CN113912719B - 检测小鼠白介素6的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测小鼠白介素6的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于免疫分析技术领域。本发明中利用人工合成的小鼠白介素6基因，经重组质粒、蛋白质表达、动物免疫和筛选，最终亚克隆获得杂交瘤细胞株20‑A4‑D5和杂交瘤细胞株10‑B8‑C9；将所述杂交瘤细胞株20‑A4‑D5分泌的抗体用吖啶酯标记得到检测抗体，所述杂交瘤细胞株10‑B8‑C9分泌的抗体用生物素标记得到捕获抗体，再将检测抗体和捕获抗体应用于检测小鼠白介素6的化学发光试剂盒中。本发明中提供的试剂盒检测灵敏度高、精密度好、线性范围宽，对抗原的反应特异性好，不会产生交叉反应。

Description

检测小鼠白介素6的单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及化学发光免疫分析技术，具体涉及用于检测小鼠白介素6的单克隆抗体及所述单克隆抗体的制备方法和应用。
背景技术
白细胞介素又称白介素，小鼠白介素6(IL-6或IL6)是一种多效性、α-螺旋、22-28kDa磷酸化和可变糖基化的细胞因子，在急性期反应、炎症、造血、骨代谢和癌症进展中发挥重要作用。IL-6与肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1(IL-1)一起驱动急性炎症反应。IL-6几乎完全负责肝脏的发热和急性期反应，并且在从急性炎症到获得性免疫或慢性炎症疾病的过渡过程中发挥非常重要的影响。IL-6除在炎症和免疫学方面发挥功能外，还可在脑血管、心脏、肿瘤以及感染性疾病中起重要作用。在脑血管疾病方面，IL-6的水平与Glasgow昏迷评分有关、与认知能力衰减有关、可诊断急性脑梗塞、预测诊断流感病毒性脑病。心脏方面，IL-6与冠心病的发病机制密切相关、诱导心肌细胞肥大反应的心肌营养素1属于IL-6细胞因子家族。感染性疾病方面，IL-6可作为重症胰腺炎的早期诊断指标、与各型狼疮性肾炎有关。肿瘤方面，IL-6水平可用于观察和监测肾细胞癌、肺癌、膀胱癌的发生发展。肾科方面，尿液IL-6水平可用于监测返流性肾病。其他方面，IL-6可用于判断休克的程度和治疗休克的疗效、IL-6参与肝纤维化的形成、血清IL-6的升高程度与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征病情有关。因此，准确定量地测定血清中IL-6的含量对疾病的早期诊断、病情评估、疗效监控和预后判断具有非常重要的意义。
目前临床上对IL-6检测的免疫学方法主要酶联免疫吸附试验法(ELISA)、免疫放射法(RIA)、电化学免疫法(ECI)、化学发光免疫分析法(CLIA)等。放射免疫法存在有效期短、放射性污染的缺点。ELISA方法通常只适用手工操作，不利于高通量的全自动检测仪器的检测，加大了实验结果人为因素引起的误差；并且ELISA方法人工操作步骤繁琐，容易出错，检测灵敏度也较低(通常只能达到ng/mL的检测限)，线性范围窄。免疫放射法的检测范围较窄，通常为5～200pg/mL。电化学免疫法的最低检出限为1.5pg/mL。化学发光免疫分析法对人源IL-6的检出限为0.5pg/mL。可见，化学发光免疫分析法的检测灵敏度相对于其他方法更高。
中国专利申请CN112129950A中公开了一种检测白介素6的磁微粒化学发光试剂盒，包括包被抗白介素6抗体的磁微粒悬浮液、酶标抗体、化学发光底物液和酶标抗体用缓冲液；酶标抗体用缓冲液包含以下浓度组分：磷酸氢二钠25～100mmol/L，磷酸二氢钠25～100mmol/L，氯化钠25～150mmol/L，蛋白保护剂0.5～2wt％，ProClin 3000.03～0.1wt％，Tetronic 1307 1～2wt％，BTA-40 1～2wt％。该专利申请通过在酶标抗体用缓冲液中使用Tetronic 1307与BTA-40两种表面活性剂联用，增加抗原抗体反应概率的同时加快抗原抗体反应时间，从而提高试剂的灵敏度和准确性。该专利申请中以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记白介素6单克隆抗体或多克隆抗体，再通过酶与其对应的化学发光底物反应产生可检测的吸收光。检测灵敏度受磁球分散程度、抗原与抗体结合率、酶与化学发光底物结合率的影响。
发明内容
本发明提供了一种检测小鼠白介素6的化学发光试剂盒，主要采用吖啶酯和生物素分别标记小鼠白介素6单克隆抗体的直接化学发光的方法，来提高小鼠白介素6的检测线性范围和灵敏度。
为了实现上述目的，本发明首先制备了小鼠白介素6单克隆抗体，所述单克隆抗体包括第一抗体和第二抗体；所述第一抗体包括重链可变区HCDR1～HCDR3和轻链可变区LCDR1～LCDR3；所述第二抗体包括重链可变区HCDR4～6和轻链可变区LCDR4～6；所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～3所示；所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～6所示；所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.7～9所示；所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.10～12所示。
优选的，所述第一抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
优选的，所述第二抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
将上述单克隆抗体应用于检测小鼠白介素6的化学发光试剂盒中，其中，所述第一抗体用吖啶酯标记得到检测抗体，所述第二抗体用生物素标记得到捕获抗体。
优选的，所述第一抗体由杂交瘤细胞株20-A4-D5分泌获得，所述第二抗体由杂交瘤细胞株10-B8-C9分泌获得；所述杂交瘤细胞株20-A4-D5和所述杂交瘤细胞株10-B8-C9的制备方法包括如下步骤：
S1、将小鼠白介素6的基因重组到表达载体质粒pATX1中得到IL6-pATX1表达载体，克隆位点为EcoRI/XhoI；将所述IL6-pATX1表达载体转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行柱纯化得到小鼠白介素6；
S2、用步骤S1得到的小鼠白介素6免疫若干大鼠，检测血清效价后，进行细胞融合，通过筛选得到若干株杂交瘤细胞株；
S3、培养步骤S2中得到的若干株杂交瘤细胞株，将分泌的抗体分别用吖啶酯和生物素进行标记；
S4、选择步骤S3所得任一种吖啶酯标记的抗体、任一种生物素标记的抗体进行两两配对，再与含有小鼠白介素6的溶液同时孵育、清洗、磁性分离，得到若干组双抗体夹心复合物；筛选出最佳配对的吖啶酯标记的抗体和生物素标记的抗体，即获得对应的最佳配对的杂交瘤细胞株20-A4-D5和杂交瘤细胞株10-B8-C9。
所述试剂盒中，通过将吖啶酯标记的抗体、生物素标记的抗体与小鼠白细胞介素6一起放入孵育槽中孵育，使吖啶酯标记的抗体和生物素标记抗体分别与小鼠白细胞介素6结合得到双抗体夹心复合物。所用的交瘤细胞株20-A4-D5和杂交瘤细胞株10-B8-C9是从筛选出的若干种不同的杂交瘤细胞株中进一步筛选出的。
所述试剂盒中，除包含有吖啶酯标记的抗体和生物素标记的抗体外，还包含有市面上常用的小鼠白介素6标准品、小鼠白介素6质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记碳酸盐(CBS)缓冲液、生物素标记碳酸盐(CBS)缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠及磁珠稀释液、标准品和质控品稀释液；这些试剂的配制方法均为常见的配制方法。
生物素标记的抗体，是先将第二抗体与生物素结合，然后加入已预先包埋了亲和素的磁珠，搅拌后施加外磁场，最终筛选而得到。亲和素是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，可以与生物素结合。当生物素标记的第二抗体加入到包埋有亲和素的磁珠后，就将第二抗体稳定结合在磁珠上得到捕获抗体。一般情况下，假如通过间接ELISA筛选获得了12株杂交瘤细胞株，则需要将这12株杂交瘤细胞株分别用吖啶酯标记和生物素标记，然后一对一地进行配对制备双抗体夹心复合物，即一共有144组双抗体夹心复合物，然后统一进行化学发光检测筛选。
所述化学发光检测筛选的具体方法为：
取上述制备的若干组双抗体夹心复合物，取0.15mol/L硝酸、0.1v/v％双氧水、发光激发液A 100μL，立即放入化学发光免疫检测仪内，仪器自动加入0.2mol/L氢氧化钠溶液，2v/v％Triton-100发光激发液B 100μL；检测累计时间为12s，检测各孔的发光强度(RLU)。根据发光强度与待测样本的浓度成正比的关系，从而获得采用不同双抗体夹心复合物检测出的标准品的浓度，最终筛选出检测结果与标准品实际浓度最接近的配对组合即为最佳配对组合。
步骤S2中细胞融合的方法为：
S21-1、将已进行免疫的大鼠固定，然后颈椎脱臼处死大鼠，置于75％的酒精中消毒至少30秒；
S21-2、取大鼠全血于室温下静置1小时，然后在4℃下过夜保存；次日将大鼠全血在5000rpm速度下离心10min，小心吸取上层血清做为杂交瘤筛选阳性对照，分装后置于-20℃下保存；
S21-3、取出大鼠脾脏，分别取3个直径为10cm的培养皿，分别加入15mL 1640基本培养基；在第一个培养皿中漂洗脾脏一次；在第二个培养皿中用镊子去除脾脏表面残留结缔组织(注意不要撕破脾脏被膜)；在第三个培养皿中，用两个载玻片磨砂面轻轻碾磨，碾破脾脏被膜后，即可得到脾细胞；
S21-4、用15mL移液管吸取碾磨充分的脾细胞悬液经细胞筛过滤，转移到50mL的无菌离心管中；再次吸取15mL 1640基本培养基反复冲洗培养皿2-3次后经细胞筛过滤，转移到上述无菌离心管中，经1000rpm速度离心5min；
S21-5、弃去离心后上清液，用15mL 1640基本培养基反复吹打20次，充分悬浮脾细胞沉淀，再添加35mL 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，在1000rpm速度下离心5min；
S21-6、重复步骤S21-5一次；然后弃去上清液，用10mL 1640基本培养基反复吹打20次，重悬脾细胞沉淀；取出约1.0mL细胞悬液，经50倍稀释后进行脾细胞计数，融合之前室温放置；
S21-7、在大鼠脾细胞离心期间，将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)收集在50mL无菌离心管中，在1200rpm速度下离心8min；
S21-8、弃去上清液，用10mL 1640基本培养基反复吹打20次，悬浮骨髓瘤细胞沉淀，再添加35mL 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，在1200rpm速度下离心8min；
S21-9、重复步骤S21-8一次，弃去上清液，用10mL 1640基本培养基反复吹打20次重悬骨髓瘤细胞沉淀；取出约1.0mL细胞悬液，经50倍稀释后进行细胞计数，融合前室温放置；
S21-10、融合开始前，打开恒温水浴锅，将温度调到37℃；将聚乙二醇(PEG)和1640基本培养基放在水浴锅中预热；
S21-11、根据细胞计数结果，将所需的脾细胞和骨髓瘤细胞分别混匀后按5:1比例在50mL离心管中混合；然后在1200rpm速度下离心8min，弃去上清液，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀；
S21-12、将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG(1min内加入1mL)；加入PEG过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端轻轻地搅拌，静置80s；匀速加入已预热的1640基本培养基(第一次)：1min内加入1mL，边加边轻轻地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第二次)：1min内加入2mL，边加边轻轻地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第三次)：3min内加入9mL，边加边轻轻地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第四次)，边加边轻轻地搅拌直至离心管中液体体积为45mL，将离心管置于37℃水浴中静置5min；
S21-13、将已融合的细胞悬液在600rpm速度下离心6min，弃去上清液，松动细胞沉淀；加入10mL HAT培养基，温柔地吹打10次悬浮细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96孔细胞培养板。
步骤S2中的筛选方法为间接ELISA筛选，包括以下步骤：
S22-1、包被：取抗原用包被液稀释至1-2μg/mL，根据所需的孔计算出所需的包被液的量，每孔加100μL，在37℃保温1h后置于4℃过夜；
S22-2、封闭：次日取出酶标板用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)加满各孔，用PBST洗涤3次，每次五分钟，每次充分拍干；然后每孔加入250μL的封闭液(1％BSA或者5％脱脂乳)，在37℃下保温2h，用PBST洗涤3次；
S22-3、加一抗：按一定比例稀释相应的某杂交瘤细胞株分泌的抗体上清液(一抗)，每孔加100μL稀释液。设置阴性对照和空白对照，阴性对照为对应的大鼠进行免疫之前的血清，空白对照为磷酸盐缓冲液，在37℃作用1h，用PBST洗涤3次；此步骤是稀释受检血清，使血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；
S22-4、加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG的抗体：将其按1:1000的比例稀释，每孔加入100μL，37℃作用1h，PBST洗涤3次；此步目的是加酶标抗免疫球蛋白(酶标抗体)，它与一抗相结合，从而使该抗体间接的标记上酶，清洗后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量；
S22-5、加底物：每孔加入100μL的底物反应液(现配现用，避光)，置于37℃下30min，然后取出加入2mol/L的H2SO4终止反应；加底物显色，颜色深度代表标本中受检抗体量；
S22-6、酶标仪测OD450值，以OD450值大于3倍阴性对照孔的值为标准，筛选出对应的一抗及对应的单克隆细胞株。
优选的，步骤S3中，抗体用吖啶酯标记的方法包括以下步骤：
S311、将吖啶酯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中配制成浓度为3mg/mL的吖啶酯溶液；
S312、将步骤S2中得到的若干株杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.8，使抗体的终浓度为2.5-3mg/mL，得抗体溶液I；
S313、按每毫克抗体加20μL所述吖啶酯溶液的比例，将所述吖啶酯溶液和所述抗体溶液I混合后于27℃避光搅拌2.5h；
S314、加入赖氨酸终止反应，于27℃避光搅拌1小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次，得到吖啶酯标记的第一抗体即为检测抗体。
优选的，步骤S3中，抗体用生物素标记的方法包括以下步骤：
S321、将生物素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中配制成浓度为15mg/mL的生物素溶液；
S322、将步骤S2中得到的若干株杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.8，使抗体的终浓度为2.5-3mg/mL，得抗体溶液II；
S323、按每毫克抗体加10μL所述生物素溶液的比例，将所述生物素溶液和所述抗体溶液II混合后于室温避光搅拌2h；
S324、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次；
S325、将步骤S324所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液，于27℃避光搅拌2h，得到生物素标记的第二抗体即为捕获抗体。
优选的，步骤S4中，选择步骤S3所得任一种吖啶酯标记的抗体、任一种生物素标记的抗体进行两两配对的方法为十字交叉配对法。十字交叉法能够减少实验的检测样本数量，节省时间，不采用十字交叉法而采用一一配对的方法也同样能达到筛选的目的。
优选的，步骤S4中，清洗、磁性分离的方法为：对孵育后的产物溶液施加外加磁场，然后去除上清液，用pH值为7.4的含0.05v/v％吐温-20的0.015mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次，去除上清液，去除外加磁场后即得到双抗体夹心复合物。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明筛选出合适的两种单克隆抗体，并将第一抗体用吖啶酯标记，第二抗体用生物素标记，将两种标记的抗体用于制备小鼠白介素6检测的试剂盒中，该两种标记的抗体与IL6结合后得到的双抗体夹心复合物进行化学发光检测，显著提高了检测IL6的灵敏度和精密度，线性范围宽，对抗原的反应特异性好，不会产生交叉反应。
附图说明
图1为实施例1的步骤S1中对表达载体IL6-pATX1进行电泳验证的电泳图；
图2为实施例1的步骤S1中对纯化后的IL6进行SDS-PAGE电泳的电泳图；
图3为实施例1制备的试剂盒与R&D试剂盒检测临床样品相关性的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
实施例1
本实施例中检测小鼠白细胞介素6的单克隆抗体包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体由杂交瘤细胞株20-A4-D5分泌，所述第二抗体由杂交瘤细胞株10-B8-C9分泌，所述杂交瘤细胞株20-A4-D5和所述杂交瘤细胞株10-B8-C9采用如下方法制备：
S1、人工合成小鼠白细胞介素6基因，将所述小鼠白细胞介素6基因重组到表达载体质粒pATX1中，得到IL6-pATX1表达载体，对载体进行电泳验证，结果如图1所示；由图1可知，克隆位点为EcoRI/XhoI，小鼠白细胞介素6基因的序列如SEQ ID No.13所示；将所述IL6-pATX1表达载体转染到293F细胞系中培养6天，收集上清液进行镍柱纯化得到小鼠白细胞介素6(IL6)；纯化后的IL6进行SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，结果如图2所示，从图2可知，纯化后的IL6纯度达到95％以上；
S2、用小鼠白细胞介素6免疫10只采购自湖北省实验动物研究中心的SD大鼠，每只大鼠免疫至少4次，取第3、4次免疫后的血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接ELISA筛选，得到12株杂交瘤细胞株，如下表1所示；
表1间接ELISA筛选得到的杂交瘤细胞株
2-A9-F6 6-H3-B12 10-B8-C9 20-A4-D5 35-D9-E12 65-F1-A6
68-B4-H12 77-G3-E3 80-H5-G8 95-D1-C5 101-C2-D12 150-I6-D1
S3、将步骤S2所得的12株杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的抗体和生物素标记的抗体，并配制小鼠白介素6标准品和质控品；
其中用吖啶酯标记抗体的方法包括以下步骤：
S311、将吖啶酯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中配制成浓度为3mg/mL的吖啶酯溶液；
S312、将步骤S2中得到的若干株杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.8，使抗体的终浓度为3mg/mL，得抗体溶液I；
S313、按每毫克抗体加20μL所述吖啶酯溶液的比例，将所述吖啶酯溶液和所述抗体溶液I混合后于27℃避光搅拌2.5小时；
S314、加入赖氨酸终止反应，于27℃避光搅拌1小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液4次，得到吖啶酯标记的抗体；
用生物素标记抗体的方法包括以下步骤：
S321、将生物素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中配制成浓度为15mg/mL的生物素溶液；
S322、将步骤S2中得到的若干株杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.8，使抗体的终浓度为3mg/mL，得抗体溶液II；
S323、按每毫克抗体加10μL所述生物素溶液的比例，将所述生物素溶液和所述抗体溶液II混合后于室温避光搅拌2.5小时；
S324、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液4次；
S325、将步骤S324所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液，于27℃避光搅拌2.5小时，得到生物素标记的抗体；所用的磁珠通过购买获得，货号为JSR，Magnoshphere-MS160/Streptavidin；
S4、将步骤S3所得任一种吖啶酯标记的抗体、任一种生物素标记的抗体进行两两配对，配对实验开始前需要将以下试剂稀释成工作浓度；
生物素标记的抗体，工作浓度为0.2μg/mL～2μg/mL；所用的抗体稀释缓冲液为R1：配置20mmol/L HEPES缓冲液，pH＝7.4，然后分别加入BSA 30g，蔗糖50g，甘氨酸2g，Tween-20 5mL，NaN3 0.5g，充分溶解后，用HEPES缓冲液定容至1L；
吖啶酯标记的抗体，工作浓度为0.1μg/mL～1μg/mL。所用的抗体稀释缓冲液为R2：配置20mmol/L HEPES缓冲液，pH＝5.5，然后分别加入BSA 30g，蔗糖20g，甘氨酸20g，Tween-20 5mL，NaN3 0.5g，充分溶解后，用HEPES缓冲液定容至1L；
准备磁珠，磁珠稀释液为：配置50mmol/L PBS溶液，pH＝7.4，加入BSA 2g，NaN30.5g，Tritonx-100 5mL，充分溶解后，用PBS缓冲液定容至1L；磁珠的终浓度为1～5mg/mL；
小鼠白细胞介素6标准品和质控品，工作浓度为1μg/mL，稀释液为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；
将上述4种试剂按照全自动化学发光仪器使用说明放入到对应的试剂仓中，进行上机操作；在全自动化学发光仪器中自动完成双抗体夹心复合物的制备以及筛选最佳配对的吖啶酯标记的抗体和生物素标记的抗体；
将分组配对后得到的12×12共144组双抗体夹心复合物进行筛选，例如，将杂交瘤细胞株20-A4-D5分泌的抗体进行吖啶酯标记后，与所有12株杂交瘤细胞株分泌的被生物素标记的抗体(包括杂交瘤细胞株20-A4-D5分泌的被生物素标记的抗体)进行双抗夹心配对筛选；最终经筛选得到4对检测抗体和捕获抗体可以作为双抗夹心复合物检测小鼠白细胞介素6标准品，然后将这4对配对抗体分别检测10例血清样本，每例样本重复检测3次后取检测结果的平均值，计算3次检测的变异系数，结果分别见表2、表3、表4和表5。
表2第一对配对抗体检测结果的变异系数
Figure BDA0003384763330000101
/>
表3第二对配对抗体检测结果的变异系数
Figure BDA0003384763330000102
Figure BDA0003384763330000111
表4第三对配对抗体检测结果的变异系数
Figure BDA0003384763330000112
/>
表5第四对配对抗体检测结果的变异系数
Figure BDA0003384763330000113
Figure BDA0003384763330000121
通过上述比对发现，由杂交瘤细胞株20-A4-D5分泌的被吖啶酯标记的抗体和由杂交瘤细胞株10-B8-C9分泌的被生物素标记的抗体检测阳性血清信号值高，变异系数小，因此杂交瘤细胞株20-A4-D5和10-B8-C9为最佳配对，它们分别分泌的单克隆抗体即为第一抗体和第二抗体。
通过测序获得第一抗体和第二抗体的重链和轻链完整序列，然后根据Kabat规则(参考文献：Kabat E.A.,Wu T.T.,Bilofsky H.Attempts to locate residuesincomplementarity-determining regions of antibody combining sites thatmakecontact with antigen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976；73:617–619)即可得到重链和轻链的CDR区的序列。
所得第一抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，所得第一抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
最终得到所述第一抗体的重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。
所述第一抗体的轻链可变区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。
所得第二抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，所得第二抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
所述第二抗体的重链可变区HCDR4、HCDR5、HCDR6的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示。
所述第二抗体的轻链可变区LCDR4、LCDR5、LCDR6的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。
将吖啶酯标记的第一抗体和生物素标记的第二抗体应用于检测小鼠白细胞介素6的化学发光试剂盒中，试剂盒中还包括小鼠白细胞介素6标准品、小鼠白细胞介素6质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记的碳酸盐(CBS)缓冲液、生物素标记的碳酸盐(CBS)缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠稀释液、标准品稀释液和质控品稀释液。
1、灵敏度的检测
参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)发布的《临床实验室检验程序检测能力评价指南(第2版)》(EP17A)的实验方案，计算定量检测小鼠白细胞介素6含量的化学发光试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度＜1.5pg/mL，具有非常高的灵敏度。
2、线性范围的检测
选择浓度为0、6.25pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、400pg/mL的IL6标准品；所用的标准品稀释液为：900mL去离子水，加入Na2HPO4 11.45g，NaH2PO4 2.28g，蔗糖30g，甘氨酸1g，Tritonx-100 5mL，NaN3 0.5g，充分溶解后，用去离子水定容至1L。
采用上述化学发光试剂盒对上述不同浓度的标准品做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.999，该化学发光试剂盒对小鼠白细胞介素6的检测的线性范围为6.25-400pg/mL。
3、精密度的检测
取浓度为10pg/mL的低浓度IL6样品和300pg/mL高浓度IL6样品，每个样品每个浓度各做3次平行测试，用3批试剂盒进行检测，计算上述化学发光试剂盒批内及批间差，结果表明上述化学发光试剂盒批内及批间差均＜3％。
4、与R&D试剂盒检测临床样品相关性：
采用上述化学发光试剂盒与R&D Mouse IL-6Quantikine ELISA Kit(Double-antibody Sandwich)试剂盒检测同一批次的样品，根据所得结果比较两者的相关性，结果见表6和图3。
表6实施例1的试剂盒与R&D试剂盒检测临床样品相关性结果
Figure BDA0003384763330000131
Figure BDA0003384763330000141
利用本实施例的上述方法筛选得到的最佳配对抗体，对17例小鼠血清样本进行检测，获得了血清中IL6的浓度值，并同时利用R&D试剂盒对该批样本进行了检测，绘制散点图。结合表6和图3可知，该试剂盒测定的小鼠血清样本中IL6的浓度值，具有明显差异性，与R&D检测数据的相关性非常好。
比对试验：对小鼠白细胞介素6浓度6.25-400pg/mL线性拟合后，回归方程Y＝0.001X+0.2836，R2＝0.9995，参照EP9-A3文件，计算医学决定水平处的偏移；以国家卫计委临床检验中心室间质评1/2Tea(15％)为可接受标准计算医学决定性水平处的偏移，计算结果为3.66％，偏移小于1/2Tea，比对通过。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 检测小鼠白介素6的单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Leu Ser Asp Phe Trp Asp Arg Tyr
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Arg Glu Lys Gly Arg Gly Phe Ser Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Gly Lys Thr Ala Ser Pro Tyr Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ser His Phe Ile Ser Glu Glu Asn Met Lys Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Gln Ser Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Phe Tyr Asp Ser Pro Phe
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Phe Thr Val Ser Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Ser Gly Ser Ser Gly Tyr Val
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Arg Asp Gly Ser Gly Thr Gln Phe Tyr Asp Phe
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Gln Val Ser Arg Phe Ser
1 5
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ser Asn Asp
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Val Glu His Ser Ser Arg Thr Lys Thr
1 5
<210> 13
<211> 683
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaattcgccg ccaccatgaa gttcctgagc gcccgcgact tccaccccgt ggccttcctg 60
ggcctgatgc tggtgaccac caccgccttc cccaccagcc aggtgcgccg cggcgacttc 120
accgaggaca ccacccccaa ccgccccgtg tacaccacca gccaggtggg cggcctgatc 180
acccacgtgc tgtgggagat cgtggagatg cgcaaggagc tgtgcaacgg caacagcgac 240
tgcatgaaca acgacgacgc cctggccgag aacaacctga agctgcccga gatccagcgc 300
aacgacggct gctaccagac cggctacaac caggagatct gcctgctgaa gatcagcagc 360
ggcctgctgg agtaccacag ctacctggag tacatgaaga acaacctgaa ggacaacaag 420
aaggacaagg cccgcgtgct gcagcgcgac accgagaccc tgatccacat cttcaaccag 480
gaggtgaagg acctgcacaa gatcgtgctg cccaccccca tcagcaacgc cctgctgacc 540
gacaagctgg agagccagaa ggagtggctg cgcaccaaga ccatccagtt catcctgaag 600
agcctggagg agttcctgaa ggtgaccctg cgcagcaccc gccagaccgg cagccaccac 660
caccaccacc actgagcggc cgc 683
<210> 14
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Leu Ser Asp Phe Trp Asp
20 25 30
Arg Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Ala Pro Glu Trp
35 40 45
Leu Gly Phe Ile Arg Glu Lys Gly Arg Gly Phe Ser Thr Glu Tyr Asn
50 55 60
Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn
65 70 75 80
Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Lys Thr Ala Ser Pro Tyr Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro
115 120 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met
130 135 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys
210 215 220
Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
245 250 255
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
290 295 300
Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe
305 310 315 320
Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met
340 345 350
Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys
355 360 365
Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp
385 390 395 400
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu
405 410 415
Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 15
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Thr Leu Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser His Phe Ile Ser
20 25 30
Glu Glu Asn Met Lys Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gln Ser Ala Ser Thr Arg Gln
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Leu Gln Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Met Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Thr Val Val Cys Phe
130 135 140
Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp
145 150 155 160
Gly Ser Glu Gln Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys
180 185 190
Val Glu Tyr Glu Arg His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys
195 200 205
Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215 220
<210> 16
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Ser Phe Thr Val Ser Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Val Ser Gly Ser Ser Gly Tyr Val Tyr Tyr Ala Glu Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Gly Ser Gly Thr Gln Phe Tyr Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly
210 215 220
Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
260 265 270
His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
290 295 300
Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys
305 310 315 320
Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro
340 345 350
Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Gln Val Ser Arg Phe
20 25 30
Ser Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Met Ser Asn Asp Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Val Glu His Ser Ser Arg
85 90 95
Thr Lys Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105 110
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Met Glu Gln Leu Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Ala Thr Val Val Cys Phe Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gln Arg Asp Gly
145 150 155 160
Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Val Glu Tyr Glu Arg His Asn
180 185 190
Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215

Claims (4)

1.检测小鼠白介素6的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为第一抗体或第二抗体；所述第一抗体包括重链可变区HCDR1~HCDR3和轻链可变区LCDR1~LCDR3；所述第二抗体包括重链可变区HCDR4~6和轻链可变区LCDR4~6；所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1~3所示；所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4~6所示；所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.7~9所示；所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.10~12所示。
2.根据权利要求1所述的检测小鼠白介素6的单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
3.根据权利要求1所述的检测小鼠白介素6的单克隆抗体，其特征在于，所述第二抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
4.一种检测小鼠白介素6的化学发光试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的第一抗体和第二抗体，其中，所述第一抗体用吖啶酯标记得到检测抗体，所述第二抗体用生物素标记得到捕获抗体。
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