CN113214374B

CN113214374B - 一种包虫病新抗原Cystatin蛋白

Info

Publication number: CN113214374B
Application number: CN202010081420.2A
Authority: CN
Inventors: 张聪敏; 任艳; 刘斯奇
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2040-02-06
Also published as: CN113214374A

Abstract

本发明公开了一种包虫病新抗原Cystatin蛋白。本发明提供的Cystatin蛋白其氨基酸序列中含有如下中的全部或部分：SEQ ID No.1的第1‑25位、第32‑56位、第64‑84位、第89‑95位、第141‑147位、第155‑168位。本发明通过GeLS‑MS/MS技术，找到了一个包虫病新抗原Cystatin蛋白，可以用来制作ELISA试剂盒并用于临床检测人源包虫病。本发明检测14例术后包虫病人血浆和6例正常西藏人血浆，阳性检出率为93％，阴性检出率为100％。本发明扩充了包虫抗原库，对诊断人源包虫病有一定的贡献。

Description

一种包虫病新抗原Cystatin蛋白

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种包虫病新抗原Cystatin蛋白。

背景技术

包虫病又名棘球蚴病，是一种人畜共患病，在中国中西部地区(西藏、青海、四川、新疆等地)感染尤其严重。人源包虫病主要分为囊型包虫病和泡型包虫病。影像学检测是最直观最常用的包虫病诊断方法，但是由于包虫病的潜伏期较长，并且只有在包虫病形成的包囊大到一定程度时才能够通过影像学检测到，所以血清学检测是影像学诊断包虫病的重要辅助手段之一。

迄今为止，已经描述了几种用于包虫病实验室诊断的方法，包括抗体，抗原和细胞因子的检测。其中，抗体检测的发展主要依赖于包虫抗原种类的发展。但是不论天然纯化抗原还是重组纯化抗原，均在特异性和/或敏感性方面有一定的不足。更为重要的是人源包虫病因涉及到取样困难、分离包虫蛋白困难等因素，一直没有出现更多的可用于血清学检测的抗原。具体而言，现有技术存在如下不足：1)从包虫病人术后分离的包虫囊中提取包虫蛋白并鉴定，本身是一个技术难点。如果鉴定到的包虫蛋白本身种类就很少，想从中选取可能作为包虫抗原的蛋白将更加困难。2)单一抗原种类少。目前最广泛应用的包虫病诊断抗原是AntigenB和Antigen5，许多研究表明这两种抗原在血清检测时会产生一定的假阳性或假阴性。3)商品化包虫抗原是天然纯化抗原，分离纯化自细粒棘球蚴破碎后的可溶性抗原片段，是一种包含多种包虫蛋白的混合物。混合的蛋白越多越容易在血清检测时产生更多假阴性或假阳性的结果。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明旨在寻找更多可以用来诊断包虫病的抗原，扩充包虫抗原数据库，使这些抗原或单一或组合都有可能提升实验室诊断包虫病的特异性和灵敏性。进而，产生从包虫病人术后分离的包虫囊中提取更多包虫蛋白并鉴定的成熟实验流程。

第一方面，本发明的目的是提供一种蛋白质。

本发明所提供的蛋白质，其氨基酸序列中含有如下中的全部或部分：

(1)SEQ ID No.1的第1-25位；

(2)SEQ ID No.1的第32-56位；

(3)SEQ ID No.1的第64-84位；

(4)SEQ ID No.1的第89-95位；

(5)SEQ ID No.1的第141-147位；

(6)SEQ ID No.1的第155-168位。

进一步地，所述蛋白质可为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

在本发明的具体实施方式中，所述蛋白质的氨基酸序列具体与“将SEQ ID No.2所示DNA分子插入到pET30a(+)质粒的酶切位点HindIII和XhoI之间后表达所得的重组蛋白”的氨基酸序列相同。

第二方面，本发明要求保护编码前文所述蛋白质的核酸分子。

进一步地，所述核酸分子中编码SEQ ID No.1的第1-25位氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-75位；

所述核酸分子中编码SEQ ID No.1的第32-56位氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID No.2的第94-168位；

所述核酸分子中编码SEQ ID No.1的第64-84位氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID No.2的190-252位；

所述核酸分子中编码SEQ ID No.1的第89-95位氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID No.2的265-285位；

所述核酸分子中编码SEQ ID No.1的第141-147位氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID No.2的421-441位；

所述核酸分子中编码SEQ ID No.1的第155-168位氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID No.2的463-504位。

更进一步地，所述核酸分子可为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码前文所述蛋白质的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，含有前文所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞。

其中，所述表达盒由启动子(如T7启动子)、所述核酸分子和终止序列(如T7终止子)组成。所述重组载体可为含有所述表达盒的重组质粒。

在本发明中，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子为T7启动子。更加具体的，所述重组载体为将前文所述核酸分子插入到pET30a(+)质粒的多克隆位点(如HindIII和XhoI之间)后得到的重组质粒。

在本发明中，所述重组菌为导入前文所述重组载体后的大肠杆菌(如大肠杆菌BL21(DE3))。

第四方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于诊断因感染细粒棘球蚴所致疾病的产品中的应用。

第五方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于诊断包虫病的产品中的应用。

其中，所述包虫病优选为人源包虫病。

第六方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于检测包虫病特异性抗体的产品中的应用。

第七方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于检测待测者血清中是否含有包虫病特异性抗体的产品中的应用。

在第四至七方面中，所述产品可为试剂盒。

第八方面，本发明要求保护一种试剂盒。

本发明所要求保护的试剂盒含有前文所述蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞；所述试剂盒具有如下功能中的至少一种：

(C1)诊断因感染细粒棘球蚴所致疾病；

(C2)诊断包虫病；

(C3)检测包虫病特异性抗体；

(C4)检测待测者血清中是否含有包虫病特异性抗体。

其中，所述包虫病优选为人源包虫病。

在本发明的具体实施方式中，所述试剂盒具体为ELISA试剂盒。所述试剂盒中还可含有ELISA检测所需常规试剂，如包被液、封闭液、洗液、显色液、检测二抗等。

本发明通过切胶酶解并质谱检测，即GeLS-MS/MS技术，找到了一个包虫病新抗原Cystatin蛋白(SEQ ID No.1)，可以用来制作ELISA试剂盒并用于临床检测人源包虫病。此包虫新抗原可大量纯化，方便大规模筛选人源包虫病。实验证明，利用本发明的包虫病新抗原Cystatin蛋白检测14例术后包虫病人血浆(确定为阳性)和6例正常西藏人血浆(确定为阴性)，阳性检出率为93％，阴性检出率为100％；而用商品化抗原检测相同的血浆时阳性检出率为86％，阴性检出率为100％。本发明扩充了包虫抗原库，对诊断人源包虫病有一定的贡献。

附图说明

图1为七个囊液组分提取到的全蛋白的SDS-PAGE和Western blotting结果展示。

图2为Cystatin重组蛋白的纯化结果展示。图中所示为Cystatin重组蛋白的梯度洗脱结果，每个泳道上样量均为10μl。图中标注的浓度为洗脱液中咪唑的浓度。

图3为纯化后Cystatin重组蛋白的WB验证实验结果展示。Cystatin重组蛋白组在26KD和34KD之间有明显条带为阳性(Cystatin重组蛋白分子量大小在26KD和34KD之间)，商品化抗原组在43KD和34KD之间有明显条带为阳性(商品化抗原检测时，最主要依靠两种抗原Antigen B和Antigen 5，其中Antigen B在诊断人源包虫病时发挥功能的最主要分子量大小在43KD和34KD之间)。图中标注的μg指的是Cystatin重组蛋白上样量。

图4为ELISA实验结果展示。Cystatin_OD(+)指的是14例术后病人血浆的OD值，Cystatin_OD(-)指的是6例正常西藏人血浆的OD值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、包虫病新抗原Cystatin蛋白的获得

1、包虫病人术后分离的包虫囊鉴定到更多包虫蛋白的过程

(1)首先将6个包虫病人术后分离的包虫囊根据其组织结构分为四部分提取蛋白，由内向外分别是原头蚴、囊液、生发层和角皮层；又根据其囊液透明与否，将6个包虫囊分为囊液透明组和非透明组。

(2)每个包虫囊的四个组分均进行了蛋白提取，并将提取的蛋白进行液态酶解，随后使用QE质谱仪进行LC-MS/MS鉴定。

(3)QE下机的原始数据使用maxquant蛋白鉴定软件，使用人和包虫蛋白数据库合集(从Uniprot(https://www.uniprot.org/)网站中下载的Unreviewed(TrEMBL)数据库)，进行包虫蛋白质鉴定，统计鉴定结果并确定包虫蛋白含量多的包虫囊部分，结果如表1和表2所示。

(4)由表1可知，有两点基本结论：一是鉴定到包虫蛋白更多的组织部分是囊液和原头蚴这两个部分；二是只有囊液透明组的囊液和原头蚴部分提取的蛋白中包含有更多的包虫蛋白。

(5)根据基本结论一，为了鉴定到更多包虫蛋白，本发明又追加提取了另外10个包虫病人术后包虫囊的囊液和原头蚴的蛋白，结果如表3和表4所示，仍然是囊液透明组的囊液和原头蚴部分提取的蛋白中包含更多包虫蛋白。

表1 6个包虫病人组中囊液透明组的蛋白质鉴定结果

注：_1表示原头蚴；_2表示囊液；_3表示生发层；_4表示角皮层。

表2 6个包虫病人组中囊液非透明组的蛋白质鉴定结果

表3 10个包虫病人组中囊液透明组的蛋白质鉴定结果

注：_1表示原头蚴；_2表示囊液。

表4 10个包虫病人组中囊液非透明组的蛋白质鉴定结果

注：_1表示原头蚴；_2表示囊液。

2、Western Blotting验证、切胶酶解并质谱鉴定(GeLC-MS/MS)

(1)接下来，根据16个样本的囊液和原头蚴的QE鉴定结果，我们选取样本编号为1、2、3、7、8、9、10的七个透明样本的原头蚴和囊液组分分别进行与病人血清的WB实验，以便验证包虫病人和正常西藏人血清与提取的全蛋白之间是否有免疫反应。

(2)因部分样本的原头蚴组分提取到的蛋白总量很少，且均包含在囊液组分鉴定到的包虫蛋白质中，故主要进行了囊液透明样本的囊液组分蛋白的Western Blotting实验(一抗为摘除过肝脏包虫囊的病人在手术前抽取的血样，被认为是患有包虫病的确定为阳性的血样。二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L)，厂商：碧云天；货号：A0201)，结果如图1所示，以样本编号为1的病人血清为例展示，包虫病人和正常西藏人血清与7个囊液透明样本囊液组分蛋白的免疫反应图谱。结果证明，囊液全蛋白对病人血清存在强烈的免疫反应，而对正常西藏人血清基本无反应。其他病人血清和正常西藏人血清对7个样本蛋白的免疫反应图谱均与样本编号为1的病人相似。

(3)又根据这7个囊液组分的SDS-PAGE图谱，对照WB的免疫条带对SDS-PAGE胶进行了切胶酶解，以期能够通过切胶分离鉴定到相应分子量区段里的更多包虫蛋白，增加找到与血清发生免疫反应的包虫抗原的几率。另外，这样可以减少高丰度蛋白对鉴定的影响。

(4)为了减少损失和减轻工作量，本发明统一将7个囊液组分蛋白根据WB免疫条带分成了10个组分，随后各组分分别进行了胶内酶解。

(5)经过QE-HF-X质谱仪的LC-MS/MS分析后，maxquant软件使用与步骤1中相同的数据库进行了蛋白搜库鉴定。结果如表5所示。

(6)通过数据分析可知，1_2、2_2和10_2这三个样本切胶分离所鉴定到的包虫蛋白包含了其余四个样本所鉴定到的包虫蛋白，所以，后续包虫抗原的候选从这三个样本各组分共同鉴定到的包虫蛋白中寻找。

表5七个囊液透明样品中囊液组分切胶酶解的蛋白质鉴定结果

注：括号中的数字表示总鉴定出的蛋白质，而括号外的数字表示每个组分中的包虫蛋白。_2表示囊液。

3、筛选作为候选抗原的包虫蛋白

(1)同一组分在三个样本中鉴定到的共同蛋白作为候选抗原库，最终10个组分一共产生了93个唯一蛋白。

(2)这93个蛋白首先与人的蛋白数据库(UniProt的Homo sapiens蛋白数据库)进行同源比对，删除同源性特别高的蛋白和已经被选为包虫抗原的那些蛋白后，剩余的蛋白进行B细胞抗原表位的预测。

4、抗原表位预测以及重组质粒构建

(1)抗原表位预测使用了一个在线预测工具http://tools.iedb.org/bcell/，只要将蛋白质序列导入即可得到关于此蛋白可能成为抗原表位的序列列表。

(2)本发明根据每一个候选蛋白的抗原表位列表，选取包含一个或多个表位的序列片段组成重组蛋白的序列，并且将此序列导入比对工具(使用的是ExPaSy网站中的比对工具(https://web.expasy.org/blast/))中与人的蛋白质数据库(UniProt的Homosapiens蛋白数据库)进行比对，只有与人的蛋白相似度<＝20％的序列片段才被选为构建重组蛋白。

(3)最终11个蛋白序列片段通过分子克隆技术插入到pET-30a(+)质粒中构建重组质粒，并通过测序确认片段已被插入。

其中，一个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的重组蛋白命名为Cystatin重组蛋白。Cystatin蛋白的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。其抗原表位、核苷酸序列和氨基酸序列详见表6。

该步骤中获得的用于表达Cystatin蛋白的重组表达载体pET-30a-Cystatin的结构描述：将SEQ ID No.2所示DNA片段插入到pET-30a(+)质粒的HindIII(AAGCTT)和XhoI(CTCGAG)之间后得到的重组质粒。经该重组质粒表达出的重组蛋白的N端携带有6His标签。

5、重组蛋白的表达与纯化

(1)重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行小量试表达，确认蛋白可以表达且分子量正确后，再进行扩培。

(2)收集的菌液经过超声提取蛋白后，再通过质粒携带的His-tag进行镍柱纯化，图2展示了本发明Cystatin重组蛋白的纯化结果展示，箭头所示处为目的蛋白。下述实验(如Western Blotting实验和ELISA实验)中采用的是咪唑浓度为200mM时洗脱下的目标蛋白，预估纯度已达到95％左右。

6、Cystatin重组蛋白的Western Blotting验证

(1)纯化后的11个重组蛋白均分别与16个术后包虫病病人血清进行了WesternBlotting实验(一抗为摘除过肝脏包虫囊的病人在手术前抽取的血样，被认为是患有包虫病的确定为阳性的血样。二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L)，厂商：碧云天；货号：A0201)，同时，购买的商品化抗原(包虫病/细粒棘球绦虫抗原为进口天然纯化抗原，分离纯化自细粒棘球绦虫棘球蚴破碎后的可溶性片段。可广泛应用于胶体金、ELISA等。厂家：杭州亿米诺生物科技有限公司，货号：YM-VI08)也与16个血清进行WB实验，结果显示只有4个重组蛋白与病人血清免疫反应大于等于商品化抗原，故选择这4个重组蛋白作为包虫抗原候选进行更多病人血清的ELISA验证试验。Cystatin重组蛋白为其中一个。

(2)图3展示了Cystatin重组蛋白和商品化抗原与16个病人血清的WB实验结果。结果显示：Cystatin重组蛋白的免疫反应率为75％，商品化抗原的免疫反应率也为75％。

表6 Cystatin重组蛋白的B细胞抗原表位、核苷酸序列和氨基酸序列

实施例2、包虫重组抗原Cystatin重组蛋白的ELISA实验验证案例

所检测的对象为14例术后包虫病人血浆(临床上已经确定为阳性)和6例正常西藏人血浆(临床上已经确定为阴性)，按照间接ELISA的标准操作步骤进行实施，结果显示Cystatin重组蛋白(实施例1纯化所得，即图2中咪唑浓度为200mM时洗脱下的目标蛋白)阳性检出率为93％，阴性检出率为100％；而用商品化抗原(包虫病/细粒棘球绦虫抗原，厂家：杭州亿米诺生物科技有限公司，货号：YM-VI08)检测相同的血浆时阳性检出率为86％，阴性检出率为100％。

1、ELISA实验具体操作步骤

(1)抗原定量：每种抗原在包被前均使用移液枪吹匀，并使用微量紫外分光光度计给抗原定量，以确保蛋白未降解。在A280处无吸收峰，则说明抗原量很低不宜用于包被；若蛋白析出或有不溶，则滴加8M尿素后吹匀，离心取上清测浓度。

(2)包被：对比抗原管壁浓度及测量值，就低取值(纯化后测定蛋白浓度会标注在离心管壁，存放在-20℃一段时间后需要重新测浓度，两个浓度就低取值进行ELISA实验)；包被量为2μg/ml、10ml/板，按照实际使用量配制包被抗原量；包被的ELISA板上标记：抗原编号、名称、标签、包被日期及板子编号等，若包被浓度不是2μg/ml则需要标明包被浓度(本实验中Cystatin重组蛋白和商品化抗原的实际包被量具体是200ng/孔)。标记完ELISA板后，加入包被抗原，100μl/孔，4℃包被过夜或37℃包被2h。其中，包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6：Na₂CO₃1.59g；NaHCO₃2.93g，纯水定容至1000ml；最后用pH试纸检测pH值，4℃保存。

(3)洗板：包被完的板子，用洗板机洗板1次，于吸水纸上拍干。50X洗液配方为：154.4g的Tris；149.0g的NaCl；24.0ml的Tween-20；800ml纯水；约45ml浓盐酸调pH7.2，纯水定容到1000ml。4℃保存。

(4)封闭：2％脱脂奶粉作为封闭液进行封闭，200μl/孔，4℃封闭过夜或37℃封闭2h。

(5)洗板：封闭完的板子，用洗板机洗板1次，于吸水纸上拍干。

(6)加一抗(包虫病人血浆或未患包虫病的正常西藏人血浆)：加入相应一抗，使用PBS按照比例1：500(体积比)稀释血浆，37℃孵育1h。

(7)洗板：用洗板机洗板3次以上，于吸水纸上拍干。

(8)加二抗：因一抗来源为人的血浆，故二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L)，厂商：碧云天；货号：A0201)使用山羊抗人1：500(体积比)加入，37℃孵育1h。

(9)洗板：用洗板机洗板3次以上，于吸水纸上拍干。洗板同时，配制好显色液(TMB)。

(10)显色：准备好终止液后，加入显色液100μl/孔，可以晃动板子加速显色过程并注意密切观察。

(11)TMB显色：显色到一定程度时(一般不能让空白和阴性显色太高)，加入50μl/孔终止液，加入终止液后需要静置10min以上，使终止彻底、颜色均一(可以晃动板子加速终止过程)，终止后读数。

(12)读数：酶标仪必须预热30min以上；TMB显色检测波长为：450nm。打开相应的酶标仪测量软件，读数。将数据存储到指定位置并完善数据。

(13)注意事项：96孔板用枪加样时，注意避免产生气泡，并且避免所加样品挂壁。加完样，整板观察，要求孔底无气泡；发现气泡时，震荡板子或用枪头去除气泡。洗板时需密切关注，确保洗板完全、彻底。显色时需密切关注，结合阴性、空白、阳性对照的显色情况，及时终止。

2、ELISA结果及分析

(1)包虫抗原免疫14例术后包虫病人血浆(确定为阳性)和6例正常西藏人血浆(确定为阴性)的OD值检测结果见图4。

(2)阴阳性判断标准：选取阴性血清样本的平均值(X)，标准差(SD)，其置信区间上限cut-off值为X+3SD。待测样本在450nm处的OD值大于等于X+3SD可判为阳性，小于X+3SD可判为阴性。

(3)通过计算，使用本发明的包虫抗原Cystatin重组蛋白免疫14例术后包虫病人血浆(确定为阳性)和6例正常西藏人血浆(确定为阴性)，其阳性检出率分别为93％，阴性检出率为100％；而用商品化抗原检测相同的血浆时阳性检出率为86％，阴性检出率为100％。可见，本发明所提供的新的包虫抗原Cystatin重组蛋白与现有的商品化抗原相比，在保证阴性检出率的情况下，在阳性检出率上更胜一筹。极大的改善了现有商品化抗原检测结果出现假阴性的问题。本发明扩充了包虫抗原库，对诊断人源包虫病有一定的贡献。

<110> 深圳华大基因股份有限公司

<120> 一种包虫病新抗原Cystatin蛋白

<130> GNCLN200348

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 178

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Pro Ile Tyr Ser Ser Asp Asn Gly Glu Glu Cys Ser Lys Pro Cys Tyr

1 5 10 15

His Gly Leu Ser Gly Asn Lys Gln Ala Ile Ala Ala Ile Val Tyr Gln

20 25 30

Pro Trp Arg Asp Pro Lys His His Ile Thr Phe Lys Pro Asn Asn Glu

35 40 45

Gly Ser Ala Asp Phe Ser Lys Asn Gly Lys Leu Ile Thr Ser Cys Glu

50 55 60

Leu Pro Glu Gly Thr Ile Leu Ser Pro Lys Glu Met Thr Ser Glu Gln

65 70 75 80

Phe Gln Glu Val Val Arg Ser Gly Ile Glu Arg Leu Asp Arg Asn Ala

85 90 95

Ser Arg Cys Phe Arg Tyr Glu Leu Met Asp Val Ile Glu Gly Lys Arg

100 105 110

Met Met Thr Ser Asn Leu Lys Tyr Glu Trp Arg Met Lys Val Lys Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Glu Ser Met Leu Gly Cys Ile Gly Ala Cys Ala Asp Asp

130 135 140

Cys Ser Gly Ile Glu Ile Tyr Arg Ala Ser Ala Phe Ala Ser Pro Phe

145 150 155 160

His Gly Gly Thr Pro Glu Ile Leu Ser Ile Glu Tyr Gln Asp Pro Thr

165 170 175

Ala Leu

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

cctatctatt ccagtgataa tggcgaggaa tgttcaaagc cttgctacca tggtttaagt 60

ggaaataagc aagcaatagc tgcgattgtg tatcaaccat ggagggatcc caagcatcac 120

atcactttta agcccaacaa tgaaggttct gcagatttca gtaaaaatgg aaagctaatt 180

actagctgtg aattaccaga agggacgatt ctgtccccta aagaaatgac atcagaacaa 240

tttcaagagg tggtccgaag tggtatcgaa agattggata gaaatgccag cagatgcttt 300

cggtacgagc tcatggatgt gattgaagga aagagaatga tgacctcgaa cctgaagtat 360

gaatggagga tgaaagtgaa gagaatttac gatgagtcta tgcttggttg tattggtgcc 420

tgcgccgacg actgctcagg cattgaaatt tacagggcca gtgccttcgc aagtccgttc 480

cacggcggaa caccagagat cctgagtatt gagtatcaag accccacagc ccta 534

Claims

1.蛋白质，为如下任一：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1所示蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID No.2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞。

5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于诊断因感染细粒棘球蚴所致疾病的产品中的应用。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于诊断包虫病的产品中的应用。

7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于检测包虫病特异性抗体的产品中的应用。

8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在制备用于检测待测者血清中是否含有包虫病特异性抗体的产品中的应用。

9.试剂盒，含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞；所述试剂盒具有如下功能中的至少一种：

（C1）诊断因感染细粒棘球蚴所致疾病；

（C2）诊断包虫病；

（C3）检测包虫病特异性抗体；

（C4）检测待测者血清中是否含有包虫病特异性抗体。