非封闭条件下进行所述第一次筛选之后；b.在所述封闭条件下进行所述第一次筛选之后；c.在进行所述第二次筛选之后。

去除多个单一抗体之间存在交集的多肽，有助于进一步提高每种单一抗体结合的多肽的特异性，从而不仅适用于对该单一抗体进行单独检测的情形，而且也适用于与其他单一抗体同时进行检测的情形。与其他单一抗体同时进行检测时，由于去除了不同单一抗体之间存在交集的多肽，因而能够减少交叉反应的发生，使得检测结果更准确。

至于去除交集的时机，在上述三个时机中任意一个时机去除均可降低交叉反应的发生，在三个不同时机分别进行交集的去除，能够从最大程度地去除在不同条件下可能导致交叉反应的多肽，从而获得每种单一抗体特异性更高的多肽集合。在非封闭条件下进行第一次筛选之后进行交集去除，有助于获得每种抗体特异性的高亲和力肽段。这些肽段在应用于潜在的药物(靶点)、疫苗或抗体检测时，灵敏度和特异性均较高。

类似地，当第一抗体阳性样本为多组含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阳性样本为多组含混合抗体的血清样本，第一抗体阴性样本为不含混合抗体的样本稀释液，第二抗体阴性样本为不含混合抗体的血清样本，且任意两组含混合抗体的样本稀释液和/或任意两组含混合抗体的血清样本之间所含的抗体种类不重叠，则筛选方法还包括排除多组不同的混合抗体之间存在交集的多肽；优选地，在以下任意一个或多个时机排除多组不同的混合抗体之间存在交集的多肽：a.在非封闭条件下进行第一次筛选之后；b.在封闭条件下进行第一次筛选之后；c.在进行第二次筛选之后。

当混合抗体以组的形式进行筛选时，有两种情形，一种是任意两组混合抗体中存在相同的单一抗体时，则不同组筛选的特异性结合多肽集合，能够在一定程度上起到相互印证的作用。比如，含A、B、C的混合抗体与含A和B的混合抗体，其所筛选到的多肽集合在一定程度上能够相互印证，但并不意味着，含A、B、C的混合抗体筛选的多肽集合减去含A和B的混合抗体筛选到的多肽集合即为抗体C对应的多肽集合，两组混合抗体之间并不能通过简单减法运算来获得其中一个抗体特异性结合的多肽集合。

另一种是任意两组混合抗体之间不存在相同的单一抗体时，则可以通过上述优选实施例，去除不同组之间存在交集的肽段，从而获得每一组抗体对应的高特异性结合的多肽集合。去除交集多肽的时机，同样为上述三个时机。

在一种优选的实施例中，在非封闭条件下和/或非封闭条件下，均采用两个或两个以上不同抗体浓度的第一抗体阳性样本进行第一次筛选(以排除不同浓度下，多肽结合的灵敏度存在差异的可能性，从而筛选出在不同浓度下均能检出的多肽)；优选地，在非封闭条件下采用两个以上不同抗体浓度的第一抗体阳性样本进行第一次筛选，并确定两个不同抗体浓度的第一抗体阳性样本进行封闭条件下的第一次筛选；优选地，第一抗体阳性样本中所含的单一抗体的浓度或混合抗体中每个单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL。

通过先在样本稀释液条件下筛选能够与不同浓度的抗体稳定结合的多肽，并选择高低两种不同的抗体浓度(同样是对多肽的检测灵敏度和稳定性是有要求的)，在之后的封闭条件下进行筛选，以在一定程度上减少工作量、降低检测成本，提高检测效率。

类似地，在血清环境中时，同样可以采用先采用多种浓度确定合适的高低浓度，进一步进行后续筛选。在一种优选的实施例中，采用两个或两个以上不同抗体浓度的第二抗体阳性样本进行第二次筛选，更优选地，第二抗体阳性样本中所含的单一抗体的浓度或混合抗体中每个单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，进一步优选为50ng/mL-500ng/mL。在该跨越数量级的浓度差异范围内，能够检测到更稳定结合的多肽。

上述样本稀释液可以是任何能够维持抗体活性的缓冲液体系。在一种优选的实施例中，样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，D-甘露醇在PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％，该样本稀释液能够在样本孵育条件下提供稳定的溶液环境，在不影响多肽-抗体正常结合的情况下，避免对实验结果造成干扰，为后续荧光成像提供真实稳定有效的数据。优选地，样本稀释的配方如下：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v，pH为7.4；更优选地，样本稀释液的配方为：137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、0.05％吐温20(v/v)、0.1％Proclin 950(v/v)及1％D-甘露醇(w/v)，pH为7.4。

优选地，在封闭条件下是指采用封闭液对多肽芯片进行封闭，使用封闭后的多肽芯片进行筛选，更优选地，封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；进一步优选地，封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且封闭液的pH为7.4。

一般封闭试剂中的有效成分有BSA、动物血清、Fab片段单链二抗等。其中，BSA组分相对单一并可能存在牛IgG，因此与能够与抗牛、山羊、绵羊、马等二抗有较强的交叉反应，会造成一定的背景。某些动物封闭血清内可能会含有叠氮化钠，因此不适用于HRP酶标的检测体系。而Fab片段单链二抗制备复杂，价格高，不宜大量使用。即现有的封闭液存在容易导致非特异性结合等背景信号，且成本高，封闭效果不稳定等潜在问题。

本申请所提供的上述封闭液能够在二抗孵育条件下提供稳定的溶液环境，能在不影响多肽-抗体正常结合的情况下，减少二抗的非特异性吸附，尤其是二抗与多肽芯片上的多肽阵列之外的固相成份的非特异性吸附，进而避免对实验结果造成干扰，有利于后续荧光成像提供真实有效稳定的数据。此外，上述封闭液成本低，性能稳定，在进行免疫学检测，特别是利用多肽阵列芯片进行检测或其他科学研究中，具有提高特异性和灵敏度的效果。

本申请的筛选方法中所使用的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，多种单一抗体均为多克隆抗体(有助于筛选到更多特异性结合的多肽)；优选地，多种单一抗体或多组混合抗体具有相同或不同的物种来源；优选地，物种来源为兔、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠或人；优选地，多种单一抗体或多组混合抗体选自如下抗体中的多个：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。

在一种优选的实施例中，在使用多肽芯片进行第一次筛选和第二次筛选均包括依次进行的抗体样本孵育和二抗孵育，其中二抗带有荧光标记；优选地，二抗的物种来源根据第一次筛选和第二次筛选步骤中各单一抗体或混合抗体中的单一抗体的物种来源进行选择，以避免物种间的交叉反应导致的非特异性信号，从而进一步提高所筛选的多肽的特异性。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：在非封闭条件下，使用多肽芯片对多种单一抗体或多组混合抗体的第一阳性样本及相应的第一阴性样本进行特异性结合多肽的第一次筛选，得到每种单一抗体或每组混合抗体各自对应的第一抗干扰肽库；其中，第一阳性样本为含一种单一抗体的样本稀释液或含多种单一抗体的混合抗体的样本稀释液，第一阴性样本为不含单一抗体或混合抗体的样本稀释液；去除多种单一抗体或多组混合抗体各自对应的第一抗干扰肽库中存在交集的多肽，得到每种单一抗体或每组混合抗体对应的第二抗干扰肽库。

该实施例中，通过在对多肽芯片未进行封闭的条件下，采用样本稀释液稀释的抗体和不含抗体样本稀释液作为背景信号的对照(即在非封闭的条件下，抗体处于样本稀释液体系中进行第一次筛选)，从而筛选得到每种单一抗体或每组混合抗体高于背景信号(即样本稀释液结合的肽段的信号)的肽段集，这些肽段与相应抗体的亲和力高，去除多种抗体的肽段集之间存在交集的肽段，从而获得每种单一抗体或每组混合抗体特异性的高亲和力肽段(即第二抗干扰肽库)。这些肽段在应用于潜在的药物(靶点)、疫苗或抗体检测时，灵敏度和特异性均较高。

采用多组混合抗体同时进行筛选时，有助于筛选大量抗体的特异性结合多肽，提高筛选效率。与采用单一抗体进行筛选不同的是，每组混合抗体样本所筛选到的多肽为该组混合抗体中多种抗体结合的多肽的总和，因而适用于检测待测样本中是否存在多种抗体的场景，比如筛查某待测样本是否存在某种(不确定的)疾病的标志性抗体时，排查阶段可以采用此类混合抗体进行筛查，若某一组混合抗体中检测出阳性抗体存在时，可以进一步采用该组混合抗体中对应的每一种单一抗体特异性结合多肽进行检测，从而确认阳性抗体。

为进一步提高所筛选的多肽与目标抗体结合的特异性，提高抗干扰能力，在一种优选的实施例中，该筛选方法进一步包括：在封闭条件下，使用多肽芯片对多种单一抗体或多组混合抗体的第一阳性样本及相应的第一阴性样本进行特异性结合多肽的第二次筛选，得到每种抗体对应的第三抗干扰肽库；取第二抗干扰肽库和第三抗干扰肽库中的多肽的交集，得到每种抗体对应的第四抗干扰肽库。

该优选实施例中，通过在对多肽芯片进行封闭的情况下，使抗体处于样本稀释液中进行第二次筛选，进一步排除了多肽芯片在非封闭条件下与每种单一抗体之间或者每组混合抗体之间存在的非特异性结合的肽段(即排除了与封闭液非特异性结合的肽段)，得到显著高于该背景信号(此处的背景信号指去除了与封闭液非特异结合的肽段后的样本稀释液所结合的肽段的信号)的肽段集，进一步与前述非封闭样本稀释液条件下筛选得到的第二抗干扰肽库取交集，从而获得在两组不同条件下均特异性与对应抗体特异性结合的高亲和力肽段集(即第四抗干扰肽库)。这些肽段对封闭条件的抗干扰能力更强，在用于目标抗体检测时，一定程度上进一步提高了检测的特异性。

在上述基础上，为进一步排除临床检测过程中的其他可能的干扰，在一种优选的实施例中，该筛选方法进一步包括：在封闭条件下，使用多肽芯片对多种单一抗体或多组混合抗体的第二阳性样本及相应的第二阴性样本进行特异性结合多肽的第三次筛选，得到每种抗体对应的第五抗干扰肽库；其中，第二阳性样本为含单一抗体的血清样本，第二阴性样本为不含单一抗体的血清样本；取第五抗干扰肽库与第四抗干扰肽库的交集，得到每种单一抗体或每组混合抗体对应的第六抗干扰肽库。

该优选实施例中，通过将抗体置于血清环境中进行第三次多肽芯片检测，进一步排除了与血清环境中的其他成分结合的多肽，使得第六抗干扰肽库中的肽段对相应抗体的结合特异性进一步提高，从而适用于血清/血浆等复杂样本中的特定抗体的检测。

在一种优选的实施例中，在得到每种抗体对应的第三抗干扰肽库和/或第五抗干扰肽库后，筛选方法还包括：去除多种单一抗体或多组混合抗体在各第三抗干扰肽库和/或第五抗干扰肽库中存在交集的多肽。

在上述封闭条件下，使抗体处于样本稀释液中进行多肽芯片检测的步骤中，以及在封闭条件下，使抗体处于模拟血清中进行多肽芯片检测的步骤中，多种单一抗体或多组混合抗体筛选得到各自对应的第三抗干扰肽库和/或第五抗干扰肽库后，可以进一步去除多种单一抗体或多组混合抗体中存在交集的肽段，保留下来的第三抗干扰肽库和/或第五抗干扰肽库中的肽段的特异性更强。在一种最优的实施例中，上述两步中均包括去除相应交集肽段的步骤。

需要说明的是，本申请中上述各优选实施例中筛选到的随机多肽阵列中与抗体特异性结合的多肽，其模拟了抗原表位的特征，既包括线性表位也包括构象表位(即非线性表位)，在构象表位的情况下，其与抗原的线性序列不一定相关，但其与抗体的结合可能与原始抗原一样强、甚至更强。

上述两种不同实施方式的筛选方法中，无论是一个还是多个单一抗体，或者是多种单一抗体形成的混合抗体，在进行检测时，优选每种单一抗体采用两个或两个以上不同抗体浓度的第一阳性样本进行第一次筛选(以排除不同浓度下，多肽结合的灵敏度存在差异的可能性，从而筛选出在不同浓度下均能检出的多肽)；优选地，第一阳性样本中所含的(任一种)单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL。在该跨越数量级的浓度差异范围内，能够检测到更稳定结合的多肽。

上述样本稀释液可以是任何能够维持抗体活性的缓冲液体系。在一种优选的实施例中，样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，D-甘露醇在PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％，该样本稀释液能够在样本孵育条件下提供稳定的溶液环境，在不影响多肽-抗体正常结合的情况下，避免对实验结果造成干扰，为后续荧光成像提供真实稳定有效的数据。优选地，样本稀释的配方如下：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v，pH为7.4；更优选地，样本稀释液的配方为：137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、0.05％吐温20(v/v)、0.1％Proclin 950(v/v)及1％D-甘露醇(w/v)，pH为7.4。

前述在多种浓度下进行多肽芯片检测有助于筛选出在不同浓度下均能稳定结合抗体的多肽，为了进一步提高检测的效率，在一种优选的实施例中，在非封闭条件下，采用两个以上不同抗体浓度的第一阳性样本进行第一次筛选，进而确定两个不同抗体浓度的第一阳性样本，然后在封闭条件下进行第二次筛选。

该优选实施例，通过先在样本稀释液条件下筛选能够与不同浓度的抗体稳定结合的多肽，并选择高低两种不同的抗体浓度(同样是对多肽的检测灵敏度和稳定性是有要求的)，在之后的封闭条件下进行筛选，以在一定程度上减少工作量、降低检测成本，提高检测效率。

类似地，在血清环境中时，同样可以采用先采用多种浓度确定合适的高低浓度，进一步进行后续筛选。在一种优选的实施例中，每种单一抗体采用两个或两个以上不同抗体浓度的第二阳性样本进行第三次筛选；优选地，第二阳性样本中所含的单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL。该跨越数量级的浓度差异范围内，能够检测到更稳定结合的多肽。

在一种优选的实施例中，封闭条件下是指采用封闭液对多肽芯片进行封闭，使用封闭后的多肽芯片分别进行第二次筛选和第三次筛选。在进行多肽芯片上样之前，先采用封闭液对多肽芯片进行封闭处理，有助于降低非特异性结合肽段的信号强度。上述封闭液也可以是常用的封闭液。为更有效地降低高密度多肽阵列的背景信号，在本申请优选的实施例中，所采用的封闭液的成分与一般所用的封闭试剂的成分不同。

一般封闭试剂中的有效成分有BSA、动物血清、Fab片段单链二抗等。其中，BSA组分相对单一并可能存在牛IgG，因此与能够与抗牛、山羊、绵羊、马等二抗有较强的交叉反应，会造成一定的背景。某些动物封闭血清内可能会含有叠氮化钠，因此不适用于HRP酶标的检测体系。而Fab片段单链二抗制备复杂，价格高，不宜大量使用。即现有的封闭液存在容易导致非特异性结合等背景信号，且成本高，封闭效果不稳定等潜在问题。

在本申请一种优选的实施例中，封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠，2.5～2.7mM氯化钾，3.8～4.3mM磷酸氢二钠，1.2～1.4mM磷酸二氢钾，0.05％～1％Tween-20v/v，0.05％～0.1％Proclin950 v/v，0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v；pH为7.2～7.6，优选7.38～7.42。在本申请一种更优选的实施例中，封闭液为137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，4.3mM磷酸氢二钠，1.4mM磷酸二氢钾，1％Tween-20v/v，0.1％Proclin950 v/v，1％D-甘露醇w/v，0.1％酪蛋白w/v，用1N的盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。

本申请所提供的上述封闭液能够在二抗孵育条件下提供稳定的溶液环境，能在不影响多肽-抗体正常结合的情况下，减少二抗的非特异性吸附，尤其是二抗与多肽芯片上的多肽阵列之外的固相成份的非特异性吸附，进而避免对实验结果造成干扰，有利于后续荧光成像提供真实有效稳定的数据。此外，上述封闭液成本低，性能稳定，在进行免疫学检测，特别是利用多肽阵列芯片进行检测或其他科学研究中，具有提高特异性和灵敏度的效果。

本申请的筛选方法中所使用的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，多种单一抗体均为多克隆抗体(有助于筛选到更多特异性结合的多肽)；优选地，多种单一抗体或多组混合抗体具有相同或不同的物种来源；优选地，物种来源为兔、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠或人；优选地，多种单一抗体或多组混合抗体选自如下抗体中的多个：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。

在一种优选的实施例中，第一次筛选、第二次筛选和第三次筛选的步骤均包括依次进行的抗体样本孵育和二抗孵育，其中二抗带有荧光标记；优选地，二抗的物种来源分别根据第一次筛选、第二次筛选和第三次筛选步骤中相应的抗体的物种来源进行选择。第一次筛选和第二次筛选的抗体样本均为含抗体的样本稀释液；第三次筛选的抗体样本为含抗体的血清。二抗的物种来源根据相应样本抗体的物种来源选择，能够避免物种间的交叉反应导致的非特异性信号，从而进一步提高所筛选的多肽的特异性。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种待测样本中目标抗体的检测方法，该检测方法包括：利用目标抗体特异性结合的靶标多肽，对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测，得到各自对应的检测结果；若待测样本和阴性对照对应的检测结果存在显著差异，则表明待测样本含有目标抗体；靶标多肽为前述任意一种筛选方法所筛选到的与目标抗体特异性结合的多肽。

本申请所筛选到的多肽为一种或多种抗体特异性结合的多肽的集合，这些多肽可以被挑选出来制备成常规的IVD抗体检测试剂盒(比如ELISA试剂盒)，通过与阴性对照比较即可确定待测样本中抗体的有无。由于本申请的筛选方法所筛选的多肽存在灵敏度高、特异性强的优势，因而不仅针对含有单一抗体的样本进行检测时，灵敏度更高，而且对含有多个抗体的样本进行检测时，特异性也更高。

本申请筛选的多肽除了可以制备成常规的IVD抗体检测试剂盒进行抗体检测外，还可以制备成多肽芯片进行抗体检测，或者采用含有待检抗体特异性结合的靶标多肽的现有的多肽芯片阵列进行检测(只需对比所关注的靶标多肽在待测样本与对照样本之间的差异即可)。根据待测样本中是否含有目标抗体，利用本申请筛选的(一种或多种抗体的)多肽集合进行检测时，不仅可以检测目标抗体的有或无，而且还可以在有的情况下，检测出有一种还是多种。

在一种优选的实施例中，在对多肽芯片进行封闭的条件下，利用含靶标多肽的多肽芯片，对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测，得到各自对应的靶标多肽的检测结果；若靶标多肽在待测样本和阴性对照对应的检测结果之间存在显著差异，则表明待测样本含有目标抗体；优选地，待测样本为样本稀释液稀释后的血清样本，阴性对照为样本稀释液，靶标多肽为前述筛选方法所筛选到的与目标抗体特异性结合的多肽集合中的任意多种多肽或肽库(每个肽库中涵盖了特异性结合的多个抗体)。

在一种优选的实施例中，目标抗体选自如下任意一种或多种：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。采用多肽芯片能够同时检测一种或多种目标抗体的有无。

在一种优选的实施例中，样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，D-甘露醇在PBST中的质量体积含量为0.5％～1％。

采用多肽芯片进行检测时，多肽芯片的处理条件与多肽筛选时的条件一样。在一种优选的实施例中，二抗根据血清样本的物种来源进行选择(以提高检测的特异性)；优选地，在对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测之前，检测方法还包括：采用封闭液对多肽芯片进行封闭(降低封闭液导致的非特异性结合，以提高检测的特异性)；优选地，封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；更优选地，封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且封闭液的pH为7.4。如前述，本申请的封闭液能减少二抗的非特异性吸附，且封闭效果好、成本低、性能稳定，具有提高检测特异性和灵敏度的效果。

在一种优选的实施例中，在对多肽芯片进行封闭的条件下，利用含靶标多肽的多肽芯片，对待测样本及待测样本的阴性对照进行检测包括：将样本稀释液以及样本稀释液稀释后的血清样本与封闭后的多肽芯片进行孵育，得到第一孵育产物；将第一孵育产物与带荧光标记的二抗进行共孵育，得到第二孵育产物；对第二孵育产物进行荧光扫描，得到样本稀释液的荧光信号和血清样本的荧光信号；检测靶标多肽在样本稀释液的荧光信号和血清样本的荧光信号之间是否存在显著差异(仅利用靶标多肽进行差异性判断，有助于减少信号处理量、提高信号处理速度和效率，提高检测效率)，若存在，则表明(待测的)血清样本中存在目标抗体(只要有目标抗体，无论是一种还是多种，均能检测出来)。

需要说明的是，在本申请优选的实施例中，采用筛选到的多种多肽，或者多肽集合来检测待测样本中一种或多种目标抗体的有无时，更适合利用人工智能的手段来处理此类“大数据”，比如通过建立预测模型(比如采用岭回归的方法进行建模)的方式来对待测样本进行预测。具体地，可以利用临床上抗体阳性与否已知的血清/血浆样本中上述靶标多肽在阳性血清样本队列中的荧光信号，与在阴性血清样本队列中的荧光信号的差异建立预测模型，进而通过将待测样本在相应靶标多肽检测到的荧光信号输入该预测模型时，可直接输出该待测样本为抗体阳性或阴性的检测结果。

在一种优选的实施例中，上述检测方法包括：建立抗体预测模型；将待测样本及阴性对照对应的荧光信号输入抗体预测模型；输出待测样本的检测结果；其中，建立抗体预测模型包括：根据临床上已知目标抗体为阳性的多个阳性血清样本以及已知为阴性的多个阴性血清样本，获取封闭条件下多肽芯片检测到的靶标多肽在阳性血清样本和阴性血清样本中的信号强度，并根据信号强度与目标抗体阳性或阴性的关系，建立抗体预测模型。

本申请优选的实施例中，上述临床上已知的阴性血清样本为健康人群的血清样本。便于将健康人群与非健康人群进行区分，以便后续进一步对非健康人群中携带某一种或多种疾病，或者处于疾病不同阶段或不同病程的不同临床样本进行区分。

下面使用商业化抗体，在一些更具体的实施例中进一步详细解释本申请的多肽的筛选方法(逐级增加干扰条件进行多肽芯片技术检测)，主要包括如下步骤：

1)非封闭条件下抗体以样本稀释液稀释(优选多个浓度，或高、低两个浓度，例如10ng/mL-1μg/mL)上机检测；

2)封闭条件下以样本稀释液稀释(优选多个浓度，或高、低两个浓度，例如10ng/mL-1μg/mL)上机检测；

3)封闭条件下抗体混入阴性血清背景后稀释(优选多个浓度，或高、低两个浓度，例如10ng/mL-1μg/mL)上机检测；

然后通过逐级排除封闭液以及血清背景干扰信号，分析抗体样本特异性结合的肽段。

例如：逐级增加干扰条件试验设计

表1：

需要说明的是：所述封闭条件是指样本(即本申请中的特定的商业化抗体)在加样至多肽芯片上前，用封闭液与多肽芯片孵育；孵育后再将样本加至多肽芯片上孵育并进行检测。

上机抗体终浓度：抗体进行多肽芯片检测时反应体系中抗体的浓度；

检测背景指：指抗体进行多肽芯片检测时所处的溶液体系。

检测流程如下：

1.样本制备：将抗体样本分别溶解于样本稀释液和阴性血清中得到高、低两个浓度的抗体样本，分别记为【低抗体+样本稀释液】、【高抗体+样本稀释液】、【低抗体+血清】、【高抗体+血清】。另准备【无抗体+样本稀释液】和【无抗体+血清】样本作为阴性对照。

2.样本稀释：用样本稀释液稀释上述样本1000倍，震荡混匀。

3.样本孵育：在非封闭条件下，加入1000倍稀释的【低抗体+样本稀释液】、【高抗体+样本稀释液】样本以及【无抗体+样本稀释液】阴性对照样本和blank(清洗液)，恒温孵育，洗板；在使用封闭液条件下，依次加入【低抗体+样本稀释液】、【高抗体+样本稀释液】、【低抗体+血清】、【高抗体+血清】样本以及【无抗体+样本稀释液】和【无抗体+血清】阴性对照样本，blank(清洗液)恒温孵育，洗板。

4.二抗孵育：分别按照抗体的物种来源加入二抗(如抗体是鼠源的，则二抗选择抗鼠二抗；若抗体是兔源的，二抗选择抗兔二抗；若抗体是人源的，二抗选择抗人二抗)，恒温孵育，洗板。阴性对照二抗按照同一张检测芯片检测抗体的来源物种选择，如果同张检测芯片上抗体来源物种不只一种，对应增加对照。

5.荧光成像：将芯片转移至成像装置，扫描荧光信号并产生高分辨率图像。

6.图像处理：将荧光成像得到的图片转化为荧光强度数值，得到相应的数值矩阵。

7.初步数据处理和质控：对样本数值进行对数转换和标准化处理，输出标准化矩阵。并进行单样本质控以及系统稳定性质控。

数据分析流程：

1.使用逐级增加干扰条件的抗体多肽芯片检测实验，挖掘抗体特异性的且不受封闭液和血清其它蛋白干扰的肽段集合，其分级肽段分析思路如下：

1)针对单一检测抗体，先筛选出多肽芯片平台能够稳定捕获的高亲和力的多肽(记为Lv1)；

2)针对多个检测抗体，排除相互之间有交叉的多肽，从而获得检测单一抗体的特异性多肽(记为Lv2)；

3)在封闭条件下所检测的特异性多肽，其相比非封闭条件下检测的多肽数量会降低，排除了封闭液对所筛选的多肽的干扰，获得抗封闭液干扰的特异性结合多肽(记为Lv3)；

4)在封闭及血清环境下检测，获得抗双重干扰(封闭液和血清环境)的特异性结合多肽(记为Lv4)；

5)筛选出的多肽在进行应用时，多种抗体特异性结合的多肽以组合形式(记为Lv5)，一次性检测出血清中是否目标抗体，以及目标抗体为一种或多种。

2.具体步骤如下：

(1)通过对同一抗体不同浓度非封闭条件下检测，获得多肽信号在样本中的信号强度，筛选显著高于【无抗体+样本稀释液】阴性对照样本信号强度阈值的肽段为初步种子肽库，排除因生产和实验环节引入的假阳性信号，获得各个抗体平台稳定捕获的高信号肽段集合-Lv1肽段集；将已检测各个抗体的Lv1肽段集进行相互比较，排除非同一免疫原或同源免疫原抗体共有肽段，其中包含因抗体制备纯化方式等因素导致的系统性干扰信号，输出每个抗体特异性肽段集合-Lv2肽段集，可以指示在非封闭条件下特定抗体的存在与否。

(2)分析同一抗体高、低两个浓度封闭条件下检测的肽段信号，筛选显著高于【无抗体+样本稀释液】阴性对照样本信号强度阈值的肽段集合，排除生产实验环节引入的假阳性信号，获得各个抗体在封闭条件下平台稳定捕获的高信号肽段集合。进而将各个抗体相互比较，排除非同一免疫原或同源免疫原抗体共有肽段，初步获得封闭条件下各个抗体特异性肽段集合。排除因封闭液组分与抗体互作导致的假阳性信号，取封闭及非封闭条件抗体特异性肽段的交集-Lv3，可以指示封闭条件下特定抗体存在与否。

(3)分析同一抗体混入到血清背景中高、低两个浓度封闭条件下检测的肽段信号，筛选显著高于【无抗体+血清】阴性对照样本信号强度阈值的肽段集合，排除以及所指示的生产实验环节引入的假阳性信号，获得各个抗体在封闭条件下且有血清背景存在的情况下平台稳定捕获的高信号肽段集合。进而将各个抗体相互比较，排除非同一免疫原或同源免疫原抗体共有肽段，初步获得封闭条件下、血清背景中各个抗体特异性肽段集合。为排除因封闭液组分及血清背景组分与抗体互作导致的假阳性信号，取上述特异性肽段集与Lv3肽段集的交集-Lv4,可以指示封闭条件下、血清背景中特定抗体存在与否。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。需要说明的是，以下实施例中所使用的样本稀释液的成分如下：含1％D-甘露醇l的PBST，PBST是含0.05％-1％的吐温20的PBS，其中1×PBS(pH 7.9,Teknova)具体配方如下：137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v。

封闭液：137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，封闭液的pH为7.4。

实施例1：抗体高可信特异性结合肽段用于混合抗体中抗体组分识别

共纳入八个抗体通过逐级过滤干扰信息的方法分析抗体的高可信特异性结合肽段，选择其中四个抗体分别进行两个抗体、三个抗体、四个抗体混合检测分析，如上逐级增加干扰条件多肽芯片技术检测，即非封闭条件直接检测、封闭条件检测以及抗体混入阴性血清样本检测。抗体单独上机检测终浓度设置为50ng/ml和500ng/ml,混合抗体上机终浓度均设定为50ng/ml。

A抗体单独检测

一、样本准备

1.抗体样本信息确认：包括预处理操作要求、浓度来源物种等，详细信息见下表。

2.本申请中涉及的检测抗体的信息见下表：

表2：

注：

PCNA抗体：增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA)由Miyachi等于1978年在SLE(系统性红斑狼疮)患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。PCNA抗体在临床上一直被用于系统性红斑狼疮的特异性检出，但其阳性率很低，IIF法阳性率仅为2％～5％。近年来研究表明其可以在多种自身免疫性疾病中检出，SLE仍为主要检出病种，抗PCNA阳性的系统性红斑狼疮患者更易出现皮疹、雷诺现象、神经精神狼疮和肾脏受累，与疾病活动相关。

CENPB抗体：着丝点蛋白质由3种成分组成：着丝点蛋白A(CENPA)，着丝点蛋白B(CENPB)和着丝点蛋白C(CENPC)；其中CENPB相对分子质量80，000，是抗着丝点抗体的主要靶抗原。抗着丝点蛋白抗体长期以来被认为对系统性硬化症(SSc)有较高的特异性，特别是其中的CREST亚型，主要临床表现包括钙质沉着、雷诺显现、食管运动功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张。抗着丝点抗体在CREST综合征患者中阳性率为40％～90％。

gp210抗体：抗gp210抗体是表现为核膜型荧光染色型的抗核包膜蛋白抗体的一种，其靶抗原为位于核孔复合物上的210kD跨膜糖蛋白。该抗体存在于一部分原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者血清中。抗线粒体抗体(AMA)是诊断PBC的特异性抗体，敏感性达90％，但仍有10％的PBC患者AMA抗体阴性，即AMA对PBC的诊断有一定的局限性。抗gp210抗体存在于20％～47％AMA阴性的PBC患者中，对于临床、生化和组织学表现疑似PBC而AMA阴性的患者，或AMA阳性而临床症状不典型、存在重叠综合征(如与干燥综合征重叠)的患者，抗gp210抗体检测有重要价值。另外gp210阳性患者肝硬化发生率明显高于阴性患者，因此该抗体阳性提示患者预后不良，亦可作为PBC患者的预后指标。

LC-1抗体：1988年Martini等应用免疫荧光(IIF)法和ID法在6例成人AIH患者血清中首先证实抗LC-1抗体的存在，其靶抗原存在于肝细胞的细胞溶质中，免疫印迹(IB)法检测表现为58kD～62kD的肝细胞胞液多肽蛋白。抗肝细胞胞质1型抗体(抗LC-1抗体)或称抗肝细胞胞质抗原1型抗体，是II型自身免疫性肝炎(AIH-Ⅱ型)的特异和敏感的标志抗体，在AIH-II中阳性率为56％～72％，与自身免疫性肝炎的诊断密切相关。

HIB抗体：HIB侵袭性b型流感嗜血杆菌,是儿童鼻咽部常见的共生细菌，是主要通过脑膜炎和肺炎每年估计造成约300万人严重患病并估计造成38.6万人死亡的一种细菌。

SARS-Cov-E：SARS病毒导致“非典型性肺炎”，其E蛋白为包膜蛋白，对该抗体检测可以辅助诊断检测样本是否被SARS病毒感染过。

GAD抗体：抗谷氨酸脱羧酶抗体适用于成年人迟发性自身免疫性糖尿病诊断。谷氨酸脱羧酶(GAD)是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的限速酶，在胰岛β细胞中存在GAD，并也合成、分泌GABA。谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)是1型糖尿病发病初期的免疫标志，也作为1型糖尿病患者接受治疗时的疗效监测指标；1型糖尿病合并Graves病的患者GADA阳性率明显高于不伴有Graves病的1型糖尿病患者，Graves病患者GAD水平可明显升高，非糖尿病患者GADA的出现并不总是预测1型糖尿病的发生。

Pf：抗恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)铁氧还蛋白-NADP+还原酶(pfFNR)抗体。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)寄生于人体的四种疟原虫之一，造成恶性疟疾的病原体。恶性疟原虫以人和雌性按蚊作为宿主。在人体进行裂体增殖及配子生殖的开始。在蚊体完成配子生殖和孢子增殖。共在人体内发育场所是肝细胞和红细胞内。

3.样本预处理：将部分为粉末的抗体进行溶解，然后与部分无浓度信息的抗体一起，检测浓度。所有待检抗体使用样本稀释液统一稀释至100μg/ml。

4.质控品总IgG(为同一份血清样本以过硫酸铵沉淀方法提取得到的总IgG样品，其他实施例中，如无特殊说明，质控品总IgG与此相同)准备。

二、非封闭条件下纯抗体检测

各抗体用样本稀释液稀释至50ng/ml和500ng/ml分别进行多肽芯片检测；

抗体检测二抗按照来源物种信息对应选择(比如，若抗体是兔源的，则二抗是抗兔源的二抗)；

同一张芯片尽量安排同样物种来源的抗体，每张检测芯片加样本稀释液作抗体浓度为0的对照(即不加抗体的阴性对照)；

对照的二抗按照同一张检测芯片检测抗体的来源物种选择，如果同张检测芯片上抗体物种来源不只一种，对应增加对照(即同一张检测芯片上检测抗体的来源有兔源和鼠源，则在该芯片上设置兔源和鼠源的对照的二抗)。

检测操作

1.样本稀释

a)质控品总IgG的稀释

使用5ml的离心管对IgG进行稀释，取16μL的IgG加入1584μL的样本稀释液中，形成100倍的稀释IgG，震荡混匀。

b)抗体稀释

使用样本稀释液将抗体分别稀释至500ng/ml和50ng/ml。

1)取2μL浓度为100μg/ml的抗体加入398μL的样本稀释液中，形成浓度为500ng/ml的稀释抗体(梯度1)，震荡混匀；

2)取20μL梯度1加入180μL的样本稀释液中，形成浓度为50ng/ml的稀释抗体(梯度2)，震荡混匀。

2.排版加样

根据样本上机排布设计，将500ng/ml的稀释抗体、50ng/ml的稀释抗体、100倍稀释的IgG和样本稀释液各分装120μL至PCR板的对应孔位中，然后使用排枪移取90μL至assayCassette对应的孔位中，封膜。

3.第一次孵育

1)提前打开恒温混匀器，将温度稳定到37℃。

2)将assay cassette置于恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

4.第一次洗板

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶中有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

5.加二抗

配制二抗稀释液：在避光条件下(关灯)，使用15ml离心管，将兔二抗(即兔源抗体的抗体)稀释1500倍(9μL二抗加到13500μL的二抗稀释液)。然后根据排版表的孔位信息，使用排枪分别取40μL/well加入到对应Cassette的对应孔中，封膜。

需要说明的是，在其他实施例中，根据抗体的物种来源，比如是鼠源或人源的，则选择相应的二抗及其相应的稀释条件。比如，可以将人二抗(即人源抗体的抗体)稀释1500倍(4μL二抗加到6ml的二抗稀释液)，将小鼠二抗(即鼠源抗体的抗体)稀释3000倍(2μL二抗加到6ml的二抗稀释液)。

6.第二次孵育

将Cassette封膜，放置恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

7.第二次洗板

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

8.芯片拆卸

1)在生物安全柜中准备好操作区域，包括芯片离心机、低棉吸水垫、90％异丙醇喷壶、装有MilliQ的水盆，盆中含有芯片槽和手柄、装有MilliQ的水化盒、干净的芯片储存盒。小心的拿出assay cassette中的每块芯片，每次拿1块，将其放置在芯片槽上。

2)芯片干燥，装盒。

9.将芯片组装于imaging cassette中。

10.荧光成像

Imaging System使用机械臂将imaging cassette转移至条形码扫描的位置。待imaging cassette和芯片条形码扫描完成后，将imaging cassette转移至Image Xpress成像。系统通过Venus软件控制指导实验者进行成像操作，需要操作者设定曝光时间和imaging cassette数目。当成像开始时，操作者可以继续添加需要成像的imagingcassette。

成像过程通过Molecular Devices Image Xpress 4成像仪对每个array产生高分辨率的TIFF图像。Gridding Software从TIFF图像文件中提取特征强度数据。

当imaging cassette组装完成后，将cassette转移至cassette hotel。接下来将启动自动成像过程。

具体数据预处理流程如下：

1)提取特征的荧光强度数值，输出1个GPR5数据文件和1个corner images文件。其中，GPR5文件包含了一个样本的所有信息和所有特征的荧光强度信息。

2)从所有样本的GPR5数据文件中提取特征的荧光强度信息，生成原始荧光强度(FG，foreground)数据矩阵。然后对每个样本的数据分别进行对数转换得到LFG(log-transferred foreground)数据矩阵、然后将每个样本的LFG数据矩阵中的每一个数值减去该样本的LFG数据矩阵中的中位数获得NLFG(normalized and log-transferredforeground)数据矩阵。该步骤还会生成一个样本芯片信息文件，该文件包括了样本阵列位置、所用芯片编号等信息。

3)质控

通过Health Tell自带的质控方法对样本和系统进行质控，是合格的。

三、封闭条件下纯抗体检测

在封闭条件下，用样本稀释液将抗体稀释至50ng/ml和500ng/ml终浓度分别进行多肽芯片检测；

抗体检测二抗按照来源物种信息对应选择；

同一张芯片尽量安排同样物种来源的抗体，每张检测芯片加一孔纯样本稀释液作抗体浓度为0的对照；

对照二抗按照同检测芯片的检测抗体的物种选择，如果同张检测芯片上抗体物种来源不只一种，对应增加对照。

检测操作

1.样本稀释：

a)质控品总IgG的稀释

使用1.5ml的离心管对IgG进行稀释，取16μL的IgG加入784μL的样本稀释液中，形成50倍的稀释IgG，震荡混匀。

b)抗体稀释

使用样本稀释液将抗体分别稀释至1000ng/ml和100ng/ml

1)取2μL浓度为100μg/ml的抗体加入18μL的样本稀释液中，形成浓度为10μg/ml的稀释抗体(梯度1)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)；

2)取15μL梯度1的抗体加入135μL的样本稀释液中，形成浓度为1000ng/ml的稀释抗体(梯度2)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)；

3)取12μL梯度2加入108μL的样本稀释液中，形成浓度为100ng/ml的稀释抗体(梯度3)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)

c)封闭液配制

取2ml的1％酪蛋白(Casein)加到18ml的样本稀释液中，混匀待用。

2.排版加样

1)芯片的封闭处理

将配制好的封闭液，使用排枪分别分装45μL至Cassette的孔位中，封膜，600rpm混匀20s，然后在恒温箱中37℃孵育1小时。

2)封闭处理Cassette(芯片)的加样

根据样本上机排布设计，将1000ng/ml的稀释抗体、100ng/ml的稀释抗体使用排枪移取45μL至Cassette对应的孔位中。

3.第一次孵育

将Cassette封膜，放置于自动化仪器的孵育模块上，孵育1h(具体操作参见非封闭条件下的第一次孵育)。

4.第一次洗板

将Cassette撕膜，置于自动洗板机中，洗板(具体操作参见非封闭条件下的第一次洗板)。

5.加二抗

在避光条件下(关灯)，使用15ml离心管，将人二抗稀释1500倍(4μL二抗加到6ml的二抗稀释液)，将小鼠二抗稀释3000倍(2μL二抗加到6ml的二抗稀释液)，使用50ml离心管，将兔二抗稀释1500倍(9μL二抗加到13500μL的二抗稀释液)。然后根据排版表的孔位信息，使用排枪分别取40μL加入到对应Cassette的对应孔中。

6.第二次孵育

将Cassette封膜，放置于恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

7.第二次洗板

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

8.芯片拆卸

1)在生物安全柜中准备好操作区域，包括芯片离心机、低棉吸水垫、90％异丙醇喷壶、装有MilliQ的水盆，盆中含有芯片槽和手柄、装有MilliQ的水化盒、干净的芯片储存盒。小心的拿出assay cassette中的每块芯片，每次拿1块，将其放置在芯片槽上。

2)芯片干燥，装盒。

9.将芯片组装于imaging cassette中。

10.荧光成像

Imaging System使用机械臂将imaging cassette转移至条形码扫描的位置。待imaging cassette和芯片条形码扫描完成后，将imaging cassette转移至Image Xpress成像。系统通过Venus软件控制指导实验者进行成像操作，需要操作者设定曝光时间和imaging cassette数目。当成像开始时，操作者可以继续添加需要成像的imagingcassette。

成像过程通过Molecular Devices Image Xpress 4成像仪对每个array产生高分辨率的TIFF图像。Gridding Software从TIFF图像文件中提取特征强度数据。

当imaging cassette组装完成后，将cassette转移至cassette hotel。接下来将启动自动成像过程。

四、封闭条件下抗体混入阴性血清检测

在封闭条件下抗体分别以50μg/ml和500μg/ml加入到阴性血清中，再将血清稀释1000倍进行多肽芯片检测(实际操作亦可先稀释血清再按照上机终浓度加入抗体，上机终浓度为多肽芯片检测反应时体系中抗体的浓度，具体操作上考虑了血清和样本消耗量，可以先分别稀释血清以及抗体样本，达成上机反应体系中背景血清1000倍稀释，抗体浓度为50ng/ml和500ng/ml的要求加入抗体)；

抗体检测二抗按照来源物种信息对应选择；

同一张芯片尽量安排同样物种来源的抗体，每张芯片加一孔1：1000稀释的阴性血清作抗体浓度为0的对照；

对照二抗按照同检测芯片检测抗体的物种选择，如果同张检测芯片上抗体物种来源不只一种，对应增加对照。

检测操作

1.样本稀释：

a)质控品总IgG的稀释

使用1.5ml的离心管对IgG进行稀释，取16μL的IgG加入784μL的样本稀释液中，形成50倍稀释的IgG，震荡混匀。

b)血清稀释

使用50ml离心管，取60μL血清样本加入29940μL的样本稀释液中，形成500倍的稀释血清，震荡混匀。

c)抗体混入血清稀释

使用500倍稀释血清将抗体分别稀释至1000ng/ml和100ng/ml，稀释步骤如下：

1)取2μL浓度为100μg/ml的抗体加入18μL的样本稀释液中，形成浓度为10μg/ml的稀释抗体(梯度1)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)；

2)取10μL梯度1的抗体加入90μL的500倍血清中，形成浓度为1000ng/ml的稀释抗体(梯度2)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)；

3)取10μL梯度2加入90μL的500倍血清中，形成浓度为100ng/ml的稀释抗体(梯度3)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)。

d)封闭液配制

取2ml的1％Casein加到18ml的样本稀释液中，混匀待用。

2.排版加样

1)芯片的封闭处理

将配制好的封闭液，使用排枪分别分装45μL至Cassette的孔位中，封膜，600rpm混匀20s，然后在恒温箱中37℃孵育1小时。

2)封闭处理Cassette(芯片)的加样

根据样本上机排布设计，将用500倍血清稀释的1000ng/ml的稀释抗体、100ng/ml的稀释抗体使用排枪移取45μL至Cassette对应的孔位中。

3.第一次孵育

将Cassette封膜，放置于自动化仪器的孵育模块上，孵育1h(具体操作参见非封闭条件下的第一次孵育)。

4.第一次洗板

将Cassette撕膜，置于自动洗板机中，洗板(具体操作参见非封闭条件下的第一次洗板)。

5.加二抗

在避光条件下(关灯)，使用15ml离心管，将人二抗稀释1500倍(4μL二抗加到6ml的二抗稀释液)，将小鼠二抗稀释3000倍(2μL二抗加到6ml的二抗稀释液)，使用50ml离心管，将兔二抗稀释1500倍(9μL二抗加到13500μL的二抗稀释液)。然后根据排版表的孔位信息，使用排枪分别取40μL加入到对应Cassette的对应孔中。

3.第二次孵育

将Cassette封膜，放置于恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

4.第二次洗板

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

5.成像扫描(具体操作参见非封闭条件下的芯片拆卸、芯片组装于imagingcassette中以及荧光成像部分)

五、数据分析

按照逐级排除干扰条件分析思路和具体步骤执行分析，获取八个抗体分别的特异性结合多肽。见下表：

表3：

抗体代码	Lv4肽段数目
		RNPC	55
PCNA	30
		CENPB	65
gp210	57
		LC-1	31
HIB	201
		SARS-Cov-E	80
Pf	508
		GAD	339

表4：

B.混合抗体检测

混合抗体检测设计：

表5：

另外每张检测芯片加一孔总IgG质控品，封闭/非封闭均同样操作。

a.在没有封闭液的情况下

将混合抗体各抗体组分以同一份样本稀释液稀释制备混合抗体样本进行多肽芯片检测。

样本中各抗体组分终浓度均为50ng/ml。

按照各抗体来源物种信息对应选择抗兔二抗。每张检测芯片加纯样本稀释液做抗体浓度为0的对照。

b.在有封闭液的情况下

将混合抗体各抗体组分以同一份样本稀释液稀释制备混合抗体样本进行多肽芯片检测。

样本中各抗体组分终浓度均为50ng/ml。

按照各抗体来源物种信息对应选择抗兔二抗。每张检测芯片加纯样本稀释液做抗体浓度为0的对照。

c.在有封闭液的情况下

将混合抗体各抗体组分以50μg/ml加入到同一份阴性血清样本，再将血清稀释1000倍制备存在血清背景的混合抗体样本用于多肽芯片检测。

按照各抗体来源物种信息对应选择抗兔二抗。每张检测芯片加一孔1：1000稀释的阴性血清做抗体浓度为0的对照。

C.抗体特异性结合肽段用于混合抗体中抗体组分分析

混合抗体检测热图见图2。在图2中，以混合抗体1-4以及对照抗体5-8的所有抗体Lv4信号肽段做热图，图中每一行代表一条肽段，每一列代表一个检测抗体样本。前8列分别代表抗体1～8单个抗体；后三列为混合抗体样本，依次是抗体1、2混合样本、抗体1、2、3混合样本以及抗体1、2、3、4混合样本。每个条带亮度为单一肽段在单个样本中的相对信号强度。如图所示，抗体1至抗体8分别有各自阳性肽段，来自一种抗体的信号肽仅在该抗体中呈现高信号水平，混合样本中同时存在各抗体组分的特异性肽段信号。且同样浓度下检测信号水平与抗体单独检测信号水平相当，不因抗体混合产生异常信号。

上述结果表明经过逐渐排除干扰(包括不同条件下的多种抗体之间交叉肽段去除，以及同一抗体检测不同条件下的肽段集合取交集)得到抗体及抗体组合具有特异性高的优势。

实施例2：抗体高可信特异性结合肽段用于临床样本中特定抗体有无的识别

A.抗体多肽芯片检测及分析：

GAD抗体特异性结合多肽的筛选：在实施例1中与其他单抗体的多肽芯片检测共同完成，主要流程如下：

(1)多肽芯片检测

a.在没有封闭液的情况下

将抗体用样本稀释液稀释后进行多肽芯片检测，抗体检测时终浓度为50ng/ml和500ng/ml。

按照抗体来源物种信息对应选择抗兔二抗。检测芯片加纯样本稀释液做抗体浓度为0的对照。

b.在有封闭液的情况下

将抗体以样本稀释液稀释后进行多肽芯片检测。抗体检测时终浓度为50ng/ml和500ng/ml。

按照抗体来源物种信息对应选择抗兔二抗。检测芯片加纯样本稀释液做抗体浓度为0的对照。

c.在有封闭液的情况下

将待测抗体以50μg/ml加入到阴性血清样本，再将血清稀释1000倍制备存在血清背景的抗体样本用于多肽芯片检测。

按照抗体来源物种信息对应选择抗兔二抗。检测芯片加一孔1：1000稀释的阴性血清做抗体浓度为0的对照。

d.扫描成像及数据分析(具体操作参见非封闭条件下的芯片拆卸、芯片组装于imaging cassette中以及荧光成像部分)

扫描成像后进行数据处理，并按照逐级排除干扰条件分析思路和具体步骤执行分析，获取目标抗体特异性结合多肽(用于对下述确诊的临床血清样本进行检测，以验证此处获取的肽段的检测效果)。

B.临床多肽芯片检测：

样本集合：临床确诊1型糖尿病患者以及健康对照人群血清样本(见下表)，经放射免疫法分别测定GAD抗体以及IA2A抗体的有无。

表6：

多肽芯片检测：封闭条件下临床血清样本检测

在封闭条件下各个血清样本以样本稀释液稀释后进行多肽芯片检测，检测时总体样本稀释倍数为1000倍。

每张检测芯片加一孔纯样本稀释液作为对照；

检测操作

1.样本稀释：

a)质控品总IgG的稀释

使用1.5ml的离心管对IgG进行稀释，取16μL的IgG加入784μL的样本稀释液中，形成50倍的稀释IgG，震荡混匀。

b)样本稀释

使用样本稀释液将血清样本稀释500倍

1)取2μL血清样本加入48μL的样本稀释液中，形成稀释倍数为25的稀释样本(梯度1)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)；

2)取5μL梯度1的样本稀释液加入95μL的样本稀释液中，形成稀释度为500的稀释样本(梯度2)，封膜、震荡混匀、离心(4000rpm 1min)；

c)封闭液配制

取2ml的1％Casein加到18ml的样本稀释液中，混匀待用。

2.排版加样

2)芯片的封闭处理

将配制好的封闭液，使用排枪分别分装45μL至Cassette的孔位中，封膜，600rpm混匀20s，然后在恒温箱中37℃孵育1小时。

3)封闭处理Cassette(芯片)的加样

根据样本上机排布设计，将500倍稀释的稀释样本使用排枪移取45μL至Cassette对应的孔位中。

3.第一次孵育

将Cassette封膜，放置于自动化仪器的孵育模块上，孵育1h(具体操作参见非封闭条件下的第一次孵育)。

4.第一次洗板

将Cassette撕膜，置于自动洗板机中，洗板(具体操作参见非封闭条件下的第一次洗板)。

5.加二抗

在避光条件下(关灯)，使用15ml离心管，将人二抗稀释1500倍(4μL二抗加到6ml的二抗稀释液)，使用排枪分别取40μL加入到对应Cassette的对应孔中。

6.第二次孵育

将Cassette封膜，放置于恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

7.第二次洗板

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

8.成像扫描(具体操作参见非封闭条件下的芯片拆卸、芯片组装于imagingcassette中以及荧光成像部分)

9.数据处理

C.GAD特异性结合多肽集合用于临床样本中GAD抗体阳性与否的识别：

使用本实施例步骤A中找到的GAD抗体(兔源多克隆抗体)特异性结合多肽集合，在本实施例提及的糖尿病队列中的单独GAD检测抗体阳性的患者的血清样本的检测结果与健康人群的血清样本的检测结果(此处的检测结果是指经过前述从FG转换成LFG，再处理为NLFG的数据处理流程后的结果)进行训练，使用岭回归模型建模(参数alpha＝1000)。将获得模型在包括GAD阳性(且不止GAD为阳性)的多个抗体检测为阳性的患者的血清样本的检测结果和另外一批健康人群的血清样本的检测结果中进行测试。

本实施例中，对筛选到的Lv1至Lv4的肽段集合都分别按上思路进行了建模，其中利用Lv1的肽段集合所建立的模型的预测结果如图3和图4所示。Lv2至Lv4的肽段集合建模后的预测结果与Lv1的结果类似(未图示)。在采用Lv4的肽段集合进行建模预测时，由于肽段数量相对更少，处理速度也更快。另外，对于Lv4的肽段集合而言，不采用模型预测的方法来检测目标抗体有无，采用与常规的ELISA类似的检测方式时，由于Lv4的肽段集合中肽段数量少且特异性更高，可采用与阴性样本直接比对的方式，来判定待测样本的检测结果。

需要说明的是，基于单独GAD抗体阳性的人群队列的血清样本(16例)的检测结果与健康人群的血清样本(24例)的检测结果作为训练集(共计40例)，然后采用剩余样本的检测结果作为测试集(包括13例健康人群样本的检测结果，24例在包含GAD检测阳性且在IA2A和ZnT8检测中至少一种以上为阳性的糖尿病患者血清样本的检测结果，共计37例)，以验证所构建的模型的预测准确性(在含有不止单独GAD抗体阳性的样本的情况下)。

图3示出的是统计结果(准确率35/37＝95％)，图4示出的是用ROC分析测定GAD抗体特异性结合多肽集合的性能。选取GAD抗体所有特异性结合多肽集合进行综合分析，在验证集(即测试集)中区分GAD抗体阳性以及GAD抗体阴性(非糖尿病)的准确率为97％，AUC为0.98。该结果显示抗体多肽芯片检测分析筛选出的特异性结合肽段在检测临床队列中有无特定抗体的应用中具有实际意义。

从以上的实施例可以看出，本申请所提供的基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，通过使用高密度随机多肽芯片技术平台(例如HealthTell的V13芯片含有130,000种多肽)在抗原表位分析方面的独特优势---可兼容线性表位和非线性表位抗体的结合，利用逐级排除可能的背景干扰的实验手段和分析思路，获得了高灵敏度和高特异性的多肽集合和组合，对应肽段可用于抗体的检测。检测时，抗体特异性结合多肽与血液中的抗体结合，通过与荧光标记的二抗孵育后，在酶标仪中检测荧光值全面无偏来反映血液中的抗体谱。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海碳云智能科技有限公司

<120> 基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法及其筛选的多肽的应用

<130> PN153005SZTY

<160> 85

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 1

Tyr His Ser Lys Ala Asn Asp Ala Leu Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成的多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 2

Val Ser Lys Trp Arg Asp His Leu Ser

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成的多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 3

Gln Gly Glu Asp Asn Val Asn Leu Ser Asp

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成的多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 4

His Ser Lys Lys His Asp Tyr Gln Ser Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 5

Ala Ala Lys Arg Asp Asp Ala Leu Asp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 6

Ala Ala Lys Arg Asp Asp Ala Leu Asp

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 7

Leu Ser Lys Leu Asn Asp His Leu Glu

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> 合成多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 8

Arg Ser Lys Lys Asp Asp Gly

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 9

His Asp Ala Leu Gly Glu Asp Asn Leu Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人SNRPC/U1C的抗体特异性结合

<400> 10

Arg Ser Lys Trp His Asp Leu Asp

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成序列，与人PCNA的抗体特异性结合

<400> 11

Glu Gln Pro Leu Gln Lys Val Gly

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人PCNA的抗体特异性结合

<400> 12

Asp Gln Gly Lys Gln Phe Glu Asp

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人PCNA的抗体特异性结合

<400> 13

Asp Gln Pro Tyr Gln Arg Ser His Gly

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人PCNA的抗体特异性结合

<400> 14

Asn Gln Pro Gln Gln His Val Tyr Val Glu Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人PCNA的抗体特异性结合

<400> 15

Asp Gln Pro Lys Gln Arg His Val Phe

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 16

Pro Asn Phe Asn Asn Arg His Ala Gly

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 17

Asn Tyr Asn Asn Leu Ala Phe Ser Gly

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 18

His Asn His Asn Asn His Phe Asp

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 19

Arg Asn Ala Asn Asn His Leu Phe Gly

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 20

Asn Phe Asn Asn Glu His Glu Gly

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 21

Asn His Asn Asn Pro Asn Phe Glu Gly

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 22

Tyr Gly Ser Arg Asn Leu Gly

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 23

Asn His Asn Asn Gly Pro Tyr Arg Gly

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 24

Asn Tyr Asn Asn Ala Gln Ser Gly

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 25

Arg Pro Trp Asn Ser Asn Asn Gln His Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> 合成多肽，与人CENPB的抗体特异性结合

<400> 26

Arg Asn Phe Asn Asn Asp Gly

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 27

Phe Asp Val Pro Pro Asn Gln Lys Leu Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 28

Gln His Leu Asn Pro Asn Leu Tyr Glu Gly

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 29

His Val Phe Gly Ala Ser Asp His Tyr Gln Gly

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 30

Tyr Leu Asp Gly Gly Arg Arg Val Asp

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 31

Asn Asp Asn Gln Asn Pro Asn Leu Ser

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 32

Asn Phe Leu Asn Pro Arg Leu Gly

1 5

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 33

Lys His Ala Trp Asn Ala Asn Pro Arg Leu Asp

1 5 10

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 34

Phe Gly Val Gly Asp Gly Gly

1 5

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人gp210的抗体特异性结合

<400> 35

Asn Gln Ser Gly Pro Glu Tyr Lys Pro His Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 36

Arg Phe Val Ser Leu Ser Asp Ala Asp

1 5

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 37

Pro Ala Asn Leu Lys Asp Ala Asp Ala Gly

1 5 10

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 38

Lys Phe Phe Ser Gln Lys Glu Val Asp

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 39

Gln Trp Val Ser Phe Ser Gln Lys Gly

1 5

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(12)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 40

Ala Gln Leu Asp Ala Asp Ala Lys Asp Tyr Leu Glu

1 5 10

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 41

Arg Val Asn Leu Arg Asp Ala Asp Gly

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 42

Pro Pro Glu Arg Gly Pro Trp Asp

1 5

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人58K高尔基蛋白的抗体特异性结合

<400> 43

Arg Leu Phe Asp Ala Asp Gly Ala Pro Lys Asp

1 5 10

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 44

Tyr Gly Glu Tyr Asn Lys Glu Leu Phe Gly

1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 45

Tyr His Trp Pro Asn Val His Val Ser

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 46

Phe Phe His Leu Pro Asn Asp Gly

1 5

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 47

Tyr Ser Asn Glu Leu Gly Tyr Asn Gln Phe Glu

1 5 10

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(12)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 48

Ala Leu Phe Gly Phe Pro Asn Asp Pro Lys Val Ser

1 5 10

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 49

Tyr Leu Asn Glu Arg Phe Glu Ala Gln Val Ser

1 5 10

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 50

Arg Lys Phe Pro Asn Glu Leu Phe Asp

1 5

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 51

Asn His Ala Pro Asn Gln Pro Trp Lys His Gly

1 5 10

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 52

Trp His Pro His Tyr Pro Asn Arg Ser Asp

1 5 10

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 53

Trp Asn Pro Asn Val His Phe Pro Asn Ser Glu

1 5 10

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 54

Lys Trp Leu Lys Tyr Ala Asn Glu Asp

1 5

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 55

Trp Lys Tyr Trp Lys Leu Glu Tyr Pro Asn Asp

1 5 10

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 56

Ser Tyr Gln Asn Glu Tyr Asn Leu Asp

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 57

Tyr Arg Asn Glu Val Asn His Val Glu

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 58

Gly His Tyr Ala Asn Glu Asn His Gly

1 5

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 59

Tyr Lys Glu Phe Asn His Gly Val Asp Gly

1 5 10

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 60

Tyr Gln Asn Glu Phe Gly Leu Asp Gly

1 5

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 61

Tyr Ala Asn Glu Lys His Glu Phe His Ser Asp

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 62

Phe Arg Ser Gly Tyr Ala Asn Glu Arg Val Leu

1 5 10

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 63

Asn Val His Lys Pro Asn His Asp Gly

1 5

<210> 64

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 64

Trp His Lys Gly Ala His Val Pro Asn Glu Gly

1 5 10

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 65

Tyr Pro Asn Asp Tyr Arg Val Pro Leu Ser Gly

1 5 10

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(12)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 66

Pro Trp Lys His Arg Phe His Phe Pro Asn His Val

1 5 10

<210> 67

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 67

Tyr Gln Asn Glu Pro Tyr Arg Pro His Phe Gly

1 5 10

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 68

Ala Val His Gln Pro Asn Val Phe Ser

1 5

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 69

Ala Tyr Pro Asn Glu Phe Glu Gly

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 70

Phe Asn Gln Pro Asn Gln Leu Leu Gly

1 5

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 71

Val His Glu Pro Asn Glu Asp Ala Asn Arg Phe

1 5 10

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 72

Phe Gly Phe His Gly Pro Asn Asp

1 5

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 73

Asn Pro Tyr Lys Arg Val Tyr Pro Asn Glu Asp

1 5 10

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 74

Asp Tyr Pro Asn Glu Ala Lys His Asp

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 75

Ser Tyr Pro Asn Glu Asp Pro Lys Arg Asp

1 5 10

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 76

Tyr Pro Asn Glu His Gln Lys Leu Asp

1 5

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 77

Tyr Pro Asn Glu Val Tyr Trp Gln Lys Arg Ser

1 5 10

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 78

His Tyr His Glu Pro Asn Ser Val Phe Gly

1 5 10

<210> 79

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 79

His Ala His Phe Pro Asn Ala Trp Arg Ser

1 5 10

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 80

Val His Val Pro Asn Gln Gln Arg Val Leu

1 5 10

<210> 81

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 81

Asn Tyr His Gln Pro Asn Lys Arg Leu Glu

1 5 10

<210> 82

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 82

Ala Phe His Lys Pro Asn Ser Gly

1 5

<210> 83

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(12)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 83

Gln Gln His Ser Tyr His Leu Pro Asn Arg Leu Gly

1 5 10

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 84

Ala Asn Ser Ala His Tyr Pro Asn Leu Gly

1 5 10

<210> 85

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 合成多肽，与人GAD抗体特异性结合

<400> 85

Phe His Glu Pro Asn Gln Leu Lys Arg Asp

1 5 10

Claims (15)

1.一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：

在封闭及非封闭的条件下，分别使用所述多肽芯片对第一抗体阳性样本和第一抗体阴性样本进行特异性结合多肽的第一次筛选，对应获得封闭条件下的第一种子肽库和非封闭条件下的第一种子肽库；

对所述封闭条件下的第一种子肽库和所述非封闭条件下的第一种子肽库中的多肽取交集，得到第二种子肽库；

在封闭的条件下，使用所述多肽芯片对第二抗体阳性样本和第二抗体阴性样本进行特异性结合多肽的第二次筛选，得到第三种子肽库；

取所述第三种子肽库与所述第二种子肽库的交集，得到第四种子肽库；

其中，所述第一抗体阳性样本为一个或多个含单一抗体的样本稀释液，所述第二抗体阳性样本为一个或多个含单一抗体的血清样本，所述第一抗体阴性样本为不含所述单一抗体的样本稀释液，所述第二抗体阴性样本为不含所述单一抗体的血清样本；或者

所述第一抗体阳性样本为一组或多组含混合抗体的样本稀释液，所述第二抗体阳性样本为一组或多组含混合抗体的血清样本，所述第一抗体阴性样本为不含所述混合抗体的样本稀释液，所述第二抗体阴性样本为不含所述混合抗体的血清样本。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述第一抗体阳性样本为多个含单一抗体的样本稀释液，所述第二抗体阳性样本为多个含单一抗体的血清样本，所述第一抗体阴性样本为不含所述单一抗体的样本稀释液，所述第二抗体阴性样本为不含所述单一抗体的血清样本，所述筛选方法还包括排除多个不同的所述单一抗体之间存在交集的多肽；

优选地，在以下任意一个或多个时机排除多个不同的所述单一抗体之间存在交集的多肽：

a.在所述非封闭条件下进行所述第一次筛选之后；

b.在所述封闭条件下进行所述第一次筛选之后；

c.在进行所述第二次筛选之后。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述第一抗体阳性样本为多组含混合抗体的样本稀释液，所述第二抗体阳性样本为多组含混合抗体的血清样本，所述第一抗体阴性样本为不含所述混合抗体的样本稀释液，所述第二抗体阴性样本为不含所述混合抗体的血清样本，且任意两组所述含混合抗体的样本稀释液和/或任意两组所述含混合抗体的血清样本之间所含的抗体种类不重叠，则所述筛选方法还包括排除多组不同的所述混合抗体之间存在交集的多肽；

优选地，在以下任意一个或多个时机排除多组不同的所述混合抗体之间存在交集的多肽：

a.在所述非封闭条件下进行所述第一次筛选之后；

b.在所述封闭条件下进行所述第一次筛选之后；

c.在进行所述第二次筛选之后。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的筛选方法，其特征在于，在所述非封闭条件下和/或所述非封闭条件下，均采用两个或两个以上不同抗体浓度的所述第一抗体阳性样本进行所述第一次筛选；

优选地，在所述非封闭条件下采用两个以上不同抗体浓度的所述第一抗体阳性样本进行所述第一次筛选，并确定两个不同抗体浓度的所述第一抗体阳性样本进行所述封闭条件下的所述第一次筛选；

优选地，所述第一抗体阳性样本中所含的单一抗体的浓度或所述混合抗体中每个单一抗体的浓度为10ng/mL～1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL；

优选地，采用两个或两个以上不同抗体浓度的所述第二抗体阳性样本进行所述第二次筛选，更优选地，所述第二抗体阳性样本中所含的单一抗体的浓度或所述混合抗体中每个单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，进一步优选为50ng/mL-500ng/mL。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的筛选方法，其特征在于，所述样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，所述D-甘露醇在所述PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％；

优选地，所述在封闭条件下是指采用封闭液对多肽芯片进行封闭，使用封闭后的所述多肽芯片进行筛选，

更优选地，所述封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，所述封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；

进一步优选地，所述封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且所述封闭液的pH为7.4。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，多个所述单一抗体或者所述混合抗体中的每个单一抗体均为多克隆抗体；

优选地，多个所述单一抗体或者所述混合抗体中的每个单一抗体具有相同或不同的物种来源；优选地，所述物种来源为兔、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠或人；

优选地，多个所述单一抗体或者所述混合抗体选自如下抗体中的多个：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，在使用所述多肽芯片进行所述第一次筛选和所述第二次筛选均包括依次进行的抗体样本孵育和二抗孵育，其中二抗带有荧光标记；

优选地，所述二抗的物种来源根据所述第一次筛选和所述第二次筛选步骤中各所述单一抗体或所述混合抗体中的单一抗体的物种来源进行选择。

8.一种基于多肽芯片的抗体特异性结合的多肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：

在非封闭条件下，使用多肽芯片对多种单一抗体或多组混合抗体的第一阳性样本及相应的第一阴性样本进行特异性结合多肽的第一次筛选，得到每种所述单一抗体或每组所述混合抗体各自对应的第一抗干扰肽库；其中，所述第一阳性样本为含单一抗体的样本稀释液或者为含所述混合抗体的样本稀释液，所述第一阴性样本为不含所述单一抗体或所述混合抗体的样本稀释液；

去除多种所述单一抗体或多组所述混合抗体各自对应的所述第一抗干扰肽库中存在交集的多肽，得到每种所述单一抗体或多组所述混合抗体对应的第二抗干扰肽库。

9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法进一步包括：

在封闭条件下，使用多肽芯片对所述第一阳性样本及相应的所述第一阴性样本进行特异性结合多肽的第二次筛选，得到第三抗干扰肽库；

取所述第二抗干扰肽库和所述第三抗干扰肽库中的多肽的交集，得到第四抗干扰肽库。

10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法进一步包括：

在封闭条件下，使用多肽芯片对第二阳性样本及相应的第二阴性样本进行特异性结合多肽的第三次筛选，得到第五抗干扰肽库；其中，所述第二阳性样本为含单一抗体的血清样本或含所述混合抗体的血清样本，所述第二阴性样本为不含所述单一抗体或所述混合抗体的血清样本；

取所述第五抗干扰肽库与所述第四抗干扰肽库的交集，得到每种所述单一抗体或每组所述混合抗体对应的第六抗干扰肽库。

11.根据权利要求10所述的筛选方法，其特征在于，在得到每种所述单一抗体或每组所述混合抗体对应的所述第三抗干扰肽库和/或所述第五抗干扰肽库后，所述筛选方法还包括：

去除多种所述单一抗体或多组所述混合抗体在各所述第三抗干扰肽库和/或所述第五抗干扰肽库中存在交集的多肽。

12.根据权利要求10或11所述的筛选方法，其特征在于，多种所述单一抗体或所述混合抗体中的每一种单一抗体采用两个或两个以上不同的抗体浓度进行所述第一次筛选；

优选地，所述第一阳性样本中所含的所述单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL；

优选地，所述样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，所述D-甘露醇在所述PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％；

优选地，在所述非封闭条件下，采用两个以上不同抗体浓度的所述第一阳性样本进行所述第一次筛选，进而确定两个不同抗体浓度的所述第一阳性样本，然后在所述封闭条件下进行所述第二次筛选；

优选地，每种所述单一抗体采用两个或两个以上不同抗体浓度的所述第二阳性样本进行所述第三次筛选；

优选地，所述第二阳性样本中所含的单一抗体的浓度为10ng/mL-1μg/mL，更优选为50ng/mL-500ng/mL；

优选地，所述在封闭条件下是指采用封闭液对多肽芯片进行封闭，使用封闭后的所述多肽芯片分别进行所述第二次筛选和所述第三次筛选；

优选地，所述封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，所述封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；

进一步优选地，所述封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且所述封闭液的pH为7.4；

优选地，所述单一抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，多种所述单一抗体或所述混合抗体中的每一种单一抗体均为多克隆抗体；

优选地，多种所述单一抗体或所述混合抗体中的每一种单一抗体具有相同或不同的物种来源；

优选地，所述物种来源为兔、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠或人；

优选地，多种所述单一抗体或所述混合抗体选自如下抗体中的多个：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体。

13.一种待测样本中目标抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

利用所述目标抗体特异性结合的靶标多肽，对所述待测样本及所述待测样本的阴性对照进行检测，得到各自对应的检测结果；

若所述待测样本和所述阴性对照对应的所述检测结果存在显著差异，则表明所述待测样本含有所述目标抗体；

所述靶标多肽为权利要求1至7中任意一项所述的筛选方法所筛选到的与所述目标抗体特异性结合的多肽，或者所述靶标多肽为权利要求8至11中任意一项所述的筛选方法所筛选到的与所述目标抗体特异性结合的多肽。

14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，在对多肽芯片进行封闭的条件下，利用含所述靶标多肽的多肽芯片，对所述待测样本及所述待测样本的阴性对照进行检测，得到各自对应的所述靶标多肽的检测结果；

若所述靶标多肽在所述待测样本和所述阴性对照对应的所述检测结果之间存在显著差异，则表明所述待测样本含有所述目标抗体；

优选地，所述待测样本为样本稀释液稀释后的血清样本，所述阴性对照为所述样本稀释液，所述靶标多肽为权利要求1-7中任意一项所述的筛选方法所筛选到的与所述目标抗体特异性结合的多肽集合中的任意多种多肽；

优选地，所述目标抗体选自如下任意一种或多种：人SNRPC/U1C的抗体、人PCNA的抗体、人CENPB的抗体、人NUP210/gp210的抗体、人FTCD/58K高尔基蛋白的抗体、HIB的抗体、SARS-CoV E蛋白的抗体、疟原虫的抗体及GAD抗体；

优选地，所述样本稀释液为含D-甘露醇的PBST缓冲液，其中，所述D-甘露醇在所述PBST缓冲液中的质量体积含量为0.5％～1％；

优选地，在对所述待测样本及所述待测样本的阴性对照进行检测之前，所述检测方法还包括：采用封闭液对所述多肽芯片进行封闭；

优选地，所述封闭液包括如下组分：130～137mM氯化钠、2.5～2.7mM氯化钾、3.8～4.3mM磷酸氢二钠、1.2～1.4mM磷酸二氢钾、0.05％～1％Tween-20v/v、0.05％～0.1％Proclin950 v/v、0.5％～1％D-甘露醇w/v和0.1％-1％酪蛋白w/v，所述封闭液的pH为7.2～7.6，更优选为7.38～7.42；

更优选地，所述封闭液为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸氢二钠、1.4mM磷酸二氢钾、1％Tween-20v/v、0.1％Proclin950 v/v、1％D-甘露醇w/v及0.1％酪蛋白w/v，且所述封闭液的pH为7.4。

15.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于，在对多肽芯片进行封闭的条件下，利用含所述靶标多肽的多肽芯片，对所述待测样本及所述待测样本的阴性对照进行检测包括：

将所述样本稀释液以及所述样本稀释液稀释后的血清样本与封闭后的所述多肽芯片进行孵育，得到第一孵育产物；

将所述第一孵育产物与带荧光标记的二抗进行共孵育，得到第二孵育产物；

对所述第二孵育产物进行荧光扫描，得到所述样本稀释液的荧光信号和所述血清样本的荧光信号；

检测所述靶标多肽在所述样本稀释液中的荧光信号和所述血清样本的荧光信号之间是否存在显著差异，若存在，则表明所述血清样本中存在所述目标抗体；

优选地，所述二抗与所述血清样本的物种来源相同；

优选地，通过多个已知所述目标抗体存在与否的临床样本队列，所检测到的所述靶标多肽在目标抗体阳性人群和目标抗体阴性人群中的荧光信号进行预测模型的构建，通过所述预测模型预测所述靶标多肽在所述样本稀释液的荧光信号和所述血清样本的荧光信号之间是否存在显著差异，即通过所述预测模型输出所述血清样本中是否为所述目标抗体阳性样本。

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