CN116549482B - 人参多糖在制备免疫调节产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供人参多糖在制备免疫调节产品中的应用。本发明尝试将人参多糖作为SARS‑CoV‑2RBD抗原的佐剂，进行免疫调节作用研究，进而提供SARS‑CoV‑2疫苗佐剂及其应用，以刺激机体相关免疫细胞的活化并产生抵抗SARS‑CoV‑2的抗体，尽量提升抗体滴度以及延长免疫记忆维持时间。

Description

人参多糖在制备免疫调节产品中的应用

技术领域

本发明涉及免疫调节技术领域，具体涉及人参多糖在制备免疫调节产品中的应用。

背景技术

为了帮助免疫系统识别抗原，在疫苗研发和生产过程中，将佐剂加入到抗原中，达到增强免疫反应的作用。佐剂是疫苗核心成分，超过90％的疫苗含有佐剂。在mRNA疫苗中，缺少脂质体佐剂会使疫苗几乎无效。此外，针对不同疫苗采用适宜的佐剂，还可以提高婴幼儿、老年人、免疫功能低下人群疫苗接种效果。

根据结构和化学组成不同，佐剂可以分为矿物盐类佐剂、乳化剂、脂质体、模式识别受体激动剂和其他类佐剂。

矿物盐类铝佐剂是最早、应用最广泛的疫苗佐剂，它可以通过形成抗原贮存库和诱导炎症信号来使药效持久，促进抗体的产生。此外，铝佐剂还可以促进Th2型免疫应答，促进APC的抗原摄取，但对Th1型免疫应答的反应不佳，且无法直接激活DC。有关铝盐产生刺激固有免疫的信号仍然存在争议。

乳化剂，如MF59和AS03已被批准用于人体疫苗，其有优于铝佐剂的佐剂效果，但其免疫刺激潜在分子机制是未知的。

目前含有脂质体的疫苗，如流感病毒疫苗和甲型肝炎疫苗已被批准。使用脂质体佐剂的流感疫苗Inflexal V在各个年龄组都有较好的免疫原性。但其成本高，高剂量时会产生高毒性，且在静脉给药时因缺乏靶向性会导致手足综合征等不良反应，生产时对工艺、储存要求高，不利于疫苗生产储备。

但是目前人用佐剂种类很少，除铝佐剂外，目前仅批准了6种人用佐剂。现有佐剂存在成本高、毒副作用大、机制不清晰等问题，且因可选择性低，需要在疫苗佐剂上需要进一步研究更多新型的佐剂来加速其发展。

SARS-CoV-2属于冠状病毒家族，是一种编码包膜和单链RNA的RNA病毒。病毒粒子的结构蛋白包括刺突(S)蛋白、核蛋白(N)、包膜(E)蛋白和细胞膜(M)蛋白。其中，S蛋白作为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入细胞的“钥匙”，主要通过RBD结构域与宿主细胞表面ACE2受体结合，继而感染宿主细胞。结合针对SARS-CoV相关研究，RBD是一个关键的中和抗体结合区，被证明能够在动物免疫中引起有效的中和抗体反应，因此可以成为重组蛋白疫苗的候选抗原。

目前针对SARS-CoV-2RBD区的核酸成分已经开发出许多疫苗，这些疫苗的设计及制备都相对简单，它们都以结构蛋白为目标，需要特定的佐剂才能有效发挥生物活性，并且随着SARS-CoV-2变异的增加和其他冠状病毒的长期威胁，失效风险较高。因此，研发SARS-CoV-2下一代疫苗至关重要。

发明内容

人参多糖(Ginseng polysaccharide，GPS)作为中成药已在临床制备成人参多糖注射液、人参多糖口服液，有多年应用基础，毒副作用少见，主要用于肺系疾病慢性阻塞性肺疾病、非小细胞肺癌、慢性心力衰竭、乳腺癌、胃癌等。具有良好的免疫调节功能，并适用于多种肺部相关疾病。本发明尝试将人参多糖作为SARS-CoV-2RBD抗原的佐剂，进行免疫调节作用研究，进而提供SARS-CoV-2疫苗佐剂及其应用，以刺激机体相关免疫细胞的活化并产生抵抗SARS-CoV-2的抗体，尽量提升抗体滴度以及延长免疫记忆维持时间。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供人参多糖在制备免疫调节产品中的应用。

优选地，所述免疫调节产品包括免疫调节药品、免疫调节化妆品或免疫调节食品。

第二方面，本发明提供人参多糖作为免疫佐剂在制备疫苗上的应用。

第三方面，本发明提供一种疫苗，包括人参多糖佐剂和蛋白。

进一步地，所述蛋白选自SARS-CoV-2RBD蛋白、SARS-CoV-2RBD-Ferritin蛋白、SARS-CoV-2M蛋白、SARS-CoV-2E蛋白、SARS-CoV-2N蛋白、SARS-CoV-2N-Ferritin蛋白中的至少一种。

优选地，所述蛋白为SARS-CoV-2RBD重组蛋白，具有以下T细胞表位：Peptide 1：VGYQPYRVVVLSFEL，Peptide 2：VRQIAPGQTGKIAD。

优选地，所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白的表达载体选自以下质粒中的一种：pET28a、pcDNA3.1、pfastbac、pSecTag、pET22b(+)、PGEX-6p-1、pSG5；

和/或，所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白通过以下表达系统中的一种表达：大肠杆菌表达系统、昆虫表达系统、酵母表达系统。

更加优选地，所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白的表达载体为pET28a；

和/或，所述表达系统为大肠杆菌；进一步优选地，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)菌株。

优选地，所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白的纯化方法包括：将SARS-CoV-2RBD重组蛋白包涵体通过预装重力柱预纯化后，采用20mM咪唑洗脱液对SARS-CoV-2RBD重组蛋白粗品进行多次洗脱，再采用Elution洗脱液进一步进行多次洗脱。

优选地，所述疫苗给药方式包括口服和皮下注射；更为优选地，所述疫苗的给药方式为皮下注射。

本发明提供一种SARS-CoV-2疫苗佐剂，该疫苗佐剂具有毒副作用小、性价比高、可扩大中草药效用价值的优势。该佐剂和SARS-CoV-2RBD重组蛋白共同作用下，有望刺激机体相关免疫细胞的活化并产生抵抗SARS-CoV-2的抗体，且抗体的滴度更高、免疫记忆维持时间更长。

附图说明

图1为本发明实施例1中RBD重组蛋白超声条件摸索结果。其中，M：蛋白质分子量标准；1：超声前菌体蛋白表达情况；2：超声后菌体蛋白表达情况；3：超声并离心后上清中蛋白表达情况；4：超声并离心后沉淀中蛋白表达情况。表明RBD蛋白于沉淀中表达。

图2为本发明实施例1中RBD重组蛋白纯化条件摸索结果，其中：M：蛋白质分子量标准；1：穿流液；2：20mM咪唑洗脱液洗脱第一次；3：20mM咪唑洗脱液洗脱第二次；4：40mM咪唑洗脱液洗脱第一次；5：40mM咪唑洗脱液洗脱第二次；6：60mM咪唑洗脱液洗脱第一次；7：60mM咪唑洗脱液洗脱第二次；8：Elution洗脱液洗脱第一次；9：Elution洗脱液洗脱第二次。

图3为本发明实施例1中RBD重组蛋白表达、纯化结果，其中：RBD蛋白在E.coliBL21(DE3)菌株中的诱导表达结果：M：蛋白质分子量标准；1：诱导前菌体蛋白表达情况；2：诱导后菌体蛋白表达情况；3：诱导后菌体经超声后上清中蛋白表达情况；4：诱导后菌体超声后沉淀中蛋白表达情况。表明RBD蛋白诱导表达成功。RBD蛋白纯化结果：M：蛋白质分子量标准；5：纯化后的RBD蛋白；6：诱导后菌体总蛋白，表明成功纯化出目的蛋白RBD，纯化后的蛋白只出现一条目的带，蛋白大小为26kDa，与预期的大小结果相符合。

图4为本发明实施例1中RBD重组蛋白浓缩结果，其中：M：蛋白质分子量标准，RBD重组蛋白分子量为26kDa；1：浓缩前RBD蛋白；2：浓缩后RBD蛋白。浓缩后RBD蛋白浓度明显高于浓缩前蛋白浓度，已成功浓缩出RBD蛋白。

图5为本发明实施例2中不同多糖给药4h后对小鼠体内DC细胞的影响。

图6为本发明实施例3中人参多糖不同方式、剂量给药4h后对小鼠体内DC、MΦ的影响；其中，A图为人参多糖不同方式、剂量给药诱导DC细胞结果；B图为人参多糖不同方式、剂量给药MΦ细胞结果；C图为人参多糖口服组和皮下注射组的DC和MΦ细胞水平。D图为人参多糖口服组和皮下注射组的中剂量组DC和MΦ细胞水平对比。

图7为本发明实施例3中在图1基础上进一步确定人参多糖不同方式、剂量给药24h后对小鼠体内DC、MΦ细胞的影响；其中，A图为人参多糖不同方式、剂量给药诱导DC细胞结果；B图为人参多糖不同方式、剂量给药诱导MΦ细胞结果；C图为人参多糖口服组和皮下注射组的DC和MΦ细胞水平。D图为人参多糖口服组和皮下注射组的中剂量组DC和MΦ细胞水平对比。

图8为本发明实施例4中BALB/c小鼠免疫流程。其中，于第0周、2周、4周进行蛋白抗原免疫，共免疫3次。于首免后第1、2、4、6、10、12、18周采取小鼠尾静脉血。

图9为本发明实施例4中小鼠血清Anti-RBD IgG水平。

图10为本发明实施例4中首次免疫后10周小鼠肺泡灌洗液Anti-RBD IgG水平。图11为本发明实施例4中人参多糖对小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺T细胞、Tfh及GC B细胞水平的影响；其中，A图为活化CD4⁺T表达情况；B图为活化CD4⁺T表达情况；C图为Tfh细胞表达情况；D图为GC B细胞表达情况。

图12为本发明实施例4中人参多糖对小鼠脾脏淋巴细胞中Tfh、GC B及MB细胞激活水平的影响，A图、B图为首次免疫后第6周、第10周小鼠脾脏淋巴细胞表达水平；C图、D图为第4周、第10周小鼠脾脏中MB细胞水平。

图13为本发明实施例4中人参多糖对小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺Tcm、CD8⁺Tcm及其细胞因子激活水平的影响；其中，A图为不同时间各组中CD4⁺Tcm细胞以及CD8⁺Tcm细胞水平；B图不同时间小鼠脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ因子和TNF-α因子表达情况。

图14为本发明实施例4中流式细胞术检测小鼠脾脏Th1和Th2水平；其中，A图第10周小鼠脾脏淋巴细胞中Th1型细胞水平；B图、C图、D图分别为第4周、第6周、第10周小鼠脾脏淋巴细胞中Th1型细胞水平；E图、F图、G图分别为第4周、第6周、第10周为小鼠脾脏淋巴细胞中Th2型细胞水平。

图15为本发明实施例4中人参多糖对小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ水平的影响，其中，A图、C图为首次免疫后6周，不同肽段刺激下脾脏T细胞中IFN-γ的分泌情况。B图、D图首次免疫后10周，不同肽段刺激下脾脏T细胞中IFN-γ的分泌情况。

具体实施方式

本发明实施例采用的人参多糖购买于四川维克奇生物有限公司，HPLC≥90％。

本发明实施例采用的BALB/c小鼠，5-6周龄雌鼠，18-20g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养在广东药科大学实验动物中心SPF级环境中，许可证号：SCXK(粤)2017-0125，动物实验经广东药科大学动物保护和使用委员会批准。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例构建SARS-CoV-2RBD重组蛋白，具体如下：

(1)重组表达菌株的构建：

质粒提取：将优化合成的pET28a-RBD穿刺菌(购自苏州金唯智生物科技有限公司)在超净台中接至含10mL LB培养基和5μL 100mg/mL卡那霉素的无菌玻璃试管中，培养12-16h后，室温、12000rpm、1min，弃上清及回流液。使用TIAN GEN质粒小提试剂盒，按照试剂盒说明书逐步提取质粒，获得目的质粒；

转化：取5μL提取的pET28a-RBD质粒，加入含50μL BL21(DE3)感受态细胞的1.5mLEP管中，使用枪头混匀后在冰上反应30min。提前调好水浴锅，将上一步的EP管放置42℃水浴锅热激45s，立马放置冰上2min；

涂板：在超净台中取无抗LB液体培养基800μL至上一步EP管中，于37℃、200rpm振荡培养箱中摇菌5h后，室温、5000rpm、5min离心菌液，在超净台中弃上清，利用回流液混匀菌体，最后在含卡那霉素的LB固体培养基涂板，置于37℃培养箱中2h后倒置过夜培养；

挑菌：在平板上选择边界清晰、菌落大且独立的菌，使用枪头挑菌后在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12-16h，获得目的菌株，部分制备成甘油菌冻存备用，部分进行扩大培养；

重组菌扩大培养：以1:1000的比例，将带pET28a-RBD质粒的BL21(DE3)菌株在无菌玻璃管中，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃摇床中200rpm培养12-16h。将过夜活化的菌液以1.5:100的比例接种于300mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养3h±10min左右，测定OD值，当OD值达到0.6-0.8之间时，在细菌培养液中以0.8:1000的比例加入IPTG诱导剂，放回摇床，继续培养5-6h。培养完成后，4℃、6000rpm离心5min收集菌体，每300mL细菌培养液的菌体收至一个50mL离心管中。

(2)包涵体处理：

菌体的细胞破碎：在15mL离心管中用6mL非变性裂解液充分混合600mL菌液离心所得菌体沉淀，获得菌体悬浮液。为防止超声破碎过程中温度过高，将15mL离心管完全置于冰水混合物中，超声波探头置于液面1/2以下，按照功率10％，工作时间3s，间隙时间3s，总时间30min的条件破碎菌体。取超声前后样品及离心后的上清、沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图1所示，表明RBD蛋白于沉淀中表达；

包涵体洗涤：将初次超声波破碎后的菌体分装至2mL EP管中，4℃、12000rpm、离心25min，充分弃上清后向各管分别加入1mL 1×PBS吹混沉淀物，再次4℃、转速12000rpm、离心5min，弃尽上清，向各管分别加入1mL含8M尿素的Binding/washing buffer(洗涤液)，重悬溶解沉淀后，移至10mL离心管中，将离心管完全置于冰水混合物中，超声波探头置于液面1/2以下，按照功率10％，工作时间3s，间隙时间3s，总时间20min的条件再次超声。超声完毕后分至2mL EP管中，4℃、12000rpm、离心20min，吸取上清液均分至2个10mL离心管中使用。

(3)镍离子亲和层析纯化：

柱平衡：将Ni-TED 6FF预装重力柱内保护液排尽后加入10mL含8M尿素的Binding/washing buffer平衡层析柱；

RBD重组蛋白纯化条件摸索：使用含8M尿素的Binding/washing buffer将10mL离心管中超声波破碎后上清液体积补至10mL，至Ni-TED 6FF预装重力柱穿流3次后留最后1次样品。再使用20mM咪唑洗脱液洗脱2次，使用40mM咪唑洗脱液洗脱2次，使用60mM咪唑洗脱液洗脱2次，每次10mL并搜集洗脱样品。最后使用Elution洗脱液洗脱2次，每次5mL并搜集洗脱样品；

电泳样品制备：取每次过柱搜集的样品，按照5：1的比例加5×loading buffer，并置于100℃金属浴10min，放于冰上冷却后使用；

SDS-PAGE凝胶电泳分析：配置10％分离胶和5％浓缩胶后，每个样品取10μL、蛋白marker上样量为3μL，按照顺序加至凝胶中。待蛋白marker跑至合适位置，停止电泳，切胶。将胶放置在适量考马斯亮蓝染色剂中，摇床60-70转，摇30min后弃染色剂，使用纯水脱色至合适程度后拍摄结果，结果如图2所示，表明RBD蛋白可用多次20mM咪唑洗脱液洗脱杂蛋白，进一步使RBD蛋白在Elution洗脱液洗脱时洗脱出。

RBD重组蛋白纯化过柱最终流程：使用含8M尿素的Binding/washing buffer将10mL离心管中超声波破碎后上清液体积补至10mL，至Ni-TED 6FF预装重力柱穿流3次后留最后1次样品。再使用20mM咪唑洗脱液洗脱5次，每次10mL并搜集洗脱样品。最后使用Elution洗脱液洗脱3次，每次5mL并搜集洗脱样品；

电泳样品制备：取每次过柱搜集的样品，按照5：1的比例加入5×loading buffer，并置于100℃金属浴10min，放于冰上冷却后使用；

层析柱清洗与保存：纯化完毕后立取25mL Elution洗脱液至Ni-TED蛋白纯化柱中；液体滴尽后，取25mL含8M尿素的Binding/washing buffer继续过柱；再取25mL超纯水过柱；最后使用5mL 20％乙醇过柱。待过柱完毕，盖好蛋白纯化柱出口，加10mL 20％乙醇后，置于管架上，保存至4℃。

(4)RBD重组蛋白的浓缩：

湿润超滤管：在截留分子量10kDa超滤管中加入15mL超纯水，4℃、4000rpm离心7min，直至内管无液体，弃掉所有外管液体；蛋白上柱：将溶解于变性洗脱液中的RBD蛋白(样品为纯化完毕的第一次洗脱液和第二次洗脱液，具体见第二章2.3.2)加至超滤管内管中，4℃、4000rpm离心7min。根据液面下降情况调整离心时间，并观察蛋白是否结团，直至页面低于1.5mL标记可停止离心；置换缓冲液：在内管中加入3倍蛋白液体积的PBS，小心吹打液面进行混匀，盖盖后4℃、4000rpm离心7min。直至页面低于1.5mL标记可停止离心，进行第二次和第三次PBS置换缓冲液；蛋白浓度检测：在内管中小心吹匀蛋白液，吸取至5mL管中，使用超微量核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度并记录，放至-80℃医用冰箱保存，供抗原免疫时使用。

(5)SDS-PAGE凝胶电泳分析：

配置10％分离胶和5％浓缩胶后，每个样品取10μL、蛋白marker上样量为3μL，按照顺序加至凝胶中。待蛋白marker跑至合适位置，停止电泳，切胶。将胶放置在适量考马斯亮蓝染色剂中，摇床60-70转，摇30min后弃染色剂，使用纯水脱色至合适程度后拍摄结果。

结论：针对SARS-CoV-2相关研究，RBD是一个关键的中和抗体结合区，被证明能够在动物免疫中引起有效的中和抗体反应，因此可以成为重组蛋白疫苗的候选抗原选择。利用大肠杆菌(E.coli)表达系统表达RBD蛋白，进一步并通过Ni TED 6FF(预填充重力柱)对重组蛋白进行纯化，通过考马斯蓝染色对表达纯化进行验证，结果显示成功表达纯化获得RBD重组蛋白(图1)。图2则表明RBD蛋白可用多次20mM咪唑洗脱液洗脱杂蛋白，进一步使RBD蛋白在Elution洗脱液洗脱时洗脱出。图3表明成功纯化出目的蛋白RBD，纯化后的蛋白只出现一条目的带，与预期的大小结果相符合。

基于纯化制备的RBD重组蛋白，在超滤管中进行蛋白复性、浓缩，制备出符合小鼠免疫浓度的重组蛋白疫苗，图4显示浓缩后RBD蛋白浓度明显高于浓缩前蛋白浓度，表明成功浓缩出RBD蛋白。将RBD蛋白应用于后续试验过程。

实施例2

本实施例考察不同多糖对动物免疫启动的影响，具体如下：

(1)动物分组：将6周龄BABL/c小鼠分5组：空白对照组、RBD组、人参多糖组、银耳多糖组和岩藻多糖组，每小组5只小鼠。其中，空白对照组给予50μL PBS；RBD组给予10μg RBD蛋白及25μL弗式佐剂(购自Sigma公司)的混合液50μL(体积不足时由PBS补齐)；人参多糖组(GPS+RBD)、银耳多糖组(TFPS+RBD)、岩藻多糖组(DSG+RBD)给予含0.8mg多糖、10μg RBD蛋白及25μL弗式佐剂的混合液50μL(体积不足时由PBS补齐)，多糖组均含0.8mg多糖。本实施例采用的RBD蛋白由实施例1获得。

(2)流式细胞术检测给药效果：

取材：于免疫后4h，将小鼠使用戊巴比妥纳深麻后颈椎脱臼处死，取小鼠双侧腹股沟淋巴结进行研磨，悬液置入15mL离心管中，4℃、1500rpm、7min后弃上清；

制备单个细胞悬浮液：将细胞使用1mL 1×PBS缓冲液重悬，利用40μm细胞筛网过滤细胞、弃掉悬浮液中杂质，4℃、1500rpm、7min后弃上清，再用1mL1×PBS缓冲液重悬；

细胞表面标志物染色：将单个细胞悬浮液按照细胞量分别分装到对应流式管中，最终总细胞悬液体积为100μL。加入检测DC表达情况的流式抗体，4℃避光染色30min后，使用1mL 1×PBS缓冲液终止染色，4℃、1500rpm、7min后弃上清，再加入200μL 1×PBS缓冲液上机检测。

图5为不同多糖在相同剂量下(0.8mg/只)给药4h后对小鼠体内DC的影响。单独使用RBD重组蛋白疫苗较比空白对照组能显著性提高小鼠DC细胞比例，利于抗原提呈(p＜0.01)。人参多糖组与银耳多糖组、岩藻多糖组相比，显著利于机体DC细胞比例的提高(p＜0.05、p＜0.01)。表明，相对于银耳多糖、岩藻多糖，人参多糖更合适作为SARS-CoV-2RBD重组蛋白疫苗的佐剂。

实施例3

本实施例对人参多糖给药方式、给药浓度条件进行探索，具体过程如下：

(1)分组：以BALB/c小鼠为动物模型，将其分为口服低剂量组、口服中剂量组、口服高剂量组、皮下注射低剂量组、皮下注射中剂量组、皮下注射高剂量组，共6组，每小组5只小鼠；

(2)动物免疫：按照不同给药方式，给予低剂量组(0.6mg/只)、中剂量组(0.8mg/只)、高剂量组(1.2mg/只)人参多糖，口服组按照一只小鼠每天10mL喝水量计算。皮下注射组为人参多糖单独注射，每只小鼠皮下注射50μL人参多糖溶液，将人参多糖按照前述低剂量、中剂量、高剂量溶解于PBS中形成注射液。

(3)流式细胞术检测给药效果：

取材：于给药后4h、24h，分批次将小鼠使用戊巴比妥钠深麻后颈椎脱臼处死，取小鼠双侧腹股沟淋巴结进行研磨，悬液置入15mL离心管中，4℃、1500rpm、7min后弃上清；

制备单个细胞悬浮液：将细胞使用1mL 1×PBS缓冲液重悬，利用40μm细胞筛网过滤细胞、弃掉悬浮液中杂质，4℃、1500rpm、7min后弃上清，再用1mL 1×PBS缓冲液重悬；

细胞表面标志物染色：将单个细胞悬浮液按照细胞量分别分装到对应流式管中，最终总细胞悬液体积为100μL。加入检测DC、MΦ表达情况的流式抗体，4℃避光染色30min后，使用1mL 1×PBS缓冲液终止染色，4℃、1500rpm、7min后弃上清，再加入200μL 1×PBS缓冲液上机检测。

结论：口服低剂量组(po low)、口服中剂量组(po middle)、口服高剂量组(pohigh)、皮下注射低剂量组(H low)、皮下注射中剂量组(H middle)、皮下注射高剂量组(Hhigh)诱导DC细胞结果如图6中A图、MΦ细胞如图6中B图所示。不同给药方式、不同给药浓度DC、MΦ细胞差异如图6中C图所示：同一给药方式下，口服中剂量与口服低剂量组有显著性差异，口服中剂量与口服高剂量组无显著性差异，口服中剂量组相对高剂量组的MΦ细胞水平较高；皮下注射组中剂量诱导DC、MΦ细胞比例高于低剂量组、高剂量组，并有显著性差异。中剂量(0.8mg/只)下，不同给药方式结果如图6中D图所示：同一给药浓度下，皮下注射组比口服组高，且具有显著性差异。**p＜0.01，***p＜0.001。故，人参多糖给药4h结果表明，中剂量0.8mg/只为给药最佳浓度，皮下注射为最佳给药途径。

为进一步确定人参多糖给药方式及剂量，给予BALB/c小鼠人参多糖24h后，再次检测小鼠双侧腹股沟淋巴结中DC细胞和MΦ细胞表达情况。实验结果如图7所示，表明：人参多糖口服组中，低剂量组DC细胞表达水平均低于中、高剂量组，但无显著性差异；高剂量组能更有效刺激MΦ细胞产生，仅与低剂量组有显著性差异(p＜0.05)。人参多糖皮下注射组中，中剂量组能更有效提高DC细胞表达水平，且均与低、高剂量组有显著性差异(p＜0.05)；皮下注射组MΦ细胞表达水平均高于口服组，仅与低剂量组有显著差异(p＜0.05)(图7中C图所示)。在中剂量下，皮下注射组DC细胞表达水平高于口服组，但无显著性差异；皮下注射组MΦ细胞表达水平高于口服组，具有显著性差异(p＜0.01)(图7中D图所示)。综上所述，再次验证中剂量0.8mg/只为给药最佳浓度，皮下注射为最佳给药途径。

实施例4

本实施例考察人参多糖作为疫苗佐剂的动物免疫方法，具体如下：

(1)动物分组：将6周龄BABL/c小鼠分为3组，每组5只。分别为对照组、RBD重组蛋白组、GPS+RBD重组蛋白组；

(2)免疫程序：于第0周、2周、4周进行蛋白抗原免疫，共免疫3次。每次免疫，每只对照组小鼠在腹部皮下注射50μL 1×PBS，每只RBD重组蛋白组、GPS+RBD重组蛋白组小鼠经腹部皮下注射总体积为50μL的蛋白液(均含10μg抗原及25μL弗式佐剂，GPS+RBD重组蛋白组含0.8mg人参多糖)；

(3)小鼠剪尾取血：于首免后第1、2、4、6、10、12、18周采取小鼠尾静脉血，4℃、2500rpm、20min离心血液取上清，保存至-80℃医用冰箱保存，供ELISA检测定血清中anti-RBD IgG抗体的滴度水平。免疫流程如图8所示。

以BALB/c小鼠为模型分析人参多糖作为佐剂诱导机体产生体液免疫应答的能力。使用0.8mg/只人参多糖佐剂与RBD重组蛋白作用于BALB/c小鼠，其中人参多糖佐剂组含人参多糖0.8mg/只、RBD重组蛋白10μg/只、Sigma佐剂系统(SAS)佐剂(即弗氏佐剂)25μL/只，总体系为50μL，体积不足时以PBS补齐；RBD重组蛋白组含RBD重组蛋白10μg/只、Sigma佐剂系统(SAS)佐剂25μL/只，总体系为50μL，体积不足时以PBS补齐；对照组为50μL无菌PBS/只。首次免疫后2周加强免疫一次，共免疫3次，于首免后第1、2、4、6、10、12、18周采取小鼠尾静脉血。免疫程序和血液采样计划如图8所示：小鼠抗原免疫共3次，每2周1次。小鼠尾静脉取血共7次，开始于首次免疫后1周，时间截止至首次免疫后第18周。第18周对小鼠进行安乐死处理。

检测项目：

一、ELISA检测小鼠血清中总IgG，具体如下：

(1)抗原包被：在ELISA高吸附板中，每孔加入4μg/mL RBD重组蛋白100μL，置于4℃孵育12-16h；

(2)封闭：彻底拍干孔板中包被蛋白液，每孔加入200μL5％牛奶，37℃恒温培养箱中90min；

(3)洗板：拍掉孔板中牛奶，加入260μL/孔PBST洗涤液，每次5min，共3-5次；

(4)孵育一抗：弃干洗涤液，将待测血清以适当倍数倍比稀释后，取100μL加入反应孔中，37℃孵育1h；

(5)洗板：拍掉孔板中血清，加入260μL/孔PBST洗涤液，每次5min，共3-5次；

(6)孵育二抗：按1:5000倍稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，加100μL/孔，37℃孵育1h；

(7)洗板：拍掉孔板中血清，加入260μL/孔PBST洗涤液，每次5min，共3-5次；

(8)显色：弃干孔中液体后，向每孔分别加入200μL TMB底物溶液，37℃避光反应10min；

(9)终止显色：每孔加入50μL 1M H₂SO₄终止反应，立即使用酶标仪于450nm处读OD值。

图9给出小鼠血清Anti-RBD IgG水平，首次免疫后第1周和第2周，人参多糖佐剂组Anti-RBD IgG水平高于对照组但无显著性差异，RBD重组蛋白组尚未在第一周引起高于对照组的血清Anti-RBD IgG水平。首次免疫后第4周，RBD重组蛋白组引起高于空白对照组的血清Anti-RBD IgG水平，GPS+RBD组诱导抗体水平最高，且持续具有显著性差异(***p＜0.001)。GPS+RBD组Anti-RBD IgG水平于首次免疫后第12周开始有所下降，下降幅度平稳，但仍保持高Anti-RBD IgG水平(第12周GPS+RBD组抗体稀释度为1：150万，RBD组为1：100万，人参多糖将RBD重组蛋白组Anti-RBD IgG抗体水平提高了50％)，且具有显著性差异(***p＜0.001)。综上所述，人参多糖作为佐剂可有效诱导机体产生更高水平的Anti-RBD IgG抗体及更长久的抗体维持时间。

二、ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中总IgG，具体如下：

(1)抗原包被：在ELISA高吸附板中，每孔加入4μg/mL RBD重组蛋白100μL，置于4℃孵育12-16h；

(2)封闭：彻底拍干孔板中包被蛋白液，每孔加入200μL 5％牛奶，37℃恒温培养箱中90min；

(3)洗板：拍掉孔板中牛奶，加入260μL/孔PBST洗涤液，每次5min，共3-5次；

(4)孵育一抗：弃干洗涤液，将待测BAL以适当倍数倍比稀释后，取100μL加入反应孔中，37℃孵育1h；

(5)洗板：拍掉孔板中BAL，加入260μL/孔PBST洗涤液，每次5min，共3-5次；

(6)孵育二抗：按1:5000倍稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，加100μL/孔，37℃孵育1h；

(7)洗板：拍掉孔板中血清，加入260μL/孔PBST洗涤液，每次5min，共3-5次；

(8)显色：弃干孔中液体后，向每孔分别加入200μL TMB底物溶液，37℃避光反应10min；

(9)终止显色：每孔加入50μL 1M H₂SO₄终止反应，立即使用酶标仪于450nm处读OD值。

肺作为新冠病毒靶器官，是最先感染并产生器质性损伤的部位，RBD反应性IgG在肺黏膜上有特异性的生物分布，故进一步检测人参多糖在RBD蛋白免疫小鼠中诱导的肺泡灌洗液Anti-RBD IgG水平。图10给出首次免疫后第10周小鼠肺泡灌洗液Anti-RBD IgG水平。取血清抗体高度达到最高峰、第三次免疫后的肺泡灌洗液进行抗体水平测定，结果显示，将肺泡灌洗液同比稀释至100倍时，GPS+RBD组OD值显著高于空白对照组(****p＜0.0001)，GPS+RBD组高于RBD组但无显著差异。人参多糖佐剂作用下诱导的RBD特异性IgG抗体反应在应答强度与单独的RBD蛋白抗原诱导的强度基本无差异，但与空白对照组有显著性差异，故人参多糖佐剂可提高肺泡灌洗液抗体能力，但其效用不明显，可能在一定程度上降低SARS-CoV-2感染风险。

三、人参多糖与RBD重组蛋白对小鼠免疫细胞增殖的影响，具体如下：

(1)取材：于首次免疫后4h、4周、6周、10周取小鼠脾脏和双侧腹股沟淋巴，置于冰上；

(2)制备单细胞悬液：于细胞筛中分别研磨淋巴与脾脏，使用胶头滴管吸至15mL离心管中，4℃、1500rpm离心7min。弃上清，淋巴使用1mL 1×PBS重悬。脾脏使用1mL红细胞裂解液冰上裂解15min后4℃、1500rpm离心7min，弃上清，使用1mL 1×PBS重悬；

(3)细胞表面分子染色：将单细胞悬液分至流式管中，加入表面分子染色抗体，染色30min后加入1mL 1×PBS终止染色后4℃、1500rpm离心7min，弃上清，使用200μL 1×PBS重悬，准备上机。

(4)细胞胞内分子染色：将单细胞悬液4℃、1500rpm离心7min，弃上清，使用1mLPRIM-1640完全重悬，取100μL细胞悬液至96孔板中，按照1:100比例加入细胞因子刺激剂，刺激8h后吹下细胞收至流式管中。4℃、1500rpm离心7min，弃上清，加入100μL 1×PBS重悬细胞后加入表染抗体，染色30min。加入1mL 1×PBS终止染色后4℃、1500rpm离心7min，弃上清。加入200μLFix/Perm破膜45min后加入1mL 1×Perm/wash终止破膜。4℃、1800rpm离心7min，弃上清，加入100μL 1×Perm/wash重悬细胞，加入胞染抗体进行染色，染色30min后加入500μL 1×Perm/wash终止染色。4℃、1800rpm离心7min，弃上清，加入1mL 1×PBS重悬后再次离心、弃上清，加入200μL 1×PBS重悬，准备上机。

为了进一步验证人参多糖佐剂作用下RBD重组蛋白疫苗是否更容易被捕获并呈递给CD4⁺T细胞，以更好的诱导体液免疫反应。取首次免疫后第4周小鼠脾脏淋巴细胞进行流式检测并分析。结果如图11所示，表明，GPS+RBD组脾脏淋巴细胞活化的CD4⁺T细胞(图A和图B)、Tfh细胞(图C)和GC B细胞(图D)的水平显著高于RBD重组蛋白组和空白对照组(*p＜0.05，**p＜0.01)。故人参多糖佐剂可促使RBD重组蛋白高效启动机体免疫应答反应(*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001)。

B细胞主要通过产生抗体，与抗原发生特异性结合来促进病毒清除。生发中心中，B细胞竞争捕获抗原，将抗原提呈给Tfh细胞，Tfh细胞辅助GC B细胞的成熟、分化，GC B细胞进一步发育为MB细胞，从而产生记忆性体液免疫反应。人参多糖的佐剂效应预计可提高小鼠对抗原的亲和力，从而更好的刺激GC B细胞、浆细胞、MB细胞的成熟及分化。MB细胞的产生在再次感染中发挥重要作用，可有效降低重症率。图12给出人参多糖对小鼠脾脏淋巴细胞中Tfh、GC B及MB细胞激活水平的影响。运用流式细胞术检测首次免疫后第6周(A)、第10周(B)小鼠脾脏淋巴细胞表达水平，其中GPS+RBD组Tfh及GC B细胞与RBD组、空白对照组均有显著性差异(*p＜0.05，**p＜0.01)；图C、图D为首次免疫后第4周、第10周小鼠脾脏中MB细胞与空白对照组有显著性差异(**p＜0.01)，第10周GPS+RBD组与RBD组MB无显著性差异，且RBD组MB细胞百分比低于空白对照组。表明人参多糖佐剂作用下可使RBD蛋白表现出更好的体液免疫效应，同时提高体液免疫记忆性，增加疫苗对机体的保护能力。

细胞免疫应答水平在抗病毒中起着重要作用，Tcm细胞是一种静息态的记忆T细胞，具有记忆性、持久性和扩增性，可以保证二次或多次感染后T细胞水平。本研究通过分析小鼠脾脏细胞CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞Tcm、IFN-γ因子和TNF-α因子表达水平，评估人参多糖佐剂在RBD蛋白中的作用。图13给出人参多糖对小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺Tcm、CD8⁺Tcm及其细胞因子激活水平的影响。结果显示，首次免疫后第4周、第6周GPS+RBD组CD4⁺Tcm细胞水平显著高于空白对照组和RBD组(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)；第6周GPS+RBD组CD8⁺Tcm细胞水平显著高于空白对照组(****p＜0.0001)；第18周GPS+RBD组CD8⁺Tcm细胞水平仍然显著高于其他两组(*p＜0.05)(图A)；第4周、第6周、第10周GPS+RBD组CD4⁺T细胞因子IFN-γ分泌水平显著高于空白对照组(*p＜0.05，***p＜0.001)；第10周GPS+RBD组CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞因子TNF-α分泌水平显著高于空白对照组(*p＜0.05，****p＜0.0001)(图B)。表明人参多糖佐剂促使RBD重组蛋白疫苗有效提高CTL反应水平，利于清除被感染的细胞，协助RBD蛋白突破亚单位疫苗诱导CTL的限制。同时产生高水平的记忆性细胞免疫和体液免疫，利于疫苗产生长期保护力及降低重症率。

Th1型细胞免疫应答在机体防御中起着十分重要的作用。Th2型细胞的升高会引起嗜酸性粒细胞升高，从而容易发生过敏反应、感染或传染、皮肤病、血液病等，Th2型细胞水平可检验药物安全性。在疫苗相关研究中，Th2型细胞与疫苗相关增强型呼吸道疾病有关。运用流式细胞术检测首次免疫后第4周、第6周、第10周小鼠脾脏淋巴细胞中Th1型、Th2型细胞表达情况，结果如图14所示，显示，GPS+RBD组分泌的Th1型细胞在首次免疫后第4周、第6周、第10周中与空白对照组比较，均有显著性差异(图A-D)；GPS+RBD组分泌的Th2型细胞在第4周、第6周与RBD组、空白对照组均无显著差异，且第10周GPS+RBD组分泌的Th2型细胞显著性低于空白对照组(图E-G)。表明人参多糖佐剂作用下可使RBD蛋白更好的介导细胞免疫、提高抗病毒能力，安全性上会降低因Th2型细胞增殖产生的疫苗相关增强型呼吸道疾病的可能性，具备一定安全性。

四、酶联免疫斑点技术检测人参多糖对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响，具体如下：

(1)肽段合成：在超净台内，将位于Spike蛋白区域内、被证明具有T细胞免疫原型的肽段，依托金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成；

(2)刺激剂准备：在超净台内，将肽段使用超纯水溶解后，通过0.22μm无菌针式过滤器过滤后分装，放至-80℃保存。将ELISpot试剂盒中阳性刺激剂按照标签溶解，同样的过滤方式分装好后放至-80℃避光保存；

(3)制备单细胞悬液：在超净台内，于细胞筛中研磨新鲜小鼠(BALB/c小鼠，首次免疫后6周和10周)脾脏，使用胶头滴管吸至15mL离心管中，4℃、1500rpm离心7min。弃上清，使用1mL红细胞裂解液冰上裂解15min后4℃、1500rpm离心7min，弃上清，使用1mL 1×PBS重悬后再次使用细胞筛，过滤掉细胞杂质。4℃、1500rpm离心7min，弃上清，使用10mLELISpot无血清培养基重悬后计数；

(4)活化预包被板：选取适量板条，每孔加入ELISpot无血清培养基200μL，超净台内静置10min后拍干；

(5)加入细胞悬液：将调整好细胞浓度的细胞加入到孔中；

(6)加入刺激物：在孔中按照实验需要加入对应的刺激剂；

(7)孵育：盖好板盖，放入到37℃、5％二氧化碳培养箱中培养20-22h；

(8)裂解细胞：拍掉孔内液体及细胞，每孔加入200μL冰冷纯水，4℃、10min；

(9)洗涤：拍干液体，每孔加入260μL 1×Washing buffer，停留1min，重复6次后拍干；

(10)孵育检测抗体：将稀释好的生物素标记的抗体，每孔100μL，37℃细胞培养箱培养1h；

(11)洗涤：拍干液体，每孔加入260μL 1×Washing buffer，停留1min，重复6次后拍干；

(12)孵育酶联亲和素：将稀释好的酶联亲和素，每孔100μL，37℃细胞培养箱培养1h；

(13)洗涤：拍干液体，每孔加入260μL 1×Washing buffer，停留1min，重复5次后扣干，揭开底板，用自来水冲洗底膜及底板，小心拍干后盖上底板，每孔加入260μL 1×Washing buffer，停留1min后扣干；

(14)AEC显色：将显色液现用现配，每孔100μL，包上锡纸，37℃细胞培养箱培养20min；终止显色：倾倒液体后，揭开底板，使用自来水冲洗孔内、孔底、底座3-5次。将板甩干，最后放到超净台风口至PVDF膜完全干燥，合上底座和板盖，包上锡纸，使用仪器读板。

基于目前新型冠状病毒变异频率极高的现状，现有疫苗(包括灭活疫苗、亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗及mRNA疫苗)的使用无法到达完全保护，尤其是在免疫后2-5月抗体滴度便降低至WHO规定的滴度标准，而T细胞免疫记忆的则更为持久，有研究表明针对SARS-CoV的T细胞免疫记忆可达8年之久。基于此我们合成了相应肽段，用以刺激分离自免疫RBD蛋白小鼠的脾淋巴细胞，用以确定相应肽段的CTL反应激活能力，进而筛选出以下T细胞表位：Peptide1氨基酸序列VGYQPYRVVVLSFEL，Peptide 2氨基酸序列VRQIAPGQTGKIAD。使用以上肽段，对小鼠脾脏于首次免疫后第6周、第10周进行T细胞分泌IFN-γ因子的ELISpot检测。

ELISpot实验进一步证实了T细胞应答，结果如图15所示，显示，首次免疫后第6周(A)(C)GPS+RBD组在两种肽段刺激下均可显著性提高T细胞中IFN-γ的分泌(*p＜0.05，**p＜0.01)。T细胞分泌IFN-γ情况：GPS+RBD组Peptide 1产生斑点中位数为28个，RBD组Peptide 1产生斑点中位数为10个，对照组Peptide 1产生斑点中位数为1个，人参多糖佐剂作用下将T细胞IFN-γ的分泌提高2.8倍。GPS+RBD组Peptide 2产生斑点中位数为32个，RBD组Peptide 2产生斑点中位数为3个，对照组Peptide 2产生斑点中位数为1个，人参多糖佐剂作用下将T细胞IFN-γ的分泌提高10.6倍。

首次免疫后第10周(B)(D)GPS+RBD组产生更高的T细胞效应，分泌更多的IFN-γ因子，与空白对照组和RBD组比较均有显著性差异(*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001)。T细胞分泌IFN-γ情况：GPS+RBD组Peptide 1产生斑点中位数为80个，RBD组Peptide 1产生斑点中位数为27个，对照组Peptide 1产生斑点中位数为0个，人参多糖佐剂作用下将T细胞IFN-γ的分泌提高2.9倍。GPS+RBD组Peptide 2产生斑点中位数为126个，RBD组Peptide 2产生斑点中位数为13个，对照组Peptide 2产生斑点中位数为0个，人参多糖佐剂作用下将T细胞IFN-γ的分泌提高9.6倍。结果表明人参多糖佐剂高效诱导RBD重组蛋白疫苗T细胞免疫反应。

综上所述，本发明具有以下优势：

(1)基于SARS-CoV-2S蛋白可有效引起中和抗体反应，在人参多糖联用下可更好刺激机体产生中和性抗体，并有效直接激活DC、MΦ细胞，利于抗原提呈；

(2)人参多糖属于中草药多糖类，提取成本低，易被人体消化吸收；并且中草药佐剂人参多糖易提取、易保存，适合批量生产，有效提高人参效用；

(3)人生多糖作为佐剂免疫效用好，可有效活化GC B、MB、Tfh、CD4⁺Tcm、Th1、CD4⁺T细胞内因子IFN-γ，抗体滴度高，免疫记忆更为持久，提供长期有效的免疫保护。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种疫苗，其特征在于：包括人参多糖和蛋白，所述蛋白为SARS-CoV-2RBD重组蛋白，具有以下T细胞表位：Peptide 1：VGYQPYRVVVLSFEL，Peptide 2：VRQIAPGQTGKIAD。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白的表达载体选自以下质粒中的一种：pET28a、pcDNA3.1、pfastbac、pSecTag、pET22b+、PGEX-6p-1、pSG5；

和/或，所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白通过以下表达系统中的一种表达：大肠杆菌表达系统、昆虫表达系统、酵母表达系统。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白的表达载体为pET28a；

和/或，所述表达系统为大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)菌株。

5.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述SARS-CoV-2RBD重组蛋白的纯化方法包括：将SARS-CoV-2RBD重组蛋白包涵体通过预装重力柱预纯化后，采用20mM咪唑洗脱液对SARS-CoV-2RBD重组蛋白粗品进行多次洗脱，再采用Elution洗脱液进一步进行多次洗脱。

6.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的给药方式为皮下注射。