CN114641315A - 癌症免疫疗法中的asc斑点 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及ASC(含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白)斑点在癌症免疫疗法中的用途。本发明还涉及含有由ASC蛋白形成的ASC斑点载体和肿瘤抗原的组合物，其用于治疗癌细胞和肿瘤。

Description

癌症免疫疗法中的ASC斑点
技术领域
本发明涉及ASC斑点在癌症治疗中的用途，以及包含ASC斑点载体的组合物，特别是ASC斑点和肿瘤抗原的组合物。
背景技术
根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)，癌症是全球主要的死亡原因；在2018年导致估计的960万例死亡。同一年的新病例数目已上升至1800万，其中肺癌是最频繁诊断的癌症类型，随后为乳腺癌。
当今，癌症治疗选项包括手术、放射疗法、化学疗法、靶向药物疗法、骨髓移植、激素疗法和免疫疗法。如本领域众所周知的，这些治疗方法中的大多数具有严重的副作用，并且仍然不能有效地治愈所有癌症类型，如根据死亡率显而易见的。免疫疗法是相对安全的，因为它使用机体自身的防御机制来对抗癌症。
传统的癌症治疗方法基于通过化学制品(化学疗法)、放射来攻击癌症的原理或通过肿瘤的手术切除。化学疗法是用作主要或次要治疗的非常常见的方法。它攻击快速生长的细胞，其包括癌细胞以及正常细胞如骨髓细胞。因此，作为主要副作用，化学疗法抑制患者的免疫系统。另一方面，免疫疗法帮助机体自身的免疫系统攻击癌细胞，并且使得可以有效治疗多重癌症类型。与化学疗法不同，免疫疗法改善整体免疫系统功能。
免疫系统是器官、组织、细胞和蛋白质的网络。免疫系统的主要功能是保护机体免受入侵者如细菌、病毒、真菌或任何其它异物的影响。由于关于癌症机制的研究，多年来已知癌细胞也被免疫系统识别。然而，由于它们衍生自机体自身的细胞，因此防御机制很难将癌细胞鉴定为异物。
另一个重要方面是，为了使免疫系统成功保护机体免受入侵者或异常细胞的影响，它需要足够的时间来识别此类异物，产生必要的防御机制并破坏它们。考虑到癌细胞是快速生长的且非常复杂，机体的防御细胞通常在完成其对癌细胞的功能之前关闭。因此，已公认的是免疫系统需要帮助才能保护机体免受快速生长癌细胞的影响。
免疫疗法是相对新的治疗方法，具有许多未知因素。首先，免疫系统在癌症中的作用尚未完全阐明。其次，涉及这种天然防御机制的蛋白质对环境变化高度敏感，且容易丧失其功能。这对开发新的治疗选项以及对患者使用这些治疗均为挑战性的。
最近的免疫学和肿瘤生物学研究为理解免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用提供了新的见解。许多研究已确立了T细胞介导抗肿瘤免疫的重要性。致癌过程导致肿瘤细胞的抗原表达变化，其可以被宿主T细胞识别(Dermime，S.，A. Armstrong，R. E. Hawkins和P. L. Stern，“Cancer vaccines and immunotherapy"，British medical bulletin，第62卷，第1期，第149-162页，2002)。
目前，免疫检查点抑制剂、改造的T细胞、单克隆抗体和癌症疫苗通常用作针对多种癌症类型的免疫疗法(Kamta，J.，M. Chaar，A. Ande，D. A. Altomare和S. Ait-Oudhia，“Advancing cancer therapy with present and emerging immuno-oncologyapproaches"，Frontiers in oncology，第7卷，第64页，2017)。
癌症疫苗可以分为两个主要组；预防性疫苗或治疗性疫苗。理论上，预防性癌症疫苗应该预防肿瘤的发展并提供持久的免疫。预防性疫苗的第一个实例是针对HBV和HPV的感染(Chang，M.-H.，“Hepatitis B Virus and Cancer Prevention"，Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer，第188卷，第75-84页，2010)。
治疗性疫苗根据其组成可以分为4个主要亚组；全细胞肿瘤、树突状细胞、DNA和亚单位疫苗。全细胞肿瘤疫苗大多数是同种异体的，并且由于在患者之间观察到的大规模肿瘤异质性而具有有限的成功(Srivatsan，S.，J. M. Patel，E. N. Bozeman，I. E.Imasuen，S. He，D. Daniels和P. Selvaraj，“Allogeneic tumor cell vaccines"，Human Vaccines & Immunotherapeutics，第10卷，第1期，第52-63页，1 2014)。树突状细胞疫苗通过从患者中提取细胞并用特异性抗原和/或佐剂刺激它们而进行生产(Kamta，J.，M.Chaar，A. Ande，D. A. Altomare和S. Ait-Oudhia，“Advancing Cancer Therapy withPresent and Emerging Immuno-Oncology Approaches."，Frontiers in oncology，第7卷，第64页，2017)。存在一种FDA批准的针对前列腺癌的树突状细胞疫苗Sipuleucel (Guo，C.，M. H. Manjili，J. R. Subjeck，D. Sarkar，P. B. Fisher和X.-Y. Wang，“Therapeutic Cancer Vaccines"，Advances in cancer research，第119卷，第421-475页，2013)。DNA疫苗在癌症免疫治疗中是新出现的，并且它们基本上需要肿瘤相关抗原的序列。
与经典疫苗一样，用于癌症免疫疗法的亚单位疫苗包括抗原或抗原表位。存在亚单位疫苗治愈黑色素瘤、前列腺癌、睾丸癌和乳腺癌的应用。尽管亚单位疫苗的免疫加强效应比全肿瘤疫苗温和，但用佐剂增加其效应是可能的(Temizoz，B.，E. Kuroda和K. J.Ishii，“Vaccine adjuvants as potential cancer immunotherapeutics"，International immunology，第28卷，第7期，第329-38页，2016)。
疫苗旨在诱导适应性免疫，其可以通过在某些疫苗制剂中使用佐剂得到增强。矿物盐、细胞因子、乳剂、微生物颗粒和脂质体可以用作佐剂(Guy，B.，“The perfect mix:recent progress in adjuvant research."，Nature Reviews Microbiology，第5卷，第7期，第505-17页，6 2007)。佐剂的作用机制才刚开始被阐明，尽管它们已使用了80多年(Awate，S.，L. A. Babiuk和G. Mutwiri，“Mechanisms of action of adjuvants."，Frontiers in immunology，第4卷，第114页，2013)。
铝盐(明矾)是人疫苗中最频繁使用的疫苗佐剂。氢氧化铝对于白喉的诱导效应于1926年首次在豚鼠中显示，并且自1931年以来，不同的明矾制剂已用于人疫苗中(Marrack，P.，A. S. McKee和M. W. Munks，“Towards an understanding of the adjuvant actionof aluminium."，Nature reviews. Immunology，第9卷，第4期，第287-93页，2009)。
然而，迄今为止，明矾佐剂的作用机制尚未完全理解。最近的一些出版物显示，明矾通过IL-1细胞因子和半胱天冬酶1诱导免疫系统，所述半胱天冬酶1是炎性小体复合物的产物(Franchi，L.，T. Eigenbrod，R. Munoz-Planillo和G. Nunez，“The inflammasome: acaspase-1-activation platform that regulates immune responses and diseasepathogenesis."，Nature immunology，第10卷，第3期，第241-7页，3 2009；.10，Eisenbarth，S. C.，O. R. Colegio，W. O'Connor，F. S. Sutterwala和R. A. Flavell，“Crucial role for the Nalp3 inflammasome in the immunostimulatory propertiesof aluminium adjuvants"，Nature，第453卷，第7198期，第1122-1126页，6 2008；Grun，J.L.和P. H. Maurer，Different T helper cell subsets elicited in mice utilizingtwo different adjuvant vehicles: the role of endogenous interleukin 1 inproliferative responses.",Cellular immunology，第121卷，第1期，第134-45页，61989)。
在明矾后的70多年，新的佐剂AS04获得FDA的批准用于HPV。AS04由明矾和单磷酰脂质A的组合形成。最后，FDA批准将AS03用于大流行性H5N1流感，但它不再商业化。用于流感疫苗的MF59的制剂与AS03非常相似，但未获得FDA的批准(Awate，S.，L. A. Babiuk和G.Mutwiri，“Mechanisms of action of adjuvants."，Frontiers in immunology，第4卷，第114页，2013)。
关于佐剂在免疫激活中的加强效应，存在许多提议的机制，其基本上是增强抗原摄取、免疫细胞募集到注射部位、激活PRR和炎性小体，随后为特定的免疫应答如Th1和Th2(Reed，S. G.，M. T. Orr和C. B. Fox，“Key roles of adjuvants in modern vaccines"，Nature Medicine，第19卷，第12期，第1597-1608页，12 2013)。
先天免疫系统的受体如TLR是佐剂的靶。当佐剂激活TLR时，某些趋化因子和细胞因子分泌到细胞外基质中。然后，这些小分子帮助细胞和体液免疫的定向。例如，来自APC和幼稚CD4细胞的IL-4分泌引导免疫诱导IgG的产生，因为IL-12和IFN引起更多的细胞免疫应答(Reed，S. G.，M. T. Orr和C. B. Fox，“Key roles of adjuvants in modernvaccines"，Nature Medicine，第19卷，第12期，第1597-1608页，12 2013)。
在人肿瘤细胞上鉴定某种特征性抗原后，已开发了创新方法，导致抗原特异性疫苗接种的开发。某些肿瘤抗原以及将这些抗原递送至免疫系统的适当途径的组合旨在优化基于人的疫苗接种(Dermime，S.，A. Armstrong，R. E. Hawkins和P. L. Stern，“Cancervaccines and immunotherapy"，British medical bulletin，第62卷，第1期，第149-162页，2002)。
肿瘤细胞也可以用作疫苗。由于这些细胞本身不能引起足够的免疫应答，研究人员集中于通过将共刺激分子或细胞因子基因引入肿瘤细胞的基因组，然后将其用作疫苗并返回给同一患者，来克服这种无应答性。然而，这种疫苗生产是相当缓慢、劳动力密集且物流方式困难的。
可替代地，重组病毒载体可以用于将肿瘤抗原递送至机体。病毒载体由于病毒感染而启动免疫应答和形成炎症反应的内在能力是这些疫苗的优点。然而，理想地，病毒载体应该是安全的，并且不应促进抗载体免疫应答，以允许抗肿瘤特异性免疫应答的加强(Dermime，S.，A. Armstrong，R. E. Hawkins和P. L. Stern，“Cancer vaccines andimmunotherapy"，British medical bulletin，第62卷，第1期，第149-162页，2002)。
尽管本领域已知癌症治疗方法，但癌症的发病率以及与此平行的死亡率每年渐增。因此，本领域仍存在关于新的癌症治疗方法的巨大需求。
ASC (含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白)是22 kDa的衔接蛋白，具有在N末端处的PYD结构域以及在C末端处的CARD结构域，其在炎性小体复合物，特别是在NLRP3、NLRC4和AIM2炎性小体中的形成中发挥功能。ASC蛋白在炎症和细胞焦亡信号传导途径中的半胱天冬酶-1蛋白质的激活中具有作用(Franchi等人，2009)。它是细胞质蛋白，其在炎性小体激活后形成斑点样结构(Miao等人，2011)。
ASC蛋白聚合成细丝并形成称为ASC斑点的大型超分子支架形成物(Sahillioglu，A. C.，F. Sumbul，N. Ozoren和T. Haliloglu，“Structural and dynamics aspects ofASC speck assembly"，Structure，第22卷，第12期，第1722-1734页，2014)。这些ASC斑点可以存在于细胞内部，或可以释放到外部(Sahillioglu，A. C.和N. Ozoren，“Artificialloading of ASC specks with cytosolic antigens"，PloS one，第10卷，第8期，第e0134912页，2015)。
也含有ASC蛋白的NLRP3炎性小体可以由刺激例如细胞外ATP、膜损伤毒素(尼日利亚菌素)、溶酶体损伤、单钠尿素(MSU)和紫外线触发。NLRP3炎性小体激活伴随着ASC斑点的合成。已显示，通过在低渗溶液中温育纯化的重组ASC蛋白，可以在体外合成ASC斑点(Fernandes-Alnemri等人，2007)。
国际专利申请WO 2009/014863公开了ASC蛋白和焦亡体(pyroptosome)可以用于自身免疫性疾病的治疗和诊断中。根据该申请，含有ASC二聚体和半胱天冬酶原-1的凋亡小体和焦亡体结构在巨噬细胞中的早期炎症应答期间出现。半胱天冬酶-1的激活依赖于焦亡体的形成。通过从巨噬细胞中分离焦亡体来诊断炎症状态。
在MF59佐剂化的流感疫苗接种后，假设ASC蛋白在触发抗原特异性体液应答中发挥作用(Ellebedy等人，2011)。
此外，通过专利申请WO 2013/160807中公开的发明，已发现ASC斑点载体可以装载有抗原和/或生物活性分子，以便用于疫苗接种。所述发明已由本发明的发明人开发。在其中，已发现生物活性分子的稳定性可以通过作为载体的ASC斑点增强至少30天，并且它们可以承受至少8次冻融循环而不降解。换言之，所提及的申请公开了可用于一般而言的疫苗的组合物。然而，尚未公开ASC斑点本身或包含ASC斑点的组合物用于治疗癌细胞或肿瘤的治疗效应。
因而，现有技术文献无一提到ASC斑点在癌症治疗中的作用。
发明内容
本发明的目的是提供新的癌症治疗方法。
本发明涉及ASC (含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白)斑点在癌症免疫疗法中的用途。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含ASC斑点载体和肿瘤抗原的组合物，用于癌细胞或肿瘤的治疗性治疗。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含ASC斑点载体的组合物，其中所述ASC斑点由ASC蛋白和肿瘤抗原的融合蛋白形成。
在本发明的另一个实施方案中，由于其加强针对肿瘤细胞的免疫系统的能力，ASC斑点用于癌症治疗中。
此外，在本发明的另一个实施方案中，提供了用于癌症治疗中的包含ASC斑点的组合物，优选包含ASC斑点和肿瘤抗原的组合的组合物，其中所述方法包括诱导和/或刺激针对哺乳动物，特别是人受试者中的癌症疾病的免疫应答，其中所述诱导或刺激导致癌症进展的减少或癌细胞的生长停滞。
附图说明
图1. 从HEK293FT细胞系生产和纯化tOVA-ASC斑点。a)编码tOVA-ASC的p-C3-d(1-238) OVA-ASC质粒。纯化的tOVA-ASC斑点的考马斯蓝染色(b)、抗hASC印迹(c)和明场图像(d)。e)纯化的mCherry-ASC斑点的荧光图像。
图2. 通过PMA分化的THP-1巨噬细胞的mCherry-ASC斑点吞噬。a)在处理后12小时获取THP-1巨噬细胞的明场图像和荧光图像。b)用PBS、mCherry和mCherry-ASC处理的THP-1巨噬细胞的抗hASC印迹。c)吞噬的mCherry-ASC斑点的流式细胞术分析。
图3. THP-1巨噬细胞对吞噬的mCherry-ASC斑点的降解。在mCherry-ASC处理后12小时，获取吞噬和降解的mCherry-ASC斑点的荧光图像。
图4. mCherry-ASC斑点的完全降解导致宿主细胞中的炎性小体复合物形成。通过THP-1巨噬细胞吞噬的mCherry-ASC斑点的抗hASC染色的荧光图像(a-b)和合并图像(c)。d)合并图像中的蓝色帧的3X放大图像。
图5. 通过mCherry-ASC处理的促炎细胞因子分泌。a)在THP-1巨噬细胞经mCherry-ASC处理后，用RT-qPCR测定NLRP3、半胱天冬酶原-1和ASC的mRNA表达水平，测定IL-1β(b)和TNF-α (c)分泌水平。(误差条显示两个生物重复之间的SD值。)
图6. 通过PMA分化的THP-1巨噬细胞的tOVA-ASC斑点的吞噬。a)在tOVA-ASC、PBS、OVA与抗hASC抗体后12小时的THP-1巨噬细胞的免疫细胞化学。b)在PBS、OVA和tOVA-ASC处理后，THP-1巨噬细胞的抗OVA和c)抗hASC印迹。
图7. 在tOVA-ASC处理后，来自PMA分化的THP-1巨噬细胞的促炎细胞因子分泌。通过ELISA测定用PBS，10 µg OVA，2 µg、5 µg和10 µg tOVA-ASC斑点处理的THP-1巨噬细胞的IL-1β (a)、TNF-α (b)和IL-6 (c)分泌水平。
图8. 在OVA脉冲后，来自tOVA-ASC注射动物的脾细胞的细胞因子分泌水平。脾细胞用OVA进行脉冲或不进行脉冲。通过ELISA从细胞的上清液中测定脾细胞的细胞因子水平。(关于OVA组，n=4，并且关于tOVA-ASC组，n=6。)
图9. 用于肿瘤模型的产生鸡卵清蛋白的EG7-OVA细胞系。a) EG7-OVA细胞系的抗OVA印迹。b) EG7-OVA肿瘤模型实验的时间线。(OVA：43kDa)
图10. 在tOVA-ASC注射后EG7-OVA肿瘤的进展。a)在注射后，对于所有注射的平均肿瘤体积。(每个点代表一个肿瘤。) b)每个肿瘤分别在不同组中的进展。c)切除肿瘤的平均重量。(对于PBS，n=3，对于OVA，n=5，且对于tOVA-ASC注射，n=8。)
图11：在tOVA-ASC斑点的两次注射腹膜内注射后，皮下接种的EG7-OVA肿瘤的根除。获取来自PBS、OVA和tOVA-ASC注射动物的切除肿瘤的照片。tOVA-ASC注射动物的8个肿瘤中的6个已完全根除。
图12. 100 µg tOVA-ASC注射的携带EG7-OVA肿瘤的C57BL/6小鼠的OVA特异性IgG应答。抗OVA IgG应答通过ELISA在紧在处死动物之前获取的血浆中进行测定。(对于PBS，n=1，对于OVA，n=4，且对于tOVA-ASC注射，n=6。)
图13. 在皮下接种的EG7-OVA肿瘤中，检测到腹膜内注射的tOVA-ASC斑点。tOVA-ASC、OVA和PBS注射动物的肿瘤样品的抗TMS1印迹。
图14. CD11C+树突状细胞浸润到tOVA-ASC注射动物的EG7-OVA肿瘤内。PBS、OVA和tOVA-ASC注射动物的50 um肿瘤切片由低温恒温器取出，并且用抗CD11c抗体染色。(CD11c：树突状细胞标记物。白色箭头显示CD11c+细胞，且红色箭头显示肿瘤组织的间隙中的非特异性抗体残留物。)
图15. tOVA-ASC注射动物的脾脏中的T细胞扩增。来自PBS和tOVA-ASC注射动物的切除脾脏的脾细胞用抗CD4、抗CD8和抗B220抗体进行染色，并且用流式细胞仪分析细胞百分比。(CD4：T辅助细胞，CD8：细胞毒性T细胞，B220：B细胞标记物；误差线显示tOVA-ASC组中的动物之间的SD值。)
图16. 腹膜内注射的mCherry-ASC定位于一只动物的肠系膜淋巴结中。PBS、mCherry和mCherry-ASC注射的动物被麻醉并在在第1天(a)和第2天(b)在IVIS机器下在580nm处被激发。
图17. 腹膜内注射的mCherry-ASC斑点引流至次级淋巴器官。PBS、mCherry和mCherry-ASC注射动物的淋巴结(A)和脾脏(B)经由超声处理进行裂解，并且用抗TMS-1抗体进行印迹。
图18. 用于免疫具有EG7-OVA肿瘤的小鼠的疫苗接种时间线。
图19. 在免疫后的肿瘤体积。在免疫后，与其它组相比，tOVA-ASC组具有最高的抗肿瘤活性。mCh-ASC+OVA组给出可讨论的结果，因为其中之一在免疫后具有完全根除的肿瘤。每个点代表每只小鼠(n=4)。
图20. EG7-OVA模型的实验组的OVA特异性IgG应答。OVA特异性IgG应答对于tOVA-ASC免疫小鼠是最高的。与OVA组相比，mCh-ASC+OVA组具有更高的OVA特异性IgG水平。对于OVA、mCh-ASC+OVA和tOVA-ASC组与PBS组的比较，存在IgG水平的显著增加(对于每组，n=4)。
具体实施方式
本发明的主要目的是开发新型癌症免疫治疗方法。这通过使用在炎症信号传导途径中具有关键功能的ASC蛋白来实现。
ASC蛋白，也称为PYCARD，是由PYCARD基因编码的衔接蛋白。它具有N末端PYRIN结构域、C膜端半胱天冬酶募集结构域(CARD)和它们之间的接头区。ASC蛋白在经由CARD-CARD相互作用的半胱天冬酶原-1和经由PYRIN-PYRIN相互作用的核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)蛋白之间形成桥。
胞质溶胶中的NLR蛋白家族感知病原体相关分子模式(PAMP)和危险相关分子模式(DAMP)。某些NLR，如NLRP3和AIM2，诱导炎性小体复合物的形成。半胱天冬酶-1经由与ASC蛋白的相互作用，在炎性小体多蛋白复合物中被激活。活化的半胱天冬酶-1将前IL-1β和前IL-18切割成其成熟形式，并且这些细胞因子释放到细胞外空间以诱导炎症。
在未受刺激的细胞中，ASC可溶于胞质溶胶中。在刺激后，ASC蛋白聚集在一起并且形成称为ASC斑点的球状结构。ASC斑点可以分泌到细胞的外部，以加速免疫细胞的募集。
为了本发明的目的，鸡卵清蛋白(OVA)用作模型抗原。
由于当前佐剂的分子作用机制之一是增强通过APC的抗原摄取，因此将THP-1单核细胞系用于细胞培养实验。为了理解ASC斑点是否已被APC吞噬，使PMA分化的THP-1巨噬细胞分别经受tOVA-ASC斑点和mCherry-ASC斑点。采用该实验，已显示了tOVA-ASC斑点和mCherry-ASC斑点两者均以浓度依赖性方式被巨噬细胞吞噬(图2)。此外，已显示了吞噬的mCherry-ASC斑点被THP-1巨噬细胞降解，并且在荧光显微镜和共聚焦显微镜下在细胞的不同位置处发现(图3)。
炎性小体是常用佐剂明矾以及目前生产的佐剂AS03和MF59的靶之一。为了理解根据本发明提议的佐剂ASC斑点是否可以引起THP-1巨噬细胞中的炎症应答，促炎蛋白的mRNA表达水平改变；用RT-qPCR测定NLRP3、ASC和半胱天冬酶原-1。在这方面，显示了当与仅mCherry蛋白处理相比时，在mCherry-ASC斑点处理后的促炎蛋白的表达水平增加到至少1.5倍(图5)。
为了支持RT-qPCR数据，在用mCherry-ASC斑点或tOVA-ASC斑点处理后，通过ELISA测定IL-1β、TNF-α和IL-6细胞因子分泌水平。IL-1β分泌以时间和浓度依赖性方式增加。在较早时间(处理后12小时)，TNF-α分泌水平的增加是浓度依赖性方式，而在以后时间点(处理后24小时)，没有观察到TNF-α分泌水平的差异(图6)。tOVA-ASC处理以浓度依赖性方式增加IL-1β分泌。在每个浓度下的tOVA-ASC斑点处理引起比10 ug OVA处理更多的IL-1β。在tOVA-ASC处理后，TNF-α和IL-6水平以浓度依赖性方式增加，并且细胞因子的分泌水平高于10 ug OVA处理。因而，通过抗原与ASC融合形成的ASC斑点导致来自THP-1巨噬细胞的炎性细胞因子分泌(图6)。通过这些RT-qPCR和ELISA数据，得出结论ASC斑点处理导致巨噬细胞中的炎症应答增加。
抗体滴度并非良好疫苗的唯一标准，并且通过CD4+细胞的细胞因子产生可以是与良好免疫的更有力关联(Plotkin，2010)。为了理解由免疫细胞中的tOVA-ASC斑点引起的T辅助细胞的细胞因子产生，执行了离体回忆测定法(ex vivo recall assay)，并且伴随和不伴随OVA脉冲，测量了TNF-α、IFN-γ和IL-4水平。IFN-γ是主要由T淋巴细胞和天然杀伤细胞产生的细胞因子，并且在抑制肿瘤进展和转移中起重要作用(Farrar，M. A.和R. D.Schreiber，“The Molecular Cell Biology of Interferongamma and its Receptor"，Annual Review of Immunology，第11卷，第1期，第571- 611页，4 1993)。它也已用作直接的抗病毒剂。它在疫苗接种后由1型T辅助细胞特异性产生，并导致延迟型超敏反应和因而细胞介导的免疫(Romagnani，S.，“Type 1 T helper and type 2 T helper cells:functions，regulation and role in protection and disease."，International journal of clinical & laboratory research，第21卷，第2期，第152-8页，1991；Godfroid，J.，G. Czaplicki，P. Kerkhofs，V. Weynants，G. Wellemans，E. Thiry和J. J.Letesson，“Assessment of the cell-mediated immunity in cattle infection afterbovine herpesvirus 4 infection，using an in vitro antigen-specific interferon-gamma assay."，Veterinary microbiology，第53卷，第1-2期，第133-41页，11 1996.)。采用离体回忆测定法，本发明的发明人已显示了OVA脉冲和非脉冲的tOVA-ASC斑点注射动物的脾细胞均分泌IFN-γ，并且分泌水平在OVA脉冲后降低，而其它组仅在OVA脉冲后分泌IFN-γ。在这方面，认为tOVA-ASC斑点可以引起没有抗原特异性的细胞免疫应答的形成。
TNF-α是促炎细胞因子，并且可以是体液和细胞免疫应答两者形成所必需的。然而，它也导致NK细胞的功能丧失，且从而降低IFN-γ的分泌和针对某些类型癌症的细胞毒性活性(Romero-Reyes，M.，C. Head，N. A. Cacalano和A. Jewett，“Potent induction ofTNF-α during interaction of immune effectors with oral tumors as a potentialmechanism for the loss of NK cell viability and function"，Apoptosis，第12卷，第11期，第2063-2075页，9 2007.)
在本发明的实验中，每只动物的脾细胞在OVA脉冲后分泌TNF- α，但来自tOVA-ASC和Alum+OVA注射动物两者的脾细胞的分泌少于OVA注射动物。
IL-4细胞因子主要由2型T辅助细胞产生，并且称为IFN-γ的相互拮抗剂。它在体内调控B细胞生长和嗜酸性粒细胞募集(Smiley，S. T.和M. J. Grusby，“Interleukin 4"，Encyclopedia of Immunology，第1451-1453页，Elsevier，1998.)。来自每只动物的脾细胞的IL-4分泌在OVA脉冲后降低，然而，伴随和不伴随OVA脉冲，tOVA-ASC注射动物的脾细胞分泌最高量的细胞因子。
因而，本发明的发明人显示了，来自tOVA-ASC注射动物的脾细胞的TNF-α和IL-4分泌水平与注射常用佐剂明矾+OVA的动物非常相似(图8)。提议的佐剂(ASC斑点)和明矾佐剂之间的差异在于在OVA脉冲前的IFN-γ分泌。由于IFN-γ引起更多的细胞介导的免疫应答，因此ASC斑点可以用于加强细胞免疫。
如上文提到的，免疫疗法是研究最多的针对癌症的研究领域之一。已尝试开发疫苗佐剂以加强患者针对癌症的细胞免疫应答，并且IFN-γ是主要将免疫系统引导至细胞免疫部分的主要细胞因子之一。由于tOVA-ASC斑点引起来自脾细胞的IFN-γ分泌，因此通过在C57BL/6中进行EG7-OVA肿瘤模型，检查了tOVA-ASC斑点对肿瘤形成的体内作用。为此，将2.5×106个EG7-OVA细胞皮下接种到小鼠的背侧，并且在肿瘤达到可触及大小时，开始腹膜内tOVA-ASC斑点注射。由于肿瘤大小显示异质性且动物数目是有限的，因此将小鼠分为实验组和对照组，其中每组至少具有一个小肿瘤、一个中尺寸肿瘤和一个大肿瘤。PBS和OVA注射作为阴性对照完成。
在第一次注射后7天，tOVA-ASC注射动物中的四个肿瘤被完全根除，而同时在OVA注射动物中又形成了一个肿瘤。然后，在第7天完成加强注射。在加强注射两天后，在tOVA-ASC组中，另外两个肿瘤被完全根除。PBS组中的一只动物死亡。由于tOVA-ASC注射动物的肿瘤进展显示了tOVA-ASC斑点对EG7-OVA肿瘤具有某种治疗作用，并且tOVA-ASC组仅剩下2个肿瘤，因此结束实验以理解ASC斑点的这种治疗效应的细胞机制和分子机制。在动物的尸检过程中，对于尸检前肿瘤已完全根除的动物的肿瘤接种，仅发现结缔组织，而没有发现任何残留的肿瘤组织。PBS和OVA组中肿瘤的平均重量为约2 g，而它在tOVA-ASC组中为0.03 g(图9)。
用动物血清的进一步实验显示了，在tOVA-ASC注射动物中，OVA特异性IgG应答成功地增加到大约18 ug/ml，因为它对于PBS和OVA组分别为5 ug/ml和8 ug/ml(图12)。tOVA-ASC组的IgG应答增加可能主要由两个原因引起。首先，由于EG7-OVA肿瘤不断产生OVA蛋白，如果tOVA-ASC斑点引起小鼠中的一般免疫爆发，则它可能导致针对OVA的抗体产生。其次，这可能通过腹膜内注射的tOVA-ASC斑点的加倍量引起。
此外，本发明的发明人认识到腹膜内注射的tOVA-ASC斑点迁移到动物之一中的皮下接种的EG7-OVA肿瘤部位，并且至少以tOVA-ASC蛋白形式完整地保持在其中(图13)。基本上，它可能由于肿瘤微环境周围的密集血管化和这些血管的渗漏，通过tOVA-ASC斑点从腹膜内位点进入循环并渗漏到肿瘤中引起。另一个原因可能是tOVA-ASC斑点被APC吞噬，并且这些APC以某种方式在肿瘤中积聚。由于肿瘤浸润的成熟DC赋予免疫激活和免疫效应细胞募集的增加，因此已用IHC染色检查了DC是否浸润到肿瘤内。使用染色常规/经典DC亚型的CD11C+抗体。
该亚型具有限定的特有形态，具有MHC II类表达(Collin，M.，N. McGovern和M.Haniffa，“Human dendritic cell subsets."，Immunology，第140卷，第1期，第22-30页，92013.)。本发明的发明人已显示了，CD11C+ DC定位于注射tOVA-ASC的动物之一的肿瘤低温恒温器中[图14]。有趣的是，在CD11C+DC浸润性肿瘤中发现了tOVA-ASC。IHC和蛋白质印迹数据增加了tOVA-ASC斑点被DC携带到肿瘤微环境的可能性。
重复EG7-OVA肿瘤模型，以理解tOVA-ASC斑点的治疗效应的分子机制和细胞机制。将EG7-OVA细胞接种到24只小鼠的每个背侧，但仅形成4个肿瘤。为了理解tOVA-ASC斑点对免疫细胞扩增和肿瘤浸润的作用，将PBS和tOVA-ASC注射到携带这4个肿瘤的动物中。第一次注射后7天，tOVA-ASC注射动物的一个肿瘤开始缩小，并且在第10天，它不再可触及。然后，结束实验，以用流式细胞术分析测定脾脏中的辅助T细胞、细胞毒性T细胞和B细胞的百分比。与PBS注射动物相比，tOVA-ASC注射动物的脾脏中的CD4+和CD8+细胞比例增加(图15)。通过来自脾细胞的细胞因子分泌和流式细胞术分析两者，可以得出结论，tOVA-ASC注射导致C57BL/6小鼠中的辅助T细胞活化的形成。
疫苗一般进行皮下、肌内或腹膜内注射，以刺激免疫。通过将抗原引流到其中APC与淋巴细胞相互作用的淋巴结，增加了疫苗的成功率(Johansen，P.和T. M. Kündig，“Intralymphatic immunotherapy and vaccination in mice."，Journal of visualized experiments : JoVE ，第84期，第e51031页，2 2014 ；Tozuka，M.，T. Oka，N. Jounai，G.Egawa，K. J. Ishii，K. Kabashima和F. Takeshita，“Efficient antigen delivery tothe draining lymph nodes is a key component in the immunogenic pathway of theintradermal vaccine"，Journal of Dermatological Science，第82卷，第1期，第38-45页，4 2016.)。此外，通过迁移性DC将抗原从注射部位递送到淋巴器官增加了CTL引发的效率(Allan，R. S.，J. Waithman，S. Bedoui，C. M. Jones，J. A. Villadangos，Y. Zhan，A.M. Lew，K. Shortman，W. R. Heath和F. R. Carbone，“Migratory Dendritic CellsTransfer Antigen to a Lymph Node-Resident Dendritic Cell Population forEfficient CTL Priming"，Immunity，第25卷， 第1期，第153-162页，7 2006. )。为了理解ASC斑点是否触发抗原引流至次级淋巴结，将mCherry-ASC斑点腹膜内注射到C57BL/6小鼠中，并且使用IVIS技术进行显现。有趣的是，当它们在580 nm处激发时，在免疫后一天识别来自mCherry-ASC注射动物的脾脏和肠系膜淋巴结的红色荧光信号，而在PBS以及仅注射mCherry的动物中不存在荧光信号(图16)。此外，本发明人通过在注射两天后处死动物后，执行来自肠系膜淋巴结和脾组织的抗hASC印迹来验证IVIS结果(图17)。
在本说明书的实验部分中解释了测试的细节。下文解释了关于这些实验及其结果的简短信息。
首先，通过p-C3-d (1-238) OVA-ASC质粒产生tOVA-ASC蛋白(包括239和386之间的氨基酸序列的OVA的截短形式与人ASC蛋白的融合蛋白)。
OVA的截短形式包括OVA的两个T细胞表位；在257和268氨基酸之间的OVA肽以及在323-339氨基酸之间的OVA肽分别是MHC I类和MHC II类表位(Lipford，G. B.，M. Hoffman，H. Wagner和K. Heeg，“Primary in vivo responses to ovalbumin. Probing thepredictive value of the Kb binding motif."，Journal of immunology(Baltimore， Md. : 1950)，第150卷，第4期，第1212-22页，2 1993；McFarland，B. J.，A. J. Sant，T. P.Lybrand和C. Beeson，“Ovalbumin (323-339) peptide binds to the majorhistocompatibility complex class II I-A(d) protein using two functionallydistinct registers."，Biochemistry，第38卷，第50期，第16663-70页，12 1999)。tOVA-ASC蛋白用于产生tOVA-ASC斑点。
另外，通过将tOVA蛋白装载到ASC斑点来产生tOVA+ASC斑点，然后将其用于调查ASC斑点在癌症免疫治疗中的佐剂效应。
因此，重要的是注意，有不同的方式将肿瘤抗原装载到ASC斑点。关于将根据本发明的一般而言的生物活性分子，特别是肿瘤抗原，装载到ASC斑点的一些方法，参考公开的专利申请WO 2013/160807 (用于抗原递送的方法)。
例如，可以经由疏水相互作用或通过形成至少一种抗原与形成ASC斑点载体的ASC蛋白的融合蛋白，将肿瘤抗原装载到ASC斑点载体。
具有亲水性质的抗原不能经由单独的疏水相互作用由ASC斑点载体携带。相应地，在一个实施方案中，通过产生抗原与包含至少13个氨基酸长和疏水序列的肽的融合蛋白，具有亲水性质的抗原可以经由疏水相互作用装载到ASC斑点载体。
其次，根据WO 2013/160807中描述的方法生产且纯化mCherry-ASC斑点。mCherry是用作成像系统的跟踪剂的红色荧光蛋白。
用上文提到的ASC斑点进行的实验已显示了，纯化的ASC斑点被巨噬细胞吞噬且降解。此外，已证明了用纯化的ASC斑点刺激THP-1巨噬细胞诱导炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。此外，已显示了，tOVA-ASC斑点注射导致来自免疫的野生型C57BL/6小鼠的脾细胞的I型和II型细胞因子分泌。最后，本发明的发明人已证实了tOVA-ASC注射导致C57BL/6小鼠中的EG7-OVA肿瘤的完全根除或尺寸减小。
如上文提到的，鸡卵清蛋白(OVA)用作用于本发明目的的模型抗原。克隆p-C3-d(1-238)OVA-ASC质粒，用于生产tOVA-ASC (包括239和386之间的氨基酸序列的OVA(鸡蛋清蛋白)的截短形式与人ASC蛋白的融合蛋白)。
为了测试ASC斑点在体内和对THP-1细胞系的免疫刺激作用，在HEK293 FT细胞系中产生了mCherry-ASC斑点和tOVA-ASC斑点。为了测定tOVA-ASC斑点的纯度和浓度，将具有预定浓度的纯化斑点和BSA装载到SDS-PAGE内，并且用考马斯蓝进行染色，如图1中可见的。完成分离蛋白质的抗hASC印迹，以了解纯化的蛋白质是否是tOVA-ASC。
为了调查ASC斑点对抗原摄取的作用，PMA分化的THP-1巨噬细胞用10 ug/ml、25ug/ml、50 ug/ml和100 ug/ml的mCherry-ASC斑点进行处理。PBS和50 ug/ml的商业mCherry蛋白用作阴性对照。在处理后12小时，在用PBS和mCherry蛋白处理的孔中并未观察到mCherry信号，但mCherry-ASC斑点处理的细胞吞噬了mCherry-ASC斑点，如图2中可见的。处理的细胞的hASC印迹也显示了吞噬和降解的mCherry-ASC蛋白。
为了确认荧光数据并对其进行定量，重复相同的实验并在处理后12小时，用流式细胞术来计数mCherry阳性细胞。mCherry阳性细胞的数目随着处理中的mCherry-ASC斑点浓度增加而增加。通过这些实验，已显示了ASC斑点增强了THP-1巨噬细胞对mCherry蛋白的吞噬。
在荧光显微镜下检测到吞噬的mCherry-ASC斑点被THP-1巨噬细胞降解(图3)。在mCherry-ASC处理后4小时，当使用荧光显微镜的40X物镜时，红色荧光信号来自细胞的细胞质，并且它也通过细胞的细胞质扩散，而不是斑点样结构。
在用10 µg mCherry-ASC斑点、10 µg mCherry和10 µg PBS处理后，用RT-qPCR测定NLRP3 ASC和半胱天冬酶原-1 (促炎蛋白)的表达水平。HPRT，管家基因，用作qPCR的对照，并且所有基因表达都根据HPRT表达进行标准化。与mCherry处理相比，NLRP3、半胱天冬酶原-1和ASC的表达水平在mCherry-ASC处理后显著增加，如图5中可见的。
为了了解ASC斑点在吞噬后是否引起促炎应答，在mCherry-ASC处理后12和24小时，从PMA分化的THP-1巨噬细胞的培养基中测定分泌的细胞因子。PBS、模拟纯化样品和商业mCherry蛋白用作阴性对照。mCherry-ASC斑点处理以时间和浓度依赖性方式增加IL-1β和TNF-α水平的分泌，而mCherry和模拟纯化样品处理的细胞分泌以基础水平的细胞因子，如图5中可见的。
因而，已推测，即使THP-1巨噬细胞中的ASC斑点并未使所使用的肽具有抗原性，肽的吞噬也得到增强并且可以形成炎症应答。
此外，为了察看tOVA-ASC斑点是否也被APC吞噬，PMA分化的THP-1巨噬细胞用10ug/ml tOVA-ASC斑点进行处理，并且在处理后12小时，完成用抗hASC抗体的免疫细胞化学测定法。10 ug/ml OVA和PBS用作阴性对照。Alexa-488缀合的抗小鼠IgG用作二抗。图6中的弱绿色荧光信号显示内源性ASC，因为它通常在细胞中发现为遍布细胞质分布，但在炎症激活后，它形成斑点样结构。图6中的点状强绿色荧光信号显示了THP-1巨噬细胞吞噬tOVA-ASC斑点。
为了确保所有斑点都不是内源性形成的，完成用抗TMS1 (兔中产生的hASC抗体)的蛋白质印迹分析。对于蛋白质印迹分析，THP-1巨噬细胞用2.5 ug/ml、5 ug/ml和10 ug/ml的tOVA-ASC进行处理。10 ug/ml OVA和PBS再次用作阴性对照。在处理后12小时，用PBS将孔洗涤3次，以去除尚未被吞噬的tOVA-ASC斑点，并且用抗TMS1和抗OVA完成蛋白质印迹分析。
如图6中可见的，条带的大小为约39 kDa，其显示了来自tOVA-ASC斑点的点状绿色荧光信号。另外，OVA可以被巨噬细胞吞噬，无需佐剂或疫苗载体(图6中的第3泳道)。
还收集了细胞的培养基，以通过ELISA测定分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。tOVA-ASC斑点处理显著增加了IL-1β和IL-6分泌(图7)。来自THP-1巨噬细胞的IL-1β分泌在tOVA-ASC处理的每个浓度下高于10 µg OVA处理，并且它以浓度依赖性方式增加。在tOVA-ASC处理后的IL-6分泌水平以剂量依赖性方式增加，并且它在10 µg /ml tOVA-ASC处理中高于单独的10 µg /ml OVA处理。TNF-α水平也随着tOVA-ASC量的浓度增加而增加。然而，在10 µg/ml OVA和10 µg /ml tOVA-ASC处理之间在TNF-α分泌方面不存在显著差异。
合成鸡卵清蛋白的C57BL/6小鼠胸腺瘤细胞系EG7-OVA是用于抗原特异性肿瘤疫苗研究的最常用的肿瘤模型之一。它们在用G418处理时表达OVA。在接种到小鼠之前，EG7-OVA细胞系的OVA表达用抗OVA印迹进行显示，如图9中所示的。
为了在8-10周龄的C57BL/6小鼠中形成肿瘤，将250万个EG7-OVA细胞接种到小鼠的每个背侧内。在接种后12天，18个肿瘤达到可触及的大小，并且起始在300 µl PBS中的100 µg tOVA-ASC的腹膜内注射，如图9中所示的。50 µg OVA和PBS用作阴性对照。在第一次免疫后，每隔一天用两位数卡尺测定肿瘤的两个尺寸。
在第一次注射后的第4天，注射tOVA-ASC的动物中的一个肿瘤被完全根除。在第一次注射后的第7天，注射tOVA-ASC的动物中的另外三个肿瘤被完全根除，并且在注射OVA的动物之一中又形成一个肿瘤。在第一次免疫后1周，与第一次中一样重复加强注射。在第二次免疫后一天，注射PBS的动物之一死亡，可能是因为它具有的肿瘤尺寸。在第二次注射后的第2天，注射tOVA-ASC的动物中的另外两个肿瘤被完全根除，如图10中可见的。
由于在第二次免疫后的第4天的第二次注射后仅剩下2个肿瘤，结束实验，以对注射tOVA-ASC的动物的肿瘤进行进一步分析。显示了每组中的每个肿瘤的进展。将所有动物处死。在其肿瘤已经根除的注射tOVA-ASC的动物中没有识别到肿瘤组织。注射OVA的动物之一具有在同一背侧中的两种分开的肿瘤组织。注射PBS、OVA和tOVA-ASC的切除肿瘤的平均体积分别为1935 mm3、1690 mm3和62 mm3，如图11中所示的。注射PBS、OVA和tOVA-ASC的肿瘤的平均肿瘤重量分别为2.5 g、2.11 g和0.07 g，如图11中所示的。
因而，tOVA-ASC斑点的两次注射导致每个肿瘤的大小减小，以及8个EG7-OVA肿瘤中的6个的完全根除，而注射PBS和OVA的动物的肿瘤在C57BL/6小鼠的背侧中继续生长，如图10中所示的。
由于tOVA-ASC斑点的抗肿瘤效应可以由针对OVA的抗体应答引起，因此通过ELISA测定动物的OVA特异性IgG水平。由于PBS组中的一只动物在处死前已经死亡，因此无法获取该动物的血液，并且仅对于PBS组的一只动物进行进一步的实验。因而，注射tOVA-ASC的动物比注射PBS和OVA的动物具有更多的OVA IgG应答，如图12中可见的。
已进行了进一步的测试，以调查ASC斑点的佐剂效应。
存在包括PBS、OVA、tOVA-ASC和mCh-ASC+OVA实验组的4组。将仅PBS、仅100 µgOVA、仅100 µg tOVA-ASC以及100 µg mCh-ASC和100 µg OVA一起腹膜内注射到每组小鼠中。PBS是阴性对照组，因为OVA和ASC斑点两者均悬浮于PBS中。为了调查ASC斑点的佐剂效应，执行OVA注射，以察看单独的OVA免疫是否足以减小肿瘤大小。另外，mCh-ASC和OVA组是察看与OVA组相比，ASC斑点的佐剂性质的模型。在该实验中，tOVA-ASC组是模型组，以察看ASC斑点作为抗原特异性抗肿瘤疫苗的载体能力。用于免疫具有EG7-OVA肿瘤的小鼠的疫苗接种时间线在图18中可见。
在EG7-OVA细胞接种后14天，肿瘤形成达到可触及的大小，以起始免疫。如图19中可见的，在第一次免疫后7天，尽管PBS、OVA和mCh-ASC+OVA组的肿瘤大小增加，但tOVA-ASC斑点免疫的小鼠的肿瘤大小几乎没有进展。然后，向每组注射第二个剂量。
在第二次免疫后7天，mCh- ASC+OVA免疫的小鼠之一和tOVA-ASC免疫的小鼠中的三只具有完全根除的肿瘤。来自仅OVA免疫的小鼠的肿瘤之一在2次注射后保持在相同的大小。mCh-ASC+OVA免疫的小鼠之一在2次注射后停留在稳定的肿瘤大小。在最后一次免疫后，将所有动物处死。最后，tOVA-ASC免疫的小鼠之一显示在注射后的肿瘤生长模式。
抗体已用于靶向肿瘤细胞的临床试验中。这些抗体与肿瘤细胞上的抗原结合，并且诱导直接细胞溶解或抗体促进的吞噬作用，导致抗原的加工以及经由APC上的MHC I类或II类分子的呈递。这种情况通过在宿主中产生针对肿瘤的抗体和/或细胞毒性T细胞来诱导宿主的抗肿瘤免疫。观察到tOVA-ASC斑点的抗肿瘤效应，因此，这种抗肿瘤活性可以由抗体促进的抗肿瘤免疫引起。为了显示宿主中的抗原特异性抗体产生，执行ELISA，以察看针对EG7-OVA肿瘤的OVA特异性IgG应答。
如图20中可见的，PBS是阴性对照组，并且与用PBS的其它组相比，对于OVA、mCh-ASC+OVA和tOVA-ASC组获得OVA特异性IgG水平的增加。当包括OVA的组彼此进行比较时，与OVA组相比，mCh-ASC+OVA组的IgG应答显著更高。另外，与OVA组相比，tOVA-ASC组的IgG应答显著更高。这显示了ASC斑点可以通过作为佐剂加强免疫系统，并且通过携带抗原以在宿主中诱导抗肿瘤免疫而具有抗肿瘤活性。
最后，已显示了腹膜内注射的mCherry-ASC斑点进入次级淋巴结，其对于适应性免疫系统的触发是重要的。
由于次级淋巴结是T细胞应答的主要位置，本发明的发明人通过IVIS和蛋白质印迹分析检查了腹膜内注射的mCherry-ASC斑点是否可以转运至肠系膜淋巴结和脾脏内。为此，将200 ul PBS中的10 ug mCherry-ASC斑点腹膜内注射到八只16-18周龄的C57BL/6小鼠中。作为阴性对照，四只动物和八只动物分别用PBS和商业mCherry蛋白进行注射。在注射后一、二和十天，在IVIS机器下监测动物。在第2天，将一半的动物处死，并且收集它们的脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏和脑用于蛋白质印迹分析。在第10天将另一半处死并收集相同的组织。
如图16中可见的，当动物在56-580 nm波长处激发时，黄色指示IVIS中的高强度的红色荧光信号，并且C57BL/6动物的腹部和生殖器区域给出背景荧光。然而，在注射后一天，在注射mCherry-ASC的动物的肠系膜淋巴结区域之一出现强烈荧光。在第10天，荧光强度对于每只动物是几乎相同的。
为了支持IVIS数据，所有获取的组织都用兔中产生的抗hASC进行印迹，以检测注射的mCherry-ASC斑点。如图17中可见的，在一只动物的肠系膜淋巴结和另一只动物的脾脏中检测到mCherry-ASC蛋白。此外，在脾脏的抗hASC印迹的较低条带中可见mCherry-ASC蛋白的降解。
相应地，在本发明的一个实施方案中，ASC斑点(其由ASC蛋白形成)用于癌症治疗中，因为实验已证实了它们加强针对肿瘤细胞的免疫系统的能力。
在另一个实施方案中，提供了用于癌症治疗方法中的包含ASC斑点的组合物，其中所述方法包括诱导和/或刺激针对哺乳动物中的癌症疾病的免疫应答，其中所述诱导或刺激导致癌症进展的减少或癌细胞的生长停滞。
在另一个实施方案中，提供了包含肿瘤抗原以及由ASC蛋白形成的ASC斑点分子的组合物，其用于癌症治疗中。
在另一个实施方案中，提供了用于癌症疗法中的ASC斑点的组合物，其中所述组合物含有通过与形成ASC斑点的ASC蛋白形成疏水相互作用，而由ASC斑点携带的肿瘤抗原。
根据本发明的一个实施方案，组合物包含由肿瘤抗原和至少一种ASC蛋白的融合蛋白形成的ASC斑点。所述组合物用于癌症的治疗中，特别是用于肿瘤的治疗中。
上文提到的融合蛋白可以由在N末端或C末端处与ASC蛋白融合的肿瘤抗原形成。
在本发明的另一个实施方案中，优选通过与形成ASC斑点的ASC蛋白形成疏水相互作用，组合物包含在ASC斑点内部携带的肿瘤抗原。
本发明涉及治疗任何类型的癌症，优选形成肿瘤的癌症，且更优选胸腺癌。
根据一个实施方案，本发明的组合物用于癌症免疫疗法中，由此将其施用于有需要的哺乳动物导致肿瘤进展的减少或肿瘤大小的减小或肿瘤的完全根除。
在本发明的另一个实施方案中，提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含ASC斑点的组合物的步骤。所述组合物优选进一步包含肿瘤抗原；优选地，肿瘤抗原通过与形成ASC斑点的ASC蛋白形成融合蛋白而由ASC斑点携带。
在另一个实施方案中，提供了包含肿瘤抗原结合的ASC斑点载体的组合物，其中所述ASC斑点载体通过ASC蛋白和肿瘤抗原的融合蛋白的寡聚化形成。
可以用于本发明的肿瘤抗原的实例是用于乳腺癌的HER2+ (膜结合蛋白)，用于前列腺癌的PSA (大小为34 kDa的糖蛋白)，用于黑色素瘤癌的MAGE (黑色素瘤相关抗原)，用于导管糖蛋白的MUC1 (跨膜糖蛋白)或新抗原。这些仅作为示例给出，任何其它肿瘤相关抗原都可以用于本发明的目的。
在本发明的另外一个实施方案中，包含肿瘤抗原结合的ASC斑点载体的组合物用于胸腺肿瘤的治疗中，其中ASC斑点由ASC和肿瘤抗原的融合蛋白形成。
实验
材料：
实验中使用的材料的细节显示于下文。
表1. 细胞系
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2. 细胞培养基
Figure 200894DEST_PATH_IMAGE002
表3. 细胞培养液
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4. 蛋白质印迹溶液
Figure 118034DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表5. ELISA溶液
溶液 成分
洗涤缓冲液 PBS，pH 7.2-7.4中的0.05% Tween 20
试剂稀释剂 PBS，pH 7.2-7.4中的过滤的1% BSA
底物溶液 显色试剂A (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)和显色试剂B (四甲基联苯胺)的1:1混合物。
终止溶液 2N H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
表6. 抗体
Figure 960088DEST_PATH_IMAGE006
表7. 质粒
p-C3-d(1-238)OVA-ASC AKIL，土耳其
p-C3-mCherry-ASC AKIL，土耳其
表8. 注射成分
十二水合硫酸铝钾 237086 Sigma，德国
完全弗氏佐剂(CFA) 344289 Calbiochem，德国
不完全弗氏佐剂(ICFA) SC37726 Santa Cruz，USA
鸡卵清蛋白 A5503 Sigma，德国
mCherry 4993-100 Bio Vision，USA
表9. 试剂盒
小鼠IL-4 DuoSet ELISA DY404-05 R&D Systems，USA
小鼠IFN-γ DuoSet ELISA DY485-05 R&D Systems，USA
小鼠TNF-α DuoSet ELISA DY410-05 R&D Systems，USA
人IL-1 β/IL-1F2 DuoSet ELISA DY201 R&D Systems，USA
人IL-6 DuoSet ELISA DY206 R&D Systems，USA
人TNF-α DuoSet ELISA DY210 R&D Systems，USA
NucleoBond Xtra Midi 740410.50 Macherey-Nagel，德国
NucloeSpin RNA 740955.50 Macherey-Nagel，德国
方法：
1. tOVA-ASC和mCherry-ASC斑点的纯化
1.1. 质粒DNA扩增和分离
将p-C3-d (1-238) OVA-ASC和p-C3-mCherry-ASC质粒克隆并用于该研究。按照制造商的建议，通过使用MACHEREY- NEGEL (MN)试剂盒完成中型和大型制备。细菌培养物分别在补充有卡那霉素的200 ml和400 ml LB中生长，用于中型和大型制备。
1.2. HEK293FT细胞系的维持
将HEK293FT细胞系维持在补充有10% FBS、MEM-NEA、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的DMEM中。当细胞达到90%汇合时，将板用PBS洗涤，并且在37℃下用胰蛋白酶消化2分钟以传代培养。
1.3. 磷酸钙转染
HEK293FT细胞系容易地通过磷酸钙转染法进行转染，其导致质粒DNA和磷酸钙的不溶性沉淀物的形成。这些沉淀物被HEK293FT细胞吞噬。将1400万个细胞接种到150 mm细胞培养板内。根据实验通过在ddH2O中稀释来调整质粒浓度，并且逐滴加入2M CaCl2。在5分钟后，加入2X HBS并形成气泡。在5分钟后，在传代培养过程中，将质粒和磷酸钙混合物逐滴添加到HEK293FT细胞上。
表10. 转染混合物。
Figure 168347DEST_PATH_IMAGE007
1.4. ASC斑点的产生和分离
计数了1400万个HEK293FT细胞，并且在六块150 mm细胞培养板的每一块上铺平板。(pC3-(d1-235) OVA-ASC)质粒DNA经由磷酸钙转染法进行转染。在转染48小时后，吸出细胞的培养基并加入3 ml PBS。通过刮取使细胞从表面脱离并且放到50 ml falcon内。在50%的功率下，经由5秒超声处理(对于30%)，将细胞裂解5次。裂解的细胞在4℃下用Beckman台式离心机以2400 g进行离心。在离心后，使沉淀溶解，直到细丝可容易地通过涡旋检测到。大的细胞碎片经由重力沉降在冰上沉降5分钟。将上清液小心地转移到新的50 mlfalcon中，并且以300 g离心5分钟。吸出上清液并将沉淀溶解于10 ml PBS中。通过涡旋再次溶解沉淀，直到细丝可见。细丝再次经由重力沉降进行沉降5分钟。
将上清液放到新的falcon内，并且以300 g进行离心。重复最后一次涡旋、重力沉降和离心，直到涡旋后不再存在细丝。最后一个样品通过1.2或5 µm注射器式过滤器进行过滤。对于每个过滤器通过3-4 ml样品，直到感应到背压。用200 µl微量移液器，将2-3ml PBS反向施加于过滤器，以将ASC斑点拯救到15 ml falcon内。反向滤液以3900 g离心1小时。将沉淀溶解于500 µl PBS中。PBS中的ASC斑点保持在+4℃下。经由SDS-PAGE和考马斯蓝染色来检查ASC斑点的纯度。除了超声处理之外的所有步骤都在细胞培养罩中完成。
1.5. 用SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定分离的ASC斑点的纯度和量
40 µl以不同浓度的分离ASC斑点和BSA分别与10 µl 5X Leamli缓冲液在1.5 ml管中混合。使它们在95℃下煮沸10分钟，并且在12% SDS-PAGE凝胶上装载预染色的蛋白梯。如蛋白质凝胶电泳部分中所述的运行样品。凝胶在塑料容器中用考马斯蓝染色1小时，然后用考马斯脱色液进行脱色。获取凝胶照片，并且用ImageJ软件，根据衍生自BSA浓度的标准曲线来计算ASC斑点的浓度。
2. ASC斑点对THP-1巨噬细胞的作用
2.1. THP-1单核细胞系的维持
THP-1是衍生自白血病患者的单核细胞系。提供了THP-1细胞，并且经由pLenti-Ef1a-EGFP-ASC的慢病毒转导，从THP-1单核细胞衍生组成性合成eGFP-ASC的THP-1 eGFP-ASC稳定细胞系。将细胞系维持在补充有10% FBS、MEM-NEA、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640中。
2.2. THP-1单核细胞向THP-1巨噬细胞的分化
在6孔板的每个孔中，用含有100 nm/ml PMA的RPMI 1640，将1.5x106个THP-1单核细胞分化为THP-1巨噬细胞共9小时。然后，用不含PMA的RPMI 1640更换细胞的培养基。
2.3. 用ASC斑点处理THP-1巨噬细胞
在分化后48小时，将mCherry-ASC或tOVA-ASC斑点以不同浓度给予到1 ml的细胞培养基上，以察看ASC斑点对巨噬细胞的作用。收集细胞的培养基并且保持在-20℃下，用于在不同时间点的进一步的细胞因子ELISA测定法。在ASC斑点处理12小时后制备用于流式细胞术分析的THP-1巨噬细胞，使细胞与PBS-EDTA一起在冰上温育30分钟。然后，通过轻轻刮取使细胞从细胞培养板脱离，并且放到15 ml离心管内。将细胞以300 g离心5分钟，并且用含有人血清的FACS缓冲液洗涤两次。如细胞表面染色和流式细胞术分析部分中所述的，对它们的细胞表面蛋白进行染色且分析。
2.4. THP-1巨噬细胞的免疫细胞化学
1.6x105个THP-1单核细胞在48孔板中分化成THP-1巨噬细胞，并且用ASC斑点进行处理。在ASC处理后12小时，吸出细胞的培养基并且用PBS将孔洗涤3次。然后，将细胞在室温下用4% PFA固定15分钟。在用PBS将细胞洗涤3次后，用包括0.25% Triton- X100去污剂的PBS，对它们进行渗透化处理。然后，在室温下用封闭缓冲液(5% BSA (w/v)的PBS-T溶液)将细胞封闭30分钟。然后，使细胞与封闭缓冲液中的1/50稀释的抗hASC抗体一起在室温下温育2小时。细胞再次用PBS进行洗涤，并且在室温下与1/500稀释的Alexa-488荧光团缀合的抗小鼠IgG一起温育1小时。在二抗的温育后，将细胞洗涤并且在荧光显微镜下显现。
2.5. 细胞因子ELISA
用夹心ELISA测定细胞的培养基中的细胞因子水平。简言之，ELISA板以制造商建议的浓度用PBS中的捕获抗体进行包被，并且在RT下温育过夜。对于每个上清液样品包被96孔板的三个孔，并且仅用PBS进行包被的三个孔作为阴性对照。在过夜温育后，用400 µlPBS-T将板洗涤3次，并且在RT下用200 µl试剂稀释剂(1% BSA的PBS溶液)封闭1小时，以防止非特异性结合。在板封闭期间，将细胞的上清液在试剂稀释剂中稀释至最终的OD值低于2.00。在封闭后，用PBS-T将板洗涤3次，并且将100μl稀释样品和细胞因子标准加入孔中，并且在室温下温育2小时。然后，将板再次用PBS-T洗涤3次，并且以制造商建议的浓度与检测抗体一起在100 µl试剂稀释剂中在RT下温育2小时。
在板洗涤后，将100 µl在试剂稀释剂中1:50稀释的HRP加到孔上，并且在RT下温育1小时。然后，再次洗涤板，并且将100 μl 1:1混合的ELISA底物A和ELISA底物B加到孔上，并且颜色开始转为蓝色。在底物添加20分钟后，用1N硫酸终止反应，并且颜色从蓝色变成黄色。用微板阅读器在450 nm和540 nm处计算孔的OD值，并且从吸光度450中提取在540处的吸光度。用SoftMaxPro软件根据标准品的吸光度值和浓度绘制标准曲线，并且由标准曲线确定上清液中的细胞因子水平。
2.6. 用RT-qPCR测定ASC斑点处理后的THP-1巨噬细胞中的促炎蛋白的表达模式
在ASC斑点处理后，在PMA分化的THP-1细胞中，用实时定量PCR测定蛋白质在mRNA水平上的表达模式。用10、25、50和100 µg的mCherry-ASC斑点处理THP-1巨噬细胞12小时。仅PBS和50 µg mCherry蛋白用作对照。
2.6.1. RNA提取。
细胞用PBS洗涤3次并经由刮取收集，并且按照制造商的建议用MN RNA提取试剂盒提取RNA。简言之，用裂解缓冲液裂解细胞，并且在与70%乙醇混合后，使裂解物与柱结合。在几个洗涤步骤后，柱在RT下用在DNA酶温育缓冲液中的DNA酶I处理15分钟。再次用洗涤缓冲液洗涤柱并干燥。然后用60 µl无RNA酶的水分离总RNA。用Nanodrop分光光度计测量RNA的纯度和浓度。
2.6.2. cDNA合成。
按照制造商的建议，使用BIOLINE SensiFAST cDNA合成试剂盒，从总RNA合成cDNA。简言之，将500 ng总RNA与4 µl 5X TransAmp缓冲液和1 µl逆转录酶在DEPC处理的H20 (最终体积：20 µl)中混合。使样品在25℃下温育10分钟，在42℃下温育15分钟，并且在85℃下温育5分钟用于失活。
2.6.3. 定量PCR。
对每种基因特异性的引物和作为对照的HPR-T用于测试ASC斑点处理后的目的基因的相对表达水平。使用Exicycler 96 qPCR机器，用BIOLINE SensiFAST SYBR MasterMix扩增cDNA样品。通过将PBS处理的细胞中的基因表达水平调整为1，并且使用2-ddct方法(Livak和Schmittgen 2001)，来确定目的基因的相对表达。
3. EG7-OVA肿瘤模型和tOVA-ASC免疫
3.1. EG7-OVA细胞系的维持
提供了EG7-OVA细胞系。EG7-OVA衍生自C57BL/6小鼠淋巴瘤细胞系EL-4。EL4细胞系用包括完整形式的鸡卵清蛋白(OVA)和新霉素抗性基因的pAc-neo-OVA质粒进行稳定转染，以形成EG7-OVA细胞系，其在用G418处理时组成性合成作为模型肿瘤抗原的OVA蛋白。将细胞系维持在补充有10% FBS、MEM-NEA、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素、2-巯基乙醇和0.4 mg/ml G418的RPMI 1640中。每两天更换细胞的培养基。
3.2. EG7-OVA肿瘤接种以及用OVA、PBS和tOVA-ASC的免疫
将100 µl PBS中的250万个EG7-OVA细胞接种到12只C57BL/6小鼠的每个背侧。18个肿瘤在12天内达到可触及的大小(<50 mm3)。如下完成腹膜内注射：在300 µl PBS中的100 µg tOVA-ASC (n=10)、50 µg商业OVA (n=5)和仅PBS (n=3)。用两位数卡尺测定肿瘤的两个尺寸。体积基于以下计算进行计算：1/2((短的长度^2)长的长度)。第二次注射如第一次进行重复。注射PBS的动物之一可能在第20天死亡。由于在第二次注射后仅剩下2个肿瘤，结束实验，以对注射tOVA-ASC的动物的肿瘤进行进一步分析。从眶窦中收集所有动物的血液。处死所有动物并收集动物的脾脏。切除动物的肿瘤，计算其体积和重量。在其肿瘤已经根除的注射tOVA-ASC的动物中没有识别到肿瘤组织。将每只动物的血浆保持在-20℃下。收获动物的脾细胞并且在96孔板中培养，用于进一步的离体回忆测定法。将动物的肿瘤在OCT中包埋，用于进一步的免疫组织化学测定法。将来自每组的肿瘤的一小部分分开用于蛋白质印迹分析，并且保持在-80℃下。
3.3. EG7-OVA肿瘤接种以及用PBS、OVA、tOVA-ASC和mCherry-ASC的免疫
与上述实验类似，已对于另外的mCherry-ASC免疫进行另一种测试。对于每只小鼠接种在100 µl 1X PBS中的2.5x106个EG7-OVA细胞。在接种前，这些细胞的OVA表达通过使用抗OVA抗体的蛋白质印迹分析进行检查。在无菌条件下制备细胞。对每只小鼠的右背侧执行这些细胞的接种。当肿瘤在12-14天后达到可触及的大小(≥ 50mm3)时，如下执行腹膜内注射：仅1X PBS、在300 µl 1X PBS中的100 µg OVA，100 µg OVA与100 µg mCherry ASC和100 µg tOVA ASC。用卡尺测定肿瘤的尺寸。根据下式计算每个肿瘤的体积：1/2[(短的长度2).长的长度]。第二次注射与第一次注射一样进行重复。
在第二次注射后1周结束实验，因为用tOVA ASC免疫的小鼠的大部分肿瘤被根除。经由卡尺计算动物的肿瘤。然后，将所有动物处死。从它们的心脏中收集它们的血液。另外，收集它们的脾脏和肝脏用于进一步分析。将动物的肿瘤切除并在OCT中包埋。所有组织都保持在冰上，直到最后一只小鼠的实验结束。收集的血样在37℃下温育1小时，然后它们以11000 rpm离心1分钟。将血液的血清收集到新的管内，并且保持在-80℃下用于长期贮存。
3.4. 肿瘤和脾脏的免疫组织化学
3.4.1. OCT包埋。将肿瘤样品放入OCT化合物中，并且在-20℃下保持过夜，然后保持在-80℃下用于进一步分析。
3.4.2. 冷冻切片。将OCT包埋的肿瘤样品以正确的方向放置到冷冻切片仪器中，并且用刀片去除不含组织的冷冻OCT。然后，适当地使用低温恒温器，将10微米的肿瘤切片置于带正电荷的载玻片上。载玻片在55℃下进行干燥，并且保持在-80℃下用于进一步分析。
3.4.3. 固定和抗原修复。载玻片在55℃下干燥2小时，并且组织切片被疏水屏障包围。然后，将组织在RT下用4% PFA固定15分钟。去除PFA，并且在振荡器上的罐中，用PBS-T将载玻片洗涤3次。将载玻片转移到填充有柠檬酸盐缓冲液(pH：6.0)的另一个罐中，并且在70℃下保持30分钟。
3.4.4. 低温恒温器切片的抗体染色。在载玻片用PBS-T洗涤3次后，它们在振荡器上在室温下用封闭缓冲液(3% BSA的PBS-T溶液)封闭30分钟。然后，使载玻片与1/400稀释的荧光标记的一抗一起在封闭缓冲液中在4℃下温育过夜。在过夜温育后，将载玻片用PBS-T洗涤3次5分钟，并且在荧光显微镜下显现。
3.5. 来自EG7-OVA肿瘤的单细胞制备
使用剪刀将肿瘤切除并切碎，直到所有组织切片都被加工成1-2 mm切片。使用来自一次性使用的10 ml注射器的柱塞，将切碎的样品针对细胞滤网进行解聚。用3-5 ml的冷RPMI 1640洗涤细胞滤网上的肿瘤组织。将洗涤步骤重复几次，直到仅观察到在过滤器中留下的结缔组织的小碎片。将细胞用RPMI 1640洗涤3次并且在RT 300 g下离心5分钟。
3.6. 用于OVA特异性IgG应答的ELISA
通过ELISA测定OVA特异性IgG应答。简言之，96孔ELISA板覆盖有100 ng/孔在100μl PBS中稀释的OVA蛋白，并且3个孔用于阴性对照，其仅包括PBS。将板密封并在4℃下温育过夜。将每个孔吸出并且用300 µl洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤3次。在最后一次洗涤后，通过用干净的纸巾纸将板吸干，来去除剩余的洗涤缓冲液和气泡。将200 µl试剂稀释剂(1% BSA的PBS溶液)加入每个孔中，并且使板在RT下温育最少1小时，最多2小时。重复洗涤步骤。在最后一次洗涤后，通过用干净的纸巾纸将板吸干，来去除剩余的洗涤缓冲液和气泡。加入100µl的标准品(从25 pg/ml到5000 pg/ml)或样品(1:500稀释)，并且板用拉伸膜进行覆盖并在RT下温育1小时。重复洗涤步骤，并且在最后一次洗涤后，执行相同的清洁方案。将100 µl1:2000抗小鼠IgG HRP连接的二抗加入每个孔中，并且板用拉伸膜进行覆盖并在RT下温育1小时。重复洗涤步骤，并且在最后一次洗涤后，执行相同的清洁方案。将100 µl底物混合物(显色试剂A和B的1:1混合物)加入每个孔中，使板避开直射光，并且使板在RT下温育20分钟。然后，向每个孔中加入20 µl终止溶液(2N H2SO4)。轻轻敲击板以确保充分混合。经由板阅读器，在450和540 nm处测量每个孔的吸光度。
4. 体内mCherry-ASC斑点的跟踪
mCherry-ASC斑点用于在腹膜内注射后跟踪ASC斑点。8只C57BL/6小鼠用在300 µlPBS中的10 µg mCherry-ASC进行腹膜内注射。作为对照，注射在300 µl PBS中的10 µgmCherry和仅300 µl PBS(作为对照组)。8只小鼠和4只小鼠分别使用mCherry和PBS注射。
4.1. 体内成像
IVIS Spectrum体内成像系统用于在体内显现注射的mCherry-ASC斑点，并且在第1、2和10天，在IVIS Spectrum机器下监测动物。
4.2. 用于蛋白质印迹和免疫组织化学的组织取样
在第2天，将来自每组的一半动物处死，并且在第10天，将另一半处死。切除动物的脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏和脑。在IVIS下离体监测脾脏。挑选来自脾脏的代表性部分用于蛋白质印迹分析，并且将其它部分在OCT化合物中包埋并贮存于-80℃下。将动物的肠系膜淋巴结、肝脏和脑保持在-80℃下，用于进一步的蛋白质印迹分析。
5. 蛋白质印迹分析
5.1. 来自细胞培养物的样品制备
基因在蛋白质水平上的表达模式和调控一般通过蛋白质印迹分析进行检测。为了分析细胞中的蛋白质表达，6孔板的每个孔用1 ml PBS进行洗涤，或者将细胞离心并用1 mlPBS进行洗涤，分别用于贴壁和悬浮细胞培养物。在PBS吸出后，将160 µl补充有0.2% NP40裂解缓冲液的蛋白酶抑制剂复合物加到细胞上。对于贴壁细胞系，用刮刀和微量移液器将细胞收集到1.5 ml管中。收集的细胞在冰上保持1小时并且每15分钟进行涡旋，用于细胞的完全裂解。通过在4℃下以13000 rpm离心30分钟来沉淀较大的细胞碎片。将上清液移至另一个1.5 ml管中。然后，将40 µl 5X Laemmli缓冲液加到样品上，并且使蛋白质在Laemmli缓冲液中在95℃下变性10分钟。
5.2. 来自组织的样品制备
在2 ml试管中，将200 µl裂解缓冲液加到大组织(脾脏、肝脏、脑和肿瘤)和整个肠系膜淋巴结的切碎且冷冻的代表性部分上。在70%功率下，经由1分钟超声处理(对于50%)，对组织进行裂解，并且在冰上保持15分钟。然后将组织裂解物以13000 rpm离心30分钟，以去除较大的碎片和结缔组织部分。将上清液放到新的1.5 ml管内并进行稀释。然后，适当地加入5X Laemmli缓冲液，并且使蛋白质在95℃下变性15分钟。
5.3. SDS-PAGE凝胶制备
将8ml 10%、12%或15%分离胶溶液与80 µl 10% APS和8 µl TEMED混合。在混合溶液后，在1.5 mm垫片和短板之间装载凝胶。然后，将异丙醇覆盖到凝胶上以保持表面。在分离胶的聚合后，去除异丙醇，并且通过将40 µl 10% APS和4 µl TEMED混合来制备4 ml 4%浓缩胶。将浓缩胶装载到分离胶上并且插入10孔梳。当浓缩胶的聚合完成后，SDS-PAGE凝胶用于蛋白质凝胶电泳。
5.4.蛋白质凝胶电泳
将蛋白质装载到SDS-PAGE凝胶上，以根据其kDa将其分开。将浇铸的SDS-PAGE凝胶置于垂直蛋白质凝胶电泳槽中，并且用运行缓冲液填充槽。小心取出梳，并且将35 µl在Leamli缓冲液中的变性蛋白质样品和蛋白梯装载到孔内。使样品在70V下运行，直到它们通过浓缩胶，并且在120 V下运行，直到染料到达分离胶的底部。
5.5. 半干转印
将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜用于抗体印迹。简言之，使硝酸纤维素膜在甲醇中活化，并且将膜和2张滤纸在转移缓冲液中润湿。将一张滤纸、滤膜、SDS-PAGE凝胶和另一张滤纸分别置于半干转印仪上。盖上仪器盖，并且在10V下完成从SDS-PAGE到硝酸纤维素膜的蛋白质转移共50分钟。
5.6.膜封闭
将蛋白质转移的膜放到塑料容器内，并且用5% (w/v)脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭1小时，以防止检测抗体的非特异性结合。
5.7. 抗体温育
将一抗在5% (w/v)BSA的TBS-T溶液中稀释，并且将叠氮化钠加入抗体溶液中，以抑制在4℃下的微生物生长。在膜封闭后，将它们用TBS-T洗涤3次5分钟。使膜与以适当稀释度的一抗一起在4℃下温育过夜。将制备的抗体稀释物保持在4℃下并且使用5-10次用于温育。一抗温育的膜用TBS-T洗涤3次5分钟。通过在5% (w/v)脱脂奶粉的TBS-T溶液中稀释HRP缀合的抗小鼠或抗兔抗体1/2000 (v/v)，来制备二抗溶液。使膜与二抗稀释物一起在RT下温育1小时。
5.8. 蛋白质的显现
在二抗温育后，将膜用TBS-T洗涤3次5分钟，然后将它们在2 ml 1:1混合的ECL蛋白质印迹底物中进行包被。然后，使用Syngene Gbox Chemi化学发光成像装置，显现膜上的蛋白质条带。
6. 细胞表面染色和流式细胞术分析
100万个细胞在FACS管中用3 ml FACS缓冲液洗涤两次。弃去上清液，并且加入5 µl Fc封闭剂和10 µl荧光染料缀合的抗体。使细胞与抗体一起在+4℃下温育30分钟。用3 mlFACS缓冲液再次将细胞洗涤3次。弃去上清液，并且将细胞重悬浮于1 ml FACS缓冲液中。用BD Acuri和FlowJo软件分析细胞表面标记物的上调。

Claims (14)

1.一种用于癌症治疗方法中的组合物，其包含由ASC蛋白形成的ASC斑点。
2.根据权利要求1使用的组合物，其中所述方法包括诱导和/或刺激针对哺乳动物中的癌症疾病的免疫应答，其中所述诱导或刺激导致癌症进展的减少或癌细胞的生长停滞。
3.根据权利要求1或2使用的组合物，其中所述癌症是胸腺癌。
4.根据权利要求1至3中任一项使用的组合物，其中所述组合物进一步包含肿瘤抗原。
5.根据权利要求4使用的组合物，其中所述肿瘤抗原通过与形成ASC斑点的ASC蛋白形成疏水相互作用而由ASC斑点携带。
6.根据权利要求4使用的组合物，其中所述肿瘤抗原作为融合蛋白的部分由ASC斑点携带，所述融合蛋白由所述肿瘤抗原和至少一种形成ASC斑点的ASC蛋白形成。
7.根据权利要求6使用的组合物，其中所述肿瘤抗原在N末端或C末端处与ASC蛋白融合。
8.根据权利要求4至7中任一项使用的组合物，其中所述肿瘤抗原在ASC斑点内部携带。
9.根据权利要求1至8中任一项使用的组合物，其中所述癌症是形成肿瘤的癌症，并且所述方法包括肿瘤进展的减少或肿瘤大小的减小。
10.一种用于在哺乳动物中生成对癌症的免疫应答的组合物，其包含ASC斑点载体和肿瘤抗原。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述肿瘤抗原作为融合蛋白的部分由ASC斑点载体携带，所述融合蛋白由所述肿瘤抗原和至少一种形成ASC斑点的ASC蛋白形成。
12.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含ASC斑点的组合物的步骤。
13.根据权利要求12的方法，其中所述组合物每周施用一次。
14.根据权利要求12或13的方法，其中所述组合物进一步包含肿瘤抗原。
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