EA013466B1 - Опухолеассоциированные пептиды, связывающиеся с молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (hla) i или ii класса, и относящаяся к ним противораковая вакцина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул HLA класса II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в частности рака почек. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул НЬЛ класса I и II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Уровень техники

Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. (Сйссусг е! а1., Аппа1з Ν.Υ. 8с1. Асай. 8с1. 1993 690:101-112). В частности, 0О8-положительные Т-клетки (Т0О8-положительные), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованных из белков, находящихся в ядре или цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться только на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК), и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и МНС класса I распознаются СЭ8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, комплексы из пептида и МНС класса II распознаются 0О4-положительными хелперными Т-клетками.

СЭ4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация 004-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауазИ, Н., В. От1уа, Μ. Ριιίζ. Е. Ниайе, Р. 8агоЬе, I. I. Ьазайе, М. Нсгки/. В. 8апдго, I. РпсЮ. Е. Воггаз-Оиез1а, апй Е. Оекз. 2002. ЮепППса(1оп о£ ап апЦдешс ерйоре £ог Не1рег Т 1утрНосу1ез £гот сагсшоетЬгуошс апОдеп. О1т. Сапсег Вее. 8:3219-3225., 6п)аИс, 8., Ώ. А1апаскоую, Е. 1адег, М. Ма1зио, А. 8е1уакитаг, Ν.Κ. АИогкц В.О. Мак1, В. Оироп!, О. В1йег, Υ.Τ. Океп, А. Кпи1й, апй Ь.1. О1й. 2003. 8шуеу о£ паШга11у осситпд 0Ό4+ Т-се11 гезропзез адатз! ΝΥ-Ε8Ο-1 ш сапсег раПегИз: О’оггекШоп \νίΐ1ι апОЬойу гезропзез. Ргос. №11. Асай. 8ск И.8.А. 100(15):8862-7).

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (т.е. 008-положительных Т-лимфоцитов), ОО4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ΣΕΝγ) (Οίπ, Ζ. апй Т. В1апкепз1ет. 2000. 004+ Т-се11-тей1а1ей 1итог ге)есОоп шуокез шЫЫОоп о£ апдюдепез1з 1ка1 1з йерепйеШ оп ΒΝ датта гесерЮг ехргеззюп Ьу поп11ета1оро1е0с се11з. [ттипйу. 12:677-686). К тому же было показано, что ОО4положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппейу, В.О., М.Н. 8кеагег, А.М. ХУаИз, апй В.К. Впдк!. 2003. 0О4⁺ Т 1утркосу!ез р1ау а сгй1са1 го1е т апйЬойу ргойисйоп апй 1итог пппшпЦу адатз! зпшап уииз 40 1агде 1итог апйдеп. Сапсег Вез. 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса II Сет^ет.саисег1ттии11у.огд, те^ет.зукрейИ.йе). Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Маск, В., V. 81е1т1е, Е. Μай^иеζ-8о^^а, апй Вейк. 1996. Веди1аί^ои о£ МНО с1азз II депез: 1еззопз 1гот а й1зеазе. Аппи. Веу. Iттиио1. 14:301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Поэтому было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессированию II класса антигенпрезентирующих клеток (АПК), например, инкубация АПК с интересующим

- 1 013466 антигеном для его поглощения, процессинга и презентации (Скаих, Р., V. УаШоштс. V. 81гооЬап!, К. ТЫе1етаи8, 1. Соййа1к, К. Ьш1еи. А.М. Еддегтоп!, Т. Вооп, апб В.Р. сап бег Вгцддеп. 1999. 1беп1гйсаИоп о! МАСЕ-3 ерйорек ргекеп!еб Ьу НЬА-ЭК то1еси1ек 1о СЭ4(+) Т 1утркосу!ек. 1. Ехр. Меб. 189:767-778) или трансфекция клеток генами или мини-генами, кодирующими интересующий антиген и слитых с инвариантной цепью. которая опосредует транслокацию антигена в лизосомный компартмент МНС класса II (М11С) по процессингу и погрузке.

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 остатков в длину и содержат два консервативных остатка («домены») в их первичной аминокислотной последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС.

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам.

Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, полученными из любого класса белков, таких как энзимы, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, например, могут быть представлены также только в опухолевых клетках, например, как продукты распада мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими структурами, такими как антигены СТ («раковый тестикул»), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани тестикул.

Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как Ьсг/аЬ1 в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Ыпекап \У.М., ХУаккег М.М., 2Ьаг В. Тке депейс Ьак1к о! сапсег о! 1йе ктбпеу. 1 Иго1. 2003 Эес;170(6 Р1 1):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), гак, с-те1, тус, рКВ, УНЬ и НЕК2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной регуляции экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСайеу е! а1. Сапсег Кекеагск 1998 15:58 2601-5; Эык е! а1. С1Ьа Боипб. 8утр. 1994 187:198-211).

Муцин-1 (МИС1) является высоко гликолизированным трансмембранным гликопротеином I типа, который с избытком гиперэкспрессирован на клеточной поверхности многих аденокарцином человека, таких как рак груди и яичников. Аберрантная дегликолизация свойственна злокачественным опухолям и обнаруживает эпитопы в опухолевых клетках, которые не должны быть представлены на нормальных клетках. Более того, экспрессия МИС1 была продемонстрирована во множественной миеломе и некоторых В-клеточных лимфомах не-Ходжкина (Сепб1ег 8, Тау1ог-Рараб1тйпои 1, ИиНд Т, Ко!кЬагб 1, апб Вигске11 1. А Ыдк1у тттподетс гедюп о! а Нитап ро1утогрЫс ерййейа1 тисш ехргеккеб Ьу сагстотак 1к табе ир о! !апбет гереа!к. 1. Вю1. СНет. 263:12820-12823 (1988); 8|ббк|ш 1988; Сй1тд А, ВаПкоуа 1, Вигскей 1, Сепб1ег 8, СШей С, апб Тау1ог-Рараб1тйгюи 1. А соге рго!еш ерйоре о! !ке ро1утогрЫс ерйкейа1 тисш бе!ес!еб Ьу !ке топос1опа1 апйЬобу 8М-3 ίκ ке1есйуе1у ехрокеб т а гапде о! рптагу сагстотак. Ш!. 1. Сапсег 43:1072-1076 (1989); Вгоккай 1999; Ииреггау 1989; Магк 1989; Ие1ко1 1988; Арок!о1орои1ок V апб МсКеп/1е Ш. Се11и1аг тистк: 1агде!к !ог кппшпо1кегару. Сгй Кеу. ^типок 14:293-309 (1994); Бит Θ1, 1еготе КК, Непбегкоп КА, Рескег С, ЭотепесН Ν, Мадапап-В1апбег 1, апб Ваггай-Воуек 8М. МИС-1 ерйкейа1 !итог тист-Ьакеб тттпЦу апб сапсег уасстек. Ттшипок Кеу. 145:61-89 (1995)). Некоторые последние сообщения (Арок!о1орои1ок V апб МсКеп/1е Ш. Се11и1аг тистк: !агде!к !ог ттшпо1кегару. Сгй Кеу. Тттипок 14:293-309 (1994); Бтп Θ1, 1еготе КК, Непбегкоп КА, Рескег С, Эотепеск Ν, МадапапВ1апбег 1, апб Ваггай-Воуек 8М. МИС-1 ерйкейа1 !итог тист-Ьакеб 1ттипйу апб сапсег уасстек. ^шипок Кеу. 145:61-89 (1995); Ватб 1989; Такакакк 1994; №1о 1997) показали, что цитотоксические нерестриктированные по МНС Т-клетки из опухолей яичника, груди, поджелудочной железы и множественной миеломы могут распознавать эпитопы центральной части белка МИС1, находящейся в тандемном повторе. Были идентифицированы два рестриктированных по НЙА-А2 Т-клеточных эпитопа, образованных из белка МИС1 (Вгоккай 1999, ЕР 1484397). Один пептид образован из участка тандемного повтора белка МИС1. Второй пептид локализован внутри сигнальной последовательности МИС1. Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов ш у1уо после вакцинаций пациентов с распространенным раком груди

- 2 013466 или яичника дендритными клетками с введенным импульсным методом пептидом, используя такие пептиды, была успешной (Вгоккай 2000) (ХУюгсску 2005). С учетом почечно-клеточной карциномы экспрессия МиС1 свойственна стандартным опухолям, и сообщалось, что она ассоциирована со степенью и стадией опухоли (Рцр1а 1999; Кгаик 2002; Ьегоу 2002; Ват1ак 2003; Сао 2000). Для МиС1 белковая гиперэкспрессия не соотносится с гиперэкспрессией мРНК.

Адипофилин является маркером для специализированных дифференцированных клеток, содержащих липидные капельки, и для заболеваний, ассоциированных с жироаккумулирующими клетками (Не1б 1998). Адипофилин содержится во многих культивируемых клеточных линиях, включающих фибробласты и эндотелиальные и эпителиальные клетки. Тем не менее, экспрессия адипофилина в тканях рестриктирована по определенным видам клеток, таким как вырабатывающие молоко эпителиальные клетки молочной железы, клетки коркового вещества надпочечника, клетки Сертоли и Лейдига мужской половой системы, а также по стеатозу или жировому перерождению гепатоцитов при алкогольном циррозе печени (НеИ 1998). Сообщалось, что адипофилин гиперэкспрессирован при колоректальном раке (8ака 2001), гепатоклеточной карциноме (Кцгока^а 2004) и при почечно-клеточной карциноме (Уонпд 2001).

с-Ме! кодирует гетеродимерный трансмембранный рецептор с тирозино-киназной активностью, который состоит из α-цепи, связанной дисульфидной связью с β-субъединицей (Войаго 1991; КиЫп 1993). Обе субъединицы экспрессированы на поверхности, тяжелая β-субъединица отвечает за связывание лигандов, фактор роста гепатоцитов (НОР), α-субъединица содержит внутриклеточный домен, который опосредует активацию различных сигнальных путей трансдукции. Сигнальный каскад с-Ме! задействован в регенерации органов, как было продемонстрировано для печени и почек, эмбриогенеза, кроветворения, развития мышц и при регуляции миграции и адгезии нормально активированных В-клеток и моноцитов (2атедаг 1995; №11ййн 1991; Моп!екапо 1998; 8с1ишй! 1995; Иекага 1995; В1ай! 1995; Такауата 1996; Μίζπηο 1993; уап, V 1997; ВеПтапп 2000). В дальнейшем многочисленные исследования показали, что гиперэкспрессия с-Ме! задействована в злокачественной трансформации и инвазивности злокачественных клеток.

с-Ме! опосредует мультифункциональные и потенциально онкогенные активности фактора роста гепатоцитов НОР/ксайег, включая содействие клеточному росту, подвижности, выживаемости, растворению внеклеточных матриц и ангиогенезу (Войаго 1991; Рикш 1993; 2атедаг 1995). Связывание НОР с рецептором вызывает автофосфорилирование с-Ме! и активирует сигнальные процессы по ходу транскрипции, включая гак, фосфатидилиноситол 3'-киназу, фосфолипазу Су и активированные митогеном белковые каскады реакций, связанные с киназой (№11ййп 1991; Моп!екапо 1998; Ригде 2000; Ро^ейо 1993; Эопд 2001; Ригде 2001). Ген с-Ме! экспрессирован преимущественно в эпителиальных клетках и гиперэкспрессирован в нескольких злокачественных тканях и клеточных линиях (Όί Регыо 1995; Реггааш 1995; Тиск 1996; Кооскекроиг 1997; Ь1 2001; Р1кскег 1998; Маикк 2002; О1ап 2002; ΡηιηίΐΌζ 2000). Возрастающее число сообщений показало, что неэпителиальные клетки, такие как кроветворные, нейтральные клетки и клетки скелета реагируют на НОР, а злокачественные заболевания кроветворной системы, как, например, множественная миелома, болезнь Ходжкина, лейкемия и лимфома экспрессируют белок с-Ме! (Окегагб1 1991; ТеоГШ 2001; Вогке! 1999; 1искег 1994; Ропк 1998). Ослабленный контроль инвазивного фенотипа роста в онкогенно активированном с-Ме!, спровоцированном с-Ме!-активационными мутациями, с-Ме! амплификацией/гиперэкспрессией и приобретением НОР/с-Ме! аутокринных петель, снабжает злокачественные клетки инвазивными и метастатическими свойства. Примечательно, что конститутивная активация с-Ме! у трансгенных мышей с НОР-гиперэкспрессией способствует обширному онкогенезу (^апд 2001; Такауата 1997).

Регулятор сигналов О-белка 5 (К.О85) является негативным регулятором сигнальных путей гетеротримерного О-белка, хотя его функция ш у1уо остается неясной. РО8-белки представляют собой семейство молекул с объединяющей каталитической функцией, но с различным тканевым распределением. Они стимулируют истинную активность гуанозин-трифосфатазы (ОТРаке) активированных субъединиц Оо! и, таким образом, ускоряет инактивацию О-белка. Таким образом, молекулы РО8 ингибируют сигналы по ходу транскрипции связанных с О-белком рецепторов (Эе 2000). Недавно было показано, что регулятор индукции сигнала-5 О-белка в перицитах совпадает с активным ремоделированием сосудов во время опухолевой неоваскуляризации. В модели панкреатического канцерогенеза островковых клеток мыши, а также в высоко ангиогенных астроцитомах наблюдалась гиперэкспрессия К.О85 в перицитах во время ангиогенного переключения, сопровождающего активное ремоделирование сосудов. Гиперэкспрессия рестриктировалась по сосудистой сети опухоли в сравнении с нормальными островками Лангерганса. Тем не менее, КО85 также активирован во время заживления ран и овуляции (Вегдег 2005).

Экспрессия К.О85 увеличена в ЯСС (Рае 2000). В другом исследовании ПЦР с обратной транскрипцией показала сильную экспрессию К.О85 во всех исследованных ЯСС, и экспрессия была очень слаба или не выявляема в нормальных почках (6.6:1 с ПЦР в реальном времени). Основным местоположением КО85 в ЯСС были эндотелиальные клетки опухоли (Ригиуа 2004). В дальнейшем сообщалось, что К.О85 является эндотелиальным клеточным маркером синусоидного типа гепатоклеточной карциномы (Скеп 2004).

- 3 013466

Аполипопротеин Ь1 (АРОЬ1) является секретируемым высокоплотным липопротеином, связывающимся с аполипопротеином А-Ι. Аполипопротеин А-Ι является относительно широко распространенным плазменным белком и основным апопротеином НОТ (липопротеины высокой плотности). Он задействован в формировании большинства холестериловых эфиров в плазме и также способствует оттоку холестерина из клеток. Аполипопротеин Ь1 может играть роль в липидном обмене и переносе по организму, а также в обратном переносе холестерина из периферических клеток в печень. Плазменный белок является полипептидом одинарной цепи с относительной молекулярной массой ок. 40 кДа (ПисйаЮан 1997; ЭисйаЮаи 2001). АРОЬ1 цДНК была изолирована из активированных эндотелиальных клеток библиотеки цДНК, и было показано, что она активируется ΤΝΓ-α, который является сильным провоспалительным цитокином. (Моиа)ет1 2002).

К1АА0367 был идентифицирован в рамках проекта «Кахи^а цДНК», цель которого - обнаружение неизвестных длинных человеческих транскриптов, кодирующих для предполагаемых белков (Ойага 1997). Хотя функция продукта предполагаемого белка К1АА0367 из 820 аминокислот неизвестна, он содержит СКАЕ-ТК1О связывающий липиды доменный профиль на С-конце, который связывает малые гидрофобные молекулы и присутствует в нескольких факторах обмена нуклеотидов и в ВСЬ2/аденовирусе Е1В 19-кДа взаимодействующем белке 2 (ΒΝΙΡ-2). ΒΝΙΡ-2 задействован в контроле различных клеточных функций, включая клеточную морфологию, миграцию, эндоцитоз и прогрессию клеточного цикла (Ζΐιοιι 2005). К1АА0367 расположен на хромосомном участке 9с.|21. Этот участок описывается как распространенная мишень гомозиготной делеции во многих опухолях (Ошъку 2001; \УеЬег 2001) или как лишенный гетерозиготности (Еои11с1атсп 2000; ΤτίραίΠί 2003).

Растворимая гуанилат циклаза (§ОС), гетеродимерный белок, состоящий из альфа- и бета-субъединиц (1 гемовая группа), катализирует конверсию ОТР во вторичный мессенджер сОМР и функционирует как главный рецептор для оксида азота и азотосодержащих сосудорасширяющих средств (УаЬе1 1998). ОИСУа3 и Ь3 гиперэкспрессированы в глиомах человека. Трансфекция антисмысловой ОИСУ1А3 или ОИСУ1В3 снижает васкуляризацию и рост опухоли «голой» мыши. Это может быть связано с тем фактом, что УЕОГ индуцируется сОМР (8ашо 2004). ОиСУ1А3 способствует миграции опухолевых клеток опухолевой клеточной линии молочной железы мыши Пайсой 2003).

Циклин Ό1 относится к высоко консервативному семейству циклинов, более точно, к подсемейству циклинов Ό (Хюид 1991; Бете 1991). Циклины выполняют функцию регуляторов СЭК (циклинзависимые киназы). Различным циклинам свойственна разная экспрессия и способы деградации, которые содействуют временной координации каждого этапа митоза (Ле+рапйе 2005). Циклин Ό1 формирует комплекс с - и функционирует как - регуляторная субъединица С.ПК4 или С.ПК6. активность которых требуется для клеточного цикла перехода О1/З. ΓΤ'ΝΟ1 формирует с СЭК4 и С.ПК6 голоэнзимный комплекс серин/треонин-киназа, обеспечивающий субстратную специфичность комплекса (Ва1е8 1994). Было показано, что этот белок взаимодействует с белком-супрессором опухоли КБ (Ьойеп 2002), и экспрессия этого гена положительно регулируется КЬ (На1аЬап 1999). Мутации, амплификация и гиперэкспрессия этого гена, который изменяет прогрессию клеточного цикла, часто наблюдались в различных опухолях и могут благоприятствовать онкогенезу (НейЬегд 1999; Уа^еГ 1999; Тгоиккагй 2000).

Белки семейства матричной металлопротеиназы (ММР) задействованы в разрушении внеклеточной матрицы при нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, размножение и ремоделирование тканей в равной степени, как и во время заболеваний, таких как артрит или метастазы (Мой 2004). Матричная металлопротеиназа 7 (ММР7) секретируется как неактивный белок-предшественник с массой 29,6 кДа, который активируется при расщеплении внеклеточными протеиназами. Активный энзим имеет молекулярную массу 19,1 кДа и связывает по два иона цинка и два иона кальция на субъединицу (М|уахак| 1990; Вго^иег 1995). ММР7 расщепляет желатин, фибронектин и казеин (М|уа/а1й 1990; ОнаШш 1989) и отличается от большинства членов семейства ММР отсутствием «консервативного» С-терминального белкового домена (Оайе 1994). ММР7 часто гиперэкспрессирован в злокачественной ткани (Ъ1п 2004; Вгаш11а11 1997; Эеиук 2004), и предполагается, что он способствует инвазии опухолевых клеток ίη νίνο (^аид 2005).

Эти белки могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Пептид корового антигена вируса гепатита В, НВУ-001, получен не из эндогенного опухолеассоциированного антигена человека, а из корового антигена вируса гепатита В. Во-первых, это позволяет количественное сравнение интенсивности Т-клеточных ответов, индуцированных ТИМАР, и следовательно, позволяет сделать важные выводы о способности вызывать противоопухолевые ответы. Вовторых, он функционирует как важный положительный контроль в случае недостатка каких-либо Тклеточных ответов у пациента. И в-третьих, он также позволяет сделать заключение о статусе иммунокомпетентности пациента.

Инфицирование вирусом гепатита В (НВУ) является одной из самых распространенных причин заболевания печени, поражающим примерно 350 млн. человек по всему миру (Кейегтапп 2005). В связи с простотой горизонтального и вертикального переноса и наличием потенциала для хронического заболевания это может привести к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, поэтому НВУ наносит сильный удар по системам здравоохранения многих стран мира. Геном НВУ (Рг^заш 2002) включает час

- 4 013466 тично двухцепочечную кольцевую ДНК. В вирионах НВУ она окружена коровым белком НВс и другими белками, формируя нуклеокапсид, который защищен внешней оболочкой, содержащей липиды и поверхностные белки семейства НВк (называемые также оболочечными белками). Антигенные детерминанты, ассоциированные с НВс и НВк, обозначаются как НВсАд и НВкАд соответственно. Эти антигены ассоциированы с серологической реакцией, т. е. ответами антител, обнаруженными в крови пациента, и находятся среди клинически наиболее применимых систем антиген-антитело для диагноза инфекции НВУ. НВс будет представлять новый чужеродный антиген у всех индивидов без предшествующей истории инфекции НВУ. Так как для этого антигена хорошо известны иммуногенные пептиды (Всг1о1сШ 1993; Ь1уш§81оп 1997), то в рамках исследований 1МА из НВсАд в качестве антигена для положительного контроля был выбран один пептид из 10 аминокислот. Индукция пептид-специфических ЦТЛ НВс будет затем использоваться как маркер для иммунокомпетентности пациента и успешной вакцинации.

Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в особенности, т. н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как «киллерные клетки», известные также как С'П8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы НЬА презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются затем к молекулам НЬА и презентируются на клеточной поверхности (Ваттепкее 1993). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, а не на здоровых клетках организма или в намного меньшей степени, называются опухолеассоциированными пептидами (ТИМАРк).

Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 гг. Буном (Вооп) и коллегами, в основном, для показания меланома. Клинические ответы лучших испытаний достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах монотерапии вакциной. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами.

Тем не менее, примирования одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ, действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по меньшей мере 3 различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Вапскегеаи 2001), а также увеличение выживаемости (личные беседы с 1. Вапскегеаи), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее 3 Тклеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания.

До сих пор было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскады реакций по процессингу II или I класса. Есть возможность инкубировать антигенпрезентирующие клетки (АПК) с интересующим антигеном для его поглощения и процессинга (Скаих, Р., УаШотте. У., 81гооЬап1, У., ТЫе1етапк, К., Сойка1к, 1., Ьийеп, В., Еддегтоп!, А. М., Вооп, Т. & уап бег, В. Р. (1999) 1. Ехр. Меб. 189, 767-778. Эепд)е1 1, 8скоог О, Б1кскег В, Веюк М, Кгаик М, Ми11ег М, КгеутЬогд К, АИепЬегепб Б, ВгапбепЬшд 1, Ка1Ьаскег Н, Вгоск В, Эпеккеп С, Ваттепкее НО, 81еуапоу1с 8. Аи!орка§у ргото1ек МНС с1акк II ргекеШабоп о£ рерббек 1гот т1гасе11и1аг коигсе рго1етк. Ргос Иа11 Асаб 8а И8А. 2005 Мау 31; 102 (22):7922-7). Другие стратегии используют белки слияния, которые содержат лизосомные последовательности-мишени. Экспрессированные в АПК, такие белки слияния направляют антигены в компартмент процессирования II класса (Магкк, М. 8., Воске, Р. А., уап Попке1ааг, Е., АообгиЛ, Ь., Ре1егк, Р. 1. & ВопИасшо, 1. 8. (1995) 1. Се11 Вю1. 131, 351-369, Робидие/, Б., Нагкшк, 8., Вебтете, 1. М., бе Регеба, 1. М. & АЫбоп, 1. Ь. (2001) 1. У1го1. 75, 10421-10430).

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического антигена и для того чтобы они были использованы в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в достаточно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в одном виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (например, число копий на клетку). Необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид («иммуногенный пептид»), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести 1п уйго или 1п у1уо к Т-клеточному ответу.

Приблизительно 30% пациентов страдают от метастатической болезни при показе врачу, и другие 25% пациентов имеют локально распространенную опухоль. У 40% индивидов метастазы развиваются, в конечном итоге, после хирургического вмешательства. Среди индивидов с метастатической болезнью

- 5 013466 приблизительно у 75% обнаруживаются легочные метастазы, у 36% поражены лимфатические узлы и/или мягкие ткани, у 20% - кости, и у 18% - печень. Показатели 5-летней выживаемости различны в зависимости от класса по системе Робсона. В целом, ИСС является причиной смерти около 80% пациентов (8епп Ш, ϋΓΐηβδ Р, С1аи8 А, 1ипщ ^Р, Рга11е НВ, 8аиег В, апб 8сй1ад РМ. СйесНШе Опко1о§1с. 51й ебйюп Ссогд ТЫете Уег1ад, 81иЦдаг1/№\\· Уогк (2001), Уокез ЕЕ, апб Со1отЬ НМ. Опсо1ощс Тйегар1е8, 2пб еб1Ооп. 8ргтдег-Уег1ад, Вег11п/Не1бе1Ьегд (2003)).

Классификация почечно-клеточной карциномы (ВСС) была произведена в соответствии с классификацией по ΤΝΜ (Сшпап Р. ΤΝΜ 81адшд о! Вепа1 Се11 сагстота. Ргезейеб а! 'О|адпо515 апб ргодпозЦ о! Вепа1 Се11 Сагстота: 1997 ХУобШюр', Восйе81ег, МшпезоШ, Магсй 21-22, СоттишсаИоп о! 1йе И1СС Ишоп 1п1ета1юпа1е Соп1ге 1е Сапсег, апб А1СС - Атепсап 1от1 СоттШее оп Сапсег, рцЬШйеб Ьу А8С Атепсап 8ос1е1у Сапсег (1997), Соттишсабоп о! 1йе И1СС), см. табл. А и В, внизу.

Таблица А. Классификация по ΤNΜ почечно-клеточной карциномы

Т1	<= 7,0 см, ограничена почкой	N1	отдельный лимфоузел	региональный
Т2	<= 7,0 см, ограничена почкой	N2	более	одного
			регионального лимфоузла
ТЗ	в большинство вен, надпочечная и	МО	отсутствие	отдалённых
	околопочечная инвазия		метастазов
Т4	поражает вне фасции Герота	М1	отдалённые метастазы

Классификация Классификация по ΤΝΜ

АГСС

Стадия I	Т1	N0	МО
Стадия II	Т2	N0	МО
Стадия III	Т1	N1	МО
	Т2	N1	МО
	ТЗ	ΝΟ,ΝΙ	МО
Стадия IV	Т4	ΝΟ,ΝΙ	МО
	любое Т	N2	МО
	любое Т	любое N	М1

Таблица В. Классификация Робсона для почечно-клеточной карциномы и 5-летняя выживаемость Класс по системе ^— ”

Показатели 5Робсона летней

Стадия I / II

Стадия III

Стадия IV (Т4)

Стадия IV (М1) выживаемости*

75% - 86%

41% - 64%

15% - 18%

0% - 3% * Американский фонд урологических заболеваний (Атепсап Роипбабоп !ог иго1ощс Океане).

Стандартный метод лечения ИСС - радикальная нефректомия (для всех стадий). Лучевая терапия может быть применена для сокращения распространения рака, однако почечно-клеточные карциномы зачастую резистентны к облучению. Гормональная терапия может в некоторых случаях (менее 10%) замедлить рост опухоли. До настоящего времени химиотерапия не проявила никакой значительной действенности при этой болезни. Винбластин, 5-РИ (5-фторурацил) и флоксоуридин (ΡϋΌΚ.) являются наиболее изученными препаратами для химиотерапии, однако лишь 5-РИ и его метаболит РиЭР проявили 1012%-ую действенность (Уокез ЕЕ, апб Со1отЬ НМ. Опсо1ощс Тйегар1е8, 2пб ебШоп. 8рппдег-Уег1ад, Вег11п/Не1бе1Ьегд (2003)). При комбинации гемцитабина и 5-Ри показатель результативности составил 17%,

Иммунологическое лечение, например, с применением Интерферона альфа (ΙΡΝα) или Интерлейкина-2 (1Ь-2) для лечения распространенной ИСС в последние годы были оценены регулирующими органами США и Европы. Лечение высокодозированным 1Ь-2 на сегодняшний день является единственным иммунологическим режимом, одобренным Управлением по санитарному надзору за пищевыми продуктами и медикаментами США (РИА). Первоначально сообщалось, что монотерапия ΙΡΝα имеет пока- 6 013466 затель эффективности в 25-30%, но действительная эффективность при многих дополнительных исследованиях составила лишь около 10% (Уокек ЕЕ, апб Со1отЬ НМ. Оисо1од1с Тйегар1е8. 2иб ебйюп. 8ргшдег-Уег1ад. Вег11и/Не1бе1Ьегд (2003)). 1Ь-2 имеет. предположительно. похожую общую эффективность в сравнении с ΙΕΝα. когда приблизительно 5% пациентов достигают стабильной полной ремиссии (КозепЬегд 1987). Заключение последнего мета-анализа более 6000 пациентов с распространенной К.СС таково. что цитокиновой терапией (например. ΙΕΝ-альфа. высокодозированные болюсные инъекции 1Ь-2 или ингаляции 1Ь-2) могут быть. в среднем. достигнуты только 12.9% клинической эффективности. Тот же анализ показал наличие 4.3% ответов на плацебо и 2.5% ответов в контрольных группах без проведения иммунотерапии (Сосйгаие Эа1аЬа5е 8уз1 Вес. 2000; (3):СЭ001425. 1ттиио1йегару £ог абуапсеб гепа1 се11 сапсег. Соррт С. РогхкоН Е. Л\га А. Китр£ 1. Со1бтап А. \УШ Т).

Хотя в последние годы новые терапии проявляли клиническую эффективность по отношению ко многим видам опухолей и были одобрены. показатель выживаемости при почечно-клеточной карциноме за последнее десятилетие не сильно изменился. Имеющиеся на данный момент возможности для систематического лечения. как химиотерапия. так и иммунологическое лечение. проявили относительно слабую эффективность и. что особенно важно. при этом существует ограничение из-за значительной общей токсичности. Следовательно. существует значительная неудовлетворенная потребность медицины в новых методах лечения почечно-клеточной карциномы.

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток. инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1. поддерживают эффекторные функции СО8-положительных киллерных Т-клеток. которые включают цитотоксические функции. направленные против опухолевых клеток. проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом. опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток. одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами. могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций. которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является. поэтому. выявление и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов. которые могут быть распознаны СО8-положительными Т-клетками или СО4-положительными Т-клетками. в особенности СО4-положительными Т-клетками типа Т_Н1. По этой причине целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для таких пептидов. которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (НЬА класса I) или II (НЬА с1азз II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины. которая. по крайней мере. частично основана на новых пептидах.

В соответствии с настоящим изобретением первая задача была решена обеспечением опухолеассоциированного пептида. выбранного из группы пептидов. включающих по крайней мере одну последовательность в соответствии с любой из 8ЕЦ Ш № 1 или 8ЕЦ Ш № 2 из приложенного списка последовательностей. причем один пептид обладает способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II (НЬА класса II). а другой способен связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (НЬА класса I) при условии. что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом.

В настоящем изобретении изобретатели демонстрируют то. что возможно изолировать и охарактеризовать пептиды. связывающиеся с молекулами НЬА класса I или II. напрямую из опухолей млекопитающих. с приоритетом для опухолей человека. предпочтительно почечно-клеточных карцином.

Настоящее изобретение обеспечивает пептиды. которые образованы из антигенов. ассоциированных с генезом опухоли. и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами НЬА II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов. в особенности лимфоцитов. в особенности Т-лимфоцитов. в особенности СО4-положительных Т-лимфоцитов. в особенности СЭ4положительных Т-лимфоцитов. опосредующих иммунные ответы типа Т_Н1.

Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды. которые образованы из антигенов. ассоциированных с генезом опухоли. и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами НЬА I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов. в особенности лимфоцитов. в особенности Т-лимфоцитов. в особенности СЭ8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов.

Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов. в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями. например. в протеолизе. ангиогенезе. росте клеток. регуляции клеточного цикла. делении клеток. регуляции транскрипции. регуляции трансляции. инвазии ткани. включая. например. опухолеассоциированные пептиды из матричной металлопротеиназы 7 (ММР7; 8ЕЦ Ш № 1) и Аполипопротеина Ь1 (ЮЕВР3; 8ЕЦ Ю № 4).

В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают неопровержимую очевидность того. что опухолеассоциированные пептиды. в достаточной мере связывающиеся беспорядочно с молекулами НЬА II класса. в особенности с такими аллелями НЬА II класса. которые генетически закодированы локусом НЬА ΌΚ. человеческого генома. способны вызывать иммунные ответы. опосредованные СП4

- 7 013466 положительными Т-клетками человека. СО4-положительные Т-клетки были изолированы из периферической крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток. Как поясняется далее на примере с пептидом из ММР7 (8ЕО ГО № 1), этот, беспорядочно связывающийся с НЬА-ОЕ, опухолеассоциированный пептид, как было обнаружено, распознается СЭ4положительными Т-клетками.

В одинаковой степени было обнаружено, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами НЬА I класса, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные СЭ8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами человека, демонстрируя также, что заявленные пептиды пригодны для инициации ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток.

Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для иммунотерапии рака.

В целях идентификации лигандов НЬА I или II класса из опухолеассоциированных антигенов (ТАА) для разработки основанной на пептидах иммунотерапии изобретатели попытались изолировать пептиды напрямую из вырезанных солидных опухолей, в особенности почечно-клеточной карциномы (ЕСС) (см. ниже, примеры).

Причинами для фокусировки внимания на ЕСС для демонстрации доказательства правильности концепции были следующие: диагноз ЕСС ставится вновь ежегодно примерно 150 тысячам человек в мире, с данным заболеванием связан высокий уровень смертности, результатом чего являются приблизительно 78 тысяч смертей в год (ΡανΙονίοΗ, С. Р. апб Ь.8. 8сйт1б1. 2004. 8еагсЫпд Гог 1йе йегебйагу саизез оГ гепа1-се11 сагстота. Ναι. Ееν. Сапсег 4:381-393). Если выявлены метастазы, то одногодичный коэффициент выживаемости сокращается примерно до 60% (1ета1, А., Е. С. Τί\ν;·ιπ. Т. Миггау, А. СйаГоог. А. 8атие1з, Е. ^агб, Е. 1. Ееиег, апб М.1. Тйип. 2004. Сапсег з1а1131юз, 2004. СА Сапсег 1. Сйп. 54:8-29), подчеркивая сильную беспомощность медицины при этом показании. В связи с тем фактом, что ЕСС является, вероятно, иммуногенной опухолью (Ойтег ΕΤΌ, Мей1а А., ВагпеИ М. 1. А рйазе 2 з!ибу оГ зигтей1апсе 1п райеп!з νίΐΠ те1аз1айс гепа1 се11 сагстота апб аззеззтеп! оГ гезропзе оГ зисй райеп!з !о Шегару оп ргодгеззюп. Мо1 Вю1йег. 1988;1:14-20. С1еате М., Е1Ы1ай М., Егобе! Υ., е! а1. [ЩегГегоп датта-1Ь сотрагеб νί(Η р1асеЬо ш те1а81айс гепа1 се11 сагстота. N Епд1 1 Меб. 1998; 338:1265), как было указано существованием опухолевых реагирующих и инфильтрирующих ЦТЛ (Е1пке, 1.Н., Р. Еаутап, 1. А1ехапбег, М. Ебтдег, Е.Е. ТиЬЬз, Е. Соппе11у, Е. Роп1ез, апб Е. Вико\\ъкг 1990. Сйагас1епхаОоп оГ 1йе су1о1уйс асПт11у оГ С.П4+ апб С.П8+ Штог-тПЙгаОпд 1утрйосу1ез т йитап гепа1 се11 сагстота. Сапсег Еез. 50:2363-2370), были инициированы клинические исследования для разработки основанных на пептидах противоопухолевых вакцинаций (\У|егеску 1., Мие11ег М., Вгоззай Р. ОепбгШс се11-Ьазеб сапсег йптипо1йегару (агдейпд МПС-1. Сапсег Iттипο1 йптипо1йег. 2005 Арг 28). Однако в связи с недостатком хелперных Тклеточных эпитопов из ТАА молекулярные вакцины обычно включают пептиды, функционирующие только как лиганды I класса.

Вторая задача настоящего изобретения была решена обеспечением фармацевтического препарата, предпочтительно в форме вакцины, эффективной против раковых клеток, в особенности клеток солидных опухолей, включающей эффективное количество пептида в соответствии с изобретением, или включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид. Вакцина в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.

Пептид или кодирующая пептид нуклеиновая кислота могут также формировать вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех т1то в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш т11го для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.

Первым аспектом изобретения обеспечивается пептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО № 1 (8^^^IΚСI^Κ^ΥСΚΕ8) или 8ЕО ГО № 2 (УМАСЭ^8У) или их вариант, при условии, что пептид не является интактным полипептидом человека, из которого получена аминокислотная последовательность (т. е. одна из последовательностей во всю длину как представленные в списке ГО локусов (инвентарные номера указаны в приложенной далее табл. 1).

Как здесь описывается в дальнейшем, все пептиды, формирующие основу настоящего изобретения, были выявлены как презентируемые несущими клетками МНС I или II класса (ЕСС). Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т. е. дериваты пептидов) будут все вызывать специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в указанных пептидах (см. ниже). Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться с целью определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь

- 8 013466 примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительно, чтобы пептид в соответствии с настоящим изобретением состоял преимущественно из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕС Ш № 1 или 8ЕС Ш № 2 или одним из их вариантов.

«Состоял преимущественно из» подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8ЕС Ш № 1 по 8ЕС Ш № 11 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на Ν- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как коровая последовательность пептида, включая соединяющий элемент, и как иммуногенный Т-хелперный эпитоп.

Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в клетки в соответствии с настоящим изобретением. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению включает 80 Ν-терминальных аминокислот НЬЛ-ΌΚ антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем «11»), как взятая из ΝΟΒΙ, инвентарный номер - СеиБаик Лссек5Юп-питЬсг Х00497 (81гиЫп. М., Маск, В. апб Ьопд, Е.О. Тке сошр1е1е 5ес.|иепсе οί 1ке ιηΚ,ΝΛ Гог 1ке НЬЛПК-а88ос1а1еб шуапапГ скат геуеаН а ро1урерббе χνίΐΐι аи иии8иа1 ШиътетЬгапе ро1агйу ЕМБО 1. 3 (4), 869-872 (1984)).

«Вариантом» данной аминокислотной последовательности мы обозначаем, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬЛ по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЬЛ-ОКБ1 в случае молекул НЬЛ II класса или НЬЛ-Л2 в случае молекул I класса, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит как способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые аберрантно экспрессируют полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, как определено в аспектах этого изобретения, так и способность стимулировать хелперные Тклетки, которые могут обеспечить помощь СЭ8-положительным Т-клеткам или напрямую атаковать клетки-мишени секрецией цитокинов. Как может быть извлечено из базы данных, как описывается впоследствии, некоторые позиции связывающихся с НЬЛ-ΌΚ пептидов являются типичными якорными остатками, образующими коровую последовательность, подходящую к соединительному элементу НЬЛсвязывающей бороздки. Модификации этих или других остатков, задействованных в связывании НЬЛΌΚ, могут усиливать связывание без изменения распознавания ЦТЛ.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого мы включаем олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их часть или их вариант, как дано.

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы «коровой последовательностью», имеющей конкретный НЬЛ-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т. е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Таким образом, предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 100, предпочтительно между 9 и 30 и особенно предпочтительно между 9 и 16 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000 Да, предпочтительно меньше, чем 50.000 Да, более предпочтительно меньше, чем 10000 Да, и типично около 5000 Да. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков.

В другом аспекте настоящего изобретения, аналогично с ситуацией, поясненной выше для молекул МНС II класса, пептиды по изобретению могут быть применены для вызывания специфического Тклеточного ответа МНС I класса, так как пептиды могут одновременно обладать коровыми или частичными последовательностями молекул НЬЛ класса I. Предпочтительный специфический пептид МНС I класса настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 16, предпочтительно между 9 и 12 аминокислотами. Нужно понимать, что такие пептиды могут быть использованы (например, в вакцине) как более длинные пептиды, аналогично пептидам МНС II класса. Способы идентификации специфических «Коровых последовательностей» МНС класса I, имеющих конкретный НЬЛ-специфический амино

- 9 013466 кислотный фрагмент для молекул НЬА класса I известны специалисту данной области и могут быть спрогнозированы, например, компьютерными программами РАРгоС (1Шр://\\л\лу.ипМиеЫпдеп.бе/иш/кх|/) и 8ΥΡΡΕΙΤΗΙ (ййр://^^^.8у1рейй1.бе) (см. ниже).

Пептиды по изобретению особенно полезны для иммунотерапевтических методов для наделения Тклеток способностью распознавать клетки, которые аберрантно экспрессируют полипептиды, формирующие основу для настоящих пептидов по изобретению. Так как эти специфические пептиды, состоящие из данных аминокислотных последовательностей, связываются с молекулами НЬА класса I или НЬА класса II, предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были такими, которые связывают молекулы НЬА класса I или НЬА класса II, и при такой связи НЬА-пептидный комплекс, представленный на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки, был бы способен вызывать стимуляцию Тклеток, которые распознают клетки, которые аберрантно экспрессирует полипептид, включающий данную аминокислотную последовательность.

Если пептид, который имеет больше чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА-связывающему региону, являлись такими, которые, по существу, не влияют на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС или презентировать пептид Т-клеткам. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.

Примеры для пептидов из МНС-лигандов, элементов, вариантов, а также отдельные примеры для Ν- и/или С-терминальных удлиняющих сегментов могут быть взяты, например, из банка данных 8УРРЕ[ТН[ (Каттепкее Н, Васйтапп 1, Еттелсй ΝΡ, Ваейог ОА, 8!еуапоу1с 8. 8ΥΡΡΕIΤΗI: ба!аЬаке Гог МНС 1щапбк апб рерйбе тоШк. Iттиподепейс8. 1999 Μν: 50(3-4):213-9. Ке\зе\\·.) на сайте ййр://ку1рейй1. Ьт1-йе1бе1Ьегд.еот/ и ссылок, включенных сюда.

В качестве неограниченных примеров некоторые пептиды для НЬА-ЭК в банке данных представлены КНКУУАСЕУТНОСЙ88. получен из цепи к карра 188-203 (Коуа!к е! а1. Еиг 1 Iттиηо1. 1997 Арг; 27 (4): 1014-21); КУО^КУОКАЬО8СК8, получен из цепи к карра 145-159 (Коуа!к е! а1. Еиг 1 Iттиηо1. 1997 Арг; 27 (4): 1014-21), ЕРКиАРТ^ЕНБНЕ, получен из САЭ65 270-283 (Епб1 е! а1. 1 С1т Шуей. 1997 Мау 15; 99 (10): 2405-15) или ЕЕКМУ^РААТНОЭШЕи, получен из 6АП65556-575 (Епб1 е! а1. 1 С1ш Шуей. 1997 Мау 15; 99 (10):2405-15.). Кроме того, пептиды могут также быть получены из мутировавших последовательностей антигенов, таких как в случае АТСЕКО88КАЕОКРУА8, полученного из ЬсгаЬ1 210 кЭ белка слияния (!еп Воксй е! а1. В1ооб. 1996 Ναν 1; 88 (9): 3522-7), бУКУЬУЫУРБУААТ, полученного из НСУ-1 N83 28-41 Э1еро1бег е! а1. 1 Упо1. 1997 Аид; 71 (8): 6011-9), или ЕККОКТРШУ^УМООкУУС, полученного из ШУ-1 (НХВ2) КТ 326-345 (уап бег Вигд е! а1. 1 Iттипо1. 1999 1ап 1; 162(1):152-60.). Все «якорные» аминокислоты (кее Глебе е! а1., ВюсЫт Вюрйук Ас!а. 1996 Шп 7; 1316 (2):85-101; 8ейе е! а1. 1 Iттипо1. 1993 8ер 15; 151 (6): 3163-70; Наттег е! а1. Се11. 1993 Ш1 16; 74 (1):197203., апб Наттег е! а1. 1 Ехр Меб. 1995 Мау 1; 181 (5): 1847-55. Как примеры для НЬА-ЭК4) выделены жирным шрифтом, предполагаемые центральные (коровые) последовательности подчеркнуты.

Все описанные выше пептиды охватываются термином «варианты» данной аминокислотной последовательности.

В понятие «пептид» изобретатели включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки присоединены пептидными связями (-СО-КН-), но и также молекулы, в которых пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Ме/1еге е! а1. (1997) 1. Iттиηо1. 159,32303237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге е! а1. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны, по крайней мере, для клеточных ответов МНС класса II и Тхелперов. Ретро-обратные пептиды, которые содержат связи КН-СО вместо пептидных связей СО-КН, намного более устойчивы к протеолизу.

Типично, что пептид по изобретению является таким, который может процессироваться, если он экспрессирован в антигенпрезентирующей клетке, так что получается фрагмент, который способен связываться с адекватной молекулой МНС и может быть презентирован подходящей клеткой и может вызывать адекватный Т-клеточный ответ. Следует понимать, что полученный из пептида сегмент может также быть пептидом по изобретению. Целесообразно, что пептид по изобретению содержит участок, который включает данную аминокислотную последовательность или ее сегмент или ее вариант и дальнейший сегмент, который обладает некоторыми желаемыми свойствами. Например, дальнейший сегмент может включать дальнейший Т-клеточный эпитоп (независимо от того, получен ли он из одного и того же полипептида в качестве первого сегмента, содержащего Т-клеточный эпитоп, или нет) или он может включать белок-носитель или пептид. Таким образом, в одном воплощении пептид по изобретению является «усеченным» белком человека или белком слияния белкового фрагмента и другого сегмента полипептида, при условии, что человеческий сегмент включает одну или более аминокислотную последователь

- 10 013466 ность изобретения.

В особенно предпочтительном воплощении пептиды по изобретению включают аминокислотную последовательность по изобретению и по крайней мере один дальнейший Т-клеточный эпитоп, причем дальнейший Т-клеточный эпитоп способен содействовать продуцированию Т-клеточного ответа, направленного на вид опухоли, который аберрантно экспрессирует опухолеассоциированный антиген. Таким образом, пептиды по изобретению включают так называемые полипептиды «бусины на нити», которые могут также использоваться в качестве вакцин. Такие пептиды могут быть отделены друг от друга химическими линкерами, которые могут содержать аминокислоты (такие как С-удлиннения), но которые могут, дополнительно или альтернативно, включать химические сшивающие группы (т.е. не иметь другой функции, кроме как обеспечения особенного пространственного размещения).

В понятие «аберрантно экспрессированный» мы включаем значение, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, или что ген является «молчащим» в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием «гиперэкспрессирован» мы подразумеваем, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.

Пептиды (по крайней мере те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Ртос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи с1 а1. (1981) 1. Огд. Сйет. 46, 3433-3436, и в прилагающихся ссылках. Временная защита Νаминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ртос). Повторное расщепление этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется с использованием 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель базируется на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептидсмола является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного ^№дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи, при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, точный выбор зависит от составляющих аминокислот пептида при синтезе.

Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии в Са1ЫоейешШуаЬюсйет (Великобритания) Ыб, №Шпд11ат NС7 201. Великобритания.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также масс-спектрометрического анализа ΜΑΒΌΙ и Ε8Ι-0-ΤΟΡ.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид по изобретению. Нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинациями и может или не может содержать нитроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.

Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК

- 11 013466 могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ соединения сегмента ДНК с векторами. Сегмент ДНК, получаемый в результате расщепления эндонуклеазы рестрикции, как описывалось ранее, подвергается воздействию бактериофага Т4 ДНК полимеразы или Е.сой ДНК полимеразы I, ферментов, которые удаляют выдающиеся З'-одноцепочечные концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями и наполняют имеющие углубления З'-концы их полимеразными активностями.

Комбинация этих активностей вследствие этого формирует фрагменты ДНК с тупыми концами. Фрагменты с тупыми концами инкубируются затем с большим молярным избытком молекул-линкеров в присутствии фермента, способного катализировать лигирование по тупым концам молекул ДНК, такого как бактериофаг Т4 ДНК лигаза. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие последовательности полимерных сшивающих агентов на их концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляются подходящим ферментом рестрикции и связываются с вектором экспрессии, который был расщеплен ферментом, вырабатывающим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая 1п1егпайоиа1 Вю1сс1то1ощс5 1пс, Νο\ν Науеп, СЫ, США.

Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто у 8а1к1 е! а1. (1988) 8с1еисе 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Согласно этому методу ДНК для ферментативного амплифицирования примыкает к двум специфическим праймерам, которые, в свою очередь, внедряются в амплифицированную ДНК. Приведенные специфические праймеры могут содержать сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые могут быть использованы для клонирования на векторы экспрессии с применением известных из уровня техники методов.

Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) экспрессируется в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего соединение по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в патентах США №: 4,440,859, выданном 3 апреля 1984 на имя Вийег е! а1., 4,530,901, выданном 23 июля 1985 на имя \Уе155шап. 4,582,800, выданном 15 апреля 1986 на имя Сго\\1. 4,677,063, выданном 30 июня 1987 на имя Магк е! а1., 4,678,751, выданном 7 июля 1987 на имя Соеббе1, 4,704,362, выданном 3 ноября 1987 на имя Йакцга е! а1., 4,710,463, выданном 1 декабря 1987 на имя Миггау, 4,757,006, выданном 12 июля 1988 на имя Тоо1е, 1г. е! а1., 4,766,075, выданном 23 августа 1988 на имя Соеббе1 е! а1,. и 4,810,648, выданном 7 марта 1989 на имя 8!а1кег, которые все включены сюда путем ссылки.

ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.

Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина.

Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, учитывая раскрытые здесь идеи, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен.

Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. сой и ВасШиз 8иЫЛ18), дрожжи (например, Зассйагошусез сегеу181ае), мицелиальные грибы (например, АзрегдШиз), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительной системой может быть КСС (почеч

- 12 013466 но-клеточная карцинома) или линия клеток А\ус115.

Промотор является контрольным элементом экспрессии, образованным последовательностью ДНК, которая позволяет связывание РНК-полимеразы и приводит к транскрипции. Совместимые с отдельными бактериями-хозяевами последовательности-промоторы типично представлены в плазмидных векторах, содержащих подходящие сайты рестрикции для вставки фрагмента ДНК настоящего изобретения. Типичными прокариотическими векторными плазмидами являются рИС18, рИС19, рВК322 и рВК329, имеющиеся в наличии в ВюгаБ ЬаЬога!опе8, КюйтопБ, СА, США, а также рТгс99А и рКК223-3, имеющиеся в наличии в Рйагтааа, Р1кса!атау, N1, США.

Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих р8УЪ имеется в наличии в Рйагтааа, Р18са!а^ау, N1, США. Этот вектор использует поздний промотор 8У40 для возбуждения экспрессии клонированных генов, наивысший уровень экспрессии был обнаружен в Т-антиген-вырабатывающих клетках, таких как клетки СО8-1. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ8С, имеющийся также в наличии в Рйагташа. Этот вектор использует глюкокортикоид-индуцируемый промотор длинного концевого повтора опухолевого вируса молочной железы мыши для возбуждения экспрессии клонированного гена. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рК8403-406 и рК8413-416, и они, как правило, имеются в наличии в 81га1адспс С1ошпд 8ук!ет8, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Плазмиды рК8403, рК8404, рК8405 и рК8406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (У1рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры ΗΙ83, ТКР1, ЬЕи2 и ИКА3. Плазмиды рК8413-416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть либо прокариотической, либо эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами в некоторых случаях и типично являются штаммом Е. со11, таким как, например, Е. со11 штамма ΌΗ5, имеющимся в наличии в ВеШекБа Кекеагсй ЬаЬогаЮпек 1пс., Ве!йекБа, ΜΌ, США, и КК1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур Атепсап Туре С'иНиге Со11ес!юп (АТСС) оГ КоскуШе, ΜΌ, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и почечные клеточные линии. Дрожжевые клетки-хозяева включают УРН499, УРН500 и УРН501, которые, как правило, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук!ет8, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССБ61, ΝΙΗ эмбриональные клетки швейцарской мыши ΝΙΗ/3Τ3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЕ 1658, почечные клетки обезьяны СО8-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЬ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки 8Г9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии.

Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Соке η е! а1. (1972) Ргос. АсаБ. 8ск И8А 69, 2110 и 8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1Б 8рппд ИагЬог ЬаЬога!огу, Со1Б 8рппд Иагбог, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у 811егтап е! а1. (1986) МеБюБк Ιη УеаЧ СепеБск, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1Б 8рппд ИагЬог Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Веддк) (1978) №11иге 275, 104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например, фосфат кальция и ΌΕΑΕ-декстран или липосомальные композиции, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк или Ь1Ге Тес1то1ощек 1пс., СаййегкЬшд, МЭ 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат модель ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами. Например, клетки, образующиеся в результате введения модели экспрессии настоящего изобретения, могут выращиваться для получения полипептида по изобретению. Клетки могут собираться и лизироваться, а содержимое их ДНК проверяться на наличие ДНК с помощью такого способа, как описывается у 8ои111егп (1975) 1. Мо1. Вю1. 98,503 или у Вегеп! е! а1. (1985) Вю!есй. 3, 208. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться применением антител, как описывается ниже.

В дополнение к непосредственному анализу на наличие рекомбинантной ДНК успешная трансформация может быть подтверждена хорошо известными иммунологическими способами, когда рекомбинантная ДНК способна управлять экспрессией белка. Например, клетки, успешно трансформированные вектором экспрессии, вырабатывают белки, проявляющие соответствующую антигенность. Образцы предположительно трансформированных клеток собирают и анализируют на белок, используя подходящие антитела. Таким образом, в дополнение к самим трансформированным клеткам-хозяевам настоящее изобретение сосредоточено также на культуре таких клеток, предпочтительно моноклональной (кло

- 13 013466 нально гомогенной) культуре или культуре, полученной из моноклональной культуры в питательной среде.

Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых.

Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в некоторых терапевтических методах.

Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС.

Предпочтительными клетками-хозяевами являются рекомбинантные клетки КСС или линии А\ус115. Предпочтителен способ получения опухолеассоциированного пептида в соответствии с настоящим изобретением, способ, включающий культивацию клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением и изоляцию пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды в соответствии со стандартными методами.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида для орального, ректального или лингвального приема, внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (б.с.) инъекции, внутрикожной (ί.ά.) инъекции, внутрибрюшной (ί.ρ.) инъекции, внутримышечной (1.т.) инъекции. Предпочтительными способами пептидной инъекции являются 8.с, ί.ά., ί.ρ., 1.т. и ί.ν. Предпочтительными способами инъекции ДНК являются ί.ά., 1.т., 8.с., ί.ρ. и ί.ν. Вводиться могут дозы от 0,1 до 500 мг пептида или ДНК, как изложено ниже.

Дальнейший аспект изобретения относится к использованию опухолеассоциированного пептида в соответствии с изобретением, нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением или вектора экспрессии в соответствии с изобретением в медицине.

Объектом настоящего изобретения в его дальнейшем аспекте является фармацевтическая композиция, содержащая по крайней мере один опухолеассоциированный пептид в соответствии с 8ЕО ГО № 1 или 8ЕО ГО № 2 в соответствии с изобретением, нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением или вектор экспрессии в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т. д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. К1ЬЬе, ΗαηάόοοΕ οί РБагтасеийса1 Ехс1р1еи18, 3. Εά., 2000, Атепсап РБагтасеиБса1 АббошаБои αηά рйаттасеиБса1 рге88. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний.

Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих 8ЕО ГО № 1 и/или 8ЕО ГО № 2, нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением или вектор экспрессии в соответствии с изобретением, вводится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает в дальнейшем по крайней мере один дополнительный опухолеассоциированный пептид, включающий последовательность в соответствии с любой из 8ЕО ГО № 3 по 8ЕО ГО № 10, соответствующую нуклеиновую кислоту или соответствующий вектор экспрессии.

Вообще, пептиды, присутствующие в фармацевтической композиции в соответствии с изобретением, имеют такие же свойства, как описаны выше для пептидов настоящего изобретения, включающих последовательность 8ЕО ГО № 1 и/или 8ЕО ГО № 2. Таким образом, они могут иметь общую длину между 9 и 100, предпочтительно между 9 и 30 и особенно предпочтительно между 9 и 16 аминокислотами. Кроме того, по крайней мере один пептид в соответствии с любой из последовательностей 8ЕО ГО № 1 по 8ЕО ГО № 11 может включать непептидные связи. Кроме того, соответствующие нуклеиновые кислоты могут кодировать для от 9 до 100, предпочтительно от 9 до 30 и особенно предпочтительно от 9 до 16 аминокислот.

Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, включающая (в особенности опухолеассоциированные) пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей в соответствии с 8ЕО ГО № 1 и/или 8ЕО ГО № 2 и 8ЕО ГО № 3 по 8ЕО ГО № 11.

Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, причем количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как присутствующие в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.

Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой.

Пептид может быть, в основном, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъю

- 14 013466 вантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Асщйа'к 0821 (Ас.|ш1а Вю1есй, Аогсек1ег, МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и, собственно, адъювантов, таких как Я1Ь1'к ЭеЮх. Также может быть использован 0ш1 А, другой, полученный из сапонина адъювант, (8ирегГок, Дания). Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. АО 95/18145 и Бопдепескег е! а1. (1993) Апп. ΝΥ Асай. 8с1. 690,276-291). Так как адъювант дефинируется как субстанция, усиливающая иммунный ответ на антиген (МейИпеР1ик® Мей1са1 ОюОопагу. ΝΙΗ), то могут использоваться и другие субстанции с этой же функцией, включая, но не ограничиваясь, агонистами То11-подобного рецептора (ТЬЯ агонисты), предпочтительно субстанции, агонистически взаимодействующие с ТБР 3, 7, 8 и 9, более предпочтительно ТБР 9, такие как протамин-стабилизированная РНК, СрС-олигонуклеотиды, СрЯ-олигонуклеотиды, бактериальная ДНК, имидазохинолины и т. д.

Другие вещества, о которых из уровня техники известно, что они способны усиливать иммунный ответ, включают, но не ограничиваются ингибиторами индуцируемой синтазы оксида азота (1ΝΟ8), аргиназы (АЯО1), индоламин-2,3-диоксигеназы (ШО), рецептора васкулярного эндотелиального фактора роста 1 (УЕ6РЯ-1), васкулярного эндотелиального фактора роста (УБОР), циклооксигеназы-2 (СОХ-2), рецептора I ТОР-бета (ТОР-бета-Я1).

Такими ингибиторами могут быть, например, моноклональные антитела к названным молекулам или малым молекулам. О малых молекулах и моноклональных антителах из уровня техники известно, что они имеют ингибиторную функцию по отношению к факторам, названным выше, и, таким образом, усиливают иммунный ответ, ими являются, например, 1-МТ, ΝΟΧ-4016, рофекоксиб, целебрекс, ВЕС, АВН, пог-ЫОНА, 8В-505124, 8Ό-208, ΕΥ580276, АМП3100, акситиниб, бевацизумаб, 18Ι-124, СРА-7, ХЬ-999, ΖΌ2171, пазопаниб, СР-547632 и УЕОР Тгар.

Также субстанции, снижающие число регуляторных Т-клеток (СЭ4+, СЭ25+, РохР3+), подходят в качестве адъювантов. Они включают, например, но не ограничиваются циклофосфамидом (Цитоксан), ОЫТАК (денилейкин дифтитокс), Сунитиниб, анти-СТЬА-4 (МОХ-010, СР-675206), анти-СЭ25, антиССЬ22 и анти-О1ТЯ.

В другом предпочтительном воплощении вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех у|уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш νίΙΐΌ для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ш уйго, то для клеток может быть полезно быть трансфицированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ГМ-КСФ (ОМ-С8Р).

Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Однако предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.

Полинуклеотид может быть, в основном, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством «генпистолета». Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует СО4-положительные Т-клетки.

Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. «Обнаженная» ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно, или подкожно. Пептиды могут вводиться внутримышечно, внутрикожно или подкожно.

Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть «обнаженной» (т.е. по существу без других компонентов для введения) или она может быть доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфецированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани («кросс-прайминг», например, Тйотак АМ, 8ап1агк1его ЬМ, Ьи1х ЕЯ, Агткйопд ТО, Сйеп ΥΟ, Ниапд ЬО, Ьайегц ЭА, Соддшк М, НгиЬап ЯН, 1аГГее ЕМ. Меко1йе1т-кресШс СЭ8(+) Т-се11 гекропкек ргоугйе е\зйепсе оГ ш у|уо сгокк-рпттд Ьу апйдеп-ргекепйпд се11к ш уасста1ей рапсгеайс сапсег

- 15 013466 рабеп!к. 1 Ехр Меб. 2004 Аид 2; 200(3):297-306).

Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся к.с. или 1.б. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу. Вакцина из нуклеиновой кислоты может вводиться без адъюванта. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'к 0821 (Ас.|ш1а Вю!есб, \Уогсек1ег МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и, собственно, адъювантов, таких как К1Ь1'к Эе1ох. Также может быть использован Οιιί1 А, другой, полученный из сапонина адъювант, (8ирет£ок, Дания). Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом.

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу е! а1. (1996) 8ет1паг§ ίη Опсо1оду 23, 135-147; Сопбоп е! а1. (1996) №1иге Мебюте 2,1122-1127; Сопд е! а1. (1997) №11иге Мебюте 3, 558-561; Ζΐκιί е! а1. (1996) 1. 1ттипо1. 156,700-710; Сгайат е! а1 (1996) 1п! 1. Сапсег 65,664-670; и Вигсбеб е! а1. (1996) стр. 309-313 1п: Вгеак! Сапсег, Абуапсек т Ью1оду апб !бегареибск, Са1уо е! а1. (ебк), 1обп ЫЬЬеу Еиго1ех1, которые все включены в описание путем ссылки.

Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ех у1уо пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у 2бои е! а1. (1995) В1ооб 86, 3295-3301; Ко111 е! а1. (1996) 8сапб. 1. 1ттипо1оду 43,646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

Согласно своему дальнейшему аспекту изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит один или более обозначенных пептидов в соответствии с изобретением. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. К1ЬЬе, НапбЬоок о£ Рбагтасеибса1 Ехс1р1еп!к, 3. Еб., 2000, Атебсап Рбагтасеибса1 Аккотабоп апб рбагтасеибса1 ргекк. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний.

Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих последовательность 8ЕО ΙΌ № 1 и/или 8ЕО ΙΌ № 2 вводится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован ЦТЛ-специфический иммунный ответ.

В другом аспекте настоящего изобретения комбинация двух или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в качестве вакцины, как в непосредственной комбинации, так и в рамках той же лечебной схемы. Кроме того, могут быть использованы комбинации с другими пептидами, например, с пептидами, специфическими для МНС Ι или ΙΙ класса. Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток ш У1!то в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе выработки ΙΡΝ-γ (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10 или 11 различных пептидов и наиболее предпочтительно 11 различных пептидов. Длина пептида для использования в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7- или 8- или 10- или 11- или 12-мерным пептидом. Более длинные пептиды могут быть также подходящими, но 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в приложенной табл. 1, являются предпочтительными для пептидов МНС класса Ι.

Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех у1уо в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту, или использоваться 1п У1!то для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЕН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Ьопдепескет е! а1. (1993)

- 16 013466

Апп. ΝΥ Асаб. δα. 690, 276-291).

Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'к ОБ21 (Ас.|ш1а Вю!еск, ^огсек!ег, МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и, собственно, адъювантов, таких как К1Ы'к ЭеЮх. Также может быть использован Οιιίΐ А, другой, полученный из сапонина адъювант, (8ирегГок, Дания). Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом. Могут быть использованы другие адъюванты, как те, что описаны выше. Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют С.Л8+ ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой СЛ4+ Т-клетками. Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют С.Л4+ Т-клетки. Стимулирующие эпитопы С.Л4+ хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине.

В особенно предпочтительном воплощении пептидной вакцины в соответствии с изобретением, указанная вакцина является комплексной пептидной опухолевой вакциной для лечения почечноклеточного рака. Предпочтительно, чтобы указанная вакцина вмещала комплекс опухолеассоциированных пептидов в соответствии с 8Е0 Ш № 1 по 10, которые расположены и были идентифицированы на первичных клетках почечного рака.

Этот комплекс включает пептиды НЬА класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по крайней мере один пептид, например, из корового антигена НВV, используемый в качестве пептида положительного контроля, служащий как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном предпочтительном воплощении вакцина состоит из 11 отдельных пептидов (в соответствии с 8Е0 Ш № 1 по 11) с весом каждого пептида от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 750 мкг и более предпочтительно от около 500 мкг до около 600 мкг и наиболее предпочтительно около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной хроматографии и получены в виде белого до серовато-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около 0,1 до 1 мг и наиболее предпочтительно между около 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин «около» подразумевает здесь +/- 10 процентов заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество ТИМАР (опухолеассоциированный пептид), присутствующего в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата.

Некоторые пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют СЛ8-положительные Т-клетки (ЦТЛ). Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой СО4-положительными Т-клетками. Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СЛ4положительные Т-клетки. Стимулирующие СЛ4-положительные эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине или пептиде из ММР7, обеспечиваемые данным изобретением.

Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у обозначенного конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами, в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.

Другой дальнейший аспект настоящего изобретения относится к применению пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Предпочтительно использование в качестве фармацевтической композиции, являющейся противораковой вакциной.

Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для индуцирования иммунного ответа, в особенности клеточного иммунного от

- 17 013466 вета, более предпочтительно опосредованного Т-клетками иммунного ответа против клеток солидных опухолей, клетки которых экспрессируют молекулу I или II класса МНС человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению.

В контексте настоящего изобретения было неожиданно установлено, что опухолевые клетки солидных опухолей, в отличие от здоровых клеток той же ткани, экспрессируют человеческие молекулы НЬА II класса на их поверхности. Этот факт был описан лишь раз в работе Вгазапас е! а1. (Вгакапас Ό, Магкоу1с-Ыркоу5к1 I, Наб/1-О)ок1с I, Ми11ег СА, Ми11ег СА. [ттипоЫ51осНет1са1 апа1ук1к о£ НЬА с1акк II апДдепк апб !итог 1пкШгаДпд топопис1еаг се11к ш гепа1 се11 сагстота: согге1аДоп \νίΐ1ι с1шюа1 апб Ыз!ора11ю1од1са1 ба!а. Ыеор1акта. 1999; 46(3): 173-8), где криостатные срезы 37 почечно-клеточных карцином (КСС) - 25 светлоклеточный, 10 гранулярный и 2 хромофобный тип - были исследованы непрямым иммунопероксидазным методом, применяющим моноклональные антитела (МоАЫ) к антигенам НЬАГОК, -ΌΡ и -ΌΟ для анализа антигенов НЬА класса II, и анти-СО14, -СЭ3, -СЭ4 и -СЭ8 МоАЫ для опухольинфильтрующих мононуклеарных клеток (ТГМ). Число положительных клеток оценивалось полуколичественным методом, а результаты иммуногистохимического исследования были соотнесены с клиническими (возраст и пол пациента, размер опухоли и классификация по ТЫМ) и гистопатологическими (цитология, гистология, степень) характеристиками КСС. Все КСС экспрессировали НЬА-ЭК, 92% -ΌΟ и 73% -ΌΡ-антигены с уровнем экспрессии в соотношении ГОК>ГОр>ГОР, однако не было установлено никакой значимой связи с какими-либо проанализированными гистопатологическими или клиническими параметрами. Моноциты были более многочисленны, чем Т-лимфоциты, а Т-клетки СЭ4+, чем СЭ8+, причем опухоли с преобладанием Т-лимфоцитов и приблизительно равным числом СГО4+ и СЭ8+ Тклеток имеют наибольший средний диаметр. Неадекватная активация Т-лимфоцитов опухолевыми клетками (несмотря на способность презентации антигена) могла быть причиной для ассоциации параметров, которая свидетельствует о более агрессивном поведении опухоли с аберрантной экспрессией антигена НЬА II класса на КСС.

Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность как данная в любой из 8ЕЦ ГО № 1 по 10.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает, таким образом, способы получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов ш т1то или ίπ уДго, причем первый способ включает контактирование Тклеток ш ν 11го с нагруженными антигеном молекулами МНС I или II класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом указанной Т-клетки, причем антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Второй способ, который является более предпочтительным, описывается у ^а1!ег е! а1. (^а1!ег 8, Неггдеп Ь, 8сДоог О, Л.тд С, \Уегпе1 Ό, ВцДппд Ш, Каттепкее НС, 81етапот1с 8. Си!Дпд ебде: ргебе!егттеб ат1бйу о£ Дитап СГО8 Т-се11к ехрапбеб оп саДЫга!еб МНС/апи-СГО28-соа1еб ιηιсгокрЬегек. I ^типок 2003 Μν 15; 171(10):4974-8).

Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и, предпочтительно, если клетка является такой, которая в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы), или, если она экспрессирует, то она является дефектной для каскадов реакций процессинга или презентации антигена. Тогда для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса II, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на названную молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш νίΙΐΌ.

Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, КМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это Транспортер, ассоциированный с Процессингом Антигена.

Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атейсап Туре Си1!иге СоПесДоп, 12301 Рагк1а\гп Опте, КосктШе, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СКЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия 8сйпе1бег 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СКЬ 19863; клеточная линия мыши КМА-8 описывается у Кагге и Ьщпддгеп (1985) I. Ехр. Меб. 162, 1745.

Обычно указанная клетка-хозяин до трансфекции, в основном, не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Тклеточной костимуляции, такую как любая из В7.1, В7.2, ТСАМ-1 и ЬРА 3.

В дальнейшем воплощении также могут быть использованы комбинации молекул НЬА.

Использование рекомбинантных полиэпитопных вакцин для доставки комплексов эпитопов СГО8положительных ЦТЛ описывается в работе ТДоткоп е! а1 (1996) I. Iттипо1. 157, 822-826 и в XVО

- 18 013466

96/03144. которые включены сюда путем ссылки. По отношению к настоящему изобретению. желательно и выгодно включение в отдельную вакцину пептида (или нуклеиновой кислоты. кодирующей пептид). причем пептид включает в любом порядке аминокислотную последовательность настоящего изобретения и СО4-положительный Т-клеточный стимулирующий эпитоп (такой как из ММР-7). Такая вакцина была бы особенно полезна для лечения раковых заболеваний.

Для генерации ЦТЛ ίη уйго могут быть использованы многие другие способы. Например. в методах. описанных у Реор1е§ е! а1. (1995) Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 92.432-436 и Ка\\'акат1 е! а1. (1992) 1. Iттиηо1. 148. 638643 при генерации ЦТЛ используются аутологичные инфильтрующие опухоль лимфоциты. Р1еЬап§к1 е! а1. (1995) Еиг. к Iттиηо1. 25. 1783-1787 для приготовления ЦТЛ использует аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). 1осйти8 е! а1. (1997) I Сеп. У1го1. 78. 1689-1695 описывает получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Н111 е! а1. (1995) ί. Ехр. Меб. 181. 2221-2228 и 1еготе е! а1 (1993) 1. Iттиηо1. 151. 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ использует В-клетки. Кроме того. для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом.

При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки. и этот метод детально описывается в патенте \¥О 97/26328. включенном сюда путем ссылки. Например. кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток. для презентации антигенов могут использоваться другие клетки. такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО). бакуловирус-инфицированные клетки насекомых. бактерии. дрожжи. инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того. могут быть использованы растительные вирусы (см.. например. Ройа е! а1 (1994) Уйо1оду 202. 449-955. где развитие мозаичного вируса китайской вигны описывается как высокопродуктивная система для презентации чужеродных пептидов.

Предпочтительно. чтобы в методе в соответствии с настоящим изобретением антигенпрезентирующая клетка включала вектор экспрессии как данный выше.

Активированные Т-клетки. которые направлены против пептидов изобретения. применимы в терапии. Таким образом. дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки. получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки. которые селективно распознают клетку. которая аберрантно экспрессирует полипептид. включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Предпочтительно. чтобы Т-клетки распознавали указанную клетку при взаимодействии с комплексом НЬА/пептид (например. соединение). Т-клетки применимы в методе уничтожения клеток-мишеней у пациента. клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид. включающий аминокислотную последовательность по изобретению. причем пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки. которые введены пациенту. могут быть получены от пациента и активироваться. как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно Т-клетки получают не от пациента. а от другого индивида. Разумеется. предпочтительно. если индивид является здоровым индивидом. «Здоровым индивидом» изобретатели обозначают. что индивид имеет. в общем. хорошее здоровье. предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием. которые можно легко проконтролировать и выявить.

Активированные Т-клетки экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР). который участвует в распознании клеток. которые экспрессируют аберрантный полипептид. Полезно. если кДНК. кодирующая ТКР. клонирована из активированных Т-клеток и перенесена на дальнейшие Т-клетки для экспрессии.

Клетками-мишенями для СЭ4-положительных Т-клеток ш у1уо в соответствии с одним воплощением настоящего изобретения могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки. окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II).

ТКР клонов Т-клеток по изобретению. специфические для пептидов по изобретению. клонируются. Использование ТКР в клонах Т-клеток определяется использованием (ί) ТКР вариабельных регионспецифических моноклональных антител и (ίί) ПЦР с обратной транскрипцией с праймерами. специфическими для семейств генов Уа и Ур. Библиотека кДНК подготовлена из поли-(А)-мРНК. экстрагированной из клонов Т-клеток. Использовались праймеры. специфические для С-терминального участка ТКР а и Р-цепей и для Ν-терминального участка идентифицированных сегментов Уа и Р. Вся кДНК для а и Рцепи ТКР амплифицировалась высокоточной ДНК-полимеразой. и амплифицированные продукты клонировались в подходящий вектор для клонирования. Клонированные гены а и Р-цепей могут быть организованы в одну цепь ТКР с помощью метода. описанного у Сйипд е! а1. (1994) Ргос. №ί1. Асаб. 8сг И8А 91-12658. В этой отдельной модели цепи за сегментом Уа1 следует сегмент У Ό1. затем сегмент Ср. затем трансмембранный и цитоплазматический сегмент цепи СЭ3. Эта отдельная цепь ТКР вводится затем в ретровирусный вектор экспрессии. панель векторов может быть использована на основе их способности инфицировать взрослые человеческие С'О8-положительные Т-лимфоциты и способствовать экспрессии генов: ретровирусная векторная система Ка! является одной предпочтительной возможностью (см. Бтег

- 19 013466 е! а1. (1994) В1ооб 83, 43). Насыщенный амфотропный ретровирус используется, чтобы инфицировать очищенные СО8-положительные или СЭ4-положительные Т-лимфоциты, изолированные из периферической крови пациентов с опухолями (следуя протоколу, опубликованному у ВоЬейк е! а1. (1994) В1ооб 84, 2878-2889, включенному сюда путем ссылки). Антитела анти-СО3 используются, чтобы инициировать пролиферацию очищенных СО8-положительных Т-клеток, которая содействует ретровирусной интеграции и стабильной экспрессии отдельной цепи ТКР. Эффективность ретровирусной трансдукции определяется окрашиванием инфицированных СО8-положительных Т-клеток антителами, специфическими для отдельной цепи ТКР. Анализ ίπ νίΐΐΌ трансдуцированных СЭ8-положительных Т-клеток устанавливает, что они проявляют такое же опухолеспецифическое уничтожение, как в случае с рестриктированным по аллотипу клоном Т-клеток, из которого были первоначально клонированы цепи ТКР. Популяции трансдуцированных СЭ8-положительных Т-клеток с ожидаемой специфичностью могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии пациентов с опухолевыми заболеваниями. Для лечения пациентов можно использовать от 10⁸ до 10¹¹ аутологичных, трансдуцированных Т-клеток. Аналогично СП8-положительным могут быть генерированы трансдуцированные СЭ4-положительные Т-хелперные клетки, несущие соотносимые модели.

Другие подходящие системы для введения генов в Т-клетки описываются в работе Могйх е! а1. (1994) Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А 91-4322, включенной сюда путем ссылки. Екккаг е! а1. (1993) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 90,720-724 и Нтеи е! а1. (1993) I. Ехр. Меб. 178, 361-366 описывают также трансфекцию Тклеток. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает ТКР, который распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению; ТКР, полученный из активированных Т-клеток.

Равно как и ТКР, в изобретение включены молекулы, функционально эквивалентные ТКР. Они включают любую молекулу, которая функционально эквивалентна ТКР, которая может выполнять такую же функцию, как и ТКР. В частности, такие молекулы включают полученные генной инженерией трехдоменные одноцепные ТКР, как те, что получены методом, описанным в работе Скцпд е! а1. (1994) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 91, 12654-12658, включенной сюда путем ссылки и относящейся к сказанному выше. Изобретение включает также полинуклеотид, кодирующий ТКР или функционально эквивалентную молекулу, и вектор экспрессии, кодирующий ТКР или его функционально эквивалентную молекулу. Векторы экспрессии, которые подходят для экспрессирования ТКР по изобретению, включают те, что описаны выше в связи с экспрессией пептидов по изобретению.

Тем не менее, предпочтительно, чтобы векторы экспрессии являлись такими, которые способны экспрессировать ТКР в следующей за Т-клетками трансфекции.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с изобретением или эффективного объема полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего указанный пептид, или эффективного числа Т-лимфоцитов, как определено выше, причем объем указанного пептида или объем указанного полинуклеотида или вектора экспрессии или Т-клеток является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у указанного пациента. Клетка-мишень типично является опухолевой или раковой клеткой, в особенности клеткой солидных опухолей, которые экспрессируют молекулу I или II класса МНС человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как данная выше.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, метод, включающий стадии (1) получение Т-клеток от пациента; (2) введение в указанные клетки полинуклеотида, кодирующего ТКР или функционально эквивалентную молекулу, как определено выше; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая определена выше, метод, включающий стадии (1) извлечение антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, у указанного пациента; (2) контактирование указанных антигенпрезентирующих клеток с пептидом, как определено в первом или втором или третьем аспектах изобретения, или с полинуклеотидом, кодирующим таковой пептид, ех νί\Ό; и (3) введение обработанных таким образом антигенпрезентирующих клеток снова пациенту.

Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Соответственно, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Мигрку е! а1 (1996) Тке Ргок!а!е 29, 371-380 апб Т)иа е! а1. (1997) Тке Ргок!а!е 32, 272-278.

В дальнейшем воплощении антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, контак

- 20 013466 тируют с полинуклеотидом, который кодирует пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом, и, предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Как правило, полинуклеотид может быть включен в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антигенспецифический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. Сопд е! а1. (1997) Сепе ТНег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, \¥ап е! а1. (1997) Нит. Сепе ТНег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (8ресЫ е! а1. (1997) I. Ехр. Меб. 186, 1213-1221 и 8хаЬо1сз е! а1. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тийпд е! а1. (1997) Еиг. I. 1ттипо1. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (АзЫеу е! а1. (1997) I. Ехр. Меб. 186, 1177-1182).

Следует понимать, что с учетом методов уничтожения клеток-мишеней у пациента особенно предпочтительно, чтобы клетками-мишенями были раковые клетки, более предпочтительно раковыми клетками почек или толстой кишки.

В предпочтительном воплощении НЬА-гаплотип пациента определяется до начала лечения. Гаплотипирование НЬА может быть произведено при использовании любого подходящего метода; такие методы хорошо известны из уровня техники.

Изобретение включает, в особенности, использование пептидов по изобретению (или кодирующих их полинуклеотидов) для активной вакцинации ш у1уо; для манипуляции аутологичными дендритными клетками ш уНго при последующем введении манипулированных таким образом дендритных клеток ш У1уо для активации ответов Т-клеток; для активации аутологичных Т-клеток ш У1!то с последующей адоптивной терапией (т. е. манипулированные таким образом Т-клетки вводятся пациенту); и для активации Т-клеток здоровых доноров (МНС-совместимых или несовместимых) 1п уНго с последующей адоптивной терапией.

В предпочтительном воплощении вакцины настоящего изобретения вводятся хозяину как отдельно, так и в комбинации с другой противораковой терапией для ингибирования или супрессии образования опухолей.

Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты описываются также выше.

Пептиды в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве диагностических реагентов. Используя пептиды, может быть проведен анализ, присутствуют ли в популяции Тклеток такие Т-клетки, которые специфически направлены против пептида или были индуцированы при терапии. Кроме того, увеличение числа предшественников Т-клеток может быть проверено теми пептидами, которые проявляют реактивность против означенного пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для контроля прогрессирования опухолевого заболевания, экспрессирующего обозначенный антиген, из которого получен пептид.

В приложенной табл. 1 приведены пептиды, которые были идентифицированы. Помимо того, в таблице приводятся названия белков, из которых получен пептид, и соответствующая позиция пептида в соответствующем белке. Кроме того, даются соответствующие Инвентарные номера, которые относятся к генному банку «Национального Центра Биотехнологической Информации» (№1Нопа1 Сеп1ге !ог Вю1есНпо1оду 1пГогта1юп) Национального Института Здоровья (№1Нопа1 1пз!1!и!е о! НеаНН) (см. Нир: \у\у\у. псЬ1.п1т.пШ.доу).

В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для окрашивания лейкоцитов, в особенности Т-лимфоцитов. Такое использование имеет особенное преимущество, если необходимо проверить, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие специфические ЦТЛ, которые направлены против пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для определения прогрессирования терапии при аденоматозном или раковом заболевании или нарушении.

В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены по стандартному способу иммунизации животных путем инъекции пептида и последующей очистки иммуноглобулина. Моноклинальные антитела могут быть получены в соответствии со стандартными протоколами, такими как описываются, например, в МеШобз ЕпхутоН (1986), 121, НуЬпбота 1есНпо1оду апб топос1опа1 ап!1Ьоб1ез.

Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в противоопухолевой иммунотерапии. До сих пор были разработаны различные стратегии для идентификации пептидов Ι или ΙΙ класса из опухолеассоциированного антигена, начиная с инкубации АПК с интересующим антигеном для его поглощения и процессинга (СНаих, Р., У. Уап!отте, У. 8!гооЬап!, К. ТЫе1етапз, I. СоПНаН В. Ьийеп, А.М. Еддегтоп!, Т. Вооп апб В.Р. уап бег Вгиддеп. 1999. 1беп11ПсаНоп о! МАСЕ-3 ерйорез ргезеп!еб Ьу НЬА-ЭВ то1еси1ез !о СЭ4(+) Т. 1утрНосу1ез. I. Ехр. Меб. 189:767778), до всевозможных стратегий трансфекции с белками слияния (Оепд)е1, I., Р. Оескег, О. 8сНоог Р. А1!епЬегепб, Т. ХУетзсНепк Н.С. Ваттепзее, апб 8. 8!еуапоую. 2004. 1беп!Шса!юп о! а па!ига11у ргосеззеб сусНп Ό1 Т-Не1рег ерйоре Ьу а поуе1 сотЫпайоп о! НЬА с1азз II !агде!тд апб б1Т!егепйа1 тазз зресйотейу. Еиг. I. 1ттипо1. 34:3644-3651). Для всех этих методов требуется большая затрата времени и зачастую

- 21 013466 остается неизвестным, действительно ли происходит презентация идентифицированных лигандов НЬЛ ш У1уо человеческими тканями.

Изобретатели идентифицировали лиганд, имеющий одну «коровую» последовательность из ММР7. Изобретатели обнаружили этот белок в гиперэкспрессированном состоянии в почечно-клеточных карциномах, к тому же, он был описан как опухолеассоциированный (М1уато1о, 8., К. Уапо, 8. 8ид1то1о, С. Шик Т. НакеЬе, Υ. Епбок, К. Кобата, М. Соуа, Т. СЫЬа, апб А. ОсЫак 2004. Ма!пх те1а11оргокета5е-7 ГасПИа1е8 ткикп-кке дго\\1к ГасЮг ЬюауайаЬййу кнопок ίΐδ ргокетаке асйуйу оп ткикп-кке дго\\1к ГасЮг Ьтбшд ргокеш 3. Сапсег Кек. 64:665-671; 8ит1, Т., Т. Nакаΐаи^, Н. УокЫба, Υ. Нуип, Т. Υηκυι, Υ. Маккитоко, Е. Nакада^а, К. 8ид1тига, Н. Ка^акЫта, апб О. Шико. 2003. Ехргеккюп оГ такпх текаПоргокетакек 7 апб 2 ш китап гепа1 се11 сагсшота. Опсо1. Кер. 10:567-570). Этот пептид беспорядочно связывался с молекулами НЬА II класса и был способен активировать СИ4-положительные Т-клетки различных здоровых доноров. Таким образом, подход изобретателей будет полезен при идентификации новых пептидов-кандидатов II класса из ТАА для использования в клинических протоколах по вакцинации.

Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением.

Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.

Последовательности 8ЕО Ш № 1 по 8ЕО Ш № 2 демонстрируют пептидные последовательности Тклеточного эпитопа, содержащего пептиды, которые презентируются МНС I или II класса в соответствии с настоящим изобретением.

8ЕО Ш № 3 по 8ЕО Ш № 11 демонстрируют пептидные последовательности пептидов, использованные в вакцине настоящего изобретения, которая впоследствии обозначается «ГМА».

На фиг. 1 показана презентация пептида IА-МЕТ-001, полученного из протоонкогена с-Мек на первичной опухолевой пробе КСС013. Нанокапиллярная высокоэффективная жидкостная хроматография Е8I М8 была сделана на пептидах, элюированных из КСС013. Масс-хроматограмма для 1006,54 ±0,5 Да показывает пик со временем удерживания 47,8 мин. Индуцированный столкновением масс-спектр затухания от м/з 1006,54, записанный во время второй ЬС-М8 при заданном времени удерживания, показанном на вставке, подтвердил присутствие IМА-МЕТ-001 (Аеиъскепк 2002).

На фиг. 2 показана тканевая экспрессия протоонкогена с-Ме1 (МЕТ). Экспрессия была проанализирована олигонуклеотидными микрочипами. Число копий соотносится с почкой, значение задано 1,0. «Р» означает, что ген присутствует, «А» - отсутствует, а «М» - предельный случай на основе статистических алгоритмов абсолютного сигнала. «I» означает, что экспрессия гена значительно увеличена в соотношении с почкой, «И» указывает на пониженную экспрессию, а «ΝΟ> означает, что в экспрессии не было изменений. Значение экспрессии по отношению к почке подсчитывалось по коэффициенту сигнальной диаграммы и указано наверху столбцов. Пунктирная горизонтальная линия показывает наивысшую экспрессию в нормальных тканях (в данном случае легкого).

На фиг. 3 показано уничтожение нагруженных пептидом клеток-мишеней ЦТЛ, примированных IМА-МЕТ-001.

На фиг. 4 показано уничтожение злокачественных клеток ЦТЛ, примированных IМА-МЕТ-001.

На фиг. 5 показан анализ ингибирования немечеными клетками-мишенями.

На фиг. 6 показан тетрамерный анализ экспансии, вызванной микросферой.

На фиг. 7 показана иммуногенность ш νίΙΐΌ IМА-ММΡ-001 - репрезентативный внутриклеточный Ш^гамма в сравнении с окрашиванием СИ4 четырех здоровых доноров. СИ4-положительные Т-клетки доноров 1, 2 и 3 проявляли реактивность к IМА-ММΡ-001 после третьей и четвертой стимуляции. Донор 4 оставался всегда отрицательным.

На фиг. 8 показана дифференциальная презентация пептидов на опухолевой и здоровой тканях - (А) масс-спектр двух видов пептидов м/з 739,96 и 741,95, полученных из нормальной почки и ткани почечноклеточной карциномы пациента КСС100, соответственно. Масс-спектр демонстрирует гиперпрезентацию пептида Адипофилин на ткани почечно-клеточной карциномы, которая приблизительно в 4 раза выше, чем на соответствующей аутологичной нормальной ткани (В). Анализ индуцированного столкновением масс-спектра затухания с м/з 741,95 (опухоль) обнаруживает пептидную последовательность ПМА-ЛОЕ003, полученную из Адипофилина.

На фиг. 9 показана иммунность ш у1уо к кМА-А^Ε-001 - Т-клеточная иммунность у 2 пациентов с КСС к нескольким не использованным в вакцинации пептидам у пациентов, вакцинированных аутологичными дендритными клетками с введенными импульсным методом двумя пептидами ТИМАР, полученными из МИС. Т-клетки, специфические для IМЛ-Л^Ε-001 («Адипофилин»), до вакцинации не были представлены и были выявлены потом у пациента #3 (верхнее изображение) после 6 вакцинаций и у пациента #8 (нижнее изображении) после 8 вакцинаций.

На фиг. 10 представлены репрезентативные примеры IМА-индуцированного Т-клеточного ответа, выявленного амплифицированным анализом ЕЫ8РОТ для того же пациента и антигена. Верхняя и ниж

- 22 013466 няя колонка представляют отрицательный контрольный антиген Н1У-001 и отдельный ТИМАР 1МАСС№001, использованные для считывания, соответственно. В левой колонке представлены анализы ЕЫ8РОТ совокупных проб до вакцинации в день обследования 2 (82) и непосредственно перед первой инъекцией (У1). В правой колонке представлены анализы ЕБ18РОТ совокупных проб, сделанных во время проведения вакцинации на 22^ой день (У6) и 36^ой день (У7). Дается число положительных клеток для каждого эксперимента.

Фиг. 11 - репрезентативные примеры 1МА-индуцированных Т-клеточных ответов, выявленных амплифицированным тетрамерным анализом на основе изменения окраски. На верхней и средней панелях представлены двухмерные точечные графики с гейтом для СЭ3+ лимфоцитов, нижняя панель -с гейтом для СЭ3+ СЭ8+ лимфоцитов. Пациенты, точки времени и окрашивание, как указано для каждой колонки. 81+У1: пробы, взятые до вакцинации; У4+У5: пробы, взятые на 8^ой и 15^ый день; У6+У7: пробы, взятые на 22^ой и 36^ой день; У6+У7: пробы, взятые на 64^ый день (последняя вакцинация) и с 85^ого по 92^ой день (конец исследования).

A. Данные для пациента 03-004, подтверждающие иммунологический ответ на 1МА-СС№001, представлены на фиг. 10. Клеточная популяция, положительная для СЭ3+ и тетрамера 1МА-СС№001, может быть выявлена после четвертой и пятой инъекции 1МА (У6+У7; средняя панель), насчитывающая 0,78% лимфоцитов (У6+У7; нижняя панель). Для тетрамера К67-001 не было обнаружено положительной популяции (верхняя панель).

B. Данные для пациента 03-003, не проявляющего иммунологического ответа на пептид 1МЛ-КС8001 (верхняя панель), но вырабатывающего 1МА-СС№001 тетрамерный положительный ответ во время схемы вакцинации (средняя панель, колонка 3 и 4), насчитывающего до 0,8% лимфоцитов (нижняя панель; колонка 3).

Фиг. 12. Наблюдаемая сила кинетики Т-клетки при амплифицированном тетрамерном анализе в отдельный момент времени. Результаты представлены для считывания в отдельный момент времени для пациента 05-001, для которого индуцированный вакциной Т-клеточный ответ был выявлен стандартным амплифицированным тетрамерным анализом с совокупными пробами. Результаты представлены для всех опухолеассоциированных антигенов, присутствующих в 1МА (пул ТИМАР), и в особенности для пептида 1МА-СС№001. Кроме того, представлены контроли Н1У-001 и 1МА-НВУ-001 в рамках того же анализа в отдельный момент времени.

Примеры

Глоссарий

Термин или Описание аббревиатура

АЕ	Нежелательное явление
АДСС	Американский объединенный комитет по раку
ВГАгМ	Федеральный институт по лекарственным препаратам и медицинской продукции
СТБ	Цитотоксические Т-клетки
ОС	Дендритные клетки
ОМ-С8Г	рчГМ-КСФ (рекомбинантный человеческий
гйиОМ-С8Р	гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор)
НВУ	Вирус гепатита В
НЬА	Человеческий лимфоцитный антиген
1АКС	Международное агентство по исследованиям рака
ΙΜΡ	Проходящий клиническое исследование лекарственный препарат
ΙΝΕ	Интерферон
МАА	Заявление на регистрационное удостоверение
МНС	Главный комплекс гистосовместимости
вес	Почечно-клеточная карцинома
8АЕ	Серьезная побочная реакция
8шРС	Краткая характеристика лекарственного средства
ТИМАР	Опухолеассоциированный пептид

Ι. Характеристика пептидов настоящего изобретения.

Данные по экспрессии генных продуктов, из которых получены пептиды ΙΜΑ

Пептиды, идентифицированные из первичной ткани КСС, были выбраны для включения в вакцину 1МА (см. ниже) в соответствии со внутренней системой приоритетности, основанной, в основном, на анализе генной экспрессии, литературе и поисках в базах данных известных свойств антигена, из которого был идентифицирован полученный пептид. Все естественно презентируемые пептиды сильно гиперэкспрессированы в ткани почечно-клеточной карциномы по сравнению с нормальной почечной тканью, также как и с рядом других жизненно важных органов и тканей. Такой отбор необходим (1) для выбора

- 23 013466 пептидов, способных индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью для распознавания опухоли, но не другой ткани, для доведения до минимума возможности аутоиммунности, индуцированной вакцинацией ΙΜΑ и (2) для гарантии того, что большинство опухолей в популяции пациента будет распознано индуцированной Т-клеткой.

Среднее распространение антигенов, из которых получены пептиды, содержащиеся в ΙΜΑ, составляет 68% (гиперэкспрессия в КСС по сравнению с жизненно важными органами и тканями в пробах КСС, и=24), колеблясь от 54 до 96% для отдельных антигенов. Что значительно выше, чем в случае стандартных опухолевых антигенов, таких как Нег-2/иеи (распространение: 25-30%).

Профилирование по глобальной генной экспрессии производилось с помощью имеющейся в продаже системы микрочипов высокой плотности (АГГуте1пх). РНК была изолирована из тканей, процессирована и гибридизирована до высокоплотных олигонуклеотидных микрочипов. После окрашивания и промывания микрочипы были просканированы, и интенсивность флуоресценции каждой точки в анализе представляла собой своего рода уровень экспрессии гена, совместимого с последовательностью ДНК олигонуклеотида. Некоторые олигонуклеотиды на микрочипах покрывают последовательность каждого гена. После статистического анализа компьютерной программой могут быть получены попарные показатели относительной экспрессии двух проб для каждого гена. Упорядочение всех данных различных проб с использованием одной константной пробы в качестве точки отсчета позволяет произвести относительный количественный подсчет уровней экспрессии среди всех проб.

Источники РНК - все РНК из человеческих тканей были куплены (ЛтЫои, ΗιιηΙίηβάοη. Великобритания; С’1оп1ес11. Не^άе1Ье^д, Германия; §1га1адеие, Лш^еМат, Нидерланды, ВюСйат, Не^άе1Ье^д, Германия). Суммарная РНК нескольких индивидов была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Качество и количество было подтверждено на биоанализаторе Лщ1еп1 2100 (ЛдБеи!, У-НЬюии, Германия) с использованием лабораторного оборудования ΚΝΑ 6000 Иапо ЬаЬСЫр Κίΐ (Лщ1еп1).

Анализ с высокоплотным олигонуклеотидным микрочипом.

Двухцепочная РНК была синтезирована из 5-8 мкг суммарной РНК, используя Зирегаспр! ΚΤΙΙ (ЫГе ТесЬпо1од1е8, 1ис., КагИгийе, Германия) и праймер (ЕигодеШес, 8егашд, Бельгия), какой приводится в руководстве ЛГГутеБтх.

Транскрипция ίη νίΐΐΌ с использованием оборудования ВюЛггау™ Н1дй У1еШ™ ΚΝΑ Тгащспр! ЬаЬе11тд Κίΐ (ΕΝΖΟ Оха^юЩс^, 1ис., Рагтт^а1е, Нью-Йорк), фрагментация, гибридизация на ЛПуте1пх И133Л или И133 Р1ц8 2.0 СеиеС-Чирз (АГГутеБтх, 8айа С1ага, Канада) и окрашивание стрептавидиномфикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬек, ^е^άеи, Нидерланды), следуя указаниям изготовителя (АГГутеБтх). Использовался сканер ЛГГуте1пх СемеАт-к Зсатег, а данные анализировались программой Мкгоаггау Лпа1у515 8ш1е 5.0 или Не Сегарр® Орега!щд 8оП\хаге (ССО8). Для упорядочивания использовались 100 генов «домашнего хозяйства», предоставленных ЛГГуте1пх. Попарное сравнение просчитывалось с использованием значений экспрессии в почке в качестве исходных данных. Следовательно, все значения экспрессии, подсчитанные с показаний сигнальной программы, соотносятся с почкой, которая задана значением 1. Значимость дифференцированной экспрессии оценивалась «переменными» показаниями, выводимыми статистическими алгоритмами, заложенными в компьютерную программу. Для абсолютного определения экспрессии данные были проанализированы снова с использованием статистических алгоритмов. Присутствие или отсутствие генной экспрессии определялось алгоритмами абсолютного вызова.

Перечень отдельной тканевой экспрессии для генной экспрессии протоонкогена с-Ме! (МЕТ) представлен на фиг. 2. МЕТ был гиперэкспрессирован в 96% проанализированных почечно-клеточных карцином (η=24, справа), но не гиперэкспрессирован или в намного меньшей степени в нескольких выбранных жизненно важных здоровых тканях и органах, а также иммунологически важных тканях и клетках (слева на фиг. 2).

В табл. 1 представлен обзор пептидов, содержащихся в вакцине по изобретению ΙΜΑ, включая также пептиды в соответствии с изобретением.

- 24 013466

Таблица 1. Пептиды в соответствии с настоящим изобретением

Внутреннее обозначение послед-ти	Антиген	Последовательность	№ послед-ти
ΙΜΑ-ΜΜΡ- 001	Матричная металлопротеиназа 7	зоЬоткоюкёуоккк”	1
ΙΜΑ-ΑϋΡ- 002	Адипофилин	νΜΑΟΏΙΥδν	2

ΙΜΑ-ΑΌΡ- 001	Адипофилин	8УА8Т1ТОУ	3
ΙΜΑ-ΑΡΟ- 001	Аполипопротеин Ы	ΑΙΑ.ϋθν(?Κ.ν	4
1МА-ССЫ- 001	Циклин ϋ1	ЬЬОАТСМРУ	5
ЫА-оис001	сисУ1Аз	ενΡΑονναν	6
ΙΜΑ-Κ67- 001	К1АА0367	АЬРОООРНЬ	7
ΙΜΑ-ΜΕΤ001	с-тс! протоонкоген	γνΠΡνίΤΒΙ	8
1МА-мис- 001	МСС1	ЗТАРРУНИУ	9
1МА-К.С8001	К68-5	ЬААЬРНЗСЬ	10
1МА-НВУ- 001	НВУ	РЬР8ОРРР8У	11

В табл. 2 представлен обзор результатов экспрессии для всех антигенов, кодирующих пептиды, содержащихся в вакцине по изобретению ГМА, а также для пептидов в соответствии с изобретением.

Таблица 2. Частотность гиперэкспрессии антигенов в КСС (п=24)

Внутреннее обозначение послед-ти	Антиген	Значимая гиперэкспрессия КСС в сравнении с почкой*	Гиперэксп р ессия КСС в сравнении со всеми нормальными тканями1 2
1ΜΑ-ΑΏΡ-001 &002	Адипофилин	83%	75%
ΙΜ А-АРО-001	Аполипопротеин Ь1	67%	58%
1МА-ССЫ-001	Циклин ϋΐ	58%	63%
1МА-<зис-оо1	СиСУ1АЗ	88%	71%
ΙΜΑ-Κ67-001	ΚΙΑΑ0367	54%	54%3
ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	с-шег протоонкоген	96%	96%
1МА-мис-оо1	мис1	нет гиперэкспрессии на уровне мРНК	нет гиперэкспрессии на уровне мРНК
ΙΜΑ-ΚΟ8-001	КО8-5	96%	58%
ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	Матричная металлопротеиназа 7	58%	67%

1. В соответствии с «переменными» значениями статистических алгоритмов, имеющихся в компьютерной программе (количество «I»).

2. Число КСС с более высокой экспрессией по сравнению с нормальной тканью с наивысшей экспрессией среди всех нормальных тканей.

3. Мозг является иммунопривелегированным органом и не был учтен по этой причине.

Минимальная гиперэкспрессия в КСС в сравнении со всеми нормальными тканями составляет 54%, максимально 96%. Это значительно выше, чем в случае стандартных опухолевых антигенов, таких как Нег-2/пеи (распространение: 25-30%).

Исключением является МИС, где не могла быть выявлена гиперэкспрессия для МИС мРНК. Тем не менее, необходимо принимать во внимание следующие публикации:

1. Аберрантная дегликолизация свойственна злокачественным опухолям и обнаруживает эпитопы в опухолевых клетках, которые не должны быть представлены на нормальных клетках. Скорее всего, такой механизм проявляется также и в КСС. Это могло бы объяснить специфическое уничтожение опухолевых клеточных линий, экспрессирующих МИС (Вгоккай 1999). См. также главу 4.1.5 о свойствах МИС.

2. ША-МП С-001 вводился в соединении с аутологичными дендритными клетками в рамках ини- 25 013466 циированного исследователями испытания в университете Тюбингена (Германия). В этом исследовании, представленном недавно в А80О 2003 (МиеПег 2003), и последующих данных в А80О 2005 (^1егеску 2005), не было заявлено ни о каких аутоиммунных эффектах.

3. Другие сообщения о клинических исследованиях показывают, что цитотоксические Т-клетки, специфические для IΜА-Μυ0-001, встречаются в естественных условиях (без иммунизации) у пациентов с карциномой груди (Ветхзск 2003) и колоректальной карциномой (^^йтаии 2004). Для этих пациентов не было заявлено об аутоиммунных эффектах. Эти данные подчеркивают естественную роль ГМАМиО-001-специфических Т-клеток.

Основываясь на этих дополнительных данных, введение IΜА-Μυ0-001 может рассматриваться как безопасное, хотя не может быть установлено гиперэкспрессии для антигена МИО отдельно на уровне мРНК.

Беспорядочное связывание ΙΜΑ-ΜΜΡ-001 с несколькими аллелями ΗΣΑ-ϋΚ

IΜА-ΜΜР-001 является пептидом, связывающимся с Н^А-^В, молекулой НБА класса II. Пептиды ТИМАР II класса активируют Т-хелперные клетки, которые играют решающую роль в содействии функции цитотоксических Т-клеток, активированных пептидами ТИМАР II класса. Беспорядочное связывание пептида НБА-ЭВ важно для гарантии того, что большинство (>50%) НБА-А*02-положительных пациентов, проходящих лечение £МА, способны также проявлять Т-клеточный ответ на IΜА-ΜΜР-001. Анализ связывания ^А-ММР-001 т зШсо указывает на то, что ^А-ММР-001 беспорядочно связывается с несколькими аллелями НБА-ЭВ (ИВВ1*0101, *0301, *0401, *1101 и *1501), покрывая в целом по крайней мере 69,6% НБА-А2-положительной европеоидной популяции. Беспорядочное связывание £МАММР-001 подтверждено экспериментально ίΐ'ΐ νίΙΐΌ данными по иммуногенности.

Принципы теста

Используя алгоритм 8ΥЕРΕIΤНI, разработанный в Университете Тюбингена (Ваттепзее 1997; Ваттеизее 1999), был составлен рейтинг для связывания IΜА-ΜΜР-001 с несколькими распространенными аллелями НБА-ЭВ (см. таблицу ниже). Алгоритм успешно применялся для идентификации эпитопов I и II класса из обширного ряда антигенов, например, из человеческого ТАА ТВР2 (класса I) (8ип 2000) и 88X2 (класса II) (Nеитаии 2004). Проанализированные аллели НБА-ЭВ покрывают по крайней мере 69,6% НБА-А2-положительного населения европеоидной расы (Моп 1997). Пороговое значение для связывания было задано числом 18, основываясь на анализе опубликованных показателей связывания для известных беспорядочно связывающихся лигандов НБА-ЭВ. Беспорядочное связывание определяется как связывание пептида НБА-ЭВ с несколькими аллелями НБА-ЭВ, экспрессированными по крайней мере у 50% европеоидного населения.

Локусы НБА-А и НБА-ЭВ имеют неравномерное распределение связей (Кпкаде й1зедш11Ьпит), что ведет к комбинациям НБА-А2 и специфических НБА-ЭВ, которым отдается предпочтение по сравнению с другими (табл. 3)

Таблица 3

Гаплотип	Частота встречаемости [%]
ΗΣΑ-Α	ΗΣΑϋΚ
2	1	8,8
2	2	14,9
2	3	6,1
2	4	21,3
2	5	1,2
2	6	15,2
2	7	13,0
2	8	4,2
2	9	1,2
2	10	1,4
2	11	8,7
2	12	2,6
2	η.а.	1,4

Табл. 3. Частотность гаплотипа Северо-Американской европеоидной расы - приведены серологические гаплотипы. Ν.3. означает «не определено» (Моп 1997).

Лиганды конкретных молекул МНС содержат химически родственные аминокислоты на конкретных позициях их первичной последовательности, которая позволяет определение пептидного участка для каждого аллеля МНС (Еа1к 1991). 8ΥЕРΕIΤНI использует матрицы фрагментов, полученные из очищенных фрагментов, основываясь исключительно на анализе естественных лигандов с помощью метода деградации Эдмана и тандемной масс-спектрометрии (8сЫт1е 2001). Эти матрицы позволяют точное прогнозирование пептидов из заданной белковой последовательности, презентированной на молекулах МНС I или II класса (Воΐζзсйке 1991).

- 26 013466

Таблица 4

Антиген	Аллель 1Я1В1*
0101 (8,8%)	0301 (6,1%)	0401 (21,3%)	0701 (13,0%)	1101 (8,7%)	1501 (п.а.%)
ΙΜΑ-	35	18	20	14	26	20
ММР-
001

Табл. 4. Показатели связывания [МА-ММР-001 с распространенными аллелями НЬА-ЭК.

Приводятся показатели связывания по 8ΥБРЕIТНI для ^А-ММР-001 для наиболее распространенных аллелей НЬА-ЭКВ1 среди европеоидного населения. Частота встречаемости соответствующих серологических гаплотипов НЬА-А2-положительных европеоидов дана в скобках. Пептид рассматривался как связывающийся с молекулой НЬА, если показатель был равен или выше 18.

Основываясь на алгоритме прогнозирования 8ΥБРЕIТНI, ГМА-ММР-001, скорее всего, связывается с несколькими аллелями НЬА-ЭК (0КВ1*0101, *0301, *0401, *1101 и *1501), покрывая по крайней мере 69,6% НЬА-А2-положительной европеоидной популяции. Так как данные по частотности НЬА-ЭК15 не доступны, этот аллель не был включен в расчеты. Таким образом, велика вероятность того, что покрытие населения даже выше, чем 69,6%. Экспериментальное подтверждение беспорядочного связывания ГМАММР-001 получено с помощью данных по иммуногенности ш νίΙΐΌ (см. ниже).

Сравнение экспрессии антигена и презентация полученного пептида на опухолевой и аутологичной нормальной ткани

Полагается, что гиперэкспрессированные антигены гиперэкспрессированы на молекулах НЬА на их клеточной поверхности. В отдельности было показано, что пептид НЬА-А*03, полученный из Адипофилина, гиперэкспрессированного антигена, из которого получены НЬА-А*02 пептиды [МА-А^Б-001 и [МА-А^Б-002. содержащиеся оба в ЕМА, высоко гиперэкспрессирован на ткани почечно-клеточной карциномы по сравнению с аутологичной нормальной тканью пациента КСС100, применяя стратегию риАМТЕА. Это демонстрирует в этом отдельном случае, что гиперэкспрессия антигена (в данном случае Адипофилина) соотносима с гиперэкспрессией полученных из того же антигена пептидов.

Детально этот метод описывается у Еет1пе1 2004. риАЫТЕА представляет собой стратегию для дифференциальной количественной оценки НЬА-элюированных пептидов из опухолевой и нормальной ткани. НЬА лиганды, полученные из двух различных источников, дериватизированы по Ν-терминальной области ¹Нх - или ²ΌΧ -реагентом и скомбинированы. После снижения сложности пептидов при высокоэффективной жидкостной хроматографии пептиды получили количественную характеристику анализом Е8ЕМ8 в соответствии с их пиковыми областями. Пара дериватизированных пептидов (¹Нхдериватизация и ²Пх-дериватизация) является физико-химически идентичной и легко обнаруживаемой, так как она обязательно коэлюируется в хроматографических системах. В дальнейшем существует константная разница в массе, зарегистрированная масс-спектрометрическим сканированием. Эта разница зависит от числа стабильных изотопов в производном. Идентификация последовательностей лиганда показывается анализом Е8ЕМ8М8 и компьютерным поиском записанного спектра в банке данных. Таким образом, этот анализ обеспечивает информацией о качественных и количественных аспектах презентации пептидов на опухолевой и нормальной ткани.

Пример дифференциальной презентации пептида НЬА на опухолевой и нормальной ткани гиперэкспрессированного антигена представлен на фиг. 8. Пептид ЕМА-АПБ-003, гиперпрезентация которого на опухолевой ткани была в 4 выше, чем на здоровой ткани почки пациента КСС100, был идентифицирован анализом индуцированного столкновением масс-спектра затухания среди множества равно презентированных пептидов. Этот гиперпрезентированный на опухолевой ткани пептид был получен из Адипофилина. Анализ генной экспрессии того же пациента КСС100 показывает также в 2,64 раза большую гиперэкспрессию Адипофилина в этой опухолевой ткани по сравнению со здоровой почкой (данные не приводятся). Эти данные подтверждают в этом конкретном случае, что гиперэкспрессия в опухолевой ткани на генном уровне ведет к пептидной гиперпрезентации на поверхности опухолевой клетки.

Иммуногенность ΐη νΐνο к ΙΜΑ-ΑϋΕ-001

В аутологичные дендритные клетки (ИСк), полученные от пациентов с КСС, импульсным способом были введены два пептида ТИМАР, полученных из МИС, среди них был IМА-МυС-001. ^А^ОБ-ШИ в вакцинации не применялся. Вакцинации производились к.с. по четыре раза каждые две недели и повторялись ежемесячно до прогрессирования опухоли. После пятой инъекции ОС пациенты получали дополнительно 3 инъекции в неделю низкой дозы ИЛ-2 (1 млн ЕЕ/т2) к.с. За активацией предшественника Тклетки наблюдалось с помощью оборудования Ш^гамма ЕЕ18Р0Т. Кроме индукции Т-клеток против двух пептидов вакцинации была установлена активность также против нескольких других известных ТИМАР-пептидов, среди них - [МА-А^Б-001.

Результаты были представлены в презентации Д-ра наук Петера Броссарта (Ре!ег Вгоккай) (из Университета Тюбингена) на ежегодной встрече Американского общества клинической онкологии (А8С0) 2005, полная презентация опубликована на веб-сайте А8С0. У двух пациентов (р! #8 и р! #13) после вак

- 27 013466 цинации двумя пептидами МИС, введенными импульсным способом в аутологичные ЭСз, был обнаружен Т-клеточный иммунитет к другим пептидам, отличающимся от вакцинированных (фиг. 9). Так как этого иммунитета не было в наличии до вакцинации, то, скорее всего, что такие Т-клетки были индуцированы распространением эпитопов. Распространение эпитопов может происходить, если опухолевые клетки разрываются (например, при некрозе, лизисе, вызванном индуцированными вакциной Т-клетками итд.) и высвобождают антигены, которые затем поглощаются антигенпрезентирующими клетками (АПК, например, дендритные клетки). Эти АПК могут затем процессировать антиген внутриклеточно и презентировать Т-клеточный эпитоп (т.е. ТИМАР-пептид) для примирования Т-клеточных ответов. Эти данные подчеркивают потенциально важную роль ГМА-АПЕ-001 как встречающегося в естественных условиях Т-клеточного антигена.

II. Приготовление и применение вакцины «ГМА» в соответствии с изобретением.

ГМА является вакциной, содержащей комплекс опухолеассоциированных пептидов, которые расположены и были идентифицированы на первичных клетках почечного рака. Этот комплекс включает пептиды НЬА класса I и II. Пептидный комплекс содержит также один пептид из корового антигена НВУ, используемый в качестве пептида для положительного контроля, служащий как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. При вакцинации пептидом, в общем, необходим адъювант, так, ГМ-КСФ будет использован в качестве адъюванта в этой схеме вакцинации (человеческий ГМ-КСФ имеется в продаже под названием 8атдтатозйт, Ьеикте®, Вег1ех).

из 10 опухолеассоциированных пептидов, содержащихся в £МА, были идентифицированы с помощью технологии ХРЕЕБГОЕХТ, описанной ниже. Поэтому для этих пептидов естественная презентация в контексте молекул НЬА, экспрессированных опухолью, имеет прямое доказательство. Пептиды ПМА-МиС^ и IМА-ССN-001 были идентифицированы с применением других технологий. Для двух последних пептидов: естественная презентация этих пептидов опухолевыми клеточными линиями демонстрируется, основываясь на косвенных доказательствах из анализа иммуногенности ш ν 11го (см. ниже).

Принципы теста

Молекулы НЬА из подвергнутой шоковой заморозке процессированной первичной ткани почечноклеточной карциномы были очищены, и были изолированы НЬА-ассоциированные пептиды. Эти пептиды либо разделяются в оффлайновом режиме методом ВЭЖХ, а фракции анализируются, или же анализ последовательности производится масс-спектрометрией в интерактивном режиме методами ВЭЖХтандемная масс-спектрометрия. Полученные последовательности проверяются синтезом идентифицированных пептидов и сравнением фрагментационных спектров идентифицированных и синтезированных пептидов. Так как идентифицированные пептиды непосредственно получены из молекул НЬА первичных опухолей, то эти результаты дают прямое доказательство естественного процессирования и презентации идентифицированных пептидов на первичной ткани почечно-клеточной карциномы.

Метод

Детально этот метод описывается в работе (Уешзсйепк 2002). Вкратце, подвергнутые шоковой заморозке пробы пациентов, полученные из Департамента Урологии Университета Тюбингена (одобрено местным этическим комитетом), были лизированы, молекулы НЬА были очищены афинной хроматографией с использованием НЬА класса ^специфического антитела У 6/32 или НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2 или (в случае IМА-ММР-001) НЬА-ЭЕ-специфического антитела Ь243. НЬАассоциированные пептиды были элюированы обработкой кислотой и изолированы из белка МНС с альфа-цепью ультрафильтрацией. Изолированные пептиды были либо разделены в оффлайновом режиме обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографией, а фракции проанализированы наноэлектроспрей масс-спектрометрией на гибридном квадрупольном время-пролётном тандемном массспектрометре с ортогональным ускорением ионов (Ц-ТОЕ I или Ц-ТОЕ ИШта, Уа!егз), или же был произведен анализ в интерактивном режиме ЖХ-МС/МС с использованием той же техники. Холостой ход использовался всегда для гарантии того, что система чиста от пептидов. Калибровка приборов производилась по крайней мере раз в день, также с надлежащей периодичностью проводились анализы стандартных соединений для гарантии оптимальной работы систем. Интерпретация фрагментационных спектров производилась вручную. Проверка анализа производилась поиском в банке данных и твердофазным синтезом предполагаемой пептидной последовательности и сравнением фрагментационных спектров идентифицированного и синтезированного пептидов. Все пептиды, содержащиеся в ЕМА (данные не приводятся), исключая ПИА-МИС^ и IМА-ССN-001, были идентифицированы в идентичной форме, подтверждая естественную презентацию этих пептидов на первичной ткани почечно-клеточной карциномы.

Ингредиенты ΙΜΑ

Пептиды для этой клинической разработки синтезируются стандартным и общепринятым способом Етос. Очищение производится препаративной ВЭЖХ и ионным обменом. Особенно важно, что принадлежность и чистота пептидов могут быть легко определены, причем с высокой точностью, с помощью масс-спектрометрии и ВЭЖХ. Композиция IМА состоит из 11 отдельных лекарственных веществ, которые более детально описываются ниже.

- 28 013466

Таблица 5. Антигены в 1МА

	Название пептида	Тип	Антиген	Распространенные акронимы и синонимы
1	ΙΜΑ-ΑϋΕ001	тимАРпептид I класса	Адипофилин	связанный с дифференциацией жировой белок, ΑϋΚΡ
2	ТМА-АОР002	тимдрпептид I класса	Адипофилин	см. выше
3	ΙΜΑ-ΑΡΟ001	ТиМАРпептид I класса	Аполипопротеин Е1	АРОЫ
4	1МА-СС1Ч- 001	ТиМАРпептид I класса	Циклин Ш	СС15ГО1, РКАО1, паратиреоидный аденоматоз 1, ВСЬ-1
5	1МА-оис- 001	ТОМАРпептид I класса	ОиСУ1АЗ	гуанилатциклаза 1растворимая-альфа 3
6	ΙΜΑ-Κ67001	тимАРпептид I класса	ΚΙΑΑ0367
7	ΙΜΑ-ΜΕΤ- 001	ТиМАРпептид I класса	С-ШС1 протоонкоген	МЕТ, НОГ (фактор роста гепатоцитов) рецептор, НОГЕ.
8	1МА-мис001	ТиМАРпептид I класса	мис1	муцин, С13227, эписиалин, эпителиальный мембранный антиген
9	ΙΜΑ-Β.Ο8001	ТиМАРпептид I класса	К.08-5	регулятор сигналов О-белка 5
10	ΙΜΑ-ΜΜΡ001	тимлрпептид II класса	Матричная металлопротеиназа 7	ММР7, матрилизин, утерин
И	ΙΜΑ-ΗΒν- 001	Виральный контрольный пептид	Коровый антиген НВУ	НВс, НВсА§, сА§

Все пептиды синтезированы по твердофазной методологии Ртос и очищены ВЭЖХ и хроматографией ионного обмена до чистоты в >95%. Правильность структуры определялась аминокислотным анализом и масс-спектрометрией.

Таблица 6. Физико-химические характеристики пептидов в 1МА

	Название пептид»	Длина пептида (№ амннокнс лот)	Молекулярная масса (г/м ОЛЬ нетто)	Форма соли	Физическая форма	Растворимость (прозрачный и бесцветный раствор 1 мг/мл)	Гигроскопичность
1	ΙΜΑΑϋΓ-001	9	833,9	Ацетатная соль	Белый до сероватобелого порошок	10% уксусная кислота	Хранится как замороженный сухой порошок. Лиофилизованные пептиды, в основном, имеют гигроскопичные свойства 1
2	ΙΜΑΑϋΓ-002	9	954,1	10% уксусная кислота
3	ΙΜΑ- АРО-001	9	900,0	вода
4	1МА- ССЙ-001	9	954,2	50% уксусная кислота
5	ΙΜΑсис-οοι	9	834,0	90% уксусная кислота
6	ΙΜΑ-Κ67- 001	9	984,1	20% уксусная кислота
7	ΙΜΑМЕТ-001	9	1006,2	10% уксусная кислота
8	ΙΜΑмис-оо1	9	921,0	10% уксусная кислота
9	ΙΜΑ-Κ68- 001	9	924,1	вода
10	ΙΜΑ- ММР-001	16	1836,1	вода
11	ΙΜΑΗΒν-001	10	1155,3	10% уксусная кислота

Лекарственный препарат 1МА, представленный в качестве лиофилизата для внутрикожного введения, содержит 11 пептидов - 578 мкг каждого пептида - в форме их солей (ацетаты). Для введения фор

- 29 013466 мулы клинического испытания пациентам порошок для инъекции, содержащий 578 мкг каждого пептида, растворяется в 700 мкл гидрокарбоната натрия (4,2%). После восстановления раствора 500 мкл (равняется разовой дозе в 413 мкг каждого пептида на инъекцию и общей разовой дозе в 4,5 мг ГМА на инъекцию) вводятся внутрикожно.

Таблица 7. Другие ингредиенты в !МА

Вода для инъекции*	Растворитель	В соответствии с Европейской фармакопеей (ЕФ).
Уксусная кислота*	Растворитель	В соответствии с (ЕФ).
Нитроген*	Инертный газ	В соответствии с (ЕФ).

* удаляются во время производства

Качество [МА гарантируется как при использовании активных веществ, так и инертных носителей, которые соответствуют требованиям ЕФ.

Иммуногенность ΐη νίίτο пептидов, содержащихся в ΙΜΑ

В РМА содержатся 9 опухолеассоциированных пептидов НЬА I класса, 1 опухолеассоциированный пептид НЬА II класса и 1 виральный контрольный пептид НЬА I класса. Иммуногенность 1п νίΙΐΌ могла быть продемонстрирована для подавляющего большинства пептидов, содержащихся в РМА.

Иммуногенность 1п νίΙΐΌ была продемонстрирована для 8 из 10 последовательностей НЬА I класса, содержащихся в РМА, используя, в основном, два Т-клеточных анализа: А) цитотоксическое уничтожение клеток-мишеней в анализе с высвобождением хрома и/или В) обнаружение Т-клеток тетрамерами НЬА. Эти анализы демонстрируют доказательство присутствия специфических клеток-предшественников в крови НЬА-А*02-положительных доноров в равной степени, как и способность таких специфических Т-клеток уничтожать клетки-мишени. Как и в последующем случае распознаются несколько опухолевых клеточных линий, эндогенно экспрессирующих антиген. Это служит дополнительным (непрямым) индикатором естественной презентации использованных пептидов на опухолевых клетках и показывает, что цитотоксические Т-клетки, полученные при использовании этих пептидов имеют сильную авидность к распознаванию опухолевых клеток. Иммуногенность 1п уйго была продемонстрирована для пептида НЬА II класса IМА-ММР-001, содержащегося в IМА, с использованием внутриклеточного окрашивания цитокинов в проточной цитометрии (см. ниже).

Таблица 8. Обобщение данных об иммуногенности 1п νίΙΐΌ пептидов, содержащихся в ^А

#	Название пептида	Иммуногенность ΐη νίίτο	Литература
1	ΙΜΑ-ΑϋΡ-001	Анализ на киллерные клетки	δοϊιιηίάΐ с! ак, 2004
2	ΙΜΑ-ΑϋΡ-002	Тетрамерная детекция	не опубликовано
3	ΙΜΑ-АРО-001	не определено	не опубликовано
4	ΙΜΑ-ΟΌΝ-ΟΟΙ	Анализ на киллерные клетки (аллогенные Т-клетки)	Забоушкоуа е! ак, 1998
5	ША-оис-οοι	не определено	не опубликовано
6	ΙΜΑ-Κ67-001	Тетрамерная детекция	не опубликовано
7	ΙΜΑ-МЕТ-001	Анализ на киллерные клетки, окрашивание цитокинов, тетрамерная детекция	8сйа§ е! а!., 2004
8	1МА-мис-оо1	Анализ на киллерные клетки, высвобождение цитокинов	Вгоззаг! е1 ак, 1999
9	ΙΜΑ-Κ68-001	Тетрамерная детекция	не опубликовано
10	ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	Окрашивание цитокинов	не опубликовано
11	ΙΜΑ-ΗΒΥ-001	Анализ на киллерные клетки	ΨβηίννΟΓίΙι е1 ак, 1995

Анализ на киллерные клетки цитотоксическое уничтожение мишеней, измеренное анализом с высвобождением хрома; Высвобождение цитокинов: высвобождение цитокинов Т-клеток измерялось методом ЕЫ8А; Окрашивание цитокинов: синтез цитокинов Т-клетками измерялся внутриклеточной проточной цитометрией; Тетрамерная детекция: детекция пептид-специфических Т-клеток тетрамерами НЬА.

Иммуногенность ΐη υϊΙιό пептидов НЬА I класса, содержащихся в ΙΜΑ ^А содержит 10 пептидов, связывающихся с НЬА I класса. Чтобы проверить пептиды на их иммуногенность 1п уйго, были получены СЭ8-положительные цитотоксические Т-клетки из аутологичных моноцитов периферической крови (МПК) от здоровых доноров с использованием отдельных пептидов, содержащихся в РМА, а активность этих цитотоксических Т-клеток контролировалась анализом с высвобождением хрома и детекцией Т-клеток тетрамерами НЬА в поточной цитометрии. Подробные данные представлены для одного отдельного пептида (IМА-МЕТ-001) для обоих методов, данные для других

- 30 013466 пептидов обобщаются в табл. 8. выше.

На первой стадии генерируются (примируются) ш уйго цитотоксические Т-клетки при повторной стимуляции моноцитов периферической крови (МПК) здоровых НЬА-А*02-положительных доноров специфическим пептидом. являющимся объектом теста. Примирование может быть произведено также с использованием аутологичных дендритных клеток. полученных из моноцитов крови донора. или нагруженных тетрамером гранул НЬА.

A. Цитотоксическое уничтожение мишени.

На второй стадии цитотоксичность таких примированных цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) проверяется маркировкой клеток-мишеней радиоактивным хромом и инкубацией клеток-мишеней с полученными ЦТЛ. Количество радиоактивного хрома. высвободившегося в супернатант. может быть соотнесено напрямую с пропорцией уничтоженных клеток-мишеней.

B. Детекция Т-клеток тетрамерами НЬА.

Альтернативно на второй стадии примированные ЦТЛ со специфичностью для заданного пептида детектируются с использованием тетрамеров НЬА. Тетрамеры состоят из четырех нагруженных пептидом молекул НЬА-А*02. соединенных друг с другом. Эти конструкции позволяют произвести специфическую маркировку родственного Т-клеточного рецептора. распознающего НЬА-пептидный комплекс в тетрамере и при маркировке тетрамера флуорохромом с последующим анализом проточной цитометрией (ЕАС8).

Примирование цитотоксических Т-клеток дендритными клетками

Для возбуждения ЦТЛ в 5х10⁵ ОС было введено импульсным способом 50 мкг/мл синтетического пептида ГМА-МЕТ-001 на 2 ч. потом их промыли и инкубировали с 2.5х10⁶ аутологичных МПК в среде ВР10. После 7 дней культивации клетки были рестимулированы аутологичными МПК с введенным импульсным способом пептидом. и 1 нг/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (Κ&Ό 8ук1етк) добавлялся в 1. 3 и 5 день. Цитотоксическая активность индуцированных ЦТЛ анализировалась на 5 день после последней рестимуляции стандартным способом с хромом-51(Вгоккаг1 1999) (см. ниже).

Примирование ΐη уйго цитотоксических Т-клеток нагруженными тетрамером гранулами

Примирование ш уйго производилось. как было указано ранее (^а1!ег 2003) или с минимальными модификациями. Вкратце. биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201. в которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи. были получены. как описывалось ранее (А1!тап 1996). Очищенный костимулированный мышиный ^С2а к антителам человека СЭ28 АЬ 9.3 (1ипд 1987) был химически биотинилирован с использованием сульфо-№гидроксисукцинимидобиотина в условиях. рекомендуемых изготовителем (РегЬю 8с1епсе. Вопп. Германия). Использованные микросферы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами с диаметром 5.60 мкм со связывающей силой в прибл. 0.06 мкг биотин-НТС/мг микросфер (Вапдк ЬаЬога!опек. ЕйНегк. Шшой/США). Для работы с микросферой использовался стерильный буфер РВ8/В8А/ЕЭТА. Для соединения с биотинилированными молекулами микросферы промывались и ресуспендировались в 2х10⁶ частиц/мл в буфере. содержащем биотинилированный МНС и/или антитела в различных концентрациях. Связывание было возможно при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Покрытые гранулы промывались три раза. ресуспендировались в указанном выше буфере и хранились до 4 недель при 4°С до использования.

МПК изолировались из свежей лейкоцитарной пленки с использованием стандартной среды для градиентного разделения (Ьтапк. ХУейНепп-Веийщеп. Сегтапу ог РАА ЬаЬога!опек. йт/. Австрия). При необходимости незатронутые СЭ8 Т-клетки были магнетически обогащены негативной элиминацией с использованием оборудования по изоляции СО8 Т-клеток (М11!епу1 Вю!ес. ВегщксН С1абЬасН. Германия) в соответствии с предписаниями производителя. результатом чего была чистота СО8-положительных ТКР-положительных клеток в более чем 80%. Стимуляции ш уйго были инициированы в 24-луночных планшетах с 5х10⁶ реактивных клеток плюс 1х10⁶ АПК или микросфер на лунку в 1.5 мл Т-клеточной среды. Если не указано иного. 5 нг/мл человеческого ИЛ-12 р70 (Κ.&Ό) добавлялось вместе с АПК или микросферами. После 3-4 дней коинкубации при 37°С добавлялась свежая среда и 20 и/мл человеческого ИЛ-2 (Κ&Ό). а клетки затем инкубировались далее при 37°С в течение 3-4 дней. Этот цикл стимуляций повторялся дважды.

Уничтожение клеток-мишеней ЦТЛ при использовании теста с высвобождением хрома

Проводился стандартный анализ с хромом-51 в соответствии с описанием (Вгоккай 2001). В клеткимишени вводилось импульсным способом 50 мкг/мл пептида на 2 ч. и они помечались хроматом натрия ⁵¹Сг в среде ВР10 на 1 ч при 37°С. 10⁴ клеток были перенесены в лунку круглодонного 96-луночного планшета. Различное число ЦТЛ добавлялось для получения окончательного объема в 200 мкл. и проводилась инкубация в течение 4 ч при 37°С. В конце анализа супернатанты (50 мкл/лунка) были собраны и посчитаны на планшетном бета-счетчике. Процентно-специфический лизис подсчитывался как: 100х (экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение/максимальное высвобождениеспонтанное высвобождение). Спонтанное и максимальное высвобождение были определены в присутствии либо среды. либо 2% Тгйоп Х-100. соответственно. Антигенная специфичность лизиса опухолевых

- 31 013466 клеток определялась далее анализом ингибирования немечеными клетками-мишенями при анализе способности немеченых клеток Т2 с введенным импульсным способом пептидом блокировать лизис опухолевых клеток при соотношении 20:1 (ингибитор:мишень).

В. Детекция цитотоксических Т-клеток тетрамерами НЬА.

Окрашивание тетрамеров ш νίΙΐΌ производилось, как было указано ранее (^а1!ег 2003) или с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201, в которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены, как описывалось ранее (А1тап 1996). Флуоресцирующие тетрамеры были получены при ко-инкубации биотинилированного НЬА-А*0201 со стрептавидином-РЕ (белковый эквивалент) или стрептавидином-АРС (Мо1еси1аг РгоЬек, Ье1беп, Нидерланды) при соотношении 4:1, молярное соотношение. Для тетрамерного анализа клетки промывались в РВ8/В8А/ЕОТА, содержащем 10 мг/мл азида натрия (Мегск, Цагтк!аб!, Германия), и окрашивались при 4°С в течение 20 мин в том же буфере, содержащем антитела ΟΌ4-ΡΙΤΟ и СЦ8-РегСР клона 8К1 (оба из Вес!оп Оюкткоп). После экспериментов по стимуляции микросферой добавлялось 100 мкг/мл немеченого стрептавидина (81дта). Клетки промывались в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8), содержащем 2% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (РС8) (РΑN Вю!есб, А1бепЬасб, Германия), 2 мМ натриевой ЭДТУ (ЕЭТА) и 10 мг/мл азида натрия, и тетрамер окрашивался при 4°С в течение 30 мин в растворе РВ8/РС8/ЕЦТА/азид, но включающем 50% РС8. Тетрамерные реагенты использовались всегда при концентрациях МНС в 5 мкг/мл. Окрашенные клетки тщательно промывались в РВ8/РС8/ ЕЦТА/азид и обрабатывались 1% формальдегидом (Мегск). Клетки анализировались на четырехцветном сортере с активацией флуоресценции РАС8Са11Ьиг (Вес!оп Цюкткоп). Отдельные результаты рассматриваются детально для 1МА-МЕТ-001 по методу А, а также и по методу В. Результаты для других пептидов НЬА I класса обобщаются в табл. 8.

A. Цитотоксическое уничтожение мишени.

Результаты были опубликованы у 8сбад 2004. Релевантная информация обобщена ниже.

На первой стадии цитотоксичность индуцированных ЦТЛ была проанализирована стандартным методом с высвобождением хрома-51 с использованием нагруженных пептидом клеток Т2 и аутологичных ЭС в качестве мишеней. Как показано на фиг. 3, линия ЦТЛ, полученная после двухнедельных рестимуляций демонстрировала антигенспецифическое уничтожение. Т-клетки распознавали только клетки Т2 или ЦС, покрытые родственным пептидом, в то время как они не лизировали клетки-мишени с введенными импульсным способом нерелевантными НЬА-А2-связывающими пептидами, полученными из белка сурвивина или обратной транскриптазы Н1У-1, подтверждая специфичность цитолитической активности.

На второй стадии анализировалась способность индуцированных ш уйго ЦТЛ лизировать опухолевые клетки, экспрессирующие белок с-Ме! эндогенно, с использованием НЬА-А*02-положительных клеточных линий НСТ 116 (рак толстой кишки), А498, М2 1257 (почечно-клеточная карцинома, КСС), МСР-7 (рак груди), Ме1 1479 (злокачественная меланома) и И266 (множественная меланома), экспрессирующая с-Ме! как мишени при стандартном анализе с хромом-51. Трансформированная ЕВУ Вклеточная линия Стой (НЬА-2+/с-Ме!-) и клеточная линия рака яичников 8К-ОУ-3 (НЬА-А3+/с-Ме!+) инкубировались для определения специфичности и НЬА-рестрикции для ЦТЛ. Как показано на фиг. 4, ЦТЛ, специфические для пептида с-Ме!, были способны эффективно лизировать злокачественные клетки, экспрессирующие как НЙА-А2, так и с-Ме!. Не были распознаны раковые клетки яичника 8К-ОУ-3 или клетки Стой, демонстрируя, что презентация пептида с-Ме! в контексте молекул НЙА-А2 на опухолевых клетках необходима для эффективного лизиса клеток-мишеней, и подтверждая антигенспецифичность и МНС-рестрикцию ЦТЛ. Индуцированные ш У1!го Т-клетки не распознавали клетки К 562, указывая на то, что цитотоксическая активность не была опосредована ΝΚ-клетками.

Для дальнейшей верификации антигенной специфичности и МНС-рестрикции индуцированных ш У1!го линий ЦТЛ мы провели анализы ингибирования немечеными клетками-мишенями. Лизис клетокмишеней (и 266 и А 498) мог быть блокирован при анализе ингибирования немечеными мишенями. Добавление «холодных» (немеченых хромом-51) клеток Т2 с введенным импульсным способом родственным пептидом снижал лизис опухолевых клеток, причем клетки Т2 с введенным импульсным способом нерелевантным пептидом не проявляли никакого эффекта (фиг. 5).

B. Детекция Т-клеток тетрамерами НЬА.

Обогащенные СЭ8 Т-клетки одного здорового донора А*02+ были простимулированы 3 раза гранулами, покрытыми в присутствии 10 нМ СЭ28 АЬ плюс либо 10 нМ нерелевантного комплекса А*02 (левая секция), либо А*02, покрытым указанным антигеном (средняя и правая секция). Указанными антигенами были пептиды ЖУРМУАТУ из СМУ рр65 (\УП1к 1996), модифицированный пептид ЕЬАС1С1ЙТУ из Ме1ап-А/МАКТ-1 (Ка^акаш1 1994) и пептид 1МА-МЕТ-001. У всех Т-клеточных линий поверхность была окрашена антителом С08-РегСР АЬ, родственным тетрамером-РЕ (белковый эквивалент) (фиг. 6; левая и средняя секция) и нерелевантным А*02/1ЬКЕРУНСУ тетрамером-АРС (правая секция). Процентное отношение клеток тетрамера+ среди СЭ8-положительных лимфоцитов определено в каждой точке.

- 32 013466

Иммуногенность ΐη νΐίΓθ пептида ΙΜΑ-ΜΜΡ-001 НЬА II класса, содержащегося в ΙΜΑ

1МА содержит один пептид НЬА II класса из матричной металлопротеиназы 7, 1МА-ММР-001. Для проверки пептида на его иммуногенность ίη νίίτο и на его свойства по беспорядочному связыванию были генерированы СО4-положительные Т-клетки из аутологичных моноцитов периферической крови (МПК) здоровых доноров с различными генотипами НЬА с использованием пептида 1МА-ММР-001, и активность этих хелперных Т-клеток измерялась методом проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием цитокинов.

Сначала ίη νίίτο генерируются (примируются) цитотоксические Т-клетки при повторной стимуляции моноцитов периферической крови (МПК) здоровых доноров специфическим тестируемым пептидом в присутствии ИЛ-12.

Примирование производилось с использованием аутологичных дендритных клеток, полученных из моноцитов крови доноров. На второй стадии проверялась активность примированных СЭ4положительных Т-клеток, специфических для данного пептида, с помощью измерения выделения ΙΕΝγ при внутриклеточном окрашивании ΙΕΝγ с использованием флюоресцентно меченого антитела. Анализ проводился методом проточной цитометрии (ЕАС8).

Получение дендритных клеток (ИС»)

Человеческие ОСУ были приготовлены из МПК свежевзятой крови здоровых доноров. МПК были изолированы с помощью градиента плотности (Фиколл) (Ьутрйосу1е Зерагайоп Мейшш, РАА ЬаЬога1опе5 ОтЬН, РаксЫпд, Австрия). Полученные клетки были промыты, ресуспендированы в среде Х-Υίνο 15 с добавлением 50 и/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 2мМ Ь-Глютамина (В1о^УЧ1Пакег, Уепйегк, Бельгия) и высеяны с плотностью в 7х10⁶ клеток/мл. После 2 ч при 37°С адгезивные моноциты культивировались в течение 6 дней в среде Х-УЕ'о с 100 нг/мл СМ-С8Е (гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор) и 40 нг/мл ИЛ-4 (АЬЧттипоТоок, Гг1е8оу1йе, Германия). На 7^ой день незрелые ОСУ были активированы 10 нг/мл ΊΝΕ-ο (Κ&Ό Зуйетк, ^екЬайеп Германия) и 20 мкг/мл ро1уЦС) (81дта А1йпсй, 31ешйе1т, Германия) на 3 дня. Состояние дифференциации ОСУ исследовалось проточной цитометрией, зрелыми ОСУ были, преимущественно, СО 14-, СО40положительные, СО80-положительные, СО83-положительные, СО86-положительные и НБА-ОК+ (данные не приводятся).

Получение антигенспецифических СИ4-положительных Т-клеток

Для получения СО4-положительных Т-клеток 10⁶ МПК были простимулированы 2х10⁵ аутологичными ОСУ. После примирования каждые 6-8 дней производились рестимуляции замороженными аутологичными МПК. Для стимуляции в клетки вводилось импульсным способом 5 мкг/мл пептида на 90 мин. при 37°С, и клетки облучались (60 Оу; Оаттасе11 1000 Е111е, №гйюп [п1егпа(1опа1 Шс, ОпСапо, Канада). Клетки культивировались в 96-луночных планшетах (7 лунок на донора и пептид) в Т-клеточной среде: КΡМI 1640, содержащей НЕРЕЗ и Ь-глютамин (О1Ьсо, РаШеу, Великобритания) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки (РАА, Со1Ье, Германия), 50 и/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 20 мкг/мл гентамицина (Вю\У11Шакег) в присутствии 10 нг/мл ИЛ-12 (Рготосе11, Не1йе1Ьегд, Германия). После 3-4 дней ко-инкубации при 37°С добавлялась свежая среда с 80 и/мл ИЛ-2 (Рго1еикгп, СЫтоп Согрогайоп, Етег^-уШе, СА, США) и 5 нг/мл ИЛ-7 (Рготосе11). Анализы проводились после третьей и четвертой стимуляции внутриклеточным окрашиванием ΙΕΝγ.

Внутриклеточное окрашивание ΙΕΝγ

Замороженные МПК размораживались, промывались дважды в среде Х-Угуо 15, ресуспендировались при 10⁷ клеток/мл в Т-клеточной среде и культивировались в течение ночи для снижения неспецифической выработки ΙΕΝγ (Ртогеп/апо 2002). На следующий день в МПК вводилось импульсным способом 5 мкг/мл пептида в течение 2 ч, они промывались трижды средой Х-Угуо 15 и инкубировались с эффекторными клетками в соотношении 1:1 в течение 6 ч. Со1дС8Юр (Вес1оп О1ск1п8оп, Не1йе1Ьегд, Германия) добавлялся для заключительных 4 ч инкубации. Клетки анализировались с использованием комплекта СуЮПх/СуЮрегт Р1и§ (Вес1оп Оюкткоп) и СО4-ЕГТС- ЦттипоФой), ΙΕΝγ-РЕ- и антител СО8РегСР клон ЗК1 (Вес1оп Оюкшкоп). После окрашивания клетки анализировались на трехцветном сортере с активацией флуоресценции ΕΛΕ8Ε;·ι№ιιτ (ВесЮп Оюкгпкоп).

Для генерации антигенспецифических СО4-положительных Т-клеток и для проверки пептидов на беспорядочное связывание МПК 4 здоровых доноров с разными аллелями НЬА-ОК (фиг. 7), были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом. Для системы обработки данных для генерирования антигенспецифических СО4положительных Т-клеток выработка ΙΕΝγ была измерена проточной цитометрией. Т-клетки были проанализированы после третьей и четвертой стимуляции внутриклеточным окрашиванием ΙΕΝγ плюс окрашивание СО4-ИТС и СО8-РегСР для определения процентного выражения ΙΕΝγ-вырабатывающих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. Во всех экспериментах стимуляции с нерелевантным пептидом и без пептида производились в качестве отрицательного контроля. ΙΕΝγ-ответ рассматривался как положительный, если детекция ΙΕΝγ-вырабатывающих СО4-положительных Т-клеток была более чем в два раза выше в сравнении с отрицательным контролем. (Нойоп 2004). Нам удалось генери

- 33 013466 ровать в трех из четырех доноров СО4-положительные Т-клетки, специфически реагирующие на интересующий пептид (фиг. 7). Т-клеточные ответы не могли быть установлены у донора 4, ни после третьей, ни после четвертой стимуляции. Наиболее высокие частотности ΙΡΝγ-продуцирующих СЭ4положительных Т-клеток, специфических для пептида 1МА-ММР-001, были обнаружены у доноров 1 и 2, соответственно.

Таким образом, 1МА-ММР-001 является беспорядочно связывающимся пептидом, который был в состоянии вызвать СЭ4-положительные Т-клеточные ответы у трех из четырех здоровых доноров, имеющих различные аллели НЬА. В соответствии с прогнозами по связыванию и полученными результатами, скорее всего, пептид презентируется НЬА-ОЯВ1*0101, НЬА-ЭЯВ1*0401/*0408 и НЬАЭЯВ1*1101. Все четыре аллеля имеют глициновый остаток в положении 86 и остаток аспарагиновой кислоты в положении 57 их β-цепей (данные не приводятся). Поэтому они имеют очень похожие участки для связывания с похожими характеристиками для их связывающих карманов Р1 и Р4 (Яаттепкее 1997; Наттег 1993; Магкйай 1994). Донор 4 имеет аллели НЬА-ЭЯВ1*0318 и ЭЯВР1401 с сильно отличающимися участками связывания. Это может объяснить, почему было невозможно вызвать Т-клеточные ответы в клетках этого донора, используя упомянутые выше пептиды.

Влияние на человека

Короткие пептиды, сходные с описанными здесь по длине и распределению аминокислот, были введены тысячам пациентов во время различных фаз, с 1 по 3, клинических испытаний с 1996. Ни в одном из этих исследований не сообщается о серьезных побочных явлениях. К тому же пептид 1МА-МИС001, содержащийся в 1МА, был уже применен для вакцинации путем нагружения на дендритные клетки в рамках начатых исследователями испытаний в Университете Тюбингена в Германии и переносился пациентами очень хорошо (А1егеску 2005).

Пептиды с последовательностями 8Е0-ГО-№ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 были протестированы на 30 пациентах, 26 из которых прошли полный курс вакцинации в течение десяти недель. Большая часть пациентов, 74%, проявила специфический иммунный ответ против пептидных последовательностей, включенных в вакцину. Уже у этой небольшой когорты на фазе I могли быть подтверждены биологические функции ш у1уо 8 из 9 пептидов (8Е0-ГО-№ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), связывающихся с МНС класса I (аллель НЬА-А*02), в соответствии с результатами амиплифицированных анализов ЕЫ8РОТ и/или тетрамерного окрашивания, проведенными, как описывается ниже. Пептид с последовательностью 8Е0-Ш-№ 1 (1МАММР-001), для которого необходимы другие рамки считывания, не мог быть проконтролирован из-за недостатка МПК из крови пациента.

Специфические иммунологические параметры (иммуномониторинг)

До сих пор иммуномониторинг был распространенной практикой для тысяч пациентов в рамках различных исследований по терапевтической вакцинации (Яотего 2004). До сих пор сообщалось о многих различных методах иммуномониторинга, включая функциональные и специфические подходы. Иммуногенными компонентами терапевтической вакцины 1МА являются НЬА-связывающие пептиды. Предполагается, что они индуцируют специфические Т-лимфоциты ш у1уо. Эта активация приведет к их пролиферации и приобретению эффекторных функций, что включает их способность к секреции цитокинов при контактировании с антигеном.

В качестве заменителя маркера для Т-клеточной активации может быть протестирована частотность специфических мононуклеарных клеток в крови, секретирующих цитокины, с использованием анализа ЕЫ8РОТ. Такие анализы особенно подходят для этой цели, так как только они основаны на клетках и дают результаты в параметрах (т.е. число клеток, образующих ореол, среди мононуклеарных клеток), что, как ожидается, должно напрямую соотноситься с действительной частотностью секретирующих цитокины антигенспецифических Т-лимфоцитов в пробах крови. В этой связи анализы также позволяют процессинг относительно большого числа проб и пептидов параллельно. Они уже широко применялись для исследований по иммуномониторингу в большом количестве клинических исследований (8сйт1йе1 2000).

Иммунный ответ

Иммунологическая активность/эффективность может быть описана анализом Т-клеточного ответа. Опыт и результаты из различных клинических исследований в отношении иммунного ответа для различных показаний представлены в литературе. Т-клеточные ответы до 100% у пациентов с раком яичника и груди описываются в работе Όίκίκ е! а1., 1999. О распространении эпитопов у 84% пациентов (п = 64) в параллельном исследовании с 3-мя группами с антигеном Нег2/пеи плюс ГМ-КСФ сообщается у Όίκίκ е! а1. в 2002, пациенты с раком яичников, молочной железы и немелкоклеточным раком легкого. Другие авторы опубликовали результаты по Т-клеточным ответам, находящиеся в пределах 33% и 83% для пациентов с меланомой (Ке1Шо17/8сйайепйогГ, 2003; 81шд1ц£Г е! а1., 2004). Авторы Саийегпаск/Сг)ег1кеп, 2003 сообщают об иммунном ответе нескольких СЭ4-положительных и СЭ8-положительных Т-клеточных клонов, специфических для антигена, использованного в этом исследовании.

Также результаты были представлены в работе А1егеску е! а1., А8СО 2005: в аутологичные зрелые дендритные клетки из моноцитов (ЭС) были введены импульсным способом два связывающихся с НЬА

- 34 013466

Α2 пептида, выведенные из пептида МИС1. Для рекрутинга и активации СЭ4-положительных Т-клеток ОС инкубировались в дальнейшем со связывающими ΓΑΝ-ΌΚ пептидами РАЭКЕ. Вакцинации производились к.с. по четыре раза каждые две недели и повторялись ежемесячно до прогрессирования опухоли в этом терапевтическом подходе. После пятой инъекции ОС пациенты получали дополнительно 3 инъекции в неделю низкой дозы ИЛ-2 (1 млн. 1Е/т2). За активацией предшественника Т-клетки наблюдалось с помощью оборудования ΙΕΝ-γ ЕЫ8РОТ и анализов с радиоактивным хромом. Кроме того, способность МПК вырабатывать цитокины в ответ на вызов связанных с вакциной эпитопов контролировалась количественным ПЦР-анализом в реальном времени.

В исследовании ^1егеску е! а1. специфические Т-клеточные ответы на пептид МИС1 ίη у1уо были обнаружены в МПК всех пациентов с объективными ответами. Эти индуцированные ίη у1уо Т-клетки были способны распознавать клетки-мишени с введенным импульсным способом родственным пептидом или совместимыми аллогенными опухолевыми клетками (А498), конститутивно экспрессирующими МИС1 антиген- и ΗΕΑ-рестриктивным способом после рестимуляции ίη у1уо. У пациентов с реакцией на лечение могли быть установлены Т-клеточные ответы на антигены, не использованные для вакцинации, такие как адипофилин, теломераза или ОЕА, указывая на то, что может наблюдаться распространение эпитопа. Пролиферативный ответ на пептид РАЭКЕ был отмечен у 11 из 16 пациентов, у некоторых пациентов уже после 2^ой вакцинации. Заключение: анализ распространения эпитопов у вакцинированных пациентов может быть практическим параметром для соотношения клинических и иммунологических ответов.

Иммунные ответы ΐη νΐνο Композиция для клинических испытаний

Композиция для клинических испытаний ГМА состоит из лиофилизата, включающего 11 пептидов в ампулах по 3 мл; разбавителя (гидрокарбонат натрия 4,2%).

Формы дозировки ΙΜΑ

Порошок для инъекций в стеклянных ампулах по 3 мл. Информация об упаковке: по 4 ампулы упакованы в коробочки. Разбавитель состоит из 700 мкл гидрокарбоната натрия, упакованного в бутылки по 250 мл. 1 ампула !МА перерастворяется при добавлении 700 мкл раствора 4,2% гидрокарбоната натрия (разбавитель). Для растворения [МА ампула и разбавитель тщательно встряхиваются в течение 3 мин и обрабатываются ультразвуком 1 мин. Затем ампула снова встряхивается в течение 1 мин. 500 мкл этого раствора вводятся в течение 30 мин после восстановления.

Вакцинация

В рамках данного исследования пациенты с распространенной почечно-клеточной карциномой проходили вакцинацию восемь раз в течение десяти недель. В общем было задействовано 24 пациента с Η^Α-А*02-положительным ΗΕΑ-типом. Внутрикожная вакцинация (ГМ-КСФ плюс ЕМА) проводилась в 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36 и 64 день. Пробы крови брались в различные моменты времени во время исследования, и Т-клетки, содержащиеся в мононуклеарах периферической крови пациента (МПК), были изолированы из гепариновой крови градиентным центрифугированием с высокой плотностью, посчитаны с помощью гемоцитомеров и законсервированы для хранения при криогенной температуре до проведения анализов. С кандидатом были проведены два стандартных анализа по методике ЕШБРОТ и один стандартный тетрамерный анализ.

Амплифицированный анализ ЕЫ8РОТ

Для анализа по методике «ех у1уо ЕЫ8РОТ» клетки с различными датами получения размораживались, подсчитывалось число живых клеток, и пробы подвергались анализу однодневной инкубацией с различными пептидами или контролями в трипликатных лунках. Анализ ех у1уо по методике ЕЫ8РОТ предоставляет количественные данные намного быстрее, чем приведенные ниже анализы. Кроме того, это единственный метод, позволяющий измерение одного пептида ΗΕΑ ΙΙ класса (IΜΑ-ΜΜР-001), содержащегося в кМА. Однако этот анализ имеет ограниченную чувствительность, и положительные данные ожидались только в случае очень сильных Т-клеточных ответов в сравнении с иммунными ответами на вирусы из памяти (вторичными).

В «амплифицированном анализе ЕЫ8РОТ» клетки с различными датами получения объединяются, пересчитываются и предварительно стимулируются антигенами в течение приблизительно двух недель для обеспечения деления специфических клеток. Затем клетки извлекаются из культуры, снова пересчитываются и анализируются, как описано выше на точечную выработку ΙΕΝ-γ при однодневной рестимуляции антигеном. Клетки, активированные в таких условиях, секретируют ΙΕΝ-γ, который был обнаружен иммуноферментным сэндвич-методом для антител. Точки были визуализированы при реакции окрашивания и посчитаны с помощью автоматического цифрового фотоаппарата с высоким разрешением (называющегося здесь «ЕЫ8РОТ-ридер»). Число точек, соотносимое с действительной частотностью активированных антигенспецифических Т-лимфоцитов в пробе, определяется по алгоритму компьютерной программы с изображений, полученных ЕЫ8РОТ-ридером. Этот анализ часто использовался для выявления Т-клеточных ответов на введенные с вакциной опухолевые антигены в рамках проводимых

- 35 013466 третьими лицами различных клинических испытаний. Возможность ложных положительных данных в связи с Т-клеточным «примированием 1п т11го» исключена при использовании в этом анализе различных контролей. В сравнении с тетрамерным анализом, описанным ниже, этот анализ дает дополнительную целесообразную информацию, т.е. высвобождение цитокинов ΓΕΝ-γ.

Амплифицированный анализ ЕЫ8РОТ был применен для 28 пациентов во время исследования, и все антигены присутствуют в £МА до и во время курса вакцинации в различные моменты времени. На фиг. 10 представлены репрезентативные примеры ЕМА-индуцированного Т-клеточного ответа, выявленного амплифицированным анализом ЕЫ8РОТ для одного и того же пациента и антигена. Верхняя и нижняя колонка представляют отрицательный контрольный антиген ШУ-001 и отдельный ТИМАР £МАССЫ-001, использованный для считывания, соответственно. Дается число положительных клеток для каждого эксперимента. В левой колонке представлены анализы ЕЫ8РОТ объединенных проб до вакцинации, в то время как в правой колонке показаны анализы ЕЫ8РОТ объединенных проб во время курса вакцинации. В то время как контрольный антиген не вел к увеличению числа точек после индукции иммунного ответа, инъекция £МА вела к увеличению числа точек для £МА-ССЫ-001. Число положительных, т.е. ΣΕΝ-γ секретирующих клеток, выросло от 27-34 до вакцинации до 100-141 после четвертой и пятой инъекции. Лечение привело к росту частотности активированных Т-лимфоцитов, специфических для антигена ХМА-ССЫ-001 у этого пациента.

Амплифицированный тетрамерный анализ

В «амплифицированном тетрамерном анализе» клетки с различными датами получения размораживаются, пересчитываются и предварительно стимулируются антигенами в течение приблизительно двух недель для обеспечения деления антигенспецифических Т-клеток. Затем клетки извлекаются из культуры, снова пересчитываются и окрашиваются меченными РЕ- и АРС-флуорохромом МНС-мультимерами плюс антитела для определения СЭ8+ Т-клеток (одна лунка на окрашивание & момент времени). Мультимеры МНС являются рекомбинантными комплексами пептид-МНС, которые мультимеризованы и конъюгированы с флуоресцентным красителем. Использовались лишь тетрамерные мультимеры НЬАА*0201, которые полностью эквивалентны с первоначально представленными в этой области (А1ίтаии 1996), называемые здесь кратко «Тетрамерами». Окрашенные и обработанные пробы анализировались проточной цитометрией с использованием стандартной методики, хорошо известной из уровня техники, результатом был свод данных для каждой пробы, основанный на отдельных клетках. Этот «амплифицированный тетрамерный анализ» имеет очень высокую чувствительность, но является менее количественным в сравнении с анализами ех т1то.

Для первичного анализа тетрамерных данных электронным способом, используя статистические файлы цитометрии, с помощью имеющейся в продаже компьютерной программы подсчитывалось число всех оцененных СЭ8+ Т-клеток, одно-тетрамерные положительные и двух-тетрамерные положительные клетки на пробу. СЭ8+ Т-клетки были идентифицированы прямым и боковым светорассеиванием с установлением гейта для живых лимфоцитов и дополнительного гейта для явлений СЭ8+ СЭ3+, основанных на флуоресценции антитела. Определение гейта лимфоцитов и СО3/СЭ8 было идентичным для всех окрашиваний у одного пациента в рамках одного анализа. Тетрамер-положительные популяции были идентифицированы из СЭ8+ Т-клеток анализом двойных тетрамерных дот-плотов (точечный график) с квадрантами или гейтами. Определение тетрамер+ клетки было идентичным для каждого условия окрашивания для данного пациента в рамках одного анализа и базировалось на распознаваемых клеточных популяциях. Амплифицированный тетрамерный анализ был применен для 28 пациентов во время исследования, и все антигены присутствуют в IМА до и во время курса вакцинации в различные моменты времени.

На фиг. 11 представлены репрезентативные примеры IМА-индуцированных Т-клеточных ответов, выявленных амплифицированным тетрамерным анализом на основе изменения окраски. Верхние и средние изображения представляют двухмерные точечные графики с гейтом для СЭ3+ лимфоцитов, нижние изображения имеют гейты для СЭ3+ СЭ8+ лимфоцитов. Пациенты, точки времени и окрашивание были такими, как указано для каждой колонки. На фиг. 11А иммунологический ответ на IМА-ССN-001 у пациента 03-004, уже показанный анализом ЕЫ8РОТ (фиг. 10), был подтвержден тетрамерным анализом. Клеточная популяция, положительная для СЭ3+ и тетрамера IМА-ССN-001, была выявлена после четвертой и пятой инъекции ^А (У6+У7; среднее изображение), в то время как для тетрамера К67-001 положительных популяций обнаружено не было (верхнее изображение). IМА-ССN-001-положительные клетки увеличились с 0,03% до вакцинации до 0,78% лимфоцитов (У6+У7; нижнее изображение) после первых трех инъекций.

Пациент 03-003 не проявлял иммунологического ответа к пептиду КС8-001 (фиг. 11В; верхнее изображение), но вырабатывал IМА-ССN-001-тетрамерный положительный ответ во время схемы вакцинации (81+У1: пробы взяты до вакцинации; У4+У5: пробы взяты на 8 и 15 день; У6+У7: пробы взяты на 22 и 36 день; У8+ЕИ: пробы взяты на 64 день (последняя вакцинация) и после 85 до 92 дней; конец исследования). На среднем изображении, в колонке 3 и 4 показаны различные клеточные популяции, положительные для ΕΝΝ-001 и СЭ3+. Во время курса вакцинации количество этих клеток возросло с 0,02% до вакцинации до 0,8% лимфоцитов (нижнее изображение; колонка 3) после первых трех инъекций и сокра- 36 013466 тилось до 0,31% после 64 дня (нижнее изображение; колонка 4; ν8+Ευ).

Для выбранных пациентов амплифицированный тетрамерный анализ проводился для отдельных моментов времени, т.е. пробы крови не были объединены, позволяя более точную оценку Т-клеточной кинетики, пример которой приводится на фиг. 12. Наблюдаемая сила кинетики Т-клетки при амплифицированном тетрамерном анализе в отдельный момент времени приводится для пациента 05-001. Опухолеассоциированные антигены, представленные в £МА (пул ТиМАР), были наиболее высокими на 22, 36 и 64 день (ν6, ν7 и ν8), в то время как пик ответа на пептид IΜА-00N-001 был зарегистрирован ранее, на 22 день (ν6). Положительный контроль НВV-001 привел к еще более быстрому ответу, достигшему свой максимум на 15 день (ν5).

Два пациента с очень высокой отвечаемостью на IΜА-00N-001 были выбраны для подтверждения результатов амплифицированного тетрамерного анализа в неамплифицированном эксперименте. Эти тетрамерные анализы ех у1уо были проведены без культивации клеток в течение двух недель.

Результаты обобщаются в табл. 9 внизу. Представлены все подлежащие оценке результаты из ех У1уо тетрамер и пациент/антиген-совместимых амплифицированных тетрамерных анализов, где вакциноиндуцированный ответ был обнаружен при амиплифицированном анализе. Для метода «ех у1уо» указан % тетрамера+ среди общего числа 0Ό8+ Т-клеток. Что касается «амплифицированного стандартного» метода оценки, то могут быть проанализированы субпопуляции 0Ό8+ Т-лимфоцитов, вторая переоценка стандартных данных показана («амплифицированный, количественный») с расчетами, основанными на общем количестве 0Ό8+ Т-лимфоцитов. «Фактор амплификации» был рассчитан, если дискретная популяция тетрамер+ была увидена ех у1уо и при амплифицированном тетрамерном анализе.

Результаты отчетливо демонстрируют, что иммунологические ответы, измеренные амплифицированным тетрамерным анализом, не являются следствием клеточной экспансии во время двухнедельной инкубации, а основаны на предшествующих, «ех у1уо» лимфоцитах, присутствующих в крови пациента.

Таблица 9. Сравнение силы Т-клеточного ответа, посчитанного исходя из анализов ех у1уо и амплифицированного тетрамерного анализа

ПАЦИЕНТ	Шифр анализа	Момент времени	Метод	Антиген	% Тетрамер+ средн СВ8+ Тлпмфоцитов	Фактор амплификации
01-001	ТЕТ-0013/2 0060511а	82	ех νίνο	мис-οοι	0,003
01-001	ТЕТ-0013/2 0060511а	VI	ех νίνο	мис-οοι	0,004
01-001	ТЕТ-0013/2 0060511а	У4	ех νίνο	мис-οοι	0,007
01-001	ТЕТ-0013/20060511а	У5	ех νίνο	мис-οοι	0,003
01-001	ТЕТ-0013/20060511а	Уб	ех νίνο	мис-οοι	0,001
01-001	ТЕТ-0013/20060511а	У7	ех νίνο	мис-οοι	0,003
01-001	ТЕТ-0013/200605 На	V»	ех νίνο	мис-οοι	0,004
01-001	ТЕТ-0013/200605 На	ги	ех νίνο	мис-οοι	0,005
01-001	ТЕТ-0001/20060425а	32;У1	амплифицированный, стандартный	мис-οοι	2,976*
01-001	ТЕТ-0001/20060425а	У4;У5	амплифицированный, стандартный	мис-οοι	2,391*
01-001	ТЕТ-0001720060425а	У6;У7	амплифицированный, стандартный	мис-οοι	4,502*
01-001	ТЕТ-0001/20060425а	ν»;ρυ	ампл иф ицир ованны й, стандартный	мис-οοι	4,900*
01-001	ТЕТ-0001/20060425а	82;У1	амплифицированный, количественный	мис-οοι	3,044*
01-001	ТЕТ-0001/20060425а	У4;У5	амплифицированный, количественный	мис-οοι	2,485*
01-001	ТЕТ-0001720060425а	У6;У7	амплифицированный, количественный	мис-οοι	4,545*
01-001	ТЕТ-0001/20060425а	νδ;Ρϋ	амплифицированный, количественный	мис-οοι	5,037*
01-003	20060727а	VI	ех νίνο	ΗΒν-001	0,006
01-003	20060727а	У7	ех νίνο	ΗΒν-001	0,021*
01-003	ТЕТ-0007/20060510Ь	VI	амплифицированный, количественный	НВУ-О01	0,036*

- 37 013466

01-003	ТЕТ-0007/20060510Ь	Ϋ7	амп л иф ициро ванн ы й, количественный	ΗΒν-001	2,587*	123
01-003	ТЕТ-0007/20060510Ь	VI	амплифицированный, стандартный	ИВУ-001	(0,084*)
01-003	ТЕТ-0007/200605 ЮЬ	У7	амплифицированный, стандартный	НВУ-001	(5,186*)	(247)
01-009	20060727а	VI	ех νίνο	гССИ-001	0,010*
01-009	20060727а	У5	ёХ νίνο	гССИ-001	0,092*
01-009	20060727а	Уб	ех νίνο	гССК-001	0,052*
01-009	ТЕТ-0026/20060711а	V!	амплифицированный, количественный	ΤϋΜΑΡ Роо!#	0,051
01-009	ТЕТ-0026/20060711а	У5	амплифицированный, количественный	ТИМАР Роо1#	5,323*	58
01-009	ТЕТ-0026/20060711а	Уб	амплифицированный, количественный	Т1ГМАР РооИ	1,398*	27
01-009	ТЕТ-0026/20060711а	VI	амплифицированный, стандартный	ТиМАР Роо!#	(0,059)
01-009	ТЕТ-0026/20060711а	У5	амплифицированный, стандартный	ΤϋΜΑΡ Роо!#	(16,961*)	(184)
01-009	ТЕТ-0026/20060711а	Уб	амплифицированный, стандартный	ΤϋΜΑΡ Роо!#	(6.181*)	(И9)
»3-009	20060727а	VI	ех νίνο	гССИ-001	0,009
03-009	20060727а	V?	ех νίνο	гССИ-001	0,034*
03-009	ТЕТ-0015/20060531а	VI	амплифицированный, количественный	ΤϋΜΑΡ Ροοί#	0,124
03-009	ТЕТ-0015/20060531а	V?	амплифицированный, количественный	ΤϋΜΑΡ ΡοόΚ	7,521*	221
03-009	ТЕТ-0015/2006053 1а	VI	амплифицированный, стандартный	ΤϋΜΑΡ Ροοί#	(0,247)
03-009	ТЕТ-0015/2006053 1а	V?	амплифицированный, стандартный	ΤϋΜΑΡ Ροοί#	(18,953*)	(557)

* - дискретный тетрамер+ популяция обнаружена;

# - отдельный анализ стал отчетливым свидетельством, что ответы пула ТИМАР могли быть исключительно отнесены к гССИ-001.

Общая иммунологическая реактивность пациентов

Т-клеточные ответы, измеренные при анализах и описанные выше, оценивались для всех пептидов, содержащихся в 1МА, для 28 пациентов в различные моменты времени исследования. Пациент обозначался как «отвечающий», т.е. показывало индуцированный вакциной иммунный ответ, если одна из проб крови, взятая в момент времени после вакцинации, содержала тетрамер-положительные лимфоциты или секретированный ΙΕΝ-γ при стимуляции одним из пептидов.

Как и ожидалось, пациенты реагировали индивидуально на различные пептиды, содержащиеся в 1МА. Учитывая небольшое число пациентов, результатом стала неожиданно хорошая реактивность, так как большинство пациентов (23 из 27 подлежащих оценке пациентов) реагировали иммунным ответом по крайней мере на один из пептидов. 8 из 27 подлежащих оценке пациентов (30%) имели даже Тклеточный ответ на несколько пептидов ТИМАР.

Литература

АНтап ГО, Мозз РА, Сои1бег Р1, ВагоисН ИН, МсНеухег-\У|Шатз МС, Ве11 Л, МсМюНае1 А1, апб Иау1з ММ. РНепо1урю апа1уз1з о! апбдеп-зресШс Т 1утрНосу!ез. 8с1епсе 274:94-96 (1996).

Ароз!о1орои1оз У апб МсКеп/1е 1Р. Се11и1аг тистз: !агде!з !ог ттшпоШегару. Сп! Веу. 1ттипо1. 14:293-309 (1994).

Ват1аз А, СНогй М, ИеИуеИобз С, Тгаказ Ν, 8ко1апкоз А, Рго!одегои В, Ьедак1 8, Тзака1ои С, Татуак1з Ν, апб Э|торои1оз МА. Ргодпозбс з1дшПсапсе о! СА 125, СИ44, апб ерййейа1 тетЬгапе апбдеп т гепа1 се11 сагстота. Иго1оду 62:368-373 (2003).

Ватб ИЬ, Ьап М8, Ме1хдаг В8, апб Р1пп ОТ 8ресгйс, Ма)ог Н1з!осотра!1Ь11йу Сотр1ех-ипгез!пс!еб Весодшйоп о! Титог-Аззос1а!еб Мистз Ьу Нитап Су!о!охк Т-се11з. РNА8 86:7159-7163 (1989).

Ва!ез 8, ВопеПа Ь, МасА11ап Ό, Раггу Ό, Но1бег А, Июкзоп С, апб Ре!егз С. СГОК6 (РЛ8Т1ВЕ) апб СГОК4 (Р8К-13) аге а б1з!тс! зиЬзе! о! !1е сусйп-берепбеп! ктазез !1а! аззоаа!е \νί!1ι сусйп Ό1. Опсодепе 9:71-79 (1994).

ВеПтапп М, Уапбе ХУоибе СР, 01епез НР, апб 8с1игтасНег Р. Нера!осу!е дго\\1Н !ас!ог-збти1а!еб туаз1уепезз о! топосу!ез. В1ооб 95:3964-3969 (2000).

Вегдег М, Вегдегз С, Ато1б В, Наттегйпд С1, апб Сапзз В. Веди1а!ог о! С-рго!ет з1дпа1тд-5 тбис!юп 1п репсу!ез сотшбез \νί!1ι асбуе уеззе1 гетобейпд биппд пеоуазсЫапхаИоп. В1ооб 105:1094-1101 (2005).

Вепо1ей1 А, СЫзап РУ, Реппа А, Ст1Но1 8, Сак-ιΙί Ь, М1зза1е С, Ро^1ег Р, 8сЫюЬ! Ш, УШе11о А, СНезпи! ВС. Иейтбоп о! а т1шта1 орбта1 су!о!охю Т-се11 ерборе \νί11ιίιι !Не бераббз В У1гиз пис1еосарз1б рго!ет. I У1го1. 67:2376-2380 (1993).

В1аб! Р, В1е!йтасйег Ό, 1зептапп 8, Ади/ζί А, апб ВпсЬте1ег С. Еззепба1 го1е !ог !Не с-те! гесер!ог т !Не т1дга!юп о! туодешс ргесигзог се11з т!о !1е бтЬ Ьиб. №1иге 376:768-771 (1995).

Вогзе! М, 8е1бе1 С, Н)ог1Н-Напзеп Н, ХУааде А, апб 8ипбап А. ТНе го1е о! Нера!осу!е дго\\1Н !ас!ог апб 1!з гесер!ог с-Ме! т ти1бр1е туе1ота апб о!Нег Ь1ооб тайдпапаез. Ьеик. ЬутрНота 32:249-256 (1999).

- 38 013466

Войаго ЛР, ЕиЬш 18, Еа1е((о ЛЬ, Сйап АМ, Кт1ес1к ТЕ, Уапбе Уоибе СЕ, апб Аагопзоп 8А. ИепЕйсайоп оГ (йе йера(осу(е дго\\1й Гас(ог гесер(ог аз (йе с-те( рго(о-опсодепе ргобиск 8с1епсе 251:802-804 (1991).

Вгатйа11 8Е, Неор(о1етоз 1Р, 8(атр СУ, апб Ьетоте ИЕ. ТтЬа1апсе оГ ехргеззюп оГ та(йх те(а11орго(етазез (ММРз) апб йззпе тЫЬйогз оГ (йе та(пх те(а11орго(етазез (ГОМРз) ш йитап рапсгеайс сагапота. 1 РаШо1. 182:347-355 (1997).

Вгоззай Р, Нетпсй К8, 8(ий1ег С, Вейпке Ь, Ееюйагб( УЬ, 8(етапотю 8, Мийт А, Еаттепзее НС, Кап/ Ь, апб Вглддег У. оГ НЬА-А2-гезйю1еб Т-се11 ерйорез бегйеб Ггот (йе МИС1 (итог апйдеп Гог Ьгоаб1у аррйсаЫе тассте (йегар1ез. В1ооб 93:4309-4317 (1999).

Вгоззай Р, 8сйпе1бег А, Лй1 Р, 8сйаттапп Т, СгипеЬасй Е, Уй(йз 8, Кап/ Ь, Вийппд НЕ апб Вглддег У. Тйе ерййейа1 (итог апйдеп МиС1 1з ехргеззеб т йета(о1од1са1 тайдпапс1ез апб 1з гесодт/еб Ьу МИС1зресШс суГоГохк Т-1утрйосуГез. Сапсег Еез. 61:6846-6850 (2001).

Вгоззай Р, УпГйз 8, 8(ий1ег С, ЕеюйагбГ УЬ, Кап/ Ь, апб Вглддег У. Шбисйоп оГ су(о(о\1с Т1утрйосу(е гезропзез т тйо аГ(ег тасстайопз νίΐΒ рерйбе-рп1зеб бепбгШс се11з. В1ооб 96:3102-3108 (2000).

Вгстпег МЕ, 8тПй УУ, апб Саз(е1йапо АЬ. Маййузт-шйЬйог сотр1ехез: соттоп (йетез атопд те(а11орго(еазез. Вюсйепиз(гу 34:6602-6610 (1995).

Сао Υ, Кагз(еп и, 2егЬап Н, апб Ваппазсй Р. Ехргеззюп оГ МИС1, Тйотзеп-Епебепгеюй-ге1аГеб апйдепз, апб суГокегайп 19 ш йитап гепа1 се11 сагстотаз апб (иЬи1аг с1еаг се11 1езюпз. Уйсйо\уз Агсй. 436:119126 (2000).

Сйеп X, Шддтз Ь Сйеипд 8Т, Ь1 Е, Мазоп У, МопГдотегу К, Еап 8Т, тап бе ЕМ, апб 8о 8. Иоте1 епбо(йейа1 се11 тагкегз ш йера(осе11и1аг сагстота. Моб. Ра(йо1. 17:1198-1210 (2004).

Ле УЬ, 2йепд В, Пзсйег Т, Е1епко Е, апб Еащийаг МС. Тйе гедл1аГог оГ С рго1ет з1дпайпд Гатйу. Аппи. Еет. Рйагтасо1. Тохюо1. 40:235-271 (2000).

Ле1зо1 С, А1 8Т, Сайег КС, Сегбез Г 8сй\гаг(тд Е, Сатепт1еге Р, Е1да1-НидиеГ Е, ЕоЬей А, 8(е1п Н, апб Мазоп ЛУ. Соехргеззюп оГ ерййейа1 тетЬгапе апйдеп (ЕМА), К1-1, апб т(ег1епкт-2 гесер(ог Ьу апар1азйс 1агде се11 1утрйотаз. Л1адпозГгс та1ие т зо-са11еб тайдпапГ ШзйосуГоз1з. Ат. 1. Ра(йо1. 130:59-70 (1988).

Лепуз Н, Ле Уетег О, Ииздепз В, Копд Υ, 8с1о( Е, Ье АТ, Уап Лат К, йаб|б|/абей А, Те)раг 8, Магее1 М, А1тап В, апб Саззйпап Л. Штазюп апб ММР ехргеззюп ргой1е т безто1б (птопгз. Вг. 1 Сапсег 90:14431449 (2004).

Лезйрапбе А, 8ютзк1 Р, апб Нтбз РУ. Сусйпз апб сбкз т бете1ортеп( апб сапсег: а регзресйте. Опсодепе 24:2909-2915 (2005).

Л1 Ееп/о МЕ, Ойтего М, С1асот1ш А, Ройе Н, Сйаз(ге Е, Мйоззау Ь, Иогбйпдег

В, Вге(й 8, Войагб1 8, Сюгбапо 8. Отегехргеззюп апб атрййсайоп оГ (йе те(/НСЕ гесер(ог депе бийпд (йе ргодгеззюп оГ со1огес(а1 сапсег. С1т Сапсег Еез. 1:147-154 (1995).

ЛйГтапп 1, Ке11ег-Ма(зсйке К, Уетзсйепк Т, Кгай Т, Неск Т, Вескег НЛ, 8(етапот1с 8, Еаттепзее НС, апб СоийеГапдеаз С. СЛ8(+) Т-се11 гезропзе адатз( МЬС1-бептеб рерйбез т даз(гот(езйпа1 сапсег зпгтйогз. Сапсег Iттипο1 [ттипο(йе^. (2004).

Лопд С, Сйеп Ζ, Ь1 ΖΥ, Υей ИТ, Вапсгой СС, апб Уап УС. Нера(осу(е дго\\1й Гас(ог/зса((ег Гас(огтбисеб асйтайоп оГ МЕК апб РЙ3К з1дпа1 ра(й\гауз соп(пйп(ез (о ехргеззюп оГ ргоапдюдешс су(октез т(ег1епкт-8 апб тазси1аг епбо(йейа1 дго\\1й Гас(ог т йеаб апб песк зцпатопз се11 сагстота. Сапсег Еез. 61:5911-5918 (2001).

Лпсйа(еап РИ, РиШпдег СЕ, Сйо МН, Епд С, апб Капе ГР. Аройроргсйет Ь депе Гатйу: йззие-зресгйс ехргеззюп, зрйстд, ргото(ег гедюпз; б1зсотегу оГ а пе\\' депе. I. Ь1р1б Еез. 42:620-630 (2001).

Лпсйа(еап РИ, РиШпдег СЕ, Оге11апа ЕЕ, Кипйаке 8Т, Иауа-У1дпе I, О'Соппог РМ, Ма11оу М1, апб Капе ГР. Аройроргсйет Ь, а пе\у йитап Шдй бепзйу йроргсйет аройроргсйет ехргеззеб Ьу (йе рапсгеаз. [беη(^Г^са(^οη. с1ошпд, сйагасГей/айоп, апб р1азта б1зй1Ьийоп оГ аройроргсйет Ь. Г. Вю1. Сйет. 272:2557625582 (1997).

Лпреггау С, К1ет В, Липе ВС, Ζйапд X, Гоигбап М, Ропсе1е( Р, Еат1ег Е, Утсеп( С, ВгосШег Г, Ьепой С. РйепоГурю апа1уз1з оГ йитап туе1ота се11 йпез. В1ооб 73:566-572 (1989).

Еа1к К, Ео(/зсйке О, 8(етапот1с 8, Шпд С, апб Еаттепзее НС. А11е1е-зресГйс тойГз гетеа1еб Ьу зециепстд оГ зе1Г-рерйбез е1и(еб Ггот МНС то1еси1ез. ИаШге 351:290-296 (1991).

Ееггасш1 Е, Л1 Ееп/о МЕ, 8со(1апб| К, Ва1б1ш Ν, Ойтего М, ЬоШш Р, Сгетопа О, Сатрапасс М, апб Сотодйо РМ. Тйе Ме(/НСЕ гесер(ог 1з отег-ехргеззеб т йитап оз(еозагсотаз апб 1з асйта(еб Ьу еййег а рагасйпе ог ап аи(осппе сйсий. Опсодепе 10:739-749 (1995).

Е1пп ОГ, Геготе КЕ, Непбегзоп ЕА, Ресйег С, Лотепесй Ν, Мадапап-В1апбег Г, апб Ваггай-Воуез 8М. МИС-1 ерййейа1 (итог тист-Ьазеб 1ттипйу апб сапсег тасстез. Iттипο1. Еет. 145:61-89 (1995).

Е1зсйег Г, Ра1тебо С, топ КЕ, Видей Р, Ргауег-Са1ей1 Т, Радапо Е, апб Котасз С. Лирйсайоп апб отегехргеззюп оГ (йе ти(ап( а11е1е оГ (йе МЕТ рго(о-опсодепе т тиШр1е йегебйагу рарй1агу гепа1 се11 (итоигз. Опсодепе 17:733-739 (1998).

Епр1а К, Лепба К, Υататοΐο М, Ма(зито(о Т, Епрте М, апб Ватта Т. Ехргеззюп оГ МИС1 тистз 1птегзе1у согге1а(еб \\Пй роз(-зпгд1са1 зигтгта1 оГ гепа1 се11 сагстота райеп(з. Вг. Г. Сапсег 80:301-308

- 39 013466 (1999).

Еигде ΚΑ, Ζ1ι;·ιη§ УУ, αηά УаЫе Уоике СЕ. Ме( гесер(ог (угокте ктаке: епкаисеά Бдпакпд (кгоидк πάπ]}^ рго(етк. Оисодеие 19:5582-5589 (2000).

Еигде ΚΑ, К1е^11ск Ό, Ье Р, Уо М№, Еаиге М, Но\х1е(( ЛК, Б1ркоп КЕ, Уо1.ке СЕУ, αηά УеЬЬ СР. 8ирргеккюп оГ Κак-теά^аΐеά (итопдетску αηά те(ак(ак1к 1йгоидй 1иЬ1ЬШои оГ Не Ме( гесер(ог (угокте ктаке. Р№Л8 98:10722-10727 (2001).

Еигиуа М, №кк1уата М, К1тига 8, 8иуата Т, №1уа Υ, Йо Н, №1«^о Т, αηά Шикига Н. Ехргеккюи оГ геди1а(ог оГ С рго(ет ыдпаШид рго(ет 5 (КС85) ίη Не Нтоиг уаксикИиге оГ китаи гепа1 се11 сагстота. Г РаИо1. 203:551-558 (2004).

Сапе М, ΜадЬаииа Ζ, МсЭоппеН 8, Мс№ей Ь, ^ονей ОН, αηά Макгаап ЬМ. 8(гис(иге αηά ехргеккюи оГ Не йитаη депе Гог (ке та(пх те(а11орго(етаке та(п1укт. ί. Вю1. Скет. 269:2032-2040 (1994).

Се1к1ег 8, Τау1ο^-Раρаά^тй^^οи к ОиНд Т, КоИЬаМ к αηά Вигске11 ί. Α Ыдк1у кптиподетс гедюп оГ а китаи ро1утогрЫс ерйкека1 тист ехргек^ Ьу сагстотак 1к таάе ир оГ (агкет гереа(к. ί. ВюБ Скет. 263:12820-12823 (1988).

СкегаН1 Е αηά 8(окег М. Нера(осу(е дго\х(к Гас1ог--ксайег Гас(ог: ткодеи, то(одеп, αηά те!. Саисег Се11к 3:227-232 (1991).

Сййид Α, ВаПкоха к Вигске11 к Се1к1ег 8, С111е(( С, αηά Τау1ο^-Раρаά^т^(^^οи ί. Α соге рго(ет еркоре оГ (ке ро1утогрНс ерккейа1 тист άеΐесΐеά Ьу (ке тоиос1оиа1 аη(^Ьοάу 8М-3 1к ке1ес(к'е1у ехро^ ίη а гаиде оГ рптагу сагстотак. Ιη(. I Саисег 43:1072-1076 (1989).

Сигкку 8, Ο1ορаάе ΟΙ, αηά Ко\\'1еу ГО. НеиНгсайои оГ а 1.2 КЬ сО№Л ГгадтеН Ггот а гедюп ои 9р21 соттои1у άе1еΐеά ίη тиНр1е (итог (урек. Саисег Сепе(. Су(одепе(. 129:93-101 (2001).

На1аЬап К. Ме1аиота се11 аи(опотоик дго\х(к: (ке КЬ/Е2Е ра(к\хау. Саисег Ме(ак(ак1к Ку. 18:333-343 (1999).

Наттег к Уа1кактт Р, То1Ьа К, Во1т Ό, Н1де11и к Такаск В, αηά 81шдадйа Е. Рготщсиоик αηά а11е1екресШс аискогк ίη НБЛ-ЭК-ЬМтд рерМек. Се11 74:197-203 (1993).

ΗάΗι^ Υ, ^аνοοά^ Е, Коок С, БщпдЬегд В, αηά БтЛегд С. Сус1тГО1 ехргеккюи ίη китаи геиа1-се11 сагстота. Ιη(. к Саисег 84:268-272 (1999).

Ηίά НУ, Мо11 К, 8ск\хеНск Ι, Каск\\кх НК, αηά Кееиап ТУ. Αά^ρορк^1^и 1к а кресШс тагкег оГ 11р10 ассити1айои ίη Нускс се11 (урек αηά Нкеакек. Се11 Т1ккие Кек. 294:309-321 (1998).

Нойои Н, Кикке11 Ν, Мооге Е, Егапк Ι, Вауάο К, Нагеиаг-Паидк^ои С, Бее Ό, Эеегк М, Н^деик М, УеткоН К, αηά МсЕ1га(к Мк Согпе1айои Ье1геееи кКегГегоп-датта кесге(1оп αηά суИНхюйу, ίη ткиккресШс тетогу Т-се11к. к НГеск О1к. 190:1692-1696(2004).

кИекк1 БС, СкакгаЬойу С, αηά Ба1а РК. №(пс οx^άе-теά^а(еά рготойои оГ таттагу (итоиг се11 т1дгакои гесцНек кедиеийа1 асН'аПоп оГ пйпс οx^άе куПкаке, диаиу1а1е сус1аке αηά т^(οдеη-ас(^νа(еά рго(ет ктаке. Ιη(. I Саисег 106:496-504 (2003).

кадей Е., Υ. №ада!а, 8. Сщайс, Н. Уаάа, Е. 8(оскег1 к КагЬаск, Р. К. ОииЬаг, 8. Υ. Бее, Α. ИидЫиИ, Ό. кадей М. ЛгаЫ, С. КНег, У. Сеги^о1о, В. ОироН, Υ. Т. Скеи, Б. к Ο1ά, ηηά Α. КииН Мопйогтд ΟΌ8 Т-се11 гекроикек (о №Г-Е8О-1: согге1а(юаа оГ китога1 αηά се11и1аг 1ттиие гекроикек. Ргос. №1(1. Αсаά. 8сБ и. 8. Α. 97:4760 (2000).

йаскег М, СииИег Α, Οηά1 С, Еопайск С, Кгиедег С, 01ек1 У, αηά Текск Н. Тке Ме(/кера(осу(е дго\\1к Гас(ог гесер(ог (НСЕК) деие 1к о\'егехргек^ ίη коте сакек оГ китаи 1еикет1а αηά 1утркота. Беик. Кек. 18:7-16 (1994).

йааад С, Б^Ье((ег ΙΑ, αηά Ми11ег-ЕЬегкаМ Нк Мисйои оГ су(о(ох1сНу ίη геккаад китаи Т 1утркосу(ек Ьошк Го Итог се11к Ьу аηйЬοάу ке(егосоаа)ида(ек. Ргос. №1(1. Αсаά. 8сБ и. 8. Α. 84:4611-4615 (1987).

Ка^акат1 Υ, Екуаки 8, 8акадиск1 К, КоЬЬтк РЕ, Κίχ·Ό1(ίηί Б, УаааааеШ кК, Арре11а Е, αηά КокеиЬегд 8Α. Неаа(1Пса(юаа оГ (ке ^ттиηοάοт^ηаη( рер^ек оГ (ке МАКТ-1 китап те1апота апйдеп ^есοдπ^ζеά Ьу (ке та)оп(у оГ НБЛ-Л2-гек(пс^ (итог каП1(га(кад 1утркосу(ек. ί Ехр. Μеά. 180:347-352 (1994).

Кооскекроиг 8, кГГегк М, Ки1опд 8, Тау1ог С, КкпеЬегд Е, НаНкоаа ЕЛ, Кекаи кН, αηά Утке Уоике СЕ, Ме( αηά кера(осу(е дго\х(к Гас(ог/кса((ег Гас(ог ехргеккюи ίη китаи дкотак. Сапсег Кек. 57:5391-5398 (1997).

Кгаик 8, ЛЬе1 РО, №аск(тапп С, Бткептапп Нк Уе^άие^ У, 8(атр СУ, Скаиάка^у К8, Мкске11 8Е, Егапке ЕЕ, αηά Ба1ап1 е. МИС1 тист αηά (геГоП Гас(ог 1 рго(ет ехргеккюи ίη гепа1 се11 сагстота: согге1айои \νί(Η ргодиокк. Нит. РаИо1. 33:60-67 (2002).

Кигока^а Υ, Ма(оЬа К, №акатоп 8, Такетака Ι, №адапо Н, Оопо К, Итеккйа К, 8акоп М, Могкеп М, αηά Ка(о К. РСК-аггау депе ехргеккюи ргоГНид оГ кера(осе11и1аг сагстота. к Ехр. С11и. Саисег Кек. 23:135141 (2004).

Бетте1 С, Уе1к 8, ЕЬег1е и, Эепд|е1 к Кгай Т, Вескег НО, Каттеикее НС, αηά 8ΐеνаηον^с 8. Э1ГГегеийа1 ^иаη(^(а(^νе апа1ук1к оГ МНС 1^даиάк Ьу такк кресйотейу иктд к(аЬ1е 1ко(оре 1аЬе1тд. №1(. Вю(есйпо1. 22:450-454 (2004).

Бегоу X, Сорт МС, ОеНкте Б, Вшкте МР, ЛиЬей кР, Соккеки В, αηά Рогске! Ν. Ехргеккюи оГ китаи тист деиек ίη иогта1 Ыиеу αηά геиа1 се11 сагстота. Н1к(ора(йо1оду 40:450-457 (2002).

Бе\х ΌΓ ΌιιΗ У, αηά Κееά 8Ι. НоНЕои оГ (кгее иονе1 китап сускик Ьу гексие оГ С1 суски (С1и) Гиис

- 40 013466 йоп куеак!. Се11 66:1197-1206 (1991).

Ь1 С, 8ска1бег Н, 8а!уашоойку К, Напакатеа Υ, Наккшо!о К, апб Нег1уп М. Оотетедкайоп о! Есабкепп апб Оекшод1ет 1 Ьу акосйпе кера!осу!е дготек !ас!ог бпгтд те 1апота беуе1оршеп!. Опсодепе 20:8125-8135 (2001).

Ьк Т8, Скои 8Н, ХУапд Ь8, Ниапд НН, Скапд 8Е, 8кк ΆΥ, Скеп ΥΣ, Скеп ΟΥ, Нки СР, Нки ΝΥ, Скои МС, Кио 81, апб Скоте КС. Ехргекк1оп крес!га о! тарах шеТа11ор^о!е^πаκеκ к те1ак1айс поп-кта11 се11 1ипд сапсег. Опсо1 Кер. 12:717-723 (2004).

ЕаутдкЮп ВО, Стт С, Сгеу Н, Шиока С, Сккай Е^ Е1кек 1, Сгеу Н, Скекпи! КУ, апб 8е!!е А. Тке кераййк В у1гик-кресШс СТЬ гекропкек кбисеб ίπ китапк Ьу крорерРбе уасскайоп аге сотрагаЬ1е !о !коке еНсйеб Ьу аси!е У1га1 тТесйоп 1 ^шипок 159:1383-1392 (1997).

Ьобеп М, 8йдка11 М, №е1кеп ΝΉ, Коок С, Етбт 80, Ок!1ипб Н, апб ЬапбЬегд С. Тке сускп Ό1 кдк апб сускп Е кдк киЬдгоирк о! Ьгеак! сапсег: керага!е рактеаук ш !ишогодепек1к Ьакеб оп райет о! депейс аЬеггайопк апб тасйуайоп о! !ке рКЬ побе. Опсодепе 21:4680-4690 (2002).

Ьоике1атеп 1, ХУцкйгот Н, апб Нептипк! К. Iшйайоп-беνе1оршеп! шобеШпд о! а11ейс 1оккек оп скготокоте 9 ш иш1НГоса1 Ь1аббег сапсег. Еиг. 1. Сапсег 36:1441-1451 (2000).

Магк А8 апб Мапдкогпкапок М. В-се11 1утркота тагктд оп1у тейй апй-ерйке11а1 тетЬгапе апйдеп. Сапсег 63:2152-2155 (1989).

Магкка11 КУ, Ыи АЕ, Сапа1ек 1, Регака В, 1огдепкеп В, СагИхок КО, Адш1аг В, Эехаих В, апб Ко!кЬагб 1В. Ко1е о! !ке ро1ушогркс гейбиек к НЬА-ОК то1еси1ек к а11е1е-кресШс Ьтбтд о! рерйбе йдапбк. 1. Iттипо1. 152:4946-4957 (1994).

Маийк С, Кгрша Т, Ма РС, Скокк 8К, Ьт 1, 8карпо СТ, 8скае!ег Е, Т1Ьа1б1 Е, Локпкоп ВЕ, апб 8а1д1а К. Моби1айоп о! Тке с-Ме!/кера!осу!е дготеТй !ас!ог раТйтеау к кта11 се11 1ипд сапсег. С1к. Сапсег Кек. 8:620-627 (2002).

М|уахак| К, Найой Υ, Ишеккк Е, Уакиикки Н, апб Ишеба М. РипДсайоп апб скагас1еп/айоп о! ех!гасе11и1аг шаТ^^x-бед^аб^пд ше!а11орго!е1паке, шайк (ришр-1), кесге!еб !гош китап гес!а1 сагскоша се11 1ке. Сапсег Кек. 50:7758-7764 (1990).

М|/ппо К, Н1диск О, Ш1е 1Ν, апб Nакаши^а Т. Нера!осу!е дготе!к !ас!ог кйши1а!ек дготек о! кеша!оро1ейс ргодеткг се11к. Вюскеш. Вкркук. Кек. Соттип. 194:178-186(1993).

Мопа)е1к Н, Еоп!уп КО, Раппекоек Н, апб Ноггеуое!к А1. Тке аро11рорго!ек Ь депе с1ик!ег как етегдеб гесепЙу к еуокйоп апб 1к ехргеккеб к китап уакскаг йккие. Сепоткк 79:539-546 (2002).

Моп!екапо К, 8опапо IV, Майпба КМ, Ропсе МЬ, Вайсо А, КЛеттап НК, Войаго ОР, апб Аагопкоп 8А. О1!!егепйа1 еПссй о! кера!осу!е дготек !ас!ог 1ко!огшк оп ерйкейа1 апб епбо1кека1 йккодепейк. Се11 Сготек О1!!ег. 9:355-365 (1998).

Мой М, Веа!!у РС, Сгауек М, Воискег КМ, апб МШогб ЕЬ. НЬА депе апб кар1о!уре !гедиепс1ек к ке №г1к Ашейсап роркайоп: ке №копа1 Магготе Оопог Ргодгат Оопог Кедкйу. ТгапкркнИаРоп 64:10171027 (1997).

Мой 10 апб УегЬ Ζ. Кедкайоп о! ша!йх Ыо1оду Ьу шайгх ше!а11орго!е1пакек. Сигг. Орк. Се11 Вю1. 16:558-564 (2004).

Мие11ег МКУ1, Вгиддег У, Соийе!аидеаκ.С, Кап/ Ь, апб Вгоккай Р. Уасстакопк тейк рерйбе ри1кеб бепбййс се11к кбисек скп1са1 апб кттпо1од1са1 гекропкек к райеп!к тейк ше!ак!айс гепа1 се11 сагстота. Ргос Аш 8ос С1к Опсо1 22, 168. 1-6-2003.

Ке! Туре: АЬкйас!

№11бпи Ь, У|дпа Е, №1гкк1кап КР, Саибко С, Ζа^педа^ К, М1ска1орои1ок СК, апб Сотодко РМ. Нера!осу!е дготек !ас!ог (НСЕ) кйши1а!ек ке !угокке ккаке асйуйу о! !ке гесер!ог епсобеб Ьу ке рго!о-опсодепе с-МЕТ. Опсодепе 6:501-504 (1991).

Nеишапи Е, Уадпег С, 8!еуапоу1с 8, КиЬикскок В, 8скогтапп С, МКско А, ЕгТап К, 8сктб1 У, апб Р!геипбкскик М. Iбепй!^сайоп о! ап НЬА-ОК-гек!йс!еб рерйбе ерйоре тейй а ргстикспопк Ьккпд райет бейуеб !гош !ке сапсег !екйк апйдеп НОМ-МЕЙ-40/88Х2. к!. 1. Сапсег 112:661-668 (2004).

№1о Н, Такакакк Т, Мак|дпск Υ, Науакк Т, Нкоба Υ, апб ^аТ К. Су!о!ох1с Т 1утркосу1ек бейуеб !гош Ьопе шагготе топопис1еаг се11к о! ши1йр1е туе1ота райеп!к гесодт/е ап ипбегд1усоку1а!еб !огш о! МИС1 шисш. к!. Iтшипо1. 9:791-798 (1997).

Окага О, №1даке Т, кккатеа К, №1ка)|та О, Окга М, 8ек1 Ν, апб Миша Ν. Сопкйисйоп апб скагас1еп/аРоп о! китап Ьгак сОХА НЬгайек кийаЬ1е !ог апа1уйк о! сОХА с1опек епсобкд ге1айуе1у 1агде рго!екк. ОКА Кек. 4:53-59 (1997).

Раск!ег 18, бе Упек НЕ, апб ЕаЬгу Ζ. Тке Ь1ооб-Ьгак Ьагйег апб йк го1е к 1ттипе рйуйеде к !ке сеп!га1 пегуоик кук!еш. 1. №игорако1. Ехр. №иго1. 62:593-604 (2003).

Ракк, Н. А., 8. Ь. 8сктеаг/, 1. К. ХУппбегкск, апб 8. А. КокепЬегд. Iттикζайоп о! райеп!к тейк ше1апоша рерйбе уасскек: 1ттипо1од1с аккеккшеп! иктд !ке ЕЙЛ8РОТ аккау. Сапсег 1. 8сг Аш. 4:316 (1998).

Ропк Е, Ирко!! СС, апб Огех1ег НС. Ехргекккп о! кера!осу!е дготек !ас!ог апб йк гесер!ог с-ше! к китап 1еикетЛа-1ушркоша се11 1кек. Ьеик. Кек. 22:797-804 (1998).

Роп/еНо С, ВагбеШ А, Мака Е, Ьопдай Р, Рапауо!ои С, Окапб К, Уа!егйе1б МО, апб Сошодйо РМ. А поуе1 гесодтйоп ток !ог ркокркайбу1кокйо1 3-ккаке Ькбкд шеб1а!ек йк аккоаайоп тейк !ке кера!осу!е

- 41 013466 дгоМк ГасГог/ксайег Гас1ог гесерГог. Мо1. Се11 Бю1. 13:4600-4608 (1993).

Ргеукаш N апб Ьауапску Ό. НераГШк Б. Аог1б Неа11к Огдашхайоп ПерагГтепГ оГ СоттишсаЫе Όίκеакек 8шуек1апсе апб Кекропке. 2002 АНО/СО8/С8К/ЬУО/2002. 2:НерайГ1к Б. (2002).

('кап ΟΝ, Сио X, Сао Б, Кой Еб, Ьее СС, Скеп ί, Аапд ЬМ, Ма1 ΑΥ, Мт НО, Нопд МН, Уапбе Аоибе СЕ, Кекаи кН, апб Тек ВТ. Ме1 ргоГет ехргеккюп 1еуе1 согге1аГек тейй кшу1уа1 ш райепГк тейк 1а1ек1аде пакоркагупдеа1 сагстота. Сапсег Кек. 62:589-596 (2002).

Оиапкп Б, Мигрку С, апб БгеаГкпаск К. Ритр-1 с^NА собек Гог а ргоГет тейй скагасГепкйск ктп1аг Го 1коке оГ с1акк1са1 со11адепаке Гатку тетЬегк. Бюскет1кйу 28:5327-5334 (1989).

Кае ЕК, 81еркепкоп 8А, №со1 ИЬ, апб С1етепГк 1А. Шус1 аккос1айоп оГ а б1уегке гапде оГ депек тейк гепа1 се11 сагстота ак 1бепйДеб Ьу бГГГегепйа1 б1кр1ау. ШГ. Г Сапсег 88:726-732 (2000).

Катйех К, Нки Ό, РаГе1 А, ЕепГоп С, Отаиег С, Тий1е КМ, апб Егапак СЬ. Оуег-ехргеккюп оГ кераГосуГе дгоМк ГасГог/ксаГГег ГасЮг (НСЕ/8Е) апб 1ке НСЕ/8Е гесерГог (сМЕТ) аге аккошаГеб тейк а Ыдк пкк оГ теГакГакк апб гесиггепсе Гог сккбгеп апб уоипд аби1Гк тейк рарШагу 1куго1б сагстота. С1т Епбосгток (ОхГ) 53:635-644 (2000).

Каттепкее Н, Басктапп к Еттепск Ν₽, Баског ОА, апб 8Геуапоую 8. 8УЕРЕIТНI: баГаЬаке Гог МНС кдапбк апб рерйбе тойГк. IттииοдеиеГ^ск 50:213-219 (1999).

Каттепкее, Н.С., Басктапп, Г, апб 8Геуапоую, 8. (1997). МНС Ыдапбк апб Рерйбе МойГк. 8ргтдегУег1ад, Не1бе1Ьегд, Сегтапу.

Кекегтапп В апб №1кскпЬеш М. Iттииο1οду оГ кераййк В У1гик апб кераййк С У1гик шГесГюп. №1. Кеу. Iттииο1. 5:215-229 (2005).

КегИхкск С, Каукег 8, 8Гитт 8, АаГегтапп I, Аа1Гег 8, 8Геуапоую 8, Аа11\\'1епег Ό, апб Сиске1 Б. Еуа1иаГюп оГ рге-ех1кГепГ 1ттипйу т райепГк \νίΐΗ рптагу ЬгеакГ сапсег: то1еси1аг апб се11и1аг аккаук Го сщапкГу апйдеп-кресШс Т 1утркосуГек т рег1ркега1 Ь1ооб топопис1еаг се11к. С1т Сапсег Кек. 9:4376-4386 (2003).

Ко1хкскке О, Еа1к К, 8Геуапоую 8, кипд С, Аа1беп Р, апб Каттепкее НС. ЕхасГ ргебюйоп оГ а паГига1 Т-се11 ерйоре. Еиг. I ^типок 21:2891-2894 (1991).

КиЬт к8, Бойаго ИР, апб Аагопкоп 8А. НераГосуГе дгоМк ГасГог/ксайег ГасГог апб йк гесерГог, Гке стеГ ргоГо-опсодепе ргобисГ. БюсЫт. Бюркук. АсГа 1155:357-371 (1993).

8ака 8, БагбеШ А, Бисккаи1Гк Р, Уе1си1екси УЕ, Кадо С, 8Г СБ, Котапк КЕ, Ской МА, Ьепдаиег С, Ктх1ег КА, апб Уоде1кГет Б. А ркокркаГаке аккоааГеб тейк теГак!ак1к оГ со1огес!а1 сапсег. 8с1епсе 294:1343-1346 (2001).

8ато М, Магиуата Т, 8ек1уа Т, Кауата Т, апб Мигакат1 Υ. Iпк1Ь111оп оГ апдюдепек1к т китап дкота се11 кпек Ьу апйкепке ^А Ггот Гке ко1иЬ1е диапу1аГе сус1аке депек, СυСΥ1А3 апб СυСΥ1Б3. Опсо1. Кер. 12:47-52 (2004).

8скад К, 8скт1бГ 8М, Ми11ег МК, Аеткскепк Т, Арре1 8, Аеек ММ, СгипеЬаск Е, 8Геуапоую 8, Каттепкее НС, апб БгоккагГ Р. IбеиГ^Г^саГ^οи оГ С-теГ опсодепе ак а Ьгоаб1у ехргеккеб Гитог-аккос1аГеб апйдеп гесодтхеб Ьу суГоГохю Т-1утркосуГек. С1т Сапсег Кек. 10:3658-3666 (2004).

8ске^ЬеηЬοдеη. С, А. 8сктйке1, и. Ке11ко1х, Т. А11даиег, и. НоГтапп, К. Мах, Е. ТЫе1, апб Ό. 8скабепбогГ. Ркаке 2 Гпа1 оГ уасстаГюп \\Лк Гугоктаке рерйбек апб дгапи1осуГе-тасгоркаде со1опу-кГ1ти1аГтд ГасГог т райепГк \νίΐΗ теГакГайс те1апота. к. ИптипоШег. 23:275 (2000) .

8сЫг1е М, Аеткскепк Т, апб 8Геуапоую 8. СотЫшпд сотриГег а1догйктк \\йк ехрептепГа1 арргоаскек регтйк Гке гар1б апб ассигаГе 1бепйГ1саГюп оГ Т-се11 ерйорек Ггот беГтеб апйдепк. к. Iттииο1. МеГкобк 257:1-16 (2001).

8скт1бГ С, Б1абГ Е, Соебеске 8, Бппктапп У, 2ксЫекске А, 8кагре М, Скегагб1 Е, апб Б1гскте1ег С. 8сайег ГасГог/кераГосуГе дгоМк ГасГог 1к еккепйа1 Гог куег беуе1ортепГ. №11иге 373:699-702 (1995).

81бб1ци1 к, АЬе М, Науек Ό, 8каш Е, Е, апб КиГе Ό. Шок-Шоп апб 8ес.|иепстд оГ а с^NА Собтд Гог Гке Нитап ИЕ3 БгеакГ Сагстота-Аккос1аГеб Апйдеп. РNА8 85:2320-2323 (1988).

81тд1иГГ, С.Ь., кг., С. К. Рейопк С. У. Υатккск^кον, Ό. Ь. Багпб, 8. ЕакГкат, Н. Са1ауой1, к. А. Райегкоп, Ό. Н. Иеасоп, 8. НЛЬйГк, Ό. ТеаГек, Р. Υ. №еке, А. А. Сгокк, К. А. СЫапеке-Би11оск, Е. М. Аообкоп, С. к. А1етакх, Р. Мет11, к. С1Ькоп, М. Кокк, апб У. Н. ЕпдеШагб. Скшса1 апб 1ттипо1одю геки1Гк оГ а гапбонихеб ркаке II Гпа1 оГ уасстаГюп иктд Гоиг те1апота рерйбек ейкег абт1шкГегеб т дгапи1осуГетасгоркаде со1опу-кГ1ти1аГтд ГасГог т аб)пуап1 ог ри1кеб оп бепбпкс се11к. к. Скп. Опсо1. 21:4016 (2003) .

8ип Υ, 8опд М, 8Геуапоую 8, 1апко\\'1ак С, Ракскеп А, Каттепкее НС, апб 8скабепбогГ Ό. ^1111^1йоп оГ а пе\\' НЕА-А(*)0201-гекйксГеб Т-се11 ерйоре Ггот Гке 1угоктаке-ге1а1еб ргоГет 2 (ТКР2) те1апота апйдеп. кН. к. Сапсег 87:399-404 (2000).

Такакакк Т, МаКдисЫ Υ, Нтоба Υ, КакшсЫ Н, Nакада^а Ν, кти К, апб Υаск^ А. Ехргеккюп оГ МИС1 оп туе1ота се11к апб тбисГюп оГ НЕА-ипгек1г1сГеб СТЬ адаткГ МИС1 Ггот а ти1йр1е туе1ота райепГ. к. Iттииο1. 153:2102-2109 (1994).

Такауата Н, Ьагоске11е Ак, 8кагр К, ОГкика Т, КпеЬе1 Р, Апуег М, Аагопкоп 8А, апб Мегкпо С. Όίуегке Гитопдепек1к аккос1аГеб тейк аЬеггапГ беуе1ортепГ т тке оуегехргекктд кераГосуГе дгоМк ГасГог/ксайег ГасГог. Ргос. №Г1. Асаб. 8с1. и. 8. А. 94:701-706 (1997).

Такауата Н, ЬаКоске11е Ак, Апуег М, Босктап ИЕ, апб Мегкпо С. 8саГГег ГасГог/кераГосуГе дгоМк

- 42 013466

Гас!ог ак а геди1а!ог оГ кке1е!а1 тикс1е агк неига1 сгек! БехекртегИ. ΓΝΑΞ 93:5866-5871 (1996).

ТеоГШ Ь, Όί ЕеЬо АБ, РгегсогБ Ε, Мадд1аго Ν, Ве1ка1к1 М, Ки!е11а 8, Стдо1аш Α, Όί ΕΝ, Мик!о Р, Р11еБ 8, Беоге С, агк Ьагосса ЬМ. Ехргеккюг оГ !Бе с-те! р^о!о-оηсодеηе агк йк кдагБ, Бера!осу!е дгох!й Гас!ог, ίη ВоБдкт Б1кеаке. В1ооБ 97:1063-1069(2001).

ТпраЙи Α, Эакдир1а 8, Коу Α, 8егдир!а Α, Коу В, КоусБохББигу 8, агк РагБа СК. 8едиегЕа1 Бейкоик ίη Ьо(Н агтк оГ сБготокоте 9 аге аккоаа!еБ хйБ Ле Бехе1ортегИ оГ БеаБ агк геск кцнатонк се11 сагстота ίη Б^аг! райегИк. Б Ехр. С1т. Сагсег Кек. 22:289-297 (2003).

ТгоиккагБ X, уе!-Бо1кеаи Η, Масго М, Ме11егт МР, Ма1е! М, Коикке1 М, агк 8о1а В. Сус1т Ό1 ехргеккюп ίη райегИк хйБ ти1Бр1е туе1ота. ^таЛк Б 1:181-185 (2000).

Тиск АВ, Рагк М, 8!етк ЕЕ, Воад Α, агк Е1Бой ВЕ. Соехргекктг оГ Бера!осу!е дгох!й Гас!ог агк гесер!ог (Ме!) ίη Битаη Ьгеак! сагстота. Ат. Б Ра!Бо1. 148:225-232 (1996).

ИеБага Υ, Мтоха О, Моп С, 81ио1а К, Кипо Б №Ба Т, агк Кйатига Ν. Р1асегИа1 БеГес! агк етЬгуошс 1е(Ва111у ίη тке 1асктд Бера!осу!е дгох!Б Гас!ог/кса!!ег Гас!ог. №Пиге 373:702-705 (1995).

Уаг Ό, V, ТаБег ТЕ, КееБгег КМ, 8тй Ь, Сгоегтк М, агБ Ра1к 8Т. Рагасгте геди1а!1ог оГ дегтта1 сегИег В се11 аББемом !БгоидБ !Бе с-те!-Бера!осу!е дгох!Б Гас!ог/кса!!ег Гас!ог ра!Бхау. Б Ехр. МеБ. 185:2121-2131 (1997).

УакеГ МА, Втунек КК, 8!игт М, Вгот1еу С, агБ КоЬтког КА. Ехргеккюг оГ сус1т Ό1 ίη рагаЛугок сагстотак, аБеготак, агБ Бурегр1ак1ак: а рагайт ^ттиηоБ^к!осБет^са1 к!иБу. МоБ. Ра!Бо1. 12:412-416 (1999).

ЭДаЙег 8, Иеггдег Ь, 8сБоог О, Бтд С, ЭДете! Ό, ВиНгтд Ш, Каттегкее ИС, агБ 81еуагоу1с 8. Си!!1гд ЕБде: РгеБе!егттеБ Лукку оГ Η шпаг СЭ8 Т-се11к ЕхрагБеБ оп СаБЬга!еБ ΜΗС/Αη!^-С^28-Соа!еБ МкгокрБегек. I Iттиηо1 171:4974-4978 (2003).

ЭДагд Ер, 8о Б Кекгк!аБ 8, агБ Е|кБтаг ΌΑ. МаБйукт (ММР-7) ргото!ек 1гуак1ог оГ охапам сагсег се11к Ьу ас11ха11ог оГ ргодекПтаке. Ιη!. ί Сагсег 114:19-31 (2005).

ЭДагд К, Еегге11 ΌΌ, Еаон/ί 8, МаБег Л, агк В1кБор БМ. Лс11ха11ог оГ !Бе Ме! гесер!ог Ьу се11 айасБтег! тБисек агБ кик!атк Бера!осе11и1аг сагстотак ίη !гагкдешс тке. Б. Се11 ВюБ 153:1023-1034 (2001).

ЭДеЬег КС, Ккдег Б, №штагт и, ЬкБ!ег Р, агБ ЭДе11ег М. СБготокота1 ткактсек аккоаа!еБ хйБ гекрогке !о сБетоЛегару агБ су!о!охк суЮктек ίη китам такдгаП дБота се11 кгек. Ιη!. Б. Сагсег 91:213-218 (2001).

ХУеи·!^^!; Т, СоиРеГагдеак С, 8сЫг1е М, ОЬегтауг Е, ЭДаЙег 8, 8сБоог О, Кигек К, Ьоекег ЭД, ВкБ1ег ΧΉ, ЭДете! Ό, 81ехагох1с 8, агБ Каттегкее Η6. Iη!ед^а!еБ Гигс11ога1 дегюниск арргоасБ Гог !Бе Бек1дг оГ ра!^еη!-^ηБ^ν^Биа1 акйитог хасстек. Сагсег Кек. 62:5818-5827 (2002).

ЭДкгеску Б, Ми11ег МК, Чогдег М8, Вгиддег ЭД, Кап/ Ь, агБ Вгоккай Р. ЛБис!^ оГ с11П1сп1 агБ 1тти1ю1од1са1 гекрогкек ίη райегИк хйБ те!ак!айс гега1 се11 сагстота айег хасски-Шонк хйБ рерйБе ри1кеБ БегБпйс се11к. Б С1т Опсо1 (Мее!тд ЛЬкБас!к) 23:2507 (2005).

ЭДй1к МК, СагткБае1 ЛБ, МугагБ К, Бт X, ЭДеекек МР, Р1асБ!ег В, агБ 81ккопк БС. ТБе Битаг су!о!охк Т-1утрБосу!е (СТЬ) гекрогке !о су!отеда1оуйик 1к Ботта!еБ Ьу к!гис!ига1 рго!ет рр65: Ггедиегсу, кресГкйу, агБ Т-се11 гесер!ог икаде оГ рр65-кресйк СТЬ. Б Уйо1. 70:7569-7579 (1996).

Х1огд Υ, Сопго11у Т, Еи!сБег В, агБ ВеасБ Ό. Ηитаг Ό-йре сус1т. Се11 65:691-699 (1991).

УехБе11 БЭД, Кейк Е, агБ №еГ|ек Б. Мактд кегке оГ такк Бек!гис!ют диаг!йа!тд МЖ с1акк Ι агБдег ргекетайог. №11. Кеу. Iттиηо1. 3:952-961 (2003).

Υоиηд ΑΝ, Атт МВ, Могего С8, Бт 8Ό, СоБег С, Ре!гок БА, МагкБа11 ЕЕ, агБ №1кБ Α8. Ехргеккюг ргоГйтд оГ гега1 ерНВе11а1 геор1актк: а те!БоБ Гог !итог с1акк^Г^са!^оη агБ Бйсохегх оГ Бкадгюкйс то1еси1аг тагкегк. Ат. Б. Ра!Бо1. 158:1639-1651 (2001).

2атедаг К агБ МкБа1орои1ок СК. ТБе тагу Гасек оГ Бера!осу!е дгох!Б Гас!ог: Ггот Бера!ороккй !о Бета!ороккй. Б. Се11 Вю1, 129:1177-1180 (1995).

2Бои ΥΓ Сиу СК, агБ Бох ВС. ВМР-2 тБисек се11 е1оηда!^оη агБ тетЬгаге ргсИгиккик Ьу т!егас!тд хйБ СБс42 У1а а тпс.|ие СБс42-ЬтБтд тойГ хйБт йк ВМР-2 агБ СБс42СЛР Бото1оду Ботат. Ехр. Се11 Кек. 303:263-274 (2005).

Котего Р, Сего!йш БС, 8рейег ЭЕ. Μоηйо^^ηд !итог аниден кресГк Т-се11 гекрогкек ίη сагсег райегИк агБ рБаке Ι сйшса1 !па1к оГ рерйБе-ЬакеБ хассни-Шот Сагсег Iттиηо1 ^титЛет. 2004 Маг;53(3):249-55.

8сБтй!е1 Α, Ке11Во1х и, ТБк1 Е, 8сБе^ЬеηЬодеη С. РиагЕйсайог оГ Штог-крескк Т 1утрБосу!ек хйБ !Бе ЕЫ8РОТ аккау. Б IттиηоίБе^. 2000 Мау-Биг;23(3):289-95.

ЭДкгеску Б, Ми11ег М, Чогдег М, Вгиддег ЭД, Кап/ Ь, Вгоккай Р. М^йои оГ с11Н1с11 агБ 1ттиго1одка1 гекрогкек ίη райегИк хйБ те!ак!а!к гега1 се11 сагстота айег хасстаиоик хйБ рерйБе ри1кеБ БегБй!к се11к. ЛЬкйас! №. 2507 ргекег!еБ а! !Бе Лггиа1 Мее!тд оГ !Бе Атепсаг 8оск1у оГ С1шка1 Огсо1оду Л8СО (2005).

- 43 013466 <110>

Перечень последовательностей

Имматикс Биотехнологиз “ '

ГмбХ <120>

Опухолеассоциированные ческого лейкоцитарного к ним противораковая пептиды, связывающиеся с молекулами человеантигена (НБА) I или II класса, и относящаяся вакцина <130>

130559РСТ <160>

<170>

РабепЫп νετβίοη

3.3 <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ Ното аархепа <400>

Бег <31п Аар

Аар 11е

Буз

С1у

Не <31п Буз Беи Туг С1у Буз Агд Бег 10 15 <210> с211> <212> <213>

РЕТ

Ното зарБепа <400>

7а 1 Меб А1а

С1у Азр

11е

Туг £ег ν&1 <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното эархепэ <400>

Бег Уа1. А1а

Зег ТЬг

11е

ТЬт* (31у \7а1 <210>

<211>

е212>

<213>

РАТ ното зархепа <400>

А1а Беи А1а

Аар <31у

Уа1 <31п

Буа

Уа1 <210>

<211>

<212>

РКТ

- 44 013466

<213>	Ното аараепз
<400>	5

Беи Беи 31у А1а ТЪ.г Суа МеЪ РЬе Уа1 15

е210э <211> <212> <213>	6 9 РКТ Ното вартепа
<400>	6

Зег Уа1 РЬе А1а С1у Уа1 Уа1 С1у Уа1

<210> <211> <212> <213>	7 9 РАТ Ното эархепз
<400>	7

А1а Беи РЬе Аар С1у Аар Рго Ηίε Беи

1	5
<210> с211> е212> <213>	8 9 РКТ Ното аартепа
<400>	8

Туг Уа1 Аар Рго Уа1 Не ТЬг Зег 11е 15

<210> с211> <212> <213>	9 9 РКТ Ното зараепз
<400>	9

Зег ТЬг А1а рго Рго Уа1 Ηίε Аап Уа1

<210> <211> <212> <213>	10 9 РКТ Ното аараепв
<400>	10

Беи А1а А1а Беи Рго Ηϊβ Зег Суа Беи

1	5
<210> <211> <212> <213>	11 10 РКТ НераЫЬ1а В у!гив
<400>	11

РЬе Беи Рго Зег Аар РЬе РЬе Рго Зег Уа1 1510

Claims (31)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. (1) получение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) от пациента;

   1. Опухолеассоциированный пептид. который выбран из группы пептидов. включающих по меньшей мере одну последовательность в соответствии с 8Е0 ГО № 1 или 8ЕЦ ГО № 2 или их вариант. при условии. что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом. причем указанный пептид обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.
2. (2) введение в указанные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей Т-клеточный рецептор (ТКР) или функционально эквивалентную молекулу, и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

   2. Опухолеассоциированный пептид по п.1. причем пептид состоит или преимущественно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО № 1 или 8ЕЦ ГО № 2 или их варианта.
3. 3. Опухолеассоциированный пептид по п.1 или 2. имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса.
4. 4. Опухолеассоциированный пептид по п.3. имеющий способность связываться по меньшей мере с одной дополнительной молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) II класса.
5. 5. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-4. причем пептид включает непептидные связи.
6. 6. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-5. причем пептид является белком слияния. в особенности включающим Ν-терминальные аминокислоты антигенассоциированной инвариантной цепи (И) НЬА-ЭК.
7. 7. Нуклеиновая кислота. кодирующая пептид по любому из пп.1-6.
8. 8. Нуклеиновая кислота по п.7. которая является ДНК. кДНК. ПНК. ЦНК. РНК или их комбинациями.
9. 9. Вектор экспрессии. способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по п.7 или 8.
10. 10. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-6 для применения в медицине.
11. 11. Клетка-хозяин. включающая нуклеиновую кислоту по п.7 или 8 или вектор экспрессии по п.9.
12. 12. Клетка-хозяин по п.11. являющаяся рекомбинантной клеткой КСС или линии А\ге11к.
13. 13. Фармацевтическая композиция. содержащая по меньшей мере один опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-6.
14. 14. Фармацевтическая композиция по п.13. дополнительно включающая по меньшей мере один дополнительный пептид. содержащий последовательность в соответствии с любой из 8ЕЦ ГО № 3 по 8ЕЦ ГО № 11.
15. 15. Фармацевтическая композиция по п.13 или 14. причем пептид включает непептидные связи.
16. 16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-15. включающая пептиды. состоящие из аминокислотных последовательностей в соответствии с 8ЕО ГО № 1 и/или 8ЕЦ ГО № 2 и 8ЕЦ ГО № 3 по 8ЕО ГО № 11.
17. 17. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-16. причем количество опухолеассоциированного(ых) пептида(ов). присутствующего(их) в указанной композиции. является ткане-. раково- и/или пациентспецифическим(и).
18. 18. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-17. дополнительно включающая по меньшей мере один приемлемый адъювант.
19. 19. Фармацевтическая композиция по п.18. причем указанный адъювант выбран из группы колониестимулирующих факторов. таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ).
20. 20. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.13-19 в качестве противораковой вакцины.
21. 21. Способ получения опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-6. включающий культивирование клетки-хозяина по п.11 и выделение пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды.
22. 22. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента. чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид. включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6. включающий введение пациенту эффективного объема пептида по любому из пп.1-6. причем объем указанного пептида. или объем указанной нуклеиновой кислоты. или объем указанного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у указанного пациента.
23. 23. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-6 для получения лекарственного средства для уничтожения клеток-мишеней у пациента. клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид. включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6.
24. 24. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ш уйго. включающий контактирование ЦТЛ ш уйго с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса. экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки в течение периода времени. достаточного для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ. причем указанный антиген является пептидом по любому из пп.1-6.
25. 25. Способ по п.24. причем антиген нагружен на молекулы МНС I или II класса. экспрессированные на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.

    - 46 013466
26. 26. Способ по п.25, причем антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии по п.9.
27. 27. Активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), полученные с помощью способа по любому из пп.24-26, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6.
28. 28. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6, включающий введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) по п.27.
29. 29. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6, включающий стадии:
30. 30. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-6 для получения лекарственного средства для уничтожения раковых клеток у пациента.
31. 31. Применение по п.30, причем указанные раковые клетки являются клетками рака почки.