CN117756903A - 一种诱导滤泡辅助性t细胞的血吸虫来源多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱导滤泡辅助性T细胞的血吸虫来源多肽及应用，目的探讨日本血吸虫来源多肽的抗原特异性以及对日本血吸虫早期感染的诊断潜能。通过用Sjp90α‑1与免疫细胞共培养发现Sjp90α‑1通过BMDCs诱导CD4+T细胞分化为Tfh细胞。此外用Sjp90α‑1肽包被并对日本血吸虫感染动物血清样本进行ELISA检测，发现随着感染周期的增加，Sjp90α‑1肽抗体水平逐渐上升，显著高于未感染动物血清中的肽抗体水平，有望在日本血吸虫病的早期诊断中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种诱导滤泡辅助性T细胞(follicularhelper T cell,Tfh)，具有抗原特异性以及对日本血吸虫感染的早期诊断潜能的血吸虫来源多肽及应用。
背景技术
日本血吸虫病的发病机制尚不清楚，目前研究认为可能是一种免疫复合物病或血清病，Tfh细胞参与诱导肝脏免疫病理形成过程。日本血吸虫感染可以引起肝脾以及神经系统的疾病，严重时可危及生命。然而，高敏感性和特异性的诊断抗原的缺乏已经成为阻碍消灭日本血吸虫病目标的显著原因之一。
肽作为免疫原性抗原表位，在驱动适应性免疫应答中起着重要作用，已被用于多种控制寄生虫感染的试验，如SjSAP4衍生肽、Gp63衍生肽和HLA衍生肽被鉴定用于血吸虫病血清学诊断或用于疟疾预防疫苗配方。然而，关于血吸虫来源多肽潜在免疫作用的研究尚未见报道。
众所周知，T淋巴细胞，尤其是滤泡辅助性T细胞在对抗血吸虫的免疫反应中至关重要，它主要位于B细胞滤泡的外围，通过表面受体CXCR5和PD-1等多种分子的表达识别，对B细胞的激活、抗体的产生和生发中心的形成起着关键作用。
截至目前为止，没有任何关于日本血吸虫来源多肽诱导Tfh细胞产生的报道，以及其在血吸虫病诊断中潜能的报道。
发明内容
本发明的主要目的是针对以上存在的问题，提供一种能诱导滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)，具有抗原特异性的多肽。
本发明的第一个目的是提供一种多肽Sjp90α-1，所述多肽Sjp90α-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：KGKSVAADNGPTVAPC。
进一步的，所述多肽Sjp90α-1来源于日本血吸虫。
进一步的，所述多肽Sjp90α-1刺激的树突状细胞诱导CD4+T细胞分化为Tfh细胞(滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell,Tfh))，进而促进B细胞产生Sjp90α-1肽抗体。
本发明的第二个目的是提供Sjp90α-1肽抗体，所述Sjp90α-1抗体由多肽Sjp90α-1诱导产生。
本发明的第三个目的是提供前述的多肽Sjp90α-1作为检测标志物在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
本发明的第四个目的是提供前述的Sjp90α-1肽抗体作为检测靶点在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
本发明的第五个目的是提供检测前述的Sjp90α-1肽的试剂或检测前述的Sjp90α-1肽抗体的试剂在制备诊断早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的试剂中的应用。
进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
本发明的第六个目的是提供一种早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的诊断试剂，包含检测前述的多肽Sjp90α-1和/或检测前述的Sjp90α-1肽抗体的试剂。
进一步的，所述的检测血吸虫来源多肽Sjp90α-1或Sjp90α-1肽抗体的试剂还包括：封闭液，酶标二抗溶液，TMB-H2O2-磷酸盐缓冲液，终止液(2mol/L H2SO4)。
进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
在某个特殊的实施例中，本发明所述筛选优势肽段并检测其抗原特异性免疫反应方法如下：
利用生物学软件分析进行抗原表位预测并选择最优多肽序列送至公司合成，然后用流式细胞术检测多肽的免疫原性，包括以下步骤：
(1)多肽抗原表位筛选并合成：在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库比对日本血吸虫蛋白同源性，并设计多肽。综合考虑序列长度、亲水性/疏水性、序列特异性和抗原表位性质等因素，选择最优多肽序列KGKSVAADNGPTVAPC合成，命名为Sjp90α-1。
(2)用Sjp90α-1体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞。流式分析显示，Sjp90α-1肽能够显著诱导巨噬细胞(F4/80+CD11b+MHC-II+)，树突状细胞(MHC-II+CD11c+)和滤泡辅助性T细胞(CD3+CD4+CXCR5+；CD3+CD4+PD1+)增加。
(3)将纯化的小鼠CD4+T细与Sjp90α-1刺激的小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)共培养24小时。流式结果表明Sjp90α-1激活的BMDCs对诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化至关重要。
(4)MBS法偶联KLH载体蛋白制备抗原：多肽KGKSVAADNGPTVAP-C，溶解于PBS缓冲溶液中，巯基偶联到钥孔血蓝蛋白KLH上。
(5)免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体：将偶联KLH的Sjp90α-1多肽混合物与弗氏完全佐剂等体积混合，分别皮下注射免疫2只日本大耳白兔，在一免后每个节点12、26、40、54d，将制备好的抗原与弗氏不完全佐剂混合进行2次加强免疫，每次免疫剂量为0.35mg/只；免疫67d后心脏采血，分离血清获取多克隆抗体。
(6)抗血清纯化：抗血清用KGKSVAADNGPTVAPC作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的肽抗体。后续效价和特异性检测为验证步骤。
(7)抗血清DB(斑点印迹杂交法)测定多克隆抗体效价：将抗原多肽用PBS稀释成50ng/μl，用2.5μL移液器利用反向吸液的方式每小方格取50ng/μL相应多肽稀释液2μL，点在膜(白色)上1cm×1cm正方形小格中心，即多肽包被量为100ng。点样完成后，将NC膜放入37℃烘箱中30min。然后封闭1h，将上述制备的多克隆抗体用封闭液进行倍比稀释，分别为肽抗体稀释比例为1:1000，1:5000，1:10000，1:50000，1:100000，1:200000。洗掉封闭液，并在每孔中加入相应的一抗稀释液1mL，室温孵育2h。TBST洗涤5次，5min/次；向每孔中加入1ml经1:8000稀释的酶标二抗(山羊抗兔-HRP)，孵育1h，TBST洗板5次；ECL显色液曝光。
(8)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测多肽特异性和交叉反应性：将实验室保存的Sjp90α原核表达蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，300mA转60min至PVDF膜，将实验室保存的日本血吸虫虫卵抗原SEA蛋白为阳性对照，后续封闭与洗脱参考肽抗体效价检测。显色液曝光。
经验证，由上述制备的Sjp90α-1肽作为诊断标志物通过ELISA检测对日本血吸虫感染有早期诊断潜力。
与现有技术相比，本申请技术方案具有以下有益效果：
本发明所述多肽Sjp90α-1能诱导滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)，具有抗原特异性的多肽。发现以Sjp90α-1肽包被平板，对日本血吸虫感染小鼠血清进行ELISA检测，可以有效地在感染早期检测出Sjp90α-1肽IgG抗体水平增高。日本血吸虫热休克蛋白Sjp90α-1肽可以作为生物标记物用于制备诊断早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的试剂。
附图说明
图1A在同一物种中分析氨基酸序列的特异性，便于发现该蛋白产生的抗体是否会识别其他蛋白。在Schistosoma中，分析基因的特异性，发现该基因分数在80-200之间，特异性良好。图1B通过TMHMM Server对蛋白跨膜区域进行预测，发现这些Sjp90α源肽在膜外有表达，表明这些肽可以表达。图1C利用DTU服务进行B细胞表位预测，得到了抗原性最高的的肽段(231-245aa)命名为Sjp90α-1。
图2Sjp90α-1刺激小鼠脾脏淋巴细胞24h后免疫细胞变化的流式结果；其中，图2A为流式分析的圈门策略；图2B-D为被激活的树突状细胞(DCs)，滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)，巨噬细胞柱状统计图。
图3Sjp90α-1肽激活BMDCs诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化。图3A、B为流式分析结果，用于证明Sjp90α-1肽诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化依赖于BMDCs。
图4抗血清DB(斑点印迹杂交法)的结果，用于检测肽抗体特异性效价。
图5蛋白免疫印迹法(Western blot)的结果，用于检测肽特异性和交叉反应性；其中，图5A为蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sjp90α-1肽特异性；图5B为蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sjp90α-1肽的交叉反应性。
图6感染与未感染日本血吸虫小鼠Sjp90α-1肽抗体水平比较；其中，图6A为感染与未感染日本血吸虫小鼠血清中Sjp90α-1肽抗体水平ELISA结果；图6B为Sjp90α-1肽抗体与日本血吸虫病ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1检测Sjp90α-1肽的抗原特异性免疫反应:
该实施例采用Sjp90α-1肽作为刺激源与免疫细胞共培养，流式细胞术检测免疫细胞激活以及分化情况，具体操作步骤如下：
(1)Sjp90α-1多肽抗原表位筛选并合成：在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库比对日本血吸虫热休克蛋白Sjp90α蛋白同源性，并检索设计Sjp90α抗原多肽。综合考虑序列长度、亲水性/疏水性、序列特异性和抗原表位性质等因素，结果显示在同种属中，分析基因的特异性，发现该基因的特异性良好(图1A)，将该序列进行跨膜结构域分析发现其表达在膜外，可进行蛋白表达(图1B)；最后我们利用DTU服务进行B细胞表位预测，得到了抗原特异性最高的的肽段(231-245aa)，命名为Sjp90α-1肽：KGKSVAADNGPTVAPC(图1C)。
(2)从小鼠中纯化脾脏淋巴细胞，加入Sjp90α-1肽(40μg/ml)刺激2h。台盼蓝排除法测定细胞活力(>95％活细胞)。采用流式细胞术计数并染色作为标记。树突状细胞(DCs)分析采用大鼠抗小鼠CD11c-Percp-cy5.5和大鼠抗小鼠MHC-II-APC对2×106细胞单细胞悬液进行表面染色；Tfh细胞分析采用大鼠抗小鼠CD3-Percp-cy5.、大鼠抗小鼠CD4-FITC、大鼠抗小鼠PD1-P和大鼠抗小鼠CXCR5-PE/Cy7对2×106细胞单细胞悬液进行表面染色；用大鼠抗小鼠F4/80-PE/Cy7、大鼠抗小鼠CD11b-FITC和大鼠抗小鼠MHC-II-AP标记2×106细胞的单细胞悬液进行巨噬细胞分析。
结果显示：Sjp90α-1肽刺激的脾脏淋巴细胞CD11c+MHC-II+细胞，CD3+CD4+CXCR5+细胞，F4/80+CD11b+MHC-II+细胞百分比显著高于未刺激的脾脏淋巴细胞(对照组)，说明Sjp90α-1肽能够显著诱导树突状细胞，Tfh细胞以及巨噬细胞增加(图2)。
(3)小鼠骨髓来源树突状细胞的制备(BMDCs)：首先从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞。将获得的细胞接种于24孔培养板中，置于RPMI完全培养基中。加入20ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导BMDCs分化。所有培养物在第3天和第5天更换一半培养基和细胞因子。第7天收集细胞供后续使用。
(4)采用CD4+T细胞分离试剂盒(STEMCELL)从小鼠脾脏淋巴细胞中阴性选择CD4+T细胞，以4×105细胞/mL重悬在新鲜完全培养基中，用Sjp90α-1肽刺激BMDCs24h后，将刺激和未刺激的BMDCs分别与CD4+T细胞在12孔板中共培养(直接共培养)，BMDCs:CD4+T细胞比例为1:1，结合4×105BMDCs(置于顶部插入物中)。共孵育第2天采用流式细胞术检测CD4+T细胞分化情况。
结果显示：与Sjp90α-1肽刺激的BMDCs共培养的CD4+T细胞分化的Tfh细胞百分比显著高于与未刺激的BMDCs共培养的CD4+T细胞分化的Tfh细胞百分比，并且没有与BMDCs共培养只用Sjp90α-1肽刺激的CD4+T细胞分化能力与对照组没有差异，说明Sjp90α-1肽激活的BMDCs是诱导CD4+T细胞分化为Tfh细胞的必要条件(图3)。
实施例2验证Sjp90α-1肽的特异性和交叉反应性：
将筛选的最优多肽Sjp90α-1与具有高度免疫原性的KLH蛋白偶联，制备针对Sjp90α-1的特异性多克隆抗体，包括以下步骤：
(1)MBS法偶联KLH载体蛋白制备抗原：多肽KGKSVAADNGPTVAPC，溶解于PBS缓冲溶液中，巯基偶联到钥孔血蓝蛋白KLH上。
(2)免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体：将偶联KLH的Sjp90α-1多肽混合物与弗氏完全佐剂等体积混合，分别皮下注射免疫2只日本大耳白兔，在一免后每个节点12、26、40、54d，将制备好的抗原与弗氏不完全佐剂混合进行2次加强免疫，每次免疫剂量为0.35mg/只；免疫67d后心脏采血，分离血清获取Sjp90α-1多克隆抗体。
(3)抗血清纯化：抗血清用KGKSVAADNGPTVAP-C作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的Sjp90α-1肽抗体。
(4)抗血清DB(斑点印迹杂交法)测定多克隆抗体效价：将抗原多肽用PBS稀释成50ng/μl，用2.5μL移液器利用反向吸液的方式每小方格取50ng/μL相应多肽稀释液2μL，点在膜(白色)上1cm×1cm正方形小格中心，即多肽包被量为100ng。点样完成后，将NC膜放入37℃烘箱中30min。然后封闭1h，将上述制备的多克隆抗体Sjp90α-1用封闭液进行倍比稀释，分别为肽抗体稀释比例为1:1000，1:5000，1:10000，1:50000，1:100000，1:200000。洗掉封闭液，并在每孔中加入相应的一抗稀释液1mL，室温孵育2h。TBST洗涤5次，5min/次；向每孔中加入1ml经1:8000稀释的酶标二抗(山羊抗兔-HRP)，孵育1h，TBST洗板5次；ECL显色液曝光。
用抗原多肽包被，将制备的肽抗体以不同比例稀释，与相应的二抗共孵育，显色液曝光结果显示：在1:200000的稀释比例下仍有明显显色，说明肽抗体浓度较高，效价较好(图4)。
(5)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sjp90α-1肽特异性：将实验室保存的Sjp90α原核表达蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，300mA转60min至PVDF膜，将实验室保存的日本血吸虫虫卵抗原SEA蛋白为阳性对照，后续封闭与洗脱参考肽抗体效价检测。显色液曝光。
日本血吸虫虫卵抗原SEA蛋白作为阳性对照，通过比较日本血吸虫热休克蛋白Sjp90α和SEA与所制备的Sjp90α-1肽表达的特异性结果显示：在29kDa位置有条带，而其他位置无特异性条带即可说明制备Sjp90α-1肽的特异性好(图5A)。
(7)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sjp90α-1肽的交叉反应性：将实验室保存的小鼠单核巨噬细胞(RAW)和人单核细胞(Thp1)培养并提取蛋白作为对照，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，300mA转60min至PVDF，后续封闭并洗脱，最后显色液曝光。通过比较小鼠来源的其他细胞和人来源的细胞中Sjp90α-1肽的表达情况，可以说明所制备的Sjp90α-1肽无交叉反应性(图5B)。
实施例3日本血吸虫感染进行早期诊断
该实施例采用日本血吸虫感染小鼠，提供了一种采用上述制备的Sjp90α-1肽包被通过ELISA检测可以对日本血吸虫感染进行早期诊断的实验方案，具体操作步骤如下：
(1)每只鼠经腹部皮肤接种日本血吸虫尾蚴(15±1)条。
(2)分别于日本血吸虫感染后0、1、2、3、4、5周使用抗凝管无菌取鼠尾血，室温静置半小时，2000rpm离心20min取血清。
(3)用Sjp90α-1肽(10μg/mL,100μL/well)包被酶标板,立即用封板膜封上，置于2-8℃过夜或37℃孵箱2h。倒出孔中溶液，用300μl的洗液洗涤2次。
(4)封闭：每孔加入1％BSA，37℃2小时，或者2-8℃封闭过夜。
(5)弃掉封闭液，用300μl的洗液洗涤2次。所有稀释后血清样本用PBS以1：10比例稀释(100μL/孔)，加入孔中，37℃孵育1～2小时。PBST洗涤5次(100μL/孔)。
(6)加入Goat anti-mouse IgG(H+L)(1:10 000，100μL/孔)，在37℃条件下孵育1h。PBST洗5次(100μL/孔)。
(7)每孔加入100μl的显色底物。
(8)每孔快速加入100μl终止液终止酶活反应。为了完全抑制酶活，终止液要均匀地覆盖微孔。加入终止液后，须立即读数，或者置于黑暗中2-8℃1个小时。测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下样本和标准品的OD值。
将日本血吸虫感染小鼠不同周期的血清分别与日本血吸虫热休克蛋白Sjp90α-1共孵育，后洗脱曝光显示样本OD值。通过比较各周期OD值判断血清中Sjp90α-1肽抗体表达量的差异。
如图6A所示，感染日本血吸虫小鼠血清中Sjp90α-1肽抗体水平较未感染小鼠血清中肽抗体水平显著增加，并且随着感染周期的增加而逐步升高。说明日本血吸虫热休克蛋白Sjp90α-1肽抗体可以在早期有效的诊断出日本血吸虫的感染情况。
如图6B所示，Sjp90α-1肽抗体与日本血吸虫病ROC曲线：AUC为0.9394，灵敏度和特异度分别为90.36％、83.33％。
综上，以日本血吸虫感染小鼠模型说明，本发明中日本血吸虫热休克蛋白Sjp90α-1肽具有对日本血吸虫感染早期诊断的潜能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多肽Sjp90α-1，其特征在于，所述多肽Sjp90α-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：KGKSVAADNGPTVAPC。
2.根据权利要求1所述的多肽Sjp90α-1，其特征在于，所述多肽Sjp90α-1来源于日本血吸虫。
3.根据权利要求1所述的多肽Sjp90α-1，其特征在于，所述多肽Sjp90α-1刺激的树突状细胞诱导CD4+T细胞分化为Tfh细胞，进而促进B细胞产生Sjp90α-1肽抗体。
4.Sjp90α-1肽抗体，其特征在于，所述Sjp90α-1抗体由多肽Sjp90α-1诱导产生。
5.权利要求1所述的多肽Sjp90α-1作为检测标志物在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
6.权利要求4所述的Sjp90α-1肽抗体作为检测靶点在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
7.检测权利要求1所述的Sjp90α-1肽的试剂或检测权利要求4所述的Sjp90α-1肽抗体的试剂在制备诊断早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的试剂中的应用。
8.根据权利要求5至7任意一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
9.根据权利要求5至7任意一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
10.一种早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的诊断试剂，其特征在于，包含检测权利要求1所述多肽Sjp90α-1和/或检测权利要求4所述的Sjp90α-1肽抗体的试剂。
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