CN115624618A - 一种HPV多肽抗原负载γδT细胞在HPV阳性宫颈癌免疫治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用HPV抗原多肽作为抗原负载γδT细胞，制备HPV特异性抗原递呈γδT细胞，用于肿瘤免疫治疗方案。本发明可用于治疗持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌。

Description

一种HPV多肽抗原负载γδT细胞在HPV阳性宫颈癌免疫治疗中 的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体涉及一种HPV的细胞免疫治疗。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)属乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是一组嗜上皮组织双链小分子DNA病毒。HPV感染人类上皮组织，能引起人类皮肤和黏膜的增生性病变，根据危险程度的不同，除导致多种乳头状瘤或疣以外，还与多种肿瘤的发生发展密切相关，如宫颈癌(cervical cancer)、膀胱癌、甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌和皮肤癌等。在诸多HPV相关肿瘤中，宫颈癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤，发病率居全球女性肿瘤第二位，占女性癌症患者总数的15％，对女性健康威胁极大。99％以上的宫颈癌患者的癌组织中可以检测到HPV存在，高危型HPV的持续感染是宫颈癌最主要的发病因素。据WHO最新数据显示，全球每年因宫颈癌而死亡的人数达27.3万，新发病例数约53万；我国每年约有13.2万宫颈癌新发病例，且患者年轻化趋势越来越明显，在25-45岁的中国年轻女性中，宫颈癌死亡率高居所有疾病死亡率第二位。HPV的主要传播途径为性接触和密切接触。目前已知的HPV亚型有100余种，其中27种亚型与宫颈癌相关，高度CIN相关的前6位高危HPV亚型分别为：HPV16、HPV58、HPV31、HPV33、HPV18和HPV52。目前早期宫颈癌治疗效果比较好，临床上应用的治疗方法主要是手术、放疗和化疗的综合治疗。但晚期宫颈癌预后欠佳,治疗面临困境。

γδT细胞被认为是获得性和自然免疫之间的一种特殊类型的免疫细胞。它们具有不受MHC限制的特异性抗原识别功能。尽管γδT细胞在循环和大多数组织中只占CD3+T淋巴细胞的一小部分，但因为它们在激活后会迅速产生细胞因子，因此它们构成了抵抗感染的第一道防线，与αβT细胞不同，γδT细胞表面的T细胞受体由γ链和δ链组成，而非α链和β链组成，人类外周血中大多数T细胞为αβT细胞，γδT细胞仅占外周血T淋巴细胞的1％～5％，但γδT细胞是介于固有免疫与获得性免疫之间的一种免疫细胞类型。

γδT细胞是T细胞的一个独特亚群，其T细胞受体由γ链和δ链组成，不同于传统的αβT细胞。γδT细胞也参与各种免疫反应，包括免疫防御和免疫监视对抗感染和肿瘤。γδT细胞能识别多种肿瘤抗原不仅对多种肿瘤具有直接杀伤能力，而且还能通过间接促进其他免疫细胞的功能来发挥抗肿瘤作用。γδT细胞由于识别抗原不受MHC限制，被认为是先天免疫的重要成员，具有对入侵病原体的快速反应和感知肿瘤细胞早期变化的功能。γδT细胞作为一种新型细胞疫苗的潜在应用最相关的是APC相关功能，γδT细胞触发抗原特异性αβT细胞应答的能力。专业的APC，如DC必须能够启动与αβT细胞的粘附相互作用，以便允许αβT细胞在APC表面筛选其同源肽-MHC复合物的存在。在CD8+和CD4+αβT细胞上的αβTCR分别与DC上的肽-MHCI类和II类复合物结合，导致αβT细胞启动，随后共刺激受体的参与启动αβT细胞的增殖和分化。γδT细胞具有抗原提呈功能，在γδT细胞激活后，它们可以进一步促进获得性免疫细胞活化，如T细胞和B细胞。因此，γδT细胞被认为是先天免疫和获得性免疫之间的桥梁。激活的γδT细胞在机体的多种免疫应答中发挥效应，例如直接杀伤感染细胞或肿瘤细胞、分泌趋化因子和细胞因子、发挥抗原提呈作用以及调节其它免疫细胞功能等。因此，γδT细胞广泛参与过敏、感染、自身免疫病和肿瘤等疾病过程。近年来，随着对肿瘤逃避免疫监视机理研究的不断深入，过继γδT细胞治疗已经成为肿瘤免疫治疗的重要手段，在肿瘤综合治疗体系中发挥着越来越重要的作用。

研究表明患者来源的γδT细胞在其增殖的高峰时间诱导的CD8+αβT细胞的反应，已经证明从健康个体和癌症患者的PBMC中扩增的γδT细胞都显示出强大的APC功能和对抗原的反应性。增的γδT细胞可以作为一种新型肿瘤细胞免疫治疗技术。相对较小的(≈100ml)患者血液样本足以在体外培养2周内产生大量的(109)γδT细胞。培养的γδT细胞有效地吸收、处理和交叉呈现复杂的抗原，包括蛋白质。因此，用肿瘤抗原治疗扩增的γδT细胞，将负载抗原的γδT细胞注入患者体内，无论是来自患者自身肿瘤细胞的细胞提取物，还是来自异源肿瘤细胞系的细胞提取物或者病原体抗原，会促进适应性免疫反应。γδT细胞保留分泌促炎细胞因子(IFNγ，TNFα)的能力，并表达淋巴结归巢标记物(CCR7，CD62L)。因此，部分活化的γδT细胞可能获得进入次级淋巴组织(脾脏、淋巴结)的能力，在那里动员内源性肿瘤特异性αβT细胞。这种新的内源性效应T细胞介导的抗肿瘤活性可能进一步支持注入的γδT细胞保留直接的肿瘤细胞杀伤活性。许多实验室的大量证据已经证明了大规模(和重复)输注γδT细胞的安全性。与有免疫检查点抑制剂(抗PD-1和抗CTLA-4抗体)联合应用，基于γδT细胞的疫苗的免疫刺激作用可能会进一步增强。

人类乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)引起了约30％的所有传染源相关癌症，并且与超过95％的宫颈癌有关。HPV预防性疫苗已上市，预防性疫苗通过诱导针对主要衣壳蛋白L1的类型特异性中和抗体来预防持续性宫颈感染。然而它们对预先存在的HPV感染或癌前病变治疗效果不显著。另外，现有的宫颈癌治疗方法均疗效有限，且由于全球范围内的HPV预防接种率不理想，HPV感染和随后发生的HPV相关恶性肿瘤将在未来几十年仍然是公共卫生问题。在专利CN114134165一种新型HPV治疗性核酸疫苗中，提供了一种治疗性核酸疫苗，但最终只能抑制表达E6/E7的癌细胞的生长；专利CN108949791B微环DNA表达抗HPV治疗性工程抗体及其应用中提供的HPV-BTEC、微环DNA载体对于预防和治疗HPV感染及HPV相关癌症具有良好效果；专利CN114015651A一种HPV特异性T细胞治疗剂中提供一种HPV特异性HPV细胞治疗剂，用以清除HPV患者体内感染HPV病毒的细胞；现有技术中HPV病毒的治疗方式一部分是基于HPV特定的亚型进行免疫治疗，或者通过T细胞治疗，但是对于不同HPV亚型感染的广泛人群而言，不足够进行免疫和治疗。因此，开发治疗性HPV疫苗和其他癌症疗法是一项紧迫的任务。

发明内容

第一方面，本发明提供一种包含负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物。

进一步的，所述抗原多肽是指与HPV相关的抗原多肽。

进一步的，所述HPV相关的抗原多肽包括与HPV相关的抗原短肽、与HPV相关的抗原长肽、与HPV相关的重组蛋白、与HPV相关的抗原多肽的RNA序列或DNA序列；表达HPV抗原多肽的减弱的病毒或细菌载体。

进一步的，所述与HPV相关的短肽是指包含8-11个氨基酸的多肽；

进一步的，所述与HPV相关的长肽是指包含25-30个氨基酸的多肽；

进一步的，所述与HPV相关的抗原多肽是指HPV的相关抗原多肽和/或HPV阳性的宫颈癌的相关抗原多肽。

进一步的，所述抗原多肽包括一种和/或多种多肽的组合物。

更进一步的，所述一种多肽可以单独存在、也可以作为包含同一肽的多个副本的多聚体存在和/或作为各种肽的杂聚体存在。

进一步的，所述抗原多肽可以是抗原自然发生区域的肽；被修饰、重组和/或通过化学合成的多肽。

进一步的，所述HPV抗原多肽包括但不限于HPV的E1、E2、E4、E5a、E5b、E6、E7、L1和L2蛋白目标分子多肽。

进一步的，所述HPV抗原多肽包括但不限于HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58等亚型的抗原多肽。

更进一步的，所述抗原多肽是指具有高亲和力和可结合多个HLA分子的表位肽。

进一步的，所述具有高亲和力和可结合多个HLA分子的表位肽可用快速筛选该主题蛋白质序列的相关计算机程序以及允许生成模拟肽的相关程序完成。

在一种实施方式中，高亲和力和可结合多个HLA分子的表位肽选自I类HLA分子表位肽，即结合亲和力值IC50≤500nM；II类HLA分子表位肽，结合亲和力值IC50≤1000nM。

进一步的，所述高亲和力和可结合多个HLA I类分子中用于多表位构建体的氨基酸残基为约8-13个氨基酸残基、优选8-11个氨基酸残基、更优选8-10个氨基酸残基；

更进一步的，高亲和力和可结合多个HLA I类分子中用于多表位构建体的氨基酸残基进一步优选为9至10个氨基酸残基；

进一步的，所述高亲和力和可结合多个HLA II类分子中用于多表位构建体的氨基酸残基为约6-30个氨基酸残基，优选6-25个氨基酸残基，更优选6-20个氨基酸残基；

更进一步的，高亲和力和可结合多个HLA II类分子中用于多表位构建体的氨基酸残基进一步优选为约13-20个氨基酸残基。

在一种实施方式中，抗原多肽选自HPV16和HPV18的抗原多肽，进一步优选附表1所述抗原序列的抗原多肽。

第二方面，本发明提供一种疫苗和/或疫苗组合物，其包含本发明第一方面所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物和疫苗上可接受的佐剂。

第三方面，本发明提供一种药物和/或药物组合物，所述药物和/或药物组合物包含本发明第一方面所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物及可选的药学上可接受的辅料。

进一步的，所述药物和/或药物组合物可制备为制剂形式，所述制剂可以为液体制剂、固体制剂和/或半固体制剂。

第四方面，本发明还提供了本发明第二方面所述负载抗原多肽的γδT细胞的疫苗和/或疫苗组合物在治疗HPV相关疾病中的用途。

第五方面，本发明还提供了本发明第三方面所述负载抗原多肽的γδT细胞的药物和/或药物组合物在治疗HPV相关疾病中的用途。

进一步的，本发明所述HPV相关疾病包括持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌等。

附图说明

图1.小鼠模型TC-1肿瘤挑战后的三组小鼠的生存曲线分析

图2.小鼠模型TC-1肿瘤挑战后的三组小鼠的肿瘤生存曲线具体实施方式

图3.小鼠解剖后肿瘤大小对比

图4.人γδT细胞体外培养扩增分析

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

如本文所用术语“负载”是把抗原加载到γδT细胞上，即把抗原肽和γδT细胞共同培养，γδT细胞吞噬抗原多肽，然后通过HLA提呈到细胞表面，激活T细胞。

如本文所用术语“抗原肽”、一个或多个“多肽”，是指通过DNA技术或化学合成方法制备获得或从天然来源如HPV或HPV阳性肿瘤的相关抗原获得，可以是含有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物，并且可以是它们的中性(不带电荷)形式或者是盐的形式、没有修饰或者经过修饰的肽；可以使用化学连接来连接各个肽表位以产生仍在本发明范围内的更大的肽；或者使用重组DNA技术，将编码免疫原性肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞γδT细胞中，并在适合表达的条件下培养，最终用于呈递合适的T细胞表位。

除非另外说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文中互换使用。

术语“组合物”或“药物组合物”可包括含有本公开的活性多肽以及例如药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合物，所述组合物被施用至受试者个体。

术语“制剂”指一种制备物，所述制备物处于允许作为活性成分细胞的生物活性可以有效发挥的形式，并且不含有对于待施用该制剂的受试者而言具有不可接受毒性的其它组分。通常细胞制剂中包含可药用形剂。“可药用”赋形剂是可以合理地施用至受试人或哺乳动物以便制剂中所用活性成分的有效剂量可以递送至受试者的试剂。赋形剂的浓度与施用模式相适应，例如可以是注射可接受的。

多肽和HLA有较高亲和力与较高的免疫原性相关。更大的免疫原性可以以几种不同的方式表现出来。免疫原性对应于是否完全引发免疫反应，对应于任何特定反应的活力，以及引发反应的群体的程度。例如，一种肽可能会在多种人群中引发免疫反应，但在任何情况下都不会产生强烈的反应。根据这些原理，已发现接近90％的高结合肽具有免疫原性，此外，更高的结合亲和力的肽诱导更强烈的免疫反应。因此，如果使用高亲和力结合肽，则需要更少的肽来引发类似的生物学效应。因此，在本发明中，高亲和力结合表位是优先考虑的。

术语“受试者”是指需要诊断、预后、免疫或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物如熊、运动动物、宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、奶牛；灵长类动物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食用动物，如牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等。

在利用计算机筛选来鉴定抗原表位时，使用开发的软件分析蛋白质序列以识别包含适当HLA结合的肽序列。可以使用多种算法对识别的肽进行评分，以预测它们结合特定HLA I类或II类等位基因的能力。大量计算机编程软件和硬件选项可用于相关领域，它们可用于实施本发明的主题以便评估已知或未知的肽序列(但不限于识别表位，确定每个肽长度的表位浓度，或生成类似物)。

本发明包含了允许快速筛选该主题的蛋白质序列的计算机程序；以及允许生成模拟肽的程序。这些程序用于分析任何已识别的氨基酸序列或操作一个未知序列，同时确定该序列和识别其携带的抗原表位；类似物也可以同时确定。

实施例1小鼠γδT细胞的分离

颈椎脱位处死小鼠，将脾脏磨成单细胞悬液。将制备好的脾细胞悬液置于Tris缓冲液中5min，2000g离心7min，用RPMI-1640培养基洗涤2次，然后在含10％血清的预热过的RPMI-1640培养基中重悬。将单细胞悬液与处理过的尼龙柱在37℃下孵育50min，洗脱后的细胞为脾脏来源的T淋巴细胞。将收集到的T淋巴细胞用PBS重悬，离心，弃上清。将含有0.5％BSA和2mM EDTA的预冷PBS分选缓冲液和CD4+分选磁珠加入到细胞中。混合后，4℃孵育10min，用分离器和LS柱分离。分离的CD4+T细胞在抗小鼠γδTCR抗体包被的培养皿中，在37℃和5％二氧化碳下培养6天，加入可溶性抗小鼠CD28抗体和IL-2。将纯化的γδT细胞与抗原多肽抗原组合物共培养制备成γδT细胞注射液。

实施例2人γδT细胞体外培养扩增

1.用肝素钠采集管采集30ml人的外周血；

2.取50ml离心管，加入15ml淋巴细胞分离液，然后将30ml外周血，缓慢加入到含有淋巴细胞分离液的离心管中；800g离心25分钟；

3.取淋巴细胞层于新的离心管中，加入生理盐水，洗涤2次，600g离心5分钟，弃上清；

4.用含有10％FBS的RPMI1640培养基重悬淋巴细胞，加入到事先包被了1ug/ml的TCR-γδ抗体的培养瓶中，同时添加1000U/ml浓度的IL-2；培养第三天后，补含10％FBS的RPMI-1640培养基，同时添加1000U/ml浓度的IL-2；培养9天后分析人γδT细胞培养扩增情况。

如图4所示，用抗Vδ2抗体和抗CD3抗体染色进行流式细胞仪分析，双阳性细胞为γδT细胞，人PBMC经过诱导培养，检测γδT细胞的纯度，其纯度达到90.22％。

实施例3负载抗原γδT细胞抑瘤实验

1.取7周龄左右的小鼠30只，随机分成3组，每组10只。组别分别设置为A：γδT细胞疫苗预防组，B：γδT细胞疫苗治疗组；C：未治疗对照组；

2.小鼠饲养在SPF洁净环境中养5天使小鼠适用环境后，A.预防组开始预防注射γδT细胞，注射三次，周期分别为：0天，3天，10天；

3.A组小鼠第三次注射后7天，A，B，C组三组小鼠均开始进行HPV阳性TC-1种植肿瘤；

4.肿瘤种植后第7天，基本可以观测到肿瘤生长，B，C组肿瘤开始生长时，对B组小鼠进行三次γδT细胞治疗接种；接种周期分别为：0天，3天，10天；

5.C组作为肿瘤对照组不接种疫苗；

6.结果观测

肿瘤种植后，用游标卡尺每周进行两次肿瘤大小和体重的测量观测。肿瘤体积大小计算方法为：V＝长*宽2/2，结果见图1-3。

如图1小鼠肿瘤生长曲线所示：疫苗预防组和疫苗治疗组在40天以后，小鼠存活量均出现小幅下降，其中疫苗治疗组小鼠存活量在50天以后出现第二次下降；未治疗对照组小鼠存活量在20以后开始出现下降，随后未治疗对照组小鼠存活量逐渐减少，下降幅度明显较大；因此，本实施例中，实验结果表明负载抗原γδT细胞对疫苗预防组和疫苗治疗组疗效显著。

如图2所示，肿瘤种植到小鼠体内后，经过预防和治疗的两组小鼠体内肿瘤细胞生长缓慢，未治疗对照组由于肿瘤细胞不受限制，呈现明显的生长曲线；结果表明注射负载抗原γδT细胞对疫苗预防组和疫苗治疗组疗效显著。

如图3所示，疫苗预防组和疫苗治疗组相比未治疗对照组的肿瘤大小小很多，说明疫苗预防组和疫苗治疗组疗效显著。

附表1 HPV16、HPV18 HLA I类和II类抗原多肽

Claims (10)

1.一种负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物，其特征在于，所述抗原多肽是指与HPV相关的抗原多肽，所述HPV相关的抗原多肽包括与HPV相关的抗原短肽、与HPV相关的抗原长肽、与HPV相关的重组蛋白、与HPV相关的抗原多肽的RNA序列或DNA序列和表达HPV抗原多肽的减弱的病毒或细菌载体。

2.如权利要求1所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物，其特征在于所述与HPV相关的抗原多肽是指HPV的相关抗原多肽和/或HPV阳性的宫颈癌的相关抗原多肽。

3.如权利要求1所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物，其特征在于所述抗原多肽包括一种和/或多种多肽的组合物。

4.如权利要求1-3任一项所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物，其特征在于所述HPV抗原多肽包括但不限于HPV的E1、E2、E4、E5a、E5b、E6、E7、L1和L2蛋白目标分子多肽。

5.如权利要求1-3任一项所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物，其特征在于所述HPV抗原多肽包括但不限于HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV52、HPV58亚型的抗原多肽。

6.如权利要求1-3任一项所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物，其特征在于所述抗原多肽具有高亲和力和可结合多个HLA分子的表位肽，所述高亲和力和可结合多个HLA I分子中用于多表位构建体的氨基酸残基为8-13个氨基酸残基；HLA II分子中用于多表位构建体的氨基酸残基为6-30个氨基酸残基。

7.一种疫苗及其疫苗组合物，其特征在于其包含权利要求1-6任一项所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物和疫苗上可接受的佐剂。

8.一种药物和/或药物组合物，其特征在于其包含权利要求1-6任一项所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物及可选的药学上可接受的辅料。

9.如权利要求8所述的药物和/或药物组合物，所述药物或药物组合物制备为液体制剂、固体制剂和/或半固体制剂。

10.如权利要求1-6任一项所述的负载抗原多肽的γδT细胞的免疫组合物在制备治疗HPV相关疾病的药物中的用途，HPV相关疾病包括持续性HPV感染、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、阴道上皮内瘤样病变(VaIN)、肛门上皮内瘤样病变(AIN)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌(SCC))、口咽癌、阴茎癌、阴道癌或肛门癌。

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