CN116041471B - 一种抗ifitm3n端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体 - Google Patents

一种抗ifitm3n端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗IFITM3N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体，属于生物医药技术领域。本发明的包含IFITM3N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽包括氨基酸序列如SEQ NO.1～3所示的多肽中的至少一种。本发明通过对IFITM3蛋白的结构进行分析，最终获得包含IFITM3N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽，并采用该抗原多肽制备多克隆抗体，该多克隆抗体能够识别IFITM3全长及截短蛋白，为IFITM3蛋白的相关研究提供支持。

Description

一种抗IFITM3N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体。
背景技术
IFITM蛋白(Interferon-induced transmembrane protein)是一类干扰素诱导的小跨膜蛋白，近年来的研究主要关注于IFITM蛋白的抗病毒功能。IFITM蛋白家族在人细胞中至少有五个成员：IFITM l、2、3、5和10。IFITM 5只在骨细胞中表达，IFITM l0的功能尚不明确。其他3种IFITM蛋白普遍表达于人体内各种细胞中，其中IFITM3是在一项siRNA筛选实验中发现的，可以抑制流感病毒，西尼罗河病毒及登革热病毒等pH依赖进入细胞的病毒，与野生型小鼠相比，IFITM3基因敲除的小鼠感染流感病毒之后，表现出更严重的临床症状。IFITM3是一种多重跨膜蛋白，分子量为15kD左右，携带IFITM3单核苷酸多态性(SNP)rs12252-C等位基因的个体显示出甲型H1N1流感病毒和新型冠状病毒的发病率和死亡率增加，体外研究表明IFITM3 rs12252 C编码N端缺失21个氨基酸的蛋白，该截短蛋白失去其抑制流感病毒复制的功能。研究发现IFITM3rs12252 CC基因型不但与2009甲型H1N1流感的临床重症相关，并且与人感染H7N9禽流感的严重临床结局相关，可能也与流感疫苗免疫应答的强弱存在一定的关联，但目前的研究仅局限在对基因组SNP位点及体外IFITM3全长蛋白，对该SNP位点可变剪接产生的N端缺失21个氨基酸的截断蛋白的研究尚不明确，因此制备IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白(下称Δ21)的抗体，以更好的对组织、细胞样本进行研究分析。当前现有的抗体均可以检测到IFITM3野生型蛋白，但无法检测到其截断蛋白。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体，该多克隆抗体识别IFITM3全长蛋白及截断蛋白，能够为IFITM3蛋白的相关研究提供支持。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽，所述抗原多肽包括氨基酸序列如SEQ NO.1～3所示的多肽中的至少一种。
抗体的免疫效果受到抗原设计、递送系统、免疫途径和佐剂选择等多种因素的综合影响，其中抗原设计至关重要。本发明采用计算机智能算法联合生物信息学软件对小鼠的IFITM3蛋白的结构进行分析，以多重跨膜蛋白为抗原靶标进行选择、设计、改造和优化，最终筛选出IFITM3蛋白上存在的得分靠前的B细胞表位，获得包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽。
作为本发明所述的包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽的优选实施方式，所述抗原多肽的C末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白。
作为本发明所述的包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽的优选实施方式，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
本发明还提供一种特异性抗所述的抗原多肽的抗体。
作为本发明所述的抗体的优选实施方式，所述抗体为多克隆抗体或抗血清。
本发明还提供所述的抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将抗原多肽混合，并与佐剂混合乳化；
(2)并采用乳化后的抗原多肽免疫实验动物；
(3)采集实验动物的血清进行纯化，得所述抗体。
作为本发明所述的抗体的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述抗原多肽为氨基酸序列如SEQ NO.1～3所示的多肽以质量比1:1:1混合而成。
本发明还提供所述抗原多肽或所述的抗体在制备用于检测IFITM3野生型蛋白、IFITM3截短蛋白、带有标签抗体的IFITM3外源性野生型蛋白和/或带有标签抗体的IFITM3截短蛋白的检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括所述抗原多肽和/或所述的抗体。
本发明还提供一种用于检测IFITM3野生型蛋白、IFITM3截短蛋白、带有标签抗体的IFITM3外源性野生型蛋白和/或带有标签抗体的IFITM3截短蛋白的检测试剂，所述检测试剂包括所述抗原多肽和/或所述的抗体。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体，本发明通过对IFITM3蛋白的结构进行分析，最终获得包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽，并采用该抗原多肽制备多克隆抗体，该多克隆抗体能够识别IFITM3全长及截短蛋白，为IFITM3蛋白的相关研究提供支持。
附图说明
图1为IFITM3 N端截短21个氨基酸的截短蛋白的二级结构、亲疏水性、抗原性、表面可及性分析图。
图2为IFITM3 N端截短21个氨基酸的截短蛋白的跨膜结构分析图。
图3为ABCpred数据库在线抗原表位预测20肽位置图。
图4为第三次免疫后兔血清的ELISA效价图。
图5为洗脱后抗体的SDS-PAGE鉴定图。
图6为纯化抗体经分子筛蛋白纯化峰图。
图7为纯化的兔多克隆抗体WB检测不同来源的IFITM3蛋白的不同形式结果图。
图8为市售IFITM3抗体检测IFITM3全长及其截短蛋白的结果图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1抗原多肽的构建
1、本实施例以GenBank中小鼠IFITM3蛋白(GenBank:NP_079654.1)的一级结构信息为基准获取截短体蛋白(Δ21)的序列信息以及抗原生物学信息，获得三段序列抗原性较高的多肽，设计多肽氨基酸序列：
1.1、截短蛋白一级结构信息序列信息如下(共117个氨基酸)：
MRIKEEYEVAEMGAPHGSASVRTTVINMPREVSVPDHVVWSLFNTLFMNFCCLGFIAYAYSVKSRDRKMVGDVTGAQAYASTAKCLNISTLVLSILMVVITIVSVIIIVLNAQNLHT
1.2、根据DNAstar的protean软件包分析其二级结构、亲疏水性、抗原性、表面可及性：亲水性高的、抗原性强、表面可及性好的有四处，位于1～25、30～40、60～75、110-117位氨基酸左右，分析结果如图1所示。
1.3、利用phyre2及TMHMM预测IFITM3 N端截短21个氨基酸的截短蛋白的跨膜结构：两种计算机模拟计算都显示胞外结构域均位于1～40、110～117位氨基酸左右，分析结果如图2所示。
2、筛选抗原多肽
2.1、根据ABCpred数据库在线抗原表位预测20肽的结果，结果如表1和图3所示。
表1 ABCpred数据库在线抗原表位预测20肽
排名 序列信息 起止位置 打分
1 VGDVTGAQAYASTAKCLNIS 70-89 0.79
2 SVPDHVVWSLFNTLFMNFCC 33-52 0.77
3 AYASTAKCLNISTLVLSILM 78-97 0.75
4 INMPREVSVPDHVVWSLFNT 26-45 0.74
5 ASVRTTVINMPREVSVPDHV 19-38 0.73
6 VLSILMVVITIVSVIIIVLN 92-112 0.72
6 YEVAEMGAPHGSASVRTTVI 7-26 0.72
6 FIAYAYSVKSRDRKMVGDVT 55-74 0.72
7 SLFNTLFMNFCCLGFIAYAY 41-60 0.62
8 120 0.81
9 103 0.62
10 112 0.59
2.2、根据IEDB在线数据库预测B细胞表位预测肽段结果，结果如表2所示。
表2 IEDB B细胞表位肽预测表
排名 肽段序列 起止位置 肽段长度
1 KEEYEVAEMGAPHGSASVRTTVINMPREVSV 4-34 31
2 SRDRKMVGDVTG 64-75 12
根据截短蛋白的一级生物学信息、二级结构、亲疏水性、抗原性、表面可及性分析，本发明筛选出3个位点分别为Pep A(4-18aa：KEEYEVAEMGAPHGS，15肽)、Pep B(19-38aa:ASVRTTVINMPREVSVPDHV 20肽)、Pep C(64-75aa:SRDRKMVGDVTG12肽)。
2.3、合成包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白抗原位点的多肽，同时在多肽C末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白，得到3条包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽，如下：
Pep A(4-18aa：KEEYEVAEMGAPHGS-KLH，15肽)、
Pep B(19-38aa:ASVRTTVINMPREVSVPDHV-KLH，20肽)、
Pep C(64-75aa:SRDRKMVGDVTG-KLH，12肽)。
实施例2抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体的制备
本实施例将实施例1制备得到的抗原多肽Pep A、Pep B和Pep C以质量比1:1:1混合，并加入等体积的佐剂进行乳化后免疫新西兰兔，并收集抗血清，具体实验步骤如下：
(1)初次免疫：采集免疫前血清作为阴性对照。将混合好的偶联KLH的抗原多肽1mg/ml，取1ml混合肽段与1ml弗氏完全佐剂乳化后，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，颈部及背部皮下选取5～6点多部位注射入免疫动物体内。
(2)第二次免疫：初次免疫后14天后，将合成多肽1mg/ml，取0.5ml与0.5ml弗氏不完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，颈部及背部皮下选取5～6点多部位注射入免疫动物体内。
(3)加强免疫：将合成多肽与弗氏不完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内，进行加强免疫1～2次。加强免疫一周后采集血清，采用ELISA方法进行抗体效价检测，检测结果如图4所示。当抗体效价达到1:102400后即可进行冲击免疫。ELISA选用了以上未偶联KLH的裸肽混合物作为包被抗原，过夜包被、封闭及洗涤后倍比稀释(1:1000-1:2048000)的抗血清和具有相同稀释梯度的免疫前血清(100μl/孔)，37℃孵育1h清洗过后，加入按照1:3000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(100μl/孔)孵化1h，最后用PBST彻底清洗后加入可溶型单组分TMB底物溶液避光反应15min，用浓硫酸终止反应，在酶标仪中取450吸光度值进行测量，读取OD630作为矫正。进而计算多抗血清的实际效价。1μg/ml的抗原包被浓度可以获得最佳的抗体效价，根据OD阳性/OD阴性≥2.1的计算公式可知，抗IFITM3 N端截短21个氨基酸的血清效价高达1:1024000。
(4)冲击免疫：同前步骤3，最后一次免疫7天后，取免疫动物全血，收集得到IFITM3N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的兔多克隆抗体血清。
(5)将采集的动物血清于4℃或室温下10000g离心10min,轻轻倒出上清，弃去含膜和细胞碎片的沉淀，向上清中加入等量的PBS，混匀。室温下10000g离心10min,重复两次，轻轻倒去上清收集。
(6)将预处理的样品以5ml/min的流速经过Protein G层析柱，收集流穿液。
(7)洗涤未结合蛋白质：用5个柱体积的预冷PBS洗柱，收集流穿液。
(8)抗体洗脱:用0.1mol/L pH 2.8甘氨酸·HCl缓冲液洗脱结合的抗体，收集洗脱液，并用Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，即得到纯化好的抗体。
(9)SDS-PAGE鉴定各步收集的样品，鉴定流穿和洗脱纯度，分析各步骤抗体损失情况，结果如图5所示。若SDS-PAGE鉴定后流穿液中还存在抗体，可将流传液重复(6)-(9)的步骤，直至流穿液中无抗体条带。Protein G琼脂糖凝胶柱先用10-20倍柱体积的超纯水洗涤，最后加入2-3倍柱体积的20％乙醇溶液，封存于4℃，便于下次使用。
(10)将纯化好的抗体转移至超滤管中进行超滤，当超滤管中剩余0.5～1ml液体时加入Tris-HCl缓冲液溶液，此过程重复3-4次，最后一次在液体剩余0.5～1ml时停止超滤，取出浓缩液体进行分子筛(凝胶过滤层析)蛋白纯化，结果如图6所示。收集分子筛中出现紫外吸收峰UV(蓝色)的对应的试管号中的液体，500ul/管。将上述试管中的液体混匀，转移至超滤管中进行超滤浓缩，采用nanodrop测浓度至10mg/ml后停止超滤，将超滤后的抗体浓缩液进行SDS-PAGE电泳鉴定，分子量大小无误后即得到IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的兔多克隆抗体,将分装后于-80℃冰箱中保存备用。
实施例3抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的多克隆抗体的应用
本实施例提供一种采用实施例3的多克隆抗体检测小鼠体内的内源性IFITM3野生型及截短蛋白及带有标签抗体的外源性野生型及截短蛋白的方法，具体包括以下步骤：
(1)蛋白样品准备：准备野生型小鼠及Δ21纯合子小鼠的蛋白，分别提取携带flag-ifitm3、flag-Δ21质粒转染293T细胞后蛋白。
(2)经由BCA法测定蛋白浓度后，将25μg的蛋白进行15％的SDS-PAGE凝胶电泳。
(3)转膜：通过湿转将电泳条带转印到PVDF膜上，在快速封闭液中室温封闭20min，然后分别用上述制备兔多克隆抗体(1:500稀释)及鼠抗flag抗体(1:3000稀释)后作为一抗，于摇床上4℃孵育过夜，用PBST洗涤4次(每次洗涤10min)，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:10000稀释)或者山羊抗IgG(1:10000稀释)在室温下孵育1h，最后清洗3次，用高敏型ECL化学发光检测试剂盒进行蛋白条带显色，进而检测组织中该基因的蛋白。
结果如图7所示，兔抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的多克隆抗体能够显示出野生型小鼠(WT)、IFITM3截短体纯合子小鼠(Δ21)、Flag-WT质粒过表达的IFITM3全长及截短蛋白条带，不能显示IFITM3基因敲除的纯合子小鼠条带。可见，本发明所制备的抗IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白多克隆抗体可用于检测内源性及外源性的IFITM3野生型全长蛋白及N端缺失21个氨基酸的截短蛋白。
本实施例分别采用购买自proteintech公司(Cat No:11714-1-AP)、abcam公司(abcam Cat No.ab288563)、Prosci公司(Cat No.5807)的商业化IFITM3抗体检测IFITM3全长及其截短蛋白(Δ21)，结果如图8所示，由图8可知，上述购买的商业化IFITM3抗体均只能检测到IFITM3的全长蛋白，无法测到IFITM3的截短蛋白。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物，其特征在于，所述抗原多肽组合物由SEQ NO.1所示的抗原多肽、SEQ NO.2所示的抗原多肽和SEQNO.3所示的抗原多肽组成。
2.根据权利要求1所述的包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物，其特征在于，所述抗原多肽的C末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白。
3.根据权利要求2所述的包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
4.一种特异性抗权利要求1~3任一项所述的包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或抗血清。
5.根据权利要求4所述的抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将抗原多肽混合，并与佐剂混合乳化；
（2）并采用乳化后的抗原多肽免疫实验动物；
（3）采集实验动物的血清进行纯化，得所述抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述抗原多肽为氨基酸序列如SEQ NO.1~3所示的多肽以质量比1:1:1混合而成。
7.权利要求1~3任一项所述包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物或权利要求4所述的抗体在制备用于检测IFITM3野生型蛋白、IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白、带有标签抗体的IFITM3外源性野生型蛋白和/或带有标签抗体的IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的检测试剂或试剂盒中的应用。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~3任一项所述包含IFITM3N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物和/或权利要求4所述的抗体。
9.一种用于检测IFITM3野生型蛋白、IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白、带有标签抗体的IFITM3外源性野生型蛋白和/或带有标签抗体的IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截短蛋白的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述包含IFITM3 N端缺失21个氨基酸的截断蛋白位点的抗原多肽组合物和/或权利要求4所述的抗体。
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