CN117903274A - 一种抗原多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗原多肽及其应用，所述抗原多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的一种或多种。本发明的抗原多肽，其纯度高达99％，丰富了包虫单一抗原数据库，为实验室诊断包虫病的特异性和灵敏性提升提供了空间。
Description
技术领域
本发明涉及免疫生物学技术领域，具体为涉及一种抗原多肽及其应用。
背景技术
包虫病(cystic echinococcosis；CE)又称棘球蚴病，是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus；Eg)的幼虫寄生于人体及某些动物的肝、肺、脑等组织器官所致的一种严重的人畜共患寄生虫病，严重危害人们健康和畜牧业的发展。
影像学检测是比较常见的包虫病诊断方法，但是由于包虫病潜伏期较长，并且只有在包虫病形成的包囊大到一定程度时才能通过影像学检测到，所以需要血清学检测作为影像学检测的重要补充手段。目前，商品化包虫抗原是天然纯化抗原，分离纯化自细粒棘球蚴破碎后的可溶性抗原片段，是一种包含多种包虫蛋白的混合物，混合的蛋白越多越容易在血清检测时产生更多假阳性或假阴性结果。
获取单一抗原，以用于包虫病检测，减少假阳性或假阴性结果，成为目前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种纯度较高的抗原多肽，可用于血清学检测包虫病，扩大了抗原多肽的选择范围；为此，本发明还提供了一种上述抗原多肽在制备诊断、治疗或预防包虫病的产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一种抗原多肽，所述抗原多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的一种或多种。
作为优选的实施例，所述抗原多肽来自细粒棘球绦虫。
本发明的第二方面，提供上述抗原多肽的制备方法，包括如下步骤：
S1、向包虫病患者肝脏包囊组织裂解样品中加入HLA-I抗体或HLA-II抗体，将HLA-多肽免疫共沉淀下来；
S2、将抗体-HLA蛋白和多肽分离，筛选，获得上述的抗原多肽。
作为优选的实施例，所述步骤S2中的筛选包括普适性筛选和免疫原性测定。
通过免疫共沉淀技术，利用HLA-I、HLA-II抗体将HLA-多肽从细胞裂解液中免疫共沉淀下来，接着将抗体-HLA蛋白和多肽分离，获得纯化的多肽，通过该方法可获得179条多肽，HLA I结合肽段中有105条肽段来源于棘球绦虫，HLA II结合肽段中有74条肽段来源于棘球绦虫。并非获得的所有多肽均可用于疫苗和包虫病诊断，进一步通过普适性和免疫原性研究，最终获得上述三条抗原多肽。
通过该方法制备的抗原多肽，与HLA-I、HLA-II分子具有高结合力和优异的免疫原性，且纯度高，可用于疫苗的制备和包虫病的诊断。
本发明的第三方面，提供一种分离的核酸，所述分离的核酸编码上述的抗原多肽。
本发明的第四方面，提供一种重组表达载体，包含上述的核酸。
本发明的第五方面，提供一种包含上述的抗原多肽、上述的核酸或上述重组表达载体的细胞。
本发明的第六方面，提供一种上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的重组表达载体或上述的细胞在制备诊断、治疗或预防包虫病的产品中的应用。
本发明的第七方面，提供一种用于检测包虫病的试剂盒，所述试剂盒包括上述的抗原多肽。
本发明的第八方面，提供一种包虫病的疫苗，所述的疫苗包括上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的重组表达载体或上述的细胞。
作为优选的实施例，所述疫苗还包括免疫学上可接受的载体。
作为优选的实施例，所述免疫学上可接受的载体包括佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂。
本发明的第九方面，提供一种疫苗的制备方法，所述的制备方法包括将上述的抗原多肽与免疫学上可接受的载体混合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的抗原多肽，其纯度高达99％，丰富了包虫病单一抗原数据库，为实验室诊断包虫病的特异性和灵敏性提升提供了空间。
(2)本发明的抗原多肽与HLA-I\II类分子具有高结合力和稳定性，可应用于细粒棘球绦虫病的预防、诊断及治疗。
(3)本发明的抗原多肽可通过化学方式大量合成，为大规模筛选人源包虫病提供了可能。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明实施例1检测肽段在质谱分析结果中的质量误差分布图。
图2是本发明实施例2抗原多肽P1的高效液相色谱图和质谱图，其中2A为高效液相色谱图，2B为质谱图。
图3是本发明实施例2抗原多肽P2的高效液相色谱图和质谱图，其中3A为高效液相色谱图，3B为质谱图。
图4是本发明实施例2抗原多肽P3的高效液相色谱图和质谱图，其中4A为高效液相色谱图，4B为质谱图。
图5是本发明实施例3中CCK-8法检测BMDCs增殖效应谱图，图中*表示P<0.05，****表示P<0.0001。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，以下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
须知，本说明书所附图式绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及能达成的目的下，均应落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
实施例1抗原多肽的筛选
抗原多肽的筛选步骤如下：
1、对手术切除的包虫病患者肝脏包囊组织进行液氮研磨、超声破碎；
2、按0.5g样品加入0.5ml裂解缓冲液的比例加入免疫共沉淀细胞裂解缓冲液(IPlysis buffer，该裂解缓冲液为PBS缓冲液，包括0.25％脱氧胆酸钠，0.2mM碘代乙酰胺，1mMEDTA，1:200蛋白酶抑制剂混合物(sigma，产品编号539131)，1mM苯甲基磺酰氟和1％辛基葡糖苷(sigma)，如上百分数为质量百分数)；
3、4℃条件下裂解2小时，得到组织裂解样品；
4、将组织裂解样品在4℃条件下24000g高速离心1.5小时。离心结束后转移上清至新的EP管后加入20μg HLA-I泛抗体(HLA-I泛抗体，为I型人类白细胞抗原，购自景杰生物，该HLA-I泛抗体为从W632杂交瘤中纯化而得)；
5、4℃条件下孵育1小时，结束后转移上清到新的EP管中，加入10μL蛋白质A/G磁珠(Protein A/G beads，购自金斯瑞生物科技股份有限公司，型号为Protein A/G MagbeadsMX L00894)继续孵育1小时；
6、孵育结束后，1000rpm离心1分钟，沉淀即为结合有HLA-I抗体的蛋白质A/G磁珠，用洗涤缓冲液(wash buffer，包括400mM NaCl溶液和20mM Tris-HCl缓冲液)洗涤磁珠3次。最后用洗脱缓冲液(elute buffer，0.1mol/L的乙酸水溶液)将抗体-HLA-I-多肽从磁珠上洗脱下来；
7、步骤4中的上清转移到新的EP管中，加入20μg HLA-II泛抗体(购自景杰生物，该HLA-II泛抗体为从IVA12杂交瘤中纯化而得)，继续第二轮IP实验；
8、步骤7中开始HLA-II的IP实验后续步骤和步骤4-6一样；
9、用截留率(cutoff)为10kD的超滤器(ultrafilter，购自博奥派克生物)对洗脱产物进行超滤，透过的物质(flowthrough)即为多肽，利用快速抽真空(speed vacuum，采用德国艾本德的真空离心浓缩仪)对多肽进行冷冻抽干；
10、对抽干的多肽进行除盐后真空冷冻干燥；
11、溶解多肽，进行液质联用分析；
12、液相色谱分离条件：C18色谱柱(1.9μm，250mm×75μm)，柱温，室温；流速，300nL/min；液流相组成：A相0.1％甲酸水溶液，B相：0.1％甲酸乙腈溶液；质谱参数设置：离子源电压，2.0KV；质量分析范围350-1800m/z；离子传输管温度，320℃；使用Mascot软件对液质联用(纳升超高效液相色谱仪与四级杆-轨道肼-离子阱三合一质谱仪联用)获得的数据进行分析。
通过上述抗原多肽的筛选过程，可检测到上百条抗原多肽，但是并非所有的抗原多肽均可用于疫苗及诊断、治疗研究。因此，需要对上百条抗原多肽进行精确筛选，筛选方法的选择为成败的关键，筛选方法设计不当，或者导致所获得的抗原多肽数量过多，会给后续的实验过程造成很大的障碍；或者导致无法获得最优的抗原多肽。
本发明通过两个步骤完成筛选，第一步，将获得的179条抗原多肽进行普适性研究，去掉普适性相对较差的抗原多肽；第二步，将经过第一步筛选的抗原多肽进行免疫原性研究，进一步验证所获得抗原多肽的免疫原性。
普适性筛选的过程如下：
收集6名由细粒棘球绦虫导致包虫病的患者手术切除的肝脏组织样本，通过上述多肽筛选获得来源于棘球绦虫的多肽179条，将筛选到的多肽与样本来源进行匹配，判断样本的普适性。
普适性筛选所获得的结果如下：
结果发现抗原肽P1：FLQSEQLT，六个样本中均存在，普适性最佳；抗原肽P2：FEQEMATAA，P3：AFIDTEVAAT，同时存在于三个样本中；还有7种抗原肽同时存在于两个样本中，均具有较好的普适性。其它抗原肽仅存在于1个样本中，抗原肽普适性较弱。
通过普适性比较，发现十种抗原肽存在于至少两个样本中，对普适性最佳的前三种抗原肽(抗原多肽P1、P2、P3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示)进行免疫原性测定(实施例3中测定方法)，免疫原性均较强。三种抗原肽氨基酸序列、对应的HLA分子类型、编码的肽段的基因名称，肽段质荷比，肽段实际质量如表1所示。
表1三种抗原肽的序列及相关特征
为了确保测量结果的准确性，考察肽段在质谱分析结果中的质量误差分布，谱图匹配肽段的得分(表征肽段鉴定的可信度)与质量偏差的分布成负相关关系；得分越高，质量偏差越小。本申请的肽段在质谱分析结果中的质量误差分布图，如图1所示。从图1中可以看出，绝大多数谱图的一级质量误差在0.01Da以内，符合轨道阱质谱的高精度特性，表明质谱仪的质量精度正常，不会由于质量偏差过大而影响到蛋白的定性定量分析。
实施例2抗原多肽的化学合成及表征
由中肽生化有限公司对抗原多肽P1、P2、P3进行人工合成；并采用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)分析其纯度和分子量。
化学合成后，HPLC检测结果显示，抗原多肽P1在10.520min时出现多肽峰值，纯度为99.3％，MS分析P1的分子量为965.1g/mol(图2A-B)；P2在8.586min时出现多肽峰值，纯度为98.8％，MS分析P2的分子量为997.1g/mol(图3A-B)；P3在7.260min时出现多肽峰值，纯度为99.7％，MS分析P3的分子量为1037.1g/mol(图4A-B)。
实施例3抗原多肽的免疫原性研究
(1)小鼠骨髓来源树突状细胞的分离和培养
①取6～8周龄的C57BL/6小鼠(购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)，腹腔注射0.1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，采用颈椎脱臼法将其处死，75％酒精浸泡消毒，无菌环境下分离小鼠股骨和胫骨，使用1ml注射器吸取RPMI-1640细胞培养液将骨髓腔冲洗4～6次，并使用100μm筛网过滤，直至骨腔冲洗变白；
②对细胞悬液进行离心(4℃，350×g，5min)，弃上清，使用红细胞裂解液将沉淀重悬，裂解2～3min，配制RPMI-1640完全培养基(含有10％胎牛血清、1％青霉素及链霉素)重悬；
③将分离的细胞悬液调节细胞浓度为1×106个/ml，加入小鼠粒细胞集落刺激因子rmGM-CSF和小鼠白细胞介素细胞因子IL-4(购自Peprotech，美国)，工作浓度分别为20ng/m1和10ng/m1，培养于6孔板中，放置于37℃，5％CO2培养箱进行培养；
④培养至第三天和第五天进行半量换液，并补足细胞因子rmGM-CSF和IL-4；
⑤培养至第七天，收集所有的悬浮细胞，即为小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)。
(2)CCK-8法体外检测BMDCs的增殖效应
①收集分离培养于第七天的BMDCs，调整细胞浓度为1×106个/ml，补足细胞因子rmGM-CSF和IL-4，培养于96孔板，每孔100μl；
②实验组分别加入10μg/ml的P1、P2、P3多肽，LPS(刺激浓度0.5μg/ml)作为阳性对照组(LPS可显著诱导BMDCs的增殖)，磷酸缓冲盐溶液(PBS)组为阴性对照组，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h；
③于每孔中加入CCK-8试剂10μl，培养箱中培养2～3h，酶标仪检测450nm处吸光值，计算细胞活力。
结果显示：体外处理BMDCs 48h后，脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为阳性对照组、多肽刺激P1组、P2组及P3组在450nm处吸光值分别为(1.48±0.02)、(1.37±0.01)、(1.38±0.00)及(1.30±0.01)，相比于阴性对照组(1.26±0.01)，均有显著性差异(P<0.05)，表明3种抗原多肽(P1-P3)均具有体外刺激BMDCs增殖的能力(如图5所示)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽来自细粒棘球绦虫。
3.一种权利要求1所述抗原多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、向包虫病患者肝脏包囊组织裂解样品中加入HLA-I抗体或HLA-II抗体，将HLA-多肽免疫共沉淀下来；
S2、将抗体-HLA蛋白和多肽分离，筛选，获得上述的抗原多肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的筛选包括普适性筛选和免疫原性测定。
5.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸编码如权利要求1所述的抗原多肽。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸。
7.一种包含权利要求1所述的抗原多肽、权利要求5所述的核酸或权利要求6所述重组表达载体的细胞。
8.一种权利要求1所述的抗原多肽、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的重组表达载体或权利要求7所述的细胞在制备诊断、治疗或预防包虫病的产品中的应用。
9.一种用于检测包虫病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的抗原多肽。
10.一种包虫病的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包括权利要求1所述的抗原多肽、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的重组表达载体或权利要求7所述的细胞。
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