RU2607379C2 - Раковый антиген - Google Patents
Раковый антиген Download PDFInfo
- Publication number
- RU2607379C2 RU2607379C2 RU2014101462A RU2014101462A RU2607379C2 RU 2607379 C2 RU2607379 C2 RU 2607379C2 RU 2014101462 A RU2014101462 A RU 2014101462A RU 2014101462 A RU2014101462 A RU 2014101462A RU 2607379 C2 RU2607379 C2 RU 2607379C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- protein
- cancer
- immune response
- cancer cells
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 140
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 119
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 38
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 17
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims abstract description 16
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims abstract description 16
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241001494992 Mycobacterium indicus pranii Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 101001057129 Bacillus cereus Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 11
- 101000700655 Mycobacterium leprae (strain TN) Serine-rich antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 101001050984 Apple stem grooving virus (strain Korea) Putative movement protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101001050983 Apple stem grooving virus (strain P-209) Probable movement protein Proteins 0.000 claims description 5
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 127
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 127
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 28
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 198
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 15
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101710148027 Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 230000021419 recognition of apoptotic cell Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- HBPQPBSTHOHSFP-UHFFFAOYSA-N OC(=O)C([Pt])=O Chemical compound OC(=O)C([Pt])=O HBPQPBSTHOHSFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003771 matrix metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121386 matrix metalloproteinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940115256 melanoma vaccine Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940022511 therapeutic cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к индуцированию экспрессии антигена на раковых клетках, и может быть использовано в медицине. Обработкой раковых клеток агентом, выбранным из Mycobacterium w, цисплатина, паклитакселя, гемцитабина и их комбинации, получают раковые антигены: белок 45 кДа, экспрессируемый клетками рака поджелудочной железы, и белок 36 кДа, экспрессируемый клетками меланомы. Изобретение позволяет получить опухолеспецифичный антиген, экспрессируемый раковыми клетками, обработанными указанным агентом, способный индуцировать иммунную реакцию на гомологичные и на гетерогенные раковые клетки, происходящие из той же ткани/того же органа. 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 8 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к антигену/антигенам раковых вакцин, иммуногенным против рака, то есть специфичным к ткани/органу, из которого он/они происходят, для применения в воздействии на рак. Изобретение также предоставляет способ получения такого антигена.
Предшествующий уровень техники
Рак вызывается быстро делящимися клетками. Он является основной причиной заболеваемости и смертности. Место происхождения рака представляет собой ткань/орган. Несмотря на тот факт, что он происходит из одиночных ткани/органа, клетки не идентичны (гомологичны). В лечении рака применяют хирургическое удаление, радиотерапию и/или химиотерапию. Установлено также, что полезна пассивная иммунотерапия в форме введения антител. Известно, что присутствие в раке, происходящем из одиночной ткани/органа, гетерогенных клеток приводит к слабому ответу на противораковую терапию, кроме хирургического лечения. Это более важно для лечения рака с помощью иммунотерапии.
Были попытки использовать активную иммунотерапию в форме вакцины для воздействия на рак. Для активной иммунотерапии необходимо использовать антиген, специфичный к раку, подлежащему лечению. Некоторые из специфических к раку антигенов включают ингибиторы металлопротеиназы матрикса, эпидермальный фактор роста, гастрин, целые раковые клетки, белки теплового шока и т.д.
Для создания иммуногенной раковой вакцины с использованием целых клеток были предложены несколько методов. Создаваемый раковой вакциной иммунный ответ часто вызывает аутоиммунную или токсичную реакцию (Blood-2011-01-325-366).
Поэтому, существует потребность иметь раковый антиген, который бы индуцировал иммунную реакцию на раковые антигены, но не на нормальные клетки (аутоиммунитет).
Используемые в качестве антигена раковые клетки либо не обладают иммуногенностью, либо генерируют слабую иммунную реакцию. Известно, что антрациклин и оксалоплатин усиливают иммуногенность раковых клеток, как описано Laurence Zitvogel et. al. в Clin Cancer Res, 2010, 16(12):3100-3104: “In response to some chemotherapeutic agents (such as anthracyclines and oxaliplatin) and ionizing irradiation, tumor cells undergo immunogenic apoptosis, meaning that they trigger a protective immune response when they are injected subcutaneously in the absence of any adjuvant into immunocompetent mice (J. Exp. Med. 2005; 202: 1691-701; Nat. Med. 2007; 13: 54-61.; Immunol. Rev. 2007; 220: 22-34.; Nat. Med. 2007; 13: 1050-1059.; Nat. Med. 2009; 15: 1170-1178.; Cell. Mol. Immunol. 2009; 6: 469-475.; Cancer Immunol. Immunother. 2010; 59: 769-777). In contrast, cells succumbing in response to other anticancer drugs (such as alkylating agents and cisplatin) fail to trigger such an immune reaction (J. Exp. Med. 2005; 202: 1691-1701)".
Задача изобретения состоит в том, чтобы генерировать иммунную реакцию, специфическую для раковых клеток, но без реакции на нормальные клетки и раковые клетки, происходящие из другой ткани/другого органа.
Таким образом, существует неудовлетворенная необходимость предоставить раковую вакцину, обладающую иммуногенностью по отношению к гетерогенной популяции клеток, происходящих из той же самой ткани/того же самого органа, и не действующую на нормальные клетки.
Цель изобретения
Основная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить антиген/антигены для раковой вакцины/раковых вакцин.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить антиген для раковой вакцины, который индуцирует иммунную реакцию на раковые клетки (и гомологичные, и гетерогенные раковые клетки) той же ткани (того же органа), из которой(-ого) они происходят.
Еще одна цель состоит в том, чтобы предоставить раковый антиген для злокачественной опухоли/злокачественных опухолей, который стимулирует клеточную иммунную реакцию на раковые клетки (и гомологичные, и гетерогенные раковые клетки), той ткани (того органа), из которого он происходит.
Еще одна цель состоит в том, чтобы предоставить раковую вакцину для злокачественной опухоли/злокачественных опухолей, которая стимулирует гуморальную иммунную реакцию на раковые клетки (и гомологичные, и гетерогенные раковые клетки) той ткани (того органа), из которого она происходит.
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить антиген для раковой вакцины для применения в лечении злокачественной опухоли (злокачественных опухолей).
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ приготовления антигена для раковой вакцины.
Краткое описание изобретения
Для целей настоящего изобретения раковые клетки могут быть выделены из опухолевых тканей. Для целей настоящего изобретения используются любые раковые клетки, происходящие из коммерчески доступных установленных клеточных линий или из новых первичных раковых клеток, полученных от пациентов.
Неожиданно, раковые клетки, обработанные цисплатином, паклитакселем, гемцитабином, Mycobacterium w или их комбинацией, имеют измененный белковый профиль. Более того, неожиданно обнаружено, что белковые профили из обработанных клеток имеют по меньшей мере один общий белок (экспрессированный или сверхэкспрессированный во всех клетках), независимо от использованного для обработки агента, например Mycobacterium w, цисплатина, паклитакселя, гемцитабина. Это наблюдение удивительно своей независимостью от того факта, что активности всех этих агентов различны. Обнаружено, что этот белок экспрессируется отлично от других белков после указанных выше обработок в соответствии с настоящим изобретением.
Установлено, что широко экспрессируемый белок в соответствии с настоящим изобретением является иммуногенным и индуцирует иммунную реакцию, воздействующую на раковые клетки, из которых он получен (гомологичные), а также на раковые клетки из той же ткани (того же органа), но имеющие иные клеточные характеристики (гетерогенные).
В соответствии с настоящим изобретением обработка линии клеток рака поджелудочной железы любым из указанных выше агентов приводит к экспрессии белка, который вызывает иммунную реакцию на те же самые (гомологичные) клетки, а также на отличающиеся (гетерогенные) клетки, притом, что они происходят из той же самой ткани (того же самого органа). Например, белок, экспрессируемый после обработки клеточной линии Mia-pa-ca-2, будет индуцировать иммунную реакцию на клетки Mia-pa-ca-2 (гомологичные), а также на клетки Panc-1, AsPc-1, SW 1990 и т.д. (гетерогенные). Иммунная реакция по природе может быть как клеточной, так и гуморальной.
Вызванная таким способом иммунная реакция способна обеспечить как профилактическое, так и терапевтическое действие на рак поджелудочной железы.
Вызванный с помощью линии клеток рака поджелудочной железы иммунный ответ не может вызывать иммунный ответ на другие типы рака.
Установлено, что введение белка/белков млекопитающим безопасно.
Краткое описание фигур
На Фиг. 1 продемонстрирована индукция клеточно-опосредованной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном.
На Фиг. 2 продемонстрирована индукция гуморальной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном. Схема нанесения представляет собой следующую:
Полоса 1: Предварительно окрашенный маркер молекулярной массы;
Полоса 2: Сыворотка мышей, иммунизированных обработанными клетками Mia-ра-са-2, экспрессирующими белок 45 кДа, в качестве первичных антител;
Полоса 3: Сыворотка нормальных мышей в качестве первичных антител.
На Фиг. 3 показано сравнение групп без введения и с введением вакцины.
На Фиг. 4 показана иммунная реакция, вызванная широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) белком, являющаяся специфичной для раковой ткани (ракового органа), из которого он происходит.
Схема нанесения на гель-1
полоса 1: пустой контроль
полоса 2: лизат клеток Mia-pa-ca-2
полоса 3: лизат клеток SW-1990
полоса 4: лизат клеток SAsPC-1
полоса 5: лизат клеток HEK 293
Схема нанесения на гель-2
полоса 1: лизат клеток РС-3 (рак простаты)
полоса 2: лизат клеток MCF-7 (рак молочной железы)
полоса 3: лизат клеток А549 (рак легких)
полоса 4: лизат клеток РА-1 (рак яичников)
полоса 5: лизат клеток А375 (меланома)
полоса 6: неокрашенный маркер белка
Подробное описание изобретения
Установлено, что если раковые клетки обработать Mycobacterium w (Mw), происходит изменение белкового профиля раковых клеток. Изменение белкового профиля сопровождается появлением насыщенной линии одного белка при анализе электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).
Неожиданно обнаружили, что этот же белок экспрессируется, когда клетки обрабатывают цисплатином, паклитакселем, гемцитабином. Белок, который так экспрессируется, определен как широко экспрессируемый (сверхэкспрессируемый) белок.
Экспрессируемый таким образом белок может быть выделен с помощью известных методов, как описано John Е. Coligan et al. в Current Protocols in Protein Science.
Неожиданно обнаружили, что этот белок генерирует иммунную реакцию на гомологичные и на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, из которых он происходит. При введении млекопитающим этот белок не вызывает иммунной реакции на нормальные клетки/ткани.
Неожиданно обнаружили также, что обработка раковых клеток такими соединениями, как цисплатин, паклитаксель, гемцитабин, также приводит к экспрессии белка, который экспрессируется, если клетки обрабатывают Mycobacterium w.
Таким образом, согласно настоящему изобретению, белок (белки), который (которые) широко экспрессируются/сверхэкспрессируются при обработке клеток Mw, цисплатином, паклитакселем и гемцитабином или их комбинацией, вызывают иммунную реакцию на гомологичные и на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, из которых он (они) происходят.
Широко экспрессированный/сверхэкспрессированный белок, индуцирующий иммунную реакцию, выделяют из раковых клеток. Для целей настоящего изобретения нет необходимости обрабатывать раковые клетки различными агентами, чтобы вызвать их гибель. Для выделения широко экспрессированного белка нет необходимости в том, чтобы клетки были живыми.
Общий белок настоящего изобретения индуцирует также иммунную реакцию, специфичную по отношению к гетерогенным раковым клеткам, специфичным к ткани/органу.
Введение общего белка в соответствии с настоящим изобретением индуцирует клеточную иммунную реакцию. Общепринятые методы, разработанные для измерения клеточной иммунной реакции, представляют собой FACS (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), ELISPOT (иммуноферментный спот-анализ), определение эффекторной функции и др.
Введение общего белка в соответствии с настоящим изобретением индуцирует гуморальную иммунную реакцию. Общепринятые методы, разработанные для этой цели, представляют собой FACS, вестерн-блот, ELISA (ИФА) и др.
Эффективность ракового антигена определяется по его способности индуцировать иммунную реакцию на гомологичные, а также гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, из которых он происходит.
Эффективность раковой вакцины в индукции иммунной реакции изучали путем определения опосредованной клетками иммунной реакции как меры увеличения числа клеток, продуцирующих интерферон-гамма в ответ на антиген, измеряемого методом ELISPOT.
Эффективность раковой вакцины в индукции иммунной реакции изучали путем определения гуморальной иммунной реакции по присутствии специфических антител, реагирующих на антиген, в сыворотках мышей, иммунизированных клетками, экспрессирующими/сверхэкспрессирующими антиген, и мышей, иммунизированных только одним антигеном.
Подобным же образом определяли индуцированную иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа. Гетерогенную реакцию оценивали для клеточной реакции с помощью определения интерферона-гамма методом ELISPOT, а для гуморальной реакции методом вестерн-блотирования.
Клеточные линии для целей настоящего изобретения могут быть получены из разных хранилищ, подобных Американской коллекции типовых культур (США) (American Type Culture Collection); Клеточному банку Австралии (Cell bank Australia); Хранилищу клеточных культур Coriell, Нью-Джерси, США (Coriell Cell Repositories, New Jersey, USA); Европейской коллекции клеточных культур (Великобритания) (European Collection of Cell Cultures, ЕСАСС); Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Германия) (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures); Японской коллекции исследовательских биоресурсов (Япония) (Japanese Collection of Research Bioresources, JCRB); Корейскому клеточному банку (Korean Cell bank, Korea); Центру биоресурсов RIKEN (Япония) (RIKEN Biresource Centre, Japan); Центру ресурсов генетики человека (США) (Human Genetics Resource Center, USA); Национальному центру клеточных наук (Индия) (National Centre for Cell Science, India); Региональным центрам ресурсов мутантных мышей (США) (MMRRC: Mutant Mouse Regional Resource Centers (USA); Национальному хранилищу человеческих нейрональных стволовых клеток (США) (National Human Neural Stem Cell Resource, USA); Банку стволовых клеток Великобритании (UK Stem Cell Bank) и NCCS (India).
Методы сбора раковых клеток и их сохранения или размножения хорошо известны. Эти методы можно использовать как для аутологичных, так и для аллогенных клеток. Эти или новые клеточные линии или специфические раковые клетки могут быть выделены, как описано Eton О. et al. (Clinical cancer research, March 1998, Vol. 4, 619-627). Свежие опухоли получали во время хирургической операции из лаборатории замороженных срезов и фрагментировали разрезанием на слои. Для получения максимального выхода жизнеспособных опухолевых клеток для приготовления вакцины массу опухоли разъединяли с помощью коллагеназы 1-го типа (2 мг/мл) и ДНКазы IV типа (0,4 мг/мл), Sigma chemical Co., St Loius, МО; ссылка 25. Эти ферменты могут изменять иммуногенность получаемого клеточного препарата. Диссоциированные клетки промывали HBSS и гентамицином, ресуспендировали в равных объемах HBSS и охлажденной смеси 10% ДМСО + 4% человеческого сывороточного альбумина. Аликвоты, содержащие 1,5-2×107 жизнеспособных опухолевых клеток, хранили под жидким азотом.
Далее описан процесс получения широко экспрессируемого белка согласно настоящему изобретению.
1. Раковые клетки суспендируют в подходящей среде для культивирования клеток, такой как DMEM, ЕМЕМ, Hanks F12 и др.
2. К клеткам добавляют любой из следующих агентов, таких как цисплатин, паклитаксель, гемцитабин и Mycobacterium w.
3. Известно, что все эти агенты убивают раковые клетки, однако для целей настоящего изобретения для получения широко экспрессируемого белка нет необходимости убивать раковые клетки обработкой любым или всеми из этих агентов. Подобным же образом убивание клеток не приводит к утрате раковыми клетками свойства экспрессировать общий целевой белок и не изменяет его иммунных характеристик.
4. Нижеследующая таблица показывает предпочтительные количества различных подлежащих использованию агентов.
5. Клетки отбирают после указанной выше обработки.
6. Белковый профиль собранных клеток определяют с помощью известных методов, таких как электрофорез, ВЭЖХ и т.д.
7. Экспрессируемый широко белок идентифицируют путем наложения белковых профилей, полученных после обработки с использованием различных агентов, как указано выше.
8. Идентифицированный белок может быть получен в масштабированных количествах с помощью методов очистки белков.
Полученные, как описано выше, раковые клетки обрабатывали клетками Mw в соотношении от 1:10 до 1:1000, предпочтительно в отношении 1:100. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°С. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линии отличающимся образом экспрессированного белка.
Раковые клетки обрабатывали цисплатином при концентрации в диапазоне от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл, предпочтительно при 5 мкг/мл. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°C. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линий отличающимся образом экспрессированных белков.
Раковые клетки обрабатывали паклитакселем при концентрации в диапазоне от 5 мкг/мл до 500 мкг/мл, предпочтительно при 5 мкг/мл. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°C. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линий отличающимся образом экспрессированных белков.
Раковые клетки обрабатывали гемцитабином при концентрации в диапазоне от 10 нМ до 1000 нМ, предпочтительно при 800 нМ. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°C. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линий отличающимся образом экспрессированных белков.
Измененные белковые профили, полученные для каждого из указанных выше режимов обработки, сопоставляли друг с другом. В раковых клетках Mia-pa-са-2 был отмечен (были отмечены) (идентифицированы) широко экспрессированный белок (экспрессированные белки) с молекулярной массой в диапазоне 40-50 кДа.
Обработанные и необработанные раковые клетки ресуспендировали в PBS с рН от 6,5 до 7,5. Клетки обрабатывали ультразвуком (УЗ) в течение 500-1500 с в режиме: 5-15 с озвучивание, 5-15 с перерыв, предпочтительно обрабатывали УЗ в течение 900 с в режиме: 9 с обработка, 10 с перерыв. В лизате определяли общий белок методом Lowry. Рассчитывали общее содержание белка и в каждую ячейку геля наносили 20 мкг белка. Для выделения белка применяли электрофорез в 5-20% полиакриламидном геле, предпочтительно в 10% полиакриламидном геле с поверхностно-активным веществом, таким как SDS, но не ограничиваясь им. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 100-300 В, предпочтительно при 200 В, в течение 30-90 мин, предпочтительно 60 мин. Гель окрашивали красящим раствором кумасси синего R250 в течение 15-60 мин и отмывали от красителя отмывающим раствором (40% метанола + 10% уксусной кислоты + 50% воды) до обесцвечивания фона и проявления линий в геле. Белковые профили сопоставляли линия за линией и отмечали общий экспрессированный (сверхэкспрессированный) белок в ответ на обработку Mw, цисплатином, паклитакселем и гемцитабином.
После идентификации содержащий интересующую линию гель разрезали на кусочки, элюировали элюирующим буфером (20 мМ трис-Cl, рН 7,7, 150 мМ NaCl, 0,2% SDS, 2 мМ EDTA) и помещали во встряхивающий аппарат для взбалтывания при комнатной температуре в течение как минимум 6-8 ч или в течение ночи. Собирали надосадочную жидкость, для осаждения белка добавляли ледяной ацетон (в соотношении белок : ацетон = 1:4) и выдерживали для осаждения при -20°C в течение 1-2 ч. Осадок отделяли центрифугированием при 15000 g в течение 45 мин при 4°C, промывали ацетоном (соотношение ацетон : вода = 4:1) и ресуспендировали в нужном объеме PBS. Общий белок определяли методом Лоури (Lowry), его специфичность анализировали с помощью полученной авторами мышиной сыворотки, содержащей антитела к интересующему белку. Для идентификации этого особенным образом экспрессированного белка проводили двумерный электрофорез в геле. Белок обнаруживался в геле в виде большого пятна в месте, соответствующем молекулярной массе 45 кДа при сравнении с положением стандартного маркера молекулярной массы белка, подвергнутого электрофорезу в том же геле.
Экспрессированный широко белок вводили инъекцией мышам. У мышей возникала специфическая иммунная реакция по отношению к раковым клеткам. Гуморальную иммунную реакцию измеряли путем детектирования антител, специфичных к широко экспрессированному/сверхэкспресированному белку. Анализ проводили с помощью стандартных приемов для вестерн-блотирования, дот-блотирования и ИФА.
Опосредованную клетками иммунную реакцию (cell mediated immune response = CMI) измеряли путем определения числа клеток, продуцирующих интерферон-гамма и/или гранзим (granzyme), и/или процента убивания клеток-мишеней (раковых клеток).
Приготовленная в соответствии с настоящим изобретением вакцина при введении животным с опухолями (мышам, млекопитающим) приводит к регрессии опухолей, если вакцина и опухоль происходят из той же самой ткани, например, вакцина с белком из меланомы для меланомы.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают область охвата изобретения.
Пример 1: Метод идентификации широко экспрессируемых белков
1. Рак поджелудочной железы
Клетки Mia-pa-ca-2 обрабатывали клетками Mw при соотношении Mw к клеткам 1:500, цисплатином при 5 мкг/мл, паклитакселем при 150 мкг/мл и гемцитабином при 800 нМ. Обработку проводили в среде без сыворотки при 37°C. Клетки лизировали, для получения протеомного профиля проводили электрофорез SDS-PAGE. Проводили наложение полученных таким образом профилей на белковый профиль необработанных клеток. Наблюдали белковый профиль для каждой обработки. Особым образом экспрессированный белок был идентифицирован в положении, соответствующем 45 кДа.
Белок 45 кДа представляет собой широко сверхэкспрессируемый белок, если клетки рака поджелудочной железы обработаны Mw, цисплатином, паклитакселем, гемцитабином или их комбинацией.
2. Меланома (рак кожи)
Клетки меланомы В16 обрабатывали цисплатином при 5 мкг/мл, паклитакселем при 150 мкг/мл и гемцитабином при 800 нМ. Обработку проводили в среде без сыворотки при 37°C. Клетки лизировали, для получения протеомного профиля проводили электрофорез SDS-PAGE. Проводили наложение полученных таким образом профилей на белковый профиль необработанных клеток. Наблюдали белковый профиль для каждой обработки. Особым образом экспрессированный белок был идентифицирован в положении, соответствующем 36 кДа.
Белок 36 кДа представляет собой широко сверхэкспрессируемый белок, если клетки меланомы обработаны Mw, цисплатином, паклитакселем, гемцитабином или их комбинацией.
3. Рак легких
Различные линии клеток рака легких (А549 и L132) обрабатывали Mw при соотношении Mw к клеткам 1:100. Каждая обрабатываемая группа содержала 4×106 клеток. Обработанные Mw клетки инкубировали 4 ч при 37°C. После обработки клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в DPBS (400 мкл) и обрабатывали УЗ в течение 15 мин (импульсы по 10 с и перерывы 20 с). В полученном лизате определяли количество белка биуретовым методом (ВСА Protein assay). Количество белка нормировали таким образом, чтобы наносить 30 мкг белка в каждую ячейку. После этого для определения белкового профиля проводили электрофорез SDS-PAGE в восстанавливающих условиях в 12% геле, гуморальную реакцию определяли вестерн-блотированием. Полученный профиль сопоставляли с белковым профилем необработанных клеток. У обеих линий клеток обнаружен общий белок с молекулярной массой 43 кДа.
4. Меланома кожи
Различные линии раковых клеток меланомы кожи (А375, B16F1 и B16F10) были обработаны Mw при соотношении Mw к клеткам 1:100. Каждая обрабатываемая группа содержала 4×106 клеток. Обработанные Mw клетки инкубировали 4 ч при 37°C. После обработки клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в DPBS (400 мкл) и обрабатывали УЗ в течение 15 мин (импульсы по 10 с и перерывы 20 с). В полученном лизате определяли количество белка методом ВСА Protein assay. Количество белка нормировали таким образом, чтобы наносить 30 мкг белка в каждую ячейку. После этого для определения белкового профиля проводили электрофорез SDS-PAGE в восстанавливающих условиях в 12% геле, гуморальную реакцию определяли вестерн-блотированием. Полученный профиль сопоставляли с белковым профилем необработанных клеток.
В гелях были обнаружены 2 белка с молекулярной массой 36 кДа и 170 кДа. Интересно, что при блотировании с антителами, полученными с помощью обработанных клеток В16, оба белка проявляли перекрестную реактивность по отношению к А375, B16F1 и B16F10, если же антитела были получены с помощью обработанных клеток А375, реакционно-способным был только белок 36 кДа.
5. Рак толстой кишки
Различные линии клеток рака толстой кишки (НСТ15 и Colo205) были обработаны Mw при соотношении Mw к клеткам 1:100. Каждая обрабатываемая группа содержала 4×106 клеток. Обработанные Mw клетки инкубировали 4 ч при 37°C. После обработки клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в DPBS (400 мкл) и обрабатывали УЗ в течение 15 мин (импульсы по 10 с и перерывы 20 с). В полученном лизате определяли количество белка методом ВСА Protein assay. Количество белка нормировали таким образом, чтобы наносить 30 мкг белка в каждую ячейку. После этого для определения белкового профиля проводили электрофорез SDS-PAGE в восстанавливающих условиях в 12% геле, гуморальную реакцию определяли вестерн-блотированием. Полученный профиль сопоставляли с белковым профилем необработанных клеток. В обеих линиях клеток был обнаружен общий белок с молекулярной массой в диапазоне между 10-15 кДа и 26 кДа.
Пример 2: Способ выделения широко экспрессированного (сверхэкспрессированного) белка (ракового антигена)
Собирали осадок клеток Mia-pa-ca-2 и промывали стерильным DPBS с центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Клетки были обработаны так, как описано в пунктах 1 и 2. Осадок обработанных клеток ресуспендировали в DPBS и обрабатывали УЗ в течение 15 мин. Общее содержание белка в лизате определяли методом Фолина-Лоури. В каждую ячейку 10% геля наносили 20 мкг лизата и проводили электрофорез SDS-PAGE в течение 45 мин при 200 В. Гель окрашивали красителем Coomassie Brilliant Blue R250. Была обнаружена белковая линия 45 кДа при сравнении с белковым маркером молекулярной массы. Кусок геля с линией был вырезан, измельчен и инкубирован в лизирующем буфере (20 мМ трис-HCl рН 7,7, 150 мМ NaCl, 0,2% SDS, 2 мМ EDTA) со встряхиванием при комнатной температуре в течение ночи. Белок элюировали из геля центрифугированием лизата при 15000 g в течение 45 мин при 4°C. Надосадочную жидкость смешивали с ледяным ацетоном в отношении 1:4 и инкубировали при -20°C в течение приблизительно 1 ч. Полученный осадок отделяли цетрифугированием при 15000 g в течение 45 мин при 4°C. Осадок промывали смесью ацетон:вода 3:2 и центрифугировали при 15000 g в течение 45 мин при 4°С.Полученный осадок ресуспендировали в DPBS, содержащие белка определяли методом Фолина-Лоури. Был получен белок со степенью чистоты около 90%.
Пример 3: Фармацевтический препарат
Фармацевтический препарат с широко экспрессированным белком для рака поджелудочной железы и рака меланомы готовили, как указано ниже.
1. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 10 мкг
фосфатный буфер | 50 мМ |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
2. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 50 мкг
фосфатный буфер | 50 мМ |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
3. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 100 мкг
фосфатный буфер | 50 мМ |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
4. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 10 мкг
ацетатный буфер | 50 мM |
NaCl | 150мМ |
наполнитель | достаточное количество |
5. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 50 мкг
ацетатный буфер | 50 мM |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
6. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 100 мкг
ацетатный буфер | 50 мM |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
7. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 100 мкг
фосфатный буфер | 10 мМ |
NaCl | 300 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
8. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 1 мкг
фосфатный буфер | 10 мМ |
NaCl | 300 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
9. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 10 мкг
фосфатный буфер | 50 мМ |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
10. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 100 мкг
фосфатный буфер | 50 мМ |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
11. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 500 мкг
фосфатный буфер | 50 мМ |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
12. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 1 мкг
ацетатный буфер | 50 mM |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
13. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 500 мкг
ацетатный буфер | 50 mM |
NaCl | 150 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
14. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 50 мкг
фосфатный буфер | 10 мМ |
NaCl | 300 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
15. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 500 мкг
трис-буфер | 50 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
16. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 500 мкг
трис-буфер | 50 мМ |
наполнитель | достаточное количество |
Указанная выше рецептура применяется как таковая или в комбинации по усмотрению с адъювантом для получения необходимой иммунной реакции при подходящем способе введения.
Пример 4: Индукция клеточной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном: Иммуногенность ракового антигена
Иммунологическую реакцию в ответ на широко экспрессированный (сверхэкспрессированный) белок 45 кДа оценивали, иммунизируя мышей внутрикожно в дни 0 и 21 рецептурой 1 из примера 3 (10 мкг белка 45 кДа). Контрольным мышам вводили PBS. Для определения количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма, методом ELISPOT на 28-й день исследования готовили суспензии спленоцитов (107 клеток в 1 мл) из индивидуальных мышей. Определение методом ELISPOT выполняли на спленоцитах мышей как в контрольной, так и в тестовой группе.
Регистрацию изображений на планшете проводили с помощью сканера CTL Spot Reader. Сигналы от каждой ячейки регистрировались автоматически. Количественные значения определяли на основе параметров чувствительности и фона, проводился анализ результатов. Как показано на фиг. 1, было обнаружено двукратное увеличение высвобождения интерферона-гамма в ответ на иммунизацию белком 45 кДа.
Пример 5: Индукция гуморальной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном: Иммуногенность ракового антигена
a. Оценивали создание гуморального иммунитета в ответ на раковый антиген. Мыши были случайным образом распределены (рандомизированы) по двум группам. Первую группу мышей в дни 0 и 21 иммунизировали внутрикожно рецептурой 15 из примера 3, а вторую группу, т.е. контрольную группу, иммунизировали PBS. У всех мышей на 28-й день исследования отбирали пробы сыворотки для определения появления антител к вакцине. Был проведен вестерн-блот анализ лизатов Mia-pa-ca-2 с сыворотками мышей, иммунизированных обработанными клетками Mia-pa-ca-2, экспрессирующими белок 45 кДа, и иммунизированных PBS (контроль). Для определения первичных антител, связавшихся с белком лизата, были использованы конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела к мышиному IgG с DAB (диамино-бензидин) в качестве окрашивающего агента. Вестерн-блот анализ показал, что иммунизация раковой вакциной Mia-pa-ca-2 вызывает образование антител к раковому антигену (фиг. 2).
b. Для создания высоких титров антител у кроликов антиген рака меланомы в рецептуре 10 из примера 3 (белок 36 кДа) вводили в дни 0, 7 и 14 совместно с адъювантом Фрейнда. На 21-й день у кроликов была взята кровь, и титры антител измеряли с помощью «dot blot» анализа, помещая антиген на нитроцеллюлозную мембрану и используя в качестве первичных антител сыворотки иммунизированных кроликов. Пятна проявляли конъюгатом вторичных антител с пероксидазой хрена. Было установлено, что титр антител к антимеланомному антигену был более 10000.
c. Для образования антител к антигену рака поджелудочной железы кроликов иммунизировали рецептурой 8 из примера 3 с антигеном рака поджелудочной железы (белок ~45 кДа) с полным адъювантом Фрейнда, а на 15-й день с неполным адъювантом Фрейнда. На 30-й день у кроликов была взята кровь, и титры антител измеряли с помощью «dot blot» анализа, помещая антиген на нитроцеллюлозную мембрану и используя в качестве первичных антител сыворотки иммунизированных кроликов. Пятна проявляли конъюгатом вторичных антител с пероксидазой хрена. Было установлено, что титр антител к антигену рака поджелудочной железы был более 50000.
Пример 6: Убивание in vitro гетерогенных и гомогенных раковых клеток спленоцитами иммунизированных мышей: анализ эффекторной функции
А. Иммунная реакция на гомологичные раковые клетки
В исследовании использовали 20 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела и распределены в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожно рецептурой 7 с раковым антигеном в дозе 100 мкг/мышь (широко экспрессированный белок 45 кДа, выделенный из клеток Mia-pa-ca-2, как описано в примере 1), а вторую группу (контроль) иммунизировали PBS.
Спленоциты из иммунизированных животных распределяли в полипропиленовые пробирки, содержащие клетки-мишени Mia-pa-ca-2. Добавляли спленоцитные эффекторы с соблюдением отношения эффектора к мишени 5:1 и 1:1. Пробирки инкубировали при 37°C в атмосфере 6% CO2 в течение 4 ч. Через 4 ч клетки осаждали центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок фиксировали 1% (масса к объему) раствором пара-формальдегида и дважды промывали DPBS с центрифугированием. Добавляли 70% этанол, клетки оставляли на льду на 30 мин. Клетки хранили для последующего анализа при -20°C.
Цитолитическую активность Т-клеток оценивали, определяя гибель клеток-мишеней эффекторными клетками с помощью протокола BD АРО BrdU Kit. Набор APO-BrdU kit - это метод двойного окрашивания разрывов ДНК и общей клеточной ДНК для детектирования апоптозных клеток методом проточной цитометрии. Клетки из иммунизированных раковым антигеном (широко экспрессируемый белок 45 кДа) при отношении эффектора к мишени 5:1 гораздо активнее лизировали гомологичные клетки-мишени (раковые клетки Mia-pa-ca-2) по сравнению с клетками контрольной группы.
В. Иммунная реакция на гетерогенные (гетерологичные) раковые клетки
В исследовании использовали 20 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела и распределены в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожно рецептурой 5 из примера 3 в дозе 50 мкг/мышь (широко экспрессированный белок 45 кДа, выделенный из клеток Mia-pa-ca-2, как описано в примере 1), а вторую группу (контроль) иммунизировали PBS.
Спленоциты иммунизированных животных из соответствующих групп помещали в полипропиленовые пробирки, содержащие клетки-мишени Panc-1, AsPC-1 или SW1990. Добавляли спленоцитные эффекторы с соблюдением отношения эффектора к мишени 5:1 и 1:1. Пробирки инкубировали при 37°C в атмосфере 6% CO2 в течение 4 ч. Через 4 ч. клетки осаждали центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок фиксировали 1% (масса к объему) раствором пара-формальдегида и дважды промывали DPBS с центрифугированием. Добавляли 70% этанол, клетки оставляли на льду на 30 мин. Клетки хранили для последующего анализа при -20°C.
Цитолитическую активность Т-клеток оценивали, определяя гибель клеток-мишеней под действием эффекторных клеток с помощью протокола BD АРО BrdU Kit. Набор APO-BrdU kit представляет собой метод двойного окрашивания разрывов ДНК и общей клеточной ДНК для детектирования апоптозных клеток методом проточной цитометрии. Клетки из иммунизированных раковым антигеном (широко экспрессированный белок 45 кДа) при отношении эффектора к мишени 5:1 гораздо активнее лизировали гетерогенные клетки-мишени рака поджелудочной железы (Panc-1, AsPC-1 или SW1990) по сравнению с клетками контрольной группы.
Пример 7: Регрессия опухолей in vivo в функциональном анализе мышей
1. В исследовании использовали 30 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела. Индукцию опухолей у мышей производили подкожной инъекцией в заднюю лапу 1×105 клеток B16-F1. После развития у мышей опухолей со средним размером ~100-150 мм3 их распределяли случайным образом по размеру опухолей в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации внутрикожно рецептурой меланомной вакцины 13 из примера 3 в дозе 500 мкг/мышь (широко экспрессированный белок 36 кДа), а вторую группу мышей (контроль) не иммунизировали. Дважды в неделю регистрировали рост опухолей, пока опухоль не достигала 10% от массы тела животного.
Сравнение с контрольной группой (фиг. 3) показывает, что объем опухолей в опытной группе не увеличивался. В действительности в опытной группе зарегистрировано уменьшение размера опухолей, что указывает на ослабление болезненного статуса. Вообще в опытной группе увеличилась выживаемость и уменьшился размер опухолей.
2. В исследовании использовали 20 мышей-самцов линии С57 в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела. Индукцию опухолей у мышей производили подкожной инъекцией в заднюю лапу 1×105 клеток Pan 02 (линия клеток рака поджелудочной железы). После развития у мышей опухолей со средним размером ~200 мм3 их распределяли случайным образом по размеру опухолей в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации рецептурой вакцины рака поджелудочной железы 4 из примера 3 (общий экспрессированный белок 45 кДа) в дозе 10 мкг/мышь, контрольную группу не иммунизировали. Дважды в неделю регистрировали рост опухолей, пока опухоль не достигала 10% от массы тела животного.
По сравнению с контрольной группой объем опухолей в опытной группе не увеличивался. Вообще в опытной группе увеличилась выживаемость и уменьшился размер опухолей. В опытной группе обнаружена задержка в увеличении массы опухолей по сравнению с животными в контрольной группе.
3. В этом исследовании использовали 10 мышей-самцов линии С57 в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации внутрикожно рецептурой 15 из примера 3 вакцины рака поджелудочной железы (широко экспрессированный белок 45 кДа) в дозе 500 мкг/мышь, а вторую группу (контроль) не иммунизировали. На 10-й день после 1-й инъекции раковой панкреатической вакцины производили у мышей индукцию опухолей подкожной инъекцией в заднюю лапу 1×105 клеток Pan 02 (линия клеток рака поджелудочной железы). Дважды в неделю регистрировали рост опухолей, пока опухоль не достигала 10% от массы тела животного.
По сравнению с контрольной группой объем опухолей в опытной группе не увеличивался. Вообще в опытной группе увеличилась выживаемость. В опытной группе зарегистрирована задержка в развитии опухолей по сравнению с контрольной группой.
Пример 8: Иммунная реакция, создаваемая широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) белком специфична по отношению к раковой ткани (органу), из которых он происходит
Мышей в дни 0 и 21 иммунизировали внутрикожно рецептурой ракового антигена 5 из примера 3 (общий экспрессированный белок 45 кДа) в дозе 50 мкг/мышь. На 28-й день исследования у мышей отбирали пробы сывороток. В лизатах клеток Mia-pa-ca-2, AsPC-1, SW-1990 и рака различного происхождения, как HEK-293 (почки), РС-3 (простата), MCF-7 (молочная железа), А549 (легкие), РА-1 (яичники) проводили вестерн-блотирование с первичными антителами, полученными у мышей к терапевтической раковой вакцине. Для определения связывания первичных антител с антигеном (антигенами) лизата использовали конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела к мышиному IgG с DAB в качестве окрашивающего/детектирующего агента. Результаты вестерн-блотирования показывают (фиг. 4), что антитела, образовавшиеся вследствие иммунизации широко экспрессированным белком 45 кДа, имеют гетерогенную реактивность по отношению к лизатам раковых клеток, происходящих из поджелудочной железы (гетерогенных), но не реагируют с лизатами раковых клеток, происходящих из другой ткани (другого органа). На фиг. 4 полосы с 2 по 4 на Геле 1 - для лизатов раковых клеток из различных тканей (органов), показывающие реакционную способность сывороток мышей, иммунизированных раковым антигеном (широко экспрессированным белком 45 кДа), что указывает на гетерогенную реакционную способность по отношению к раковым клеткам, происходящим из данной ткани (данного органа). В то же время полосы с 1 по 5 на Геле 2 показывают отсутствие реакционной способности по отношению к раковым клеткам, происходящим из другой ткани (другого органа), - а именно простаты, молочной железы, легких, яичников и кожи, что иллюстрирует безопасность вакцины, содержащей раковый антиген (широко экспрессированный белок).
Резюме
Настоящее изобретение непредсказуемо обнаружило, что раковые клетки, обработанные цисплатином, паклитакселем, гемцитабином, Mycobacterium w или их комбинацией, имеют измененный белковый профиль. Более того, установлено, что белковые профили обработанных клеток имеют по меньшей мере один белок, общий (широко экспрессированный/сверхэкспрессированный), независимо от того, какой агент был использован для обработки, например, Mycobacterium w, цисплатин, паклитаксель, гемцитабин. Белок (широко экспрессированный/сверхэкспрессированный) отличается от белков раковых клеток, происходящих из различных органов (различных тканей).
Установлено, что широко экспрессированный белок, введенный в рецептуру в количестве более 1 мкг, является иммуногенным и индуцирует иммунную реакцию на раковые клетки, из которых он происходит (гомологичные), а также на раковые клетки той же самой ткани (того же самого органа), но с отличными клеточными характеристиками (гетерогенные), как описано в примере выше. Иммунная реакция, вызванная при использовании линии клеток рака поджелудочной железы, не инициирует иммунный ответ на другие типы рака. Установлено, что введение белка (белков) безопасно для млекопитающих. Для дополнительного усиления иммунной реакции эти белки по усмотрению можно перед введением млекопитающему комбинировать с адъювантом.
Вызванная таким образом иммунная реакция способна обеспечить как профилактическое, так и терапевтическое воздействие на рак поджелудочной железы.
Claims (5)
1. Раковый антиген, специфичный к раку, экспрессируемый раковыми клетками, обработанными агентом, выбранным из Mycobacterium w, цисплатина, паклитакселя, гемцитабина и их комбинации, индуцирующий иммунную реакцию на гомологичные и на гетерогенные раковые клетки, происходящие из той же ткани/того же органа, где указанный раковый антиген представляет собой белок 45 кДа, экспрессируемый клетками рака поджелудочной железы, и белок 36 кДа, экспрессируемый клетками меланомы.
2. Раковый антиген по п. 1, где индуцированная иммунная реакция представляет собой клеточно-опосредованную иммунную реакцию.
3. Раковый антиген по п. 1, где индуцированная иммунная реакция представляет собой гуморальную иммунную реакцию.
4. Раковый антиген по любому из пп. 1-3, снижающий опухолевую нагрузку при введении млекопитающему в фармацевтически приемлемой композиции.
5. Раковый антиген по п. 4, где указанная фармацевтически приемлемая композиция дополнительно содержит адъювант.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN1929MU2011 | 2011-07-05 | ||
IN1929/MUM/2011 | 2011-07-05 | ||
PCT/IB2012/053396 WO2013005164A2 (en) | 2011-07-05 | 2012-07-04 | Cancer antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014101462A RU2014101462A (ru) | 2015-08-10 |
RU2607379C2 true RU2607379C2 (ru) | 2017-01-10 |
Family
ID=47116113
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014101462A RU2607379C2 (ru) | 2011-07-05 | 2012-07-04 | Раковый антиген |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9714275B2 (ru) |
EP (1) | EP2729166B1 (ru) |
JP (1) | JP2014521599A (ru) |
AU (1) | AU2012279923B2 (ru) |
CA (1) | CA2841767C (ru) |
ES (1) | ES2647768T3 (ru) |
RU (1) | RU2607379C2 (ru) |
WO (1) | WO2013005164A2 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5889335B2 (ja) * | 2011-01-11 | 2016-03-22 | カディラ ファーマシューティカルズ リミテッド | 癌治療用医薬組成物 |
WO2017192863A1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-11-09 | L.E.A.F. Holdings Group Llc | Targeted liposomal gemcitabine compositions and methods thereof |
JP6421208B2 (ja) * | 2017-02-28 | 2018-11-07 | カディラ ファーマシューティカルズ リミテッド | がん抗原 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA013466B1 (ru) * | 2005-09-05 | 2010-04-30 | Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх | Опухолеассоциированные пептиды, связывающиеся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (hla) i или ii класса, и относящаяся к ним противораковая вакцина |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA79952C2 (en) * | 2001-12-10 | 2007-08-10 | Kabulesh Mafatlal Khamar | MYCOBACTERIUM w APPLICATIONS FOR CANCER TREATMENT |
US20040214203A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-10-28 | Oncotech, Inc. | Genes related to sensitivity and resistance to chemotherapeutic drug treatment |
EA200800917A1 (ru) * | 2005-04-25 | 2008-12-30 | Бакулиш Мафатлал Хамар | Адъюванты для вакцин |
WO2011068832A1 (en) * | 2009-12-01 | 2011-06-09 | Precision Therapeutics, Inc. | Multi drug response markers for breast cancer cells |
RU2615346C2 (ru) * | 2011-02-28 | 2017-04-04 | Кадила Фармасьютикалз Лимитед | Терапевтическая вакцина против рака |
-
2012
- 2012-07-04 WO PCT/IB2012/053396 patent/WO2013005164A2/en active Application Filing
- 2012-07-04 CA CA2841767A patent/CA2841767C/en active Active
- 2012-07-04 ES ES12780814.5T patent/ES2647768T3/es active Active
- 2012-07-04 AU AU2012279923A patent/AU2012279923B2/en active Active
- 2012-07-04 RU RU2014101462A patent/RU2607379C2/ru active
- 2012-07-04 EP EP12780814.5A patent/EP2729166B1/en active Active
- 2012-07-04 JP JP2014518045A patent/JP2014521599A/ja active Pending
- 2012-07-04 US US14/130,504 patent/US9714275B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA013466B1 (ru) * | 2005-09-05 | 2010-04-30 | Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх | Опухолеассоциированные пептиды, связывающиеся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (hla) i или ii класса, и относящаяся к ним противораковая вакцина |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
VOELTZEL T. et al., Detection of a 45-kilodalton antigen overexpressed in a cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cell line, Hybridoma, 1994, v.13,n.5,p.367-372. PAN S. et al., Quantitative proteomics analysis integrated with microarray data reveals that extracellular matrix proteins, catenins, and p53 binding protein 1 are important for chemotherapy response in ovarian cancers, OMICS, 2009, v.13,n.4,p.345-354. SUR P.K. et al., Role of mycobacterium w as adjuvant treatment of lung cancer (non-small cell lung cancer), J. Indian Med. Assoc., 2003, v.101, n.2, p.118-120. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2729166B1 (en) | 2017-09-06 |
US9714275B2 (en) | 2017-07-25 |
CA2841767C (en) | 2023-03-14 |
JP2014521599A (ja) | 2014-08-28 |
WO2013005164A3 (en) | 2013-03-14 |
AU2012279923A1 (en) | 2014-02-06 |
WO2013005164A2 (en) | 2013-01-10 |
RU2014101462A (ru) | 2015-08-10 |
ES2647768T3 (es) | 2017-12-26 |
EP2729166A2 (en) | 2014-05-14 |
CA2841767A1 (en) | 2013-01-10 |
AU2012279923B2 (en) | 2017-03-09 |
US20140294896A1 (en) | 2014-10-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101806370B1 (ko) | 보다 높은 탄수화물 항원 밀도 및 신규한 사포닌 애쥬번트를 갖는 백신 | |
KR101863534B1 (ko) | 유방암 재발 예방용 백신 | |
RU2720295C2 (ru) | Композиции иммуногенных/терапевтических гликоконъюгатов и их применения | |
US10597731B2 (en) | Allogeneic autophagosome-enriched composition for the treatment of disease | |
Calderon-Gonzalez et al. | Gold glyconanoparticles coupled to listeriolysin O 91–99 peptide serve as adjuvant therapy against melanoma | |
KR101810840B1 (ko) | 암의 예방 및 치료용 msi-특이적 프레임쉬프트 펩티드(fsp) | |
RU2607379C2 (ru) | Раковый антиген | |
JP2007507521A (ja) | NY−ESO−1とアジュバントのinvivo有効性 | |
CN104136040B (zh) | 自体癌细胞疫苗 | |
JP4803460B2 (ja) | Hla−a24分子結合性扁平上皮癌抗原由来ペプチド | |
US11096995B2 (en) | Therapeutic cancer vaccine based on stress proteins rendered immunogenic | |
JP6421208B2 (ja) | がん抗原 | |
US20090246230A1 (en) | Compositions and methods for inducing tumor resistance | |
WO2019138210A1 (en) | Immunogenic agent and associated compositions, uses and methods | |
KR100980246B1 (ko) | T/Tn과 산화 만난의 접합체 및 이를 포함하는 암 백신조성물 | |
CN113412275A (zh) | 用于癌症免疫疗法的基于迷路蛋白的肽及其用途 | |
KR20230153047A (ko) | 톡소포자충의 항원 rop4를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 백신 | |
BRPI1005909B1 (pt) | Cepa transgênica atenuada de trypanosoma cruzi como vetor vacinal | |
WO2014184797A2 (en) | Hemoglobin receptor as novel vaccine for leishmaniasis |