CN116178517A - 一种t细胞抗原多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包虫病相关的抗原多肽、一种编码抗原多肽的核酸及包含该核酸的载体、一种包含抗原多肽或核酸的细胞，同时提供了一种包虫病疫苗，本申请以包虫病重组蛋白P29为研究基础，筛选并优化出有免疫效应的肽表位分子，在诊断包虫病、筛选治疗或预防包虫病的药物及为临床治疗提供决策支持中具有重要价值。

Description

一种T细胞抗原多肽及其应用
技术领域
本发明属于免疫生物学技术领域，具体涉及一种T细胞抗原多肽及其在生物医药中的应用。
背景技术
包虫病是一种寄生虫蚴虫感染人体或者家畜而引发的严重危害人畜健康的慢性感染性疾病，该病广泛的流行于世界各地畜牧业发达地区。包虫病的疫苗研究起步较晚，水平也相对滞后。到目前为止，包虫病的疫苗在国内外还没有一个成功转化为商品的疫苗上市。现有研究表明，细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)作为潜在的疫苗在绵羊中展现出抗细粒棘球蚴的保护作用，rEg.P29免疫绵羊后，保护性免疫力即免于被感染的绵羊比例为94.5％，rEg.P29免疫小鼠后，再用原头蚴腹腔注射攻击小鼠，得到96.6％的保护性免疫力，rEg.P29具有作为包虫病疫苗转化应用的可能性。
从近些年来分子疫苗的研究进展来看，疫苗越来越趋于表位化，分子的小型化，这样能让疫苗的免疫效果更专一，副作用更小。
历史上，活减毒或灭活形式的微生物病原体(病毒、细菌等)被用于诱导抗原特异性反应，保护宿主免受感染。基于所使用的病原体，这样的疫苗配方可能包含几十到几百种蛋白质。然而，保护性免疫通常依赖于这些配方中的少数精选蛋白，而大多数蛋白对诱导保护性免疫是不必要的。此外，这些额外的蛋白质可能会引起过敏和/或反应性反应，因此需要从疫苗配方中消除它们。这一理论基础导致了人们对亚单位疫苗的兴趣，即在疫苗配方中使用单个或选择少数微生物蛋白来诱导保护性免疫。这个逻辑的延伸是，即使是单个蛋白质也包含数百个抗原表位，而所有这些都是不必要的；而有些甚至可能不利于保护性免疫的诱导。这引起了人们对肽疫苗的兴趣，该疫苗只包含能够诱导阳性的、理想的T细胞和B细胞介导的免疫应答的表位。这些疫苗中使用的肽是由20-30个氨基酸序列合成而成的免疫原性肽分子，代表抗原的特定表位。一方面，由于表位是较大蛋白中的抗原决定因素，这些多肽被认为足以激活适当的细胞和体液反应，同时消除过敏和/或反应性反应。此外，肽疫苗可通过形成多个非相邻的免疫显性表位和/或在病原体不同血清/菌株之间保守的表位，用于诱导对给定病原体的多个血清学变异(血清)或菌株的广谱免疫。
非专利文献Epitope specificities and antibody responses to the EG95hydatid vaccine(D.J.WOOLLARD等，Parasite Immunology，1998:20:535–540)公开了一种EG95包虫抗原；
非专利文献Immunoprotection of recombinant Eg.P29 against Echinococcusgranulosus in sheep(Hao Wang等，Vet Res Commun(2016)40:73–79)公开了Eg.P29重组蛋白；
专利文献CN105343873A公开了一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.P29分子工程疫苗；
以上文献均未公开本申请中表位化、小型化具有免疫原性的抗原多肽(表位肽)，即使公开了针对rEg.P29的疫苗也是表达整个重组蛋白的疫苗，而全长蛋白很可能产生免疫副作用。
因此，提供一种具有一定强度免疫原性的小型化的抗原多肽，是开发小型肽疫苗，进而有效治疗包虫病的重要基础。
发明内容
本申请以疫苗分子rEg.P29为研究基础，筛选并优化出有免疫效应的特定序列的抗原多肽，该抗原多肽能够诱导rEg.P29免疫小鼠淋巴细胞活化，且使其增殖。而且，冻干的肽的化学上比较稳定，采用该抗原多肽制备的疫苗在常规的冷链储存运输下依然稳定。更重要的是，通常情况下多肽的活化特异性细胞以及促进细胞增殖方面的效果都会弱于完整的蛋白，但是本申请提供的抗原多肽基本跟完整的蛋白效果接近。
本发明的第一方面，提供了一种抗原多肽，所述的抗原多肽来源于包虫病重组蛋白或其片段。
优选的，所述的包虫病选自多房棘球绦虫或细粒棘球绦虫感染所致。
优选的，所述的抗原多肽包含包虫病重组蛋白上的表位。
优选的，所述的抗原多肽来源于细粒棘球蚴重组蛋白rEg.P29上的表位。
进一步优选的，所述的抗原多肽来源于细粒棘球蚴重组蛋白rEg.P29上的T细胞抗原表位。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原多肽选自一个或多个SEQID NO：47的T细胞抗原表位。
所述的T细胞抗原表位为可以与TCR或抗体结合的肽段。
优选的，所述的T细胞抗原表位可以为SEQID NO：47上一段连续、不连续的氨基酸序列。
优选的，所述的T细胞抗原表位可以为SEQID NO：47组成的重组蛋白上的空间上相邻的氨基酸残基组成。
优选的，所述的抗原多肽上包含至少一个抗原表位。
优选的，所述的抗原多肽包含SEQID NO：47中至少连续8个氨基酸。进一步优选的，所述的抗原多肽长度小于238aa。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原多肽包含SEQID NO：47中连续8-20个氨基酸，进一步优选的，所述的抗原多肽包含SEQID NO：47中连续8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。
优选的，所述的抗原多肽包括：
A)SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上的氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上的氨基酸序列同一性为80％以上；
C)与SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原多肽包含一个T细胞抗原表位，优选为SEQ ID NO：1-46中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原多肽包含两个以上T细胞抗原表位，优选为SEQ ID NO：1-46中的两种以上。其中，所述的两种以上的T细胞抗原表位直接连接或者通过接头连接。
优选的，所述的抗原多肽诱导特异性T细胞免疫反应，所述的特异性T细胞分泌的细胞因子包括：γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
优选的，所述的抗原多肽能同时刺激产生CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+的T细胞。
优选的，所述的抗原多肽诱导和辅助B细胞产生针对包虫病的特异性抗体。
本发明的第二方面，提供了一种核酸，其编码上述的抗原多肽。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，其包含编码上述的抗原多肽的核酸。
优选的，所述的表达载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如启动子、终止子或酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体、真核表达载体或病毒表达载体，优选为原核表达载体，例如大肠杆菌系列。
优选的，所述的表达载体可以为质粒、粘粒、噬菌体或病毒等。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述抗原多肽、上述核酸或上述表达载体的细胞。
本发明的第五方面，提供一种包虫病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括检测上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体或上述的细胞的试剂。
本发明的第六方面，提供了一种疫苗，所述的疫苗包含上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体或上述的细胞，以及免疫学上可接受的载体。
优选的，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂等等。
优选的，所述佐剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)、CpG、铝盐佐剂(氢氧化铝或者磷酸铝)、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子、GM-CSF、IL-17、IFNg、IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP 1、TAP2以及其功能性片段。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂，所述的佐剂为FCA或CpG佐剂。
优选的，所述的疫苗包括肽段疫苗、蛋白疫苗、mRNA疫苗和DNA疫苗。
本发明的第七方面，提供了上述疫苗的制备方法，所述的制备方法包括将上述的抗原多肽与免疫学上可接受的载体混合。
优选的，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂等等。
优选的，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂，进一步优选的，所述佐剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)、CpG、铝盐佐剂(氢氧化铝或者磷酸铝)、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子、GM-CSF、IL-17、IFNg、IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
优选的，所述的佐剂为FCA或CpG佐剂。
本发明的第八方面，提供了一种抗包虫病抗体的筛选方法，所述的筛选方法包括将待筛选物与上述的抗原多肽混合。
其中，所述的抗体筛选的方法不是治疗方法。该方法用来筛选中和抗体，对抗体的药效进行检测和比较，以确定哪些抗体可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第九方面，提供了一种诱导特异性免疫应答的方法，包括向个体施加上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体或上述的疫苗。
优选的，所述的特异性免疫应答包括T细胞应答和/或B细胞应答。
优选的，上述免疫应答是针对包虫病的免疫应答，进一步优选的，上述免疫应答是针对包虫病重组抗原P29的免疫应答。
优选的，所述的T细胞应答促使T细胞分泌的细胞因子包括：γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
优选的，所述的特异性免疫应答能同时产生CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+的T细胞。
本发明的第十方面，提供了一种pMHC分子，所述的pMHC分子包含MHC，以及上述的抗原多肽。
本发明的第十一方面，提供了上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体、上述的细胞、上述的疫苗、上述的pMHC分子或上述的方法在制备预防和/或治疗包虫病的产品中的应用。
优选的，所述的产品包括但不限于疫苗、抗体、药物、试剂盒；优选地，所述的产品为疫苗和/或抗体。
本发明的第十二方面，提供了上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体、上述的细胞、上述的试剂盒、上述的pMHC分子或上述的疫苗在预防和/或治疗包虫病中的应用。
本发明的第十三方面，提供了一种抗体，所述的抗体可以与本发明所述的抗原多肽结合。
本发明中的抗原多肽，也可以用于免疫学方法进行抗体鉴定。所述的免疫学方法例如微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)、免疫印迹法、快速测定法(如快速斑点免疫结合试验、液相芯片法等)。
本发明所述的“多个”为2个以上，包括但不限于2-50个，优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“预防”表示为了阻止或延迟疾病或病症或症状在机体内的发生而实施的方式。
本发明所述的“核酸”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本问列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。
有益效果：
提供了最短且最有效的rEg.P29的T细胞表位作为rEg.P29的抗原多肽的核心序列，该抗原多肽仅包含15aa的氨基酸，能有效刺激细胞因子产生，促进T细胞活化和增殖并且能同时刺激产生CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+的T细胞。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：rEg.P29表达纯化的SDS-PAGE分析，其中M为marker，泳道1为IPTG诱导前含有pET28a的大肠杆菌；泳道2为IPTG诱导6h后含有pET28a-P29的大肠杆菌；泳道3为通过his亲和层析纯化的rEg.P29；
图2：小鼠免疫实验方案，各组小鼠分别皮下注射rEg.P29+FCS、rEg.P29+CpG或PBS，其中，W代表周，-2、-1分别代表收集样本前三周、前两周；
图3：rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞中的特异性细胞因子检测结果，其中，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度，分别用PBS，rEg.P29+FCA和rEg.P29+CpG组小鼠脾脏淋巴细胞加入rEg.P29刺激培养三天后收集培养上清，细胞因子释放结果；
图4：rEg.P29的T细胞抗原多肽设计示意图；
图5：45条T细胞表位混合肽筛选结果，分别用PBS，rEg.P29+FCA和rEg.P29+CpG组小鼠脾脏淋巴细胞，加入T细胞表位混合肽或rEg.P29刺激培养三天后收集培养上清，细胞因子释放结果；
图6：分别用ID15、ID16、ID17、ID18、ID19以及rEg.P29刺激rEg.P29+FCA免疫、rEg.P29+CpG免疫或PBS组的小鼠脾脏淋巴细胞，细胞因子释放结果，其中，ns代表非显著性差异，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图7：T细胞抗原多肽以及rEg.P29刺激rEg.P29+FCA免疫、rEg.P29+CpG免疫或PBS组小鼠脾脏淋巴细胞，细胞因子的释放结果，其中，ns代表非显著性差异，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图8：T细胞抗原多肽或rEg.P29刺激rEg.P29+FCA免疫、rEg.P29+CpG免疫或PBS组的小鼠脾脏淋巴细胞，ELISPOT检测产生特异性IFN-γ及IL-4的细胞数，其中，A、C分别为产生特异性IFN-γ的细胞或特异性IL-4的细胞结果，B、D分别对应A、C具体细胞数统计结果，ns代表非显著性差异，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图9：流式细胞术检测示意图；
图10：T细胞抗原多肽或rEg.P29刺激rEg.P29+FCA免疫、rEg.P29+CpG免疫或PBS组的小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ的细胞比例，其中，ns代表非显著性差异，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图11：rEg.P29刺激诱导rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠脾脏淋巴细胞活化结果，其中，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图12：rEg.P2986-100刺激诱导rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠脾脏淋巴细胞活化结果，其中，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图13：rEg.P29刺激诱导rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠脾脏淋巴细胞增殖结果，其中，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图14：rEg.P2986-100刺激诱导rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠脾脏淋巴细胞增殖结果，其中，*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；
图15：试剂稀释梯度示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 rEg.P29的表达纯化
rEg.P29开放阅读框氨基酸序列(SEQ ID NO：47)
MSGFDVTKTFNRFTQRAGELVNKNEKTSYPTRTSDLIHEIDQMKAWISKIITATEEFVDINIASKVADAFQKNKEKITTTDKLGTALEQVASQSEKAAPQLSKMLTEASDVHQRMATARKNFNSEVNTTFIEDLKNFLNTTLSEAQKAKTKLEEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAKWEAEVRKDESDFDRVHQESLTIFEKTCKEFDGLSVQLLDLIRAEKNYYEACAKECSMMLGE
取出本室保存的含有rEg.P29/pET28a重组质粒及空载质粒pET28a的BL21菌株，在超净工作台上用接种环挑取菌株，分别接种于卡那霉素(Kana)终浓度为50ug/mL的LB固体培养基平板培养皿，放入提前开好的37℃培养箱，过夜。次日观察菌落生长情况，挑取单个单克隆菌落，将重组菌接种于含卡那霉素(Kana)终浓度为50ug/mL的LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡过夜，200rpm至有明显黄色在OD600nm波长下OD＝0.6时，再以1∶100的比例接种于LB液体培养基中扩大培养，37℃培养6h后OD＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇床振荡诱导6h，收集菌体，12％SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。将诱导表达的菌液置于超速离心机中，在4℃，8000rpm/min的条件下离心10mins，收集菌体备用。
rEg.P29的纯化：诱导表达后，经检测该蛋白属于融合蛋白，纯化后得到纯度较高的重组蛋白rEg.P29，SDS-PAGE可在31KD左右检测到目的蛋白(图1所示)。BCA法检测蛋浓度，调整浓度为1mg/mL储存备用，内毒素含量为0.356EU/mL。
实施例2 rEg.P29免疫小鼠诱导特异性细胞因子产生
将纯化后的rEg.P29(1mg/mL)，与弗氏佐剂(rEg.P29与弗氏佐剂的体积比为1:5)或CpG佐剂(rEg.P29与CpG佐剂的体积比为1:2)进行混合，总体积100μl，剩余部分用PBS补足，腹部皮下三点免疫，间隔7天进行一次加强(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂)，对照组同法注射PBS 100μL/只，免疫方案如图2所示。
(1)小鼠脾脏淋巴细胞的分离
分离脾部周围多余组织，取全脾，放入装有Hank’s的15ml离心管中置于冰上，提取细胞时先用Hank’s洗涤两遍，于70μm filter中用高压灭菌五毫升注射器的活塞轻轻研磨，边研磨边加入Hank’s冲洗；将获得的滤液离心弃上清，用过Hank’s重悬平铺在小鼠脾脏淋巴细胞分离液面上2200转室温离心20分钟(升7降0)。离心后吸取白膜层用Hank’s洗涤并再次离心，1800转室温离心8分钟，弃上清，用完全1640培养液重悬并计数。
(2)特异性细胞因子检测
分离rEg.P29免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，加入rEg.P29+Anti-CD28，37℃，5％CO2刺激培养72h，ELISA检测培养上清中细胞因子。
检测步骤如下：
1.包被捕获抗体(capture antibody)：用包被液1:250倍稀释捕获抗体，混匀，100μL/孔，96孔板，盖上锡箔纸，湿盒中4℃冰箱过夜；
2.洗板：弃液，洗液洗3次，摇床，1分钟/次，最后一次尽量拍干残留的液体；
3.封闭：试剂稀释液，200μL/孔，湿盒中，室温1小时；
4.标准品和样本准备：(封闭期间)
①标准品：用试剂稀释液按下图15梯度稀释标准品；
②样本：冻存样本提前复融，避免反复冻融样本；
用试剂稀释液按适宜的比例稀释样本，以保证样本中细胞因子的浓度在检测范围之内。
5.洗板：弃液，洗液洗3次，摇床，1分钟/次，最后一次尽量拍干残留的液体；
6.加标准品和样本：根据96孔板布局，在相应的孔中加标准品和样本，100μL/孔，摇床上混匀，湿盒中，室温2小时；
标准品：每个浓度2复孔，一般位置为1B～H，2B～H
样本：3复孔
7.洗板：弃液，洗液洗5次，摇床，1分钟/次，最后一次尽量拍干残留的液体；
8.加检测抗体(Detection antibody)和酶(Sav-HRP)：
用试剂稀释液按1:250倍稀释检测抗体和HRP；混匀，100μL/孔，湿盒中，室温1小时；
9.洗板：弃液，洗液洗7次，摇床，1分钟/次，最后一次尽量拍干残留的液体；
10.显色：底物TMB，100μL/孔，湿盒中室温，避光，显色时间不超过30分钟；
11.终止：终止液，50μL/孔，摇床上混匀，波长λ＝450nm读板。
12.数据处理。
分别于第三次免疫后1,2,4,8,16周分离rEg.P29+弗氏佐剂，rEg.P29+CpG佐剂和PBS对照组小鼠脾脏淋巴细胞，将其分别加入rEg.P29包被的微量反应孔中，使用ELISA方法检测培养上清中细胞因子。rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ，IL-2和TNF-α含量明显高于对照组，这些细胞因子对于对抗寄生虫感染具有重要意义(图3)，差别具有统计学意义，而无IL-4和IL-10产生。
实施例3 rEg.P29的T细胞抗原多肽筛选，优化及鉴定
(1)rEg.P29的T细胞表位筛选
将rEg.P29的238个氨基酸按照步移重叠的方式合成45条重叠肽，每条15个氨基酸，每条肽之间重叠10个氨基酸，45条肽覆盖rEg.P29全长，rEg.P29的T细胞表位设计示意图如图4所示，氨基酸序列如表1所示。同实施例2，在末次免疫后两周分离rEg.P29免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，将合成好的45条肽相邻三个分为一组(例如ID1-3；ID4-5等)加Anti-CD28，用来刺激rEg.P29免疫和对照组的小鼠脾脏淋巴细胞37℃，5％CO2培养72h，ELISA检测培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-2，如图5所示，ID16-18可以刺激rEg.P29免疫的小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ和IL-2。
接下来我们分别用ID15,ID16,ID17,ID18,ID19以及rEg.P29加Anti-CD28刺激rEg.P29免疫和对照组的小鼠脾脏淋巴细胞37℃，5％CO2培养72h，ELISA检测培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-2，如图6所示，ID18和ID19相对于其他肽段可以刺激产生更多的细胞因子IFN-γ和IL-2。
表1：各rEg.P29的T细胞表位序列
Figure BDA0003376772250000071
/>
Figure BDA0003376772250000081
(2)rEg.P29的T细胞表位优化和鉴定
为了进一步优化rEg.P29的T细胞表位，人工合成了覆盖ID18和ID19全长的rEg.P2986-105(SEQ ID NO：46)以及它们的重叠部分rEg.P2991-100，然后分别用rEg.P2986-100(ID18),rEg.P2991-100,rEg.P2986-105，rEg.P2991-105以及rEg.P29加Anti-CD28刺激rEg.P29免疫和对照组的小鼠脾脏淋巴细胞37℃，5％CO2培养72h，ELISA检测培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-2，如图7所示，rEg.P2986-105和rEg.P2986-100相对于其他肽段可以刺激产生更多的细胞因子IFN-γ和IL-2，并且它们之间没有统计学差异。
为了验证以上结果，我们又通过ELISPOT和流式细胞术来对以上两个肽段进行分析。rEg.P2986-105，rEg.P2986-100或rEg.P29加Anti-CD28刺激或不刺激rEg.P29免疫和对照组的小鼠脾脏淋巴细胞37℃，5％CO2培养24h，ELISPOT检测产生特异性IFN-γ的细胞数，具体操作如下：
试剂准备：
1.包被液(1×PBS)：1L pH 7.2，
8g氯化钠(NaCl),0.2g氯化钾(KCl),1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4),0.24g磷酸氢二钾(KH2PO4),加900mL双蒸水(ddH2O)；完全溶解后，调整pH值至7.2，加双蒸水(ddH2O)定容至1L，高压灭菌或无菌过滤后保存于4℃。
2.封闭液：细胞培养基(完全1640)
3.洗液Ⅰ：1×PBS+0.05％Tween-20
4.洗液Ⅱ：1×PBS
5.稀释液：1×PBS+10％灭活胎牛血清(FBS)
无菌滤纸：高压灭菌的滤纸，洗板时用。
一.无菌操作(超净台内)
1.紫外灭菌：使用前ELISPOT板照紫外，30分钟；
2.捕获抗体(capture antibody)：用包被液1:200倍稀释捕获抗体，混匀，100μL/孔，湿盒中4℃冰箱过夜；
3.洗板：弃液，用封闭液洗板两次，200μL/孔，3-5分钟/次，最后一次尽量在无菌滤纸上拍干残留的液体；
4.封闭：封闭液，200μL/孔，室温2小时；
5.细胞培养：弃液，将加入刺激剂的细胞悬液接种到板内，200μL/孔，37℃，5％CO2培养2小时至24小时(视具体培养情况而定)；
二.无需无菌操作
6.洗板：弃液，去离子水洗板2次，200μL/孔，3-5分钟/次；洗液Ⅰ洗板3次，200μL/孔，3-5分钟/次，最后一次尽量拍干残留的液体；
7.加检测抗体(Detection antibody)：稀释液1:250倍稀释检测抗体，混匀后用2μm的滤器过滤，100μL/孔，室温孵育2小时；
8.洗板：弃液，洗液Ⅰ洗板3次，200μL/孔，1-2分钟/次，最后一次尽量拍干残留的液体；
9.加酶(Sav-HRP)：稀释液1:100倍稀释酶，混匀，100μL/孔，室温孵育1小时；
10.洗板：弃液，洗液Ⅰ洗板4次，200μL/孔，1-2分钟/次；洗液Ⅱ洗板2次，200μL/孔，1-2分钟/次，弃掉洗液。
11.加底物：底物溶液AEC(BD Bioscience，Cat.No.551951)，100μL/孔，第5-60分钟期间观察点的产生情况，避免产生过高的背景。
12.终止：去离子水洗板终止反应。
13.干燥：室温放置板直至其彻底干燥。
14.数据分析：ELISPOT Reader读板并进行数据分析。
如图8所示，rEg.P2986-105和rEg.P2986-100可以刺激产生特异性IFN-γ的细胞数没有统计学差异。
此外，rEg.P2986-105和rEg.P2986-100均不可以刺激产生特异性IL-4，对应上述ELISA结果。
rEg.P2986-100或rEg.P29加Anti-CD28刺激或不刺激rEg.P29免疫和对照组的小鼠脾脏淋巴细胞37℃，5％CO2培养24h，流式细胞术检测产生特异性IFN-γ的细胞比例，操作如下：
试剂准备：
1.1×磷酸盐缓冲液(1×PBS)：10L pH 7.2～7.4
80.0g氯化钠(NaCl),11.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4),2.0g磷酸二氢钾(KH2PO4),2.0g氯化钾(KCl),加9L双蒸水(ddH2O)。
完全溶解后，调整pH值至7.2～7.4，加双蒸水定容至1L，2～8℃保存。
2.洗液BufferⅡ：1×PBS+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+0.05％叠氮钠(NaN3),2～8℃保存；
3.固定液：4％多聚甲醛PFA，2～8℃保存。
4.破膜液BufferⅢ：1×PBS+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+0.05％叠氮钠(NaN3)+0.1％皂苷(Saponin),2～8℃保存。
实验操作：
离心机4℃提前制冷
待检测细胞根据实验设计，未刺激和/或刺激处理后，调成浓度为1×106/mL的细胞悬液待检测。
一、表面分子染色
1.离心：4℃，1800rpm，8min；
2.重悬：弃上清，加入洗液，2mL/管，离心(4℃,1800rpm,8min)，洗两遍，用洗液重悬细胞，100μL/管；
3.表面染色：根据实验设计，加入相应的表面分子染色抗体；
4.孵育：4℃避光孵育30分钟；
5.洗涤：加入洗液，2mL/管，离心(4℃,1800rpm,8min)，洗两遍，弃上清，加入150-200μL/管的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机；
6.上机检测(Calibur or BD AriaⅡ)。
二、细胞内因子染色
1.离心：4℃，1800rpm，8min；
2.重悬：弃上清，加入洗液，2mL/管，4℃,离心(4℃,1800rpm,8min)，洗两遍，用洗液重悬细胞，100μL/管；
3.表面染色：根据实验设计，加入相应的表面分子染色抗体；
4.孵育：4℃避光孵育30分钟；
5.洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm，8min，两遍；
6.固定：弃上清，加入4％多聚甲醛(PFA)，500μL/管，混匀，室温避光8分钟；
7.洗涤：加入洗液，2mL/管，离心(4℃,2200rpm,8min)，一遍；弃上清，加入破膜液，2mL/管，离心(4℃,2200rpm,8min)，一遍。
8.破膜：弃上清，用破膜液重悬细胞，200μL/管，4℃，放置至少2小时或者过夜；
9.洗涤：加入破膜液，2mL/管，离心(4℃,2200rpm,8min)，洗一遍；
10.重悬：用破膜液重悬细胞，100μL/管；
11.胞内染色：根据实验设计，加入相应的染色抗体，混匀，4℃避光孵育30分钟；
12.洗涤：加入洗液，2mL/管，离心(4℃,2200rpm,8min)，两遍；
弃上清，用150-200μL的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机；
13.上机检测(Calibur or BD AriaⅡ)。
三、数据分析
用软件Flowjo7.6.1分析处理数据。
如图9和10所示，rEg.P2986-105，rEg.P2986-100和rEg.P29均可以刺激产生特异性IFN-γ，并且刺激产生特异性IFN-γ的比例没有统计学差异。
实施例4 rEg.P29和rEg.P2986-100能够诱导rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞活化
鉴于抗原表位是抗原中最小的免疫功能单位，我们最终选择了最短且最有效的rEg.P2986-100(15aa)作为rEg.P29的T细胞抗原多肽。分离小鼠脾脏淋巴细胞，rEg.P2986-100或rEg.P29加Anti-CD28刺激或不刺激rEg.P29免疫和对照组的小鼠脾脏淋巴细胞37℃，5％CO2分别培养24h和72h，流式细胞术检测其活化标志CD25和CD69，具体操作如实施例3表面染色。
如图11，12所示，相对于PBS组，rEg.P2986-100或rEg.P29刺激后第一天CD69的表达升高，第三天CD25的表达明显升高，说明rEg.P2986-100或rEg.P29刺激能够诱导rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞活化。
实施例5 rEg.P29和rEg.P2986-100能够诱导rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖
用预热的PBS洗涤2次，然后加入CFSE(Invitrogen,Carlsbad,USA，终浓度为2.5mol/L)，37℃避光孵育15min。用预冷的RPMI1640(含10％胎牛血清)终止反应，在4℃下孵育5分钟，用预冷的RPMI1640(含10％胎牛血清)洗涤两次。然后将CFSE标记的细胞加入或不加入rEg.P2986-100或rEg.P29进行培养。37℃，5％CO2培养，在第3天，5天分别收集细胞样本，用荧光标记单克隆抗体在4℃避光染色进行表型分析。
如图13，14所示，相对于PBS组，rEg.P2986-100或rEg.P29刺激后CFSE荧光强度均在第三天下降，第五天继续下降，说明rEg.P2986-100或rEg.P29刺激均能够诱导rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖，并且它们两者之间没有统计学差异。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种T细胞抗原多肽及其应用
<130> 1
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Gly Phe Asp Val Thr Lys Thr Phe Asn Arg Phe Thr Gln
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Thr Lys Thr Phe Asn Arg Phe Thr Gln Arg Ala Gly Glu Leu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Arg Phe Thr Gln Arg Ala Gly Glu Leu Val Asn Lys Asn Glu
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Gly Glu Leu Val Asn Lys Asn Glu Lys Thr Ser Tyr Pro
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Asn Lys Asn Glu Lys Thr Ser Tyr Pro Thr Arg Thr Ser Asp
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Thr Ser Tyr Pro Thr Arg Thr Ser Asp Leu Ile His Glu Ile
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Arg Thr Ser Asp Leu Ile His Glu Ile Asp Gln Met Lys Ala
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Ile His Glu Ile Asp Gln Met Lys Ala Trp Ile Ser Lys Ile
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Gln Met Lys Ala Trp Ile Ser Lys Ile Ile Thr Ala Thr Glu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Trp Ile Ser Lys Ile Ile Thr Ala Thr Glu Glu Phe Val Asp Ile
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Thr Ala Thr Glu Glu Phe Val Asp Ile Asn Ile Ala Ser Lys
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Phe Val Asp Ile Asn Ile Ala Ser Lys Val Ala Asp Ala Phe
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asn Ile Ala Ser Lys Val Ala Asp Ala Phe Gln Lys Asn Lys Glu
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Val Ala Asp Ala Phe Gln Lys Asn Lys Glu Lys Ile Thr Thr Thr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Lys Asn Lys Glu Lys Ile Thr Thr Thr Asp Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Lys Ile Thr Thr Thr Asp Lys Leu Gly Thr Ala Leu Glu Gln Val
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Lys Leu Gly Thr Ala Leu Glu Gln Val Ala Ser Gln Ser Glu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Leu Glu Gln Val Ala Ser Gln Ser Glu Lys Ala Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Ser Gln Ser Glu Lys Ala Ala Pro Gln Leu Ser Lys Met Leu
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Lys Ala Ala Pro Gln Leu Ser Lys Met Leu Thr Glu Ala Ser Asp
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Leu Ser Lys Met Leu Thr Glu Ala Ser Asp Val His Gln Arg Met
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Thr Glu Ala Ser Asp Val His Gln Arg Met Ala Thr Ala Arg Lys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Val His Gln Arg Met Ala Thr Ala Arg Lys Asn Phe Asn Ser Glu
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ala Thr Ala Arg Lys Asn Phe Asn Ser Glu Val Asn Thr Thr Phe
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asn Phe Asn Ser Glu Val Asn Thr Thr Phe Ile Glu Asp Leu Lys
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Val Asn Thr Thr Phe Ile Glu Asp Leu Lys Asn Phe Leu Asn Thr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ile Glu Asp Leu Lys Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser Glu Ala
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser Glu Ala Gln Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Thr Leu Ser Glu Ala Gln Lys Ala Lys Thr Lys Leu Glu Glu Val
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gln Lys Ala Lys Thr Lys Leu Glu Glu Val Arg Leu Asp Leu Asp
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Lys Leu Glu Glu Val Arg Leu Asp Leu Asp Ser Asp Lys Thr Lys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Arg Leu Asp Leu Asp Ser Asp Lys Thr Lys Leu Lys Asn Ala Lys
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ser Asp Lys Thr Lys Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gln Lys
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gln Lys Ala Lys Trp Glu Ala
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Thr Ala Glu Gln Lys Ala Lys Trp Glu Ala Glu Val Arg Lys Asp
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Ala Lys Trp Glu Ala Glu Val Arg Lys Asp Glu Ser Asp Phe Asp
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Glu Val Arg Lys Asp Glu Ser Asp Phe Asp Arg Val His Gln Glu
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Glu Ser Asp Phe Asp Arg Val His Gln Glu Ser Leu Thr Ile Phe
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Arg Val His Gln Glu Ser Leu Thr Ile Phe Glu Lys Thr Cys Lys
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Ser Leu Thr Ile Phe Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp Gly Leu
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp Gly Leu Ser Val Gln Leu Leu
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Glu Phe Asp Gly Leu Ser Val Gln Leu Leu Asp Leu Ile Arg Ala
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ser Val Gln Leu Leu Asp Leu Ile Arg Ala Glu Lys Asn Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Asp Leu Ile Arg Ala Glu Lys Asn Tyr Tyr Glu Ala Cys Ala Lys
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Lys Asn Tyr Tyr Glu Ala Cys Ala Lys Glu Cys Ser Met Met
1 5 10 15
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ala Leu Glu Gln Val Ala Ser Gln Ser Glu Lys Ala Ala Pro Gln Leu
1 5 10 15
Ser Lys Met Leu
20
<210> 47
<211> 238
<212> PRT
<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)
<400> 47
Met Ser Gly Phe Asp Val Thr Lys Thr Phe Asn Arg Phe Thr Gln Arg
1 5 10 15
Ala Gly Glu Leu Val Asn Lys Asn Glu Lys Thr Ser Tyr Pro Thr Arg
20 25 30
Thr Ser Asp Leu Ile His Glu Ile Asp Gln Met Lys Ala Trp Ile Ser
35 40 45
Lys Ile Ile Thr Ala Thr Glu Glu Phe Val Asp Ile Asn Ile Ala Ser
50 55 60
Lys Val Ala Asp Ala Phe Gln Lys Asn Lys Glu Lys Ile Thr Thr Thr
65 70 75 80
Asp Lys Leu Gly Thr Ala Leu Glu Gln Val Ala Ser Gln Ser Glu Lys
85 90 95
Ala Ala Pro Gln Leu Ser Lys Met Leu Thr Glu Ala Ser Asp Val His
100 105 110
Gln Arg Met Ala Thr Ala Arg Lys Asn Phe Asn Ser Glu Val Asn Thr
115 120 125
Thr Phe Ile Glu Asp Leu Lys Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser Glu
130 135 140
Ala Gln Lys Ala Lys Thr Lys Leu Glu Glu Val Arg Leu Asp Leu Asp
145 150 155 160
Ser Asp Lys Thr Lys Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gln Lys Ala
165 170 175
Lys Trp Glu Ala Glu Val Arg Lys Asp Glu Ser Asp Phe Asp Arg Val
180 185 190
His Gln Glu Ser Leu Thr Ile Phe Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp
195 200 205
Gly Leu Ser Val Gln Leu Leu Asp Leu Ile Arg Ala Glu Lys Asn Tyr
210 215 220
Tyr Glu Ala Cys Ala Lys Glu Cys Ser Met Met Leu Gly Glu
225 230 235

Claims (10)

1.一种抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽选自一个或多个SEQ ID NO：47的T细胞抗原表位。
2.根据权利要求1所述的抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽包含SEQ ID NO：47中连续8-20个氨基酸，优选的，所述的抗原多肽包括：
A)SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上的氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上的氨基酸序列同一性为80％以上；
C)与SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)SEQ ID NO：1-46中的一种或两种以上所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求1-2任一所述抗原多肽的核酸。
4.一种包含权利要求3所述的核酸的表达载体。
5.一种包含权利要求1-2任一所述的抗原多肽、权利要求3所述的核酸或权利要求4所述表达载体的细胞。
6.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含权利要求1-2任一所述的抗原多肽、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的细胞，以及免疫学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂，优选的，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂，所述的佐剂为FCA或CpG。
8.一种权利要求6-7任一所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将权利要求1或2所述的抗原多肽与免疫学上可接受的载体混合。
9.一种抗包虫病抗体的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括将待筛选物与权利要求1或2所述的抗原多肽混合。
10.权利要求1-2任一所述的抗原多肽、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的细胞在制备预防和/或治疗包虫病的产品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117903274A (zh) * 2023-12-06 2024-04-19 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 一种抗原多肽及其应用

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