CN117304314A - Aqp4抗体及其应用 - Google Patents

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CN117304314A CN202311275512.4A CN202311275512A CN117304314A CN 117304314 A CN117304314 A CN 117304314A CN 202311275512 A CN202311275512 A CN 202311275512A CN 117304314 A CN117304314 A CN 117304314A
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Abstract

本发明提供了AQP4抗体及其应用。具体地，本发明提供AQP4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；或者所述重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的LCDR1，如SEQ ID NO:15所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:16所示的LCDR3。经过CBA和TBA方法的验证，本发明的AQP4单克隆抗体都可以成功地特异性地识别AQP4抗原的胞外区。

Description

AQP4抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及AQP4抗体及其应用。
背景技术
中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，是一种与自身免疫相关的疾病，与多种自身抗体相关，包括：抗水通道蛋白4(AQP4)抗体、抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、抗髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体和抗髓鞘相关糖蛋白抗体。其中以AQP4抗体最为常见，AQP4阳性的患者约占该类疾病的75％以上。
AQP4抗体目前商业的单抗有以下几种：Thermo的MA5-35079和Sigma的AMAB90537为鼠单抗，并且它们都是识别AQP4的C末端(256-323位氨基酸)抗原；而CST公司的59678为兔单抗，也是使用C末端未知的抗原；另外还有abcam的鼠单抗ab9512，它使用的抗原为AQP4C端的301-318aa肽段。因此这些AQP4单抗识别的抗原表位都是集中在AQP4的羧基端，并且位于胞内区。因此在做免疫反应时都需要对细胞或者组织进行通透处理，这样抗体才能进入细胞并且和AQP4抗原的C末端反应。
发明内容
针对现行AQP4单抗的不足，即，它们都是识别胞内区，且为动物来源，本发明提供了一种人源AQP4抗体或其抗原结合片段。经过CBA和TBA方法的验证，本发明得到的2种AQP4单克隆抗体都可以成功地特异性地识别AQP4抗原的胞外区。
因此，一方面，本发明提供了一种AQP4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
或者所述重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的LCDR1，如SEQ ID NO:15所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:16所示的LCDR3。
在一些实施方式中，所述AQP4抗体或其抗原结合片段的重链可变区可以包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述AQP4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区可以包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述AQP4抗体或其抗原结合片段的重链可变区可以包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:17具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述AQP4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区可以包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:18具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述AQP4抗体或其抗原结合片段可以包含重链和轻链，所述重链可以包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链可以包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述AQP4抗体或其抗原结合片段可以包含重链和轻链，所述重链可以包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链可以包含如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述AQP4抗体是单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。
另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码上述AQP4抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
再一方面，本发明提供了一种重组载体，特别是重组表达载体，其包含上述核酸分子。
在一些实施方式中，所述载体可以是原核表达载体或真核表达载体。
在一些实施方式中，所述载体可以是质粒。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其导入或含有上述重组载体。
在一些实施方式中，所述细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞的实例包括但不限于，HEK293T细胞，Hela细胞，Hep2细胞，等等。
再一方面，本发明提供了上述AQP4抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括使上述宿主细胞在培养物中进行培养以得到AQP4抗体或其抗原结合片段的步骤。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括使从培养物中回收所述AQP4抗体或其抗原结合片段的步骤。
又一方面，本发明提供了所述AQP4抗体或其抗原结合片段的应用。
在一些实施方式中，本发明提供了所述AQP4抗体或其抗原结合片段在制备用于检测AQP4抗体的制品(特别是阳性对照品)中的应用。
在一些实施方式中，本发明提供了所述AQP4抗体或其抗原结合片段在制备用于AQP4抗原转染细胞的质检的制品中的应用。
在一些实施方式中，本发明提供了所述AQP4抗体或其抗原结合片段在AQP4抗原的抗原决定簇研究中的应用。
再一方面，本发明提供了一种AQP4抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含所述AQP4抗体或其抗原结合片段作为阳性标品。
本发明从AQP4抗体阳性脑脊液患者的体液中分离B细胞或者浆细胞，通过10X单细胞免疫组库测序，获得上百条配对的抗体序列。选取部分抗体序列并补全，构建到真核表达质粒中，转染Expi293，表达纯化全抗。经过筛选验证，从中挑选出2种重组表达的人源AQP4单抗。性能分析表明这两种抗体由于识别的是AQP4抗原的胞外区，不用对细胞或者组织进行通透处理，就能够直接用于免疫荧光检测。
因此，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明的人源AQP4单抗，可直接用于细胞或者组织样本AQP4抗原的免疫荧光检测，不用提前进行通透处理；
(2)本发明的人源AQP4单抗可以耐受Triton、Saponin等多种细胞通透试剂，能够稳定地用于免疫荧光检测；
(3)本发明的人源AQP4单抗可以作为AQP4抗体检测试剂盒的阳性标品，使用同一套抗人的荧光二抗，简化了试剂盒的成分。
附图说明
图1为实施例3中纯化的人源AQP4单抗(BCR1、BCR2)考染图。
图2为显示实施例4中人源AQP4单抗(BCR1、BCR2)能够识别不同的AQP4蛋白亚型的图。
图3为显示实施例5中人源AQP4单抗和AQP4不同胞外loop区突变体的免疫荧光反应图。其中：A为AQP4蛋白的结构示意图，AQP4胞外有3个loop区：loop A，loop C和loop E；B为AQP4的loop A，loop C和loop E突变体转染的细胞和AQP4 BCR1/2抗体反应的结果。
图4为显示实施例6中人源AQP4单抗和标签抗体相比，省略了细胞通透处理即可进行免疫荧光实验的图。
图5为显示实施例6中人源AQP4单抗和保存不同时间的AQP4检测材料反应的免疫荧光图。
图6为实施例7中人源AQP4单抗和小鼠脑组织的免疫荧光图。其中：Cerebellum代表小脑；Hippo代表海马区。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料和仪器
PCR酶：Max DNA Polymerase(Takara,货号：R045A)，KOD DNAPolymerase(品牌Toyobo，货号：KOD-201)；
细胞系：HEK293T细胞，FreeStyleTM 293-F细胞购自Thermofisher，货号：R79007；Expi293TM Expression Medium购自Thermofisher，货号：A1435101；
胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；
质粒：pCDNA3.4购自纽普生物，货号：V001453#；pEGFP-N1购自Addgene，54767；AQP4 M1/M23表达质粒购自山东维真，货号分别为CH895708/CH811833，其表达载体为pEnter，插入的表达蛋白C末端会带有His和Flag双标签；
质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；
同源重组试剂盒：HiFi DNA Assembly Master Mix，货号：E2621L；
纯水仪：Millipore Direct-5 UV Water Purification System；
移液器：eppendorf；
PCR仪：Bio-Rad T100；
Anti-His鼠单抗：购自Thermofisher，货号R930-25；
基因合成由通用生物公司合成；
Valproic Acid(VPA)购自Sigma货号P4543；
荧光二抗：Alexa Fluor 488Anti-human lgG购自Thermofisher，货号：A11013；
Chromium单细胞5'文库试剂盒：Chromium Next GEM Single Cell 5'Kit v2,4rxns 100265；
V(D)J扩增试剂盒：Chromium Single Cell Human BCR Amplification Kit,16rxns 1000253。
实施例1、BCR测序获得配对的人源抗体序列
1.患者纳入：纳入抗体阳性临床诊断明确的视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)患者，在临床知情的情况下获取其体液；
2.流式分析：从体液中分离细胞进行流式染色，使用抗人CD45，CD3，CD19，CD27，IgD，CD38，CD138表面marker对细胞进行染色，使用FACSARIAIII(BD)仪器进行检测对naiveB细胞，memory B细胞亚群，浆细胞/浆母细胞进行分群；
3.10X Genomics转录组测序、VDJ 5′RACE扩增测序及数据分析：
去除死细胞的细胞样本使用一个10X单细胞芯片(Chromium Next GEM SingleCell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3.1,16rxns PN-1000121)，将单细胞与凝胶珠共同封装在液滴中。分别使用Chromium单细胞5'文库试剂盒和Chromium单细胞VDJ富集试剂盒进行VDJ文库构建。液滴封装的逆转录cDNA分为3份分别用于5'单细胞转录组、B细胞建库。在Illumina NovaSeq平台上测序。将汇集的5'单细胞转录组在Illumina NextSeq 500上进行测序。将得到的FASTQ文件输入基于Linux的Cellranger进行。GEX测序文库与ref data-Cellranger-GRCh38参考基因组进行比对，VDJ测序文库与VDJ GRCh38 alts ensembl参考比对。并产生初步VDJ基因型，克隆型鉴定。
实施例2、人源AQP4抗体的小试表达和初筛
人源AQP4抗体的小试表达：
基于单细胞测序结果，对于选定的10组配对BCR重链轻链经过补全人lgG1kappa/lammda，密码子优化后合成基因插入真核表达载体pcDNA3.4中(由通用生物公司合成并完成亚克隆)。使用六孔板的HEK293T生产抗体。具体步骤如下：
1)293T细胞按照1x 106细胞/孔接种到6孔板中，加入2mL DMEM高糖培养基，混合均匀，置于CO2培养箱37℃过夜培养；
2)细胞密度在80％左右，进行转染：在250μL OptiMEM中加入配对的抗体轻重链表达质粒共2μg(轻重链质粒比例1:1)和6μL的PEI MAX 40K(1mg/mL)混匀，室温静置10-15分钟；
3)每孔细胞进行换液，加入1mL OptiMEM，然后再加入步骤2)中的转染试剂，轻柔混匀，在CO2培养箱37℃培养4小时，再换成含3％ FBS OptiMEM换液继续培养，每3天换液一次，取2次培养基进行浓缩，得到AQP4抗体的粗产物。
人源AQP4抗体的初筛：
通过细胞免疫荧光实验来筛选已经表达的可能的人源AQP4抗体，主要步骤如下：
1.293T/Hep2细胞使用10％FBS+DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
2.待细胞密度达到40％-50％，将AQP4 M23重组质粒载体pEnter-AQP4 M23用PEI转染进入细胞，转染6小时后更换新鲜培养基；
3.细胞固定：转染24-48小时后，待细胞密度达到80％-90％，使用4％多聚甲醛将细胞于室温固定5-15分钟，用PBS/TBS洗涤液200μL清洗3次；
4.细胞免疫荧光实验
步骤1：将浓缩的AQP4候选抗体稀释到200μL，加到检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG的二抗混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察绿色荧光信号。
经检测，表达了10个抗体，其中8个和转染AQP4细胞爬片反应后没有绿色荧光信号，为阴性结果，但是其中有2个和转染AQP4细胞爬片反应产生了明显的绿色荧光信号。因此这两个抗体为特异性的AQP4抗体，分别命名为AQP4 BCR1和AQP4 BCR2。AQP4 BCR1的重链为AQP4 BCR1 H：SEQ ID NO:9；AQP4 BCR1的轻链为AQP4 BCR1 L：SEQ ID NO:10；AQP4 BCR2的重链为AQP4 BCR2 H：SEQ ID NO:19，AQP4 BCR2的轻链为AQP4BCR2 L：SEQ ID NO:20。
利用生物信息学分析测序结果，经过blast比对，得到AQP4 BCR1的重链可变区(AQP4 BCR1 VH)为QITLKESGPTLVKPTETLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWVRQPPGKALEW LALLYWDGDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNLVVLTVTNMDPVDTATYYCARRLMGSIWAN WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)，AQP4BCR1的轻链可变区(AQP4 BCR1 VL)为Q SVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNFVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRASGIPDRF SGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDISLSAGVFGGGTKLTVL(SEQ IDNO:8)；AQP4 BCR2的重链可变区(AQP4 BCR2 VH)为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF TFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCARVHRDFWSGYFYPDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)，AQP4 BC R2的轻链可变区(AQP4 BCR2 VL)为DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLA WYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYS WTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:18)。
经Antibody CDR annotation分析，AQP4 BCR1的重链可变区具有如TSGVGVG(SEQID NO:1)所示的HCDR1，如LLYWDGDKRYSPSLKS(SEQ ID NO:2)所示的HCDR2，如RLMGSIWAN(SEQ ID NO:3)所示的HCDR3，以及AQP4 BCR1的轻链可变区具有如SGSTSNIGNNFVS(SEQ IDNO:4)所示的LCDR1，如DNNKRAS(SEQ ID NO:5)所示的LCDR2，如GTWDISLSAGV(SEQ ID NO:6)所示的LCDR3；AQP4 BCR2的重链可变区具有如SYWMT(SEQ ID NO:11)所示的HCDR1，如NIKQEGSEKYYVDAVKG(SEQ ID NO:12)所示的HCDR2，如VHRDFWSGYFYPDY(SEQ ID NO:13)所示的HCDR3，以及AQP4 BCR2的轻链可变区具有如RASQSISSWLA(SEQ ID NO:14)所示的LCDR1，如KASSLES(SEQ ID NO:15)所示的LCDR2，如QQYNSYSWT(SEQ ID NO:16)所示的LCDR3。
实施例3、人源AQP4抗体的表达和纯化
人源AQP4抗体的表达质粒构建：
人源AQP4抗体(BCR1、BCR2)基因分别由通用公司合成，并亚克隆到表达载体pCDNA3.4中，AQP4 BCR1的轻重链表达质粒为pCDNA3.4-AQP4-BCR1-H和pCDNA3.4-AQP4-BCR1-L，AQP4 BCR2的轻重链表达质粒为pCDNA3.4-AQP4-BCR2-H和pCDNA3.4-AQP4-BCR2-L。
人源AQP4抗体的表达：
1、Expi293细胞培养到密度为2.5-3.0x 106细胞/mL，准备转染；
2、将人源AQP4单抗表达质粒pCDNA3.4-AQP4-BCR1-H/L或pCDNA3.4-AQP4-BCR2-H/L按轻重链质粒比1:2共30μg加入到3mL OptiMEM中，混匀；
3、取120μL的PEI MAX 40K(1mg/mL)加入到OptiMEM中混匀，室温静置10-15分钟；
4、将混匀好的DNA和PEI混合物加到27mL Expi293细胞中，37℃摇床振荡培养；
5、转染后24小时，加入300μL的VPA和270μL的葡萄糖溶液至VPA终浓度为1mM；
6、继续振荡培养4天，然后收取培养基。
人源AQP4抗体的纯化：
1、将收取的Expi293细胞培养基15000rpm，4℃离心10分钟，去除死细胞和细胞碎片；
2、每200mL培养基上清液加入1mg Protein A beads，培养基上清液和protein Abeads旋转、结合孵育；
3、孵育1h后，用Wash缓冲液漂洗Protein A beads，漂洗3-5次，去除与beads或抗体结合弱的杂质；
4、然后利用强酸性缓冲液(pH3.0-3.5)洗脱Protein A上结合的抗体，再利用碱性的缓冲液(PH约12.0)中和；
5、第一步亲和层析完成后，将洗脱液浓缩至0.5mL左右，使用Superdex200Increase进行第二步分子筛层析，收集不同的蛋白峰流穿液，选择完整单抗位置的流穿液浓缩即得人源AQP4抗体BCR1和BCR2(图1)。
实施例4、重组人源AQP4单抗识别不同亚型的AQP4蛋白
AQP4有两种主要的异构体：M1和M23。这两种异构体在N端的胞质区有22个氨基酸的差异，M1异构体：全长323个氨基酸，翻译起始点在Met-1，Met-23异构体：较短，含有301个氨基酸，翻译起始位点为Met-23。虽然N的22个氨基酸不是AQP4抗体的靶点，但是影响细胞表面蛋白质的四级结构，两种异构体均可组装成同源四聚体AQP4，但只有M23异构体在细胞膜上规则的成簇排列，称为正交四聚体(OAP)。
本实施例将本发明的两种人源的AQP4单抗和两种AQP4异构体进行细胞免疫荧光检测：重组人源AQP4单抗BCR1和BCR2作为阳性标品用于AQP4不同异构体的测试。检测步骤如下：
1.293T/Hep2细胞使用10％FBS+DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
2.待细胞密度达到40％-50％，分别将AQP4 M1和M23两种重组质粒载体用PEI转染进入细胞，转染6小时后更换新鲜培养基；
3.细胞固定：转染24-48小时后，待细胞密度达到80％-90％，使用4％多聚甲醛将细胞于室温固定5-15分钟，用PBS/TBS洗涤液200μL清洗3次；
4.细胞免疫荧光实验
步骤1：将纯化的AQP4抗体BCR1和BCR2稀释到0.1-1μg/μL，加到转染M1和M23细胞的检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG的二抗混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图2所示，纯化的BCR1和BCR2抗体，和转染AQP4 M1，M23的细胞反应都能产生绿色荧光信号，而转染对照质粒的没有绿色荧光。因此这两种人源AQP4单抗都能识别M1和M23，区别是转染AQP4 M23的细胞能够产生的更强、更聚集的信号，可能和AQP4 M23异构体更能形成正交阵列(OAP)结构有关。
实施例5、重组人源AQP4抗体识别AQP4抗原的空间结构
本发明发现重组人源AQP4单抗能够识别AQP4的胞外区，而AQP4的胞外区结构只有3个短的loop区(图3中A)，为了验证重组人源AQP4单抗到底识别哪个胞外loop区，本发明构建了一系列的AQP4突变体蛋白，将AQP4家族的同源蛋白AQP1的胞外区和AQP4对应的胞外区进行置换，得到了3个AQP突变体表达质粒，最终的免疫荧光实验证明，AQP4的胞外区loop A和loop C是主要的抗原识别区，而loop E不影响AQP4抗原和重组人源AQP4单抗的识别。
AQP4突变体的构建：使用重叠延伸PCR的载体构建方法分别将AQP1的loop A(YPVGNNQTAVQD，SEQ ID NO:21)替换AQP4的loop A(NWGGTEKPLPVD，SEQ ID NO:22)；将AQP1的loop C(TSSLTGNSLGRNDLADGVNSG，SEQ ID NO:23)替换AQP4的loop C(TPPSVVGGLGVTMVHGNLT，SEQ ID NO:24)；将AQP1的loop E(VITHNFS，SEQ ID NO:25)替换AQP4的loop E(GNWENHW，SEQ ID NO:26)；得到三种AQP4的突变体质粒。
CBA法细胞制备
步骤1：293T/Hep2细胞使用10％FBS+DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
步骤2：待细胞密度达到40％-50％，将三种AQP4的突变体及AQP1质粒用PEI转染进入细胞，转染6小时后更换新鲜培养基；
步骤3：细胞固定：转染24-48小时后，待细胞密度达到80％-90％，使用4％多聚甲醛将细胞于室温固定5-15分钟，用PBS/TBS洗涤液200μL清洗3次；
细胞免疫荧光实验
步骤1：将纯化的AQP4抗体BCR1和BCR2稀释到0.1-1μg/μL，Anti-His鼠单抗(Thermo，R930-25)按说明书要求加到检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488 Anti-human lgG或者偶联Alexa Fluor 488Anti-mouse lgG的二抗混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图3中B所示，三种AQP4突变体及AQP1质粒本身带有His标签，转染的细胞使用Anti-AQP4抗体进行染色，结果表明，三种突变体蛋白尽管改变了不同的loop区，但是并没有影响表达和蛋白的膜定位。本发明的人源AQP4单抗BCR1和BCR2的染色结果表明，loop A和loop C对于AQP4抗体BCR1和BCR2和AQP4抗原的识别很重要，缺一不可，一个loop的改变就会导致抗体和抗原无法识别，而loop E相对而言并不重要，替换后仍然能够检测到明显的绿色荧光信号，这也说明AQP4抗体BCR1和BCR2和AQP4抗原的识别是依赖于AQP4抗原的空间构像，尤其是loop A和loop C形成的空间结构，缺一不可。
实施例6、重组人源AQP4单抗用于细胞的间接免疫荧光法(Cell beased assay，CBA)的质控的优点
目前AQP4抗体的检测有两种方法：基于细胞的间接免疫荧光法(Cell beasedassay，CBA)或者ELISA。CBA法仍然被公认为金标准，因为细胞表达的抗原蛋白固定后仍然能够保持其天然的空间结构，具有更佳的抗原性。目前市场上流通的AQP4 CBA法检测试剂盒都未包含阳性对照，在获得阴性结果时不能排除因为细胞表达的问题，例如：转染操作失误，无法让使用者完全放心。很多实验室依赖在患者群体中筛选到阳性样本作为阳性对照品，但是单个的样本比较有限，使用完后只能寻找新的阳性样本，无法保持很好的一致性。另外尽管市场上有商业化的AQP4抗体，但是由于价格昂贵，并且大都是鼠源或者兔源的，需要相应的二抗，和检测人源自身抗体使用的抗人二抗不一样，增加了额外的试剂，另外由于如图3中A所示，AQP4的N端和C端都位于胞内，通常的标签都加上蛋白的N端或者C端，所以在使用该标签抗体(如His)，需要提前对细胞进行通透处理，而AQP4抗体检测是不需要通透处理的，因为AQP4自身免疫抗体主要识别胞外区，因此急需开发一种更加简便的AQP4抗体作为CBA法检测的阳性标品。本发明人发现人源AQP4 BCR抗体相比其它形式的AQP4阳性抗体标准品具有多种优势：一是人源AQP4 BCR抗体无需通透打孔处理，即可用于免疫荧光反应。并且打孔处理也不会影响其免疫荧光反应；二是人源AQP4 BCR抗体由于识别AQP4抗原的空间结构，相比于普通的标签抗体具有明显的优势。
AQP4抗体检测细胞制备：
步骤1：293T/Hep2细胞使用10％FBS+DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
步骤2：待细胞密度达到40％-50％，将AQP4 M23质粒用PEI转染进入细胞，转染6小时后更换新鲜培养基；
步骤3：细胞固定：转染24-48小时后，待细胞密度达到80％-90％，使用4％多聚甲醛将细胞于室温固定5-15分钟，用PBS/TBS洗涤液200μL清洗3次，无菌的环境中保存备用；
人源AQP4单抗用于免疫荧光实验无需通透处理：
将制备的48孔细胞，使用AQP4抗体BCR1/2和His抗体(Thermo，R930-25)进行免疫荧光实验。
步骤1：对表达AQP4的细胞检测孔，分别进行不打孔，Saponin打孔和Triton X-100打孔处理10分钟，漂洗一次；
步骤2：将纯化的AQP4抗体BCR1和BCR2抗体稀释到0.1-1μg/μL，His鼠单抗(Thermo，R930-25)按说明书要求加到打孔或不打孔的检测孔中；
步骤3：避光37℃孵育1小时；
步骤4：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤5：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG或者偶联Alexa Fluor488Anti-mouse lgG的二抗混匀孵育1小时；
步骤6：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤7：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图4所示，打孔或者不打孔处理，人源AQP4单抗BCR1和BCR2都能和AQP4表达细胞反应，产生特异性的绿色荧光信号。而His鼠单抗(Thermo，R930-25)只有在使用Saponin或者Triton X-100才能染出来绿色荧光信号，不进行打孔通透处理的话，由于His单抗无法进入细胞和His标签反应而无法反应产生荧光信号。因此实验也说明本发明的人源AQP4抗体单抗可以耐受Triton、Saponin等多种细胞通透试剂，能够稳定地用于免疫荧光检测。
另外，检测试剂的保存时间也是检测试剂稳定性的一个重要考量，本发明发现识别空间构像的AQP4抗体更适合作为阳性标品去质检CBA法中检测AQP4自身免疫抗体所用的细胞基质，因为使用常用的标签抗体可以检测到抗原末端的小标签是否存在，但是它不能反映抗原蛋白的构像的改变。基于以上猜测，本发明使用人源AQP4抗体和标签抗体(AQP4抗体)同时检测保存不同时间的AQP4抗原表达细胞基质。
AQP4抗体检测细胞基质的免疫荧光实验：
将制备的AQP4抗原表达细胞，在常温放置0周，1周和2周之后同时使用AQP4抗体BCR1/2和His抗体进行免疫荧光实验。
步骤1：将纯化的AQP4抗体BCR1和BCR2抗体稀释到0.1-1μg/μL，His鼠单抗(Thermo，R930-25)按说明书要求加到无菌环境室温放置不同时间的检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG或者偶联Alexa Fluor488Anti-mouse lgG的二抗混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图5所示，人源AQP4单抗BCR1和BCR2的染色结果表明细胞放置1周后，转染AQP4 M23抗原的细胞产生的阳性信号明显减弱，2周后几乎看不到明显的绿色荧光信号，这和已知的AQP4阳性血清(来自医院的临床样本)阳性信号的变化是一致。而AQP4抗体在1周和2周只有稍微的信号变弱，可能是由于AQP4蛋白存在轻微的末端降解造成的。
因此人源AQP4 BCR单抗能够更加灵敏的反映AQP4抗原的空间构像改变，相比于普通的标签抗体具有明显的优势。
实施例7、重组人源AQP4单抗用于组织免疫荧光实验
人源AQP4 BCR抗体能够有效地识别质粒转染细胞表达AQP4，本发明进一步地使用小鼠的脑组织检测了人源AQP4 BCR抗体是否能够识别鼠源的天然的AQP4蛋白。具体实验步骤如下：
1.冰冻OCT包埋小鼠脑组织样品从-80℃冰箱中取出待用；
2.切片：小鼠脑组织样品切片厚度10um，切片直接放在室温的PBS中；
3.封闭过氧化物酶体：3％H2O2，(1mL 30％ H2O2+9mL甲醇)；
4.PBS 5分钟×3次；
5.高温抗原修复：95℃水浴，柠檬酸盐(PH＝6.0)修复液，6min。结束后放置20-30min使温度降低；(此步骤可选用，有相熟的同学做的时候用了这一步，结果也挺好的)；
6.PBS 5分钟X3次；
7.透膜，0.2％ Triton室温20分钟；
8.封闭：10％山羊血清，1h；
9.纯化的BCR1和BCR2抗体孵育4℃过夜；
10.PBS 5分钟×3次；
11.孵育抗人的荧光二抗Alexa Fluor 488Anti-human lgG，室温1h；
12.PBS 5分钟×3次；
13.滴加DAPI避光孵育15分钟；
14.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS；
15.用含抗荧光淬灭剂的封片，37℃烘干保存；
16.拍照记录结果。
检测结果如图6所示，使用人源AQP4单抗BCR1和BCR2在小鼠脑组织切片上能够检测出明显的AQP4阳性信号，阳性信号主要在小鼠的海马和小脑区。
经过CBA和TBA的验证，本发明筛选的人源AQP4 BCR抗体能够有效地识别AQP4，因此可以作为AQP4抗体检测试剂盒的阳性标品。所述人源AQP4单抗作为阳性标品存在具有2个优点：一是可以和检测人体样本共用抗人二抗，不需要增加额外的试剂组分；二是它能够更加精准地反映出转染AQP4抗原细胞基质的保存状态，是否丧失了空间构像而不能用于AQP4抗体的检测，让使用者真正放心。因此本发明筛选的2种人源AQP4单抗可以作为AQP4免疫荧光检测试剂盒的阳性标品，为建立一个稳定的AQP4抗体检测体系打下了坚实的基础。
序列表
AQP4 BCR1 HCDR1(SEQ ID NO:1)：TSGVGVG
AQP4 BCR1 HCDR2(SEQ ID NO:2)：LLYWDGDKRYSPSLKS
AQP4 BCR1 HCDR3(SEQ ID NO:3)：RLMGSIWAN
AQP4 BCR1 LCDR1(SEQ ID NO:4)：SGSTSNIGNNFVS
AQP4 BCR1 LCDR2(SEQ ID NO:5)：DNNKRAS
AQP4 BCR1 LCDR3(SEQ ID NO:6)：GTWDISLSAGV
AQP4 BCR1 VH(SEQ ID NO:7)：
QITLKESGPTLVKPTETLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWVRQPPGKALEWLALLYWDGDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNLVVLTVTNMDPVDTATYYCARRLMGSIWANWGQGTLVTVSS
AQP4 BCR1 VL(SEQ ID NO:8)：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNFVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRASGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDISLSAGVFGGGTKLTVL
AQP4 BCR1重链(SEQ ID NO:9)：
QITLKESGPTLVKPTETLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWVRQPPGKALEWLALLYWDGDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNLVVLTVTNMDPVDTATYYCARRLMGSIWANWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
AQP4 BCR1轻链(SEQ ID NO:10)：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNFVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRASGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDISLSAGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
AQP4 BCR2 HCDR1(SEQ ID NO:11)：SYWMT
AQP4 BCR2 HCDR2(SEQ ID NO:12)：NIKQEGSEKYYVDAVKG
AQP4 BCR2 HCDR3(SEQ ID NO:13)：VHRDFWSGYFYPDY
AQP4 BCR2 LCDR1(SEQ ID NO:14)：RASQSISSWLA
AQP4 BCR2 LCDR2(SEQ ID NO:15)：KASSLES
AQP4 BCR2 LCDR3(SEQ ID NO:16)：QQYNSYSWT
AQP4 BCR2 VH(SEQ ID NO:17)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVHRDFWSGYFYPDYWGQGTLVTVSS
AQP4 BCR2 VL(SEQ ID NO:18)：DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSWTFGQGTKVEIK
AQP4 BCR2重链(SEQ ID NO:19)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVHRDFWSGYFYPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
AQP4 BCR2轻链(SEQ ID NO:20)：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
AQP1 Loop A(SEQ ID NO:21)：YPVGNNQTAVQD
AQP4 Loop A(SEQ ID NO:22)：NWGGTEKPLPVD
AQP1 Loop C(SEQ ID NO:23)：TSSLTGNSLGRNDLADGVNSG
AQP4 Loop C(SEQ ID NO:24)：TPPSVVGGLGVTMVHGNLT
AQP1 Loop E(SEQ ID NO:25)：VITHNFS
AQP4 Loop E(SEQ ID NO:26)：GNWENHW。

Claims (10)

1.一种AQP4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
或者所述重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的LCDR1，如SEQ ID NO:15所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:16所示的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的AQP4抗体或其抗原结合片段，其中，所述AQP4抗体是单克隆抗体，
优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。
3.根据权利要求1所述的AQP4抗体或其抗原结合片段，其中，所述AQP4抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述AQP4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，或者
所述AQP4抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:17具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述AQP4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:18具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的AQP4抗体或其抗原结合片段，其中，所述AQP4抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，或者
所述重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
5.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1-4中任一项所述的AQP4抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
6.一种重组载体，特别是重组表达载体，其包含如权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其导入或含有如权利要求6所述的重组载体。
8.一种制备AQP4抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括使如权利要求7所述的宿主细胞在培养物中进行培养以得到AQP4抗体或其抗原结合片段的步骤，
优选地，所述方法进一步包括使从培养物中回收所述AQP4抗体或其抗原结合片段的步骤。
9.如权利要求1-4中任一项所述的AQP4抗体或其抗原结合片段的应用，所述应用包括：所述AQP4抗体或其抗原结合片段在制备用于检测AQP4抗体的制品(特别是阳性对照品)中的应用；所述AQP4抗体或其抗原结合片段在制备用于AQP4抗原转染细胞的质检的制品中的应用；所述AQP4抗体或其抗原结合片段在AQP4抗原的抗原决定簇研究中的应用。
10.一种AQP4抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-4中任一项所述的AQP4抗体或其抗原结合片段作为阳性标品。
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