CN110402145A - 用于增强免疫应答的信使核糖核酸及其使用方法 - Google Patents
用于增强免疫应答的信使核糖核酸及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开的特征在于编码增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽的分离的mRNA，所述多肽诸如激活I型干扰素途径信号传导或NFkB信号传导的多肽，所述mRNA包括含有一个或多个经修饰的核碱基的mRNA。本公开的特征还在于使用所述分离的mRNA，例如，当与一种或多种感兴趣抗原一起施用时用于增强免疫应答，诸如以刺激抗癌免疫应答或抗病原体免疫应答的方法。
Description
相关申请
本申请要求以下申请的权益：2016年10月26日提交的美国临时专利申请序列号62/412,933；2017年3月3日提交的美国临时专利申请序列号62/467,034；2017年4月26日提交的美国临时专利申请序列号62/490,522；以及2017年9月13日提交的美国临时专利申请序列号62/558,206。上面提到的申请的全部内容通过该引用并入本文。
发明背景
调控免疫应答的能力在多种临床情况(包括治疗癌症和病原性感染，以及增强疫苗应答以提供保护性免疫)下是有益的。存在许多用于调控参与诸如癌症和病原性感染等疾病的生物途径和/或分子的功能的治疗工具。这些工具包括例如小分子抑制剂、细胞因子和治疗性抗体。这些工具中的一些通过调控受试者的免疫应答而起作用，诸如调控免疫系统内的细胞活性的细胞因子，或者调控对免疫应答的调节的免疫检查点抑制剂抗体(诸如抗CTLA-4或抗PD-L1)。
此外，疫苗长期以来用于刺激针对病原体抗原的免疫应答，从而提供针对后来暴露于这些病原体的保护性免疫。最近，已经使用在肿瘤细胞上发现的抗原开发了疫苗，从而增强抗肿瘤免疫应答性。除了疫苗中所使用的一种或多种抗原之外，其他剂也可以包含在疫苗制剂中，或与该疫苗制剂组合使用，以进一步增强对疫苗的免疫应答。增强疫苗应答性的此类剂在本领域中称为佐剂。常用疫苗佐剂的实例包括铝凝胶和盐、单磷酰脂质A、MF59水包油型乳剂、弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)、弗氏不完全佐剂(Freund’sincomplete adjuvant)、去污剂和植物皂苷。这些佐剂通常与基于蛋白质或肽的疫苗一起使用。目前正在开发替代类型的疫苗，诸如基于RNA的疫苗。
本领域需要增强对感兴趣抗原的免疫应答的另外的有效剂。
发明内容
本公开提供了编码增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽的信使RNA(mRNA)，这些信使RNA在本文中称为免疫增强剂构建体。在某些实施方案中，这些信使RNA(mRNA)是经化学修饰的，在本文中称为经修饰的mRNA(mmRNA)，其中该mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基。作为替代，该mRNA可以完全包含未经修饰的核碱基。在一个实施方案中，免疫增强剂构建体涉及编码下述多肽的信使RNA(mRNA)，该多肽增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答(任选地其中所述mRNA包含一个或多个经修饰的核碱基)，并且其中该免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
在某些实施方案中，免疫增强剂mRNA构建体(或免疫增强剂mRNA构建体的组合)将对感兴趣抗原的免疫应答，例如相对于在不存在该免疫增强剂的情况下对该抗原的免疫应答，或相对于增强对该抗原的免疫应答的小分子激动剂在大小上成倍增强。例如，在各种实施方案中，相比于例如在不存在该免疫增强剂mRNA构建体的情况下对感兴趣抗原的免疫应答，或者相比于例如在存在对感兴趣抗原的免疫应答的小分子激动剂的情况下对该抗原的免疫应答，该免疫增强剂mRNA构建体将对该抗原的免疫应答增强0.3至1000倍、1至750倍、5至500倍、7至250倍或10至100倍。在一些实施方案中，相比于例如在不存在该免疫增强剂mRNA构建体的情况下对感兴趣抗原的免疫应答，或者相比于例如在存在对感兴趣抗原的免疫应答的小分子激动剂的情况下对该抗原的免疫应答，该免疫增强剂mRNA构建体将对该抗原的免疫应答增强至少2倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或更大倍数。
感兴趣抗原可以是受试者体内的内源性抗原(例如，内源性肿瘤抗原)，或用免疫增强剂构建体提供给受试者的外源性抗原(例如，外源性肿瘤抗原或病原体抗原，包括疫苗抗原)。因此，本公开的免疫增强剂mRNA可用于刺激或加强针对感兴趣抗原的体内免疫应答，这些感兴趣抗原诸如治疗癌症中的肿瘤抗原，或者治疗病原性疾病或针对病原性疾病接种疫苗中的病原体抗原。
在一个实施方案中，感兴趣抗原是内源性抗原，诸如肿瘤抗原，并且将mRNA免疫增强剂构建体提供给有需要的受试者，以刺激或加强针对该肿瘤抗原的免疫应答。在某些实施方案中，该mRNA免疫增强剂构建体与一种或多种另外的剂(例如，mRNA构建体)组合施用，以便例如通过诱导免疫原性细胞死亡(诸如通过坏死性凋亡或细胞焦亡)来促进内源性抗原释放。因此，在另一个方面，本发明提供了编码诱导免疫原性细胞死亡(诸如坏死性凋亡或细胞焦亡)的多肽的mRNA构建体(例如，mmRNA)。在一些方面，由这些mRNA诱导的免疫原性细胞死亡导致胞质溶胶组分从细胞(例如，肿瘤细胞)释放，使得在体内刺激针对细胞抗原(例如，内源性肿瘤抗原)的免疫应答。
在其他实施方案中，感兴趣抗原是由mRNA诸如经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码的外源性抗原，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mRNA上提供或与免疫增强剂在不同的mRNA构建体上提供。配制(或共同配制)免疫增强剂mRNA和抗原mRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该抗原的免疫应答。
在一些方面，本公开提供了编码增强免疫应答的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA构建体)，其中增强免疫应答的方式例如：刺激I型干扰素途径信号传导、刺激NFkB途径信号传导、刺激炎症应答、刺激细胞因子产生，或者刺激树突状细胞的发育、活性或动员。通过免疫增强剂mRNA增强对感兴趣抗原的免疫应答引起例如以下结果：刺激细胞因子产生、刺激细胞免疫(T细胞应答)诸如抗原特异性CD8+或CD4+ T细胞应答和/或刺激体液免疫(B细胞应答)诸如抗原特异性抗体应答，或者前述应答的任意组合。
在一些方面，本公开提供了编码下述多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，该多肽在至少一种Toll样受体(TLR)的下游起作用，从而增强免疫应答，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码刺激I型干扰素应答的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码刺激NFkB介导的促炎应答的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码作为细胞内衔接蛋白的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码作为细胞内信号传导蛋白的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码作为转录因子的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码参与坏死性凋亡或坏死体形成的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。在一些方面，本公开提供了编码参与细胞焦亡或炎性体形成的多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽的实例在本文中提供。还提供了包含两种或更多种免疫增强剂mRNA(相同类型或不同类型)的组合的组合物。
在一些方面，本公开提供了编码组成型活性人STING多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)。在一个方面，该组成型活性人STING多肽包含选自V147L、N154S、V155M、R284M、R284K、R284T、E315Q、R375A和它们的组合的一个或多个突变。在一些方面，该组成型活性人STING多肽包含V155M突变(例如，具有以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列，或者由以SEQ IDNO:199、1319或1320示出的核苷酸序列编码)。在一些方面，该组成型活性人STING多肽包含突变V147L/N154S/V155M。在其他方面，该组成型活性人STING多肽包含突变R284M/V147L/N154S/V155M。在其他方面，该组成型活性人STING多肽包含以SEQ ID NO:1-10和224中的任一者示出的氨基酸序列。在另一个方面，该组成型活性人STING多肽由以SEQ ID NO:199-208、225、1319、1320、1442-1450和1466中的任一者示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码组成型活性人IRF3多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)。在一个方面，该组成型活性人IRF3多肽包含S396D突变。在一个方面，该组成型活性人IRF3多肽包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列，或由以SEQ ID NO:210或SEQ ID NO:1452示出的核苷酸序列编码。在一个方面，该组成型活性IRF3多肽是小鼠IRF3多肽，例如包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列，或由以SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:1453示出的核苷酸序列编码。
在还有其他方面，本公开提供了编码组成型活性人IRF7多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)。在一个方面，该组成型活性人IRF7多肽包含选自S475D、S476D、S477D、S479D、L480D、S483D、S487D和它们的组合的一个或多个突变；氨基酸247-467缺失；以及前述突变和/或缺失的组合。在一个实施方案中，该组成型活性人IRF7多肽包含以SEQ ID NO:14-18中的任一者示出的氨基酸序列。在一个实施方案中，该组成型活性人IRF7多肽由以SEQ ID NO:213-217和1454-1459中的任一者示出的核苷酸序列编码。
在还有其他方面，本公开提供了编码某一多肽的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)，所述多肽选自MyD88、TRAM、IRF1、IRF8、IRF9、TBK1、IKKi、STAT1、STAT2、STAT4、STAT6、c-FLIP、IKKα、IKKβ、RIPK1、TAK-TAB1融合物、DIABLO、Btk、自激活半胱天冬酶-1和Flt3。
在其他方面，本公开提供了mRNA组合物(例如，mmRNA组合物)，这些组合物包含编码一种或多种感兴趣抗原的一种或多种mRNA构建体(例如，mmRNA构建体)，和增强针对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽，其中所述一种或多种抗原和多肽由同一个mRNA(mmRNA)构建体或单独的mRNA(mmRNA)构建体编码，所述单独的mRNA构建体可以共同配制，然后同时或相继地施用于有需要的受试者。本文所述免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)中的任意一些(单独或组合的)可用于一种或多种组合物中，以增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答。
因此，在一些方面，本公开提供了包含编码增强免疫应答的多肽的第一mRNA(例如，mmRNA)和编码至少一种感兴趣抗原的第二mRNA(例如，mmRNA)的组合物，任选地其中所述第一mRNA和第二mRNA包含一个或多个经修饰的核碱基，并且其中当将该组合物施用于受试者时，所述多肽增强对至少一种感兴趣抗原的免疫应答。在一个方面，该组合物包含编码至少一种感兴趣抗原和增强对所述至少一种感兴趣抗原的免疫应答的多肽这两者的单种mRNA构建体(例如，mmRNA)。在另一个方面，该组合物包含两种mRNA构建体(例如，mmRNA)，一种编码至少一种感兴趣抗原，另一种编码增强对所述至少一种感兴趣抗原的免疫应答的多肽。在一些方面，当该组合物包含两种mRNA构建体时，这两种mRNA构建体(例如，mmRNA)在相同的组合物(诸如，脂质纳米粒子)中共同配制，然后共同施用于受试者。在其他方面，当提供两种或更多种mRNA构建体时，此类mRNA构建体可以在不同的组合物(诸如，两种或更多种脂质纳米粒子)中配制，然后(例如，同时或相继地)施用于有需要的受试者。
在其他方面，本公开提供了一种组合物，其包含编码增强免疫应答的多肽的第一mRNA(例如，mmRNA)和编码至少一种感兴趣抗原的第二mRNA(例如，mmRNA)，其中所述至少一种感兴趣抗原是至少一种肿瘤抗原。在一个方面，所述至少一种肿瘤抗原是至少一种突变型KRAS抗原。在一个方面，所述至少一种突变型KRAS抗原包含选自G12D、G12V、G13D、G12C和它们的组合的至少一个突变。在一个方面，所述至少一种突变型人KRAS抗原包含如以SEQID NO:95-106和131-132中的任一者示出的氨基酸序列。在其他方面，该组合物包含编码至少一种突变型人KRAS抗原和组成型活性人STING多肽的mRNA构建体，例如其中该mRNA编码如以SEQ ID NO:107-130中的任一者示出的氨基酸序列。编码至少一种突变型人KRAS抗原和组成型活性人STING多肽的构建体的示例性mRNA核苷酸序列以SEQ ID NO:220-223和1462-1465示出。在其他方面，该肿瘤抗原是致癌病毒抗原(例如，人乳头瘤病毒(HPV)抗原，诸如HPV16 E6或HPV E7抗原、或它们的组合)。
在本公开组合物的其他方面，至少一种感兴趣抗原是至少一种病原体抗原。在一个方面，所述至少一种病原体抗原来自选自病毒、细菌、原生动物、真菌和寄生生物的病原体。在一个实施方案中，所述至少一种病原体抗原是至少一种病毒抗原。在一个方面，所述至少一种病毒抗原是至少一种人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一个方面，该HPV抗原是HPV16E6或HPV E7抗原、或它们的组合。在一个方面，该HPV抗原包含如以SEQ ID NO:36-94中的任一者示出的氨基酸序列。在本公开组合物的其他方面，所述至少一种病原体抗原是至少一种细菌抗原。在一个实施方案中，所述至少一种细菌抗原是多价抗原。
在一个实施方案中，感兴趣抗原是致癌病毒的一种或多种抗原，所述致癌病毒诸如人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、埃-巴二氏病毒(EpsteinBarr Virus，EBV)、人T细胞嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)疱疹病毒(KSHV)或梅克尔细胞(Merkel cell)多瘤病毒(MCV)。在一个方面，致癌病毒的感兴趣抗原由mRNA(例如，经化学修饰的mRNA)编码，并且与免疫增强剂构建体在相同的mRNA上提供或与免疫增强剂在不同的mRNA构建体上提供。在一些方面，配制(或共同配制)免疫增强剂和一种或多种病毒抗原mRNA，然后(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激针对该受试者体内的一种或多种致癌病毒抗原的免疫应答。本文描述了与免疫增强剂一起使用的合适的致癌病毒抗原。
在一个实施方案中，感兴趣抗原是构成个性化癌症疫苗的一种或多种肿瘤抗原。在一个方面，本公开提供了一种疫苗制剂，其包含编码对于癌症受试者有特异性的一种或多种癌症抗原(称为新表位(neoepitope))的mRNA(例如，mmRNA)，连同免疫增强剂构建体，其中所述癌症抗原和免疫增强剂由相同或不同的mRNA(例如，mmRNA)编码。本文描述了选择对于癌症受试者有特异性的癌症抗原以及基于其设计个性化癌症疫苗的方法。因此，在一个方面，本公开提供了个性化癌症疫苗，其包含由一种或多种mRNA(例如，经化学修饰的mRNA)编码的对于癌症受试者有特异性的一种或多种肿瘤抗原(例如，一种或多种新表位)，其中所述癌症新表位由相同的mRNA或不同的mRNA编码(例如，每个癌症新表位在单独的mRNA构建体上编码)。在一些方面，所述一种或多种癌症新表位与免疫增强剂构建体在相同的mRNA构建体上编码或与免疫增强剂在不同的mRNA构建体上编码。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mRNA和一种或多种癌症抗原mRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对所述一种或多种癌症抗原的免疫应答。
在一个方面，该mRNA构建体编码个性化癌症抗原，该抗原是由2至100个肽表位组成的多联癌症抗原。在另一个方面，该多联癌症抗原包括下列特征中的一种或多种：a)切割敏感性位点散布在2至100个肽表位之间；b)编码每个肽表位的mRNA彼此直接连接，而不使用接头连接；c)编码每个肽表位的mRNA使用单个核苷酸接头彼此连接；d)每个肽表位包含25至35个氨基酸，并且包括位于中心的SNP突变；e)这些肽表位的至少30％对来自受试者的I类MHC分子具有最高的亲和力；f)这些肽表位的至少30％对来自受试者的II类MHC分子具有最高的亲和力；g)这些肽表位的至少50％对于HLA-A、HLA-B和/或DRB1的预测结合亲和力IC>500nM；h)该mRNA编码20个肽表位；i)这些肽表位的50％对于I类MHC具有结合亲和力，并且这些肽表位的50％对于II类MHC具有结合亲和力；以及/或者j)编码这些肽表位的mRNA被排列成使得这些肽表位被排序成最大程度减少假表位(pseudo-epitope)。
在一些方面，该多联癌症抗原包含2至100个肽表位，其中每个肽表位包含31个氨基酸并且包括位于中心的SNP突变，在该SNP突变的每一侧都具有15个侧接氨基酸。在一些方面，这些肽表位是T细胞表位、B细胞表位，或T细胞表位和B细胞表位的组合。在一些方面，这些肽表位包含至少一个MHC I类表位和至少一个MHC II类表位。在一些方面，这些表位的至少30％是MHC I类表位，或者这些表位的至少30％是MHC II类表位。
在一个实施方案中，感兴趣抗原是至少一种细菌抗原，例如包含在相同或单独的mRNA(例如，mmRNA)上编码的至少一种细菌抗原和免疫增强剂构建体的细菌疫苗。在一个方面，本公开提供了一种细菌疫苗，其包含编码一种或多种细菌抗原连同免疫增强剂构建体的mRNA，其中所述细菌抗原和免疫增强剂由相同或不同的mRNA编码。因此，在一个方面，本公开提供了包含一种或多种细菌抗原(例如，由一种或多种经化学修饰的mRNA编码)的细菌疫苗(例如，多价疫苗)，其中所述细菌抗原由相同的mRNA或不同的mRNA编码(例如，每种细菌抗原在单独的mRNA构建体上编码)。在一些方面，这些细菌抗原与免疫增强剂构建体在相同的mRNA构建体上编码或与免疫增强剂在不同的mRNA构建体上编码。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mRNA和一种或多种细菌抗原mRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对所述一种或多种细菌抗原的免疫应答
在一些实施方案中，将该细菌疫苗施用于受试者以提供预防性治疗(即，预防感染)。在一些实施方案中，将该细菌疫苗施用于受试者以提供治疗性治疗(即，治疗感染)。在一些实施方案中，该细菌疫苗在受试者体内诱导体液免疫应答(即，产生对感兴趣的细菌抗原有特异性的抗体)。在一些实施方案中，该细菌疫苗在受试者体内诱导适应性免疫应答。合适细菌的非限制性实例包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
在一个实施方案中，感兴趣抗原是多价抗原(即，该抗原包含多个抗原表位，诸如包含相同或不同表位的多个抗原肽)，从而增强针对多价抗原的免疫应答。在一个方面，该多价抗原是多联抗原(concatemeric antigen)。在一些实施方案中，本文所述的mRNA疫苗包含具有开放阅读框的mRNA，该开放阅读框编码由2至100个肽表位(例如，相同或不同的表位)组成的多联抗原。在一个实施方案中，该多价抗原是癌症抗原。在另一个实施方案中，该多价抗原是细菌抗原。本文描述了多价抗原的非限制性实例。
本公开的mRNA(例如，mmRNA)构建体(例如，免疫增强剂mRNA、编码抗原的mRNA或它们的组合)可以包含例如5'UTR、编码多肽的密码子优化的开放阅读框、3'UTR和所连接核苷的3’加尾区。在一个实施方案中，该mRNA还包含一个或多个微RNA(miRNA)结合位点。
在一个实施方案中，本公开的经修饰的mRNA构建体被完全修饰。例如，在一个实施方案中，该mmRNA包含假尿苷(ψ)、假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、2-硫代尿苷(s2U)、2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、N6-甲基-腺苷(m6A)或N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。在另一个实施方案中，该mmRNA包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷，2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷，或它们的组合。在又一个实施方案中，该mmRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷、或α-硫代-腺苷，或它们的组合。
在另一个方面，本公开涉及包含本公开的mRNA(例如，经修饰的mRNA)的脂质纳米粒子。在一个实施方案中，该脂质纳米粒子是脂质体。在另一个实施方案中，该脂质纳米粒子包含阳离子脂质和/或可电离脂质。在一个实施方案中，该阳离子脂质和/或可电离脂质是2,2-二亚油基-4-甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)或二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)。在一个实施方案中，该脂质纳米粒子还包含与该脂质纳米粒子的外表面缀合的靶向部分。
在另一个方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含本公开的mRNA(例如，mmRNA)或本公开的脂质纳米粒子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了前述实施方案或相关实施方案中任一项的免疫调节治疗组合物，其中每种mRNA配制在相同或不同的脂质纳米粒子载体中。在一些方面，编码一种或多种感兴趣抗原(例如，癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原)的每种mRNA配制在相同或不同的脂质纳米粒子载体中。在一些方面，编码增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的免疫增强剂的每种mRNA配制在相同或不同的脂质纳米粒子载体中。在一些方面，编码一种或多种感兴趣抗原的每种mRNA配制在相同的脂质纳米粒子载体中，并且编码免疫增强剂的每种mRNA配制在不同的脂质纳米粒子载体中。在一些方面，编码一种或多种感兴趣抗原的每种mRNA配制在相同的脂质纳米粒子载体中，并且编码免疫增强剂的每种mRNA与编码一种或多种感兴趣抗原的每种mRNA配制在相同的脂质纳米粒子载体中。在一些方面，编码一种或多种感兴趣抗原的每种mRNA配制在不同的脂质纳米粒子载体中，并且编码免疫增强剂的每种mRNA与编码每种感兴趣抗原(例如，癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原)的每种mRNA配制在相同的脂质纳米粒子载体中。
在一些方面，本公开提供了前述实施方案中任一项的免疫调节治疗组合物，其中该免疫调节治疗组合物配制在脂质纳米粒子中，其中该脂质纳米粒子中的可电离氨基脂质:磷脂:甾醇:经PEG修饰脂质的摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％。在一些方面，该可电离氨基脂质选自例如2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
在一些方面，本公开提供了前述实施方案或相关实施方案中任一项的免疫调节治疗组合物，其中每种mRNA包括至少一种化学修饰。在一些方面，该化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在其他方面，本公开提供了包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
(i)具有编码HPV抗原的开放阅读框的mRNA；或
具有编码HPV16抗原的开放阅读框的mRNA；或
具有编码HPV18抗原的开放阅读框的mRNA；或
具有编码至少一种HPV E6抗原的开放阅读框的mRNA；或
具有编码至少一种HPV E7抗原的开放阅读框的mRNA；或
具有编码至少一种HPV E6抗原和至少一种HPV E7抗原的开放阅读框的mRNA；和
(ii)具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
在前述脂质纳米粒子载体的一些方面，该组成型活性人STING多肽包含突变V155M。在一些方面，该组成型活性人STING多肽包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列。在一些方面，编码该组成型活性人STING多肽的mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含至少一个miR-122微RNA结合位点。在一些方面，编码该组成型活性人STING多肽的mRNA包含以SEQ ID NO:199、1319或1320示出的核苷酸序列。
在一些方面，本公开提供了前述实施方案中任一项的脂质纳米粒子，其中该脂质纳米粒子中的可电离氨基脂质:磷脂:甾醇:经PEG修饰脂质的摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％。在一些方面，该可电离氨基脂质选自例如2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。在某些实施方案中，该脂质纳米粒子包含化合物25(作为可电离氨基脂质)、DSPC(作为磷脂)、胆固醇(作为甾醇)和PEG-DMG(作为经PEG修饰脂质)。在某些实施方案中，该脂质纳米粒子中的化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％。在一个实施方案中，该脂质纳米粒子中的化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％(即，化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的比率为约50:10:38.5:1.5)。在一个实施方案中，该脂质纳米粒子中的化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为50％:10％:38.5％:1.5％(即，化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的比率为50:10:38.5:1.5)。
在一些方面，本公开提供了一种药物产品，诸如疫苗，其包括在疗法例如预防性或治疗性治疗(例如，癌症疗法)中使用的前述或相关脂质纳米粒子载体中的任一种，任选地具有在这种疗法中的使用说明。
在与前述药物产品或疫苗有关的一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第一脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第一感兴趣抗原(例如，至少一种癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第二脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第二感兴趣抗原(例如，至少一种癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第三脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第三感兴趣抗原(例如，至少一种癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第四脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第四感兴趣抗原(例如，至少一种(例如癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在其他方面，本公开提供了包含药物组合物的第一脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种HPV抗原(例如，至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第二脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第二HPV抗原(例如，至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第三脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第三HPV抗原(例如，至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了包含药物组合物的第四脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第四HPV抗原(例如，至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在前述药物产品或疫苗的一些方面，第一、第二、第三和第四脂质纳米粒子载体中的每一者都包含长度为20、21、22、23、24或25个氨基酸的肽抗原。在一些方面，每种肽抗原的长度为25个氨基酸。
在前述第一、第二、第三和第四脂质纳米粒子载体的一些方面，其中所述一种或多种HPV抗原包含以SEQ ID NO:36-72示出的一种或多种氨基酸序列。在一些方面，所述一种或多种HPV抗原包含以SEQ ID NO:73-94示出的一种或多种氨基酸序列。
在前述第一、第二、第三和第四脂质纳米粒子载体的一些方面，该组成型活性人STING多肽包含突变V155M。在一些方面，该组成型活性人STING多肽包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列。在一些方面，该组成型活性人STING多肽包含3'UTR，该3'UTR包含至少一个miR-122微RNA结合位点。在一些方面，编码该组成型活性人STING多肽的mRNA包含以SEQID NO:199、1319或1320示出的核苷酸序列。
在一些方面，本公开提供了一种药物产品，诸如疫苗，其包括在预防性或治疗性治疗(例如，癌症疗法)中使用的前述或相关脂质纳米粒子载体中的任一种，任选地具有在疗法中的使用说明。在一些方面，本公开提供了一种药物产品，诸如疫苗，其包括在癌症疗法中使用的前述第一、第二、第三和第四脂质纳米粒子载体中的任一种，任选地具有在癌症疗法中的使用说明。
在一些方面，本公开提供了一种药物产品，诸如疫苗，其包括在预防性或治疗性治疗(例如，癌症疗法)中使用的第一、第二、第三和第四脂质纳米粒子载体，任选地具有在疗法中的使用说明，其中：
(i)第一脂质纳米粒子载体包含药物组合物，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第一感兴趣抗原(例如，至少一种癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原，例如至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂；
(ii)第二脂质纳米粒子载体包含药物组合物，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第二感兴趣抗原(例如，癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原，例如至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂；
(iii)第三脂质纳米粒子载体包含药物组合物，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第三感兴趣抗原(例如，癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原，例如至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂；并且
(iv)第四脂质纳米粒子载体包含药物组合物，其中该药物组合物包含：具有编码至少一种第四感兴趣抗原(例如，癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原，例如至少一种E6抗原和/或至少一种E7抗原)的开放阅读框的mRNA；具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mRNA；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在任何前述或相关方面，本公开提供了用于治疗受试者的方法，该方法包括：向有需要的受试者施用任何前述或相关的免疫调节治疗组合物或者任何前述或相关的脂质纳米粒子载体。在一些方面，该免疫调节治疗组合物或脂质纳米粒子载体与另一种治疗剂(例如，癌症治疗剂)组合施用。在一些方面，该免疫调节治疗组合物或脂质纳米粒子载体与抑制性检查点多肽组合施用。在一些方面，该抑制性检查点多肽是特异性地结合选自PD-1、PD-L1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR和LAG3的分子的抗体或其片段。
在一些方面，本公开提供了一种组合物(例如，疫苗)，其包含编码感兴趣抗原的mRNA和编码增强对感兴趣抗原的免疫应答的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)的mRNA，其中所述编码感兴趣抗原(Ag)的mRNA和所述编码增强对感兴趣抗原的免疫应答的多肽(例如，免疫增强剂(IP)，例如STING多肽)的mRNA以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或20:1的Ag:IP质量比配制。作为替代，IP:Ag质量比可以为例如：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20。在一些方面，该组合物以编码感兴趣抗原的mRNA与编码增强对感兴趣抗原的免疫的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)的mRNA为5:1的质量比配制(即，Ag与IP之比为5:1，或作为替代，IP与Ag之比为1:5)。在一些方面，该组合物以编码感兴趣抗原的mRNA与编码增强对感兴趣抗原的免疫的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)的mRNA为10:1的质量比配制(即，Ag与IP之比为10:1，或作为替代，IP与Ag之比为1:10)。
在另一个方面，本公开涉及用于增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本公开的mRNA组合物、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得受试者体内对感兴趣抗原的免疫应答增强，该mRNA组合物编码一种或多种感兴趣抗原和增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽。在一个方面，增强受试者体内的免疫应答包括刺激细胞因子产生(例如，IFN-γ或TNF-α)。在另一个方面，增强受试者体内的免疫应答包括刺激抗原特异性CD8+ T细胞活性，例如致敏(priming)、增殖和/或存活(例如，增加效应/记忆T细胞群)。在一个方面，增强受试者体内的免疫应答包括刺激抗原特异性CD4+ T细胞活性(例如，增加辅助T细胞活性)。在其他方面，增强受试者体内的免疫应答包括刺激B细胞应答(例如，增加抗体产生)。
在一些方面，增强受试者体内的免疫应答包括刺激细胞因子产生、刺激抗原特异性CD8+ T细胞应答、刺激抗原特异性CD4+辅助细胞应答、增加效应记忆CD62Llo T细胞群、刺激B细胞活性或刺激抗原特异性抗体产生，或者前述应答的任意组合。
在一些方面，该增强的免疫应答包括刺激细胞因子产生，其中所述细胞因子为IFN-γ或TNF-α、或这两者。在一些方面，该增强的免疫应答包括刺激抗原特异性CD8+ T细胞应答，其中该抗原特异性CD8+ T细胞应答包括CD8+ T细胞增殖或CD8+ T细胞细胞因子产生，或这两者。在一些方面，CD8+ T细胞细胞因子产生增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
在一些方面，该增强的免疫应答包括抗原特异性CD8+ T细胞应答，其中该CD8+ T细胞应答包括CD8+ T细胞增殖，并且其中CD8+T细胞在总T细胞群中的百分比增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
在一些方面，该增强的免疫应答包括抗原特异性CD8+ T细胞应答，其中该CD8+ T细胞应答包括效应记忆CD62Llo T细胞在CD8+ T细胞中的百分比增加。
在另一个方面，本公开涉及用于增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本公开的mmRNA组合物、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得受试者体内对感兴趣抗原的免疫应答增强,该mmRNA组合物编码一种或多种感兴趣抗原和增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽，其中对感兴趣抗原的免疫应答维持的时间超过10天、超过15天、超过20天、超过25天、超过30天、超过40天、超过50天、超过60天、超过70天、超过80天、超过90天，超过100、120、150、200、250、300天或1年或更长时间。
在一个方面，本公开提供了用于增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的方法，其中向受试者同时或相继地施用两种不同的免疫增强剂mRNA(例如，mmRNA)构建体(其中一种或两种构建体还编码mRNA(例如，mmRNA)构建体、或与该mRNA构建体一起施用，该mRNA构建体编码所述一种或多种感兴趣抗原)。在一个方面，在向受试者施用刺激I型干扰素途径信号传导的免疫增强剂mmRNA组合物之前向该受试者施用刺激树突状细胞发育或活性的免疫增强剂mRNA组合物。
在其他方面，本公开提供了刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫应答的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的组合物、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得刺激该受试者体内对肿瘤的免疫应答，该组合物包含至少一种编码一种或多种肿瘤抗原的mRNA构建体和编码增强对所述一种或多种肿瘤抗原的免疫应答的多肽的mRNA构建体。在一个方面，肿瘤为肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤癌、宫颈癌或头颈癌。在一些方面，受试者是人。
在一个实施方案中，本公开提供了预防或治疗有需要的受试者体内的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含至少一种mRNA构建体的组合物，所述至少一种mRNA构建体编码：(i)至少一种感兴趣的HPV抗原和(ii)增强针对所述至少一种感兴趣的HPV抗原的免疫应答的多肽，使得增强对所述至少一种感兴趣的HPV抗原的免疫应答。在一个实施方案中，增强针对至少一种感兴趣的HPV抗原的免疫应答的多肽是STING多肽。在一个实施方案中，所述至少一种HPV抗原是至少一种E6抗原、至少一种E7抗原，或至少一种E6抗原和至少一种E7抗原的组合(例如，E6和/或E7的可溶性形式或细胞内形式)。在一个实施方案中，所述至少一种HPV抗原和所述多肽在单独的mRNA上编码，并且在施用于受试者之前在脂质纳米粒子中共同配制。作为替代，所述一种或多种HPV抗原和多肽可以在相同的mRNA上编码。在一个实施方案中，受试者有暴露于HPV的风险，并且该组合物在暴露于HPV之前施用。在另一个实施方案中，受试者感染了HPV或患有HPV相关癌症。在一个实施方案中，该HPV相关癌症选自宫颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌。在一个实施方案中，该患有癌症的受试者还用免疫检查点抑制剂治疗。
在另一个方面，本公开提供了刺激有需要的受试者体内对病原体的免疫应答的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的组合物、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得刺激该受试者体内对病原体的免疫应答，该组合物包含至少一种编码一种或多种病原体抗原的mRNA构建体和编码增强对所述一种或多种病原体抗原的免疫应答的多肽的mRNA构建体。在一个方面，病原体选自病毒、细菌、原生动物、真菌和寄生生物。在一个方面，病原体为病毒，诸如人乳头瘤病毒(HPV)。在一个方面，病原体为细菌。在一个方面，受试者是人。
在任何前述或相关方面，本公开提供了包含脂质纳米粒子和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，该药物组合物被配制用于肌内递送。
在任何前述或相关方面，本公开提供了用于增强个体体内的免疫应答(例如，治疗个体体内的癌症或延迟个体体内的癌症的进展)的脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物，其中所述治疗包括将该组合物与第二组合物组合施用，其中该第二组合物包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体。
在任何前述或相关方面，本公开提供了脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体在制造用于增强个体体内的免疫应答(例如，治疗个体体内的癌症或延迟个体体内的癌症的进展)的药物方面的用途，其中该药物包含所述脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用该药物，任选地与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用。
在任何前述或相关方面，本公开提供了试剂盒，其包括容器和包装说明书，该容器包含脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物，该包装说明书包括用于施用所述脂质纳米粒子或药物组合物以增强个体体内的免疫应答(例如，治疗个体体内的癌症或延迟个体体内的癌症的进展)的说明。在一些方面，该包装说明书还包括用于单独施用、或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米粒子或药物组合物以增强个体体内的免疫应答(例如，治疗个体体内的癌症或延迟个体体内的癌症的进展)的说明。
在任何前述或相关方面，本公开提供了试剂盒，其包括药物和包装说明书，该药物包含脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物，该包装说明书包括用于单独施用、或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用该药物以增强个体体内的免疫应答(例如，治疗个体体内的癌症或延迟个体体内的癌症的进展)的说明。在一些方面，该试剂盒还包括包装说明书，其包括用于在施用第二药物之前、在施用第二药物的同时或之后施用第一药物以增强个体体内的免疫应答(例如，治疗个体体内的癌症或延迟个体体内的癌症的进展)的说明。
在任何前述或相关方面，本公开提供了脂质纳米粒子、组合物或其用途，或者包括如本文所述的脂质纳米粒子或组合物的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4，或它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽为抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab)的抗PD-L1抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自替西木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(ipilimumab)的抗CTLA-4抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)的抗PD1抗体。
在相关方面，本公开提供了减小或缩小有需要的受试者体内肿瘤大小或抑制的肿瘤生长的方法，该方法包括向该受试者施用本公开的任何前述或相关脂质纳米粒子，或本公开的任何前述或相关组合物。
在相关方面，本公开提供了在患有癌症的受试者体内诱导抗肿瘤应答的方法，该方法包括向该受试者施用本公开的任何前述或相关脂质纳米粒子，或本公开的任何前述或相关组合物。在一些方面，该抗肿瘤应答包括T细胞应答。在一些方面，该T细胞应答包括CD8+ T细胞。
在前述方法的一些方面，该组合物通过肌内注射施用。
在前述方法的一些方面，该方法还包括施用包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的第二组合物。在一些方面，该检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4，或它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽为抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自替西木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
在任何前述或相关方法的一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物通过静脉内注射施用。在一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物每2至3周施用一次。在一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物每2周施用一次或每3周施用一次。在一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物在施用脂质纳米粒子或其药物组合物之前，在施用脂质纳米粒子或其药物组合物的同时或之后施用。
附图说明
图1是示出用组成型活性STING mRNA构建体转染的TF1a细胞中IFN-β产生的刺激的柱形图。
图2是示出组成型活性STING构建体激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)的柱形图。STING变体23a和23b对应于SEQ ID NO:1，STING变体42对应于SEQ ID NO:2，STING变体19、21a和21b对应于SEQ ID NO:3，STING变体41对应于SEQ ID NO:4，STING变体43对应于SEQID NO:5，STING变体45对应于SEQ ID NO:6，STING变体46对应于SEQ ID NO:7，STING变体47对应于SEQ ID NO:8，STING变体56对应于SEQ ID NO:9，并且STING变体57对应于SEQ IDNO:10。
图3A至图3B是示出组成型活性IRF3构建体(图3A)或组成型活性IRF7构建体(图3B)激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)的柱形图。IRF3变体1、3和4对应于SEQ ID NO:12，IRF3变体2和5对应于SEQ ID NO:11(变体具有不同的标签)。IRF7变体36对应于SEQ ID NO:18，并且变体31为SEQ ID NO:18的鼠形式。IRF7变体32对应于SEQ ID NO:17，IRF7变体33对应于SEQ ID NO:14。
图4是示出组成型活性cFLIP和IKKβmRNA构建体激活NFκB-荧光素酶报告基因的柱形图。
图5是示出组成型活性RIPK1 mRNA构建体激活NFκB-荧光素酶报告基因的图。
图6是示出用DIABLO mRNA构建体转染的SKOV3细胞中的TNF-α诱导的柱形图。
图7是示出用DIABLO mRNA构建体转染的SKOV3细胞中的白介素6(IL-6)诱导的柱形图。
图8A至图8B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPVE6/E7疫苗构建体免疫的小鼠在第一次免疫后第21天的CD8+脾细胞的细胞内染色(ICS)的图。图8A示出了对IFN-γ的E7特异性应答的ICS。图8B示出了对TNF-α的E7特异性应答的ICS。
图9A至图9B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPVE6/E7疫苗构建体免疫的小鼠的CD8+脾细胞的细胞内染色(ICS)的图。图9A示出了对IFN-γ的E6特异性应答的ICS。图9B示出了对TNF-α的67特异性应答的ICS。
图10A至图10B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV E6/E7疫苗构建体免疫的小鼠的CD8+脾细胞在第21天(图10A)或第53天(图10B)对IFN-γ的E7特异性应答的细胞内染色(ICS)的图。
图11A至图11B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV E6/E7疫苗构建体免疫的小鼠的CD8+脾细胞在第21天和第53天的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的图。图11A示出了来自用细胞内E6/E7免疫的小鼠的E7特异性应答。图11B示出了来自用可溶性E6/E7免疫的小鼠的E7特异性应答。
图12A至图12B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV E6/E7疫苗构建体免疫的小鼠的脾细胞在第21天(图12A)或第53天(图12B)时，活CD45+细胞中的CD8b+细胞的百分比的图。
图13A至图13B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV E6/E7疫苗构建体免疫的小鼠的CD8b+脾细胞在第21天(图13A)或第53天(图13B)的E7-MHC1-四聚体(对于表位RAHYNIVTF有特异性)染色的图。
图14A至图14D是将第21天与第53天的E7-四聚体+CD8细胞相比较，示出大多数E7-四聚体+CD8+细胞具有“效应记忆”CD62Llo表型的图，证明该“效应记忆”CD62Llo表型在整个研究期间得以维持。图14A(第21天)和图14B(第53天)示出了具有效应记忆CD62Llo表型的CD8增加的％。图14C和图14D示出了当用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV E6/E7疫苗构建体免疫小鼠时，E7-四聚体+CD8(其为CD62Llo)增加的％。
图15A至图15B是示出用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的MC38新抗原疫苗构建体(ADRvax)免疫的小鼠的CD8+脾细胞在第21天(图15A)或第35天(图15B)由IFN-口细胞内染色(ICS)体现的MC38新抗原特异性应答的图。
图16A至图16B是示出在用与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体共同配制的MC38新抗原疫苗构建体(ADRvax)免疫的小鼠的脾或PBMC中的活CD45+细胞中的CD8b+细胞的百分比的图(图16A)，或者该小鼠的脾或PBMC中的CD8b+细胞中的CD62Llo细胞的百分比的图(图16B)。
图17是示出用单独的指定细菌抗原mRNA构建体(0.2μg)治疗或用与STING免疫增强剂mRNA构建体共同配制的细菌肽mRNA构建体治疗的小鼠的抗体滴度比较的图。
图18描绘了结肠直肠癌中如使用cBioPortal鉴定的NRAS和KRAS突变频率。
图19A至图19C是示出在用表达HPV E7的TC1肿瘤攻击之前或之时如所指示用HPVE6/E7构建体连同STING免疫增强剂mRNA构建体进行预防性治疗(单独进行，或与第6、9和12天的抗CTLA-4或抗PD1治疗组合)的小鼠的肿瘤体积的图，示出了HPV E6/E7+STING治疗对肿瘤生长的抑制。在第1天进行肿瘤攻击的某些小鼠在第-14天和第-7天用可溶性E6/E7+STING(图19A)或用细胞内E6/E7+STING(图19B)治疗。在第1天进行肿瘤攻击的其他小鼠在第1天和第8天用可溶性E6/E7+STING(图19C)治疗。
图20A至图20I是示出在用表达HPV E7的TC1肿瘤攻击之后，如所指示用HPV E6/E7构建体连同STING免疫增强剂mRNA构建体进行治疗性治疗的小鼠的肿瘤体积的图，其中图20A为单独进行该治疗，图20B为该治疗与第13、16和19天的抗CTLA-4治疗组合，图20C为该治疗与第13、16和19天的抗PD1治疗组合，示出了HPV E6/E7+STING治疗对肿瘤生长的抑制。图20D至图20I示出用鼠STING配体DMXAA进行的治疗。
图21提供了示出在具有200mm3体积大小(上图)或300mm3体积大小(下图)的肿瘤的小鼠体内如所指示用HPV E6/E7构建体连同STING免疫增强剂mRNA构建体进行治疗性治疗之后的肿瘤体积的图。
图22是示出用以指定的Ag:STING比率与STING免疫增强剂共同配制的ADR疫苗构建体免疫的小鼠在第一次免疫后第21天CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的图。用突变型ADR抗原组合物(包含三种肽)或野生型ADR组合物(作为对照)再刺激CD8+细胞。
图23是示出用以指定的Ag:STING比率与STING免疫增强剂共同配制的ADR疫苗构建体免疫的小鼠在第一次免疫后第21天CD8+脾细胞中的TNF-α的细胞内染色(ICS)的图。用突变型ADR抗原组合物(包含三种肽)或野生型ADR组合物(作为对照)再刺激CD8+细胞。
图24A至图24C是示出用以指定的Ag:STING比率与STING免疫增强剂共同配制的ADR疫苗构建体免疫的小鼠在第一次免疫后第21天CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的图。用该ADR抗原组合物内含有的突变型或野生型(作为对照)肽再刺激CD8+细胞。图24A示出了对ADR组合物内的Adpk1肽的应答。图24B示出了对ADR组合物内的Reps1肽的应答。图24C示出了对ADR组合物内的Dpagt1肽的应答。
图25是示出用以指定的不同Ag:STING比率共同配制的CA-132和STING免疫增强剂治疗的小鼠针对CA-132疫苗内的MHC I类表位的抗原特异性T细胞应答的图，此类应答如通过针对IFN-γ的ELISpot分析所测量的。
图26是示出用以指定的不同Ag:STING比率共同配制的CA-132和STING免疫增强剂治疗的小鼠在用CA-87肽再刺激后，针对CA-132疫苗内的MHC I类表位的抗原特异性T细胞应答的柱形图，此类应答如通过针对IFN-γ的ELISpot分析所测量的。
图27是示出用以指定的Ag:STING比率与STING免疫增强剂共同配制的HPV16 E7疫苗构建体免疫的小鼠在第一次免疫后第21天CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的图。
图28A至图28C是示出用HPV疫苗+STING构建体治疗、之后用HPV16 E6肽汇集物(图28A)、HPV16 E7肽汇集物(图28B)或培养基(阴性对照)(图28C)进行离体刺激的食蟹猴的CD8+ T细胞的TNF细胞内染色(ICS)结果的柱形图。
图29A至图29C是示出用HPV疫苗+STING构建体治疗、之后用HPV16 E6肽(图29A)、HPV16 E7肽(图29B)或培养基(阴性对照)(图29C)进行离体刺激的食蟹猴的CD8+ T细胞的IL-2细胞内染色(ICS)结果的柱形图。
图30是示出用HPV疫苗+STING构建体治疗的食蟹猴血清中的抗E6 IgG的ELISA结果的图。
图31是示出用HPV疫苗+STING构建体治疗的食蟹猴血清中的抗E7 IgG的ELISA结果的图。
图32是示出来自用突变型KRAS疫苗+STING构建体免疫的小鼠，之后用KRAS-G12V肽离体刺激的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)结果的图。
图33是示出来自用突变型KRAS疫苗+STING构建体免疫的小鼠，之后用KRAS-G12D肽离体刺激的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)结果的图。
图34是示出来自用突变型KRAS疫苗+STING构建体免疫的小鼠，之后与经KRAS-G12V脉冲的Cos7-A11细胞离体共培养的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)结果的图。
图35是示出来自用突变型KRAS疫苗+STING构建体免疫的小鼠，之后与经KRAS-G12D脉冲的Cos7-A11细胞离体共培养的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)结果的图。
图36是示出来自用具有STING构建体或具有不可翻译的mRNA对照(NTFIX)构建体的A11病毒表位多联体免疫的小鼠，之后用各个病毒表位离体刺激的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)结果的图。
图37A至图37B是示出用与STING、IRF3/IRF7或IRF3/IRF7/IKKβ免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV疫苗构建体免疫的小鼠在第一次免疫后第21天的CD8+脾细胞的细胞内染色(ICS)的图。图37A示出了对IFN-γ的E7特异性应答的ICS。图37B示出了对TNF-α的E7特异性应答的ICS。
图38A至图38C是示出用与STING、TAK1、TRAM或MyD88免疫增强剂mRNA构建体共同配制的OVA抗原免疫的小鼠在第一次免疫后第25天的CD8+脾细胞的细胞内染色(ICS)的图。图38A示出了对IFN-γ的OVA特异性应答的ICS。图38B示出了对TNF-α的OVA特异性应答的ICS。图38C示出了对IL-2的OVA特异性应答的ICS。
图39是示出用与STING、MAVS、IKKβ、半胱天冬酶1+半胱天冬酶4+IKKβ、MLKL或MLKL+STING免疫增强剂mRNA构建体共同配制的OVA抗原免疫的小鼠在第一次免疫后第21天的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的柱形图。DMXAA为STING的化学激活剂，被用作对比物。
图40是示出用与STING、MAVS、IKKβ、半胱天冬酶1+半胱天冬酶4+IKKβ、MLKL或MLKL+STING免疫增强剂mRNA构建体共同配制的OVA抗原免疫的小鼠在第一次免疫后第50天的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的柱形图。DMXAA为STING的化学激活剂，被用作对比物。
图41A至41B是示出用与所指示的组成型活性STING突变型构建体共同配制或共同施用的OVA抗原免疫的小鼠的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的柱形图。图41A示出了免疫后第21天的情况。图41B示出了第一次免疫后第90天的情况。
图42A至图42B是示出用与STING免疫增强剂mRNA构建体共同配制的HPV疫苗构建体免疫的CD4耗尽小鼠的CD8+脾细胞中的IFN-γ的细胞内染色(ICS)的柱形图。图42A示出了第一次免疫后第21天的情况。图42B示出了第一次免疫后第50天的情况。
图43提供了示出具有TC1 HPV肿瘤且用HPV-STING疫苗单独地或与抗CD4(用于耗尽CD4 T细胞)或抗CD8(用于耗尽CD8 T细胞)组合治疗的小鼠体内的肿瘤体积的图。
图44A至图44B是示出来自用以指示的Ag剂量和STING剂量与STING免疫增强剂mRNA构建体共同配制的MC38抗原疫苗构建体免疫的小鼠的脾的CD4hiCD8+细胞中的CD62Llo细胞的百分比的图。图44A示出了第21天脾细胞的结果。图44B示出了第54天脾细胞的结果。
图45是示出来自用编码多联的20个鼠表位(CA-132)的mRNA与STING免疫增强剂mRNA的组合免疫的小鼠的抗原特异性IFN-γT细胞应答的柱形图，与之对比的是标准佐剂或未配制的mRNA(未包封在LNP中)。示出的数据是用在该多联体内编码的II类表位(CA-82和CA-83)进行体外肽再刺激的数据。
图46是示出来自用编码多联的20个鼠表位(CA-132)的mRNA与STING免疫增强剂mRNA的组合免疫的小鼠的抗原特异性IFN-γT细胞应答的柱形图，与之对比的是标准佐剂或未配制的mRNA(未包封在LNP中)。示出的数据是用在该多联体内编码的I类表位(CA-87、CA-90和CA-93)进行体外肽再刺激的数据。
图47是示出来自用编码多联的20个鼠表位(CA-132)的mRNA与STING免疫增强剂mRNA的组合免疫的小鼠的抗原特异性IFN-γT细胞应答的柱形图，其中该STING构建体与疫苗同时施用，或在24小时之后或48小时之后施用。示出的数据是用在该多联体内编码的II类表位(CA-82和CA-83)或I类表位(CA-87、CA-90和CA-93)进行体外肽再刺激的数据。
图48示出了来自用以变化的Ag剂量和STING剂量以及Ag:STING比率与STING免疫增强剂mRNA组合的编码多联的52个鼠表位的mRNA免疫的小鼠的抗原特异性应答。示出的数据是用在该多联体内编码的肽序列(对应于II类表位CA-82)进行体外再刺激的数据。
图49示出了来自用以变化的Ag剂量和STING剂量以及Ag:STING比率与STING免疫增强剂mRNA组合的编码多联的52个鼠表位的mRNA免疫的小鼠的抗原特异性应答。示出的数据是用在该多联体内编码的肽序列(对应于II类表位CA-83)进行体外再刺激的数据。
图50示出了来自用以变化的Ag剂量和STING剂量以及Ag:STING比率与STING免疫增强剂mRNA组合的编码多联的52个鼠表位的mRNA免疫的小鼠的抗原特异性应答。示出的数据是用在该多联体内编码的肽序列(对应于I类表位CA-87)进行体外再刺激的数据。
图51示出了来自用以变化的Ag剂量和STING剂量以及Ag:STING比率与STING免疫增强剂mRNA组合的编码多联的52个鼠表位的mRNA免疫的小鼠的抗原特异性应答。示出的数据是用在该多联体内编码的肽序列(对应于I类表位CA-93)进行体外再刺激的数据。
图52示出了来自用以变化的Ag剂量和STING剂量以及Ag:STING比率与STING免疫增强剂mRNA组合的编码多联的52个鼠表位的mRNA免疫的小鼠的抗原特异性应答。示出的数据是用在该多联体内编码的肽序列(对应于I类表位CA-113)进行体外再刺激的数据。
图53示出了来自用以变化的Ag剂量和STING剂量以及Ag:STING比率与STING免疫增强剂mRNA组合的编码多联的52个鼠表位的mRNA免疫的小鼠的抗原特异性应答。示出的数据是用在该多联体内编码的肽序列(对应于II类表位CA-90)进行体外再刺激的数据。
图54是示出用MLKL 1-180mRNA构建体转染的Hep3B细胞的细胞活力的柱形图，其中细胞活力如使用发光细胞活力测定测量的。
图55是示出用MLKL 1-180mRNA构建体转染的Hep3B细胞的细胞活力的图，其中细胞活力如使用细胞活性读出测量的。
图56是示出从用MLKL 1-180mRNA构建体转染的Hep3B细胞释放ATP的图，用于指示坏死性凋亡。
图57是示出从用MLKL 1-180mRNA构建体转染的HeLa细胞释放HMGB1的图，用于指示坏死性凋亡。
图58是示出用空白对照转染、用细胞凋亡诱导构建体(“PUMA”)转染或用MLKL构建体转染的细胞上的钙网蛋白的细胞表面染色的图，用于指示由MLKL构建体引起的坏死性凋亡。
图59A至图59C是示出用MLKL、GSDMD或RIP3K mRNA构建体转染的HeLa细胞(图59A)、B16F10细胞(图59B)或MC38细胞(图59C)的细胞活力的柱形图，其中细胞活力如使用发光细胞活力测定测量的。*p<0.05；***p<0.001对L2K##p<0.01对HsMLKL(1-180)。
图60是示出在用多聚化RIPK3 mRNA构建体转染的NIH3T3细胞中诱导死亡的柱形图。
图61是示出在用多聚化RIPK3构建体转染的B16F10细胞中诱导DAMP释放(HMGB1释放)的柱形图，用于指示坏死性凋亡。
图62是示出用DIABLO mRNA构建体转染的SKOV3细胞的细胞活力的柱形图，其中细胞活力如使用发光细胞活力测定测量的。
图63是示出在用半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11mRNA构建体转染的HeLa细胞中诱导细胞死亡的柱形图。结果示出了来自四个独立实验的平均值±SEM。
图64是示出在用NLRP3、Pyrin或ASC mmRNA构建体转染的HeLa细胞中诱导细胞死亡的柱形图。结果示出了来自四个独立实验的平均值±SEM。
图65A至图65B是示出组成型活性IRF3构建体(图65A)或IRF7构建体(图65B)激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)的柱形图。
图66是针对图67中所示实验结果的研究设计的示意图。
图67是示出在如所指示那样用免疫增强剂初免，然后如所指示那样用半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11构建体转染的HeLa细胞释放IL-18的柱形图。
图68A至图68K是示出用指示的刽子手(executioner)mRNA构建体单独地或与指示的免疫检查点抑制剂组合治疗对小鼠体内MC38肿瘤生长的影响的图。
图69A至图69B是示出用指示的刽子手mRNA构建体单独地或与指示的免疫增强剂和/或免疫检查点抑制剂组合治疗对小鼠体内MC38肿瘤生长(图69A)和小鼠存活百分比(图69B)的影响的图。
图70A至图70B是示出与单独的媒介物或NT对照+抗PD-1相比，用STING mRNA构建体与抗PD-1的组合治疗对小鼠体内MC38肿瘤生长(图70A)和小鼠存活百分比(图70B)的影响的图。
具体实施方式
本公开提供了一些组合物，诸如编码增强对感兴趣抗原的免疫应答的多肽的mRNA构建体，在本文中称为免疫增强剂mRNA构建体或免疫增强剂mRNA，包括经化学修饰的mRNA(mmRNA)。本公开的免疫增强剂mRNA通过例如激活I型干扰素途径信号传导、刺激NFkB途径信号传导或这两者来增强免疫应答，从而刺激对感兴趣抗原的抗原特异性应答。本公开的免疫增强剂mRNA增强对施用该免疫增强剂mRNA的受试者体内的内源性抗原的免疫应答，或增强对与该免疫增强剂mRNA一起施用于受试者的外源性抗原(例如，与该免疫增强剂mRNA共同配制和共同施用的编码感兴趣抗原的mRNA构建体，或与该免疫增强剂mRNA分开配制和施用的编码感兴趣抗原的mRNA构建体)的免疫应答。
令人惊讶的是，已发现向受试者施用本公开的免疫增强剂mRNA(例如，编码组成型活性STING多肽的mRNA)或免疫增强剂mRNA的组合刺激细胞因子产生(例如，炎性细胞因子产生)、刺激抗原特异性CD8+效应细胞应答、刺激抗原特异性CD4+辅助细胞应答、增大效应记忆CD62Llo T细胞群并刺激针对感兴趣抗原产生抗原特异性抗体。
如实施例中详细描述的，已发现施用免疫增强剂mRNA构建体(或免疫增强剂mRNA的组合)增加了通过ICS证实的响应于抗原对一种或多种细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα和/或IL-2)呈阳性的CD8+ T细胞的百分比，并增加了总T细胞群中的CD8+ T细胞的百分比(例如，实施例5和图8至图12)。值得注意的是，这些效果是持久的，因为通过ICS证实对一种或多种细胞因子呈阳性的抗原特异性CD8+T细胞的较高百分比在体内维持长达7周(图11)。还发现施用免疫增强剂mRNA构建体(或免疫增强剂mRNA的组合)增大了效应记忆CD62Llo T细胞群(例如，实施例5、6和实施例19)，并且该效果随时间推移而维持(实施例19和图44)。重要的是，对mRNA疫苗的抗原特异性T细胞应答和抗体应答的增强在非人灵长类动物中也得到证明(例如，实施例12和图28至图31)。
在细菌疫苗的情形下，已经证实施用免疫增强剂mRNA构建体通过增大体内的抗原特异性抗体应答来增强对细菌疫苗的体液应答(例如，实施例7和图17)。
在癌症疫苗的情形下，施用免疫增强剂mRNA构建体被证实引起针对癌症新表位的稳健且持久的免疫应答(实施例6)，并且被证实在用致癌病毒疫苗进行预防性和治疗性疫苗接种时强效抑制肿瘤生长(实施例10)。例如，将免疫增强剂mRNA与HPV疫苗一起施用有效地(单独地或与检查点抑制剂组合)防止体内的表达HPV的肿瘤细胞生长(图19)，并且用HPV疫苗连同该免疫增强剂mRNA一起(单独地或与检查点抑制剂组合)进行治疗性疫苗接种有效地诱导体内的表达HPV的肿瘤消退(图20)。值得注意的是，将免疫增强剂mRNA与该治疗性疫苗一起施用还表现出抑制体内已形成的大肿瘤的功效(图21)。
在个性化癌症疫苗的情形下，已经证实施用免疫增强剂mRNA构建体增强了对编码诱导I和II这两类MCH应答的个性化癌症疫苗(多联体)的mRNA的抗原特异性T细胞应答和抗体应答(例如，实施例20和图45至图53)。还发现施用免疫增强剂mRNA增强了对编码各种形式(单体和多联体)的KRAS癌症抗原的mRNA的免疫应答(例如，实施例13和图32至图36)。
还已经证明编码I型干扰素诱导剂和NFκB激活剂的免疫增强剂mRNA的组合(例如，实施例14和图37)，以及编码在TLR下游起作用的细胞内信号传导途径的组分的免疫增强剂mRNA(例如，实施例15和图38)增强了抗原特异性T细胞应答。编码衔接蛋白(例如，STING或MAVS)、NFκB激活剂(例如，IKKβ)、炎性体诱导物(例如，半胱天冬酶1/4)和坏死体诱导物(例如，MLKL)的免疫增强剂mRNA的另外组合也被证实可增强抗原特异性T细胞应答。令人惊讶的是，与单独的编码MLKL的mRNA相比，编码衔接蛋白(例如，STING)的mRNA和编码坏死体诱导物(例如，MLKL)的mRNA的组合表现出增强的活性(例如，实施例16和图39至图40)。第90天的结果证明该免疫增强作用是持久的(例如，实施例18和图41)。
出乎意料地，据发现与单独的抗原相比，在大多数抗原上添加编码免疫增强剂(例如，STING)的mRNA与免疫增强剂的比率(Ag:IP)改善了抗原特异性T细胞应答(例如，实施例20)。应答的广度大得出乎意料。对于测试的六种抗原(表位)中的四种，向抗原添加编码免疫增强剂的mRNA始终产生比单独的抗原更高的T细胞应答。因此，发现抗原与免疫增强剂的比率存在宽的钟形曲线，提高了免疫原性。
还发现，在所有测试的抗原上添加编码免疫增强剂(例如，STING)的mRNA相对于单独的抗原增强了对抗原的免疫应答。在大多数情况下，发现免疫至少增强2倍，并且对于某些抗原，导致免疫甚至增强更多倍(例如，增强超过5倍、超过10倍、超过20倍、超过30倍、超过50倍，或超过75倍)(例如，实施例21)。
因此，本公开提供了包含一种或多种mRNA构建体(例如，一种或多种mmRNA构建体)的组合物，其中所述一种或多种mRNA构建体编码一种或多种感兴趣抗原，并且在相同或单独的mRNA构建体中编码增强对感兴趣抗原的免疫应答的多肽。在一些方面，本公开提供了纳米粒子，例如脂质纳米粒子，其包含单独的或与编码感兴趣抗原的mRNA组合的增强免疫应答的免疫增强剂mRNA。本公开还提供了药物组合物，其包含如本文所述mRNA中的任一种或纳米粒子，例如包含如本文所述mRNA中的任一种的脂质纳米粒子。
在另一个方面，本公开提供了包含一种或多种mRNA构建体(例如，一种或多种mmRNA构建体)的组合物，所述mRNA构建体编码诱导免疫原性细胞死亡(诸如坏死性凋亡或细胞焦亡)的多肽。此类mRNA构建体可以与本公开的免疫增强剂mRNA构建体组合使用，以增强体内的内源性抗原的释放，从而刺激针对内源性抗原的免疫应答。在一些方面，本公开提供了纳米粒子，例如脂质纳米粒子，其包含单独的或与免疫增强剂mRNA组合的诱导免疫原性细胞死亡的mRNA。本公开还提供了药物组合物，其包含如本文所述mRNA中的任一种或纳米粒子，例如包含如本文所述mRNA中的任一种的脂质纳米粒子。
在其他方面，本公开提供了用于增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的方法，方式为向受试者施用单独免疫增强剂mRNA构建体(对于内源性抗原)，或施用编码一种或多种感兴趣抗原的一种或多种mRNA和编码增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽的mRNA、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得受试者体内对感兴趣抗原的免疫应答增强。可以使用增强免疫应答的方法，例如，来刺激受试者体内对肿瘤的免疫原性应答、刺激受试者体内对病原体的免疫原性应答，或增强受试者体内对疫苗的免疫应答。
免疫增强剂mRNA
本公开的一个方面涉及编码这样的多肽的mRNA：该多肽刺激或增强针对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答。增强对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的此类mRNA在本文中称为免疫增强剂mRNA构建体或免疫增强剂mRNA，包括经化学修饰的mRNA(mmRNA)。本公开的免疫增强剂增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答。该增强的免疫应答可以是细胞应答、体液应答或这两者。如本文所用，“细胞”免疫应答旨在涵盖涉及T细胞或由T细胞介导的免疫应答，而“体液”免疫应答旨在涵盖涉及B细胞或由B细胞介导的免疫应答。免疫增强剂可以通过例如以下各项来增强免疫应答：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
如本文所用，“刺激I型干扰素途径信号传导”旨在涵盖激活I型干扰素信号传导途径的一种或多种组分(例如，修饰此类组分的磷酸化、二聚化等，从而激活该途径)、刺激从干扰素敏感性应答元件(ISRE)转录和/或刺激I型干扰素的产生或分泌(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和/或IFN-ω)。如本文所用，“刺激NFkB途径信号传导”旨在涵盖激活NFkB信号传导途径的一种或多种组分(例如，修饰此类组分的磷酸化、二聚化等，从而激活该途径)、刺激从NFkB位点转录和/或刺激表达受NFkB调节的基因产物的产生。如本文所用，“刺激炎症应答”旨在涵盖刺激炎性细胞因子(包括但不限于I型干扰素、IL-6和/或TNFα)产生。如本文所用，“刺激树突状细胞的发育、活性或动员”旨在涵盖直接或间接刺激树突状细胞的成熟、增殖和/或功能活性。
在某些实施方案中，免疫增强剂mRNA构建体将对感兴趣抗原的免疫应答在大小上成倍增强，例如，相对于在不存在该免疫增强剂的情况下对该抗原的免疫应答，或相对于增强对该抗原的免疫应答的小分子激动剂。例如，在各种实施方案中，相比于例如在不存在该免疫增强剂mRNA构建体的情况下对感兴趣抗原的免疫应答，或者相比于例如在存在对感兴趣抗原的免疫应答的小分子激动剂的情况下对该抗原的免疫应答，该免疫增强剂mRNA构建体将对感兴趣抗原的免疫应答增强至少2倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或更大倍数。在一些实施方案中，相比于例如在不存在该免疫增强剂mRNA构建体的情况下对感兴趣抗原的免疫应答，或者相比于例如在存在对感兴趣抗原的免疫应答的小分子激动剂的情况下对该抗原的免疫应答，该免疫增强剂mRNA构建体将对感兴趣抗原的免疫应答增强0.3至1000倍、1至750倍、5至500倍、7至250倍或10至100倍。免疫增强剂构建体将免疫应答的大小增强的倍数可以使用本领域已知的标准方法测量(例如，如实施例中所述)。例如，表达炎性细胞因子(例如，IFN-γ和/或TNF-α)的抗原特异性T细胞的水平可以通过例如细胞内染色(ICS)或通过ELISpot分析来评估，如实施例中所述。
在一些方面，本公开提供了编码以下列方式刺激或增强有需要的受试者体内的免疫应答(例如，增强受试者体内的免疫应答)的多肽的mRNA：例如，诱导适应性免疫(例如，通过刺激I型干扰素产生)、刺激炎症应答、刺激NFkB信号传导和/或刺激受试者体内的树突状细胞(DC)的发育、活性或动员。在一些方面，向有需要的受试者施用免疫增强剂mRNA增强了受试者体内的细胞免疫(例如，T细胞介导的免疫)、体液免疫(例如，B细胞介导的免疫)，或者细胞和体液这两种免疫。在一些方面，施用免疫增强剂mRNA刺激细胞因子产生(例如，炎性细胞因子产生)、刺激抗原特异性CD8+效应细胞应答、刺激抗原特异性CD4+辅助细胞应答、增加效应记忆CD62Llo T细胞群、刺激B细胞活性或刺激抗原特异性抗体产生，包括前述应答的组合。在一些方面，施用免疫增强剂mRNA刺激细胞因子产生(例如，炎性细胞因子产生)并刺激抗原特异性CD8+效应细胞应答。在一些方面，施用免疫增强剂mRNA刺激细胞因子产生(例如，炎性细胞因子产生)并刺激抗原特异性CD4+辅助细胞应答。在一些方面，施用免疫增强剂mRNA刺激细胞因子产生(例如，炎性细胞因子产生)并增加效应记忆CD62Llo T细胞群。在一些方面，施用免疫增强剂mRNA刺激细胞因子产生(例如，炎性细胞因子产生)并刺激B细胞活性或刺激抗原特异性抗体产生。
在一个实施方案中，免疫增强剂增大抗原特异性CD8+效应细胞应答(细胞免疫)。例如，免疫增强剂可以增大抗原特异性CD8+效应细胞活性的一种或多种指标，包括但不限于CD8+ T细胞增殖和CD8+ T细胞细胞因子产生。例如，在一个实施方案中，免疫增强剂增加抗原特异性CD8+ T细胞的IFN-γ、TNFα和/或IL-2的产生。在各种实施方案中，免疫增强剂可以响应于抗原而将CD8+ T细胞细胞因子产生(例如，IFN-γ、TNFα和/或IL-2产生)增加(相比于不存在该免疫增强剂的情况下的CD8+ T细胞细胞因子产生)至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。例如，可以用感兴趣抗原在体外刺激从受治疗受试者获得的T细胞，并且可以在体外评估CD8+ T细胞细胞因子的产生。CD8+ T细胞细胞因子的产生可以通过本领域已知的标准方法测定，包括但不限于测量细胞因子产生的分泌水平(例如，通过ELISA或本领域已知的用于测定上清液中的细胞因子的量的其他合适方法)和/或测定细胞内染色(ICS)对该细胞因子呈阳性的CD8+ T细胞的百分比。例如，用于表达IFN-γ、TNFα和/或IL-2的CD8+ T细胞的细胞内染色(ICS)可以通过本领域已知的方法进行(参见例如实施例)。在一个实施方案中，免疫增强剂将通过ICS证实的响应于抗原对一种或多种细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα和/或IL-2)呈阳性的CD8+ T细胞的百分比增加(相比于不存在该免疫增强剂的情况下通过ICS证实的对所述一种或多种细胞因子呈阳性的CD8+ T细胞的百分比)至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
在又一个实施方案中，免疫增强剂将总T细胞群(例如，脾T细胞和/或PBMC)中的CD8+ T细胞的百分比相比于不存在该免疫增强剂的情况下的CD8+ T细胞的百分比增大。例如，免疫增强剂可以将总T细胞群中的CD8+ T细胞的百分比相比于不存在该免疫增强剂的情况下的CD8+ T细胞的百分比增大至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。总T细胞群中的CD8+ T细胞的总百分比可以通过本领域已知的标准方法测定，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)。
在另一个实施方案中，免疫增强剂增大肿瘤特异性免疫细胞应答，如通过在存在该免疫增强剂的情况下体内的肿瘤体积相比于不存在该免疫增强剂的情况下的肿瘤体积减小所确定的。例如，免疫增强剂可以将肿瘤体积相比于不存在该免疫增强剂的情况下的肿瘤体积减小至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。肿瘤体积的测量结果可以通过本领域公认的方法测定。
在另一个实施方案中，免疫增强剂例如通过将抗原特异性抗体产生的的量相比于不存在该免疫增强剂的情况下抗原特异性抗体产生增加，来增大B细胞活性(体液免疫应答)。例如，免疫增强剂可以将抗原特异性抗体产生相比于不存在该免疫增强剂的情况下的抗原特异性抗体产生增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。在一个实施方案中，评估了抗原特异性IgG产生。抗原特异性抗体产生可以通过本领域公认的方法来评估，包括但不限于测量样品(例如，血清样品)中的抗原特异性抗体(例如，IgG)的水平的ELISA、RIA等方法。
在另一个实施方案中，免疫增强剂增大了效应记忆CD62Llo T细胞群。例如，免疫增强剂可以增加CD8+ T细胞中的CD62Llo T细胞的总％。除了其他功能之外，该效应记忆CD62Llo T细胞群已被证实在淋巴细胞运输中具有重要功能(参见例如Schenkel,J.M.和Masopust,D.(2014)Immunity 41:886-897)。在各种实施方案中，免疫增强剂可以将响应于抗原的CD8+ T细胞中的效应记忆CD62Llo T细胞的总百分比增加(相比于不存在该免疫增强剂的情况下的CD8+ T细胞群中的CD62Llo T细胞的总百分比)至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。CD8+ T细胞中的效应记忆CD62Llo T细胞的总百分比可以通过本领域已知的标准方法测定，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)。
已经显示免疫增强剂mRNA构建体增强对感兴趣抗原的免疫应答的能力是持久的，且在延长的时间段(例如，长达90天)内观察到增强的免疫原性。因此，在各种实施方案中，免疫增强剂mRNA构建体可以增强抗原特异性免疫应答持续至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少1个月、至少2个月或至少3个月、或更长时间。
免疫增强剂mRNA构建体增强对感兴趣抗原的免疫应答的能力可以在本领域已知的小鼠模型系统中评估。在一个实施方案中，使用免疫活性小鼠模型系统。在一个实施方案中，该小鼠模型系统包括C57/Bl6小鼠(例如，以评估对感兴趣抗原的抗原特异性CD8+ T细胞应答，诸如实施例中所述)。在另一个实施方案中，该小鼠模型系统包括BalbC小鼠或CD1小鼠(例如，以评估B细胞应答，诸如抗原特异性抗体应答)。
在一些实施方案中，本公开的免疫增强剂多肽在至少一种Toll样受体(TLR)的下游起作用，从而增强免疫应答。因此，在一个实施方案中，该免疫增强剂不是TLR，而是受体自身下游的TLR信号传导途径内的分子。
在一些实施方案中，该多肽刺激I型干扰素(IFN)应答。适合用作免疫增强剂的刺激I型IFN应答的多肽的非限制性实例包括STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI和IFI16。刺激I型干扰素(IFN)应答的多肽的具体实例在下面进一步描述。
在另一个实施方案中，该多肽刺激NFκB介导的促炎应答。刺激NFκB介导的促炎应答的多肽的非限制性实例包括STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7。刺激NFκB介导的促炎应答的多肽的具体实例在下面进一步描述。
在另一个实施方案中，该多肽是细胞内衔接蛋白。在一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白刺激I型IFN应答。在另一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白刺激NFκB介导的促炎应答。细胞内衔接蛋白的非限制性实例包括STING、MAVS和MyD88。细胞内衔接蛋白的具体实例在下面进一步描述。
在另一个实施方案中，该多肽是细胞内信号传导蛋白。在一个实施方案中，该多肽是TLR信号传导途径的细胞内信号传导蛋白。在一个实施方案中，该细胞内信号传导蛋白刺激I型IFN应答。在另一个实施方案中，该细胞内信号传导蛋白刺激NFκB介导的促炎应答。细胞内信号传导蛋白的非限制性实例包括MyD88、IRAK 1、IRAK2、IRAK4、TRAF3、TRAF6、TAK1、TAB2、TAB3、TAK-TAB1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、IKKα、IKKβ、TRAM、TRIF、RIPK1和TBK1。细胞内信号传导蛋白的具体实例在下面进一步描述。
在另一个实施方案中，该多肽为转录因子。在一个实施方案中，该转录因子刺激I型IFN应答。在另一个实施方案中，该转录因子刺激NFκB介导的促炎应答。转录因子的非限制性实例包括IRF3或IRF7。转录因子的具体实例在下文进一步描述。
在另一个实施方案中，该多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成。如果蛋白质本身介导坏死性凋亡或与另外的分子一起参与介导坏死性凋亡和/或坏死体形成，则称多肽“参与”坏死性凋亡或坏死体形成。参与坏死性凋亡或坏死体形成的多肽的非限制性实例包括MLKL、RIPK1、RIPK3、DIABLO和FADD。参与坏死性凋亡或坏死体形成的多肽的具体实例在下面进一步描述。
在另一个实施方案中，该多肽参与细胞焦亡或炎性体形成。如果蛋白质本身介导细胞焦亡或与另外的分子一起参与介导细胞焦亡和/或炎性体形成，则称多肽“参与”细胞焦亡或炎性体形成。参与细胞焦亡或炎性体形成的多肽的非限制性实例包括半胱天冬酶1、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶11、GSDMD、NLRP3、Pyrin结构域和ASC/PYCARD。参与细胞焦亡或炎性体形成的多肽的具体实例在下面进一步描述。
在一些实施方案中，编码免疫增强剂的本公开的mRNA可以包含一个或多个经修饰的核碱基。合适的修饰在下面进一步讨论。
在一些实施方案中，将编码免疫增强剂的本公开的mRNA配制成脂质纳米粒子。在一个实施方案中，该脂质纳米粒子还包含编码感兴趣抗原的mRNA。在一个实施方案中，将该脂质纳米粒子施用于受试者以增强针对该受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答。合适的纳米粒子和使用方法将在下面进一步讨论。
在另一个实施方案中，本公开提供了包含两种或更多种免疫增强剂mRNA的组合的组合物。所述两种或更多种免疫增强剂mRNA可以是相同类型的免疫增强剂(例如，两种或更多种刺激I型干扰素(IFN)应答的免疫增强剂)，或者可以是不同类型的免疫增强剂。因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的第一多肽的第一信使RNA(mRNA)、编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的第二多肽的第二mRNA，以及任选地，编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的第三多肽的第三mRNA(以及任选地，编码免疫增强剂的第四、第五、第六或更多种mRNA)，
其中该免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
在一些实施方案中，第一、第二和/或任选地第三多肽(以及任选地，第四、第五、第六或更多种多肽)在至少一种Toll样受体(TLR)的下游起作用，从而增强免疫应答。
在该组合组合物的各种实施方案中：
(i)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且所述第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答；
(ii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且所述第二多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成；
(iii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且所述第二多肽参与细胞焦亡或炎性体形成；
(iv)所述第一多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且所述第二多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成；
(v)第一多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且第二多肽参与细胞焦亡或炎性体形成；
(vii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答、所述第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且所述第三多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成；或
(viii)第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答、第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且第三多肽参与细胞焦亡或炎性体形成。
这些类别的免疫增强剂中的每一种的合适的非限制性实例在上文中列出，并在下面进一步详细描述。设想了所列免疫增强剂的所有组合。
在一些实施方案中，第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且选自STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI和IFI16；第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且选自STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7。在一些实施方案中，第一多肽为组成型活性IRF3，并且第二多肽为组成型活性IKKβ。在一些实施方案中，该组合物还包含编码组成型活性IRF7多肽的mRNA(即，该组合物包含编码组成型活性IRF3、组成型活性IRF7多肽和组成型活性IKKβ的mRNA)。
在一些实施方案中，第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且选自STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI和IFI16；第二多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成，并且选自MLKL、RIPK1、RIPK3、DIABLO和FADD。在一些实施方案中，第一多肽为组成型活性STING，并且第二多肽为MLKL多肽。
在一些实施方案中，第一多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且选自STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7；所述第二多肽参与细胞焦亡或炎性体形成，并且选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶11、GSDMD、NLRP3、Pyrin结构域和ASC/PYCARD。在一些实施方案中，第一多肽为组成型活性IKKβ，并且第二多肽为半胱天冬酶-1多肽。在一些实施方案中，该组合物还包含编码半胱天冬酶-4多肽的mRNA(即，该组合物包含编码组成型活性IKKβ、半胱天冬酶-1多肽和半胱天冬酶-4多肽的mRNA)。
在一些实施方案中，编码两种或更多种免疫增强剂的本公开的组合组合物包含含有一个或多个经修饰的核碱基的一种或多种mRNA。合适的修饰在下面进一步讨论。
在一些实施方案中，将编码两种或更多种免疫增强剂的本公开的组合组合物配制成脂质纳米粒子。在一些实施方案中，该脂质纳米粒子还包含编码感兴趣抗原的mRNA。在一些实施方案中，将该脂质纳米粒子施用于受试者以增强针对该受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答。合适的纳米粒子和使用方法将在下面进一步讨论。
刺激I型干扰素的免疫增强剂mRNA
在一些方面，本公开提供了编码这样的多肽的免疫增强剂mRNA：该多肽通过刺激或增强I型干扰素途径信号传导来刺激或增强针对感兴趣抗原的免疫应答，从而刺激或增强I型干扰素(IFN)产生。已经确定成功诱导抗肿瘤或抗微生物适应性免疫需要I型IFN信号传导(参见例如Fuertes,M.B.等人，(2013)Trends Immunol.34:67-73)。产生I型IFN(包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω)在清除微生物感染(诸如病毒感染)中起作用。还已经认识到，宿主细胞DNA(例如来源于受损细胞或垂死细胞)能够诱导I型干扰素产生，并且I型IFN信号传导途径在适应性抗肿瘤免疫的发育中起作用。然而，许多病原体和癌细胞已经进化出减小或抑制I型干扰素应答的机制。因此，通过向受试者提供本公开的免疫增强剂mRNA来激活(包括刺激和/或增强)有需要的受试者体内的I型IFN信号传导途径，在各种各样的临床情况(包括治疗癌症和病原性感染，以及增强疫苗应答以提供保护性免疫)下刺激或增强了受试者体内的免疫应答。
I型干扰素(IFN)是促炎细胞因子，其通常在病毒感染后，在多种不同的细胞类型中快速产生，并且已知具有各种各样的作用。体内产生I型IFN的典型后果是激活抗微生物细胞程序，以及发展先天免疫应答和适应性免疫应答。I型IFN在受感染细胞和邻近细胞中诱导细胞内在的抗微生物状态，这限制了感染因子(特别是病毒病原体)的扩散。I型IFN还调控先天免疫细胞激活(例如，树突状细胞成熟)，以促进抗原呈递细胞和自然杀伤细胞的功能。I型IFN还促进高亲和力抗原特异性T和B细胞应答和免疫记忆的发展(Ivashkiv和Donlin，(2014)Nat Rev Immunol 14(1):36-49)
I型IFN激活树突状细胞(DC)，并且通过自分泌信号传导促进其T细胞刺激能力(Montoya等人，(2002)Blood 99:3263-3271)。I型IFN暴露经由增加趋化因子受体和粘附分子的表达(例如，以促进DC迁移到引流淋巴结中)、共刺激分子和MHC I类和II类抗原呈递来促进DC的成熟。在I型IFN暴露后成熟的DC可以有效地引发保护性T细胞应答(Wijesundara等人，(2014)Front Immunol 29(412)和其中的参考文献)。
I型IFN可以促进或抑制T细胞激活、增殖、分化和存活，在很大程度上取决于I型IFN信号传导相对于T细胞受体信号传导的时间(Crouse等人，(2015)Nat Rev Immunol 15:231-242)。早期研究揭示，MHC-I表达在多种细胞类型中响应于I型IFN而上调(Lindahl等人，(1976),J Infect Dis 133(增刊):A66-A68；Lindahl等人，(1976)Proc Natl Acad SciUSA 17:1284-1287)，这是获得最佳T细胞刺激、分化、扩增和溶细胞活性的要求。I型IFN可以对CD8 T细胞发挥强效的共刺激作用，从而增强CD8 T细胞增殖和分化(Curtsinger等人，(2005)J Immunol 174:4465-4469；Kolumam等人，(2005)J Exp Med202:637-650)。
类似于对T细胞的作用，I型IFN信号传导对B细胞应答具有正负两方面的影响，这取决于暴露的时间和背景(Braun等人，(2002)Int Immunol 14(4):411-419；Lin等人，(1998)187(1):79-87)。I型IFN信号传导可以抑制未成熟B细胞的存活与成熟。与未成熟B细胞相比，已经证实I型IFN暴露在病毒感染后或实验性免疫后促进B细胞激活、抗体产生和同种型转换(Le Bon等人，(2006)J Immunol176:4:2074-2078；Swanson等人，(2010)J ExpMed 207:1485-1500)。
已经确定了参与I型IFN途径信号传导的多种组分，包括STING、干扰素调节因子，诸如IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8和IRF9、TBK1、IKKi、MyD88、MAVS和TRAM。参与I型IFN途径信号传导的另外组分包括IKKα、TRAF3、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4、TRIF、IPS-1、TLR-3、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9、RIG-1、DAI和IFI16。
因此，在一个实施方案中，免疫增强剂mRNA编码参与I型IFN途径信号传导的前述组分中的任一种。
编码STING的免疫增强剂mRNA
本公开涵盖编码STING(包括STING的组成型活性形式)作为免疫增强剂的mRNA(包括mmRNA)。STING(干扰素基因的刺激物；也称为跨膜蛋白173(TMEM173)、IRF3激活介质(MITA)、蛋氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸(MPYS)和ER IFN刺激物(ERIS))是含有379个氨基酸的内质网(ER)驻留跨膜蛋白，它充当控制免疫应答基因转录的信号传导分子，包括I型IFN和促炎细胞因子(Ishikawa和Barber，(2008)Nature 455:647-678；Ishikawa等人，(2009)Nature 461:788-792；Barber(2010)Nat Rev Immunol 15(12):760-770)。
STING充当信号传导衔接物，将DNA的胞质溶胶检测与TBK1/IRF3/I型IFN信号传导轴连接起来。STING的信号传导衔接物功能通过直接感测环状二核苷酸(CDN)而激活。CDN的实例包括环状二-GMP(鸟苷5'-单磷酸)、环状二-AMP(腺苷5'-单磷酸)和环状GMP-AMP(cGAMP)。CDN最初被表征为普遍存在的细菌第二信使，现在已知其构成一类病原体相关分子模式分子(PAMP)，CDN经由与STING直接相互作用来激活TBK1/IRF3/I型IFN信号传导轴。STING能够感测细胞的胞质溶胶中的异常DNA种类和/或CDN，包括来源于细菌和/或来源于宿主蛋白环状GMP-AMP合酶(cGAS)的CDN。cGAS蛋白是DNA传感器，其响应于在胞质溶胶中检测到DNA而产生cGAMP(Burdette等人，(2011)Nature 478:515-518；Sun等人，(2013)Science 339:786-791；Diner等人，(2013)Cell Rep 3:1355-1361；Ablasser等人，(2013)Nature 498:380-384)。
在与CDN结合后，STING二聚化并经历构象变化，从而促进与TANK结合激酶1(TBK1)形成复合物(Ouyang等人，(2012)Immunity36(6):1073-1086)。该复合物易位至核周高尔基体，导致TBK1递送至内溶酶体区室，在那里将IRF3和NF-κB转录因子磷酸化(Zhong等人，(2008)Immunity 29:538-550)。最近的一项研究已经证实，STING通过与TBK1和IRF3这两者结合以特异性地促进TBK1对IRF3的磷酸化，而起到支架的作用(Tanaka和Chen，(2012)SciSignal 5(214):ra20)。IRF3-、IRF7-和NF-κB-依赖性信号传导途径的激活诱导细胞因子和其他免疫应答相关蛋白(诸如I型IFN)的产生，这些细胞因子和蛋白促进抗病原体和/或抗肿瘤活性。
许多研究已经调查了使用STING的CDN激动剂作为潜在的疫苗佐剂或免疫调节剂来引发体液免疫应答和细胞免疫应答(Dubensky等人，(2013)Ther Adv Vaccines1(4):131-143和其中的参考文献)。初步研究证明，施用CDN c-di-GMP减弱了体内的金黄色葡萄球菌感染，从而减少了小鼠感染模型中回收的细菌细胞的数量，但并未观察到c-di-GMP在体外对细菌细胞有抑制和杀菌作用，这表明细菌细胞的减少归因于对宿主免疫系统的影响(Karaolis等人，(2005)Antimicrob Agents Chemother 49:1029-1038；Karaolis等人，(2007)Infect Immun75:4942-4950)。最近的研究已经证实，与用单独的GM-CSF疫苗进行免疫相比，用产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的癌症疫苗(称为STINGVAX)配制的合成CDN衍生分子在癌症的治疗性动物模型中引发增强的体内抗肿瘤作用(Fu等人，(2015)Sci Transl Med 7(283):283ra52)，这表明CDN是强效的疫苗佐剂。
已经描述了由映射到人TMEM173基因的多态性产生的突变型STING蛋白，其表现出功能获得表型或组成型活性表型。突变型STING等位基因在体外表达时，被证实强效地刺激对I型IFN的诱导(Liu等人，(2014)N Engl J Med 371:507-518；Jeremiah等人，(2014)JClin Invest 124:5516-5520；Dobbs等人，(2015)Cell Host Microbe18(2):157-168；Tang和Wang，(2015)PLoS ONE 10(3):e0120090；Melki等人，(2017)J Allergy Clin ImmunolIn Press；Konig等人，(2017)Ann Rheum Dis 76(2):468-472；Burdette等人，(2011)Nature 478:515-518)。
本文提供了编码STING的组成型活性形式(包括突变型人STING同种型)以用作本文所述免疫增强剂的mRNA(包括经化学修饰的mRNA(mmRNA))。编码STING的组成型活性形式(包括突变型人STING同种型)的mRNA(例如，mmRNA)在本文的序列表中列出。本文使用的突变型人STING多肽的氨基酸残基编号对应于用于本领域可作为Genbank登录号NP_938023获得的含有379个氨基酸残基的野生型人STING(同种型1)的编号。
因此，在一个方面，本公开提供了编码在氨基酸残基155处具有突变(特别是氨基酸取代，诸如V155M突变)的突变型人STING蛋白的mRNA(例如，mmRNA)。在一个实施方案中，该mRNA(例如，mmRNA)编码如以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列。在一个实施方案中，该STING V155M突变体由以SEQ ID NO:199、1319或1320示出的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，该mRNA(例如，mmRNA)包含如以SEQ ID NO:209示出的3’UTR序列，该序列包括miR122结合位点。
在其他方面，本公开提供了编码在氨基酸残基284处具有突变(诸如氨基酸取代)的突变型人STING蛋白的mRNA。残基284取代的非限制性实例包括R284T、R284M和R284K。在某些实施方案中，该突变型人STING蛋白具有R284T突变，例如具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:1442示出的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，该突变型人STING蛋白具有R284M突变，例如具有如以SEQ ID NO:3示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:1443示出的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，该突变型人STING蛋白具有R284K突变，例如具有如以SEQ ID NO:4或224示出的氨基酸序列，或由以SEQ ID NO:202、225、1444或1466示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码在氨基酸残基154处具有突变(诸如氨基酸取代，诸如N154S突变)的突变型人STING蛋白的mRNA。在某些实施方案中，该突变型人STING蛋白具有N154S突变，例如具有如以SEQ ID NO:5示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:203或SEQID NO:1445示出的核苷酸序列编码。
在还有其他方面，本公开提供了编码在氨基酸残基147处具有突变(诸如氨基酸取代，诸如V147L突变)的突变型人STING蛋白的mRNA。在某些实施方案中，具有V147L突变的该突变型人STING蛋白具有如以SEQ ID NO:6示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:204或SEQID NO:1446示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码在氨基酸残基315处具有突变(诸如氨基酸取代，诸如E315Q突变)的突变型人STING蛋白的mRNA。在某些实施方案中，具有E315Q突变的该突变型人STING蛋白具有如以SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:205或SEQ IDNO:1447示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码在氨基酸残基375处具有突变(诸如氨基酸取代，诸如R375A突变)的突变型人STING蛋白的mRNA。在某些实施方案中，具有R375A突变的该突变型人STING蛋白具有如以SEQ ID NO:8示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:206或SEQ IDNO:1448示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码具有前述突变中的一种或多种，或者两种、三种、四种或更多种的组合的突变型人STING蛋白的mRNA。因此，在一个方面，本公开提供了编码具有选自V147L、N154S、V155M、R284T、R284M、R284K、E315Q和R375A以及它们的组合的一个或多个突变的突变型人STING蛋白的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码具有选自下列的突变的组合的突变型人STING蛋白的mRNA：V155M和R284T；V155M和R284M；V155M和R284K；V155M和V147L；V155M和N154S；V155M和E315Q；以及V155M和R375A。
在其他方面，本公开提供了编码具有V155M和一种、两种、三种或更多种以下突变的突变型人STING蛋白的mRNA：R284T；R284M；R284K；V147L；N154S；E315Q；和R375A。在其他方面，本公开提供了编码具有V155M、V147L和N154S这些突变的突变型人STING蛋白的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码具有V155M、V147L、N154S这些突变，并且任选地在氨基酸284处具有突变的突变型人STING蛋白的mRNA。在还有其他方面，本公开提供了编码具有V155M、V147L、N154S这些突变，并且在氨基酸284处具有选自R284T、R284M和R284K的突变的突变型人STING蛋白的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码具有V155M、V147L、N154S和R284T这些突变的突变型人STING蛋白的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码具有V155M、V147L、N154S和R284M这些突变的突变型人STING蛋白的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码具有V155M、V147L、N154S和R284K这些突变的突变型人STING蛋白的mRNA。
在其他实施方案中，本公开提供了编码这样的突变型人STING蛋白的mRNA：该蛋白在氨基酸残基147、154、155，以及任选地284处具有突变的组合，所述突变特别是氨基酸取代，诸如V147L、N154S、V155M，以及任选地R284M。在某些实施方案中，该突变型人STING蛋白具有V147N、N154S和V155M这些突变，诸如，如以SEQ ID NO:9示出或由以SEQ ID NO:207或SEQ ID NO:1449示出的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在某些实施方案中，该突变型人STING蛋白具有R284M、V147N、N154S和V155M这些突变，诸如，如以SEQ ID NO:10示出或由以SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:1450示出的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本公开提供了编码为全长379个氨基酸的野生型蛋白的组成型活性截短形式的突变型人STING蛋白(诸如由137至379个氨基酸组成的组成型活性人STING多肽)的mRNA。
编码免疫调节因子(IRF)的免疫增强剂mRNA
本公开提供了编码干扰素调节因子(诸如作为免疫增强剂的IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8和IRF9)的mRNA(包括mmRNA)。IRF转录因子家族参与基因表达的调节，导致在先天免疫应答期间产生I型干扰素(IFN)。迄今为止已经鉴定出9种人IRF(IRF-1至IRF-9)，每个家族成员在其N-末端结合结构域(DBD)内共享广泛的序列同源性(Mamane等人，(1999)Gene 237:1-14；Taniguchi等人，(2001)Annu Rev Immunol19:623-655)。在IRF家族内，IRF1、IRF3、IRF5和IRF7已经被明确地指出是I型IFN基因转录的正调节物(Honda等人，(2006)Immunity 25(3):349-360)。IRF1是被发现能够激活I型IFN基因启动子的第一个家族成员(Miyamoto等人，(1988)Cell 54:903-913)。尽管研究证实IRF1参与I型IFN基因表达，但在感染病毒的IRF1-/-鼠成纤维细胞中观察到I型IFN的正常诱导，这表明了可分配性(Matsuyama等人，(1993)Cell 75:83-97)。还证实IRF5对于病毒或TLR激动剂引起的I型IFN诱导是可有可无的(Takaoka等人，(2005)Nature434:243-249)。
因此，在一些方面，本公开提供了编码人IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8和IRF9的组成型活性形式作为免疫增强剂的mRNA。在一些方面，本公开提供了编码人IRF3和/或IRF7的组成型活性形式的mRNA。
在先天免疫应答期间，IRF-3在早期诱导I型IFN中起关键作用。IRF3转录因子以组成型方式表达，并且以潜在形式在细胞的细胞核与细胞质之间穿梭，且在磷酸化之前主要定位在胞质溶胶中(Hiscott(2007)J Biol Chem 282(21):15325-15329；Kumar等人，(2000)Mol Cell Biol20(11):4159-4168)。通过TBK-1(TANK结合激酶1；也称为T2K和NAK)和/或IKKε(诱导型IκB激酶；也称为IKKi)将C-末端处的丝氨酸残基磷酸化之后，IRF3从细胞质易位到细胞核中(Fitzgerald等人，(2003)Nat Immuno4(5):491-496；Sharma等人，(2003)Science300:1148-1151；Hemmi等人，(2004)J Exp Med199:1641-1650)。IRF3的转录活性由这些磷酸化事件和易位事件介导。IRF3激活的模型提出，C-末端磷酸化诱导IRF3的构象变化，从而促进同二聚化和/或异二聚化(例如，使用IRF7；参见Honda等人，(2006)Immunity25(3):346-360)、核定位，以及与转录共激活因子CBP和/或p300关联(Lin等人，(1999)Mol Cell Biol 19(4):2465-2474)。虽然无活性的IRF3组成性地穿梭进出细胞核，但磷酸化的IRF3蛋白仍然与CBP和/或p300缔合、保留在细胞核中，并诱导IFN和其他基因的转录(Kumar等人，(2000)Mol Cell Biol 20(11):4159-4168)。
与IRF3相比，IRF7在大多数细胞中表现出低表达水平，却被I型IFN介导的信号传导强烈诱导，从而支持以下概念：IRF3主要负责IFN基因的早期诱导，IRF7则参与晚期诱导期(Sato等人，(2000)Immunity 13(4):539-548)。配体与I型IFN受体结合引起异源三聚体转录激活因子的激活，该激活因子称为IFN刺激的基因因子3(ISGF3)，它由IRF9、STAT1和STAT2组成，并且负责诱导IRF7基因(Marie等人，(1998)EMBO J 17(22):6660-6669)。与IRF3一样，IRF7可以在其C-末端区发生丝氨酸磷酸化之后在细胞质与细胞核之间分配，从而允许其发生二聚化与核易位。IRF7与IRF3形成同源二聚体或异源二聚体，并且这些不同二聚体中的每一种都差异性地作用于I型IFN基因家族成员。IRF3在激活IFN-β基因方面比激活IFN-α基因更强效，而IRF7却有效地激活IFN-α和IFN-β这两种基因(Marie等人，(1998)EMBO J 17(22):6660-6669)。
本文提供了编码IRF3和IRF7的组成型活性形式(包括突变型人IRF3同种型和突变型人IRF7同种型)以用作如本文所述免疫增强剂的mRNA。编码IRF3和IRF7的组成型活性形式(包括突变型人IRF3和IRF7同种型)的mRNA在本文的序列表中列出。本文使用的突变型人IRF3多肽的氨基酸残基编号对应于用于本领域可作为Genbank登录号NP_001562获得的含有427个氨基酸残基的野生型人IRF3(同种型1)的编号。本文使用的突变型人IRF7多肽的氨基酸残基编号对应于用于本领域可作为Genbank登录号NP_001563获得的含有503个氨基酸残基的野生型人IRF7(同种型a)的编号。
因此，在一些方面，本公开提供了编码有组成型活性的突变型人IRF3蛋白的mRNA，该蛋白例如在氨基酸残基396处具有突变，诸如氨基酸取代，诸如S396D突变，例如如以氨基酸序列SEQ ID NO:12示出或由以SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:1463示出的核苷酸序列编码。在其他方面，该mRNA构建体编码包含S396D突变的组成型活性小鼠IRF3多肽，例如如以SEQ ID NO:11的氨基酸序列示出或由以210或SEQ ID NO:1452示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码有组成型活性的突变型人IRF7蛋白的mRNA。在一个方面，本公开提供了编码包含一个或多个点突变(与野生型相比的氨基酸取代)的组成型活性IR7蛋白的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码组成型活性IR7蛋白(包括该蛋白的截短形式(与野生型相比的氨基酸缺失))的mRNA。在还有其他方面，本公开提供了编码组成型活性IR7蛋白(包括该蛋白的截短形式)的mRNA，该蛋白还包括一个或多个点突变(与野生型相比的氨基酸缺失和氨基酸取代的组合)。
人IRF7的野生型氨基酸序列(同种型a)以SEQ ID NO:13示出，并且由以SEQ IDNO:212或SEQ ID NO:1454示出的核苷酸序列编码。制备了包含与野生型序列相比的点突变、缺失或这两者的一系列组成型活性形式的人IRF7。在一个方面，本公开提供了编码包含以下突变中的一种或多种突变的组成型活性IRF7多肽的免疫增强剂mRNA构建体：S475D、S476D、S477D、S479D、L480D、S483D和S487D，以及它们的组合。在其他方面，本公开提供了编码包含突变S477D和S479D的组成型活性IRF7多肽的mmRNA，该多肽如以氨基酸序列SEQ IDNO:14示出，由以SEQ ID NO:213或SEQ ID NO:1455示出的核苷酸序列编码。在另一个方面，本公开提供了编码包含突变S475D、S477D和L480D的组成型活性IRF7多肽的mRNA，该多肽如以氨基酸序列SEQ ID NO:15示出，由以SEQ ID NO:214或SEQ ID NO:1456示出的核苷酸序列编码。在其他方面，本公开提供了编码包含突变S475D、S476D、S477D、S479D、S483D和S487D的组成型活性IRF7多肽的mRNA，该多肽如以氨基酸序列SEQ ID NO:16示出，由以SEQID NO:215或SEQ ID NO:1457示出的核苷酸序列编码。在另一个方面，本公开提供了编码包含氨基酸残基247-467缺失(即，包含氨基酸残基1-246和468-503)的组成型活性IRF7多肽的mRNA，该多肽如以氨基酸序列SEQ ID NO:17示出，由以SEQ ID NO:216或SEQ ID NO:1458示出的核苷酸序列编码。在另一个方面，本公开提供了编码包含氨基酸残基247-467缺失(即，包含氨基酸残基1-246和468-503)并且还包含突变S475D、S476D、S477D、S479D、S483D和S487D的组成型活性IRF7多肽的mRNA，该多肽如以氨基酸序列SEQ ID NO:18示出，由以SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:1459示出的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了编码包含残基152-246缺失(即，包含氨基酸残基1-151和247-503)的截短的IRF7无活性“空”多肽构建体的mRNA，该多肽构建体如以氨基酸序列SEQ ID NO:19示出，由以SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:1460示出的核苷酸序列编码(例如，用于对照目的)。在其他方面，本公开提供了编码包含残基1-151缺失(即，包含氨基酸残基152-503)的截短的IRF7无活性“空”多肽构建体的mRNA，该多肽构建体如以氨基酸序列SEQID NO:20示出，由以SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:1461示出的核苷酸序列编码(例如，用于对照目的)。
激活I型IFN的另外的免疫增强剂mRNA
除了上述的STING和IRF mRNA构建体之外，本公开还提供了编码I型IFN信号传导途径的另外组分的mRNA构建体，这些mRNA构建体可以用作免疫增强剂，以通过激活I型IFN信号传导途径来增强免疫应答。例如，在一个实施方案中，该免疫增强剂mRNA构建体编码MyD88蛋白。本领域已知MyD88在IRF7的上游发信号。在一个方面，本公开提供了编码组成型活性MyD88蛋白(诸如具有一个或多个点突变的突变型MyD88蛋白)的mmRNA。在一个方面，本公开提供了编码具有L265P取代的突变型人或小鼠MyD88蛋白的mRNA，该蛋白如分别以SEQID NO:134(由以SEQ ID NO:1409或SEQ ID NO:1480示出的核苷酸序列编码)和135示出。
在另一个方面，免疫增强剂mRNA构建体编码MAVS(线粒体抗病毒信号传导)蛋白。本领域已知MAVS在IRF3/IRF7的上游发信号。已经证明MAVS在对双链RNA病毒的保护性干扰素应答中有重要作用。例如，缺乏MAVS的感染轮状病毒的小鼠相比具有MAVS的小鼠产生明显更少的IFN-β和明显增多的病毒量(Broquet,A.H.等人，(2011)J.Immunol.186:1618-1626)。此外，已经证实通过MAVS进行的RIG-1或MDA5信号传导是激活感染轮状病毒的细胞产生IFN-β所必需的(Broquet等人，出处同上)。MAVS也已经被证实对连同MDA5一起介导的对柯萨奇B病毒(Coxsackie B virus)的I型干扰素应答至关重要(Wang,J.P.等人，(2010)J.Virol.84:254-260)。更进一步，已经证实尽管不同类别的受体负责细胞中的RNA和DNA感测，但下游信号传导组分在物理上和功能上相互关联，并且RIG-1/MAVS RNA感测途径与cGAS-STING DNA感测途径之间存在交互应答(cross-talk)，用于增强有效的抗病毒应答，包括干扰素应答(Zevini,A.等人，(2017)Trends Immunol.38:194-205)。在一个方面，本公开涵盖编码组成型活性MAVS蛋白(诸如具有一个或多个点突变的突变型MAVS蛋白)的mRNA。在另一个方面，本公开涵盖过表达的野生型MAVS蛋白。在一个方面，本公开提供了编码如以SEQ ID NO:1387示出的MAVS蛋白的mRNA。编码SEQ ID NO:1387的MAVS蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1413和SEQ ID NO:1484示出。
在另一个方面，免疫增强剂mRNA构建体编码TRAM(TICAM2)蛋白。本领域已知TRAM在IRF3的上游发信号。在一个方面，本公开涵盖编码组成型活性TRAM蛋白(诸如具有一个或多个点突变的突变型TRAM蛋白)的mmRNA。在另一个方面，本公开涵盖过表达的野生型TRAM蛋白。在一个方面，本公开提供了编码如以SEQ ID NO:136示出的小鼠TRAM蛋白的mRNA。编码SEQ ID NO:136的TRAM蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1410或SEQ ID NO:1481示出。
在还有其他方面，本公开提供了编码TANK结合激酶1(TBK1)或诱导型IκB激酶(IKKi，也称为IKKε)(包括TBK1或IKKi的组成型活性形式)作为免疫增强剂的免疫增强剂mRNA构建体。TBK1和IKKi已被证明是将IRF3和IRF7磷酸化的病毒激活激酶的组分，因而在I型IFN信号传导途径中在IRF3和IRF7的上游起作用(Sharma,S.等人，(2003)Science 300:1148-1151)。TBK1和IKKi参与转录因子(例如IRF3/7和NF-κB)的磷酸化和激活，这些转录因子诱导I型IFN基因以及IFN诱导型基因的表达(Fitzgerald,K.A.等人，(2003)Nat Immunol4(5):491-496)。
因此，在一个方面，本公开提供了编码TBK1蛋白(包括TBK1的组成型活性形式，包括突变型人TBK1同种型)的免疫增强剂mRNA构建体。在还有其他方面，免疫增强剂mRNA构建体编码IKKi蛋白，包括IKKi的组成型活性形式，包括突变型人IKKi同种型。
刺激炎症应答的免疫增强剂mRNA
在其他方面，本公开提供了通过刺激炎症应答来增强免疫应答的免疫增强剂mRNA构建体。刺激炎症应答的药剂的非限制性实例包括STAT1、STAT2、STAT4和STAT6。因此，本公开提供了编码这些炎症诱导蛋白的一种或组合(包括组成型活性形式)的免疫增强剂mRNA构建体。
本文提供了编码STAT6的组成型活性形式(包括突变型人STAT6同种型)以用作如本文所述的免疫增强剂的mRNA。编码STAT6的组成型活性形式(包括突变型人STAT6同种型)的mRNA在本文的序列表中列出。本文使用的突变型人STAT6多肽的氨基酸残基编号对应于用于本领域可作为Genbank登录号NP_001171550.1获得的含有847个氨基酸残基的野生型人STAT6(同种型1)的编号。
在一个实施方案中，本公开提供了编码包含选自S407D、V547A、T548A、Y641F和它们的组合的一个或多个氨基酸突变的组成型活性人STAT6构建体的mRNA构建体。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含V547A和T548A这些突变的组成型活性人STAT6构建体，诸如以SEQ ID NO:137示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含S407D突变的组成型活性人STAT6构建体，诸如以SEQ ID NO:138示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含S407D、V547A和T548A这些突变的组成型活性人STAT6构建体，诸如以SEQ ID NO:139示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含V547A、T548A和Y641F这些突变的组成型活性人STAT6构建体，诸如以SEQ ID NO:140示出的序列。
刺激NFkB信号传导的免疫增强剂mRNA
在其他方面，本公开提供了通过刺激NFkB信号传导来增强免疫应答的免疫增强剂mRNA构建体，其中已知该NFkB信号传导参与刺激免疫应答。刺激NFkB信号传导的蛋白质的非限制性实例包括STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7。因此，本公开的免疫增强剂mRNA构建体可以编码这些NFkB途径诱导蛋白中的任一种(例如为组成型活性形式)。
上文在有关激活I型IFN的免疫增强剂mRNA构建体的小节中描述了可以充当通过刺激NFkB信号传导来增强免疫应答的免疫增强剂mRNA构建体的合适的STING构建体。
上文在有关激活I型IFN的免疫增强剂mRNA构建体的小节中描述了可以充当通过刺激NFkB信号传导来增强免疫应答的免疫增强剂mRNA构建体的合适的MyD88构建体。
在一个实施方案中，本公开提供了一种免疫增强剂mRNA构建体，其激活编码c-FLIP(细胞半胱天冬酶8(FLICE)样抑制蛋白)蛋白(在本领域中也称为CASP8和FADD样细胞凋亡调节物)的NFκB信号传导，该蛋白包括组成型活性c-FLIP。本文提供了编码c-FLIP的组成型活性形式(包括突变型人c-FLIP同种型)以用作如本文所述的免疫增强剂的mmRNA。编码c-FLIP的组成型活性形式(包括突变型人c-FLIP同种型)的mmRNA在本文的序列表中列出。本文使用的突变型人c-FLIP多肽的氨基酸残基编号对应于用于本领域可作为Genbank登录号NP_003870获得的含有480个氨基酸残基的野生型人c-FLIP(同种型1)的编号。
在一个实施方案中，该mRNA编码包含两个DED结构域、一个p20结构域和一个p12结构域的c-FLIP长(L)同种型，诸如具有以SEQ ID NO:141示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA编码包含两个DED结构域的c-FLIP短(S)同种型，从而编码氨基酸1-227，诸如具有以SEQ ID NO:142示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA编码c-FLIP p22切割产物，从而编码氨基酸1-198，诸如具有以SEQ ID NO:143示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA编码c-FLIP p43切割产物，从而编码氨基酸1-376，诸如具有以SEQ ID NO:144示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA编码c-FLIP p12切割产物，从而编码氨基酸377-480，诸如具有以SEQ ID NO:145示出的序列。编码上文讨论的c-FLIP蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ IDNO:1398-1402和1469-1473示出。
在另一个实施方案中，激活NFκB信号传导的免疫增强剂mRNA构建体编码组成型活性IKKαmRNA构建体或组成型活性IKKβmRNA构建体。在一个实施方案中，该组成型活性人IKKβ多肽包含S177E突变和S181E突变，诸如以SEQ ID NO:146示出的序列。在另一个实施方案中，该组成型活性人IKKβ多肽包含S177A突变和S181A突变，诸如以SEQ ID NO:147示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码组成型活性小鼠IKKβ多肽。在一个实施方案中，该组成型活性小鼠IKKβ多肽包含S177E突变和S181E突变，诸如以SEQ ID NO:148示出的序列。在另一个实施方案中，该组成型活性小鼠IKKβ多肽包含S177A突变和S181A突变，诸如以SEQ ID NO:149示出的序列。编码具SEQ ID NO:146的蛋白质的示例性核苷酸序列以SEQID NO:1414和SEQ ID NO:1485示出。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含PEST突变的组成型活性人或小鼠IKKα多肽，诸如具有如以SEQ ID NO:150示出的序列(人)(由以SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:28示出的核苷酸序列编码)或如以SEQ ID NO:154示出的序列(小鼠)(由以SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:1429示出的核苷酸序列编码)。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含PEST突变的组成型活性人或小鼠IKKβ多肽，诸如具有以SEQID NO:152示出的序列(人)(由以SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:1397示出的核苷酸序列编码)或以SEQ ID NO:156示出的序列(小鼠)(由以SEQ ID NO:157或SEQ ID NO:1430示出的核苷酸序列编码)。
在另一个实施方案中，本公开提供了免疫增强剂mRNA构建体，该构建体激活编码受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)蛋白的NFκB信号传导。本领域描述了编码诱导免疫原性细胞死亡的RIPK1构建体的DNA构建体的结构，例如，Yatim,N.等人，(2015)Science350:328-334或Orozco,S.等人，(2014)Cell Death Differ.21:1511-1521，该结构可以用于设计本文所示还用于激活NFkB信号传导的合适的RNA构建体(参见实施例)。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码人或小鼠RIPK1多肽的RIPK1氨基酸1-555、以及IZ结构域，诸如具有以SEQID NO:158(人)或SEQ ID NO:161(小鼠)示出的序列。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码人或小鼠RIPK1多肽的RIPK1氨基酸1-555、以及EE和DM结构域，诸如具有以SEQ ID NO:159(人)或SEQ ID NO:162(小鼠)示出的序列。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码人或小鼠RIPK1多肽的RIPK1氨基酸1-555、以及RR和DM结构域，诸如具有以SEQ ID NO:160(人)或SEQ ID NO:163(小鼠)示出的序列。编码上述RIPK1多肽的示例性核苷酸序列以SEQ IDNO:1403-1408和1474-1479示出。
在又一个实施方案中，激活NFκB信号传导的免疫增强剂mRNA构建体编码Btk多肽，诸如突变型Btk多肽，诸如Btk(E41K)多肽(例如，编码以SEQ ID NO:173示出的ORF氨基酸序列)。
在又一个实施方案中，激活NFκB信号传导的免疫增强剂mRNA构建体编码TAK1蛋白，诸如组成型活性TAK1。
在又一个实施方案中，激活NFκB信号传导的免疫增强剂mRNA构建体编码TAK-TAB1蛋白，诸如组成型活性TAK-TAB1。在一个实施方案中，免疫增强剂mRNA构建体编码人TAK-TAB1蛋白，诸如具有以SEQ ID NO:164示出的序列。编码SEQ ID NO:164的TAK-TAB1蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1411或SEQ ID NO:1482示出。
编码细胞内衔接蛋白的免疫增强剂mRNA
在一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为细胞内衔接蛋白。细胞内衔接子(也称为信号转导衔接蛋白)是在信号转导途径中作为主要蛋白的辅助物的蛋白质。衔接蛋白含有多种蛋白结合模块，用于将蛋白结合配偶体连接在一起并促进产生更大的信号传导复合物。这些蛋白质本身往往缺乏任何内在的酶活性，而是介导特定的蛋白质-蛋白质相互作用，从而驱动蛋白质复合物的形成。
在一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白刺激I型IFN应答。在另一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白刺激NFκB介导的促炎应答。
在一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白为STING蛋白，诸如STING多肽的组成型活性形式，包括突变型人STING同种型。STING已经在本领域中被确定为内质网衔接子，其促进先天免疫信号传导，并且已被证实用于激活NFkB介导的转录途径和IRF3/IRF7介导的转录途径这两者以诱导I型IFN的表达(参见例如Ishikawa,H.和Barber，G.H.(2008)Nature455:674-678)。例如，在通过双链DNA(例如，病毒DNA)激活cGAS和IFI16后，STING在激活TBK1的过程中(NFkB介导的转录和IRF3/IRF介导的转录的上游)充当衔接蛋白。编码STING的合适的mRNA构建体在上文的激活I型干扰素的免疫增强剂的章节中详细描述。
在另一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白为MAVS蛋白，诸如MAVS多肽的组成型活性形式，包括突变型人MAVS同种型。MAVS在本领域中也称为VISA(病毒诱导的信号传导衔接子)、IPS-1或Cardif。MAVS已经在本领域中被确定为在通过双链RNA(例如，双链RNA病毒)激活细胞质RNA解旋酶RIG-1和MDA5后，在激活TBK1的过程中(NFkB介导的转录和IRF3/IRF介导的转录的上游)充当细胞内衔接蛋白。编码MAVS的合适的mRNA构建体在上文的激活I型干扰素的免疫增强剂的小节中详细描述。
在另一个实施方案中，该细胞内衔接蛋白为MyD88蛋白，诸如MyD88多肽的组成型活性形式，包括突变型人MyD88同种型。MyD88已经在本领域中被确定为被TLR用于激活I型IFN应答和NFkB介导的促炎应答的细胞内衔接蛋白(参见例如O’Neill,L.A.等人，(2003)J.Endotoxin Res.9:55-59)。编码MyD88的合适的mRNA构建体在上文关于激活I型IFN应答的免疫增强剂的小节中详细描述。
编码细胞内信号传导蛋白的免疫增强剂mRNA
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为细胞内信号传导蛋白。如本文所用，“细胞内信号传导蛋白”是指参与信号转导途径并且通常具有酶活性(例如，激酶活性)的蛋白质。在一个实施方案中，该多肽是TLR信号传导途径的细胞内信号传导蛋白(即，该多肽是在TLR介导的信号传导的转导中起作用，但并非TLR本身的细胞内分子)。在一个实施方案中，该细胞内信号传导蛋白刺激I型IFN应答。在另一个实施方案中，该细胞内信号传导蛋白刺激NFκB介导的促炎应答。细胞内信号传导蛋白的非限制性实例包括MyD88、IRAK 1、IRAK2、IRAK4、TRAF3、TRAF6、TAK1、TAB2、TAB3、TAK-TAB1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、IKKα、IKKβ、TRAM、TRIF、RIPK1和TBK1。细胞内信号传导蛋白的具体实例描述于有关激活I型干扰素或激活NFκB信号传导的免疫增强剂的小节中。
编码转录因子的免疫增强剂mRNA
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为转录因子。转录因子含有至少一个序列特异性DNA结合结构域，并且起到调节一种或多种基因向mRNA转录的速率的作用。在一个实施方案中，该转录因子刺激I型IFN应答。在另一个实施方案中，该转录因子刺激NFκB介导的促炎应答。转录因子的非限制性实例包括IRF3或IRF7。IRF3构建体和IRF7构建体的具体实例描述于有关激活I型干扰素的免疫增强剂的小节中。
编码参与坏死性凋亡或坏死体形成的多肽的免疫增强剂mRNA
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成。如果蛋白质介导坏死性凋亡本身或与另外的分子一起参与介导坏死性凋亡和/或坏死体形成，则称多肽“参与”坏死性凋亡或坏死体形成。参与坏死性凋亡或坏死体形成的多肽的非限制性实例包括MLKL、RIPK1、RIPK3、DIABLO和FADD。
编码RIPK1的合适的mRNA构建体在上文的激活NFκB信号传导的免疫增强剂的章节中详细描述。
在一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)。MLKL构建体诱导坏死性细胞死亡，其特征在于释放DAMP。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码人或小鼠MLKL的氨基酸1-180。编码MLKL的mRNA构建体或其免疫原性细胞死亡诱导片段的非限制性实例编码人或小鼠MLKL的氨基酸1-180，它们分别包含以SEQID NO:1327和1328示出的氨基序列。编码具SEQ ID NO:1327的MLKL蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1412和SEQ ID NO:1483示出。
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码与其自身多聚化(同源寡聚化)的RIPK3多肽。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码与RIPK1二聚化的RIPK3多肽。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3的激酶结构域和RHIM结构域。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3的激酶结构域、RIPK3的RHIM结构域，以及两个FKBP(F>V)结构域。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3多肽(例如，包含RIPK3的激酶结构域和RHIM结构域)和IZ结构域(例如，IZ三聚体)。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3多肽(例如，包含RIPK3的激酶结构域和RHIM结构域)以及一个或多个EE结构域或RR结构域(例如，2xEE结构域，或2xRR结构域)。此外，编码诱导免疫原性细胞死亡的RIPK3构建体的DNA构建体的结构进一步描述于例如Yatim,N.等人，(2015)Science 350:328-334或Orozco,S.等人，(2014)Cell Death Differ.21:1511-1521中，并且可以用于设计合适的RNA构建体。编码RIPK3的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1329-1344和1379示出的任何氨基酸序列的ORF。编码SEQ ID NO:1339的RIPK3多肽的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1415和SEQ ID NO:1486示出。
在另一个实施方案中，免疫增强剂mRNA构建体编码具有低pI的直接IAP结合蛋白(DIABLO)(也称为SMAC/DIABLO)。如本文的实施例中所述，DIABLO构建体诱导细胞因子释放。在一个实施方案中，本公开提供了编码野生型人DIABLO同种型1序列的mRNA构建体，诸如具有以SEQ ID NO:165示出的序列(对应于本领域作为Genbank登录号NP_063940.1公开的含有239个氨基酸的人DIABLO同种型1前体)。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含S126L突变的人DIABLO同种型1序列，诸如具有以SEQ ID NO:166示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型1的氨基酸56-239，诸如具有以SEQ ID NO:167示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型1的氨基酸56-239并且包含S126L突变，诸如具有以SEQ ID NO:168示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型人DIABLO同种型3序列，诸如具有以SEQ ID NO:169示出的序列(对应于本领域作为Genbank登录号NP_001265271.1公开的含有195个氨基酸的人DIABLO同种型3)。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含S82L突变的人DIABLO同种型3序列，诸如具有以SEQ ID NO:170示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型3的氨基酸56-195，诸如具有以SEQ ID NO:171示出的序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型3的氨基酸56-195并且包含S82L突变，诸如具有以SEQ IDNO:172示出的序列。编码SEQ ID NO:169的DIABLO多肽的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1416和SEQ ID NO:1487示出。
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为FADD(具有死亡结构域的Fas相关蛋白)。编码FADD的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1345-1351示出的任何氨基酸序列的ORF。编码FADD蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1417-1422和1488-1493示出。
编码参与细胞焦亡或炎性体形成的多肽的免疫增强剂mRNA
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽参与细胞焦亡或炎性体形成。如果蛋白质介导细胞焦亡本身或与另外的分子一起参与介导细胞焦亡和/或炎性体形成，则称多肽“参与”细胞焦亡或炎性体形成。参与细胞焦亡或炎性体形成的多肽的非限制性实例包括半胱天冬酶1、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶11、GSDMD、NLRP3、Pyrin结构域和ASC/PYCARD。
在一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为半胱天冬酶1。在一个实施方案中，该半胱天冬酶1多肽为自激活的半胱天冬酶-1多肽(例如，编码以SEQ IDNO:175-178示出的任何ORF氨基酸序列)，其可以促进前IL1β和前IL18切割为它们各自的成熟形式。
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为半胱天冬酶-4或半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11。在各种实施方案中，半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11构建体可以编码(i)全长野生型半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11；(ii)全长半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11加上IZ结构域；(iii)N末端缺失的半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11加上IZ结构域；(iv)全长半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11加上DM结构域；或(v)N末端缺失的半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11加上DM结构域。N末端缺失形式的半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-11的实例含有氨基酸残基81-377。N末端缺失形式的半胱天冬酶-5的实例含有氨基酸残基137-434。编码半胱天冬酶-4的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1352-1356示出的任何氨基酸序列的ORF。编码半胱天冬酶-5的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1357-1361示出的任何氨基酸序列的ORF。编码半胱天冬酶-11的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1362-1366示出的任何氨基酸序列的ORF。
在一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为gasdermin D(GSDMD)。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型人GSDMD序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人GSDMD的氨基酸1-275。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人GSDMD的氨基酸276-484。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型小鼠GSDMD。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码小鼠GSDMD的氨基酸1-276。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码小鼠GSDMD的氨基酸277-487。编码GSDMD的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1367-1372示出的任何氨基酸序列的ORF。
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为NLRP3。编码NLRP3的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQ ID NO:1373或1374示出的ORF氨基酸序列。
在另一个实施方案中，由该免疫增强剂mRNA构建体编码的多肽为细胞凋亡相关斑点样蛋白，该蛋白含有CARD(ASC/PYCARD)或其片段，诸如结构域。在一个实施方案中，该多肽为Pyrin B30.2结构域。在另一个实施方案中，该多肽为包含V726A突变的Pyrin B30.2结构域。编码Pyrin B30.2结构域的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQ ID NO:1375或1376示出的ORF氨基酸序列。编码ASC的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQ ID NO:1377或1378示出的ORF氨基酸序列。
另外的免疫增强剂mRNA
本公开提供了另外的免疫增强剂mRNA构建体。在一些实施方案中，该免疫增强剂mRNA构建体编码SOC3多肽(例如，编码以SEQ ID NO:174示出的ORF氨基酸序列)。
在还有其他实施方案中，免疫增强剂mRNA构建体编码调控树突状细胞(DC)活性(诸如刺激DC的产生、活性或动员)的蛋白质。刺激DC动员的蛋白质的非限制性实例为FLT3。因此，在一个实施方案中，该免疫增强剂mRNA构建体编码FLT3蛋白。
除所述多肽编码序列之外，免疫增强剂mRNA构建体通常还包含如本文针对mRNA构建体所述的其他结构特性(例如，经修饰的核碱基、5’帽、5’UTR、3’UTR、一个或多个miR结合位点、多聚腺苷酸尾，如本文所述)。合适的mRNA构建体组分如本文所述。
包括mRNA的感兴趣抗原
本公开的免疫增强剂mRNA可以与期望增强针对其的免疫应答的任何类型的抗原结合使用，包括与编码至少一种感兴趣抗原的mRNA序列(在相同或单独的mRNA构建体上)一起使用，以增强针对感兴趣抗原(诸如肿瘤抗原或病原体抗原)的免疫应答。因此，本公开的免疫增强剂mRNA增强例如mRNA疫苗应答，从而充当遗传佐剂。在一个实施方案中，所述一种或多种感兴趣抗原是肿瘤抗原。在另一个实施方案中，所述一种或多种感兴趣抗原是病原体抗原。在各种实施方案中，所述一种或多种病原体抗原可以来自选自病毒、细菌、原生动物、真菌和寄生生物的病原体。
在一个实施方案中，该抗原是内源性抗原，诸如原位释放的肿瘤抗原或病原体抗原。作为替代，该抗原是外源性抗原。外源性抗原可以与该免疫增强剂mRNA构建体共同施用，或者作为替代，可以在该免疫增强剂mRNA构建体之前或之后施用。外源性抗原可以与免疫增强剂mRNA构建体共同配制，或者作为替代，可以与该免疫增强剂mRNA构建体分开配制。在一个实施方案中，外源性抗原由与编码该免疫增强剂的mRNA构建体相同或不同的mRNA构建体(例如，mmRNA构建体)编码。在其他实施方案中，该抗原可以是例如蛋白质、肽、糖蛋白、多糖或脂质。
在一个实施方案中，所述一种或多种感兴趣抗原是肿瘤抗原。在一个实施方案中，该肿瘤抗原包含肿瘤新表位，例如，来自肿瘤抗原的突变型肽。在一个实施方案中，该肿瘤抗原是Ras抗原。对癌症中的Ras突变的全面调查已经在本领域中有描述(Prior,I.A.等人，(2012)Cancer Res.72:2457-2467)。因此，包含至少一种与癌症相关联的突变的Ras氨基酸序列可以用作感兴趣抗原。在一个实施方案中，该肿瘤抗原是突变型KRAS抗原。突变型KRAS抗原一直与对某些治疗剂的获得性耐药性有关(参见例如Misale,S.等人，(2012)Nature486:532-536；Diaz,L.A.等人，(2012)Nature 486:537-540)。此外，本领域已经描述了包含至少一种突变型RAS肽和抗代谢物化学治疗剂的抗肿瘤疫苗(美国专利9,757,439，其全部内容以引用方式明确地并入本文)。因此，美国专利9,757,439中所述的任何突变型RAS肽可以(例如，与本公开的免疫增强剂结合)用作本公开的抗原，从而增强针对Ras肿瘤抗原的抗肿瘤免疫应答。
在一个实施方案中，突变型KRAS抗原包含具有选自G12D、G12V、G13D和G12C以及它们的组合的一个或多个突变的氨基酸序列。突变型KRAS抗原的非限制性实例包括包含以SEQ ID NO:95至106和131至132示出的氨基酸序列中的一种或多种的那些。在一个实施方案中，该突变型KRAS抗原是包含选自G12D、G12V、G13D和G12C的突变的一种或多种突变型KRAS 15聚体(15mer)肽，其非限制性实例以SEQ ID NO:95-97示出。在另一个实施方案中，该突变型KRAS抗原是包含选自G12D、G12V、G13D和G12C的突变的一种或多种突变型KRAS 25聚体肽，其非限制性实例以SEQ ID NO:98-100和131示出。在另一个实施方案中，该突变型KRAS抗原是包含选自G12D、G12V、G13D和G12C的突变的一种或多种突变型KRAS 3x15聚体肽(3个拷贝的该15聚体肽)，其非限制性实例以SEQ ID NO:101-103示出。在另一个实施方案中，该突变型KRAS抗原是包含选自G12D、G12V、G13D和G12C的突变的一种或多种突变型KRAS3x25聚体肽(3个拷贝的该25聚体肽)，其非限制性实例以SEQ ID NO:104-106和132示出。在另一个实施方案中，该突变型KRAS抗原是含有G12D、G12V、G13D和G12C这些突变的25聚体肽的100聚体多联体肽(即，SEQ ID NO:98、99、100和131的100聚体多联体)。因此，在一个实施方案中，该突变型KRAS抗原包含编码SEQ ID NO:98、99、100和131的mRNA构建体。突变型KRAS抗原、其氨基酸序列和编码这些抗原的mRNA序列的进一步描述公开于美国申请序列号62/453,465中，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。在一些实施方案中，该突变型KRAS抗原是由以SEQ ID NO:1321或1322示出的核苷酸序列编码的含有G12D、G12V、G13D和G12C这些突变的25聚体肽的100聚体多联体肽。
在一个实施方案中，肿瘤抗原由还包含免疫增强剂(即，还编码增强针对该肿瘤抗原的免疫应答的多肽)的mRNA构建体编码。此类构建体的非限制性实例包括编码以SEQ IDNO:107至130示出的氨基酸序列之一的KRAS-STING构建体。编码KRAS-STING构建体的核苷酸序列的非限制性实例以SEQ ID NO:220-223示出。
在又一个实施方案中，该肿瘤抗原是致癌病毒抗原。在一个实施方案中，该致癌病毒是人乳头瘤病毒(HPV)，并且所述一种或多种HPV抗原是E6抗原和/或E7抗原。HPV E6抗原的非限制性实例包括包含以SEQ ID NO:36至72示出的氨基酸序列的那些。HPV E7抗原的非限制性实例包括包含以SEQ ID NO:73至94示出的氨基酸序列的那些。在其他实施方案中，该HPV抗原是E1、E2、E4、E5、L1或L2蛋白，或者它们的抗原肽序列。合适的HPV抗原在PCT申请号PCT/US2016/058314中进一步描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。
在另一个实施方案中，该肿瘤抗原由mRNA癌症疫苗编码。合适的mRNA癌症疫苗在PCT申请号PCT/US2016/044918中详细描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。
在又一个实施方案中，该肿瘤抗原是内源性肿瘤抗原，诸如在原位破坏肿瘤细胞时释放的肿瘤抗原。本领域已经确定存在导致体内细胞死亡，从而引起细胞内组分释放的天然机制，使得可以刺激针对这些细胞内组分的免疫应答。此类机制在本文中称为免疫原性细胞死亡，包括坏死性凋亡和细胞焦亡。因此，在一个实施方案中，本公开的免疫增强剂mRNA构建体在发生内源性免疫原性细胞死亡的条件下施用于具有肿瘤的受试者，使得一种或多种内源性肿瘤抗原释放，从而增强针对这些肿瘤抗原的免疫应答。在一个实施方案中，将该免疫增强剂mRNA构建体连同编码“刽子手mRNA构建体”的第二mRNA构建体一起施用于具有肿瘤的受试者，该刽子手mRNA构建体刺激该受试者体内的肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡。刽子手mRNA构建体的实例包括编码MLKL、RIPK3、RIPK1、DIABLO、FADD、GSDMD、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-11、Pyrin、NLRP3和ASC/PYCARD的那些。刽子手mRNA构建体以及它们与免疫增强剂mRNA构建体组合的用途在美国申请序列号62/412,933中进一步详细描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。
在一个实施方案中，所述一种或多种感兴趣抗原是病原体抗原。在一个实施方案中，该病原体抗原包括病毒抗原。在一个实施方案中，该病毒抗原是人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一个实施方案中，该HPV抗原是E6或E7抗原。HPV E6抗原的非限制性实例包括包含以SEQ ID NO:36至72示出的氨基酸序列的那些。HPV E7抗原的非限制性实例包括包含以SEQID NO:73至94示出的氨基酸序列的那些。在其他实施方案中，该HPV抗原是E1、E2、E4、E5、L1或L2蛋白，或者它们的抗原肽序列。合适的HPV抗原在PCT申请号PCT/US2016/058314中进一步描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。在另一个实施方案中，该病毒抗原是单纯疱疹病毒(HSV)抗原，诸如HSV-1或HSV-2抗原。例如，该病毒抗原可以为HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白B、糖蛋白C、糖蛋白D、糖蛋白E、糖蛋白I、ICP4或ICP0抗原。合适的HSV抗原在PCT申请号PCT/US2016/058314中进一步描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。
在一个实施方案中，该病原体抗原是细菌抗原。在一个实施方案中，该细菌抗原是多价抗原(即，该抗原包含多个抗原表位，诸如包含不同表位的多个抗原肽)。在一个实施方案中，该细菌抗原是衣原体(Chlamydia)抗原，诸如MOMP、OmpA、OmpL、OmpF或OprF抗原。合适的衣原体抗原在PCT申请号PCT/US2016/058314中进一步描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。
在一个实施方案中，病原体抗原由还包含免疫增强剂(即，还编码增强针对该肿瘤抗原的免疫应答的多肽)的mRNA构建体编码。
除所述抗原编码序列之外，编码一种或多种感兴趣抗原的mRNA构建体典型地还包含如本文针对mRNA构建体所述的其他结构特性(例如，经修饰的核碱基、5’帽、5’UTR、3’UTR、一个或多个miR结合位点、多聚腺苷酸尾，如本文所述)。合适的mRNA构建体组分如本文所述。
致癌病毒(oncovirus)
在一个实施方案中，免疫增强剂构建体用于增强针对来自致癌病毒的一种或多种抗原的免疫应答。病毒感染是引起所有人类癌症中相当大一部分癌症的原因。据估计，全世界所有人类癌症中大约有12％的病因在于病毒(Parkin(2006)Int J Cancer 118:3030-3044)。术语“致癌病毒”是指具有能够引起癌症的DNA和/或RNA基因组的任何病毒，该术语可以与术语“肿瘤病毒”或“癌症病毒”同义地使用。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将七种人致癌病毒识别为“在人体中有足够的致癌性证据”的第1组生物致癌因素，包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、高危人乳头瘤病毒(HPV)、人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)、人免疫缺陷病毒(HIV)和卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)(Bouvard等人，(2009)Lancet Oncol10:321-322)。梅克尔细胞多瘤病毒(MCV)是最近发现的致癌病毒，其被IARC分类为第2A组生物致癌因素(Feng等人，(2008)Science319(5866):1096-1100)。
靶向病原性病毒(例如，脊髓灰质炎、流感)的疫苗的出色安全性记录、有效性和被经济弱势人群获得的能力已经促使人们努力开发和实施靶向致癌病毒的预防性和治疗性疫苗接种策略(Schiller和Lowy，(2010)Ann Rev Microbiol 64:23-41)。因此，在一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对致癌病毒的一种或多种感兴趣抗原的免疫应答。例如，来自致癌病毒的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对一种或多种致癌病毒抗原的免疫应答。致癌病毒、及其用于与免疫增强剂构建体组合使用以由此增强针对致癌病毒的免疫应答的合适抗原的非限制性实例在下文进一步描述。
A.人乳头瘤病毒(HPV)
在一个实施方案中，致癌病毒抗原来自人乳头瘤病毒(HPV)。宫颈癌是影响全世界女性的第四大流行恶性肿瘤(Wakeham和Kavanagh，(2014)Curr Oncol Rep 16(9):402)。感染人乳头瘤病毒(HPV)与几乎所有宫颈癌病例相关联，并且是造成其他几种癌症的原因，这些癌症包括：阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌(Forman等人，(2012)Vaccine第30卷增刊5:F12-23；Maxwell等人，(2016)Annu Rev Med67:91-101)。迄今为止，已经鉴定了300多种乳头瘤病毒并加以测序，包括超过200类HPV，这些HPV根据它们的致癌潜力进行分类。患上宫颈癌与感染“高危”HPV类型之间的关联是公认的，并为子宫颈筛查期间的HPV DNA检测和开发预防性疫苗提供了理论依据(Egawa等人，(2015)Viruses 7(7):3863-3890)。在高危HPV类型中，HPV16和HPV18是造成约70％宫颈癌病例的主要乳头瘤病毒类型(Walboomers等人，(1999)J Pathol 189(1):12-19；Clifford等人，(2002)Bri J Cancer 88:63-73)。
将HPV鉴定为宫颈癌和其他肛门与生殖器(orogenital)恶性肿瘤的致病因素提供了通过疫苗接种和靶向HPV感染的其他治疗策略来减轻由HPV相关癌症引起的发病率和死亡率的机会(zur Hausen(2002)Nat Rev Cancer 2(5):342-350)。存在靶向HPV病毒颗粒的主要衣壳蛋白L1的预防性HPV疫苗(Harper等人，(2010)Discov Med 10(50):7-17；Kash等人，(2015)J Clin Med 4(4):614-633)。这些疫苗已经防止未感染人群获得HPV感染，还已经防止先前感染的患者再次感染。然而，目前可用的HPV疫苗不能治疗、也不能清除已形成的HPV感染和HPV相关病变(Ma等人，(2012)Expert Opin Emerg Drugs 17(4):469-492)。治疗性HPV疫苗代表用于清除现有HPV感染和相关疾病的潜在治疗方法。与可以产生针对病毒颗粒的中和抗体的预防性HPV疫苗不同，治疗性HPV疫苗可以刺激细胞介导的免疫应答，以特异性靶向并杀死受感染的细胞。
虽然许多HPV感染仍无症状且被免疫系统清除，但可能发生持续的HPV感染，这可能进一步发展为低度或高度宫颈上皮内瘤形成和/或宫颈癌(Ostor(1993)Int J Gynecolpathol 12(2):186-192；Ghittoni等人，(2015)Ecancermedicalscience 9:526)。HPV病毒DNA在许多HPV相关病变和癌症中整合到宿主的基因组中。这种整合可能导致早期基因(E1、E2、E4和E5)和晚期基因(L1和L2)的缺失。在整合过程期间缺失L1和L2妨碍了使用针对HPV相关癌症的预防性疫苗。此外，E2是HPV致癌基因E6和E7的负调节物。在整合期间缺失E2导致E6和E7的表达增加，并且被认为促成HPV相关致瘤作用。致癌蛋白E6和E7是HPV相关恶性肿瘤的起始和维持所必需的，并且在转化细胞中表达。靶向E6和E7的治疗性HPV疫苗可以回避针对自身抗原的免疫耐受性问题，因为这些病毒编码的致癌蛋白是人体的外源蛋白。由于这些原因，HPV致癌蛋白E6和E7充当治疗性HPV疫苗的理想靶标。
因此，在一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣HPV抗原的免疫应答。例如，来自HPV的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和HPV抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该HPV抗原的免疫应答。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和HPV抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种HPV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对HPV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。在一些实施方案中，至少一种HPV抗原性多肽选自E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1和L2，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽选自E1、E2、E4、E5、E6和E7。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽是E6、E7，或E6和E7的组合。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽是L1、L2，或L1和L2的组合。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽是L1。在一些实施方案中，该L1蛋白获自HPV血清型6、11、16、18、31、33、35、39、30、45、51、52、56、58、59、68、73或82。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽是L1、L2或L1和L2的组合，以及E6、E7或E6和E7的组合。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽来自HPV病毒株HPV 16型(HPV16)、HPV 18型(HPV18)、HPV 26型(HPV26)、HPV 31型(HPV31)、HPV 33型(HPV33)、HPV 35型(HPV35)、HPV 45型(HPV45)、HPV 51型(HPV51)、HPV 52型(HPV52)、HPV 53型(HPV53)、HPV56型(HPV56)、HPV 58型(HPV58)、HPV 59型(HPV59)、HPV 66型(HPV66)、HPV 68型(HPV68)、HPV 82型(HPV82)，或它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽来自HPV病毒株HPV16、HPV18或它们的组合。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽来自HPV病毒株HPV 6型(HPV6)、HPV11型(HPV11)、HPV 13型(HPV13)、HPV 40型(HPV40)、HPV 42型(HPV42)、HPV 43型(HPV43)、HPV 44型(HPV44)、HPV 54型(HPV54)、HPV 61型(HPV61)、HPV 70型(HPV70)、HPV 72型(HPV72)、HPV 81型(HPV81)、HPV 89型(HPV89)，或它们的组合。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽来自HPV病毒株HPV 30型(HPV30)、HPV 34型(HPV34)、HPV 55型(HPV55)、HPV 62型(HPV62)、HPV 64型(HPV64)、HPV 67型(HPV67)、HPV 69型(HPV69)、HPV 71型(HPV71)、HPV 73型(HPV73)、HPV 74型(HPV74)、HPV83型(HPV83)、HPV 84型(HPV84)、HPV 85型(HPV85)，或它们的组合。
在一些实施方案中，疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码从HPV获得的E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1和L2蛋白中的至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种)或它们的组合的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码选自从HPV获得的E1、E2、E4、E5、E6和E7蛋白的至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)多肽或它们的组合的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码选自从HPV获得的E6和E7蛋白的至少一种多肽或它们的组合的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码选自从HPV获得的L1或L2蛋白的多肽或它们的组合的开放阅读框。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成HPV病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责HPV与被感染细胞结合的抗原性多肽。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的HPV感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染HPV或有感染HPV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HPV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗和/或预防由HPV感染引起和/或与HPV感染有因果关联的癌症的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于减轻HPV感染或由HPV感染引起的至少一种症状的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者体内的宫颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌或口咽癌的风险的方法。在这些方法中的每一者中，将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染HPV或有感染HPV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HPV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。
任选地，向需要预防和/或治疗HPV感染的药物的受试者提供药物：该药物包含免疫增强剂构建体和编码至少一种HPV多肽或其免疫原性片段的一种或多种免疫调节治疗性核酸，以产生针对HPV和/或感染HPV的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致HPV病毒滴度降低。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生对抗HPV抗体的中和。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对HPV感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
B.乙型肝炎病毒(HBV)
在另一个实施方案中，该致癌病毒抗原来自乙型肝炎病毒(HBV)。乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)的双链DNA病毒。HBV在感染类后引起乙型肝炎疾病。除了引起肝炎之外，感染HBV还可以导致发展肝硬化和肝细胞癌。因此，在另一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣的乙型肝炎病毒(HBV)抗原的免疫应答。例如，来自HBV的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和HBV抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该HBV抗原的免疫应答。
HBV基因组编码由字母S、C、P和X标出界线的四个重叠的开放阅读框(即，基因)(Ganem等人，(2001)Fields Virology第4版；Hollinger等人，(2001)Fields Virology第4版)。S基因编码病毒表面包膜蛋白HBsAg，并且可以在结构上和功能上划分为前S1区、前S2区和S区。有三种形式的HBsAG，即小(S)、中(M)和大(L)。核心基因或C基因具有前核心区和核心区。多个框内翻译起始密码子是S基因和C基因的特征，其产生相关、但功能上不同的蛋白质。C基因编码病毒核衣壳HBcAg或乙型肝炎e抗原(HBeAg)，这取决于翻译是分别从核心区还是前核心区起始的。核心蛋白自组装成衣壳样结构。前核心ORF编码信号肽，信号肽将翻译产物导向受感染细胞的内质网，在那里蛋白质被进一步加工形成分泌的HBeAg。HBeAg的功能在很大程度上未被表征，但它一直与免疫耐受有关，其功能是促进持续感染(Milich和Liang，(2003)Hepatology 38:1075-1086。聚合酶(pol)是含大约800个氨基酸的大蛋白质，并且是由P ORF编码的。Pol在功能上划分为三个结构域：末端蛋白质结构域，其涉及衣壳化和负链合成的引发；逆转录酶(RT)结构域，其催化基因组合成；以及核糖核酸酶H结构域，其降解前基因组RNA并促进复制。HBV X ORF编码具有多种功能的16.5-kd蛋白(HBxAg)，这些功能包括信号转导、转录激活、DNA修复和抑制蛋白质降解(Cross等人，(1993)ProcNatl Acad Sci USA 90:8078-8082；Bouchard和Schneider(2004)J Virol 78:12725-12734)。这种活动的机制和HBxAg在病毒生命周期中的生物学功能仍然所知甚少。然而，已公认的是HBxAg对于体内的生产性HBV感染是必需的，并且可能有助于HBV的致癌潜力(Liang(2009)Hepatology 49(增刊S5):S13-S21)。
尽管有效的预防性疫苗可供使用，但仍有超过2.4亿人长期感染HBV，并且每年有超过50万人死于慢性感染所致的肝脏疾病(世界卫生组织(2015)乙型肝炎情况说明书FS204)。目前可用于HBV感染的治疗选择包括核苷(酸)类似物和α干扰素(IFN-α)。然而，这些治疗有一些局限性。核苷(酸)类似物有效阻抑病毒复制，但不能消除感染。一旦停止用核苷(酸)类似物治疗，病毒就会在受感染的人体内迅速反弹。此外，用抗病毒剂长期治疗可能导致产生耐药突变病毒。与核苷(酸)类似物相比，具有抗病毒和免疫调节这两种活性的IFN-α可以在一些患者体内产生更持久的结果。然而，IFN-α治疗通常与副作用的高发生率相关联，这使其成为次优的治疗选择。因此，有必要设计针对HBV相关感染和疾病的新型有效治疗(Reynolds等人，(2015)J Virol 89(20):10407-10415)。
典型地通过检测病毒抗原和/或针对这些抗原的抗体来监测HBV感染及其治疗。在感染HBV后，第一种可检测的抗原是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，之后是乙型肝炎“e”抗原(HBeAg)。血清中出现针对HBsAg和/或针对核心抗原(HBcAg)的IgG抗体表明该病毒被清除，也称为血清转化。大量研究表明，CD4+辅助细胞(TR)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的HBV特异性细胞免疫直接和间接地影响受HBV感染个体体内的病毒复制、病毒血症水平和向慢性状态的发展。与清除急性感染的患者相比，发展为慢性疾病的患者倾向于缺乏HBV特异性T细胞应答，具有较弱的或狭窄聚焦的HBV特异性T细胞应答(参见例如Chisari,1997,JClin Invest 99:1472-1477；Maini等人，1999,Gastroenterology 117:1386-1396；Rehermann等人，2005,Nat Rev Immunol 2005；5:215-229；Thimme等人，2001,J Virol 75:3984-3987；Urbani等人，2002,J Virol 76:12423-12434；Wieland和Chisari，2005,JVirol 79:9369-9380；Webster等人，2000,Hepatology 32:1117-1124；Penna等人，1996,JClin Invest 98:1185-1194；Sprengers等人，2006,J Hepatol 2006；45:182-189。)
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和HBV抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种HBV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对HBV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。在一些实施方案中，至少一种HBV抗原性多肽选自HBsAg(S、M或L)、HBcAg、HBeAg、HBxAg、Pol，以及它们的组合。
基于跨测序基因组的组间趋异，HBV已经在系统发育上被分为9种基因型，从A至I，并且具有从单个个体分离的推定的第10种基因型J。这些HBV基因型进一步被分为至少35种基因亚型。基因型差异影响疾病严重程度、疾病进程和并发症的可能性，对治疗的应答和可能对疫苗接种的应答(Kramvis等人，(2005),Vaccine 23(19):2409-2423；Magnius和Norder，(1995),Intervirology 38(1-2):24-34)。
HBV基因型A被进一步分为基因亚型A1、A2、A4和准基因亚型A3，后一组序列不符合基因亚型分类的标准。HBV基因型B被进一步分为6种基因亚型B1、B2、B4至B6，和准基因亚型B3。HBV基因型C是最古老的HBV基因型，被进一步分为16种基因亚型C1至C16，反映了人群中长期的地方性流行病。HBV基因型D被进一步分为6种基因亚型D1至D6。HBV基因型F被进一步分为4种基因亚型F1至F4。基因型I被进一步分为2种基因亚型I1和I2。此外，基于HBV的包膜蛋白上存在的抗原表位，HBV已经通过血清学被分为4种主要血清型adr、adw、ayr和ayw(Kramvis(2014)Intervirology 57:141-150)。
在一些实施方案中，所述至少一种HBV抗原性多肽来自HBV基因型A(例如，基因亚型A1至A4中的任一种)、HBV基因型B(例如，基因亚型B1至B6中的任一种)、HBV基因型C(例如，基因亚型C1至C16中的任一种)、HBV基因型D(例如，基因亚型D1至D6中的任一种)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，基因亚型F1至F4中的任一种)、HBV基因型G或HBV基因型I(例如，基因亚型I1至I2中的任一种)。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的HBV感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染HBV或有感染HBV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HBV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗和/或预防由HBV感染引起和/或与HBV感染有因果关联的癌症的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于减轻HBV感染或由HBV感染引起的至少一种症状的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于减轻受试者体内的肝损伤的方法。在这些方法中的每一者中，将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染HBV或有感染HBV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HBV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。
任选地，向需要预防和/或治疗HBV感染的药物的受试者提供药物：该药物包含免疫增强剂构建体和编码至少一种HBV多肽或其免疫原性片段的一种或多种免疫调节治疗性核酸，以产生针对HBV和/或感染HBV的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致HBV病毒滴度降低。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生对抗HBV抗体的中和。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对HBV感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
在一些实施方案中，免疫调节治疗性核酸(例如，信使RNA、mRNA)包含至少一种具有编码至少一种HBV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对HBV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框的多核苷酸(例如，mRNA)。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自HBsAg、HBcAg、HBeAg、HBxAg或Pol。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自临时的和/或确认的HBV基因型和/或基因亚型。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自临时的或未分配的HBV基因型或基因亚型。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成HBV病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责HBV病毒与被感染细胞结合的抗原性多肽。
C.丙型肝炎病毒(HCV)
在另一个实施方案中，该致癌病毒抗原来自丙型肝炎病毒(HCV)。丙型肝炎病毒(HCV)是引起丙型肝炎的一种小的、有包膜的正义单链RNA病毒，其中丙型肝炎是主要影响肝脏的一种病毒感染疾病。因此，在另一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣的丙型肝炎病毒(HCV)抗原的免疫应答。例如，来自HCV的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和HCV抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该HCV抗原的免疫应答。
HCV的RNA基因组编码含有3010个氨基酸的大型多蛋白，该大型多蛋白由细胞和病毒编码的蛋白酶和肽酶共翻译加工和翻译后加工产生成熟的结构蛋白和非结构(NS)蛋白。这些HCV结构蛋白包括核心(作为替代，C或p22)和两个包膜糖蛋白E1和E2(作为替代，分别为gp35和gp70)。这些非结构(NS)蛋白包括NS1(作为替代，p7)、NS2(作为替代，p23)、NS3(作为替代，p70)、NS4A(作为替代，p8)、NS4B(作为替代，p27)、NS5A(作为替代，p56/58)和NS5B(作为替代，p68)(Ashfaq等人，(2011)Virol J 8:161)。
基于整个病毒基因组的系统发育分析和序列分析，HCV变体目前被分为7种独立的基因型和超过80种确认亚型和临时亚型(Smith等人，(2014)Hepatology 59(1):318-327)。国际病毒分类委员会(ICTV)维护并定期更新参考分离株、确认亚型和临时亚型、未分配的HCV分离株、登录号和注释比对的表格(http://talk.ictvonline.org/links/hcv/hcv-classification.htm)。HCV亚型1a、1b、2a和3a被认为是“流行亚型”，在全球范围内分布，并且在高收入国家中占HCV感染的很大比例。这些亚型在发现HCV传播之前的几年中，被认为经由感染的血液、血液制品、静脉内用药和其他途径迅速扩散(Smith等人，(2005)J GenVirol 78(Pt2):321-328；Pybus等人，(2005)Infect Genet Evol 5:131-139；Magiorkinis等人，(2009)PLoS Med 6:e1000198)。其他HCV亚型被认为是“地方性”病毒株，相对稀少，并且在局限性更强的区域中长时间循环。来自基因型1和2的地方性病毒株主要定位于西非，来自基因型3的地方性病毒株主要定位于南亚，来自基因型4的地方性病毒株主要定位于中非和中东，来自基因型5的地方性病毒株主要定位于南非，来自基因型6的地方性病毒株主要定位于东南亚(Simmonds(2001)J Gen Virol 82:693:712；Pybus等人，(2009)J Virol83:1071-1082)。迄今为止，仅报道了一种基因型7感染(Murphy等人，(2007)J ClinMicrobiol 45:1102-1112)。
尽管已经证实黑猩猩易受实验感染的影响，但HCV天然地仅感染人(Pfaender等人，(2014)Emerg Microbes Infect 3:e21)。HCV造成的慢性病毒感染是肝硬化、肝脏疾病、门静脉高压症、肝功能恶化和癌症(例如，肝细胞癌、HCC)的主要原因(Webster等人，(2015)Lancet 385(9973):1124-1135)。全世界估计有超过1.6至1.7亿人患有丙型肝炎，这最终导致每年大约35万人死亡(Zaltron等人，(2012)BMC Infect Dis 12(Suppl 2):S2；Lavanchy(2011)Clin Microbiol Infect 17:107-115)。在全球范围内，所有肝硬化病例和HCC病例中的大约四分之一归因于HCV感染。然而，在高度流行的地区，HCV在HCC病例和肝硬化病例中所占的比例通常大于50％(Perz等人，(2006)J Hepatol 45(4):529-538)。与一般人群相比，慢性感染的人的生活质量下降(Bezemer等人，(2012)BMC Gastroenterol 12:11)。
在实施全面筛查之前，输血和输注血液制品以前是HCV传播的主要途径(Zou等人，(2010)Transfusion 50(7):1495-1504)。经由静脉内用药经皮传播现在是发达国家的主要传播途径(Cornberg等人，(2011)Liver Int 31(Suppl 2):30-60；Nelson等人，(2011)Lancet 378(9791:571-583)。诸如针头和注射器交换计划(NSP)和鸦片制剂替代疗法(OST)等社会服务可以有效减少注射吸毒者(PWID)之间的HCV传播，但这些方法可能不足以将HCV的流行率降低到较低水平(Turner等人，(2011)Addiction 106(11)1978-1988；Vikermann等人，(2012)Addiction 107(11):1984-1995)。最近，已经开发出高效的直接作用抗病毒疗法(DAA)并将其用于治疗HCV感染(例如，博赛泼维(boceprevir)、特拉匹韦(telaprevir)、司美匹韦(simeprevir)、索非布韦(sofosbuvir)、雷迪帕韦(ledipasvir)、奥比他韦(ombitasvir)、帕利瑞韦(paritaprevir)、利托那韦(ritonavir)、达萨布韦(dasabuvir)、达卡他韦(daclatasvir)、艾尔巴韦(elbasvir)、格佐匹韦(grazoprevir)、维帕他韦(velpatasvir))。由于DAA可以在许多患者体内导致持续的病毒学应答(SVR，作为替代称为“病毒治愈”)，所以这些药物证明有潜力成为治疗作为预防方法来降低HCV流行率(Smith-Palmer等人，(2015)BMC Infect Dis 15:19)。然而，关于这些治疗的高财务成本和付款人报销决定方面的难题目前限制了这些治疗的广泛使用(Martin等人，(2011)J Hepatol 54(6):1137-1144；Martin等人，(2012)Hepatology 55(1):49-57；Brennan和Shrank(2014)JAMA 312(6):593-594)。
HCV疫苗接种是降低HCV流行率的替代性治疗和/或预防策略。在实验感染的黑猩猩中进行的早期HCV疫苗研究发现，由病毒包膜糖蛋白E1(gp35)和E2(gp72)组成的亚单位疫苗引发了高功效体液应答，该应答有效控制了同源HCV基因型1a病毒并促进该病毒清除(Choo等人，(1994)Proc Nat Acad Sci USA 91(4):1294-1298)。在人中进行的I期研究证明，包含糖蛋白E1和E2的疫苗引发了广泛反应性的中和抗体(Law等人，(2013)PLoS ONE 8(3):e59776)。设计用于产生针对HCV的T细胞应答的替代性疫苗接种方法也已经在人1期研究中进行了测试，并被证实具有高度免疫原性(Barnes等人，(2012)Sci Trans Med 4(115):115ra1)。这些研究已经证明，体液、抗体介导的免疫应答和/或适应性T细胞介导的应答都是用于开发预防性和/或治疗性HCV疫苗的有前景的方法。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和HCV抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种HCV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对HCV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。在一些实施方案中，至少一种HCV抗原性多肽选自核心(C,p22)、E1(gp35)、E2(gp70)、NS1(p7)、NS2(p23)、NS3(p70)、NS4A(p8)、NS4B(p27)、NS5A(p56/58)、NS5B(p68)，以及它们的组合。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的HCV感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染HCV或有感染HCV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HCV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。任选地，向需要预防和/或治疗HCV感染的药物的受试者提供药物：该药物包含一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HCV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，以产生针对HCV和/或感染HCV的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致HCV病毒滴度降低和/或持续病毒学应答的建立。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生对抗HCV抗体的中和。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对HCV感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
在一些实施方案中，免疫调节治疗性核酸(例如，信使RNA、mRNA)包含至少一种具有编码至少一种HCV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对HCV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框的多核苷酸(例如，mRNA)。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自核心(C,p22)、E1(gp35)、E2(gp70)、NS1(p7)、NS2(p23)、NS3(p70)、NS4A(p8)、NS4B(p27)、NS5A(p56/58)、NS5B(p68)，以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自确认的HCV基因型和/或亚型1、1a、1b、1c、1d、1e、1g、1h、1i、1j、1k、1l、1m、1n、2、2a、2b、2c、2d、2e、2f、2i、2j、2k、2l、2m、2q、2r、2t、2u、3、3a、3b、3d、3e、3g、3h、3i、3k、4、4a、4b、4c、4d、4f、4g、4k、4l、4m、4n、4o、4p、4q、4r、4s、4t、4v、4w、5、5a、6、6a、6b、6c、6d、6e、6f、6g、6h、6i、6j、6k、6l、6m、6n、6o、6p、6q、6r、6s、6t、6u、6v、6w、6xa、6xb、6xc、6xd、6xe、7或7a。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自临时HCV基因型和/或亚型1f、2g、2h、2n、2o、2p、2s、3c、3f、4e、4h、4i或4j。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自临时的或未分配的HCV分离株。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成HCV病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责HCV与被感染细胞结合的抗原性多肽。
D.埃-巴二氏病毒(EBV)
在另一个实施方案中，该致癌病毒抗原来自埃-巴二氏病毒(EBV)。埃-巴二氏病毒(EBV)，作为替代人疱疹病毒4(HHV-4)，是传染性单核细胞增多症的致病因素，并且与大量的良性疾病和恶性疾病相关联，这些疾病包括几种人癌症(例如，霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、乳腺癌、肝细胞癌、胃部/胃癌、移植后淋巴细胞增生性疾病(PTLD)、中枢神经系统淋巴瘤(CNS)、鼻咽癌、多发性硬化症、EBV相关淋巴瘤、口腔毛状白斑、弥漫型B大细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤)(Jha等人，(2016)Front Microbiol 7(1602)，以及其中的参考文献)。EBV是一种极其普遍的病毒，感染全世界超过95％的成年人群(Cohen(2000)N Engl J Med 343:481-492)。因此，在另一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣的埃-巴二氏病毒(EBV)抗原的免疫应答。例如，来自EBV的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和EBV抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该EBV抗原的免疫应答。
EBV基因组是线性双链DNA(dsDNA)分子，长度为大约172kb。EBV基因组具有编码大约80种病毒蛋白的潜力，这些病毒蛋白中的许多蛋白的功能仍未被表征。被表征的EBV基因(包括其对应的基因产物和提出的功能(如果已知的话))包括BKRF1(EBNA1)[质粒维持、DNA复制、转录调节]、BYRF1(EBNA2)[反式激活]、BLRF3/BERF1(EBNA3A，作为替代EBNA3)[转录调节]、BERF2a/b(EBNA3B，作为替代EBNA4)、BERF3/4(EBNA3C，作为替代EBNA6)[转录调节]、BWRF1(EBNA-LP，作为替代EBNA5)[反式激活]、BNLF1(LMP1)[B细胞存活、抗细胞凋亡]、BNRF1(LMP2A/B，作为替代TP1/2)[维持潜伏期]、BARF0(A73，RPMS1)、EBER1/2(小RNA)[调节先天免疫]、BZLF1(ZEBRA/Zta/EB1)[反式激活，引发裂解周期]、BRLF1[反式激活，引发裂解周期]、BILF4[反式激活，引发裂解周期]、BMRF1[反式激活]、BALF2[DNA结合]、BALF5[DNA聚合酶]、BORF2[核糖核苷酸还原酶亚单位]、BARF1[核糖核苷酸还原酶亚单位]、BXLF1[胸苷激酶]、BGLF5[碱性外切核酸酶]、BSLF1[引物酶]、BBLF4[解旋酶]、BKRF3[尿嘧啶DNA糖基化酶]、BLLF1(gp350/220)[主要包膜糖蛋白]、BXLF2(gp85，作为替代gH)[病毒-宿主包膜融合]、BKRF2(gp25，作为替代gL)[病毒-宿主包膜融合]、BZLF2(gp42)[病毒-宿主包膜融合，结合MHC II类]、BALF4(gp110，作为替代gB)、BDLF3(gp100-150)、BILF2(gp55-78)、BCRF1[病毒白介素-10]和BHRF1[病毒bcl-2类似物](Liebowitz和Kieff(1993)Epstein-Barrvirus.In:The Human Herpesvirus.Roizman B、Whitley RJ、Lopez C编辑，New York，第107–172页；Li等人，(1995)J Virol 69:3987-3994；Nolan和Morgan，(1995)J Gen Virol76:1381-1392；Thompson和Kurzrock，(2004)Clin Cancer Res 10:803-821；Young和Murray(2003)Oncogene22:5108-5121)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和EBV抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种EBV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对EBV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。任何前述EBV蛋白均可以用作抗原性EBV多肽。免疫原性EBV蛋白及其表位已经在本领域中描述(例如，Rajcani J.等人，(2014)RecentPat.Antiinfect.Drug Discover.9:62-76)。在某些实施方案中，该抗原性EBV多肽选自BLLF1(gp350/220)、BZLF1/Zta、EBNA2、EBNA3、EBNA6、LMP1、LMP2A，以及它们的组合。
已知感染人的EBV类型主要有两种：EBV-1和EBV-2(作为替代，分别称为A型和B型，或者分别称为B95-8病毒株和AG876病毒株)。这两种EBV类型在编码EBV核抗原EBNA-2、EBNA-3A/3、EBNA-3B/4和EBNA-3C/6的基因的序列上有所不同(Sample等人，(1990)J Virol64:4084-4092；Dambaugh等人，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:7632-7636)。在两种主要的EBV类型中，在从临床样品分离的EBV中观察到广泛的病毒株多样性，这种多样性可能在疾病类型和严重程度方面起作用。第一个完整的EBV基因组序列B95-8在1984年公布(Baer等人，(1984)Nature 310:207-211)。已经报道了另外22种EBV的基因组序列(AG876、GD1、GD2、HKNPC1、Akata、Mutu、C666-1、M81、Raji、K4123-Mi和K4413-Mi)，以及来源于鼻咽癌临床样品的8种EBV序列和来源于1000基因组项目的三个EBV基因组的基因组序列(Tsai等人，(2013)Cell Rep 5:458-470；Dolan等人，(2006)Virology 350-164-170；Palser等人，(2015)J Virol89(10):5222-5237，以及其中的参考文献)。最近的一份报告分析了71种新的EBV基因组(包括直接从唾液测序的第一种EBV基因组)的基因组序列。将这些新的EBV基因组序列与先前公布的12种病毒株组合加以分析。该分析揭示，已建立的EBV基因组的基因图谱(NC_007605)代表了来自不同地理位置和来自不同类型感染的EBV分离株。本研究中重新检查了公认的EBV 1型和2型分类，发现该分类仍然是主要变化形式，最主要通过EBNA2和EBNA3A、-B和-C中的变化来解释(Palser等人，(2015)J Virol 89(10):5222-5237)。
在一些实施方案中，所述至少一种EBV抗原性多肽来自EBV-1或EBV-2。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的EBV感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染EBV或有感染EBV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种EBV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。任选地，向需要预防和/或治疗EBV感染的药物的受试者提供药物：该药物包含一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种EBV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，以产生针对EBV和/或感染EBV的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致EBV病毒滴度降低和/或持续病毒学应答的建立。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生中和抗EBV抗体。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对EBV感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成EBV病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责EBV与被感染细胞结合的抗原性多肽。
E.人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)
在另一个实施方案中，该致癌病毒抗原来自人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)。人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1，作为替代人T嗜淋巴细胞病毒或人T细胞白血病-淋巴瘤病毒)是一种能够在人体内建立持续感染的逆转录病毒。HTLV-1感染了全世界估计1000万至2000万人，而大多数人感染无症状，3％至5％的感染个体发展成高度恶性和难治性的成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)(Gessain等人，(2012)Front Microbiol 3:388；Taylor等人，(2005)Oncogene24:6047-6057)。HTLV感染还与几种炎症病症和免疫介导病症有因果关联，最突出的是HTLV相关脊髓病变/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)。大约0.25％至3.8％的HTLV-1感染人群发展为HAM/TSP(Yamano和Sato，(2012)Front Microbiol 3:389)。HTLV-1的人间传播需要经由母乳喂养、性交、输注含有细胞的血液成分以及共用针头和/或注射器(例如，静脉内用药)来转移病毒感染的细胞。因此，在另一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣的人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)抗原的免疫应答。例如，来自HTLV-1的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和HTLV-1抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该HTLV-1抗原的免疫应答。
HTLV-1是复杂的逆转录病毒；除了所有逆转录病毒科共有的结构蛋白和酶的标准清单(gag、pol、pro和env)之外，HTLV-1基因组的3’区(作为替代称为pX区)编码辅助基因tax、rex、p12、p21、p13、p30和HBZ。Tax和HBZ在ATL的致癌过程中是必不可少的(Giam和Semmes(2016)Viruses 8(6):161)。与其他逆转录病毒相似，在传播之后，病毒逆转录酶由基因组病毒RNA产生前病毒DNA。前病毒通过病毒整合酶整合到宿主基因组中。之后，HTLV-1感染被认为仅通过分裂细胞扩散，颗粒产量极小。前病毒的定量反映了HTLV-1感染细胞的数量，该数量限定了前病毒载量(Concalves等人，(2010)Clin Microbiol Rev 23(3):577-589)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和HTLV-1抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种HTLV-1抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对HTLV-1的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。在某些实施方案中，该抗原性HTLV-1多肽选自gag、pol、pro、env、tax、rex、p12、p21、p13、p30、HBZ，以及它们的组合。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的HTLV-1感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染HTLV-1或有感染HTLV-1的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HTLV-1多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。任选地，向需要预防和/或治疗HTLV-1感染的药物的受试者提供药物：该药物包含一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种HTLV-1多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，以产生针对HTLV-1和/或感染HTLV-1的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致HTLV-1病毒滴度降低和/或持续病毒学应答的建立。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生中和抗HTLV-1抗体。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对HTLV-1感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成HTLV-1病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责HTLV-1与被感染细胞结合的抗原性多肽。
F.卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)
在另一个实施方案中，该致癌病毒抗原来自卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)。卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV；作为替代，人疱疹病毒-8、HHV-8)是属于疱疹病毒科(Herpesviridae)内的猴病毒属(Rhadinovirus)的双链DNAγ-疱疹病毒。KSHV是所有形式的卡波西氏肉瘤(AIDS患者体内经常出现的癌症)的致病因素，与下列疾病有因果关联：原发渗出性淋巴瘤(PEL；作为替代基于体腔的淋巴瘤，BCBL)、某些类型的多中心卡斯尔曼病(multicentric Castleman’s disease)(MCD；作为替代多中心卡斯尔曼病(MCD)-相关的浆母细胞性淋巴瘤)和KSHV炎性细胞因子综合征(KICS)(Chang等人，(1994)Science 266:1865-1869；Dupin等人，(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96:4546-4551；Boshoff和Weiss，(2002)Nat Rev Cancer 2(5):373-382；Yarchoan等人，(2005)Nat Clin Pract Oncol 2(8):406-415；Cesarman等人，(1995)N Engl J Med 332(18):1186-1191；Staudt等人，(2004)Cancer Res 64(14):4790-4799；Soulier等人，(1995)Blood 86:1276-1280；Uldrick等人，(2010)Clin Infect Dis 51:350-358))。因此，在另一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣的卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)抗原的免疫应答。例如，来自KSHV的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和KSHV抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该KSHV抗原的免疫应答。
该KSHV基因组包含大约165kb的dsDNA分子，并且跨病毒株和分离株表现出高度的序列同一性。位于该病毒基因组的末端的两个主要基因区K1/VIP(由KSHV基因组的5′末端编码的基于可变免疫受体酪氨酸的激活基序蛋白)和K15/LAMP(由KSHV基因组的3′末端编码的潜伏相关膜蛋白)与中心基因组区相比具有高度可变性(Zong等人，(1999)J Virol73:4156-4170；Poole等人，(1999)73:6646-6660)。
K1基因的序列可变性导致确定了五种主要KSHV亚型(A、B、C、D和E)，从而在跨病毒株的氨基酸水平上显示出高达35％的可变性。K15基因的序列分析导致KSHV序列的额外分类，变体被指定为P、M或N等位基因，在氨基酸水平上相差高达70％(Hayward和Zong，(2007)Curr Top Microbiol Immunol 312:1-42)。其他9个病毒基因组基因座(大约为该基因组的5.6％)在该KSHV基因组的更保守的中心区之内含有额外的可变性(T0.7/K12、K2、K3、ORF18/19、ORF26、K8、ORF73)，以及ORF75基因区内的两个基因座。基于K1/K15可变性、病毒株分类和9种ORF的可变性，已知的KSHV基因组目前被分为12种主要基因型(Strahan等人，(2016)Viruses 8(4):92)。
基本上所有卡波西氏肉瘤病例都携带KSHV，并且持续存在KSHV是肿瘤发生所必需的。该KSHV基因组具有编码大约90种蛋白质的潜力，已知这些蛋白质中有许多用于介导病毒复制、病毒-宿主相互作用、肿瘤发生，以及免疫阻抑和逃避(Dittmer和Damania，(2013)Curr Opin Virol 3:238-244)，它们可以被认为是潜在的治疗靶标。被表征的KSHV基因(包括其对应的基因产物和/或提出的功能(如果已知的话))包括ORFK1(糖蛋白；KSHV ITAM信号传导蛋白，KIS)、ORF4(卡波西补体对照蛋白，KCP；kaposica)、ORF6(ssDNA结合蛋白)、ORF11(dUTPase相关蛋白，DURP)、ORFK2(病毒白介素6同源物，vIL6)、ORF70(胸苷酸合酶)、ORFK4(vCCL-2、vMIP-II、MIP-1b)、ORFK4.1(vCCL-3、vMIP-III、BCK)、ORFK5(免疫应答调节物2，MIR-2；E3泛素连接酶)、ORFK6(vCCL-1、vMIP-I、MIP-1a)、PAN(晚期基因表达)、ORF16(vBCL2，Bcl2同源物)、ORF17.5(支架或装配蛋白，SCAF)、ORF18(晚期基因调节)、ORF34(与HIF-1α结合)、ORF35(有效裂解病毒再激活所必需的)、ORF36(病毒丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、ORF37(sox)、ORF38(被膜蛋白)、ORF39(糖蛋白M，gM)、ORF45(被膜蛋白；RSK激活剂)、ORF46(尿嘧啶去糖基化酶)、ORF47(糖蛋白L，gL)、ORF50(RTA)、ORFK8(k-bZIP；复制相关蛋白，RAP)、ORF57(mRNA输出/剪接)、ORF58、ORF59(持续合成因子)、ORF60(核糖核蛋白还原酶)、ORF61(核糖核蛋白还原酶)、ORFK12(kaposin)、ORF71(vFLIP，ORFK13)、ORF72(vCyclin,vCYC)、ORF73(潜伏相关核抗原1，LANA1)、ORF8(糖蛋白B，gB)、ORF9(DNA聚合酶)、ORF10(干扰素功能调节物)、ORFK3(免疫应答调节物1，MIR-1；E3泛素连接酶)、K5/6-AS、ORF17(蛋白酶)、ORF21(胸苷激酶)、ORF22(糖蛋白H，gH)、ORF23(预测糖蛋白)、ORF24(复制所必需的)、ORF25(主要衣壳蛋白，MCP)、ORF26(次要衣壳蛋白；三链体组分2，TRI-2)、ORF27(糖蛋白)、ORF28(BDLF3 EBV同源物)、ORF29(包装蛋白)、ORF30(晚期基因调节)、ORF31(核与细胞质)、ORF32(被膜蛋白)、ORF33(被膜蛋白)、ORF40/41(解旋酶-引物酶)、ORF42(被膜蛋白)、ORF43(门户衣壳蛋白)、ORF44(解旋酶)、ORF45.1、ORFK8.1A(糖蛋白，gp8.1A)、ORFK8.1B(糖蛋白gp8.1B，ORF52(被膜蛋白)、ORF53(糖蛋白N，gN)、ORF54(dUTPase/免疫调节)、ORF55(被膜蛋白)、ORF56(DNA复制)、ORFK9(vIRF1)、ORFK10(vIRF4)、ORFK10.5(vIRF3，LANA2)、ORFK11(vIRF2)、ORF62(三链体组分1，TRI-1)、ORF65(小衣壳蛋白；小壳粒相互作用蛋白，SCIP)、ORF66(衣壳)、ORF67(核出口复合物)、ORF67.5、ORF68(糖蛋白)、ORF69(BRLF2核出口)、ORFK14(vOX2)、ORF74(vGPCR)、ORF75(FGARAT)、ORF2(二氢叶酸还原酶)、ORF7(毒粒蛋白，vGPCR)、ORF48、ORF49(激活JNK/p38)、ORF63(NLR同源物)、ORF64(去泛素化酶)、ORFK15(LMP1/2)和ORFK7(细胞凋亡病毒抑制剂，vIAP)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和KSHV抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种KSHV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对KSHV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。任何前述KSHV蛋白均可以用作抗原性KSHV多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种KSHV抗原性多肽来自KSHV亚型A、KSHV亚型B、KSHV亚型C、KSHV亚型D或KSHV亚型E。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的KSHV感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染KSHV或有感染KSHV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种KSHV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。任选地，向需要预防和/或治疗KSHV感染的药物的受试者提供药物：该药物包含一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种KSHV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，以产生针对KSHV和/或感染KSHV的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致KSHV病毒滴度降低和/或持续病毒学应答的建立。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生中和抗KSHV抗体。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对KSHV感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成KSHV病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责KSHV与被感染细胞结合的抗原性多肽。
G.梅克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)
在另一个实施方案中，该致癌病毒抗原来自梅克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)。梅克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)是多瘤病毒科(Polyomaviridae)的无包膜双链DNA病毒，是梅克尔细胞癌(MCC)的致病因素。MCC是一种罕见但具有攻击性的皮肤癌形式，与高龄、过度暴露于紫外线、免疫缺陷和存在MCPyV相关联。在美国，每年大约有1,500例新的MCC病例被诊断出来，代表这是一种相对罕见的癌症；然而，MCC的发生率在过去二十年中增加至三倍，年度诊断率继续攀升5％至10％。尽管MCC很罕见，却是最致命和最具侵略性的皮肤癌之一，其死亡率超过30％(Agelli和Clegg，(2003)J Am Acad Dermatol 49:832-841；Becker等人，(2009)Cell Mol Life Sci 66:1-8；Calder和Smoller，(2010)Adv Anat Pathol 17:155-161；Hodgson,(2005)J Sur Oncol 89:1-4；Lemos和Nghiem，(2007)J Invest Dermatol 127:2100-2103)。因此，在另一个方面，免疫增强剂构建体可以用于增强针对一种或多种感兴趣的梅克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)抗原的免疫应答。例如，来自MCPyV的一种或多种感兴趣抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的构建体mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和MCPyV抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该MCPyV抗原的免疫应答。
MCC来源于梅克尔细胞(作为替代梅-郎二氏细胞(Merkel-Ranvier cell)或触觉上皮细胞)的恶性转化，其中梅克尔细胞是涉及触摸和/或触觉感觉的机械感受细胞(Woo等人，(2016)Trends Cell Biol 25(2):74-81)。MCPyV存在于80％至85％的临床MCC肿瘤标本中(Feng等人，(2008)Science 319:1096-1100；Dalianis和Hirsch，(2013)Virology 437:63-72，以及其中的参考文献)。MCPyV被认为是迄今为止在其天然宿主体内引起肿瘤的唯一的人多瘤病毒(Arora等人，(2012)Curr.Opin.Virol 2:489-498；Spurgeon和Lambert，(2013)Virology 435:118-130)。
MCPyV病毒DNA克隆地整合在80％至85％的MCC肿瘤中。原型病毒(MCV350)基因组是包含5387个碱基对的环状双链DNA分子。所有测序的MCPyV病毒株的基因组平均具有约5.4个千碱基。该MCPyV基因组包含双向表达的早期编码区和晚期编码区，这些编码区被包含病毒复制起点的非编码调节区分开。MCPyV早期区(作为替代“T抗原基因座”)的大小为大约3kb，并且编码在感染时首先表达的基因(Feng等人，(2011)PLoS ONE 6:e22468；Feng等人，(2008)Science 319:1096-1100；Neumann等人，(2011)PLoS ONE 6:e29112)。MCPyV早期区表达三种T抗原(蛋白质)：大T抗原(LT)、小T抗原(sT)和57kT抗原(57kT)(Shuda等人，(2009)Int J Cancer 125(6):1243-9；Shuda等人，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(42):16272-7)。除了这三种T抗原之外，该MCPyV早期基因座还编码第四种蛋白质，即替代性T抗原开放阅读框(ALTO)。ALTO从LT的含有200个氨基酸的MUR区转录，并且似乎在进化上与鼠多瘤病毒的中间T抗原有关(Carter等人，(2013)Proc Natl Acad Sci USA 110:12744-12749)。
MCPyV的晚期区编码主要衣壳蛋白病毒蛋白1(VP1)和次要衣壳蛋白2和3(VP2和VP3)的开放阅读框。该MCPyV基因组表达来自晚期链的含有22个核苷酸的病毒miRNA(MCV-miR-M1-5p)，其最可能在感染的晚期期间自动调节早期病毒基因表达(Lee等人，(2011)JClin Virol 52(3):272-5；Seo等人，(2009)Virology 383(2):183-7)。研究支持该结论：病毒T抗原的组成型表达是病毒诱导的转化所必需的(Spurgeon和Lambert，(2013)Virology435(1):118-130，以及其中的参考文献)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，在相同或不同的mRNA上包含免疫增强剂构建体和MCPyV抗原构建体)包含至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种MCPyV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对MCPyV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框。在一些实施方案中，所述至少一种MCPyV抗原性多肽或其免疫原性片段选自大T抗原(LT)、小T抗原(sT)、57kT抗原(57kT)、替代性T抗原(ALTO)、主要衣壳蛋白病毒蛋白1(VP1)、次要衣壳病毒蛋白2或3(VP2或VP3)，以及它们的组合。
本公开的一些实施方案涉及治疗和/或预防人体内的MCPyV感染的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染MCPyV或有感染MCPyV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种MCPyV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗和/或预防由MCPyV感染引起和/或与MCPyV感染有因果关联的癌症的方法，其中将一种或多种本文所述的组合物提供给有需要的受试者(例如，感染MCPyV或有感染MCPyV的风险的人)，所述组合物含有一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种MCPyV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，这些核酸已被本领域技术人员证实或预测能够产生免疫应答。
任选地，向需要预防和/或治疗MCPyV感染的药物的受试者提供药物：该药物包含一种或多种编码免疫增强剂构建体和至少一种MCPyV多肽或其免疫原性片段的免疫调节治疗性核酸，以产生针对MCPyV和/或感染MCPyV的受试者细胞的免疫应答。在一些实施方案中，该免疫应答导致MCPyV病毒滴度降低。在一些实施方案中，该免疫应答导致产生中和抗MCPyV抗体。在一些实施方案中，该免疫应答导致针对MCPyV感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
在一些实施方案中，免疫调节治疗性核酸(例如，信使RNA、mRNA)包含至少一种具有编码至少一种MCPyV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对MCPyV的免疫应答的免疫原性片段)的开放阅读框的(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自大T抗原(LT)、小T抗原(sT)、57kT抗原(57kT)、替代性T抗原(ALTO)、主要衣壳蛋白病毒蛋白1(VP1)、次要衣壳病毒蛋白2或3(VP2或VP3)，以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自临时的和/或确认的MCPyV基因型和/或亚型(例如参见Martel-Jantin等人，(2014)J Clin Microbiol52(5):1687-1690；Hashida等人，2014J.Gen.Virol.95:135–141；Matsushita等人，(2014)Virus Genes 48:233–242；Baez等人，(2016)Virus Res 221:1-7，这些文献的全文以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，所述至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段选自未分配的MCPyV分离株。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码在结构上修饰受感染细胞的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码形成MCPyV病毒衣壳的一部分或全部的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码能够自组装成病毒样颗粒的抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码负责MCPyV病毒与被感染细胞结合的抗原性多肽。
个性化癌症疫苗
在一些方面，本公开提供了包含一种或多种mRNA构建体的个性化癌症疫苗，其中所述一种或多种mRNA构建体编码增强对感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽(即，免疫增强剂)。在一些实施方案中，该感兴趣的癌症抗原由相同或单独的mRNA构建体编码。在一些实施方案中，感兴趣的癌症抗原对受试者具有特异性。例如，感兴趣的癌症抗原(例如，如下所述进行选择和/或设计)可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和癌症抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该癌症抗原的免疫应答。本文描述了与免疫增强剂一起使用的合适的癌症抗原，包括对癌症受试者具有特异性的个性化抗原。
例如，该疫苗可以包含编码对每个受试者具有特异性的一种或多种癌症抗原(称为新表位)的mRNA。在肿瘤细胞中表达或由肿瘤细胞表达的抗原被称为“肿瘤相关抗原”。特定的肿瘤相关抗原也可以在、或者也可以不在非癌性细胞中表达。许多肿瘤突变是本领域熟知的。在非癌性细胞中不表达或很少表达，或者其在非癌性细胞中的表达相比在癌性细胞中的表达充分降低并且在接种疫苗后诱导免疫应答的肿瘤相关抗原被称为新表位。新表位对身体是完全陌生的，因而不会产生针对健康组织的免疫应答、也不会被免疫系统的保护性组分掩盖。在一些实施方案中，基于新表位的个性化疫苗是合乎需要的，因为此类疫苗制剂将使针对患者的特异肿瘤的特异性最大化。突变衍生的新表位可以由以下各项产生：点突变，导致蛋白质中的不同氨基酸的非同义突变；其中终止密码子经修饰或缺失的通读突变，这类突变导致翻译出在C-末端处具有新型肿瘤特异性序列的较长蛋白质；剪接位点突变，这类突变导致在成熟mRNA中、因而在独特的肿瘤特异性蛋白质序列中包含内含子；染色体重排，其在2种蛋白质的连接处产生具有肿瘤特异性序列的嵌合蛋白(即，基因融合)；移码突变或缺失，其导致具有新型肿瘤特异性蛋白质序列的新的开放阅读框；以及易位。
用于产生个性化癌症疫苗的方法通常涉及鉴定突变(例如，使用核酸或蛋白质深度测序技术)、鉴定新表位(例如，使用经验证的肽-MHC结合预测算法或其他分析技术的应用来产生一组可以结合患者HLA等位基因并且基于肿瘤中存在的突变的候选T细胞表位)、任选地证明针对所选择的新表位的抗原特异性T细胞，或者证明候选新表位与肿瘤表面上的HLA蛋白结合，以及开发该疫苗。
用于鉴定突变的技术的实例包括但不限于动态等位基因特异性杂交(DASH)、微孔板阵列对角凝胶电泳(MADGE)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、TaqMan系统以及各种DNA“芯片”技术，即Affymetrix SNP芯片，以及基于通过侵入性切割产生小信号分子、然后进行质谱或固定锁式探针和滚环扩增的方法。
该核酸或蛋白质深度测序技术是本领域已知的。可以使用任何类型的序列分析方法。例如，可以对整个肿瘤基因组、肿瘤外显子组(编码蛋白质的DNA)或肿瘤转录组进行核酸测序。实时单分子边合成边测序技术依赖于检测荧光核苷酸，因为它们被掺入与待测序模板互补的新生DNA链中。还存在其他快速高通量测序方法。可以对肿瘤蛋白质组进行蛋白质测序。此外，蛋白质质谱法可以用于鉴定或验证是否存在与肿瘤细胞上的MHC蛋白结合的突变型肽。肽可以从肿瘤细胞或从肿瘤免疫沉淀的HLA分子酸洗脱，然后使用质谱法鉴定。可以将测序结果与已知的对照组或与对患者的正常组织进行的测序分析进行比较。
在一些实施方案中，这些新表位以比野生型肽更大的亲和力与I类HLA蛋白结合，并且/或者能够激活抗肿瘤CD8 T细胞。在肿瘤上很少发现任何特定基因中的相同突变。
MHC I类蛋白存在于身体的几乎所有细胞(包括大多数肿瘤细胞)的表面上。MHC I类蛋白负载有通常来自内源性蛋白或来自细胞内存在的病原体、然后呈递给细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗原。T细胞受体能够识别和结合与MHC I类分子复合的肽。每种细胞毒性T淋巴细胞都表达能够结合特异性MHC/肽复合物的独特的T细胞受体。
在使用计算机算法的情况下，有可能预测潜在的新表位，诸如T细胞表位，即肽序列，这些新表位被I类或II类MHC分子结合，呈肽呈递复合物的形式，然后以这种形式被T淋巴细胞的T细胞受体识别。可用于鉴定将与MHC结合的肽的程序的实例包括例如：LonzaEpibase、SYFPEITHI(Rammensee等人，Immunogenetics,50(1999),213-219)和HLA_BIND(Parker等人，J.Immunol.,152(1994),163-175)。
一旦选择了推定的新表位，就可以使用体外和/或体内测定对它们进行进一步测试。常规的体外实验室测定，诸如Elispot测定可以与来自每个患者的分离物一起使用，以精修基于算法的预测选择的新表位列表。
在一些实施方案中，这些mRNA癌症疫苗和疫苗接种方法包括基于特定突变的表位或抗原(新表位)和由癌症-种系基因表达的那些表位或抗原(在多个患者体内发现的肿瘤共同的抗原，在本文中称为“传统癌症抗原”或“共有癌症抗原”)。在一些实施方案中，传统抗原是已知通常在癌症或肿瘤中、或在特定类型的癌症或肿瘤中发现的抗原。在一些实施方案中，传统癌症抗原是非突变的肿瘤抗原。在一些实施方案中，传统癌症抗原是突变的肿瘤抗原。
在一些实施方案中，这些疫苗还可以包含编码一种或多种非突变肿瘤抗原的mRNA。在一些实施方案中，这些疫苗还可以包含编码一种或多种突变肿瘤抗原的mRNA。
许多肿瘤抗原是本领域已知的。在一些实施方案中，该癌症或肿瘤抗原是以下抗原中的一种：CD2、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD47、CD52、CD56、CD70、CD79、CD137、4-IBB、5T4、AGS-5、AGS-16、血管生成素2、B7.1、B7.2、B7DC、B7H1、B7H2、B7H3、BT-062、BTLA、CAIX、癌胚抗原、CTLA4、Cripto、ED-B、ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFL7、EpCAM、EphA2、EphA3、EphB2、FAP、纤连蛋白、叶酸受体、神经节苷脂GM3、GD2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、gp100、gpA33、GPNMB、ICOS、IGF1R、整合素av、整合素ανβ、LAG-3、Lewis Y、间皮素、c-MET、MN碳酸酐酶IX、MUC1、MUC16、结合素-4、NKGD2、NOTCH、OX40、OX40L、PD-1、PDL1、PSCA、PSMA、RANKL、ROR1、ROR2、SLC44A4、多配体聚糖-1、TACI、TAG-72、腱生蛋白、TIM3、TRAILRl、TRAILR2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，以及它们的变体。
如本文所用，表位(也称为抗原决定簇)是在适当的背景下被免疫系统(特别是被抗体、B细胞或T细胞)识别的抗原的一部分。表位包括B细胞表位和T细胞表位。B细胞表位是被产生特异性抗体的B细胞识别所必需的肽序列。B细胞表位是指被抗体识别的抗原的特定区域。抗体的与该表位结合的那部分称为互补位。基于结构和与互补位的相互作用，表位可以是构象表位或线性表位。线性或连续表位由蛋白质的特定区域的一级氨基酸序列限定。与该抗体相互作用的序列在该蛋白质上相继位于彼此相邻的位置，并且该表位通常可以由单个肽模拟。构象表位是由天然蛋白质的构象结构限定的表位。这些表位可以是连续的或不连续的，即，该表位的组分可以位于蛋白质的不同部分上，这些部分在折叠的天然蛋白质结构中彼此接近。
T细胞表位是与APC上的蛋白质缔合的肽序列，这类表位是被特异性T细胞识别所必需的。T细胞表位在细胞内加工并呈递在APC的表面上，在那里它们与MHC分子(包括MHCII类和MHC I类)结合。
在其他方面，本发明的癌症疫苗包括编码多种肽表位抗原的mRNA疫苗，这些肽表位抗原与一个或多个散布的通用II型T细胞表位一起排列。通用II型T细胞表位包括但不限于ILMQYIKANSKFIGI(破伤风毒素；SEQ ID NO:226)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(破伤风毒素；SEQ ID NO:227)、QYIKANSKFIGITE(破伤风毒素；SEQ ID NO:228)、QSIALSSLMVAQAIP(白喉毒素；SEQ ID NO:229)和AKFVAAWTLKAAA(pan-DR表位(PADRE)；SEQ ID NO:230)。在一些实施方案中，该mRNA疫苗包含相同的通用II型T细胞表位。在其他实施方案中，该mRNA疫苗包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个不同的通用II型T细胞表位。在一些实施方案中，所述一个或多个通用II型T细胞表位散布在每一个癌症抗原之间。在其他实施方案中，所述一个或多个通用II型T细胞表位散布在每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100个癌症抗原之间。
可以使用免费数据库或商业数据库(例如，Lonza Epibase，antitope)来鉴定表位。这些工具可用于预测靶抗原蛋白内最具免疫原性的表位。然后可以在人HLA小组中合成和筛选所选择的肽，并且使用最具免疫原性的序列来构建编码所述一种或多种抗原的mRNA。用于绘制细胞毒性T细胞的表位的一种策略基于产生跨蛋白质的每种标称11聚体的四个C-末端肽的等摩尔混合物。该策略将产生含有所有可能的活性CTL表位的文库抗原。
肽表位可以是对表位合理的任何长度。在一些实施方案中，该肽表位为9至30个氨基酸。在其他实施方案中，该长度为9至22个、9至29个、9至28个、9至27个、9至26个、9至25个、9至24个、9至23个、9至21个、9至20个、9至19个、9至18个、10至22个、10至21个、10至20个、11至22个、22至21个、11至20个、12至22个、12至21个、12至20个、13至22个、13至21个、13至20个、14至19个、15至18个或16至17个氨基酸。
这些个性化癌症疫苗包括多个表位。在一些实施方案中，这些个性化癌症疫苗编码48至54种个性化癌症抗原。在一个实施方案中，这些个性化癌症疫苗编码52种个性化癌症抗原。在一些实施方案中，这些个性化癌症抗原中的每一种都是由单独的开放阅读框编码的。在一些实施方案中，这些个性化癌症疫苗由45种或更多的、46种或更多的、47种或更多的、48种或更多的、49种或更多的、50种或更多的、51种或更多的、52种或更多的、53种或更多的、54种或更多的、或者55种或更多的抗原构成。在其他实施方案中，这些个性化癌症疫苗由1000个或更少的、900个或更少的、500个或更少的、100个或更少的、75个或更少的、50个或更少的、40个或更少的、30个或更少的、20个或更少的、或者100个或更少的表位构成。在还有其他实施方案中，这些个性化癌症疫苗具有3至100种、5至100种、10至100种、15至100种、20至100种、25至100种、30至100种、35至100种、40至100种、45至100种、50至100种、55至100种、60至100种、65至100种、70至100种、75至100种、80至100种、90至100种、5至50种、10至50种、15至50种、20至50种、25至50种、30至50种、35至50种、40至50种、45至50种、100至150种、100至200种、100至300种、100至400种、100至500种、50至500种、50至800种、50至1,000种、或100至1,000种癌症抗原。
在一些实施方案中，肽表位的最佳长度可以通过以下过程获得：合成V5标签多联体-测试蛋白酶位点，将其引入到DC细胞中(例如，使用RNA Squeeze过程)，裂解细胞，然后运行抗V5蛋白质印迹法以评估蛋白酶位点处的切割。
RNA Squeeze技术是一种细胞内递送方法，通过该方法可以将多种材料递送到范围广泛的活细胞中。细胞经受微流体构造，这引起快速的机械变形。变形导致暂时的膜破裂和新形成的瞬时孔。材料然后经由这些瞬时孔被动地扩散到细胞胞质溶胶中。该技术可以用于多种细胞类型，包括原代成纤维细胞、胚胎干细胞和大量免疫细胞，并且已被证实在大多数应用中具有相对高的活性，而且不会通过它的行动对敏感材料(诸如量子点或蛋白质)造成损害。Sharei等人，PNAS(2013)；110(6):2082-7。
可以设计新表位以最佳地结合MHC，以便促进强烈的免疫应答。在一些实施方案中，每个肽表位都包含抗原区和MHC稳定区。MHC稳定区是使肽稳定在MHC中的序列。该MHC稳定区的长度可以为5至10个、5至15个、8至10个、1至5个、3至7个或3至8个氨基酸。在还有其他实施方案中，该抗原区的长度为5至100个氨基酸。肽在呈递于细胞表面上之前，通过内质网内的竞争亲和力结合与MHC I类分子相互作用。单个肽的亲和力与其氨基酸序列以及该氨基酸序列内的限定位置存在特异性结合基序直接相关。在MHC中呈递的肽由肽结合沟的底部保持在α1/α2异二聚体(由两个不同的亚单位组成的分子)的中心区中。肽结合沟底部的残基序列决定了它结合的具体肽残基。
可以通过计算机辅助比较结合位点(MHC袋)对每个靶表位的结合位点中的每个氨基酸处的具体氨基酸的亲和力来鉴定最佳结合区，以鉴定对所有受检查抗原的理想结合物。可以使用结合位点的数据点的氨基酸预测矩阵来鉴定表位的MHC稳定区。氨基酸预测矩阵是具有定义数据点的第一轴线和第二轴线的表。预测矩阵可以如Singh,H.和Raghava，G.P.S.(2001),“ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.”Bioinformatics,17(12),1236-37)中所示生成。
在一些实施方案中，基于受试者的特定MHC来设计该MHC稳定区。以这种方式，可以针对每个患者优化MHC稳定区。
在一些情况下，抗原的每个表位可以包括MHC稳定区。这些表位内的所有MHC稳定区可以相同、也可以不同。这些MHC稳定区可以位于肽的N末端部分或肽的C末端部分。作为替代，这些MHC稳定区可以位于肽的中心区中。在一些实施方案中，新表位的长度为13个残基或更少，并且新表位通常由介于约8个与约11个之间的残基(特别是9个或10个残基)组成。在其他实施方案中，这些新表位可以设计得更长。例如，这些新表位朝向每个对应的基因产物的N-末端和C-末端可以具有2至5个氨基酸的延伸。使用较长的肽可以允许患者细胞进行内源性加工，并且可以导致更有效的抗原呈递和对T细胞应答的诱导。
被选择包含在疫苗中的新表位将典型地为高亲和力结合肽。在一些方面，新表位以比野生型肽更大的亲和力结合HLA蛋白。在一些实施方案中，新表位的IC50至少小于5000nM、至少小于500nM、至少小于250nM、至少小于200nM、至少小于150nM、至少小于100nM、至少小于50nM或更小。典型地，预测的IC50<50nM的肽通常被认为是中至高亲和力的结合肽，并且将被选择用于使用HLA结合的生物化学测定来凭经验测试它们的亲和力。最后，将确定人免疫系统是否能够针对这些突变的肿瘤抗原产生有效的免疫应答，从而有效地杀死肿瘤而不是正常细胞。
具有期望活性的新表位可以在必要时进行修饰，以提供某些期望的属性，例如，改善的药理学特征，同时增加或至少保留未经修饰肽的基本上所有生物活性，以结合期望的MHC分子并激活适当的T细胞或B细胞。例如，这些新表位可以经受各种变化，诸如保守或非保守取代，在这种情况下，此类变化可以在使用这些表位时提供某些优点，诸如改善的MHC结合。所谓保守取代，是指将一种氨基酸残基替换为另一种在生物学上和/或化学上相似的氨基酸残基，例如，将一种疏水性残基替换为另一种，或将一种极性残基替换为另一种。这些取代包括以下组合，诸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。也可以使用D-氨基酸来探测单个氨基酸取代的影响。这些修饰可以使用众所周知的肽合成过程来进行，如例如以下文献中所述：Merrifield,Science 232:341-347(1986),Barany和Merrifield,The Peptides,Gross和Meienhofer编辑，(N.Y.,Academic Press)，第1至284页(1979)；以及Stewart和Young，Solid Phase PeptideSynthesis,(Rockford,Ill.,Pierce)，第2版(1984)。
也可以通过延长或减小化合物的氨基酸序列(例如，通过添加或缺失氨基酸)来修饰新表位。还可以通过改变某些残基的顺序或组成来修饰这些肽、多肽或类似物，容易理解的是，对于生物活性必需的某些氨基酸残基(例如，在关键接触位点处的那些或保守残基)通常不会被改变，且对生物活性没有不利影响。
典型地，采用具有单个氨基酸取代的一系列肽来确定静电荷、疏水性等对结合的影响。例如，沿肽的长度进行一系列带正电(例如，Lys或Arg)或带负电(例如，Glu)的氨基酸取代，从而揭示对各种MHC分子和T细胞受体或B细胞受体的不同敏感模式。此外，可以采用使用小的相对中性的部分诸如Ala、Gly、Pro或类似残基的多种取代。这些取代可以是同源寡聚体或异源寡聚体。被的或添加的残基的数量和类型取决于必需接触点之间所必需的间距和所寻求的某些功能属性(例如，疏水性对亲水性)。通过此类取代还可以实现对MHC分子或T细胞受体的结合亲和力相比亲本肽的亲和力增加。在任何情况下，此类取代都应当采用所选择的氨基酸残基或其他分子片段，以避免例如可能破坏结合的空间干扰和电荷干扰。
这些新表位还可以包含这些新表位中的两个或更多个残基的等排物。如本文所定义的等排物，是由于第一序列的空间构象符合对于第二序列有特异性的结合位点，而可以取代该第二序列的两个或更多个残基的序列。该术语具体包括本领域技术人员熟知的肽骨架修饰。此类修饰包括酰胺氮、.α.-碳、酰胺羰基的修饰，完全替换酰胺键、延伸、缺失或骨架交联。一般来讲，参见Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins，第VII卷(Weinstein编辑，1983)。
考虑免疫原性是选择包含在疫苗中的最佳新表位的重要组成部分。可以例如通过分析新表位的MHC结合能力、HLA混杂性、突变位置、预测的T细胞反应性、实际的T细胞反应性、导致具体构象的结构和所得的溶剂暴露，以及特定氨基酸的表示来评估免疫原性。诸如NetMHC预测算法等已知算法可以用于预测肽结合常见HLA-A和-B等位基因的能力。对MHC结合肽的结构评估也可以通过计算机三维分析和/或蛋白质对接程序来进行。使用预测的与MHC分子结合的表位结构(诸如从Rosetta算法获得的预测表位结构)可以用于评估表位的氨基酸残基在该表位与MHC分子结合时的溶剂暴露程度。可以在体外用表位和T细胞来通过实验评估T细胞反应性。作为替代，可以使用T细胞应答/序列数据集来评估T细胞反应性。
包含在疫苗中的新表位的重要组成部分是缺乏自身反应性。可以筛选推定的新表位以证实该表位局限于肿瘤组织，例如，由于恶性细胞内的遗传性改变而出现。理想的是，表位不应存在于患者的正常组织中，因而从数据集中滤出自相似表位。
在其他方面，本公开提供了用于制备mRNA癌症疫苗的方法，方式为：从受试者分离样品、鉴定样品中的多种癌症抗原、确定来自所述多种癌症抗原的T细胞表位、制备具有编码抗原和增强对该抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mRNA癌症疫苗，其中该抗原包含所述T细胞表位中的至少一个。在一些实施方案中，该方法还涉及确定T细胞表位与受试者的MHC的结合强度。在其他实施方案中，该方法还涉及确定每个表位的T细胞受体面(TCR面)，并且选择TCR面与内源性蛋白相似性低的表位。T细胞表位可能已经得到优化，以提供与受试者的MHC的结合强度。在一些实施方案中，每个表位的TCR面与内源性蛋白的相似性低。
例如，可以使用称为JanusMatrix(Epivax)的技术来鉴定具有期望的TCR面和对MHC的期望结合强度的表位，其中该技术检查来自结合HLA的侧面和面向TCR的侧面这两者的交叉反应性T细胞表位，以允许跨大基因组序列数据库进行比较。可以单独使用或连同JanusMatrix一起使用一套算法，来优化表位选择。例如，EpiMatrix获取来源于保守靶蛋白序列的重叠9聚体框，并对它们针对一组I类或II类HLA等位基因的潜在结合亲和力进行评分；每个得分高且被预测结合的frame-by-allele评估为推定的T细胞表位。ClustiMer获取EpiMatrix输出，并鉴定含有大量推定T细胞表位的9聚体簇。BlastiMer自动进行将先前鉴定的序列提交给BLAST以确定是否有任何序列与人类基因组共享相似性的过程；任何这样的相似序列都可能被容忍或引发不需要的自身免疫应答。EpiAssembler采用由Conservatrix和EpiMatrix鉴定的保守的免疫原性序列，并将它们编织在一起以形成高度免疫原性的共有序列。JanusMatrix可以用于筛选出由于与人类基因组编码的序列具有同源性而可能潜在地引发不期望的自身免疫应答或调节性T细胞应答的序列。VaccineCAD可以用于将候选表位连接成珠串设计，同时最大限度减少可能在连接过程中产生的非特异性连接表位。
根据本公开的用于产生个性化癌症疫苗的方法涉及使用诸如如本文所述对组织样品进行的核酸或蛋白质深度测序方法的技术鉴定突变。在一些实施方案中，对患者转录组中的突变执行初始鉴定。将来自患者转录组的数据与来自患者外显子组的序列信息进行比较，以便鉴定表达的患者特异性突变和肿瘤特异性突变。该比较产生推定新表位的数据集，称为突变组(mutanome)。该突变组可以针对每个患者包括大约100个至10,000个候选突变。使用一组查询或算法对该突变组进行数据探测分析，以鉴定用于产生新抗原疫苗的最佳突变集。在一些实施方案中，设计并制造了mRNA新抗原疫苗。然后用该疫苗治疗患者。
在一些实施方案中，从突变鉴定过程的起始到开始治疗患者的整个方法在短于2个月内实现。在其他实施方案中，整个过程在7周或更短的时间、6周或更短的时间、5周或更短的时间、4周或更短的时间、3周或更短的时间、2周或更短的时间、或短于1周内实现。在一些实施方案中，整个方法在短于30天内执行。
该突变鉴定过程可以涉及分析转录组和外显子组这两者，或仅分析转录组或外显子组。在一些实施方案中，首先分析转录组，然后分析外显子组。对生物或组织样品执行分析。在一些实施方案中，生物或组织样品是血液或血清样品。在其他实施方案中，该样品是B细胞的组织库样品或EBV转化。
一旦合成mRNA疫苗，就将其施用于患者。在一些实施方案中，该疫苗按时间表施用长达两个月、长达三个月、长达四个月、长达五个月、长达六个月、长达七个月、长达八个月、长达九个月、长达十个月、长达十一个月、长达一年、长达一年半、长达两年、长达三年或长达四年。该时间表可以无变化，也可以有变化。在一些实施方案中，该时间表是在前3周内每周施用，之后每月施用。
在治疗的任何时候，可以检查患者以确定疫苗中的突变是否仍然合适。基于该分析，可以调整或重新配置该疫苗，以包含一种或多种不同的突变或者移除一种或多种突变。
已经认识到并且理解，通过分析癌症相关突变的某些特性，可以评估和/或选择最佳新表位以包含在mRNA疫苗中。一个新表位或一组新表位的特性可以包括例如：对患者RNA测序或其他核酸分析中的基因或转录物水平表达的评估、可用数据库中的组织特异性表达、已知的致癌基因/肿瘤阻抑因子、识别变体置信度评分、RNA测序等位基因特异性表达、保守与非保守氨基酸取代、点突变位的置(增大的TCR接合的中心评分)、点突变的位置(差异HLA结合的锚定评分)、自我性：与患者WES数据的核心表位同源性<100％、8聚体至11聚体的HLA-A IC50和HLA-B IC50、15聚体至20聚体的HLA-DRB1 IC50、混杂性评分(即，预测结合的患者HLA的数量)、8聚体至11聚体的HLA-C IC50、15聚体至20聚体的HLA-DRB3-5 IC50、15聚体至20聚体的HLA-DQB1/A1 IC50、15聚体至20聚体的HLA-DPB1/A1 IC50、I类与II类比例、涵盖的患者HLA-A、HLA-B和DRB1同种异型的多样性、点突变与复杂表位(例如，框移)的比例，和/或假表位HLA结合评分。
在一些实施方案中，用于鉴定最佳新表位的癌症相关突变的特性是与突变类型、患者样品中的突变丰度、免疫原性、缺乏自身反应性和肽组成的性质有关的特性。
应当确定突变类型，并将其视为确定推定的表位是否应当被包含在疫苗中的一个因素。突变的类型可以变化。在一些情况下，可能期望在单个疫苗中包含多种不同类型的突变。在其他情况下，可能更期望包含单一类型的突变。可以加权和计算特定突变的值。
还可以对患者样品中的突变的丰度进行评分，并在决定推定的表位是否应当被包含在疫苗中时将其考虑进去。高丰度的突变可以促进更强烈的免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的个性化mRNA癌症疫苗可以用于治疗癌症。
这些mRNA癌症疫苗可以作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用于健康个体或早期癌症或晚期和/或转移性癌症。在一个实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的mRNA癌症疫苗的有效量可以足以用于免疫激活，特别是抗原特异性免疫激活。
在一些实施方案中，该mRNA癌症疫苗可以与抗癌治疗剂(包括但不限于传统癌症疫苗)一起施用。可以将该mRNA癌症疫苗与抗癌治疗剂结合，以更进一步增强免疫治疗应答。该mRNA癌症疫苗和其他治疗剂可以同时或相继施用。当同时施用其他治疗剂时，它们可以在相同或分开的制剂中施用，但是同时施用。当其他治疗剂和mRNA癌症疫苗的施用在时间上分开时，其他治疗剂彼此相继施用并且与mRNA癌症疫苗相继施用。两次施用这些化合物之间的时间间隔可以是大约几分钟，或者可以是更长时间，例如，几小时、几天、几周、几个月。其他治疗剂包括但不限于抗癌治疗剂、佐剂、细胞因子、抗体、抗原等。
在另一个实施方案中，这些肽表位是由2至100个肽表位组成的多联癌症抗原的形式。在一些实施方案中，该多联癌症抗原包括下列特征中的一种或多种：a)切割敏感性位点散布在2至100个肽表位之间；b)编码每个肽表位的mRNA彼此直接连接，而不使用接头连接；c)编码每个肽表位的mRNA使用单个核苷酸接头彼此连接；d)每个肽表位包含25至35个氨基酸，并且包括位于中心的SNP突变；e)这些肽表位的至少30％对来自受试者的I类MHC分子具有最高的亲和力；f)这些肽表位的至少30％对来自受试者的II类MHC分子具有最高的亲和力；g)这些肽表位的至少50％对于HLA-A、HLA-B和/或DRB1的预测结合亲和力为IC>500nM；h)该mRNA编码45至55个肽表位；i)该mRNA编码52个肽表位；j)这些肽表位的50％对于I类MHC具有结合亲和力，并且这些肽表位的50％对于II类MHC具有结合亲和力；k)编码这些肽表位的mRNA被排列成使得这些肽表位被排序以最大程度减少假表位，l)这些肽表位的至少30％是长度为15个氨基酸的I类MHC结合肽；以及/或者m)这些肽表位的至少30％是长度为21个氨基酸的II类MHC结合肽。
细菌疫苗
在一些方面，本公开提供了包含一种或多种mRNA构建体的细菌疫苗，其中所述一种或多种mRNA构建体编码增强对感兴趣的细菌抗原的免疫应答的多肽(即，免疫增强剂)。在一些实施方案中，该感兴趣的细菌抗原由相同或单独的mRNA构建体编码。在一些实施方案中，该细菌疫苗包含一种或多种编码增强免疫应答的多肽的mRNA构建体，以及一种或多种编码至少一种感兴趣的细菌抗原的mRNA构建体。例如，感兴趣的细菌抗原可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和细菌抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该细菌抗原的免疫应答。本文描述了与免疫增强剂一起使用的合适的细菌抗原。
在一些实施方案中，该细菌疫苗是预防性的(即，防止感染)。在一些实施方案中，该细菌疫苗是治疗性的(即，治疗感染)。在一些实施方案中，该细菌疫苗诱导体液免疫应答(即，产生对感兴趣的细菌抗原有特异性的抗体)。在一些实施方案中，该细菌疫苗诱导适应性免疫应答。适应性免疫应答响应于与抗原或免疫原的对抗而发生，在这种情况下，免疫应答对于该抗原/免疫原的抗原决定簇具有特异性。适应性免疫应答的实例为诱导抗原特异性抗体产生，或者抗原特异性诱导/激活T辅助淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞。
在一些实施方案中，该细菌疫苗诱导保护性的适应性免疫应答，其中在受试者体内诱导抗原特异性免疫应答，作为对使用抗原免疫(人工或天然)的反应，在这种情况下，免疫应答能够保护该受试者抵抗后续该抗原或包含该抗原的病理相关剂造成的攻击。
在一些实施方案中，本文所述的细菌疫苗用于治疗金黄色葡萄球菌造成的感染。在一些实施方案中，本文所述的细菌疫苗用于治疗耐抗生素金黄色葡萄球菌造成的感染。在一些实施方案中，本文所述的细菌疫苗用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)造成的感染。
医院获得性感染是美国医疗保健系统中最常见和最昂贵的问题之一，其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)是这类感染的第二大原因。MRSA是造成所有医院获得性金黄色葡萄球菌感染中的40％至50％的原因。此外，最近的研究表明，金黄色葡萄球菌还是假体植入物感染的主要介质。金黄色葡萄球菌用来阻止宿主免疫应答并发展成持续感染的最重要机制之一是通过形成高度发达的生物膜。生物膜是微生物衍生的群落，其中细菌细胞附着于水合表面并嵌入多糖基质中。生物膜中的细菌在其生长、基因表达和蛋白质产生中表现出改变的表型。
因此，在一些实施方案中，本文所述的细菌疫苗防止由于金黄色葡萄球菌建立生物膜介导的慢性感染。在一些实施方案中，感兴趣抗原在由金黄色葡萄球菌产生的生物膜中发现。此类抗原的实例描述于美国专利号9,265,820中，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，该细菌疫苗包含至少一种由浮游形式的细菌表达的多肽，和至少一种由生物膜形式的细菌表达的多肽。
在一些实施方案中，感兴趣的细菌抗原来源于金黄色葡萄球菌。耐药性金黄色葡萄球菌表达多种表面暴露蛋白，这些表面暴露蛋白是疫苗靶标候选物，以及用于制备靶向金黄色葡萄球菌的抗体的免疫剂候选物。此类抗原的实例描述于PCT公布号WO 2012/136653和WO 2015/082536，以及Ramussen,K.等人，Vaccine，第34卷，4602-4609(2016)中，这些文献中的每一者全文以引用方式并入本文。
技术人员将理解，可以由本文所述的细菌疫苗的mRNA编码的不同金黄色葡萄球菌蛋白质的身份、数量和大小可以变化。例如，该疫苗可以包含仅编码全长多肽的一部分的mRNA。在一些实施方案中，该疫苗可以包含编码部分多肽和全长多肽的组合的mRNA。
由本文所述的细菌疫苗中包含的mRNA编码的浮游生物和生物膜表达多肽的身份不受具体限制，但各自为来自金黄色葡萄球菌菌株的多肽。在一些实施方案中，该多肽暴露在细菌的表面上。
在一个实施方案中，该细菌抗原是多价抗原(即，该抗原包含多个抗原表位，诸如包含不同表位的多个抗原肽，诸如多联抗原)。
在另一个实施方案中，该细菌抗原是衣原体抗原，诸如MOMP、OmpA、OmpL、OmpF或OprF抗原。合适的衣原体抗原在PCT申请号PCT/US2016/058314中进一步描述，该申请的全部内容以引用方式明确并入本文。
多价疫苗
免疫增强剂构建体可以与多价抗原(即，该抗原包含多个抗原表位，诸如包含不同表位的多个抗原肽，诸如多联抗原)组合使用，从而增强针对该多价抗原的免疫应答。在一个实施方案中，该多价抗原是癌症抗原。在另一个实施方案中，该多价抗原是细菌抗原。例如，感兴趣的多价抗原(例如，如下所述进行设计)可以由经化学修饰的mRNA(mmRNA)编码，该mRNA与免疫增强剂构建体在相同的mmRNA上提供或与免疫增强剂在不同的mmRNA构建体上提供。可以配制(或共同配制)免疫增强剂mmRNA和多价抗原mmRNA，然后将其(同时或相继地)施用于有需要的受试者，以刺激该受试者体内针对该多价抗原的免疫应答。本文描述了与免疫增强剂一起使用的合适的多价抗原，包括癌症抗原和细菌抗原。
在一些实施方案中，本文所述的mRNA疫苗包含具有开放阅读框的mRNA，该开放阅读框编码由2至100个肽表位组成的多联抗原。
在一些实施方案中，本文所述的多联疫苗可以包括单个新表位的多个拷贝、基于单一类型突变(即，点突变)的多个不同的新表位、基于多种突变类型的多个不同的新表位、新表位和其他抗原，诸如肿瘤相关抗原或回忆抗原。
在一些实施方案中，该多联抗原可以包括回忆抗原(有时也称为记忆抗原)。回忆抗原是先前已经被个体遇到并且对于其存在预先存在的记忆淋巴细胞的抗原。在一些实施方案中，回忆抗原可以是个体有可能遇到的感染性疾病抗原，诸如流感抗原。回忆抗原有助于促进更强烈的免疫应答。
除肽表位之外，该多联抗原可以具有一个或多个靶向序列。如本文所用，靶向序列是指促进肽摄取到细胞内区室(诸如内体)中以在MHC I类或II类决定簇内加工和/或呈递的肽序列。
靶向序列可以存在于多联体抗原表位的N-末端和/或C-末端处，与其直接相邻或被接头切割敏感性位点隔开。这些靶向序列具有多种长度，例如4至50个氨基酸的长度。
该靶向序列可以是例如内体靶向序列。内体靶向序列是来源于已知驻留在MHC II类Ag加工区室中的内体蛋白或溶酶体蛋白的序列，诸如恒定链、溶酶体相关膜蛋白(LAMP1、4LAMP2)和树突状细胞(DC)-LAMP或与其具有至少80％序列同一性的序列。此外，可以使用均由被激活的PBMC扩增的编码MHC I类信号肽片段(78bp，分泌信号(sec))和包含终止密码子的跨膜结构域和胞质溶胶结构域(MHC I类运输信号(MITD)，168bp)的示例性核酸(sec有义，5′-aag ctt agc ggc cgc acc atg cgg gtc acg gcg ccc cga acc-3′(SEQ ID NO:1314)；sec反义，5′-ctg cag gga gcc ggc cca ggt ctc ggt cag-3′(SEQ ID NO:1315)；MITD有义，5′-gga tcc atc gtg ggc att gtt gct ggc ctg gct-3′(SEQ ID NO:1316)；和MITD反义，5′-gaa ttc agt ctc gag tca agc tgt gag aga cac atc aga gcc-3′(SEQ IDNO:1317)。
MHC I类呈递典型地为低效过程(实际上在10,000个降解分子中仅呈递1个肽)。用APC致敏CD8 T细胞提供的表面肽/MHC I复合物的密度不足，导致弱应答，从而表现出细胞因子分泌受损和记忆池(memory pool)减小。本文所述的方法能够提高MHC I类呈递的效率。MHC I类靶向序列包括MHC I类运输信号(MITD)和PEST序列(据推测通过靶向蛋白质以快速降解来增大抗原特异性CD8 T细胞应答)。
在一些实施方案中，这些mRNA疫苗可以与用于促进抗原呈递细胞(APC)产生(例如，通过将非APC转变为假APC)的剂结合。抗原呈递是免疫应答的起始、扩增和持续的关键步骤。在该过程中，抗原片段通过主要组织相容性复合物(MHC)或人白细胞抗原(HLA)呈递给驱动抗原特异性免疫应答的T细胞。对于免疫预防和免疫疗法，增强这种应答对于提高功效很重要。可以设计或增强本发明的mRNA疫苗，以驱动有效的抗原呈递。用于增强APC加工和呈递的一种方法是更好地将mRNA疫苗靶向抗原呈递细胞(APC)。另一种方法涉及用免疫刺激制剂和/或组分激活APC细胞。
作为替代，用于将非APC重编程以成为APC的方法可以与本文所述的mRNA疫苗一起使用。重要的是，摄取mRNA制剂并且是其治疗作用的靶标的大多数细胞不是APC。因此，设计将这些细胞转变为APC的方法将有益于功效。本文提供了用于将RNA疫苗(例如，mRNA疫苗)递送至细胞，同时还促进非APC转变为APC的方法和途径。在一些实施方案中，编码APC重编程分子的mRNA包含在该mRNA疫苗中或与该mRNA疫苗共同施用。
如本文所用，APC重编程分子是促进非APC细胞向APC样表型转变的分子。APC样表型是能够进行MHC II类加工的特性。因此，具有APC样表型的APC细胞是具有一种或多种外源性分子(APC重编程分子)的细胞，与不具有所述一种或多种外源性分子的相同细胞相比，其具有增强的MHC II类加工能力。在一些实施方案中，APC重编程分子是CIITA(MHC II类表达的中心调节剂)；伴侣蛋白诸如CLIP、HLA-DO、HLA-DM等(将抗原片段加载到MHC II类中的增强子)和/或共刺激分子如CD40、CD80、CD86等(T细胞抗原识别和T细胞激活的增强子)。
CIITA蛋白是通过与一组保守的与II类启动子区缔合的DNA结合蛋白相互作用来增强对MHC II类基因转录的激活的反式激活蛋白(Steimle等人，1993,Cell 75:135-146)。CIITA的转录激活功能已经被映射到氨基末端酸性结构域(氨基酸26-137)。编码与CIITA相互作用的蛋白质的核酸分子称为CIITA相互作用蛋白104(在本文中也称为CIP104)。已经证实CITTA和CIP104均增强从MHC II类启动子转录，因而可用作本发明的APC重编程分子。在一些实施方案中，该APC重编程分子是全长CIITA、CIP104或其他相关分子或其活性片段，诸如CIITA的氨基酸26-137，或与其具有至少80％序列同一性并维持增强激活MHC II类基因的转录能力的氨基酸。
在一些实施方案中，该APC重编程分子以编码该APC重编程分子的mRNA的形式递送至受试者。因此，本文所述的mRNA疫苗可以包含编码APC重编程分子的mRNA。在一些实施方案中，该mRNA为单顺反子mRNA。在其他实施方案中，该mRNA为多顺反子mRNA。在一些实施方案中，该编码一种或多种抗原的mRNA与编码APC重编程分子的mRNA处于分开的制剂中。在其他实施方案中，该编码一种或多种抗原的mRNA与编码APC重编程分子的mRNA处于相同的制剂中。在一些实施方案中，该编码一种或多种抗原的mRNA与编码APC重编程分子的mRNA同时施用于受试者。在其他实施方案中，该编码一种或多种抗原的mRNA与编码APC重编程分子的mRNA在不同的时间施用于受试者。例如，该编码APC重编程分子的mRNA可以在编码一种或多种抗原的mRNA之前施用。该编码APC重编程分子的mRNA可以在即将施用编码所述抗原的mRNA之前施用，在施用后者之前至少1小时、之前至少1天、之前至少1周或之前至少1个月施用。作为替代，该编码APC重编程分子的mRNA可以在编码一种或多种抗原的mRNA之后施用。该编码APC重编程分子的mRNA可以在施用编码所述抗原的mRNA之后立即施用，在施用后者之后至少1小时、之后至少1天、之后至少1周或之后至少1个月施用。
在其他实施方案中，该靶向序列是附接在编码肽的任一端或两端处的泛素化信号。在其他实施方案中，该靶向序列是附接在编码肽的内部位点处和/或附接到任一端的泛素化信号。因此，该mRNA可以包含在编码多联肽的核苷酸的任一端或两端处编码泛素化信号的核酸序列。泛素化是一种翻译后修饰，是将泛素附接到底物靶蛋白上的过程。泛素化信号是能够靶向肽并将肽加工成一种或多种蛋白酶体的肽序列。通过使用泛素化信号靶向并加工肽，该肽的细胞内加工可以更贴切地重现抗原呈递细胞(APC)中的抗原加工。
泛素是一种8.5kDa的调节蛋白，存在于真核生物体的几乎所有组织中。在人类基因组中，有四种产生泛素的基因：UBB、UBC、UBA52和RPS27A。UBA52和RPS27A编码分别与核糖体蛋白L40和S27a融合的单拷贝泛素。基因UBB和UBC编码多聚泛素前体蛋白。泛素化分三个步骤，由三种酶进行。泛素激活酶(也称为E1酶)修饰泛素，使其处于反应状态。E1与ATP和泛素这两者结合，催化泛素C-末端的酰基腺苷酸化。然后，该泛素被转移至活性位点半胱氨酸残基，从而释放AMP。最终，在该泛素的C-末端羧基基团与E1半胱氨酸巯基基团之间形成硫酯键。在人类基因组中，UBA1和UBA6是编码E1酶的两个基因。
激活的泛素然后经受E2泛素缀合酶的作用，这些酶经由反式(硫)酯化反应将该泛素从E1转移至E2的活性位点半胱氨酸。E2与激活的泛素和E1酶这两者结合。人有35种不同的E2酶，特征在于其高度保守的结构，该结构被称为泛素缀合催化(UBC)折叠。E3泛素连接酶促进泛素化级联的最后步骤。一般来讲，它们在靶蛋白的赖氨酸与泛素的C-末端甘氨酸之间产生异肽键。E3连接酶有数百种；有些还激活E2酶。E3酶用作系统的底物识别模块，并且既与E2、又与底物相互作用。这些酶具有以下两个结构域中的一个：与E6-AP羧基末端(HECT)结构域同源的结构域，或真正引起关注的新基因(RING)结构域(或密切相关的U-box结构域)。HECT结构域E3酶在与E3的活性位点半胱氨酸形成专性硫酯中间体时瞬时结合泛素，而RING结构域E3酶则催化从E2酶直接转移至底物。
添加到该抗原中的泛素的数量可以增强加工步骤的功效。例如，在多聚泛素化中，在第一个泛素分子已经附接到肽之后添加另外的泛素分子。通过将泛素分子的甘氨酸残基连接到该泛素的与肽结合的赖氨酸，产生所得的泛素链。每个泛素都含有可以充当泛素化位点的7个赖氨酸残基和1个N-末端。当四个或更多个泛素分子附接到肽抗原上的赖氨酸残基时，26S蛋白酶体识别该复合物，使其内化，然后将该蛋白质降解成小肽。
泛素野生型具有以下序列(智人(Homo sapiens))：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO:1318)
在一些实施方案中，这些表位通过切割敏感性位点连接。切割敏感性位点是易受酶或蛋白酶切割的肽。这些位点也称为蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，该蛋白酶为细胞内酶。在一些实施方案中，该蛋白酶是在抗原呈递细胞(APC)中发现的蛋白酶。因此，这些蛋白酶切割位点对应于APC中的高丰度(高度表达)蛋白酶。对APC酶敏感的切割敏感性位点称为APC切割敏感性位点。在APC中表达的蛋白酶包括但不限于半胱氨酸蛋白酶，诸如：组织蛋白酶B、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶F、组织蛋白酶Z、组织蛋白酶V、组织蛋白酶O、组织蛋白酶C和组织蛋白酶K，以及天冬氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶D、组织蛋白酶E，以及天冬酰胺酰内肽酶。
以下是示例性APC切割敏感性位点：
组织蛋白酶B：在Arg-Arg键的羧基侧上切割
组织蛋白酶D具有以下优先切割序列：
其中Xaa＝任何氨基酸残基，亲水＝Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp或Tyr，↓＝切割位点
组织蛋白酶H：Arg-↓-NHMec；Bz-Arg-↓-NhNap；Bz-Arg-↓NHMec；Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec；Pro-Gly-↓-Phe
组织蛋白酶S和F：Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-Xaa
其中Xaa＝任何氨基酸残基
组织蛋白酶V：Z-Phe-Arg-NHMec；Z-Leu-Arg-NHMec；Z-Val-Arg-NHMec
组织蛋白酶O：Z-Phe-Arg-NHMec and Z-Arg-Arg-NHMec
组织蛋白酶C具有以下优先切割序列：
其中Xaa＝任何氨基酸残基，↓＝切割位点
组织蛋白酶E：Arg-X、Glu-X和Arg-Arg
天冬酰胺酰内肽酶：在天冬酰胺残基之后
组织蛋白酶L具有以下优先切割序列：
其中Xaa＝任何氨基酸残基，疏水＝Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp或Tyr，芳族＝Phe、Trp、His或Tyr，↓＝切割位点
在一些实施方案中，该切割敏感性位点是组织蛋白酶B或S敏感性位点。示例性组织蛋白酶B敏感性位点包括但不限于以SEQ ID No:226-615示出的那些。示例性组织蛋白酶S敏感性位点包括但不限于以SEQ ID No:616-1313示出的那些。
在一些实施方案中，这些mRNA癌症疫苗和疫苗接种方法包括编码由一种或多种新表位和一种或多种传统癌症抗原组成的多联癌症抗原的mRNA。在一些实施方案中，除了编码的新表位之外，该mRNA还编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种传统癌症抗原。
在一些实施方案中，该多联抗原编码5至10个癌症肽表位。在还有其他实施方案中，该多联抗原编码25至100个癌症肽表位。在一些实施方案中，这些mRNA癌症疫苗和疫苗接种方法包括基于特定突变的表位或抗原(新表位)和由癌症-种系基因表达的那些表位或抗原(在多个患者体内发现的肿瘤共同的抗原)。在一些实施方案中，这些mRNA癌症疫苗和疫苗接种方法包括一种或多种传统表位或抗原，例如，在传统癌症疫苗中发现的一种或多种表位或抗原。
被选择包含在该多联抗原中的新表位将典型地为高亲和力结合肽。该多联构建体中的新表位可以相同或不同，例如，它们的长度、氨基酸序列或这两者有差别。
在一些实施方案中，接头散布在这些新表位之间。
在一些实施方案中，该疫苗可以是包含多个新表位的多顺反子疫苗、或一种或多种单mRNA疫苗，或它们的组合。
在一些实施方案中，这些mRNA细菌疫苗和疫苗接种方法包括编码由一种或多种细菌抗原组成的多联细菌抗原的mRNA。在一些实施方案中，该mRNA编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种细菌抗原。
免疫增强剂mRNA和感兴趣抗原的组合物
在另一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含至少一种经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，所述mmRNA编码：(i)至少一种感兴趣抗原；以及(ii)当所述至少一种mmRNA施用于受试者时，增强针对所述至少一种感兴趣抗原的免疫应答的至少一种多肽，其中所述mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基。因此，本公开提供了包含至少一种免疫增强剂mRNA和至少一种编码感兴趣抗原的mRNA的组合物，其中单个mRNA构建体可以编码所述一种或多种感兴趣抗原以及增强对所述一种或多种抗原的免疫应答的多肽这两者，或者作为替代，该组合物可以包含两种或更多种单独的mRNA构建体，第一mRNA和第二mRNA，其中第一mRNA编码至少一种感兴趣抗原，并且第二mRNA编码增强对所述一种或多种抗原的免疫应答的多肽(即，第二mRNA包含免疫增强剂)。
在包含编码一种或多种感兴趣抗原的第一mRNA和编码增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽的第二mRNA的那些实施方案中，第一mRNA和第二mRNA可以共同配制在一起(例如，在共同施用之前)，诸如在相同的脂质纳米粒子中共同配制。
在包含编码所述一种或多种感兴趣抗原和增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽这两者的单个mRNA的那些实施方案中，编码该多肽的序列可以在所述mRNA构建体上定位于编码所述感兴趣抗原的序列的上游或下游。例如，编码抗原和免疫刺激性多肽这两者的mRNA构建体的非限制性实例包括编码至少一种突变型KRAS抗原和一种组成型活性STING多肽(例如，编码以SEQ ID NO:107-130中的任一者示出的氨基酸序列)的那些。在一个实施方案中，该组成型活性STING多肽位于该构建体的N-末端处(即，该抗原编码序列的上游)，如以SEQ ID NO:107-118示出。在另一个实施方案中，该组成型活性STING多肽位于该构建体的C-末端处(即，该抗原编码序列的下游)，如以SEQ ID NO:119-130示出。
编码可以与本公开的免疫增强剂mRNA组合使用的感兴趣抗原的各种mRNA(例如，mRNA疫苗)在下面进一步详细描述。
诱导免疫原性细胞死亡的mRNA构建体
在另一个方面，本公开提供了编码诱导免疫原性细胞死亡(诸如坏死性凋亡或细胞焦亡)的多肽的mRNA构建体(例如，mmRNA)。由这些mRNA诱导的免疫原性细胞死亡导致胞质溶胶组分从细胞释放，使得在体内刺激针对该细胞的免疫应答。因此，本发明的mRNA可以用于刺激针对感兴趣细胞(诸如癌症治疗中的肿瘤)的体内免疫应答。编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA可以单独使用，或者作为替代，可以与一种或多种刺激或增强免疫应答性的另外的剂组合使用。此类另外的剂包括刺激适应性免疫(诸如刺激I型干扰素产生)的剂、诱导T细胞激活或致敏的剂，和/或调控一种或多种免疫检查点的剂。此类另外的剂也可以是mRNA，或者作为替代，可以是不同类型的剂，诸如蛋白质、抗体或小分子。在一个实施方案中，该另外的剂是本公开的一种或多种免疫增强剂mRNA构建体。
免疫原性细胞死亡与非免疫原性细胞死亡是可区分开的，因为免疫原性细胞死亡导致细胞内组分从细胞释放到周围环境中，使得这些组分可用于刺激免疫应答。已经鉴定了许多典型地在免疫原性细胞死亡期间释放的细胞内组分，称为“损伤相关分子模式”或DAMP，包括ATP、HMGB1、IL-1a、尿酸、DNA片段、组蛋白和线粒体内容物。DAMP可以在细胞外释放，或者某些DAMP从细胞内部易位至细胞表面(例如，钙网蛋白，其从内质网腔易位至细胞表面)。因此，释放DAMP充当免疫原性细胞死亡的指标。免疫原性细胞死亡的特征还在于刺激促炎细胞因子。
两种类型的免疫原性细胞死亡为坏死性凋亡和细胞焦亡。这些类型的程序性细胞死亡中的每一种都具有使它们彼此区分开并且与细胞凋亡区分开的典型特征，其中细胞凋亡是程序性非免疫原性细胞死亡的一种形式。细胞凋亡的区别特征在于它是半胱天冬酶依赖性的(例如，依赖于起始半胱天冬酶，诸如对于死亡受体诱导的细胞凋亡，依赖于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10，或对于内在触发的细胞凋亡，依赖于半胱天冬酶-9)，并且导致细胞质浓缩和细胞皱缩、质膜起泡(但不丧失质膜完整性)、细胞内钙浓度增加和线粒体外膜透化(MOMP)。重要的是，细胞凋亡不会导致细胞内组分释放到周围环境中，因而被认为是免疫耐受的。相比之下，坏死性凋亡不依赖于半胱天冬酶活性，而是依赖于激酶(称为受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1))的活性。事实上，半胱天冬酶的激活抑制了坏死性凋亡，因为例如激活的半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10使RIPK1失活。RIPK1被激活时与RIPK3相互作用，导致形成坏死体复合物。由坏死性凋亡引起的细胞死亡也依赖于混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)。坏死性凋亡的特征在于细胞塌陷和质膜完整性丧失，包括释放DAMP。细胞焦亡的特征还在于释放DAMP，但与坏死性凋亡的不同之处在于它依赖于gasdermin D(GSDMD)、含有pyrin结构域的NLR家族-3(NLRP3；编码crypyrin)和半胱天冬酶1，以及人中的半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5和小鼠中的半胱天冬酶-11，从而导致对炎性体的诱导。导致质膜破裂和炎症的另外形式的不依赖于半胱天冬酶的免疫原性细胞死亡包括线粒体通透性转换介导的调节性坏死(MPT-RN)、铁死亡、依赖性细胞死亡和NETosis(关于综述，参见例如Linkermann,A.等人，(2014)Nat.Rev.Immunol.14:759-767)。
在一个实施方案中，本发明提供了编码诱导坏死性凋亡的多肽的mRNA。在另一个实施方案中，本发明提供了编码诱导细胞焦亡的多肽的mRNA。在还有其他实施方案中，本发明提供了编码诱导MPT-RN、铁死亡、依赖性细胞死亡或NETosis的多肽的mRNA。
在一个实施方案中，诱导坏死性凋亡的多肽是混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。如实施例22至23中进一步描述的，MLKL构建体诱导坏死性细胞死亡，其特征在于释放DAMP。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码人或小鼠MLKL的氨基酸1-180。在一个实施方案中，该MLKL构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该MLKL构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码MLKL的mRNA构建体或其免疫原性细胞死亡诱导片段的非限制性实例编码人或小鼠MLKL的氨基酸1-180，它们分别包含以SEQ ID NO:1327和1328示出的氨基序列。
在另一个实施方案中，该多肽是受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。如实施例24中进一步描述的，RIPK3构建体诱导坏死性细胞死亡。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码与其自身多聚化(同源寡聚化)的RIPK3多肽。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码与RIPK1二聚化的RIPK3多肽。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3的激酶结构域和RHIM结构域。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3的激酶结构域、RIPK3的RHIM结构域，以及两个FKBP(F>V)结构域。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3多肽(例如，包含RIPK3的激酶结构域和RHIM结构域)和IZ结构域(例如，IZ三聚体)。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK3多肽(例如，包含RIPK3的激酶结构域和RHIM结构域)以及一个或多个EE结构域或RR结构域(例如，2xEE结构域，或2xRR结构域)。此外，编码诱导免疫原性细胞死亡的RIPK3构建体的DNA构建体的结构进一步描述于例如Yatim,N.等人，(2015)Science 350:328-334或Orozco,S.等人，(2014)Cell DeathDiffer.21:1511-1521中，并且可以用于设计合适的RNA构建体。在一个实施方案中，该RIPK3构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该RIPK3构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或5’UTR中。编码RIPK3或其免疫原性细胞死亡诱导片段的的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1329-1344示出的任何氨基酸序列的ORF。
在另一个实施方案中，该多肽是受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码人或小鼠RIPK1多肽的氨基酸1-155。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK1多肽和IZ结构域。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK1多肽和DM结构域。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码RIPK1多肽和一个或多个EE结构域或RR结构域。此外，编码诱导免疫原性细胞死亡的RIPK1构建体的DNA构建体的结构进一步描述于例如Yatim,N.等人，(2015)Science 350:328-334或Orozco,S.等人，(2014)Cell Death Differ.21:1511-1521中，并且可以用于设计合适的RNA构建体。在一个实施方案中，该RIPK1构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该RIPK1构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码RIPK1或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:158-163示出的任何氨基酸序列的ORF。
在另一个实施方案中，该多肽是具有低pI的直接IAP结合蛋白(DIABLO)(也称为SMAC/DIABLO)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。如实施例中所述，DIABLO构建体诱导细胞死亡和细胞因子释放。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型人DIABLO同种型1序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含S126L突变的人DIABLO同种型1序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型1的氨基酸56-239。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型1的氨基酸56-239并包含S126L突变。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型人DIABLO同种型3序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码包含S27L突变的人DIABLO同种型3序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型3的氨基酸56-240。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人DIABLO同种型3的氨基酸56-240并包含S27L突变。在一个实施方案中，该DIABLO构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该DIABLO构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码DIABLO或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:165-172示出的任何氨基酸序列的ORF。
在另一个实施方案中，该多肽是FADD(具有死亡结构域的Fas相关蛋白)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。在一个实施方案中，该FADD构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该FADD构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码FADD或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1345-1351示出的任何氨基酸序列的ORF。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码诱导细胞焦亡的多肽的mRNA。在一个实施方案中，该多肽是gasdermin D(GSDMD)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。在一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型人GSDMD序列。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人GSDMD的氨基酸1-275。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码人GSDMD的氨基酸276-484。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码野生型小鼠GSDMD。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码小鼠GSDMD的氨基酸1-276。在另一个实施方案中，该mRNA构建体编码小鼠GSDMD的氨基酸277-487。在一个实施方案中，该GSDMD构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该GSDMD构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码GSDMD或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQ ID NO:1367-1372示出的任何氨基酸序列。
在另一个实施方案中，该多肽为半胱天冬酶-4或半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。在各种实施方案中，半胱天冬酶-4、-5或-11构建体可以编码(i)全长野生型半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11；(ii)全长半胱天冬酶-4、-5或-11加上IZ结构域；(iii)N末端缺失的半胱天冬酶-4、-5或-11加上IZ结构域；(iv)全长半胱天冬酶-4、-5或-11加上DM结构域；或(v)N末端缺失的半胱天冬酶-4、-5或-11加上DM结构域。N末端缺失形式的半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-11的实例含有氨基酸残基81-377。N末端缺失形式的半胱天冬酶-5的实例含有氨基酸残基137-434。在一个实施方案中，半胱天冬酶-4、-5或-11构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，半胱天冬酶-4、-5或-11构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码半胱天冬酶-4或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1352-1356示出的任何氨基酸序列的ORF。编码半胱天冬酶-5或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1357-1361示出的任何氨基酸序列的ORF。编码半胱天冬酶-11或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例包含具有以SEQ ID NO:1362-1366示出的任何氨基酸序列的ORF。
在另一个实施方案中，该多肽为NLRP3，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。在一个实施方案中，该NLRP3构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该NLRP3构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或5’UTR中。编码NLRP3或其免疫原性细胞死亡诱导片段的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQID NO:1373或1374示出的ORF氨基酸序列。
在另一个实施方案中，该多肽是含有CARD的细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC/PYCARD)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段，诸如Pyrin结构域。在一个实施方案中，该多肽为Pyrin B30.2结构域。在另一个实施方案中，该多肽为包含V726A突变的Pyrin B30.2结构域。在一个实施方案中，该ASC/PYCARD或Pyrin构建体包含一个或多个miR结合位点。在一个实施方案中，该ASC/PYCARD或Pyrin构建体包含miR122结合位点、miR142-3p结合位点或这两个结合位点，例如在3’UTR或在5’UTR中。编码Pyrin B30.2结构域的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQ ID NO:1375或1376示出的ORF氨基酸序列。编码ASC的mRNA构建体的非限制性实例编码以SEQ ID NO:1377或1378示出的ORF氨基酸序列。
编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的本发明的mRNA可以与刺激炎症和/或免疫反应并且/或者调节免疫应答性的其他剂组合使用。对于针对癌细胞的免疫应答有效杀死癌细胞，已经描述了许多事件，这些事件必须以逐步的方式发生并且允许迭代地进行和扩展。该过程一直以来被称为癌症免疫循环(参见例如Chen,D.S.和Mellman,I.(2013)Immunity,39:1-10)。这些相继的事件涉及：(i)癌细胞抗原释放；(ii)癌症抗原呈递(例如，通过树突状细胞或其他抗原呈递细胞)；(iii)T细胞致敏和激活；(iv)T细胞(例如，CTL)运输至肿瘤；(v)T细胞浸润到肿瘤中；(vi)T细胞识别癌细胞；以及(vii)杀死癌细胞。
因此，本发明的另一个方面涉及可以与本发明的mRNA组合使用的另外的剂，该mRNA编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽，以便促进或增强针对靶向杀死的细胞的细胞抗原的免疫应答。此类另外的剂可以刺激或促进炎症应答和/或免疫应答。除此之外或作为替代，此类另外的剂可以调节免疫应答性，例如通过充当免疫检查点调控剂。另外的剂还可以是mRNA，例如，具有如本文针对mRNA构建体所述的结构特性(例如，经修饰的核碱基、5’帽、5’UTR、3’UTR、一个或多个miR结合位点、多聚腺苷酸尾，如本文所述)。作为替代，另外的剂可以是非mRNA药剂，诸如蛋白质、抗体或小分子。
在一个实施方案中，另外的剂增强免疫应答，例如，诱导适应性免疫(例如，通过刺激I型干扰素产生)、刺激炎症应答、刺激NFkB信号传导和/或刺激树突状细胞(DC)动员。在一个实施方案中，诱导适应性免疫的剂为I型干扰素。例如，包含I型干扰素的药物组合物可以用作该剂。作为替代，在另一个实施方案中，诱导适应性免疫的另外的剂是刺激I型干扰素产生的剂。刺激I型干扰素产生的剂的非限制性实例包括STING、IRF1、IRF3、IRF5、IRF6、IRF7和IRF8。刺激炎症应答的剂的非限制性实例包括STAT1、STAT2、STAT4、STAT6、NFAT和C/EBPb。刺激NFkB信号传导的剂的非限制性实例包括IKKβ、c-FLIP、RIPK1、IL-27、ApoF和PLP。刺激DC动员的剂的非限制性实例为FLT3。又一种增强免疫应答的剂为DIABLO(SMAC/DIABLO)。
在一个实施方案中，增强免疫应答的剂是本公开的免疫增强剂mRNA构建体，其非限制性实例包括编码STING、IRF3、IRF7、STAT6、Myd88、Btk(E41K)、TAK-TAB1、DIABLO(SMAC/DIABLO)、TRAM(TICAM2)多肽或自激活半胱天冬酶-1多肽的构建体，组成型活性IKKβ、组成型活性IKKα、c-FLIP和RIPK1 mRNA构建体。
在另一个实施方案中，该另外的剂诱导T细胞激活或致敏。例如，诱导T细胞激活或致敏的另外的剂可以是细胞因子或趋化因子。诱导T细胞激活或致敏的细胞因子或趋化因子的非限制性实例包括IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20和CCL21。在一个实施方案中，该剂是包含细胞因子或趋化因子的药物组合物。在另一个实施方案中，该剂是诱导产生细胞因子或趋化因子的剂。在另一个实施方案中，该剂是编码细胞因子或趋化因子的mRNA构建体。在另一个实施方案中，该剂是编码诱导趋化因子或细胞因子的多肽的mRNA构建体。
在另一个实施方案中，该另外的剂调控免疫检查点。本领域已经描述了各种免疫检查点抑制剂，包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂。免疫检查点的其他调控剂可以靶向OX-40、OX-40L或ICOS。在一个实施方案中，调控免疫检查点的剂为抗体。在另一个实施方案中，调控免疫检查点的剂为蛋白质或小分子调控剂。在另一个实施方案中，该剂(诸如mRNA)编码免疫检查点的抗体调控剂。
在一个实施方案中，调控免疫检查点的另外的剂靶向PD-1。靶向PD-1的免疫治疗剂的非限制性实例包括派姆单抗、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特珠单抗、纳武单抗、伊匹单抗、匹利珠单抗(pidilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、MEDI0680和PDR001、AMP-224、PF-06801591、BGB-A317、REGN2810、SHR-1210、TSR-042、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和affimer。
在一个实施方案中，调控免疫检查点的另外的剂靶向PD-L1。靶向PD-L1的免疫治疗剂的非限制性实例包括阿维鲁单抗(MSB0010718C)、阿特珠单抗(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)和BMS936559。
在一个实施方案中，调控免疫检查点的另外的剂靶向CTLA-4。靶向CTLA-4的免疫治疗剂的非限制性实例包括伊匹单抗、替西木单抗和AGEN1884。
在一个实施方案中，调控免疫检查点的另外的剂靶向OX-40或OX-40L。在一个实施方案中，靶向OX-40或OX-40L的剂是编码Fc-OX-40L多肽的mRNA构建体。在还有其他实施方案中，靶向OX-40或OX-40L的剂是免疫刺激性激动剂抗OX-40或OX-40L抗体，本领域已知的实例包括MEDI6469(激动剂抗OX40抗体)和MOXR0916(激动剂抗OX40抗体)。
在又一个实施方案中，调控免疫检查点的另外的剂是ICOS途径激动剂。
mRNA构建体组分
mRNA可以是天然存在或非天然存在的mRNA。mRNA可以包含一个或多个经修饰的核碱基、核苷或核苷酸，如下所述，在这种情况下，它可以称为“经修饰的mRNA”或“mmRNA”。如本文所述，“核苷”被定义为含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)的组合的化合物。如本文所述，“核苷酸”被定义为包含磷酸酯基团的核苷。
mRNA可以包含5’非翻译区(5’-UTR)、3’非翻译区(3’-UTR)和/或编码区(例如，开放阅读框)。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21示出。在这些构建体中使用的另一个示例性5’UTR以SEQ ID NO:1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。mRNA可以包含任何合适数量的碱基对，包括数十个(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个)、数百个(例如，200、300、400、500、600、700、800或900个)或数千个(例如，1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个)碱基对。任何数目(例如，全部、一些或没有)核碱基、核苷或核苷酸可以是典型种类的类似物，经取代、修饰或以其他方式非天然存在。在某些实施方案中，可以修饰特定核碱基类型中的全部核碱基。
在一些实施方案中，如本文所述的mRNA可以包含5’帽结构、链终止核苷酸，任选地包含Kozak序列(也称为Kozak共有序列)、茎环、多聚腺苷酸序列和/或多聚腺苷酸化信号。
5’帽结构或帽种类是包含通过接头连接的两个核苷部分的化合物，并且可以选自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽类似物、或抗反向帽类似物(ARCA)。帽种类可以包含一个或多个经修饰的核苷和/或接头部分。例如，天然的mRNA帽可以包含鸟嘌呤核苷酸和在7位甲基化的鸟嘌呤(G)核苷酸，它们在其5’位通过三磷酸酯键连接，例如m7G(5’)ppp(5’)G，通常写为m7GpppG。帽种类也可以是抗反向帽类似物。可能的帽种类的非限制性列表包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m2 7,O3′GpppG、m2 7,O3′GppppG、m2 7,O2′GppppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m2 7,O3′GpppG、m2 7,O3′GppppG和m2 7,O2′GppppG。
mRNA可以替代地或另外包括链终止核苷。例如，链终止核苷可以包括在其糖基团的2’位置和/或3’位置脱氧的那些核苷。这些种类可以包括3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶和2',3'-双脱氧核苷，诸如2',3’-双脱氧腺苷、2',3'-双脱氧尿苷、2',3'-双脱氧胞嘧啶、2',3'-双脱氧鸟苷和2',3'-双脱氧胸腺嘧啶。在一些实施方案中，将链终止核苷酸(例如在3’-末端处)掺入mRNA中可以导致mRNA稳定化，如例如在国际专利公布号WO 2013/103659中所述。
mRNA可以替代地或另外包括茎环，诸如组蛋白茎环。茎环可以包括2、3、4、5、6、7、8个或更多个核苷酸碱基对。例如，茎环可以包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可以位于mRNA的任何区域中。例如，茎环可以位于非翻译区(5’非翻译区或3’非翻译区)、编码区或者多聚腺苷酸序列或尾部中、之前或之后。在一些实施方案中，茎环可以影响mRNA的一种或多种功能，诸如翻译起始、翻译效率和/或转录终止。
mRNA可以替代地或另外包括多聚腺苷酸序列和/或多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸序列可以完全或大部分由腺嘌呤核苷酸或者其类似物或衍生物组成。多聚腺苷酸序列可以是位于mRNA的3’非翻译区附近的尾部。在一些实施方案中，多聚腺苷酸序列可以影响mRNA的核输出、翻译和/或稳定性。
mRNA可以替代地或另外包括微RNA结合位点。
在一些实施方案中，mRNA是包含第一编码区和第二编码区的双顺反子mRNA，其具有包含允许在第一编码区与第二编码区之间启动内部翻译的内部核糖体进入位点(IRES)序列的间插序列，或具有编码自切割肽(诸如2A肽)的间插序列。IRES序列和2A肽典型地用于增强由相同的载体表达多种蛋白质。多种IRES序列是本领域已知和可用的，并且可加以使用，包括例如脑心肌炎病毒IRES。
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以包括编码自切割肽的序列。该自切割肽可以是、但不限于2A肽。多种2A肽是本领域已知和可用的，并且可使用，包括例如口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A病毒2A肽、明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A肽和猪捷申病毒-1 2A肽。几种病毒使用2A肽来通过核糖体跳跃由一种转录物产生两种蛋白质，使得正常的肽键在2A肽序列处受损，导致从一个翻译事件产生两种不连续的蛋白质。作为一个非限制性实例，该2A肽可以具有蛋白质序列：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:24)、其片段或变体。在一个实施方案中，该2A肽在最后的甘氨酸和最后的脯氨酸之间切割。作为另一个非限制性实例，本公开的多核苷酸可以包括编码具有蛋白质序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:24)片段或其变体的2A肽的多核苷酸序列。编码该2A肽的多核苷酸序列的一个实例是：GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQID NO:25)。在一个说明性实施方案中，2A肽由以下序列编码：5’-TCCGGACTCAGATCCGGGGATCTCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTC-3’(SEQ ID NO:26)。该2A肽的多核苷酸序列可以通过本文所述的方法修饰或进行密码子优化并且/或者是本领域已知的。
在一个实施方案中，该序列可以用于分离两种或更多种感兴趣多肽的编码区。作为一个非限制性实例，编码F2A肽的序列可以介于第一编码区A与第二编码区B之间(A-F2Apep-B)。存在F2A肽导致切割F2A肽序列末端处的甘氨酸与脯氨酸之间的一个长蛋白(NPGP被切割以产生NPG和P)，从而产生单独的蛋白质A(具有连接的21个氨基酸的F2A肽，以NPG结束)和单独的蛋白质B(具有连接1个氨基酸P的F2A肽)。同样地，对于其他2A肽(P2A、T2A和E2A)，长蛋白中存在该肽导致2A肽序列末端处的甘氨酸与脯氨酸之间的切割(NPGP被切割以产生NPG和P)。蛋白质A和蛋白质B可以是相同或不同的感兴趣肽或多肽。在具体实施方案中，蛋白质A是诱导免疫原性细胞死亡的多肽，并且蛋白质B是刺激炎症应答和/或免疫应答并且/或者调节免疫应答性的另一种多肽(如下文进一步描述的)。
经修饰的mRNA
虽然在某些实施方案中，本公开的mRNA完全包含未经修饰的核碱基、核苷或核苷酸，但在一些实施方案中，本公开的mRNA包含一个或多个经修饰的核碱基、核苷或核苷酸(称为“经修饰的mRNA”或“mmRNA”)。在一些实施方案中，与参考未经修饰的mRNA相比，经修饰的mRNA可以具有有用的特性，包括增强的稳定性、细胞内保留、增强的翻译，和/或缺乏对引入mRNA的细胞的先天免疫应答的实质性诱导。因此，使用经修饰的mRNA不但可以增强蛋白质产生的效率、核酸的细胞内保留，而且可以具有降低的免疫原性。
在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3或4个)不同的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个)不同的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，相对于对应的未经修饰的mRNA，经修饰的mRNA可以在引入mRNA的细胞中具有降低的降解。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖胞苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖胞苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k2C)、α-硫代-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2′-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2’-F-阿糖胞苷、2’-F-胞苷和2’-OH-阿糖胞苷。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括α-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2′-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2’-F-阿糖腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-阿糖腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括α-硫代-鸟苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、不完全修饰的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2, 7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1,2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2’-F-阿糖鸟苷和2’-F-鸟苷。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷，2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷，或2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是N1-甲基假尿苷(m1ψ)，并且本公开的mRNA被N1-甲基假尿苷(m1ψ)完全修饰。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)代表该mRNA中75％至100％的尿嘧啶。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)代表该mRNA中100％的尿嘧啶。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，该经修饰的核碱基为1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷或α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，该mRNA包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，该mRNA包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，该mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，该mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，该mRNA包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，该mRNA包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，该mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，该mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，该mRNA包含2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，该mRNA包含2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，该mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，该mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在某些实施方案中，本公开的mRNA被一致地修饰(即，完全修饰、遍及整个序列修饰)用于特定的修饰。例如，可以用5-甲基-胞苷(m5C)一致地修饰mRNA，这意味着该mRNA序列中的所有胞嘧啶残基都被5-甲基-胞苷(m5C)替换。类似地，本公开的mRNA可以通过用诸如上文示出的经修饰残基替换，来对序列中存在的任何类型的核苷残基进行一致修饰。
在一些实施方案中，本公开的mRNA可以在编码区(例如，编码多肽的开放阅读框)中修饰。在其他实施方案中，mRNA可以在编码区之外的区域中修饰。例如，在一些实施方案中，提供了5′-UTR和/或3′-UTR，其中任一者或两者可以独立地含有一个或多个不同的核苷修饰。在此类实施方案中，核苷修饰也可以存在于编码区中。
可以存在于本公开的mmRNA中的核苷修饰及其组合的实例包括但不限于下列PCT专利申请公布中所述的那些：WO2012045075、WO2014081507、WO2014093924、WO2014164253和WO2014159813。
本公开的mmRNA可以包括对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。这些组合可以包括本文所述的任何一种或多种修饰。
经修饰核苷和经修饰核苷组合的实例在下面的表1和表2中提供。经修饰核苷酸的这些组合可以用于形成本公开的mmRNA。在某些实施方案中，可以用经修饰核苷来部分或完全地取代本公开的mRNA的天然核苷酸。作为一个非限制性实例，天然核苷酸尿苷可以被本文所述的经修饰核苷取代。在另一个非限制性实例中，天然核苷尿苷可以被本文所公开的经修饰核苷中的至少一种部分取代(例如，天然尿苷的约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％)。
表1.核苷修饰的组合
表2.经修饰核苷及其组合
根据本公开，可以将本公开的多核苷酸合成为包含表1或表2的组合修饰或单个修饰。
在列出单个修饰的情况下，所列出的核苷或核苷酸代表已被修饰的A、U、G或C核苷酸或核苷的100％。在列出百分比的情况下，这些百分比代表存在的A、U、G或C三磷酸酯总量中的特定A、U、G或C核碱基三磷酸酯的百分比。例如，以下组合：25％5-氨基烯丙基-CTP+75％CTP/25％5-甲氧基-UTP+75％UTP是指这样的多核苷酸，其中25％的胞嘧啶三磷酸酯为5-氨基烯丙基-CTP，而75％的胞嘧啶为CTP；25％的尿嘧啶为5-甲氧基UTP，而75％的尿嘧啶为UTP。在未列出经修饰的UTP的情况下，在该多核苷酸中发现的那些核苷酸的100％位点处使用天然存在的ATP、UTP、GTP和/或CTP。在该实例中，所有的GTP核苷酸和ATP核苷酸均未经修饰。
可以对本公开的mRNA或其区域进行密码子优化。密码子优化方法是本领域已知的，并且可以用于多种目的：匹配宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠、偏置GC含量以增大mRNA稳定性或减少二级结构、最大程度减少可能破坏基因构建或表达的串联重复序列密码子或碱基列(base run)、定制转录和翻译控制区、插入或移除蛋白质运输序列、在编码的蛋白质中移除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)，添加、移除或改组蛋白质结构域，插入或删除限制性位点、修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点、调节翻译速率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠，或者减少或消除该多核苷酸内部带来问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务在本领域中是已知的；非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(Menlo Park,CA)和/或专有方法的服务。在一个实施方案中，使用优化算法来优化该mRNA序列，例如，以优化哺乳动物细胞中的表达或增强mRNA稳定性。
在某些实施方案中，本公开包括与本文所述的任何多核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多核苷酸。
本公开的mRNA可以通过本领域可获得的方法产生，包括但不限于体外转录(IVT)方法和合成方法。可以利用酶促(IVT)方法、固相方法、液相方法、组合合成方法、小区域合成方法和连接方法。在一个实施方案中，使用IVT酶促合成方法制备mRNA。通过IVT制备多核苷酸的方法是本领域已知的，并且描述于国际申请PCT/US2013/30062中，其内容全文以引用方式并入本文。因此，本公开还包括多核苷酸，例如DNA、构建体(例如，质粒)和载体(例如，病毒载体)，其可以用于体外转录本文所述的mRNA。
可以在合成期间或合成后将非天然修饰的核碱基引入到多核苷酸(例如，mRNA)中。在某些实施方案中，修饰可以位于核苷间键、嘌呤碱基或嘧啶碱基、或糖上。在具体实施方案中，可以使用化学合成或使用聚合酶，在多核苷酸链的末端处或多核苷酸链中的任何其他位置引入修饰。经修饰核酸的实例及其合成公开于PCT申请号PCT/US2012/058519中。经修饰多核苷酸的合成也描述于Verma和Eckstein，Annual Review of Biochemistry，第76卷，99-134(1998)中。
酶促连接方法或化学连接方法可以用于将多核苷酸或其区域与不同功能部分缀合，所述功能部分诸如靶向剂或递送剂、荧光标记、液体、纳米粒子等。多核苷酸和经修饰多核苷酸的缀合物在Goodchild,Bioconjugate Chemistry，第1卷第3期，165-187(1990)中进行了综述。
微RNA(miRNA)结合位点
本公开的多核苷酸可以包括调节元件，例如，微RNA(miRNA)结合位点、转录因子结合位点、结构化mRNA序列和/或基序、工程改造以充当内源性核酸结合分子的假受体的人工结合位点，以及它们的组合。在一些实施方案中，包含此类调节元件的多核苷酸被称为包含“传感器序列”。传感器序列的非限制性实例描述于美国公布2014/0200261中，其内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))包含编码感兴趣多肽的开放阅读框(ORF)，并且还包含一个或多个miRNA结合位点。包含或掺入一个或多个miRNA结合位点基于天然存在的miRNA的组织特异性和/或细胞类型特异性表达，提供对本公开的多核苷酸的调节，进而调节由其编码的多肽。
miRNA(例如，天然存在的miRNA)为长19至25个核苷酸的非编码RNA，其结合多核苷酸并通过降低稳定性或通过抑制该多核苷酸的翻译来下调基因表达。miRNA序列包含“种子”区域，即，成熟miRNA的2至8位区域中的序列。miRNA种子可以包含成熟miRNA的2至8或2至7位。在一些实施方案中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2至8)，其中对应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺苷(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2至7)，其中对应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺苷(A)。参见例如Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Bartel DP；Mol Cell.2007年7月6日；27(1):91-105。可以进行对靶细胞或靶组织的miRNA谱分析，以确定细胞或组织中存在还是不存在miRNA。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))包含一个或多个微RNA结合位点、微RNA靶序列、微RNA互补序列或微RNA种子互补序列。此类序列可以对应于任何已知的微RNA，例如，与任何已知的微RNA具有互补性，这些微RNA诸如美国公布US2005/0261218和美国公布US2005/0059005中教导的那些，这些公布中每一者的内容全文以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“微RNA(miRNA或miR)结合位点”是指多核苷酸内(例如，DNA内或RNA转录物内，包括5′UTR和/或3′UTR中)对miRNA的所有部分或一个区域具有足够大的互补性，以与该miRNA相互作用、缔合或结合的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码感兴趣多肽的ORF，并且还包含一个或多个miRNA结合位点。在示例性实施方案中，该多核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))的5'UTR和/或3'UTR包含一个或多个miRNA结合位点。
与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的多核苷酸调节(例如，miRNA介导的翻译阻遏或多核苷酸降解)的互补程度。在本公开的示例性方面，与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的多核苷酸降解(例如，miRNA指导的RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的mRNA切割)的互补程度。该miRNA结合位点可以与例如19至25个核苷酸的miRNA序列、19至23个核苷酸的miRNA序列或22个核苷酸的miRNA序列具有互补性。该miRNA结合位点可以仅与miRNA的一部分互补，例如与天然存在的miRNA序列的全长的小于1、2、3或4个核苷酸的一部分互补。当期望的调节是mRNA降解时，优选的是完全或完整互补性(例如，天然存在的miRNA的长度上的所有部分或相当大一部分的完全互补性或完整互补性)。
在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有互补性(例如，部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，该miRNA结合位点包括与miRNA种子序列完全互补的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有互补性(例如，部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，该miRNA结合位点包括与miRNA序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点除1、2或3个核苷酸取代、末端添加和/或截短之外，与miRNA序列具有完全互补性。
在一些实施方案中，该miRNA结合位点与对应的miRNA具有相同的长度。在其他实施方案中，该miRNA结合位点是比5’末端、3’末端或这两者处的对应miRNA短的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个核苷酸。在还有其他实施方案中，该微RNA结合位点比5’末端、3’末端或这两者处的对应微RNA短两个核苷酸。比对应的miRNA短的miRNA结合位点仍然能够降解掺入了一个或多个所述miRNA结合位点的mRNA或阻止该mRNA翻译。
在一些实施方案中，该miRNA结合位点结合对应的成熟miRNA，该成熟miRNA为含有Dicer的活性RISC的一部分。在另一个实施方案中，该miRNA结合位点与RISC中对应的miRNA结合将含有该miRNA结合位点的mRNA降解或阻止该mRNA翻译。在一些实施方案中，该miRNA结合位点与miRNA具有足够的互补性，使得包含该miRNA的RISC复合物切割包含该miRNA结合位点的多核苷酸。在其他实施方案中，该miRNA结合位点具有不完全的互补性，使得包含该miRNA的RISC复合物诱导包含该miRNA结合位点的多核苷酸中的不稳定性。在另一个实施方案中，该miRNA结合位点具有不完全的互补性，使得包含该miRNA的RISC复合物阻遏包含该miRNA结合位点的多核苷酸的转录。
在一些实施方案中，该miRNA结合位点具有来自对应miRNA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个错配。
在一些实施方案中，该miRNA结合位点具有至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个或至少约21个与对应miRNA的至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个或至少约21个连续核苷酸互补的连续核苷酸。
通过将一个或多个miRNA结合位点工程改造到本公开的多核苷酸中，该多核苷酸可以被靶向以便降解或降低翻译，条件是所考虑的该miRNA是可得的。这可以减少多核苷酸递送时的脱靶效应。例如，如果本公开的多核苷酸不打算递送至某组织或细胞，但最终却到达了所述组织或细胞，则如果该组织或细胞中富含的miRNA的一个或多个结合位点被工程改造到该多核苷酸的5′UTR和/或3′UTR中，则该miRNA可以抑制感兴趣基因的表达。
相反，这些miRNA结合位点可以从它们天然存在于其中的多核苷酸序列中移除，以便增加特定组织中的蛋白质表达。例如，可以从多核苷酸中移除特定miRNA的结合位点，以改善含有该miRNA的组织或细胞中的蛋白质表达。
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含5'UTR和/或3′UTR中的至少一个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂导向特定细胞，诸如但不限于正常细胞和/或癌性细胞。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含5'-UTR和/或3′-UTR中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂导向特定细胞，诸如但不限于正常细胞和/或癌性细胞。
可以通过引入或移除一个或多个miRNA结合位点(例如，一个或多个不同的miRNA结合位点)来实现对多种组织中的表达的调节。是否移除或插入miRNA结合位点的决定可以基于miRNA表达模式和/或它们在发育中的组织和/或细胞和/或疾病中的分布来做出。已经报道了对miRNA、miRNA结合位点及其表达模式和在生物学中的作用的鉴定(例如，Bonauer等人，Curr Drug Targets 2010 11:943-949；Anand和Cheresh，Curr Opin Hematol 201118:171-176；Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011年12月20日，doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009 136:215-233；Landgraf等人，Cell,2007129:1401-1414；Gentner和Naldini，Tissue Antigens.201280:393-403，及其中的所有参考文献；这些文献中的每一者全文以引用方式并入本文)。
miRNA和miRNA结合位点可以对应于任何已知序列，包括美国公布号2014/0200261、2005/0261218和2005/0059005中所述的非限制性实例，这些公布中每一者全文以引用方式并入本文。
已知miRNA调节mRNA从而调节蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
具体来说，已知miRNA在免疫细胞(也称为造血细胞)中差异表达，这些免疫细胞诸如抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等。免疫细胞特异性miRNA参与免疫原性、自身免疫性、对感染的免疫应答、炎症，以及基因疗法和组织/器官移植之后的不需要的免疫应答。免疫细胞特异性miRNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和细胞凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146仅仅在免疫细胞中表达，特别是在骨髓树突状细胞中含量丰富。已经证明，通过将miR-142结合位点添加到多核苷酸的3′-UTR，可以关闭对该多核苷酸的免疫应答，从而使组织和细胞中的基因转移更加稳定。miR-142有效地降解抗原呈递细胞中的外源性多核苷酸并阻抑转导细胞的细胞毒性消除(例如，Annoni A等人，blood,2009,114,5152-5161；Brown BD等人，Nat med.2006,12(5),585-591；Brown BD等人，blood,2007,110(13):4144-4152，这些文献中的每一者全文以引用方式并入本文)。
抗原介导的免疫应答可以指由外来抗原触发的免疫应答，这些外来抗原在进入生物体时被抗原呈递细胞加工并展示在抗原呈递细胞的表面上。T细胞可以识别呈递的抗原并诱导表达该抗原的细胞的细胞毒性消除。
将miR-142结合位点引入到本公开的多核苷酸的5'UTR和/或3′UTR中可以通过miR-142介导的降解选择性地阻遏抗原呈递细胞中的基因表达，从而限制抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)中的抗原呈递，由此防止在递送该多核苷酸之后出现抗原介导的免疫应答。该多核苷酸随后在靶组织或靶细胞中稳定表达，而不触发细胞毒性消除。
在一个实施方案中，已知在免疫细胞(特别是抗原呈递细胞)中表达的miRNA的结合位点可以被工程改造到本公开的多核苷酸中，以通过miRNA介导的RNA降解阻抑该多核苷酸在抗原呈递细胞中的表达，从而压制抗原介导的免疫应答。该多核苷酸的表达在不表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中维持。例如，在一些实施方案中，为了防止针对肝脏特异性蛋白的免疫原性反应，可以移除任何miR-122结合位点并且可以将miR-142(和/或mirR-146)结合位点工程改造到本公开的多核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中。
为了进一步驱动APC和巨噬细胞中的选择性降解和阻抑，本公开的多核苷酸可以在5'UTR和/或3'UTR中单独地或与miR-142结合位点和/或miR-146结合位点组合包含另外的负调节元件。作为一个非限制性实例，该另外的负调节元件为组成型衰变元件(CDE)。
免疫细胞特异性miRNA包括但不限于hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-1-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p,miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p,、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p、、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。此外，可以在免疫细胞中通过微阵列杂交和切片机分析鉴定新型miRNA(例如，Jima DD等人，Blood,2010,116:e118-e127；Vaz C等人，BMC Genomics,2010,11,288，这些文献中每一者的内容全文以引用方式并入本文。)
已知在肝脏中表达的miRNA包括但不限于miR-107、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1228-3p、miR-1228-5p、miR-1249、miR-129-5p、miR-1303、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-152、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-296-5p、miR-557、miR-581、miR-939-3p和miR-939-5p。可以将来自任何肝脏特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在肝脏中的表达。肝脏特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
已知在肺中表达的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-7a-3p、let-7a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-127-3p、miR-127-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-130b-3p、miR-130b-5p、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-18b-3p、miR-18b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-296-3p、miR-296-5p、miR-32-3p、miR-337-3p、miR-337-5p、miR-381-3p和miR-381-5p。可以将来自任何肺特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在肺中的表达。肺特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
已知在心脏中表达的miRNA包括但不限于miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-186-3p、miR-186-5p、miR-208a、miR-208b、miR-210、miR-296-3p、miR-320、miR-451a、miR-451b、miR-499a-3p、miR-499a-5p、miR-499b-3p、miR-499b-5p、miR-744-3p、miR-744-5p、miR-92b-3p和miR-92b-5p。可以将来自任何心脏特异性微RNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在心脏中的表达。心脏特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
已知在神经系统中表达的miRNA包括但不限于miR-124-5p、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1271-3p、miR-1271-5p、miR-128、miR-132-5p、miR-135a-3p、miR-135a-5p、miR-135b-3p、miR-135b-5p、miR-137、miR-139-5p、miR-139-3p、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-153、miR-181c-3p、miR-181c-5p、miR-183-3p、miR-183-5p、miR-190a、miR-190b、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR-30c-5p、miR-30d-3p、miR-30d-5p、miR-329、miR-342-3p、miR-3665、miR-3666、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-383、miR-410、miR-425-3p、miR-425-5p、miR-454-3p、miR-454-5p、miR-483、miR-510、miR-516a-3p、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-571、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-802、miR-922、miR-9-3p和miR-9-5p。神经系统中富含的miRNA还包括在神经元中特异性表达的那些，包括但不限于miR-132-3p、miR-132-3p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-320b、miR-320e、miR-323a-3p、miR-323a-5p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-922，以及在神经胶质细胞中特异性表达的那些，包括但不限于miR-1250、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-219-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-3065-3p、miR-3065-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-338-5p和miR-657。可以将来自任何CNS特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在神经系统中的表达。神经系统特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
已知在胰腺中表达的miRNA包括但不限于miR-105-3p、miR-105-5p、miR-184、miR-195-3p、miR-195-5p、miR-196a-3p、miR-196a-5p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-30a-3p、miR-33a-3p、miR-33a-5p、miR-375、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-493-3p、miR-493-5p和miR-944。可以将来自任何胰腺特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在胰腺中的表达。胰腺特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
已知在肾脏中表达的miRNA包括但不限于miR-122-3p、miR-145-5p、miR-17-5p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-204-3p、miR-204-5p、miR-210、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-296-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR30c-5p、miR-324-3p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-363-3p、miR-363-5p和miR-562。可以将来自任何肾脏特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在肾脏中的表达。肾脏特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
已知在肌肉中表达的miRNA包括但不限于let-7g-3p、let-7g-5p、miR-1、miR-1286、miR-133a、miR-133b、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-188-3p、miR-188-5p、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-25-3p和miR-25-5p。可以将来自任何肌肉特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在肌肉中的表达。肌肉特异性miRNA结合位点可以单独工程改造，或进一步与本公开的多核苷酸中的免疫细胞(例如，APC)miRNA结合位点组合。
miRNA也在不同类型的细胞中差异表达，这些细胞诸如但不限于内皮细胞、上皮细胞和脂肪细胞。
已知在内皮细胞中表达的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-100-3p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-101-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1236-3p、miR-1236-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19a-5p、miR-19b-1-5p、miR-19b-2-5p、miR-19b-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-217、miR-210、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-296-5p、miR-361-3p、miR-361-5p、miR-421、miR-424-3p、miR-424-5p、miR-513a-5p、miR-92a-1-5p、miR-92a-2-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p和miR-92b-5p。在内皮细胞中根据深度测序分析发现了许多新型miRNA(例如，Voellenkle C等人，RNA,2012,18,472-484，其全文以引用方式并入本文)。可以将来自任何内皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在内皮细胞中的表达。
已知在上皮细胞中表达的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-1246、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-338-3p、miR-429、miR-451a、miR-451b、miR-494、miR-802和miR-34a、miR-34b-5p、miR-34c-5p、miR-449a、miR-449b-3p、呼吸道纤毛上皮细胞特异性miR-449b-5p、let-7家族、miR-133a、miR-133b、肺上皮细胞特异性miR-126、miR-382-3p、肾上皮细胞特异性miR-382-5p和角膜上皮细胞特异性miR-762。可以将来自任何上皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点引入本公开的多核苷酸或从本公开的多核苷酸移除，以调节该多核苷酸在这些上皮细胞中的表达。
此外，胚胎干细胞富含一大群miRNA，从而控制干细胞自我更新以及各种细胞谱系的发育和/或分化，所述细胞谱系诸如神经细胞、心脏细胞、造血细胞、皮肤细胞、成骨细胞和肌肉细胞(例如，Kuppusamy KT等人，Curr.Mol Med,2013,13(5),757-764；Vidigal JA和Ventura A，Semin Cancer Biol.2012,22(5-6),428-436；Goff LA等人，PLoS One,2009,4:e7192；Morin RD等人，Genome Res,2008,18,610-621；Yoo JK等人，Stem Cells Dev.2012,21(11),2049-2057，这些文献中的每一者全文以引用方式并入本文)。胚胎干细胞中富含的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-a-3p、let-7a-5p、let7d-3p、let-7d-5p、miR-103a-2-3p、miR-103a-5p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-1246、miR-1275、miR-138-1-3p、miR-138-2-3p、miR-138-5p、miR-154-3p、miR-154-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-290、miR-301a-3p、miR-301a-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-302e、miR-367-3p、miR-367-5p、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-373、miR-380-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-486-5p、miR-520c-3p、miR-548e、miR-548f、miR-548g-3p、miR-548g-5p、miR-548i、miR-548k、miR-548l、miR-548m、miR-548n、miR-548o-3p、miR-548o-5p、miR-548p、miR-664a-3p、miR-664a-5p、miR-664b-3p、miR-664b-5p、miR-766-3p、miR-766-5p、miR-885-3p、miR-885-5p,miR-93-3p、miR-93-5p、miR-941,miR-96-3p、miR-96-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。许多预测的新型miRNA在人胚胎干细胞中通过深度测序而被发现(例如，Morin RD等人，Genome Res,2008,18,610-621；Goff LA等人，PLoS One,2009,4:e7192；Bar M等人，Stem cells,2008,26,2496-2505，这些文献中每一者的内容全文以引用方式并入本文)。
在一个实施方案中，胚胎干细胞特异性miRNA的结合位点可以包含在本公开的多核苷酸的3'UTR中或从其中移除，以调控胚胎干细胞的发育和/或分化、抑制干细胞在退行性病症(例如，退行性疾病)下的衰老，或刺激处于疾病状况下的干细胞(例如，癌症干细胞)的衰老和细胞凋亡。
进行了许多miRNA表达研究以分析miRNA在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异表达。一些miRNA在某些癌细胞中异常地过表达，另一些miRNA则低表达。例如，miRNA在下列细胞或病症中差异表达：癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和胰腺疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结肠直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌症阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺部疾病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳腺癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)、白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563)，这些专利中每一者的内容全文以引用方式并入本文。
作为一个非限制性实例，可以从本公开的多核苷酸的3'UTR移除在某些癌细胞和/或肿瘤细胞中过表达的miRNA的miRNA结合位点，从而恢复癌细胞中被这些过表达的miRNA阻抑的表达，因此改善对应的生物学功能，例如，转录刺激和/或阻遏、细胞周期停滞、细胞凋亡和细胞死亡。其中miRNA表达未被上调的正常细胞和正常组织将保持不受影响。
miRNA还可以调节复杂的生物过程，诸如血管生成(例如，miR-132)(Anand和Cheresh，Curr Opin Hematol 2011 18:171-176)。在本公开的多核苷酸中，可以移除或引入参与此类过程的miRNA结合位点，以便使多核苷酸的表达适应生物学相关的细胞类型或相关的生物过程。在该背景下，本公开的多核苷酸被定义为营养缺陷型多核苷酸。
在一些实施方案中，可以通过将miRNA结合位点掺入编码本公开的多肽的mRNA中来改变该多肽的治疗窗和/或差异表达(例如，组织特异性表达)。在一个实例中，mRNA可以包含由在一种组织类型中相比于在另一种组织类型中具有更高表达的miRNA结合的一个或多个miRNA结合位点。在另一个实例中，mRNA可以包含由在癌细胞中相比于在相同起源组织的非癌性细胞中具有较低表达的miRNA结合的一个或多个miRNA结合位点。当存在于表达低水平的这种miRNA的癌细胞中时，由该mRNA编码的多肽典型地将表现出增加的表达。
与正常肝细胞相比，肝癌细胞(例如，肝细胞癌细胞)典型地表达低水平的miR-122。因此，编码包含至少一个miR-122结合位点(例如，在mRNA的3’-UTR中)的多肽的mRNA典型地将在正常肝细胞中表达相对低水平的这种多肽，并且将在肝癌细胞中表达相对高水平的这种多肽。如果该多肽能够诱导免疫原性细胞死亡，则这可以引起相比于正常肝细胞，对肝癌细胞(例如，肝细胞癌细胞)优先的免疫原性细胞杀伤。
在一些实施方案中，该mRNA包含至少一个miR-122结合位点、至少两个miR-122结合位点、至少三个miR-122结合位点、至少四个miR-122结合位点，或至少五个miR-122结合位点。在一个方面，该miRNA结合位点结合miR-122，或与miR-122互补。在另一个方面，该miRNA结合位点结合miR-122-3p或miR-122-5p。在一个特定方面，该miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:1326具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核苷酸序列，其中该miRNA结合位点与miR-122结合。在另一个特定方面，该miRNA结合位点包含与SEQID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核苷酸序列，其中该miRNA结合位点与miR-122结合。这些序列在下表3中示出。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含miRNA结合位点，其中该miRNA结合位点包含选自表3的一种或多种核苷酸序列，包括这些miRNA结合位点序列中的任何一种或多种的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸还包含选自表3的相同或不同miRNA结合位点中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个，包括它们的任意组合。在一些实施方案中，该miRNA结合位点结合miR-142或与miR-142互补。在一些实施方案中，该miR-142包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，该miRNA结合位点结合miR-142-3p或miR-142-5p。在一些实施方案中，该miR-142-3p结合位点包含SEQID NO:29。在一些实施方案中，该miR-142-5p结合位点包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，该miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核苷酸序列。
表3.代表性的微RNA和微RNA结合位点
在一些实施方案中，miRNA结合位点在该多核苷酸的任何位置(例如，5'UTR和/或3'UTR)插入本公开的多核苷酸中。在一些实施方案中，该5'UTR包含miRNA结合位点。在一些实施方案中，该3'UTR包含miRNA结合位点。在一些实施方案中，该5'UTR和该3'UTR包含miRNA结合位点。该多核苷酸中的插入位点可以是该多核苷酸中的任何位置，只要miRNA结合位点插入该多核苷酸中在不存在对应miRNA的情况下不妨碍功能性多肽的翻译；并且在miRNA存在下，miRNA结合位点插入多核苷酸以及miRNA结合位点与对应miRNA结合能够降解该多核苷酸或阻止该多核苷酸翻译。
在一些实施方案中，miRNA结合位点插入包含ORF的本公开多核苷酸中的ORF的终止密码子下游至少约30个核苷酸处。在一些实施方案中，miRNA结合位点插入本公开的多核苷酸中的ORF的终止密码子下游至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸或至少约100个核苷酸处。在一些实施方案中，miRNA结合位点插入本公开的多核苷酸中的ORF的终止密码子下游约10个核苷酸至约100个核苷酸、约20个核苷酸至约90个核苷酸、约30个核苷酸至约80个核苷酸、约40个核苷酸至约70个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约45个核苷酸至约65个核苷酸处。
miRNA基因调节可以受miRNA周围序列的影响，诸如但不限于周围序列的种类、序列的类型(例如，异源、同源、外源、内源或人工)、周围序列中的调节元件和/或周围序列中的结构元件。该miRNA可以受5′UTR和/或3′UTR的影响。作为一个非限制性实例，与相同序列类型的人3′UTR相比，非人3′UTR可以增加miRNA序列对感兴趣多肽的表达的调节作用。
在一个实施方案中，该5′UTR的其他调节元件和/或结构元件可以影响miRNA介导的基因调节。调节元件和/或结构元件的一个实例是5′UTR中的结构化IRES(内部核糖体进入位点)，其对于结合翻译延伸因子以启动蛋白质翻译是必需的。EIF4A2与5′-UTR中该次级结构化元件的结合对于miRNA介导的基因表达是必需的(Meijer HA等人，Science,2013,340,82-85，其全文以引用方式并入本文)。本公开的多核苷酸还可以包含该结构化的5′UTR，以便增强微RNA介导的基因调节。
可以将至少一个miRNA结合位点工程改造到本公开的多核苷酸的3′UTR中。在该背景下，可以将至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个miRNA结合位点工程改造到本公开的多核苷酸的3′UTR中。例如，可以将1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、2个或1个miRNA结合位点工程改造到本公开的多核苷酸的3′UTR中。在一个实施方案中，掺入本公开的多核苷酸中的miRNA结合位点可以是相同的miRNA位点，也可以是不同的miRNA位点。掺入本公开的多核苷酸中的不同miRNA结合位点的组合可以包括其中掺入了任何不同miRNA位点的多于一个拷贝的组合。在另一个实施方案中，掺入本公开的多核苷酸中的miRNA结合位点可以靶向体内相同或不同的组织。作为一个非限制性实例，通过在本公开的多核苷酸的3′-UTR中引入组织特异性、细胞类型特异性或疾病特异性的miRNA结合位点，特定细胞类型(例如，肝细胞、骨髓细胞、内皮细胞、癌细胞等)中的表达程度可以降低。
在一个实施方案中，miRNA结合位点可以在本公开的多核苷酸中的3′UTR的5′末端附近、该3′UTR的5′末端与3′末端之间的大约半途和/或该3′UTR的3′末端附近工程改造。作为一个非限制性实例，miRNA结合位点可以在该3′UTR的5′末端附近和该3′UTR的5′末端与3′末端之间的大约半途工程改造。作为另一个非限制性实例，miRNA结合位点可以在该3′UTR的3′末端附近和该3′UTR的5′末端与3′末端之间的大约半途工程改造。作为又一个非限制性实例，miRNA结合位点可以在该3′UTR的5′末端附近和该3′UTR的3′末端附近工程改造。
在另一个实施方案中，3′UTR可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA结合位点。这些miRNA结合位点可以与miRNA、miRNA种子序列和/或该种子序列侧接的miRNA序列互补。
在一个实施方案中，可以将本公开的多核苷酸工程改造为包含在受试者的不同组织或不同细胞类型中表达的多于一个miRNA位点。作为一个非限制性实例，可以将本公开的多核苷酸工程改造为包含miR-192和miR-122，以调节该多核苷酸在受试者的肝脏和肾脏中的表达。在另一个实施方案中，可以将本公开的多核苷酸工程改造为包含针对相同组织的多于一个miRNA位点。
在一些实施方案中，可以用miRNA结合位点改变与由本公开的多核苷酸编码的多肽相关联的治疗窗和/或差异表达。例如，由于这些细胞的miRNA特征，可以将编码提供死亡信号的多肽的多核苷酸设计为在癌细胞中以更高水平表达。当癌细胞表达较低水平的特定miRNA时，编码该miRNA(或多个miRNA)的结合位点的多核苷酸将以更高水平表达。因此，提供死亡信号的多肽在癌细胞中触发或诱导细胞死亡。具有相同miRNA的较高表达的相邻非癌细胞受编码的死亡信号的影响会较小，这是因为该多核苷酸由于miRNA结合至结合位点或3′UTR中编码的“传感器”的影响而将以较低水平表达。相反，细胞存活信号或细胞保护性信号可以递送到含有癌细胞和非癌性细胞的组织，在那里，miRNA在癌细胞中具有更高的表达，结果是产生针对癌细胞的较低存活信号和针对正常细胞的较大存活信号。基于如本文所述的miRNA结合位点的用途，可以设计和施用具有不同信号的多个多核苷酸。
在一些实施方案中，可以通过在多核苷酸中掺入至少一个传感器序列并配制该多核苷酸用于施用，来控制该多核苷酸的表达。作为一个非限制性实例，本公开的多核苷酸可以通过掺入miRNA结合位点并将该多核苷酸配制在包含阳离子脂质(包括本文所述的任何脂质)的脂质纳米粒子中而靶向组织或细胞。
基于不同的组织、细胞类型或生物条件中miRNA的表达模式，本公开的多核苷酸可以工程改造为在特定的组织、细胞类型或生物条件中更靶向地表达。通过引入组织特异性miRNA结合位点，本公开的多核苷酸可以设计用于在组织或细胞中、或在生物学条件的背景下的最佳蛋白质表达。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以设计为掺入miRNA结合位点，这些miRNA结合位点与已知的miRNA种子序列具有100％同一性或与miRNA种子序列具有小于100％的同一性。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以设计为掺入与已知的miRNA种子序列具有至少以下同一性的miRNA结合位点：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。该miRNA种子序列可以部分突变以降低miRNA结合亲和力，并因此导致对该多核苷酸的下调降低。实质上，该miRNA结合位点与该miRNA种子之间的匹配或错配的程度可以充当变阻器(rheostat)，以更精细地调节该miRNA调控蛋白质表达的能力。此外，miRNA结合位点的非种子区中的突变还可以影响miRNA调控蛋白质表达的能力。
在一个实施方案中，miRNA序列可以掺入茎环的环中。
在另一个实施方案中，miRNA种子序列可以掺入在茎环的环中，并且miRNA结合位点可以掺入该茎环的5′或3′茎中。
在一个实施方案中，翻译增强子元件(TEE)可以掺入在茎环的茎的5′末端上，并且miRNA种子可以掺入该茎环的茎中。在另一个实施方案中，TEE可以掺入在茎环的茎的5′末端上，miRNA种子可以掺入该茎环的茎中，并且miRNA结合位点可以掺入该茎环的茎的3′末端中或该茎环之后的序列中。该miRNA种子和该miRNA结合位点可以属于相同的和/或不同的miRNA序列。
在一个实施方案中，掺入miRNA序列和/或TEE序列改变了该茎环区的形状，这可以增加和/或减少翻译。(参见例如，Kedde等人，“A Pumilio-induced RNA structure switchin p27-3′UTR controls miR-221and miR-22accessibility.”Nature CellBiology.2010，该文献全文以引用方式并入本文)。
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸的5′-UTR可以包含至少一个miRNA序列。该miRNA序列可以是但不限于19或22个核苷酸的序列和/或不含种子的miRNA序列。
在一个实施方案中，该5′UTR中的miRNA序列可以用于稳定本文所述的本公开的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸的5′UTR中的miRNA序列可以用于降低翻译起始位点(诸如但不限于起始密码子)的可及性。参见例如全文以引用方式并入本文的Matsuda等人，PLoS One.201011(5):e15057；其使用围绕起始密码子的反义锁核酸(LNA)寡核苷酸和外显子-连接复合物(EJC)(-4至+37，其中AUG密码子的A为+1)，以便降低对于第一起始密码子(AUG)的可及性。Matsuda证实，用LNA或EJC改变起始密码子周围的序列影响了多核苷酸的效率、长度和结构稳定性。本公开的多核苷酸可以包含miRNA序列，而不是Matsuda等人描述的LNA或EJC序列，其位于翻译起始位点附近，以便降低对该翻译起始位点的可及性。翻译起始位点可以在该miRNA序列之前、之后或之内。作为一个非限制性实例，该翻译起始位点可以位于miRNA序列诸如种子序列或结合位点之内。作为另一个非限制性实例，该翻译起始位点可以位于miR-122序列诸如种子序列或mir-122结合位点之内。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含至少一种miRNA，以便抑制抗原呈递细胞进行的抗原呈递。该miRNA可以是完整的miRNA序列、miRNA种子序列、不含种子的miRNA序列，或它们的组合。作为一个非限制性实例，掺入本公开的多核苷酸中的miRNA对于造血系统可以有特异性。作为另一个非限制性实例，掺入本公开的多核苷酸中以抑制抗原呈递的miRNA为miR-142-3p。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含至少一种miRNA，以便抑制编码的多肽在感兴趣的组织或细胞中的表达。作为一个非限制性实例，本公开的多核苷酸可以包含至少一个miR-122结合位点，以便抑制编码的感兴趣多肽在肝脏中的表达。作为另一个非限制性实例，本公开的多核苷酸可以包含至少一个miR-142-3p结合位点、miR-142-3p种子序列、没有该种子的miR-142-3p结合位点、miR-142-5p结合位点、miR-142-5p种子序列、没有该种子的miR-142-5p结合位点、miR-146结合位点、miR-146种子序列和/或没有该种子序列的miR-146结合位点。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可以在3′UTR中包含至少一个miRNA结合位点，以便选择性地降解免疫细胞中的mRNA治疗剂，以压制由治疗性递送引起的不需要的免疫原性反应。作为一个非限制性实例，该miRNA结合位点可以使本公开的多核苷酸在抗原呈递细胞中更不稳定。这些miRNA的非限制性实例包括mir-142-5p、mir-142-3p、mir-146a-5p和mir-146-3p。
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸在该多核苷酸的区域中包含至少一个可以与RNA结合蛋白相互作用的miRNA序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)包含(i)序列优化的核苷酸序列(例如，ORF)和(ii)miRNA结合位点(例如，与miR-142结合的miRNA结合位点)。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码本文所公开的多肽的尿嘧啶修饰序列和本文所公开的miRNA结合位点，例如，与miR-142结合的miRNA结合位点。在一些实施方案中，编码多肽的尿嘧啶修饰序列包含至少一个经化学修饰的核碱基，例如5-甲氧基尿嘧啶。在一些实施方案中，编码本公开的多肽的尿嘧啶修饰序列中至少95％的核碱基类型(例如，尿嘧啶)是经修饰的核碱基。在一些实施方案中，编码多肽的尿嘧啶修饰序列中至少95％的尿嘧啶是5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，将包含编码本文所公开的多肽的核苷酸序列和miRNA结合位点的多核苷酸与递送剂一起配制，该递送剂例如具有式(I)的化合物，例如，化合物1至147中的任一种。
包含功能性RNA元件的经修饰多核苷酸
本公开提供了包含修饰(例如，RNA元件)的合成多核苷酸，其中该修饰提供了期望的翻译调节活性。在一些实施方案中，本公开提供了包含5’非翻译区(UTR)、起始密码子、编码多肽的完整开放阅读框、3’UTR和至少一种修饰的多核苷酸，其中所述至少一种修饰提供期望的翻译调节活性，例如，促进和/或增强mRNA翻译的翻译保真度的修饰。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是顺式作用调节活性。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是43S起始前复合物(PIC)或核糖体在起始密码子处或附近的停留时间增加。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是在起始密码子处或从起始密码子起始多肽合成的增加。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是从完全开放阅读框翻译的多肽的量增加。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是PIC或核糖体进行的起始密码子解码的保真度增加。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是抑制或减少PIC或核糖体引起的遗漏扫描。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是PIC或核糖体解码起始密码子的速率降低。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是抑制或减少在该mRNA之内除了起始密码子之外的任何密码子处起始多肽合成。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是抑制或减少从该mRNA之内除了完整开放阅读框之外的任何开放阅读框翻译的多肽的量。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是抑制或减少异常翻译产物的产生。在一些实施方案中，期望的翻译调节活性是一种或多种前述翻译调节活性的组合。
因此，本公开提供了包含这样的RNA元件的多核苷酸，例如mRNA：该RNA元件包含提供如本文所述的期望翻译调节活性的序列和/或一种或多种RNA二级结构。在一些方面，该mRNA包含这样的RNA元件：该RNA元件包含促进和/或增强mRNA翻译的翻译保真度的序列和/或一种或多种RNA二级结构。在一些方面，该mRNA包含这样的RNA元件：该RNA元件包含提供期望的翻译调节活性(诸如抑制和/或减少遗漏扫描)的序列和/或一种或多种RNA二级结构。在一些方面，本公开提供了包含这样的RNA元件的mRNA：该RNA元件包含抑制和/或减少遗漏扫描，从而促进mRNA的翻译保真度的序列和/或一种或多种RNA二级结构。
在一些实施方案中，该RNA元件包含天然核苷酸和/或经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，该RNA元件包含连接核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，该序列提供如本文所述的期望翻译调节活性。在一些实施方案中，该RNA元件包含连接核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，该序列形成或折叠成稳定的RNA二级结构，其中该RNA二级结构提供如本文所述的期望翻译调节活性。RNA元件可以基于下列各项来鉴定和/或表征：元件(例如，富含GC的元件)的一级序列、元件所形成的RNA二级结构(例如，茎环)、元件在RNA分子内的位置(例如，位于mRNA的5’UTR之内)、元件(例如，“翻译增强子元件”)的生物学功能和/或活性，以及它们的任意组合。
在一些方面，本公开提供了具有一种或多种抑制遗漏扫描和/或促进mRNA翻译的翻译保真度的结构修饰的mRNA，其中这些结构修饰中的至少一种是富含GC的RNA元件。在一些方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的连接核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一个实施方案中，该富含GC的RNA元件位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30个、约25个、约20个、约15个、约10个、约5个、约4个、约3个、约2个或约1个核苷酸处。在另一个实施方案中，该富含GC的RNA元件位于Kozak共有序列上游15至30个、15至20个、15至25个、10至15个或5至10个核苷酸处。在另一个实施方案中，该富含GC的RNA元件位于紧邻该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列的位置。
在任何前述或相关方面，本公开提供了富含GC的RNA元件，该元件包含具有以任何顺序连接的3至30个、5至25个、10至20个、15至20个、约20个、约15个、约12个、约10个、约7个、约6个或约3个核苷酸、其衍生物或类似物的序列，其中该序列的组成为70％至80％胞嘧啶、60％至70％胞嘧啶、50％至60％胞嘧啶、40％至50％胞嘧啶、30％至40％胞嘧啶碱基。在任何前述或相关方面，本公开提供了富含GC的RNA元件，该元件包含具有以任何顺序连接的3至30个、5至25个、10至20个、15至20个、约20个、约15个、约12个、约10个、约7个、约6个或约3个核苷酸、其衍生物或类似物的序列，其中该序列的组成为约80％胞嘧啶、约70％胞嘧啶、约60％胞嘧啶、约50％胞嘧啶、约40％胞嘧啶，或约30％胞嘧啶。
在任何前述或相关方面，本公开提供了富含GC的RNA元件，该元件包含具有以任何顺序连接的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该序列的组成为70％至80％胞嘧啶、60％至70％胞嘧啶、50％至60％胞嘧啶、40％至50％胞嘧啶，或30％至40％胞嘧啶。在任何前述或相关方面，本公开提供了富含GC的RNA元件，该元件包含具有以任何顺序连接的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该序列的组成为约80％胞嘧啶、约70％胞嘧啶、约60％胞嘧啶、约50％胞嘧啶、约40％胞嘧啶，或约30％胞嘧啶。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的连接核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该富含GC的RNA元件位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸处，并且其中该富含GC的RNA元件包含以任何顺序连接的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该序列的组成为胞嘧啶大于50％。在一些实施方案中，该序列的组成为胞嘧啶大于55％、胞嘧啶大于60％、胞嘧啶大于65％、胞嘧啶大于70％、胞嘧啶大于75％、胞嘧啶大于80％、胞嘧啶大于85％，或胞嘧啶大于90％。
在其他方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的连接核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该富含GC的RNA元件位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸处，并且其中该富含GC的RNA元件包含约3至30、5至25个、10至20个、15至20个或约20个、约15个、约12个、约10个、约6个或约3个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该序列包含重复的GC-基序，其中该重复的GC-基序为[CCG]n，其中n＝1至10、n＝2至8、n＝3至6，或n＝4至5。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝1、2、3、4或5。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝1、2或3。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝1。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝2。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝3。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝4(SEQ ID NO:1384)。在一些实施方案中，该序列包含重复的GC-基序[CCG]n，其中n＝5(SEQ ID NO:1382)。
在另一个方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的连接核苷酸或者其衍生物或类似物的序列，其中该富含GC的RNA元件包含表4中列出的任何一种序列。在一个实施方案中，该富含GC的RNA元件位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30个、约25个、约20个、约15个、约10个、约5个、约4个、约3个、约2个或约1个核苷酸处。在另一个实施方案中，该富含GC的RNA元件位于Kozak共有序列上游约15至30个、15至20个、15至25个、10至15个或5至10个核苷酸处。在另一个实施方案中，该富含GC的RNA元件位于紧邻该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列的位置。
在其他方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的如表4中列出的序列V1[CCCCGGCGCC](SEQ ID NO:1383)、或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于紧邻该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列的上游位置的如表4中列出的序列V1。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基处的如表4中列出的序列V1。在其他实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1至3、3至5、5至7、7至9、9至12或12至15个碱基处的如表4中列出的序列V1。
在其他方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的如表4中列出的序列V2[CCCCGGC]、或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于紧邻该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列的上游位置的如表4中列出的序列V2。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基处的如表4中列出的序列V2。在其他实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1至3、3至5、5至7、7至9、9至12或12至15个碱基处的如表4中列出的序列V2。
在其他方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的如表4中列出的序列EK[GCCGCC]、或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于紧邻该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列的上游位置的如表4中列出的序列EK。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基处的如表4中列出的序列EK。在其他实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1至3、3至5、5至7、7至9、9至12或12至15个碱基处的如表4中列出的序列EK。
在还有其他方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为富含GC的RNA元件，该RNA元件包含在该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的如表4中列出的序列V1[CCCCGGCGCC](SEQ ID NO:1383)、或者其衍生物或类似物，其中该5’UTR包含表4中示出的以下序列：
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(SEQ ID NO:1384)。
在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于紧邻表4中示出的5’UTR序列中的Kozak共有序列的上游位置的如表4中列出的序列V1。在一些实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基处的如表4中列出的序列V1，其中该5’UTR包含表4中示出的以下序列：
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(SEQ ID NO:1384)。
在其他实施方案中，该富含GC的元件包含位于该mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1至3、3至5、5至7、7至9、9至12或12至15个碱基处的如表4中列出的序列V1，其中该5’UTR包含表4中示出的以下序列：
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(SEQ ID NO:1384)。
在一些实施方案中，该5’UTR包含表4中列出的以下序列：
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC(SEQ ID NO:1385)
在一些实施方案中，该5’UTR包含表4中列出的以下序列：
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCACC(SEQ ID NO:1386)
表4
在另一个方面，本公开提供了包含至少一种修饰的经修饰的mRNA，其中至少一种修饰为包含稳定的RNA二级结构的富含GC的RNA元件，该稳定的RNA二级结构包含按形成发夹或茎环的顺序连接的核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构在Kozak共有序列的上游。在另一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10或约5个核苷酸处。在另一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约20、约15、约10或约5个核苷酸处。在另一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约5、约4、约3、约2、约1个核苷酸处。在另一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约15至30、约15至20、约15至25、约10至15或约5至10个核苷酸处。在另一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游12至15个核苷酸处。在另一个实施方案中，该稳定的RNA二级结构具有约-30kcal/mol、约-20至-30kcal/mol、约-20kcal/mol、约-10至-20kcal/mol、约-10kcal/mol、约-5至-10kcal/mol的ΔG。
在另一个实施方案中，该修饰与编码多肽的开放阅读框可操作地连接，并且其中该修饰和该开放阅读框是异源的。
在另一个实施方案中，富含GC的RNA元件的序列仅仅由鸟嘌呤(G)核碱基和胞嘧啶(C)核碱基组成。
提供如本文所述的期望翻译调节活性的RNA元件可以使用已知的技术(诸如核糖体谱分析)鉴定和表征。核糖体谱分析是一种允许确定与mRNA结合的PIC和/或核糖体的位置的技术(参见例如Ingolia等人，(2009)Science 324(5924):218-23，该文献以引用方式并入本文)。该技术基于通过PIC和/或核糖体保护mRNA的区域或区段不被核酸酶消化。保护导致产生30bp的RNA片段，称为“足迹”。RNA足迹的序列和频率可以通过本领域已知的方法(例如，RNA测序)进行分析。该足迹大致以核糖体的A位点为中心。如果PIC或核糖体停留在沿mRNA的特定位置处，则在这些位置处产生的足迹将相对常见。研究已经证实，在PIC和/或核糖体表现出降低的持续合成能力的位置处产生较多足迹，并且在PIC和/或核糖体表现出增加的持续合成能力的位置处则产生较少足迹(Gardin等人，(2014)eLife 3:e03735)。在一些实施方案中，通过核糖体谱分析确定PIC或核糖体在沿着组成本文所述的任何一种或多种RNA元件的多核苷酸的离散位置处的停留时间或占用时间。
递送媒介物
一般说明
本公开的mRNA可以配制在纳米粒子或其他递送媒介物中，例如，以便在递送至受试者时保护它们免于降解。说明性的纳米粒子在Panyam,J.&Labhasetwar,V.Adv.DrugDeliv.Rev.55,329–347(2003)和Peer,D.等人，Nature Nanotech.2,751–760(2007)中有所描述。在某些实施方案中，本公开的mRNA被包封在纳米粒子内。在具体实施方案中，纳米粒子是至少一种维度(例如，直径)小于或等于1000nM、小于或等于500nM、或者小于或等于100nM的粒子。在具体实施方案中，纳米粒子包含脂质。脂质纳米粒子包括但不限于脂质体和胶束。可以存在许多脂质中的任何一种，包括阳离子脂质和/或可电离脂质、阴离子脂质、中性脂质、两亲性脂质、PEG化脂质和/或结构脂质。此类脂质可以单独使用或组合使用。在具体实施方案中，脂质纳米粒子包含一种或多种本文所述的mRNA。
在一些实施方案中，本文所述mRNA的脂质纳米粒子制剂可以包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7或8种)阳离子脂质和/或可电离脂质。此类阳离子脂质和/或可电离脂质包括但不限于3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-八三十八烷(KL25)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2R))、(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2S))、N，N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基-N,N--N-三乙基氯化铵(“DOTMA”)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；1,2-二油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(“DOTAP.Cl”)；3-β-(N--(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基-三氟乙酸铵(“DOSPA”)、双十八烷基酰胺基甘氨酰基羧基精胺(“DOGS”)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(“DODAP”)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(“DODMA”)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)。此外，可以使用阳离子脂质和/或可电离脂质的许多商业制剂，诸如(包括可从GIBCO/BRL获得的DOTMA和DOPE)和(包括可从GIBCO/BRL获得的DOSPA和DOPE)。KL10、KL22和KL25描述于例如美国专利号8,691,750中，该专利全文以引用方式并入本文。在具体实施方案中，该脂质为DLin-MC3-DMA或DLin-KC2-DMA。
适用于本公开的脂质纳米粒子的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油，以及连接到中性脂质的其他阴离子修饰基团。
适用于本公开的脂质纳米粒子的中性脂质包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。具有不同链长和饱和度的多种酰基链基团的脂质是可获得的，或者可以通过众所周知的技术分离或合成。此外，可以使用具有饱和脂肪酸链和不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。在一些实施方案中，本公开中使用的中性脂质是DOPE、DSPC、DPPC、POPC或任何相关的磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，该中性脂质可以由鞘磷脂、二氢鞘磷脂或具有其他头部基团(诸如丝氨酸和肌醇)的磷脂组成。
在一些实施方案中，两亲性脂质包含在本公开的纳米粒子中。适用于本公开的纳米粒子的示例性两亲性脂质包括但不限于鞘脂、磷脂和氨基脂。在一些实施方案中，磷脂选自磷脂选自1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。也可以使用其他缺乏磷的化合物，诸如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸。此外，此类两亲性脂质可以轻易地与其他脂质(诸如甘油三酯和甾醇)混合。
在一些实施方案中，本公开的纳米粒子的脂质组分可以包含一种或多种PEG化脂质。PEG化脂质(也称为PEG-脂质或经PEG修饰脂质)是用聚乙二醇修饰的脂质。该脂质组分可以包括一种或多种PEG化脂质。PEG化脂质可以选自由以下各项组成的非限制性组：经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油和经PEG修饰的二烷基甘油。例如，PEG化脂质可以为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
本公开的脂质纳米粒子可以包含一种或多种结构脂质。可以存在于本公开的脂质纳米粒子中的示例性非限制性结构脂质包括胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角甾醇、番茄次碱、番茄碱、熊果酸或α-生育酚。
在一些实施方案中，本公开的一种或多种mRNA可以配制在直径为约1nm至约900nm，例如约1nm至约100nm、约1nm至约200nm、约1nm至约300nm、约1nm至约400nm、约1nm至约500nm、约1nm至约600nm、约1nm至约700nm、约1nm至800nm、约1nm至约900nm的脂质纳米粒子中。在一些实施方案中，该纳米粒子可以具有约10nm至约300nm、约20nm至约200nm、约30nm至约100nm、或约40nm至约80nm的直径。在一些实施方案中，该纳米粒子可以具有约30nm至约300nm、约40nm至约200nm、约50nm至约150nm、约70nm至约110nm、或约80nm至约120nm的直径。在一个实施方案中，mRNA可以配制在直径为约10nm至约100nm的脂质纳米粒子中，该直径包括在诸如但不限于下列数字之间的范围：约10nm至约20nm、约10nm至约30nm、约10nm至约40nm、约10nm至约50nm、约10nm至约60nm、约10nm至约70nm、约10nm至约80nm、约10nm至约90nm、约20nm至约30nm、约20nm至约40nm、约20nm至约50nm、约20nm至约60nm、约20nm至约70nm、约20nm至约80nm、约20nm至约90nm、约20nm至约100nm、约30nm至约40nm、约30nm至约50nm、约30nm至约60nm、约30nm至约70nm、约30nm至约80nm、约30nm至约90nm、约30nm至约100nm、约40nm至约50nm、约40nm至约60nm、约40nm至约70nm、约40nm至约80nm、约40nm至约90nm、约40nm至约100nm、约50nm至约60nm、约50nm至约70nm、约50nm至约80nm、约50nm至约90nm、约50nm至约100nm、约60nm至约70nm、约60nm至约80nm、约60nm至约90nm、约60nm至约100nm、约70nm至约80nm、约70nm至约90nm、约70nm至约100nm、约80nm至约90nm、约80nm至约100nm，和/或约90nm至约100nm。在一个实施方案中，mRNA可以配制在直径为约30nm至约300nm、约40nm至约200nm、约50nm至约150nm、约70nm至约110nm、或约80nm至约120nm(包括其间的范围)的脂质纳米粒子中。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可以具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm或大于950nm的直径。
在一些实施方案中，可以增大和/或减小该脂质纳米粒子的粒度。粒度的变化可以能够帮助抵抗生物反应(诸如但不限于炎症)，或者可以增大递送至患者或受试者的mRNA的生物学效应。
在某些实施方案中，期望使用对细胞类型和/或组织类型有特异性的靶向部分靶向本公开的纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)。在一些实施方案中，可以使用靶向部分将纳米粒子靶向特定的细胞、组织和/或器官。在具体实施方案中，纳米粒子包含一种或多种本文所述的mRNA，以及靶向部分。示例性的非限制性靶向部分包括配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如，核黄素)和抗体(例如，全长抗体、抗体片段(例如，Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab’片段，或F(ab’)2片段)、单结构域抗体、骆驼科动物抗体及其片段、人抗体及其片段、单克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体))。在一些实施方案中，该靶向部分可以是多肽。该靶向部分可以包括完整多肽(例如，肽或蛋白质)或其片段。靶向部分典型地以使得该靶向部分可用于与靶标(例如，细胞表面受体)相互作用这样的方式定位在纳米粒子的外表面上。多种不同的靶向部分和靶向方法是本领域已知和可获得的，包括例如在Sapra等人，Prog.Lipid Res.42(5):439-62,2003和Abra等人，J.Liposome Res.12:1-3,2002中所述的那些。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子(例如，脂质体)可以包括亲水性聚合物链的表面涂层，诸如聚乙二醇(PEG)链(参见例如，Allen等人，Biochimica et Biophysica Acta1237:99-108,1995；DeFrees等人，Journal of the American Chemistry Society 118:6101-6104,1996；Blume等人，Biochimica et Biophysica Acta 1149:180-184,1993；Klibanov等人，Journal of Liposome Research 2:321-334,1992；美国专利号5,013,556；Zalipsky,Bioconjugate Chemistry 4:296-299,1993；Zalipsky,FEBS Letters 353:71-74,1994；Zalipsky,Stealth Liposomes，第9章(Lasic和Martin编辑)，CRC Press,BocaRaton Fla.,1995)。在一种方法中，用于靶向该脂质纳米粒子的靶向部分与形成该纳米粒子的脂质的极性头部基团连接。在另一种方法中，该靶向部分附接到PEG链的远端，从而形成亲水性聚合物涂层(参见例如，Klibanov等人，Journal of Liposome Research 2:321-334,1992；Kirpotin等人，FEBS Letters 388:115-118,1996)。
可以使用用于偶联一个或多个靶向部分的标准方法。例如，可以使用磷脂酰乙醇胺(其可以被激活以附接靶向部分)、或衍生的亲脂性化合物(诸如脂质衍生的博来霉素)。可以使用例如掺入蛋白质A的脂质体来构建靶向抗体的脂质体(参见例如，Renneisen等人，J.Bio.Chem.,265:16337-16342,1990，以及Leonetti等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),87:2448-2451,1990)。抗体缀合的其他实例在美国专利号6,027,726中公开。靶向部分的实例还可以包括对细胞组分(包括与赘生物或肿瘤相关联的抗原)有特异性的其他多肽。用作靶向部分的多肽可以经由共价键附接到脂质体(参见例如，Heath,Covalent Attachmentof Proteins to Liposomes,149Methods in Enzymology 111-119(Academic Press,Inc.1987))。其他靶向方法包括生物素-亲和素系统。
在一些实施方案中，本公开的脂质纳米粒子包括将该脂质纳米粒子靶向细胞的靶向部分，其中细胞包括但不限于肝细胞、结肠细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞(包括原发性肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞)。在具体实施方案中，该靶向部分将脂质纳米粒子靶向肝细胞。在其他实施方案中，该靶向部分将脂质纳米粒子靶向结肠细胞。在一些实施方案中，该靶向部分将脂质纳米粒子靶向肝癌细胞(例如，肝细胞癌细胞)或结肠直肠癌细胞(例如，原发性肿瘤或癌转移)。
脂质纳米粒子
在一组实施方案中，提供了脂质纳米粒子(LNP)。在一个实施方案中，脂质纳米粒子包含脂质和一种或多种mRNA，其中脂质包括可电离脂质、结构脂质、磷脂。本文所述LNP中的每一种都可以用作本文所述mRNA的制剂。在一个实施方案中，脂质纳米粒子包含可电离脂质、结构脂质、磷脂、经PEG修饰脂质和一种或多种mRNA。在一些实施方案中，该LNP包含可电离脂质、经PEG修饰脂质、甾醇和磷脂。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质:磷脂:甾醇:经PEG修饰脂质的摩尔比为约20％至60％:约5％至25％:约25％至55％:约0.5％至15％。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质、经PEG修饰脂质、胆固醇和磷脂的摩尔比为约50％:约1.5％:约38.5％:约10％。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质、PEG-脂质、胆固醇和磷脂的摩尔比为约55％:约2.5％:约32.5％:约10％。在一些实施方案中，可电离脂质为可电离氨基或阳离子脂质，中性脂质为磷脂，并且甾醇为胆固醇。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质:胆固醇:DSPC(1,2-双十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱):PEG-DMG的摩尔比为50:38.5:10:1.5。
a.可电离脂质
本公开提供了具有有利特性的药物组合物。例如，本文所述的脂质(例如，具有式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IV)、(V)或(VI)中任一者的那些可以有利地用于脂质纳米粒子组合物中，这些组合物用于将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物的细胞或器官。例如，本文所述的脂质几乎没有或没有免疫原性。例如，与参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)相比，本文所公开的脂质化合物具有较低的免疫原性。例如，与包含参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)和相同的治疗剂或预防剂的对应制剂相比，包含本文所公开的脂质和治疗剂或预防剂的制剂具有增大的治疗指数。具体地讲，本申请提供了药物组合物，其包含：
(a)包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列的多核苷酸；和
(b)递送剂。
在一些实施方案中，该递送剂包含具有式(I)的脂质化合物，或者其盐或立体异构体
其中
R1选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自C3-6碳环和杂环；
R9选自H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
在一些实施方案中，式(I)化合物的一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
其中烷基基团和烯基基团可以是直链或支链的。
在一些实施方案中，式(I)化合物的一个子组包括以下那些或者其盐或立体异构体：其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或者(ii)当n为1或2时，Q不是5、6和7元杂环烷基。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，其中
R1选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR，以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，该杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基和C1-3烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自C3-6碳环和杂环；
R9选自H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR，以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，该杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基和C1-3烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在又一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；当Q为5至14元杂环并且(i)R4为-(CH2)nQ(其中n为1或2)、或(ii)R4为-(CH2)nCHQR(其中n为1)、或(iii)R4为-CHQR和-CQ(R)2时，则Q为5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自C3-6碳环和杂环；
R9选自H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在又一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；当Q为5至14元杂环并且(i)R4为-(CH2)nQ(其中n为1或2)、或(ii)R4为-(CH2)nCHQR(其中n为1)、或(iii)R4为-CHQR和-CQ(R)2时，则Q为5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在又一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自C3-6碳环和杂环；
R9选自H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在又一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未经取代的C1-6烷基，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在又一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，并且n选自3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在又一个实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，并且n选自3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在还有其他实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q为-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在还有其他实施方案中，式(I)化合物的另一个子组包括满足以下条件的那些，或者其盐或立体异构体，其中
R1选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q为-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在某些实施方案中，式(I)化合物的一个子组包括具有式(IA)的那些：
或者其盐或立体异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；R4为未经取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，式(I)化合物的一个子组包括具有式(IA)的那些，或者其盐或立体异构体，
其中
l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；
M1为键或M’；
R4为未经取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、芳基基团和杂芳基基团；并且
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在某些实施方案中，式(I)化合物的一个子组包括具有式(II)的那些：
或者其盐或立体异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为未经取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，式(I)化合物的一个子组包括具有式(II)的那些，或者其盐或立体异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1为键或M’；
R4为未经取代的C1-3烷基，或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、芳基基团和杂芳基基团；并且
R2和R3独立地选自H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，式(I)化合物为式(IIa)化合物，
或其盐，其中R4如上所述。
在一些实施方案中，式(I)化合物为式(IIb)化合物，
或其盐，其中R4如上所述。
在一些实施方案中，式(I)化合物为式(IIc)化合物，
或其盐，其中R4如上所述。
在一些实施方案中，式(I)化合物为式(IIe)化合物，
或其盐，其中R4如上所述。
在一些实施方案中，式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)的化合物包含选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR的R4，其中Q、R和n如上所定义。
在一些实施方案中，Q选自-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环，其中R如上所定义。在一些方面，n为1或2。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，式(I)化合物为式(IId)化合物，
或其盐，其中R2和R3独立地选自C5-14烷基和C5-14烯基，n选自2、3和4，并且R’、R”、R5、R6和m如上所定义。
在式(IId)化合物的一些方面，R2为C8烷基。在式(IId)化合物的一些方面，R3为C5-C9烷基。在式(IId)化合物的一些方面，m为5、7或9。在式(IId)化合物的一些方面，每个R5都为H。在式(IId)化合物的一些方面，每个R6都为H。
在另一个方面，本申请提供了脂质组合物(例如，脂质纳米粒子(LNP))，其包含：(1)具有式(I)的化合物；(2)任选的辅助脂质(例如，磷脂)；(3)任选的结构脂质(例如，甾醇)；和(4)任选的脂质缀合物(例如，PEG-脂质)。在示例性实施方案中，该脂质组合物(例如，LNP)还包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，例如包封在其中的多核苷酸。
如本文所用，术语“烷基”或“烷基基团”是指包含一个或多个碳原子(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)的直链或支链饱和烃。
符号“C1-14烷基”是指包含1至14个碳原子的直链或支链饱和烃。烷基基团可以任选地被取代。
如本文所用，术语“烯基”或“烯基基团”是指包含两个或更多个碳原子(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个双键的直链或支链烃。
符号“C2-14烯基”是指包含2至14个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基基团可以包含一个、两个、三个、四个或更多个双键。例如，C18烯基可以包含一个或更多个双键。包含两个双键的C18烯基基团可以是亚油基基团。烯基基团可以任选地被取代。
如本文所用，术语“碳环”或“碳环基团”是指包含一个或多个碳原子环的单环或多环体系。环可以为三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元、十二元、十三元、十四元或十五元环。
符号“C3-6碳环”是指包含具有3至6个碳原子的单环的碳环。碳环可以包含一个或多个双键，并且可以是芳族的(例如，芳基基团)。碳环的实例包括环丙基基团、环戊基基团、环己基基团、苯基基团、萘基基团和1,2-二氢萘基基团。碳环可以任选地被取代。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环基团”是指包含一个或多个环的单环或多环体系，其中至少一个环包含至少一个杂原子。杂原子可以为例如氮原子、氧原子或硫原子。环可以是三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元或十二元环。杂环可以包含一个或多个双键，并且可以是芳族的(例如，杂芳基基团)。杂环的实例包括咪唑基基团、咪唑烷基基团、噁唑基基团、噁唑烷基基团、噻唑基基团、噻唑烷基基团、吡唑烷基基团、吡唑基基团、异噁唑烷基基团、异噁唑基基团、异噻唑烷基基团、异噻唑基基团、吗啉基基团、吡咯基基团、吡咯烷基基团、呋喃基基团、四氢呋喃基基团、苯硫基基团、吡啶基基团、哌啶基基团、喹啉基基团和异喹啉基基团。杂环可以任选地被取代。
如本文所用，“可生物降解基团”是可以促进受试者体内的脂质更快代谢的基团。可生物降解基团可以是但不限于-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团。
如本文所用，“芳基基团”是包含一个或多个芳族环的碳环基团。芳基基团的实例包括苯基基团和萘基基团。
如本文所用，“杂芳基基团”是包含一个或多个芳族环的杂环基团。杂芳基基团的实例包括吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。芳基基团和杂芳基基团都可以任选地被取代。例如，M和M’可以选自由以下各项组成的非限制性组：任选地被取代的苯基、噁唑和噻唑。在本文的式中，M和M’可以独立地选自上述可生物降解基团的清单。
除非另外指明，否则烷基基团、烯基基团和环基(例如，碳环基和杂环基)基团可以任选地被取代。任选的取代基可以选自但不限于卤素原子(例如，氯、溴、氟或碘基团)、羧酸(例如，-C(O)OH)、醇(例如，羟基、-OH)、酯(例如，-C(O)OR或-OC(O)R)、醛(例如，-C(O)H)、羰基(例如，-C(O)R，作为替代由C＝O表示)、酰卤(例如，-C(O)X，其中X为选自溴化物、氟化物、氯化物和碘化物的卤化物)、碳酸酯(例如，-OC(O)OR)、烷氧基(例如，-OR)、缩醛(例如，-C(OR)2R”“，其中每个OR为可以相同或不同的烷氧基基团，并且R”“为烷基或烯基基团)、磷酸根(例如，P(O)4 3-)、硫醇(例如，-SH)、亚砜(例如，-S(O)R)、亚磺酸(例如，-S(O)OH)、磺酸(例如，-S(O)2OH)、硫醛(例如，-C(S)H)、硫酸根(例如，S(O)4 2-)、磺酰基(例如，-S(O)2-)、酰胺(例如，-C(O)NR2，或-N(R)C(O)R)、叠氮基(例如，-N3)、硝基(例如，-NO2)、氰基(例如，-CN)、异氰基(例如，-NC)、酰氧基(例如，-OC(O)R)、氨基(例如，-NR2、-NRH或-NH2)、氨基甲酰基(例如，-OC(O)NR2、-OC(O)NRH或-OC(O)NH2)、磺酰胺(例如，-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(R)S(O)2R、-N(R)S(O)2H或-N(H)S(O)2H)、烷基基团、烯基基团和环基(例如，碳环基或杂环基)基团。
在前述任一项中，R为如本文所定义的烷基基团或烯基基团。在一些实施方案中，这些取代基基团本身可以进一步被例如如本文所定义的一个、两个、三个、四个、五个或六个取代基取代。例如，C1-6烷基基团可以进一步被一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的取代基取代。
当适用时，式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)中任一者的化合物包括下列特征中的一种或多种。
在一些实施方案中，R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O、S和P的杂原子的5至14元芳族或非芳族杂环，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，该杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基和C1-3烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；当Q为5至14元杂环并且(i)R4为-(CH2)nQ(其中n为1或2)、或(ii)R4为-(CH2)nCHQR(其中n为1)、或(iii)R4为-CHQR和-CQ(R)2时，则Q为5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基。
在另一个实施方案中，R4选自C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基，-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4为未经取代的C1-4烷基，例如未经取代的甲基。
在某些实施方案中，本公开提供具有式(I)的化合物，其中R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，并且n选自3、4和5。
在某些实施方案中，本公开提供具有式(I)的化合物，其中R4选自-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q为-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5。
在某些实施方案中，本公开提供了具有式(I)的化合物，其中R2和R3独立地选自C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环，并且R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，并且n选自3、4和5。
在某些实施方案中，R2和R3独立地选自C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。
在一些实施方案中，R1选自C5-20烷基和C5-20烯基。
在其他实施方案中，R1选自-R*YR”、-YR”和-R”M’R’。
在某些实施方案中，R1选自-R*YR”和-YR”。在一些实施方案中，Y为环丙基基团。在一些实施方案中，R*为C8烷基或C8烯基。在某些实施方案中，R”为C3-12烷基。例如，R”可以为C3烷基。例如，R”可以为C4-8烷基(例如，C4、C5、C6、C7或C8烷基)。
在一些实施方案中，R1为C5-20烷基。在一些实施方案中，R1为C6烷基。在一些实施方案中，R1为C8烷基。在其他实施方案中，R1为C9烷基。在某些实施方案中，R1为C14烷基。在其他实施方案中，R1为C18烷基。
在一些实施方案中，R1为C5-20烯基。在某些实施方案中，R1为C18烯基。在一些实施方案中，R1为亚油基。
在某些实施方案中，R1带支链(例如，癸烷-2-基、十一烷-3-基、十二烷-4-基、十三烷-5-基、十四烷-6-基、2-甲基十一烷-3-基、2-甲基癸烷-2-基、3-甲基十一烷-3-基、4-甲基十二烷-4-基或十七烷-9-基)。在某些实施方案中，R1为
在某些实施方案中，R1为未经取代的C5-20烷基或C5-20烯基。在某些实施方案中，R’为经取代的C5-20烷基或C5-20烯基(例如，被C3-6碳环取代，诸如1-环丙基壬基)。
在其他实施方案中，R1为-R”M’R’。
在一些实施方案中，R’选自-R*YR”和-YR”。在一些实施方案中，Y为C3-8环烷基。在一些实施方案中，Y为C6-10芳基。在一些实施方案中，Y为环丙基基团。在一些实施方案中，Y为环己基基团。在某些实施方案中，R*为C1烷基。
在一些实施方案中，R”选自C3-12烷基和C3-12烯基。在一些实施方案中，与Y相邻的R”为C1烷基。在一些实施方案中，与Y相邻的R”为C4-9烷基(例如，C4、C5、C6、C7或C8或C9烷基)。
在一些实施方案中，R’选自C4烷基和C4烯基。在某些实施方案中，R’选自C5烷基和C5烯基。在一些实施方案中，R’选自C6烷基和C6烯基。在一些实施方案中，R’选自C7烷基和C7烯基。在一些实施方案中，R’选自C9烷基和C9烯基。
在其他实施方案中，R’选自C11烷基和C11烯基。在其他实施方案中，R’选自C12烷基、C12烯基、C13烷基、C13烯基、C14烷基、C14烯基、C15烷基、C15烯基、C16烷基、C16烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基。在某些实施方案中，R’带支链(例如，癸烷-2-基、十一烷-3-基、十二烷-4-基、十三烷-5-基、十四烷-6-基、2-甲基十一烷-3-基、2-甲基癸烷-2-基、3-甲基十一烷-3-基、4-甲基十二烷-4-基或十七烷-9-基)。在某些实施方案中，R’为
在某些实施方案中，R’为未经取代的C1-18烷基。在某些实施方案中，R’为经取代的C1-18烷基(例如，被C3-6碳环取代的C1-15烷基，诸如1-环丙基壬基)。
在一些实施方案中，R”选自C3-14烷基和C3-14烯基。在一些实施方案中，R”为C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基或C8烷基。在一些实施方案中，R”为C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基或C14烷基。
在一些实施方案中，M’为-C(O)O-。在一些实施方案中，M’为-OC(O)-。
在其他实施方案中，M’为芳基基团或杂芳基基团。例如，M’可以选自苯基、噁唑和噻唑。
在一些实施方案中，M为-C(O)O-在一些实施方案中，M为-OC(O)-。在一些实施方案中，M为-C(O)N(R’)-。在一些实施方案中，M为-P(O)(OR’)O-。
在其他实施方案中，M为芳基基团或杂芳基基团。例如，M可以选自苯基、噁唑和噻唑。
在一些实施方案中，M与M’相同。在其他实施方案中，M与M’不同。
在一些实施方案中，每个R5都为H。在某些这样的实施方案中，每个R6也为H。
在一些实施方案中，R7为H。在其他实施方案中，R7为C1-3烷基(例如，甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在一些实施方案中，R2和R3独立地为C5-14烷基或C5-14烯基。
在一些实施方案中，R2和R3是相同的。在一些实施方案中，R2和R3为C8烷基。在某些实施方案中，R2和R3为C2烷基。在其他实施方案中，R2和R3为C3烷基。在一些实施方案中，R2和R3为C4烷基。在某些实施方案中，R2和R3为C5烷基。在其他实施方案中，R2和R3为C6烷基。在一些实施方案中，R2和R3为C7烷基。
在其他实施方案中，R2和R3是不同的。在某些实施方案中，R2为C8烷基。在一些实施方案中，R3为C1-7(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7烷基)或C9烷基。
在一些实施方案中，R7和R3是H。
在某些实施方案中，R2是H。
在一些实施方案中，m为5、7或9。
在一些实施方案中，R4选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR。
在一些实施方案中，Q选自：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-C(R)N(R)2C(O)OR、碳环和杂环。
在某些实施例中，Q为-OH。
在某些实施方案中，Q为经取代或未经取代的5至10元杂芳基，例如，Q为咪唑、嘧啶、嘌呤、2-氨基-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮-9-基(或鸟嘌呤-9-基)、腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基或尿嘧啶-1-基。在某些实施方案中，Q为经取代的5至14元杂环烷基，例如，被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基和C1-3烷基的取代基取代。例如，Q为4-甲基哌嗪基、4-(4-甲氧基苄基)哌嗪基或异吲哚啉-2-基-1,3-二酮。
在某些实施方案中，Q为未经取代或经取代的C6-10芳基(诸如苯基)或C3-6环烷基。
在一些实施方案中，n为1。在其他实施方案中，n为2。在另外的实施方案中，n为3。在某些其他实施方案中，n为4。例如，R4可以为-(CH2)2OH。例如，R4可以为-(CH2)3OH。例如，R4可以为-(CH2)4OH。例如，R4可以为苄基。例如，R4可以为4-甲氧基苄基。
在一些实施方案中，R4为C3-6碳环。在一些实施方案中，R4为C3-6环烷基。例如，R4可以为任选地被例如OH、卤素、C1-6烷基等取代的环己基。例如，R4可以为2-羟基环己基。
在一些实施方案中，R为H。
在一些实施方案中，R为未经取代的C1-3烷基或未经取代的C2-3烯基。例如，R4可以为-CH2CH(OH)CH3或-CH2CH(OH)CH2CH3。
在一些实施方案中，R为经取代的C1-3烷基，例如CH2OH。例如，R4可以为-CH2CH(OH)CH2OH。
在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成具有一个或多个选自N、O、S和P的杂原子的5至14元芳族或非芳族杂环。在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成任选地被取代的芳族或非芳族C3-20碳环(例如，C3-18碳环、C3-15碳环、C3-12碳环或C3-10碳环)。在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成C3-6碳环。在其他实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成C6碳环，诸如环己基或苯基基团。在某些实施方案中，杂环或C3-6碳环被一个或多个烷基基团(例如，在同一个环原子上、或者在相邻或不相邻的环原子上)取代。例如，R2和R3连同它们所连接的原子一起可以形成具有一个或多个C5烷基取代的环己基或苯基基团。在某些实施方案中，由R2和R3形成的杂环或C3-6碳环被碳环基团取代。例如，R2和R3连同它们所连接的原子一起可以形成环己基或被环己基取代的苯基基团。在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成C7-15碳环，诸如环庚基、环十五烷基或萘基基团。
在一些实施方案中，R4选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR。在一些实施方案中，Q选自-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环。在其他实施方案中，Q选自咪唑、嘧啶和嘌呤。
在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3连同它们所连接的原子一起形成C3-6碳环，诸如苯基基团。在某些实施方案中，杂环或C3-6碳环被一个或多个烷基基团(例如，在同一个环原子上、或者在相邻或不相邻的环原子上)取代。例如，R2和R3连同它们所连接的原子一起可以形成具有一个或多个C5烷基取代的苯基基团。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物，式(I)化合物选自：
以及它们的盐和异构体。
在其他实施方案中，式(I)化合物选自化合物1至化合物147，或者它们的盐或立体异构体。
在一些实施方案中，提供了包含中心哌嗪部分的可电离脂质。本文所述的脂质可以有利地用于脂质纳米粒子组合物中，这些组合物用于将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物的细胞或器官。例如，本文所述的脂质几乎没有或没有免疫原性。例如，与参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)相比，本文所公开的脂质化合物具有较低的免疫原性。例如，与包含参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)和相同的治疗剂或预防剂的对应制剂相比，包含本文所公开的脂质和治疗剂或预防剂的制剂具有增大的治疗指数。
在一些实施方案中，该递送剂包括具有式(III)的脂质化合物
或者其盐或立体异构体，其中
环A为
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自代表单键；当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”；
每个M独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
X1、X2和X3独立地选自键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH-；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个R独立地选自C1-3烷基和C3-6碳环；
每个R’独立地选自C1-12烷基、C2-12烯基和H；并且
每个R”独立地选自C3-12烷基和C3-12烯基，
其中当环A为时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不是-CH2-；并且/或者
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者是-R”MR’。
在一些实施方案中，该化合物为式(IIIa1)至(IIIa6)中的任一种：
当适用时，式(III)化合物或(IIIa1)至(IIIa6)中任一者的化合物包括下列特征中的一种或多种。
在一些实施方案中，环A为
在一些实施方案中，环A为
在一些实施方案中，环A为
在一些实施方案中，环A为
在一些实施方案中，环A为
在一些实施方案中，环A为其中环，其中N原子与X2连接。
在一些实施方案中，Z为CH2。
在一些实施方案中，Z不存在。
在一些实施方案中，A1和A2中的至少一者为N。
在一些实施方案中，A1和A2中的每一者都为N。
在一些实施方案中，A1和A2中的每一者都为CH。
在一些实施方案中，A1为N并且A2为CH。
在一些实施方案中，A1为CH并且A2为N。
在一些实施方案中，X1、X2和X3中的至少一者不是-CH2-。例如，在某些实施方案中，X1不是-CH2-。在一些实施方案中，X1、X2和X3中的至少一者为-C(O)-。
在一些实施方案中，X2为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-或-CH2-OC(O)-。
在一些实施方案中，X3为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-或-CH2-OC(O)-。在其他实施方案中，X3为-CH2-。
在一些实施方案中，X3为键或-(CH2)2-。
在一些实施方案中，R1和R2是相同的。在某些实施方案中，R1、R2和R3是相同的。在一些实施方案中，R4和R5是相同的。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5是相同的。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-R”MR’。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至多一者为-R”MR’。例如，R1、R2和R3中的至少一者可以为-R”MR’，并且/或者R4和R5中的至少一者为-R”MR’。在某些实施方案中，至少一个M为-C(O)O-。在一些实施方案中，每个M都为-C(O)O-。在一些实施方案中，至少一个M为-OC(O)-。在一些实施方案中，每个M都为-OC(O)-。在一些实施方案中，至少一个M为-OC(O)O-。在一些实施方案中，每个M为-OC(O)O-。在一些实施方案中，至少一个R”为C3烷基。在某些实施方案中，每个R”都为C3烷基。在一些实施方案中，至少一个R”为C5烷基。在某些实施方案中，每个R”都为C5烷基。在一些实施方案中，至少一个R”为C6烷基。在某些实施方案中，每个R”都为C6烷基。在一些实施方案中，至少一个R”为C7烷基。在某些实施方案中，每个R”都为C7烷基。在一些实施方案中，至少一个R’为C5烷基。在某些实施方案中，每个R’都为C5烷基。在其他实施方案中，至少一个R’为C1烷基。在某些实施方案中，每个R’都为C1烷基。在一些实施方案中，至少一个R’为C2烷基。在某些实施方案中，每个R’都为C2烷基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为C12烷基。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的每一者都为C12烷基。
在某些实施方案中，该化合物选自：
在一些实施方案中，该递送剂包括化合物236。
在一些实施方案中，该递送剂包括具有式(IV)的化合物
或者其盐或立体异构体，其中
A1和A2各自独立地选自CH或N，并且A1和A2中的至少一者为N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自代表单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自C6-20烷基和C6-20烯基；
其中当环A为时，则
i)R1、R2、R3、R4和R5是相同的，其中R1不是C12烷基、C18烷基和C18烯基；
ii)R1、R2、R3、R4和R5中只有一者选自C6-20烯基；
iii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者具有与R1、R2、R3、R4和R5中的至少另外一者不同的碳原子数；
iv)R1、R2和R3选自C6-20烯基，R4和R5选自C6-20烷基；或
v)R1、R2和R3选自C6-20烷基，R4和R5选自C6-20烯基。
在一些实施方案中，该化合物为式(IVa)化合物：
当适用时，式(IV)或(IVa)的化合物包括下列特征中的一种或多种。
在一些实施方案中，Z为CH2。
在一些实施方案中，Z不存在。
在一些实施方案中，A1和A2中的至少一者为N。
在一些实施方案中，A1和A2中的每一者都为N。
在一些实施方案中，A1和A2中的每一者都为CH。
在一些实施方案中，A1为N并且A2为CH。
在一些实施方案中，A1为CH并且A2为N。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5是相同的，并且不是C12烷基、C18烷基和C18烯基。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5是相同的，并且为C9烷基或C14烷基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中只有一者选自C6-20烯基。在某些此类实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5具有相同的碳原子数。在一些实施方案中，R4选自C5-20烯基。例如，R4可以为C12烯基或C18烯基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者具有与R1、R2、R3、R4和R5中的至少另外一者不同的碳原子数。
在某些实施方案中，R1、R2和R3选自C6-20烯基，R4和R5选自C6-20烷基。在其他实施方案中，R1、R2和R3选自C6-20烷基，R4和R5选自C6-20烯基。在一些实施方案中，R1、R2和R3具有相同的碳原子数，并且/或者R4和R5具有相同的碳原子数。例如，R1、R2和R3，或R4和R5可以具有6、8、9、12、14或18个碳原子。在一些实施方案中，R1、R2和R3，或R4和R5为C18烯基(例如，亚油基)。在一些实施方案中，R1、R2和R3，或R4和R5为包含6、8、9、12或14个碳原子的烷基基团。
在一些实施方案中，R1具有与R2、R3、R4和R5不同的碳原子数。在其他实施方案中，R3具有与R1、R2、R4和R5不同的碳原子数。在另外的实施方案中，R4具有与R1、R2、R3和R5不同的碳原子数。
在一些实施方案中，该化合物选自：
在其他实施方案中，该递送剂包括具有式(V)的化合物
或者其盐或立体异构体，其中
A3为CH或N；
A4为CH2或NH；并且A3和A4中的至少一者为N或NH；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自代表单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
R1、R2和R3独立地选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”；
每个M独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
X1和X2独立地选自-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个R独立地选自C1-3烷基和C3-6碳环；
每个R’独立地选自C1-12烷基、C2-12烯基和H；并且
每个R”独立地选自C3-12烷基和C3-12烯基。
在一些实施方案中，该化合物为式(Va)化合物：
当适用时，式(V)或(Va)化合物包括下列特征中的一种或多种。
在一些实施方案中，Z为CH2。
在一些实施方案中，Z不存在。
在一些实施方案中，A3和A4中的至少一者为N或NH。
在一些实施方案中，A3为N并且A4为NH。
在一些实施方案中，A3为N并且A4为CH2。
在一些实施方案中，A3为CH并且A4为NH。
在一些实施方案中，X1和X2中的至少一者不是-CH2-。例如，在某些实施方案中，X1不是-CH2-。在一些实施方案中，X1和X2中的至少一者为-C(O)-。
在一些实施方案中，X2为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-或-CH2-OC(O)-。
在一些实施方案中，R1、R2和R3独立地选自C5-20烷基和C5-20烯基。在一些实施方案中，R1、R2和R3是相同的。在某些实施方案中，R1、R2和R3为C6、C9、C12或C14烷基。在其他实施方案中，R1、R2和R3为C18烯基。例如，R1、R2和R3可以为亚油基。
在一些实施方案中，该化合物选自：
在其他实施方案中，该递送剂包括具有式(VI)的化合物：
或者其盐或立体异构体，其中
A6和A7各自独立地选自CH或N，其中A6和A7中的至少一者为N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自代表单键；当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
X4和X5独立地选自-CH2-、-CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”；
每个M独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自C1-12烷基和C2-12烯基；
每个R独立地选自C1-3烷基和C3-6碳环；
每个R’独立地选自C1-12烷基、C2-12烯基和H；并且
每个R”独立地选自C3-12烷基和C3-12烯基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自C6-20烷基和C6-20烯基。
在一些实施方案中，R1和R2是相同的。在某些实施方案中，R1、R2和R3是相同的。在一些实施方案中，R4和R5是相同的。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5是相同的。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为C9-12烷基。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的每一者独立地为C9、C12或C14烷基。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的每一者都为C9烷基。
在一些实施方案中，A6为N并且A7为N。在一些实施方案中，A6为CH并且A7为N。
在一些实施方案中，X4为-CH2-并且X5为-C(O)-。在一些实施方案中，X4和X5为-C(O)-。
在一些实施方案中，当A6为N并且A7为N时，X4和X5中的至少一者不是-CH2-，例如，X4和X5中的至少一者是-C(O)-。在一些实施方案中，当A6为N并且A7为N时，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-R”MR’。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者不是-R”MR’。
在一些实施方案中，该化合物为
在其他实施方案中，该递送剂包括具有下式的化合物：
本文所公开的脂质化合物的胺部分可以在某些条件下质子化。例如，根据式(I)的脂质的中心胺部分典型地在低于氨基部分的pKa的pH下质子化(即带正电)，并且在高于该pKa的pH下基本上不带电。此类脂质可以称为可电离氨基脂质。
在一个具体实施方案中，该可电离氨基脂质为化合物18。在另一个实施方案中，该可电离氨基脂质为化合物236。
在一些实施方案中，该可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)在脂质组合物中的量在约1摩尔％至99摩尔％的范围内。
在一个实施方案中，该可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)在脂质组合物中的量至少为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99摩尔％。
在一个实施方案中，该可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)在脂质组合物中的量在约30摩尔％至约70摩尔％、约35摩尔％至约65摩尔％、约40摩尔％至约60摩尔％，以及约45摩尔％至约55摩尔％的范围内。
在一个具体实施方案中，该可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)在脂质组合物中的量为约50摩尔％。
除了本文所公开的可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)之外，本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含另外的组分，诸如磷脂、结构脂质、PEG-脂质，以及它们的任意组合。
b.磷脂
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种磷脂，例如，一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂或它们的组合。一般来讲，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可以选自例如由下列各项组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。
脂肪酸部分可以选自例如由下列各项组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
特定的磷脂可以促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许含脂质组合物(例如，LNP)的一种或多种元素(例如，治疗剂)穿过膜，从而允许例如一种或多种元素递送至靶组织。
还设想了非天然磷脂物质，包括具有修饰和置换(包括支化、氧化、环化和炔烃类)的天然物质。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替换的烯基基团)官能化或与其交联。在适当的反应条件下，炔烃基团在暴露于叠氮化物时可以经历铜催化的环加成反应。此类反应可以用于官能化纳米粒子组合物的脂质双层，以促进膜渗透或细胞识别或将纳米粒子组合物与有用组分(诸如靶向部分或成像部分(例如，染料))缀合。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂类，诸如鞘磷脂。
磷脂的实例包括但不限于下列各项：
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂为DSPC(1,2-双十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的类似物或变体。在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂为式(IX)的化合物：
(或其盐，其中：
每个R1独立地为任选地被取代的烷基；或任选地，两个R1与间插原子连接在一起形成任选地被取代的单环碳环基或任选地被取代的单环杂环基；或任选地，三个R1与间插原子连接在一起形成任选地被取代的双环碳环基或任选地被取代的双环杂环基；
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式：
L2的每个例子独立地为键或任选地被取代的C1-6亚烷基，其中任选地被取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-替换；
R2的每个例子独立地为任选地被取代的C1-30烷基、任选地被取代的C1-30烯基，或任选地被取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-替换；
RN的每个例子独立地为氢、任选地被取代的烷基，或氮保护基团；
环B为任选地被取代的碳环基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的芳基，或任选地被取代的杂芳基；并且
p为1或2；
前提是该化合物不是下式的化合物：
其中R2的每个例子独立地为未经取代的烷基、未经取代的烯基或未经取代的炔基。
i)磷脂头部修饰
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的磷脂头部(例如，经修饰的胆碱基团)。在某些实施方案中，具有经修饰的头部的磷脂为具有经修饰的季胺的DSPC或其类似物。例如，在式(IX)的一些实施方案中，R1中的至少一者不是甲基。在某些实施方案中，R1中的至少一者不是氢或甲基。在某些实施方案中，式(IX)的化合物为下式中的一种：
或其盐，其中：
每个t独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个u独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
每个v独立地为1、2或3。
在某些实施方案中，式(IX)的化合物为下式中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX)的化合物为以下化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX)的化合物为式(IX-a)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的核心。在某些实施方案中，本文所述的具有经修饰的核心的磷脂为具有经修饰的核心结构的DSPC、或其类似物。例如，在式(IX-a)的某些实施方案中，基团A不具有下式：
在某些实施方案中，式(IX-a)的化合物为下式中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX)化合物为以下化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含代替甘油酯部分的环状部分。在某些实施方案中，在本发明中有用的磷脂为具有代替甘油酯部分的环状部分的DSPC(1,2-双十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、或其类似物。在某些实施方案中，式(IX)的化合物为式(IX-b)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物为式(IX-b-1)的化合物：
或其盐，其中：
w为0、1、2或3。
在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物为式(IX-b-2)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物为式(IX-b-3)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物为式(IX-b-4)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-b)的化合物为以下中的一种：
或其盐。
(ii)磷脂尾部修饰
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的尾部。在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂为具有经修饰的尾部的DSPC(1,2-双十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、或其类似物。如本文所述，“经修饰的尾部”可以是具有以下脂族链的尾部：更短或更长的脂族链、具有引入的支化的脂族链、具有引入的取代基的脂族链、其中一个或多个亚甲基被环状基团或杂原子基团替换的脂族链，或它们的任意组合。例如，在某些实施方案中，式(IX)的化合物为式(IX-a)化合物或其盐，其中R2的至少一个例子为R2的每个例子都为任选地被取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-替换。
在某些实施方案中，式(IX)化合物为式(IX-c)化合物：
或其盐，其中：
每个x独立地为介于0与30之间(包括端值在内)的整数；并且
每个例子为G独立地选自任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-。每种可能性都代表本发明的独立实施方案。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为式(IX-c-1)的化合物：
或其盐，其中：
v的每个例子独立地为1、2或3。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为式(IX-c-2)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为下式化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为以下化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为式(IX-c-3)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为下式的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为以下的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂包含经修饰的磷酸胆碱部分，其中将季胺连接到磷酰基基团的烷基链不是乙烯(例如，n不是2)。因此，在某些实施方案中，在本发明中有用或可能有用的磷脂为式(IX)的化合物，其中n为1、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，式(IX)的化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX)的化合物为以下中的一种：
或其盐。
c.替代性脂质
在某些实施方案中，使用替代性脂质来代替本发明的磷脂。此类替代性脂质的非限制性实例包括下列各项：
d.结构脂质
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质。
将结构脂质掺入在脂质纳米粒子中可以有助于减轻该粒子中的其他脂质的聚集。结构脂质可以选自包括但不限于下列各项的组：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄次碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、藿烷类化合物、植物甾醇、类固醇，以及它们的混合物。在一些实施方案中，该结构脂质为甾醇。如本文所定义，“甾醇”为由类固醇醇类组成的类固醇亚组。在某些实施方案中，该结构脂质为类固醇。在某些实施方案中，该结构脂质为胆固醇。在某些实施方案中，该结构脂质为胆固醇的类似物。在某些实施方案中，该结构脂质为α-生育酚。结构脂质的实例包括但不限于下列各项：
在一个实施方案中，本文所公开的药物组合物的脂质组合物中的结构脂质(例如甾醇，诸如胆固醇)的量在约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、约30摩尔％至约50摩尔％、或约35摩尔％至约45摩尔％的范围内。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的结构脂质(例如甾醇，诸如胆固醇)的量在约25摩尔％至约30摩尔％、约30摩尔％至约35摩尔％、或约35摩尔％至约40摩尔％的范围内。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的结构脂质(例如甾醇，诸如胆固醇)的量为约24摩尔％、约29摩尔％、约34摩尔％或约39摩尔％。
在一些实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的结构脂质(例如甾醇，诸如胆固醇)的量为至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60摩尔％。
e.聚乙二醇(PEG)-脂质
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种聚乙二醇(PEG)脂质。
如本文所用，术语“PEG-脂质”是指经聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG-脂质的非限制性实例包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、经PEG修饰的二烷基胺和经PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称为PEG化脂质。例如，PEG-脂质可以为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，该PEG-脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油酰基(PEG-dipalmetoleyl)、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，该PEG-脂质选自经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油，以及它们的混合物。
在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22，优选地约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分，例如mPEG-NH2，具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，该PEG-脂质为PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子可以包含是不可扩散的PEG的PEG-脂质。不可扩散的PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG-脂质是本领域已知的，诸如美国专利号8158601和国际公开号WO 2015/130584A2中所述的那些，这些专利全文以引用方式并入本文。
一般来讲，本文所述的各种配方的其他脂质组分(例如，PEG-脂质)中的一些可以如2016年12月10日提交的名称为“Compositions and Methods for Delivery ofTherapeutic Agents”的国际专利申请号PCT/US2016/000129所述合成，该专利申请全文以引用方式并入本文。
脂质纳米粒子组合物的脂质组分可以包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，诸如PEG-脂质或经PEG修饰的脂质。此类物质可以供选择地称为PEG化脂质。PEG-脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG-脂质可以选自包括以下各项的非限制性组：经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油，以及它们的混合物。例如，PEG-脂质可以为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，这些经PEG修饰脂质为PEG DMG的经修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：
在一个实施方案中，在本发明中有用的PEG-脂质可以是国际公布号WO2012099755中所述的PEG化脂质，该国际公布的内容全文以引用方式并入本文。可以修饰本文所述的这些示例性PEG-脂质中的任一种，以便在PEG链上包含羟基基团。在某些实施方案中，该PEG-脂质为PEG-OH脂质。如本文一般定义的，“PEG-OH脂质”(在本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)基团的PEG化脂质。在某些实施方案中，该PEG-OH脂质在PEG链上包含一个或多个羟基基团。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端处包含-OH基团。每种可能性都代表本发明的独立实施方案。
在某些实施方案中，可用于本发明的PEG-脂质为式(VII)的化合物。本文提供了式(VII)的化合物：
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选地被取代的烷基，或氧保护基团；
r为介于1与100之间(包括端值在内)的整数；
L1为任选地被取代的C1-10亚烷基，其中任选地被取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)替换；
D为通过点击化学获得的部分或在生理条件下可切割的部分；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式：
L2的每个例子独立地为键或任选地被取代的C1-6亚烷基，其中任选地被取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-替换；
R2的每个例子独立地为任选地被取代的C1-30烷基、任选地被取代的C1-30烯基，或任选地被取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-替换；
RN的每个例子独立地为氢、任选地被取代的烷基，或氮保护基团；
环B为任选地被取代的碳环基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的芳基，或任选地被取代的杂芳基；并且
p为1或2。
在某些实施方案中，式(VII)的化合物为PEG-OH脂质(即，R3为-ORO，并且RO为氢)。在某些实施方案中，式(VII)的化合物为式(VII-OH)化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，D为通过点击化学获得的部分(例如，三唑)。在某些实施方案中，式(VII)的化合物为式(VII-a-1)或(VII-a-2)化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)化合物为下式化合物中的一种：
或其盐，其中
s为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在某些实施方案中，式(VII)的化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)的化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，D为在生理条件下可切割的部分(例如，酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、脲)。在某些实施方案中，式(VII)的化合物为式(VII-b-1)或(VII-b-2)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)的化合物为式(VII-b-1-OH)或(VII-b-2-OH)的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)的化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，式(VII)的化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。
在某些实施方案中，可用于本发明的PEG-脂质为PEG化脂肪酸。在某些实施方案中，可用于本发明的PEG-脂质为式(VIII)的化合物。本文提供了式(VIII)的化合物：
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选地被取代的烷基，或氧保护基团；
r为介于1与100之间(包括端值在内)的整数；
R5为任选地被取代的C10-40烷基、任选地被取代的C10-40烯基，或任选地被取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基基团被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-替换；并且
RN的每个例子独立地为氢、任选地被取代的烷基，或氮保护基团。
在某些实施方案中，式(VIII)的化合物为式(VIII-OH)的化合物：
或其盐。在一些实施方案中，r为45。
在某些实施方案中，式(VIII)的化合物为下式化合物中的一种：
或其盐。在一些实施方案中，r为45。
在还有其他实施方案中，式(VIII)的化合物为：
或其盐。
在一个实施方案中，式(VIII)化合物为
在一个实施方案中，本文所公开的药物组合物的脂质组合物中的PEG-脂质的量在以下范围内：约0.1摩尔％至约5摩尔％、约0.5摩尔％至约5摩尔％、约1摩尔％至约5摩尔％、约1.5摩尔％至约5摩尔％、约2摩尔％至约5摩尔％摩尔％、约0.1摩尔％至约4摩尔％、约0.5摩尔％至约4摩尔％、约1摩尔％至约4摩尔％、约1.5摩尔％至约4摩尔％、约2摩尔％至约4摩尔％、约0.1摩尔％至约3摩尔％、约0.5摩尔％至约3摩尔％、约1摩尔％至约3摩尔％、约1.5摩尔％至约3摩尔％、约2摩尔％至约3摩尔％、约0.1摩尔％至约2摩尔％、约0.5摩尔％至约2摩尔％、约1摩尔％至约2摩尔％、约1.5摩尔％至约2摩尔％、约0.1摩尔％至约1.5摩尔％、约0.5摩尔％至约1.5摩尔％，或约1摩尔％至约1.5摩尔％。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的PEG-脂质的量为约2摩尔％。在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的PEG-脂质的量为约1.5摩尔％。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的PEG-脂质的量为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5摩尔％。
在一些方面，本文所公开的药物组合物的脂质组合物不包含PEG-脂质。
f.其他可电离氨基脂质
除了根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的脂质之外或代替这些脂质，本文所公开的药物组合物的脂质组合物还可以包含一种或多种可电离氨基脂质。
可电离脂质可以选自由下列各项组成的非限制性组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-八三十八烷(KL25)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、(13Z,165Z)-N,N-二甲基-3-二十九碳-13-16-二烯-1-胺(L608)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))、(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。除这些之外，可电离氨基脂质也可以是包含环胺基的脂质。
可电离脂质也可以是国际公布号WO 2017/075531 A1中所公开的化合物，该公布据此全文以引用方式并入本文。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：
以及它们的任意组合。
可电离脂质也可以是国际公布号WO 2015/199952 A1中所公开的化合物，该公布据此全文以引用方式并入本文。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：
以及它们的任意组合。
g.纳米粒子组合物
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含除上述那些之外的一种或多种组分。例如，该脂质组合物可以包含一种或多种渗透增强剂分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂(例如，表面活性剂)，或其他组分。例如，渗透增强剂分子可以是美国专利申请公布号2005/0222064所描述的分子。碳水化合物可以包括单糖(例如，葡萄糖)和多糖(例如，糖原及其衍生物和类似物)。
聚合物可以包含在本文所公开的药物组合物(例如，脂质纳米粒子形式的药物组合物)中和/或用于包封或部分包封该药物组合物。聚合物可以是可生物降解的和/或生物相容的。聚合物可以选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨基甲酸乙酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。
脂质组合物与多核苷酸之间的比率的范围可以为约10:1至约60:1(重量/重量)。
在一些实施方案中，脂质组合物与多核苷酸之间的比率可以为约10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1或60:1(重量/重量)。在一些实施方案中，脂质组合物与编码治疗剂的多核苷酸的重量比为约20:1或约15:1。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子可以按以下的脂质与多核苷酸重量比包含多核苷酸(例如，mRNA)：5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1或70:1，或者这些比率的范围或这些比率中的任一种，诸如但不限于5:1至约10:1、约5:1至约15:1、约5:1至约20:1、约5:1至约25:1、约5:1至约30:1、约5:1至约35:1、约5:1至约40:1、约5:1至约45:1、约5:1至约50:1、约5:1至约55:1、约5:1至约60:1、约5:1至约70:1、约10:1至约15:1、约10:1至约20:1、约10:1至约25:1、约10:1至约30:1、约10:1至约35:1、约10:1至约40:1、约10:1至约45:1、约10:1至约50:1、约10:1至约55:1、约10:1至约60:1、约10:1至约70:1、约15:1至约20:1、约15:1至约25:1、约15:1至约30:1、约15:1至约35:1、约15:1至约40:1、约15:1至约45:1、约15:1至约50:1、约15:1至约55:1、约15:1至约60:1或约15:1至约70:1。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子可以包含浓度为大约0.1mg/ml至2mg/ml的多核苷酸，其浓度诸如但不限于0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml或大于2.0mg/ml。
在一些实施方案中，将本文所公开的药物组合物配制为脂质纳米粒子(LNP)。因此，本公开还提供纳米粒子组合物，其包含：(i)包含递送剂(诸如，如本文所述的式(I)或(III)化合物)的脂质组合物，和(ii)编码感兴趣多肽的多核苷酸。在此类纳米粒子组合物中，本文所公开的脂质组合物可以包封编码感兴趣多肽的多核苷酸。
纳米粒子组合物的尺寸典型地为微米级或更小，并且可以包括脂质双层。纳米粒子组合物涵盖脂质纳米粒子(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物(lipoplexe)。例如，纳米粒子组合物可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。
纳米粒子组合物包括例如脂质纳米粒子(LNP)、脂质体和脂质复合物。在一些实施方案中，纳米粒子组合物是包含一个或多个脂质双层的囊泡。在某些实施方案中，纳米粒子组合物包括由水性隔室隔开的两个或更多个同心双层。脂质双层可以官能化和/或彼此交联。脂质双层可以包括一种或多种配体、蛋白质或通道。
在一些实施方案中，本公开的纳米粒子组合物包含至少一种根据式(I)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物。例如，该纳米粒子组合物可以包含化合物1至147中的一种或多种，或者化合物1至342中的一种或多种。纳米粒子组合物还可以包含多种其他组分。例如，除了根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的脂质之外，该纳米粒子组合物可以包含一种或多种其他脂质，诸如(i)至少一种磷脂、(ii)至少一种结构脂质、(iii)至少一种PEG-脂质，或(iv)它们的任意组合。包含结构脂质可以是任选的，例如，当根据式III的脂质用于本发明的脂质纳米粒子组合物中时。
在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)。在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC)。
在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含式(III)的化合物(例如，化合物236)。在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含式(III)的化合物(例如，化合物236)和磷脂(例如，DOPE或DSPC)。
在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含由式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)组成或基本上由其组成的脂质组合物。在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含由式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC)组成或基本上由它们组成的脂质组合物。
在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含由式(III)的化合物(例如，化合物236)组成或基本上由其组成的脂质组合物。在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含由式(III)的化合物(例如，化合物236)和磷脂(例如，DOPE或DSPC)组成或基本上由它们组成的脂质组合物。
在一个实施方案中，脂质纳米粒子包含可电离脂质、结构脂质、磷脂、经PEG修饰的脂质和mRNA。在一些实施方案中，该LNP包含可电离脂质、经PEG修饰脂质、甾醇和磷脂。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质:磷脂:甾醇:经PEG修饰脂质的摩尔比为约20％至60％:约5％至25％:约25％至55％:约0.5％至15％。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质、经PEG修饰脂质、胆固醇和磷脂的摩尔比为约50％:约1.5％:约38.5％:约10％。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质、PEG-脂质、胆固醇和磷脂的摩尔比为约55％:约2.5％:约32.5％:约10％。在一些实施方案中，可电离脂质为可电离氨基脂质，中性脂质为磷脂，并且甾醇为胆固醇。在一些实施方案中，该LNP中的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG-脂质的摩尔比为50:38.5:10:1.5。在一些实施方案中，可电离脂质为化合物18或化合物236，PEG-脂质为化合物428或PEG-DMG。
在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:磷脂:化合物428的摩尔比为50:38.5:10:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:DSPC:化合物428的摩尔比为50:38.5:10:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:磷脂:PEG-DMG的摩尔比为50:38.5:10:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:DSPC:PEG-DMG的摩尔比为50:38.5:10:1.5。
在一些实施方案中，该LNP中的化合物236:胆固醇:磷脂:化合物428的摩尔比为50:38.5:10:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物236:胆固醇:DSPC:化合物428的摩尔比为50:38.5:10:1.5。
在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:磷脂:化合物428的摩尔比为40:38.5:20:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:DSPC:化合物428的摩尔比为40:38.5:20:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:磷脂:PEG-DMG的摩尔比为40:38.5:20:1.5。在一些实施方案中，该LNP中的化合物18:胆固醇:DSPC:PEG-DMG的摩尔比为40:38.5:20:1.5。
在一些实施方案中，纳米粒子组合物可以具有化合物18:磷脂:胆固醇:化合物428的摩尔比为50:10:38.5:1.5的配方。在一些实施方案中，纳米粒子组合物可以具有化合物18:DSPC:胆固醇:化合物428的摩尔比为50:10:38.5:1.5的配方。在一些实施方案中，纳米粒子组合物可以具有化合物18:磷脂:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为50:10:38.5:1.5的配方。在一些实施方案中，纳米粒子组合物可以具有化合物18:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为50:10:38.5:1.5的配方。
在一些实施方案中，该LNP的多分散性值小于0.4。在一些实施方案中，该LNP在中性pH下具有净中性电荷。在一些实施方案中，该LNP的平均直径为50nm至150nm。在一些实施方案中，该LNP的平均直径为80nm至100nm。
如本文一般定义的，术语“脂质”是指具有疏水特性或两亲特性的小分子。脂质可以是天然存在的或合成的。脂质种类的实例包括但不限于脂肪、蜡、含甾醇的代谢物、维生素、脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮化合物，以及孕烯醇酮脂质。在一些情况下，一些脂质的两亲特性导致它们在水性介质中形成脂质体、囊泡或膜。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子(LNP)可以包含可电离脂质。如本文所用，术语“可电离脂质”具有其在本领域中的普通含义，并且可以指包含一个或多个带电部分的脂质。在一些实施方案中，可电离脂质可以带正电或带负电。可电离脂质可以带正电，在这种情况下，它可以称为“阳离子脂质”。在某些实施方案中，可电离脂质分子可以包含胺基，并且可以称为可电离氨基脂质。如本文所用，“带电部分”是携带形式电子电荷的化学部分，例如，单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。该带电部分可以是阴离子的(即，带负电的)或阳离子的(即，带正电的)。带正电部分的实例包括胺基(例如，伯胺、仲胺和/或叔胺)、铵基、吡啶鎓基、胍基和咪唑鎓基。在一个具体实施方案中，带电部分包括胺基。带负电基团或其前体的实例包括羧酸酯基团、磺酸酯基团、硫酸酯基团、膦酸酯基团、磷酸酯基团、羟基基团等。在一些情况下，带电部分的电荷可以随环境条件而变化，例如，pH的变化可以改变该部分的电荷，和/或使该部分变得带电或不带电。一般来讲，可以根据需要选择分子的电荷密度。
应当理解，术语“带电”或“带电部分”不是指分子上的“部分负电荷”或“部分正电荷”。术语“部分负电荷”和“部分正电荷”在本领域中具有其普通含义。当官能团包含变得极化的键，使得电子密度被拉向该键的一个原子，从而在该原子上产生部分负电荷时，可能产生“部分负电荷”。一般来讲，本领域的普通技术人员将认识到可以通过这种方式变得极化的键。
在一些实施方案中，可电离脂质为可电离氨基脂质，在本领域有时称为“可电离阳离子脂质”。在一个实施方案中，可电离氨基脂质可以具有带正电的亲水性头部和疏水性尾部，它们经由连接体结构连接。
除这些之外，可电离脂质也可以是包含环胺基的脂质。
在一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于国际公布号WO2013086354和WO2013116126中所述的可电离脂质；这些国际公布中每一者的内容全文以引用方式并入本文。
在又一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII；这些式中的每一者全部以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，脂质可以是可切割的脂质，诸如国际公布号WO2012170889中所述的那些，该国际公布全文以引用方式并入本文。在一个实施方案中，该脂质可以通过本领域已知的方法合成和/或如国际公布号WO2013086354中所述合成；这些国际公布中每一者的内容全文以引用方式并入本文。
纳米粒子组合物可以通过多种方法表征。例如，显微术(例如，透射电子显微镜或扫描电子显微镜)可以用于检查纳米粒子组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如，电位测定滴定)可以用于测量ζ电位。动态光散射还可以用于测定粒径。还可以使用诸如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)的仪器来测量纳米粒子组合物的多种特征，诸如粒度、多分散性指数和ζ电位。
在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含由式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)组成或基本上由其组成的脂质组合物。在一些实施方案中，该纳米粒子组合物包含由式(I)的化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC或MSPC)组成或基本上由它们组成的脂质组合物。
纳米粒子组合物可以通过多种方法表征。例如，显微术(例如，透射电子显微镜或扫描电子显微镜)可以用于检查纳米粒子组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如，电位测定滴定)可以用于测量ζ电位。动态光散射还可以用于测定粒径。还可以使用诸如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)的仪器来测量纳米粒子组合物的多种特征，诸如粒度、多分散性指数和ζ电位。
纳米粒子的尺寸可以帮助抵抗生物反应，诸如但不限于炎症，或者可以增大多核苷酸的生物学效应。
如本文所用，在纳米粒子组合物的背景下的“尺寸”或“平均尺寸”是指纳米粒子组合物的平均直径。
在一个实施方案中，将编码感兴趣多肽的多核苷酸配制在直径为约10nm至约100nm的脂质纳米粒子中，该直径诸如但不限于约10nm至约20nm、约10nm至约30nm、约10nm至约40nm、约10nm至约50nm、约10nm至约60nm、约10nm至约70nm、约10nm至约80nm、约10nm至约90nm、约20nm至约30nm、约20nm至约40nm、约20nm至约50nm、约20nm至约60nm、约20nm至约70nm、约20nm至约80nm、约20nm至约90nm、约20nm至约100nm、约30nm至约40nm、约30nm至约50nm、约30nm至约60nm、约30nm至约70nm、约30nm至约80nm、约30nm至约90nm、约30nm至约100nm、约40nm至约50nm、约40nm至约60nm、约40nm至约70nm、约40nm至约80nm、约40nm至约90nm、约40nm至约100nm、约50nm至约60nm、约50nm至约70nm、约50nm至约80nm、约50nm至约90nm、约50nm至约100nm、约60nm至约70nm、约60nm至约80nm、约60nm至约90nm、约60nm至约100nm、约70nm至约80nm、约70nm至约90nm、约70nm至约100nm、约80nm至约90nm、约80nm至约100nm，和/或约90nm至约100nm。
在一个实施方案中，这些纳米粒子具有约10nm至500nm的直径。在一个实施方案中，该纳米粒子具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一些实施方案中，纳米粒子组合物的最大尺寸为1μm或更短(例如，1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm或更短)。
纳米粒子组合物可以是相对均匀的。多分散性指数可以用于指示纳米粒子组合物的均质性，例如，该纳米粒子组合物的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。纳米粒子组合物可以具有约0至约0.25的多分散性指数，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，本文所公开的纳米粒子组合物的多分散性指数可以为约0.10至约0.20。
纳米粒子组合物的ζ电位可以用于指示该组合物的电动电位。例如，该ζ电位可以描述纳米粒子组合物的表面电荷。通常需要具有相对低电荷(正或负)的纳米粒子组合物，因为带更高电荷的物质可能与体内的细胞、组织和其他元素不期望地相互作用。在一些实施方案中，本文所公开的纳米粒子组合物的ζ电位可以为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV，或约+5mV至约+10mV。
在一些实施方案中，这些脂质纳米粒子的ζ电位可以为约0mV至约100mV、约0mV至约90mV、约0mV至约80mV、约0mV至约70mV、约0mV至约60mV、约0mV至约50mV、约0mV至约40mV、约0mV至约30mV、约0mV至约20mV、约0mV至约10mV、约10mV至约100mV、约10mV至约90mV、约10mV至约80mV、约10mV至约70mV、约10mV至约60mV、约10mV至约50mV、约10mV至约40mV、约10mV至约30mV、约10mV至约20mV、约20mV至约100mV、约20mV至约90mV、约20mV至约80mV、约20mV至约70mV、约20mV至约60mV、约20mV至约50mV、约20mV至约40mV、约20mV至约30mV、约30mV至约100mV、约30mV至约90mV、约30mV至约80mV、约30mV至约70mV、约30mV至约60mV、约30mV至约50mV、约30mV至约40mV、约40mV至约100mV、约40mV至约90mV、约40mV至约80mV、约40mV至约70mV、约40mV至约60mV，以及约40mV至约50mV。在一些实施方案中，这些脂质纳米粒子的ζ电位可以为约10mV至约50mV、约15mV至约45mV、约20mV至约40mV，以及约25mV至约35mV。在一些实施方案中，这些脂质纳米粒子的ζ电位可以为约10mV、约20mV、约30mV、约40mV、约50mV、约60mV、约70mV、约80mV、约90mV和约100mV。
多核苷酸的术语“包封效率”描述了相对于所提供的初始量，在制备后由纳米粒子组合物包封或以其他方式与纳米粒子组合物缔合的多核苷酸的量。如本文所用，“包封”可以指完全、基本或部分包围、限制、围绕或包裹(encasement)。
期望有很高的包封效率(例如，接近100％)。可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎纳米粒子组合物之前和之后含有该纳米粒子组合物的溶液中的多核苷酸的量来测量包封效率。
可以使用荧光来测量溶液中的游离多核苷酸的量。对于本文所述的纳米粒子组合物，多核苷酸的包封效率可以为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可以为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可以为至少90％。
本文所公开的药物组合物中存在的多核苷酸的量可以取决于多种因素，诸如多核苷酸的大小、所需的靶标和/或应用，或纳米粒子组合物的其他特性，以及多核苷酸的特性。
例如，可用于纳米粒子组合物中的mRNA的量可以取决于该mRNA的大小(表示为长度或分子质量)、序列和其他特征。纳米粒子组合物中的多核苷酸的相对量也可以变化。
可以根据功效和耐受性方面的考虑来优化本公开的脂质纳米粒子组合物中存在的脂质组合物和多核苷酸的相对量。对于包含mRNA作为多核苷酸的组合物，N:P比率可以作为有用的度量。
由于纳米粒子组合物的N:P比率控制表达和耐受性这两者，因此期望的是具有低N:P比率和强表达的纳米粒子组合物。N:P比率根据纳米粒子组合物中脂质与RNA的比率而变化。
一般来讲，较低的N:P比率是优选的。可以选择一种或多种RNA、脂质以及它们的量，来提供约2:1至约30:1(诸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1)的N:P比率。在某些实施方案中，N:P比率可以为约2:1至约8:1。在其他实施方案中，N:P比率为约5:1至约8:1。在某些实施方案中，N:P比率介于5:1与6:1之间。在一个具体方面，N:P比率为约5.67:1。
除了提供纳米粒子组合物之外，本公开还提供了制备脂质纳米粒子(包括包封多核苷酸)的方法。此类方法包括使用本文所公开的任何药物组合物，并且根据本领域已知的脂质纳米粒子制备方法产生脂质纳米粒子。参见例如Wang等人，(2015)“Delivery ofoligonucleotides with lipid nanoparticles”Adv.Drug Deliv.Rev.87:68-80；Silva等人，(2015)“Delivery Systems for Biopharmaceuticals.第I部分：Nanoparticles andMicroparticles”Curr.Pharm.Technol.16:940-954；Naseri等人，(2015)“Solid LipidNanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers:Structure,Preparation andApplication”Adv.Pharm.Bull.5:305-13；Silva等人，(2015)“Lipid nanoparticles forthe delivery of biopharmaceuticals”Curr.Pharm.Biotechnol.16:291-302，以及其中引用的参考文献。
药物组合物
本公开包括药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂结合的本文所述的mRNA或纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)。在具体实施方案中，该mRNA存在于纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)中。在具体实施方案中，该mRNA或纳米粒子存在于药物组合物中。在各种实施方案中，该药物组合物中存在的一种或多种mRNA包封在纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)中。在具体实施方案中，第一mRNA与第二mRNA的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1，或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在具体实施方案中，第一mRNA与第二mRNA的摩尔比大于1:1。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含编码感兴趣抗原(Ag)的mRNA和编码增强对感兴趣抗原的免疫应答的多肽(例如，免疫增强剂(IP)，例如STING多肽)的mRNA，其中所述编码感兴趣抗原(Ag)的mRNA和所述编码增强对感兴趣抗原的免疫应答的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)(IP)的mRNA以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或20:1的Ag:IP质量比配制。作为替代，IP:Ag质量比可以为例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20。在一些实施方案中，该组合物以编码感兴趣抗原的mRNA与编码增强对感兴趣抗原的免疫的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)的mRNA为1:1、1.25:1、1.50:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2.50:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.50:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.50:1、4.75:1或5:1的Ag:IP质量比配制。在一些实施方案中，该组合物以编码感兴趣抗原的mRNA与编码增强对感兴趣抗原的免疫的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)的mRNA为5:1的质量比配制(Ag与IP之比为5:1；或者作为替代，IP与Ag之比为1:5)。在一些实施方案中，该组合物以编码感兴趣抗原的mRNA与编码增强对感兴趣抗原的免疫的多肽(例如，免疫增强剂，例如STING多肽)的mRNA为10:1的质量比配制(Ag与IP之比为10:1，或作为替代，IP与Ag之比为1:10)。
含有编码免疫增强剂的mRNA构建体和编码感兴趣抗原的mRNA构建体这两者的共同配制的制剂可能对致敏CD8+ T细胞和诱导抗原特异性免疫应答(例如，抗肿瘤免疫)特别有益。在该领域中已经报道，通过病原体相关分子模式(PAMP)直接激活抗原呈递细胞(APC)是CD8+ T细胞致敏所必需的，而由促炎介质间接激活的APC在致敏CD8+ T细胞方面无效(Kratky,W.等人，(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:17414-17419)。因此，编码免疫增强剂的mRNA构建体和编码感兴趣抗原的mRNA构建体的共同配制的制剂可能对直接激活APC和致敏CD8+ T细胞特别有益。
药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如，治疗活性物质和/或预防活性物质。本公开的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。配制和/或制造药剂中的一般考虑因素可以在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins,2005(全文以引用方式并入本文)中找到。在具体实施方案中，药物组合物包含mRNA和脂质纳米粒子、或它们的复合物。
本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知或以后开发的任何方法制备。一般来讲，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如果有必要和/或期望，将产品分割、成形和/或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以根据所治疗的受试者的身份、大小和/或状况且进一步根据施用该组合物的途径而变化。举例来说，该组合物可以包含介于0.1％与100％之间，例如，介于0.5％与70％之间、介于1％与30％之间、介于5％与80％之间、或至少80％(重量/重量)的活性成分。
可以使用一种或多种赋形剂来配制本公开的mRNA，以便：(1)增大稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续释放或延迟释放(例如，从该mRNA的贮库制剂中)；(4)改变生物分布(例如，将该mRNA靶向特定的组织类型或细胞类型)；(5)增加由该mRNA在体内编码的多肽的翻译；和/或(6)改变由该mRNA在体内编码的多肽的释放特征。除了传统的赋形剂诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本公开的赋形剂还可以包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米粒子(例如，脂质体和胶束)、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、碳水化合物、用mRNA转染的细胞(例如，用于移植到受试者体内)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物，以及它们的组合。因此，本公开的制剂可以包含一种或多种赋形剂，每种赋形剂的量一同增大该mRNA的稳定性、增加该mRNA的细胞转染、增加该mRNA编码的多肽的表达，和/或改变mRNA编码的多肽的释放特征。此外，可以使用自组装核酸纳米粒子来配制本公开的mRNA。
用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；该文献全文以引用方式并入本文)。可以设想使用常规赋形剂介质在本公开的范围之内，除非任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，例如由于产生了任何不期望的生物学效应、或者说以有害的方式与该药物组合物的任何其他一种或多种组分相互作用。赋形剂可以包括例如：抗粘附剂、抗氧化剂、粘结剂、涂料、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或涂料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸(氢)钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧甲基淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以包括至少一种药学上可接受的盐。可以包含在本公开的制剂中的药学上可接受的盐的实例包括但不限于酸加成盐、碱金属盐或碱土金属盐、碱性残基(诸如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲基胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种类型的多核苷酸。作为一个非限制性实例，这些制剂可以含有本文所述的1、2、3、4、5种或多于5种mRNA。在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种编码多肽的mRNA和至少一种核酸序列，诸如但不限于siRNA、shRNA、snoRNA和miRNA。
用于例如肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液、混悬液、糖浆和/或酏剂。除活性成分之外，液体剂型还可以包含本领域常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、乙基碳酸酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除惰性稀释剂之外，这些口服组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和/或悬浮剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂混合，这些增溶剂诸如醇、油、改性油、二醇、聚山梨酸酯、环糊精、聚合物，和/或它们的组合。
可以使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬剂。无菌可注射制剂可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液和/或乳剂，例如，1,3-丁二醇中的溶液的形式。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。无菌的非挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸)可以用于制备可注射制剂。可以将可注射制剂灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，和/或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述灭菌剂可以在使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。
在一些实施方案中，将包含至少一种本文所述mRNA的药物组合物施用于哺乳动物(例如人)。尽管本文所提供的药物组合物的描述主要涉及适合于向人施用的药物组合物，但技术人员将理解，此类组合物通常适合施用于任何其他动物，例如非人哺乳动物。对适合施用于人的药物组合物进行修饰以便使这些组合物适合施用于各种动物是很好理解的，并且有普通技术的兽医药理学家可以仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和/或进行这种修饰。设想向其施用这些药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。在具体实施方案中，向受试者提供两种或更多种本文所述的mRNA。在具体实施方案中，将第一mRNA和第二mRNA同时或在不同时间(例如，相继地)提供给受试者。在具体实施方案中，将第一mRNA和第二mRNA在相同的药物组合物或制剂中提供给受试者，例如，以促进相同的细胞摄取这两种mRNA。
本公开还包括试剂盒，其包括容器，该容器包含编码增强免疫应答的多肽的mRNA。在另一个实施方案中，该试剂盒包括容器，该容器包含编码增强免疫应答的多肽的mRNA、以及编码一种或多种感兴趣抗原的一种或多种另外的mRNA。在其他实施方案中，该试剂盒包括第一容器和第二容器，该第一容器包含编码增强免疫应答的多肽的mRNA，该第二容器包含编码一种或多种感兴趣抗原的一种或多种mRNA。在具体实施方案中，用于增强免疫应答的mRNA和编码一种或多种抗原的一种或多种mRNA存在于相同或不同的纳米粒子和/或药物组合物中。在具体实施方案中，这些mRNA是冻干、干燥或冷冻干燥的。
增强免疫应答的方法
本公开提供了用于增强受试者(例如，人受试者)体内对感兴趣抗原的免疫应答的方法。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用本公开的包含至少一种mRNA构建体的组合物(或其脂质纳米粒子、或其药物组合物)，所述至少一种mRNA构建体编码：(i)至少一种感兴趣抗原和(ii)增强针对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的多肽，使得增强对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答。在一个实施方案中，增强免疫应答包括刺激细胞因子产生。在另一个实施方案中，增强免疫应答包括增强细胞免疫(T细胞应答)，诸如刺激抗原特异性CD8+ T细胞活性、刺激抗原特异性CD4+ T细胞活性或增加“效应记忆”CD62Llo T细胞的百分比。在另一个实施方案中，增强免疫应答包括增强体液免疫(B细胞应答)，诸如刺激抗原特异性抗体产生。
在该方法的一个实施方案中，该免疫增强剂mRNA编码刺激I型干扰素途径信号传导的多肽(例如，该免疫增强剂编码多肽诸如STING、IRF3、IRF7，或本文所述的另外的免疫增强剂中的任一种)。在该方法的各种其他实施方案中，免疫增强剂编码刺激NFkB途径信号传导、刺激炎症应答或刺激树突状细胞的发育、活性或动员的多肽。在一个实施方案中，该方法包括在向受试者施用刺激I型干扰素途径信号传导的mRNA组合物之前向该受试者施用刺激树突状细胞的发育、活性或动员的mRNA组合物。例如，可以在施用刺激I型干扰素途径信号传导的mRNA组合物之前1至30天(例如3天、5天、7天、10天、14天、21天、28天)施用刺激树突状细胞的发育或活性的该mRNA组合物。
本公开的免疫增强剂对受试者体内针对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的增强可以通过本领域中建立的用于评估免疫应答的多种方法来评估，包括但不限于实施例中所述的方法。例如，在各种实施方案中，通过CD8+细胞中IFN-γ或TNF-α的细胞内染色(ICS)水平、脾或外周CD8b+细胞的百分比、或者脾或外周“效应记忆”CD62Llo细胞的百分比来评估增强。
据报道，STING介导的信号传导的结果可以在不同细胞类型之间变化，与其他细胞类型(例如，巨噬细胞和树突状细胞)相比，T细胞尤其表现出更强的STING应答，并且T细胞表现出增大的STING表达水平(Gulen,M.F.等人，(2017)Nature Comm.8(1):427)。因此，STING信号传导的幅度可以导致不同的效应应答，从而允许根据剂量、细胞类型表达和/或与感兴趣抗原共同配制(例如，Ag:STING比率)来调节和微调STING介导的应答。实施例中描述的数据指示存在很宽的治疗窗，其中STING表现出增强抗原特异性免疫应答方面的有效性。
本公开的组合物以有效量施用于受试者。一般来讲，有效量的该组合物将允许在细胞中有效地产生编码的多肽。效率的度量可以包括多肽翻译(由多肽表达指示)、mRNA降解水平和免疫应答指标。
诱导免疫原性细胞死亡的方法
本发明提供了在细胞(例如，哺乳动物细胞)中诱导免疫原性细胞死亡的方法。在一个实施方案中，该细胞为人细胞。在一些实施方案中，在细胞中诱导免疫原性细胞死亡的方法涉及使细胞与本文所述的mRNA接触，所述mRNA例如编码诱导免疫原性细胞死亡(诸如坏死性凋亡或细胞焦亡)的多肽的mRNA。在某些实施方案中，这种方法包括使细胞与编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的分离的mRNA接触。在具体实施方案中，使细胞与包含编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA的脂质纳米粒子组合物接触。在使细胞与该脂质纳米粒子组合物或分离的mRNA接触之后，该mRNA可以被吸收在细胞中并且在其中翻译以产生诱导免疫原性细胞死亡的多肽。在一个实施方案中，免疫原性细胞死亡的特征在于细胞肿胀、质膜破裂和细胞的胞质溶胶内容物释放。在一个实施方案中，免疫原性细胞死亡的特征在于从细胞释放ATP和HMGB1。
本发明还提供了相比于正常细胞，在癌细胞中选择性诱导免疫原性细胞死亡的方法。在一些实施方案中，在癌细胞中选择性诱导免疫原性细胞死亡的方法涉及使细胞与本文所述的mRNA接触，所述mRNA例如编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA，其中所述mRNA还包含使该多肽在正常细胞中的表达相比在癌细胞中的表达降低的调节元件。在具体实施方案中，该调节元件是用于在正常细胞中比在癌细胞中具有更高表达的微RNA的结合位点(例如，miR-122结合位点)，其中该微RNA与该结合位点结合抑制了多肽的表达。在具体实施方案中，使细胞与纳米粒子组合物接触，该纳米粒子组合物包含mRNA，该mRNA包含编码多肽的区域和微RNA结合位点。在使细胞与该纳米粒子组合物或分离的mRNA接触之后，该mRNA可以被吸收在细胞中并且在其中翻译以产生多肽。该多肽在癌细胞中的表达比在正常细胞中更高，导致相比正常细胞，以更大的程度诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡。
一般来讲，使哺乳动物细胞与组合物(例如，本发明的分离的mRNA、纳米粒子或药物组合物)接触的步骤可以在体内、离体、在培养物中或在体外进行。在本发明的示例性实施方案中，使哺乳动物细胞与组合物(例如，本公开的分离的mRNA、纳米粒子或药物组合物)接触的步骤在体内或离体进行。与细胞接触的组合物的量和/或其中mRNA的量可以取决于所接触的细胞或组织的类型、施用方式、该组合物和其中的mRNA的生理化学特征(例如，大小、电荷和化学组成)，以及其他因素。一般来讲，有效量的该组合物将允许在细胞中有效地产生编码的多肽。效率的度量可以包括多肽翻译(由多肽表达指示)、mRNA降解水平和免疫应答指标。
使包含mRNA或分离的mRNA的组合物与细胞接触的步骤可以涉及或引起转染。在一些实施方案中，包含在脂质纳米粒子中的磷脂可以促进转染和/或提高转染效率，例如，通过与细胞膜或细胞内膜相互作用和/或融合。转染可以允许该mRNA在细胞内翻译。
可以轻易地确定本发明的组合物(例如，脂质纳米粒子或分离的mRNA)诱导免疫原性细胞死亡的能力，例如通过将该组合物诱导免疫原性细胞死亡的能力与可以诱导免疫原性细胞死亡的已知的剂或操作(包括但不限于：接合TNFR受体、TLR受体或TCR受体，DNA损伤或病毒感染)的这种能力进行比较。本领域已知多种确定药剂是否可以诱导免疫原性细胞死亡的方法，例如，染色和染料(例如，CELLTOXTM、Red、碘化丙啶和YOYO3)、细胞活力测定和检测DAMP(“损伤相关分子模式”)的释放(包括ATP、HMGB1、IL-1a、尿酸、DNA片段和/或线粒体内容物的释放)的测定(例如，ELISA)。
预防方法和治疗方法
用于增强受试者体内对一种或多种感兴趣抗原的免疫应答的本公开方法可以用于多种临床应用、预防应用或治疗应用。例如，这些方法可以用于刺激患有肿瘤的受试者或有患上肿瘤的风险(例如，有可能暴露于致癌病毒，诸如HPV)的受试者体内的抗肿瘤免疫。此外，这些方法可以用于刺激受试者体内的抗病原体免疫，诸如以治疗患有病原体感染的受试者或在暴露于病原体之前向受试者提供针对该病原体的保护性免疫(例如，针对该病原体的疫苗接种)。
因此，在一个方面，本公开涉及刺激有需要的受试者体内对肿瘤或肿瘤抗原的免疫原性应答的方法，该方法包括向受试者施用本公开的包含至少一种mRNA构建体的组合物(或其脂质纳米粒子，或其药物组合物)，所述至少一种mRNA构建体编码：(i)至少一种感兴趣的肿瘤抗原和(ii)增强针对所述一种或多种感兴趣的肿瘤抗原的免疫应答的多肽，使得增强对所述一种或多种感兴趣的肿瘤抗原的免疫应答。合适的感兴趣肿瘤抗原包括本文所述的那些(例如，肿瘤新抗原，包括突变型KRAS抗原；致癌病毒抗原，包括HPV抗原)。在该方法的一个实施方案中，向受试者施用编码以SEQ ID NO:107-130中的任一者示出的序列的突变型KRAS抗原-STING mRNA构建体。
本公开还提供了治疗或预防有需要的受试者体内的癌症的方法，其涉及向该受试者提供或施用本文所述的至少一种mRNA组合物(即，在相同或单独的mRNA构建体中的免疫增强剂mRNA和编码抗原的mRNA)。在相关实施方案中，向受试者提供或施用包含一种或多种mRNA的纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)。在另外的相关实施方案中，向受试者提供或向受试者施用本公开的药物组合物。在具体实施方案中，该药物组合物包含编码如本文所述的抗原和免疫刺激性多肽的一种或多种mRNA，或者它包含含有所述一种或多种mRNA的纳米粒子。在具体实施方案中，所述一种或多种mRNA存在于纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)中。在具体实施方案中，所述一种或多种mRNA或纳米粒子存在于药物组合物中。
在某些实施方案中，有需要的受试者已被诊断患有癌症，或被认为具有患上癌症的风险。在一些实施方案中，该癌症为肝癌、结肠直肠癌、黑素瘤癌、胰腺癌、NSCLC、宫颈癌或头颈癌。在具体实施方案中，肝癌为肝细胞癌。在一些实施方案中，结肠直肠癌为原发性肿瘤或癌转移。在一些实施方案中，该癌症为造血癌症。在一些实施方案中，癌症为急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、骨髓营养不良综合征(包括难治性贫血和难治性血细胞减少症)或骨髓增生性赘生物或疾病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)。在其他实施方案中，该癌症为基于血液的癌症或造血癌症。在还有其他实施方案中，该癌症为HPV相关癌症，诸如宫颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和/或口咽癌。
针对特定癌症类型的选择性可以通过组合使用适当的LNP制剂(例如，靶向特定细胞类型)与工程改造到mRNA构建体中的适当的一种或多种调节位点(例如，微RNA)来实现。
在一些实施方案中，将所述一种或多种mRNA、纳米粒子或药物组合物以肠胃外途径施用于患者。在具体实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在各种实施方案中，向受试者提供有效量的所述一种或多种mRNA。
治疗癌症的方法还可以包括用增强受试者体内的抗肿瘤应答和/或对肿瘤具有细胞毒性的另外的剂(例如，化学治疗剂)来治疗受试者。用于组合疗法的合适治疗剂包括小分子化学治疗剂，包括蛋白酪氨酸激酶抑制剂，以及生物抗癌剂，诸如抗癌抗体，包括但不限于下文进一步讨论的那些。组合疗法可以包括向受试者施用免疫检查点抑制剂以增强抗肿瘤免疫，诸如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂。免疫检查点的其他调控剂可以靶向OX-40、OX-40L或ICOS。在一个实施方案中，调控免疫检查点的剂为抗体。在另一个实施方案中，调控免疫检查点的剂为蛋白质或小分子调控剂。在另一个实施方案中，该剂(诸如mRNA)编码免疫检查点的抗体调控剂。可以在组合疗法中使用的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括派姆单抗、阿仑单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、MEDI0680和PDR001、AMP-224、PF-06801591、BGB-A317、REGN2810、SHR-1210、TSR-042、affimer、阿维鲁单抗(MSB0010718C)、阿特珠单抗(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、BMS936559、伊匹单抗、替西木单抗、AGEN1884、MEDI6469和MOXR0916。
在一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗有需要的受试者体内的HPV相关癌症的方法，该方法包括向受试者施用本公开的包含至少一种mRNA构建体的组合物(或其脂质纳米粒子，或其药物组合物)，所述至少一种mRNA构建体编码：(i)至少一种感兴趣的HPV抗原和(ii)增强针对所述一种或多种感兴趣的HPV抗原的免疫应答的多肽，使得增强对所述一种或多种感兴趣的HPV抗原的免疫应答。在各种实施方案中，该HPV相关癌症为宫颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和/或口咽癌。在某些实施方案中，由所述一种或多种mRNA构建体编码的所述一种或多种HPV抗原是至少一种E6抗原、至少一种E7抗原或至少一种E6抗原和至少一种E7抗原这两者。在一个实施方案中，所述一种或多种E6抗原和/或所述一种或多种E7抗原是可溶的。在另一个实施方案中，所述一种或多种E6抗原和/或所述一种或多种E7抗原是细胞内抗原。在一个实施方案中，增强针对一种或多种感兴趣的HPV抗原的免疫应答的多肽是STING多肽(例如，组成型活性STING多肽)。在一个实施方案中，所述一种或多种HPV抗原和STING多肽在不同的mRNA上编码，并且在共同施用于受试者之前在脂质纳米粒子中共同配制。在另一个实施方案中，所述一种或多种HPV抗原和STING多肽在相同的mRNA上编码。在一个实施方案中，将编码所述一种或多种HPV抗原和免疫增强剂的组合物施用于有暴露于HPV的风险的受试者，从而提供针对HPV感染和发展一种或多种HPV相关癌症的预防性保护。在另一个实施方案中，将编码所述一种或多种HPV抗原和免疫增强剂的组合物施用于感染HPV和/或患有HPV相关癌症的受试者，从而通过增强受试者体内针对HPV的免疫应答来提供针对HPV的治疗活性。在某些实施方案中，患有HPV相关癌症的受试者还用免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1等)与用HPV+免疫增强剂疫苗治疗的组合进行治疗。
在另一个方面，本公开涉及刺激有需要的受试者体内对病原体的免疫原性应答的方法，该方法包括向受试者施用本公开的包含至少一种mRNA构建体的组合物(或其脂质纳米粒子，或其药物组合物)，所述至少一种mRNA构建体编码：(i)至少一种感兴趣的病原体抗原和(ii)增强针对所述一种或多种感兴趣的病原体抗原的免疫应答的多肽，使得增强对所述一种或多种感兴趣的病原体抗原的免疫应答。在一个实施方案中，所述至少一种病原体抗原来自选自病毒、细菌、原生动物、真菌和寄生生物的病原体。
合适的感兴趣病原体抗原包括本文所述的那些。在一个实施方案中，所述一种或多种病原体抗原是一种或多种病毒抗原。在一个实施方案中，所述一种或多种病原体抗原是人乳头瘤病毒(HPV)抗原，诸如E6抗原(例如，包含如以SEQ ID NO:36-72中的任一者示出的氨基酸序列)或E7抗原(例如，包含如以SEQ ID NO:73-94中的任一者示出的氨基酸序列)。在一个实施方案中，所述一种或多种病原体抗原是一种或多种细菌抗原，诸如多价细菌抗原。
在刺激有需要的受试者体内对一种或多种病原体抗原的免疫原性应答的方法的一个实施方案中，将一种或多种mRNA构建体、脂质纳米粒子或药物组合物以肠胃外途径施用于受试者。在一个实施方案中，将所述一种或多种mRNA、脂质纳米粒子或药物组合物通过输注每周施用一次。
包含一种或多种本公开的mRNA的药物组合物可以通过任何合适的途径施用于受试者。在一些实施方案中，本公开的组合物通过多种途径中的一种或多种途径施用，包括肠胃外(例如，皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射，以及任何合适的输注技术)、口服、经皮或真皮内、皮肤内、直肠、阴道内、局部(例如，通过散剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻腔、口腔、肠内、玻璃体、瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口腔喷雾剂和/或散剂、鼻喷雾剂和/或气溶胶剂，和/或通过门静脉导管。在一些实施方案中，组合物可以静脉内、肌肉内、真皮内、动脉内、肿瘤内、皮下施用或通过吸入施用。在一些实施方案中，肌肉内施用该组合物。然而，考虑到药物递送学科中的可能进展，本公开涵盖通过任何适当的途径递送本公开的组合物。一般来讲，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括含有一种或多种mRNA的药物组合物的性质(例如，其在各种身体环境(诸如血流和胃肠道)中的稳定性)，以及患者的状况(例如，患者是否能够耐受特定的施用途径)。
在某些实施方案中，本公开的组合物在给定的一剂中，可以按足以递送约0.0001mg/kg至约10mg/kg、约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.005mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约0.0001mg/kg至约5mg/kg、约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.005mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.0001mg/kg至约1mg/kg、约0.001mg/kg至约1mg/kg、约0.005mg/kg至约1mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、或约0.1mg/kg至约1mg/kg的剂量水平施用，其中1mg/kg的剂量向每1kg受试者体重提供1mg的mRNA或纳米粒子。在具体实施方案中，可以施用剂量为约0.005mg/kg至约5mg/kg的本公开的mRNA或纳米粒子。
在一些实施方案中，配制包含免疫增强剂mRNA构建体(例如，STING构建体)和抗原构建体(例如，疫苗构建体)这两者的本公开的组合物，使得其根据免疫增强剂构建体的固定剂量进行优化。在给定的一剂中，该免疫增强剂构建体的固定剂量的非限制性实例包括0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.001mg/kg至10mg/kg、0.005mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、2mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.001mg/kg至5mg/kg、0.005mg/kg至5mg/kg、0.01mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、2mg/kg至5mg/kg、0.0001mg/kg至1mg/kg、0.001mg/kg至1mg/kg、0.005mg/kg至1mg/kg、0.01mg/kg至1mg/kg、或0.1mg/kg至1mg/kg，其中1mg/kg的剂量向每1kg受试者体重提供1mg的mRNA。
在另一个实施方案中，配制包含免疫增强剂mRNA构建体(例如，STING构建体)和抗原构建体(例如，疫苗构建体)这两者的本公开的组合物，使得其根据抗原构建体的固定剂量进行优化。在给定的一剂中，该抗原构建体的固定剂量的非限制性实例包括0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.001mg/kg至10mg/kg、0.005mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、2mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.001mg/kg至5mg/kg、0.005mg/kg至5mg/kg、0.01mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、2mg/kg至5mg/kg、0.0001mg/kg至1mg/kg、0.001mg/kg至1mg/kg、0.005mg/kg至1mg/kg、0.01mg/kg至1mg/kg、或0.1mg/kg至1mg/kg，其中1mg/kg的剂量向每1kg受试者体重提供1mg的mRNA。
在一些实施方案中，该免疫调节治疗组合物中的RNA多核苷酸(免疫增强剂RNA多核苷酸、编码抗原的RNA多核苷酸，或这两者)的剂量为每剂1至5μg、5至10μg、10至15μg、15至20μg、10至25μg、20至25μg、20至50μg、30至50μg、40至50μg、40至60μg、60至80μg、60至100μg、50至100μg、80至120μg、40至120μg、40至150μg、50至150μg、50至200μg、80至200μg、100至200μg、100至300μg、120至250μg、150至250μg、180至280μg、200至300μg、30至300μg、50至300μg、80至300μg、100至300μg、40至300μg、50至350μg、100至350μg、200至350μg、300至350μg、320至400μg、40至380μg、40至100μg、100至400μg、200至400μg或300至400μg。在一些实施方案中，该免疫调节治疗组合物通过皮内或肌内注射施用于受试者。在一些实施方案中，该免疫调节治疗组合物在第0天施用于受试者。在一些实施方案中，第二剂的该免疫调节治疗组合物在第7天、第14天或第21天施用于受试者。
在一些实施方案中，剂量为25微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为10微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为30微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为100微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为50微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为75微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为150微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为400微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为300微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，剂量为200微克的RNA多核苷酸包含在施用于受试者的该免疫调节治疗组合物中。在一些实施方案中，该RNA多核苷酸在局部淋巴结中的累积水平为在远端淋巴结中的100倍。在其他实施方案中，该免疫调节治疗组合物是经化学修饰的，并且在其他实施方案中，该免疫调节治疗组合物是未经化学修饰的。
在一些实施方案中，有效量为1μg至100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为一共向受试者施用一次或两次的25μg剂量。在一些实施方案中，有效量为一共向受试者施用两次的100μg剂量。在一些实施方案中，有效量为可以一共向受试者施用一次或两次或更多次的以下剂量：1μg至10μg、1μg至20μg、1μg至30μg、5μg至10μg、5μg至20μg、5μg至30μg、5μg至40μg、5μg至50μg、10μg至15μg、10μg至20μg、10μg至25μg、10μg至30μg、10μg至40μg、10μg至50μg、10μg至60μg、15μg至20μg、15μg至25μg、15μg至30μg、15μg至40μg、15μg至50μg、20μg至25μg、20μg至30μg、20μg至40μg、20μg至50μg、20μg至60μg、20μg至70μg、20μg至75μg、30μg至35μg、30μg至40μg、30μg至45μg、30μg至50μg、30μg至60μg、30μg至70μg、30μg至75μg。
剂量可以每天以相同或不同的量施用一次或多次，以获得期望水平的mRNA表达和/或效果(例如，治疗效果)。递送期望剂量的频率可以例如为一天三次、一天两次、一天一次、隔天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次，十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送期望的剂量。例如，在某些实施方案中，将包含免疫增强剂mRNA构建体(例如，STING构建体)和抗原构建体(例如，疫苗构建体)这两者的本公开组合物至少施用两次，其中第二剂量在施用第一剂量之后至少1天、或至少3天、或至少7天、或至少10天、或至少14天、或至少21天、或至少28天、或至少35天、或至少42天或至少48天施用。在某些实施方案中，第一剂量和第二剂量分别在第0天和第2天、或分别在第0天和第7天、或分别在第0天和第14天、或分别在第0天和第21天、或分别在第0天和第48天施用。另外的剂量(即，第三剂量、第四剂量等)可以按施用前两个剂量的相同或不同的时间表施用。例如，在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量间隔7天施用，之后每周施用一次或多次另外的剂量。在另一个实施方案中，第一剂量和第二剂量间隔7天施用，之后每两周施用一次或多次另外的剂量。
在一些实施方案中，可以例如在外科手术之前或之后，或在急性疾病、病患或病症的情况下施用单剂量。针对任何特定患者的具体的治疗有效、预防有效或其他适当的剂量水平将取决于多种因素，包括：正在治疗的病患的严重程度和身份(如果有的话)；采用的一种或多种mRNA；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和采用的具体药物组合物的排泄率；治疗的持续时间；与采用的具体药物组合物组合使用或碰巧一起使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以与另一种剂(例如，另一种治疗剂、预防剂和/或诊断剂)组合施用。所谓“与……组合”，并不旨在暗示这些药剂必须同时施用并且/或者被配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本公开的范围之内。例如，可以组合施用包含一种或多种不同mRNA的一种或多种组合物。组合物可以与一种或多种其他的期望治疗剂或医学过程同时施用，或者在一种或多种其他的期望治疗剂或医学规程之前或之后施用。一般来讲，每种剂都将以针对该剂确定的剂量和/或时间表施用。在一些实施方案中，本公开涵盖结合以下剂递送本公开的组合物，或者其成像组合物、诊断组合物或预防性组合物：这些剂改善前述组合物的生物利用度、减少和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在体内的分布。
可以与本公开的组合物组合施用的示例性治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂和其他治疗剂。细胞毒性剂可以包括例如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登木素生物碱、雷查霉素，以及它们的类似物。放射性离子也可以用作治疗剂，并且可以包括例如放射性碘、锶、磷、钯、铯、铱、钴、钇、钐和镨。其他治疗剂可以包括例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶，以及达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、雷查霉素、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式-二氯二氨铂(II)(DDP)和顺铂)、蒽环霉素(例如，道诺霉素和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素、博来霉素、光神霉素和安曲霉素)和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春花碱、紫杉醇和美登木素生物碱)。
要在组合方案中采用的疗法(治疗剂或过程)的特定组合将考虑期望的治疗剂和/或过程的相容性以及要实现的期望治疗效果。还应当理解，所采用的疗法可以对相同的病患实现期望的效果(例如，可用于治疗癌症的组合物可以与化学治疗剂同时施用)，或者可以实现不同的效果(例如，控制任何不利影响)。
免疫检查点抑制剂(诸如派姆单抗或纳武单抗)靶向程序性死亡受体1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)与PD-L2之间的相互作用，最近已经被批准用于治疗各种恶性肿瘤，并且目前正在针对各种癌症(包括黑色素瘤、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC))的临床试验中加以研究。
因此，本公开的一个方面涉及组合疗法，其中在施用本公开的脂质纳米粒子或组合物之前，先用PD-1拮抗剂治疗受试者。在另一个方面，在施用本公开的脂质纳米粒子或组合物之前，已经用结合PD-1的单克隆抗体治疗了受试者。在另一个方面，在用抗PD-1单克隆抗体疗法治疗之前，已经向受试者施用了本公开的脂质纳米粒子或组合物。在一些方面，该抗PD-1单克隆抗体疗法包括纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗，或它们的任意组合。
在另一个方面，在施用本公开的脂质纳米粒子或组合物之前，已经用结合PD-L1的单克隆抗体治疗了受试者。在另一个方面，在用抗PD-L1单克隆抗体疗法治疗之前，向受试者施用脂质纳米粒子或组合物。在一些方面，该抗PD-L1单克隆抗体疗法包括德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、MEDI473、BMS-936559、阿特珠单抗，或它们的任意组合。
在一些方面，在用本公开的组合物治疗之前，已经用CTLA-4拮抗剂治疗了受试者。在另一个方面，在施用本公开的脂质纳米粒子或组合物之前，先前已经用结合CTLA-4的单克隆抗体治疗了受试者。在一些方面，在用抗CTLA-4单克隆抗体治疗之前，已经向受试者施用了脂质纳米粒子或组合物。在一些方面，该抗CTLA-4抗体疗法包括伊匹单抗或替西木单抗。
在任何前述或相关方面，本公开提供了用于治疗或延迟个体体内癌症的进展的脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物，其中所述治疗包括将该组合物与第二组合物组合施用，其中该第二组合物包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体。
在任何前述或相关方面，本公开提供了脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗或延迟个体体内癌症的进展的药物中的用途，其中该药物包含所述脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用该药物。
在任何前述或相关方面，本公开提供了试剂盒，其包括容器和包装说明书，该容器包含脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物，该包装说明书包括用于施用所述脂质纳米粒子或药物组合物以治疗或延迟个体体内癌症的进展的说明。在一些方面，该包装说明书还包括用于与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米粒子或药物组合物以治疗或延迟个体体内癌症的进展的说明。
在任何前述或相关方面，本公开提供了试剂盒，其包括药物和包装说明书，该药物包含脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物，该包装说明书包括用于单独施用、或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用该药物以治疗或延迟个体体内癌症的进展的说明。在一些方面，该试剂盒还包括包装说明书，其包括用于在施用第二药物之前、在施用第二药物的同时或之后施用第一药物以治疗或延迟个体体内癌症的进展的说明。
在任何前述或相关方面，本公开提供了脂质纳米粒子、组合物或其用途，或者包括如本文所述的脂质纳米粒子或组合物的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4，或它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽为抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自替西木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
在相关方面，本公开提供了减小或缩小肿瘤大小或抑制有需要的受试者体内的肿瘤生长的方法，该方法包括向该受试者施用本公开的任何前述或相关脂质纳米粒子，或本公开的任何前述或相关组合物。
在相关方面，本公开提供了在患有癌症的受试者体内诱导抗肿瘤应答的方法，该方法包括向该受试者施用本公开的任何前述或相关脂质纳米粒子，或本公开的任何前述或相关组合物。在一些方面，该抗肿瘤应答包括T细胞应答。在一些方面，该T细胞应答包括CD8+ T细胞。
在前述方法的一些方面，该方法还包括施用包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的第二组合物。在一些方面，该检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4，或它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽为抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及它们的组合。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自替西木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。在一些方面，该检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
在任何前述或相关方法的一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物通过静脉内注射施用。在一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物每2至3周施用一次。在一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物每2周施用一次或每3周施用一次。在一些方面，包含检查点抑制剂多肽的该组合物在施用脂质纳米粒子或其药物组合物之前，在施用脂质纳米粒子或其药物组合物的同时或之后施用。
在任何前述或相关方面，本公开提供了包含脂质纳米粒子和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，该药物组合物被配制用于肌内递送。
用于诱导免疫原性细胞死亡的治疗方法
本发明提供了刺激有需要的受试者(例如，人受试者)体内对肿瘤的免疫原性应答的方法。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的mRNA，其编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽，使得刺激该受试者体内对肿瘤的免疫原性应答。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的脂质纳米粒子，其包含编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA，使得刺激该受试者体内对肿瘤的免疫原性应答。在又一个实施方案中，该方法包括向受试者施用本发明的药物组合物(例如，包含本发明的mRNA或脂质纳米粒子)，使得刺激该受试者体内对肿瘤的免疫原性应答。
在各种实施方案中，该方法可以包括向受试者施用一种或多种刺激炎症和/或免疫反应和/或调节免疫应答性的另外的剂，从而进一步促进或增强该受试者体内对肿瘤的免疫原性应答。用作另外的剂的合适类型的药剂如上所述。在一个实施方案中，向该受试者施用一种另外的剂。在另一个实施方案中，向该受试者施用两种另外的剂，这些另外的剂彼此不同。在又一个实施方案中，向该受试者施用三种另外的剂，这些另外的剂彼此不同。
在一个实施方案中，该方法还包括向该受试者施用至少一种剂，该剂增强免疫应答，例如，诱导适应性免疫(例如，通过刺激I型干扰素产生)、刺激炎症应答、刺激NFkB信号传导和/或刺激树突状细胞(DC)动员。在一个实施方案中，该方法还包括向该受试者施用至少一种诱导适应性免疫的剂。在一个实施方案中，所述诱导适应性免疫的剂为I型干扰素(例如，包含I型干扰素的药物组合物)。在另一个实施方案中，所述诱导适应性免疫的剂刺激I型干扰素。刺激适应性免疫的剂(例如，mRNA构建体)的非限制性实例包括STING、IRF1、IRF3、IRF5、IRF6、IRF7和IRF8。在另一个实施方案中，该剂刺激炎症应答。刺激炎症应答的剂(例如，mRNA构建体)的非限制性实例包括STAT1、STAT2、STAT4、STAT6、NFAT和C/EBPb。在另一个实施方案中，该剂刺激NFκB信号传导。刺激NFκB信号传导的剂(例如，mRNA构建体)的非限制性实例包括IKKβ、c-FLIP、RIPK1、IL-27、ApoF和PLP。在另一个实施方案中，该剂刺激DC动员。刺激DC动员的剂的非限制性实例为FLT3。在又一个实施方案中，所述增强免疫应答的剂为DIABLO(SMAC/DIABLO)(例如，DIABLO mRNA构建体)。
在另一个实施方案中，该方法还包括向该受试者施用至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂。在一个实施方案中，所述诱导T细胞激活或致敏的剂为细胞因子或趋化因子。诱导T细胞激活或致敏的细胞因子或趋化因子的非限制性实例包括IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20和CCL21。在一个实施方案中，所述诱导T细胞激活或致敏的剂为包含IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20或CCL21的药物组合物。在另一个实施方案中，所述诱导T细胞激活或致敏的剂为编码IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20或CCL21的剂(例如，mRNA构建体)。在又一个实施方案中，该剂为编码诱导趋化因子或细胞因子(例如，诱导IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20或CCL21)的多肽的mRNA构建体。
在另一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用至少一种调控免疫检查点的剂。在一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂为抗体。在另一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂为编码抗体的剂(例如，mRNA构建体)。在一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂为CTLA-4抑制剂，其非限制性实例包括伊匹单抗、替西木单抗和AGEN1884。在另一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂为PD-1抑制剂，其非限制性实例包括派姆单抗、阿仑单抗、阿特珠单抗、纳武单抗、伊匹单抗、匹利珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、MEDI0680和PDR001、AMP-224、PF-06801591、BGB-A317、REGN2810、SHR-1210、TSR-042、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和affimer。在另一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂为PD-L1抑制剂，其非限制性实例包括阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS936559。在又一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂调控OX-40或OX-40L的活性，其非限制性实例包括Fc-OX-40L、MEDI6469(激动剂抗OX40抗体)和MOXR0916(激动剂抗OX40抗体)。在又一个实施方案中，所述调控免疫检查点的剂调控ICOS的活性(例如，ICOS途径激动剂)。
在一个实施方案中，除了施用编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA之外，该方法还包括施用：(i)至少一种增强免疫应答(例如，诱导适应性免疫、刺激I型干扰素、刺激炎症应答、刺激NFκB信号传导和/或刺激DC动员)的剂；和(ii)至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂。在另一个实施方案中，该方法还包括施用：(i)至少一种增强免疫应答(例如，诱导适应性免疫、刺激I型干扰素、刺激炎症应答、刺激NFκB信号传导和/或刺激DC动员)的剂；和(ii)至少一种调控免疫检查点的剂。在另一个实施方案中，该方法还包括施用：(i)至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂；和(ii)至少一种调控免疫检查点的剂。在又一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用：(i)至少一种增强免疫应答(例如，诱导适应性免疫、刺激I型干扰素、刺激炎症应答、刺激NFκB信号传导和/或刺激DC动员)的剂；(ii)至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂；和(iii)至少一种调控免疫检查点的剂。
在刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫原性应答的方法的一个实施方案中，将mRNA构建体、脂质纳米粒子或药物组合物以肠胃外途径施用于受试者。在一个实施方案中，将所述mRNA、脂质纳米粒子或药物组合物通过输注每周施用一次。在一个实施方案中，该肿瘤为肝癌、结肠直肠癌或黑素瘤癌细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种用于刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫原性应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的下列物质：
(i)第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，其编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽，其中所述第一mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；
以及下列中的至少一者：
(ii)编码增强免疫应答(例如，诱导适应性免疫、刺激I型干扰素、刺激炎症应答、刺激NFκB信号传导和/或刺激DC动员)的多肽的第二mmRNA；其中所述第二mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；
(iii)编码诱导T细胞激活或致敏的多肽的第三mmRNA，其中所述第三mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；和/或
(iv)编码调控免疫检查点的多肽的第四mmRNA，其中所述第四mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基，
使得在该受试者体内产生对肿瘤的免疫原性应答。
第一mmRNA、第二mmRNA、第三mmRNA和/或第四mmRNA可以存在于施用于受试者的相同药物组合物或脂质纳米粒子中。作为替代，第一mmRNA、第二mmRNA、第三mmRNA和/或第四mmRNA可以存在于施用于受试者的不同药物组合物或脂质纳米粒子中。
在一个实施方案中，将第一mmRNA和第二mmRNA施用于受试者。在另一个实施方案中，将第一mmRNA和第三mmRNA施用于受试者。在另一个实施方案中，将第一mmRNA和第四mmRNA施用于受试者。在另一个实施方案中，将第一mmRNA、第二mmRNA和第三mmRNA施用于受试者。在另一个实施方案中，将第一mmRNA、第二mmRNA和第四mmRNA施用于受试者。在另一个实施方案中，将第一mmRNA、第三mmRNA和第四mmRNA施用于受试者。在另一个实施方案中，将第一mmRNA、第二mmRNA、第三mmRNA和第四mmRNA施用于受试者。
在一个实施方案中，由第一mmRNA编码的多肽选自MLKL、RIPK3、RIPK1、DIABLO、FADD、GSDMD、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-11、NLRP3、ASC/CARD和Pyrin。在一个实施方案中，由第二mmRNA编码的多肽选自DIABLO、STING、IRF1、IRF3、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8、STAT1、STAT2、STAT4、STAT6、NFAT、C/EBPb、IKKβ、c-FLIP、RIPK1、IL-27、ApoF、PLP和FLT3。在一个实施方案中，由第二mmRNA编码的多肽选自DIABLO、STING、IRF3、IRF7、STAT6、IKKβ、c-FLIP和RIPK1。在一个实施方案中，由第三mmRNA编码的多肽选自IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20和CCL21。在一个实施方案中，由第四mmRNA编码的多肽选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、OX-40激动剂、OX-40L和ICOS途径激动剂。
本发明还提供了治疗或预防有需要的受试者体内的癌症的方法，其涉及向该受试者提供或施用编码本文所述多肽的mRNA。在相关实施方案中，向受试者提供或施用包含该mRNA的纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)。在另外的相关实施方案中，向受试者提供或向受试者施用本发明的药物组合物。在具体实施方案中，该药物组合物包含编码本文所述多肽的mRNA，或者它包含含有该mRNA的纳米粒子。在具体实施方案中，该mRNA存在于纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)中。在具体实施方案中，该mRNA或纳米粒子存在于药物组合物中。在某些实施方案中，有需要的受试者已被诊断患有癌症，或被认为具有患上癌症的风险。在一些实施方案中，癌症为肝癌、结肠直肠癌或黑素瘤癌。在具体实施方案中，肝癌为肝细胞癌。在一些实施方案中，结肠直肠癌为原发性肿瘤或癌转移。在一些实施方案中，该癌症为造血癌症。在一些实施方案中，癌症为急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、骨髓营养不良综合征(包括难治性贫血和难治性血细胞减少症)或骨髓增生性赘生物或疾病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)。在其他实施方案中，该癌症为基于血液的癌症或造血癌症。针对特定癌症类型的选择性可以通过组合使用适当的LNP制剂(例如，靶向特定细胞类型)与工程改造到mRNA构建体中的适当的一种或多种调节位点(例如，微RNA)来实现。
在一些实施方案中，将所述mRNA、纳米粒子或药物组合物以肠胃外途径施用于患者。在具体实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在各种实施方案中，向受试者提供有效量的所述mRNA。
本发明还提供了治疗或预防有需要的受试者体内的癌症的方法，其包括向该受试者提供有效量的本文所述mRNA，例如，编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA，其中所述mRNA还包含使该多肽在癌细胞中的表达相比在正常细胞中的表达增强的调节元件。在具体实施方案中，该调节元件是用于在正常细胞中比在癌细胞中具有更高表达的微RNA的结合位点(例如，miR-122结合位点)，其中该微RNA与该结合位点结合抑制了多肽的表达。在具体实施方案中，该mRNA存在于纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)中。在具体实施方案中，该mRNA或纳米粒子存在于药物组合物中。该纳米粒子或分离的mRNA可以被吸收在受试者的细胞中并且在其中翻译，以产生诱导免疫原性细胞死亡的多肽。在具体实施方案中，该多肽在癌细胞中的表达比在正常细胞中更高，导致相比正常细胞，癌细胞的免疫原性细胞死亡更多。
在某些实施方案中，本发明包括治疗或预防有需要的受试者体内的癌症的方法，其包括结合治疗剂(诸如化学治疗药物或其他抗癌剂)向该受试者提供本文所述的第一mRNA，例如，编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA。用于组合疗法的合适治疗剂包括小分子化学治疗剂，包括蛋白酪氨酸激酶抑制剂，以及生物抗癌剂，诸如抗癌抗体。在组合疗法中使用的其他合适的治疗剂在下面进一步描述。
包含一种或多种本发明的mRNA的药物组合物可以通过任何合适的途径施用于受试者。在一些实施方案中，本发明的组合物通过多种途径中的一种或多种途径施用，包括肠胃外(例如，皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射，以及任何合适的输注技术)、口服、经皮或真皮内、皮肤内、直肠、阴道内、局部(例如，通过散剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻腔、口腔、肠内、玻璃体、瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口腔喷雾剂和/或散剂、鼻喷雾剂和/或气溶胶剂，和/或通过门静脉导管。在一些实施方案中，组合物可以静脉内、肌肉内、真皮内、动脉内、肿瘤内、皮下施用或通过吸入施用。然而，考虑到药物递送学科中的可能进展，本公开涵盖通过任何适当的途径递送本发明的组合物。一般来讲，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括含有一种或多种mRNA的药物组合物的性质(例如，其在各种身体环境(诸如血流和胃肠道)中的稳定性)，以及患者的状况(例如，患者是否能够耐受特定的施用途径)。
在某些实施方案中，本发明的组合物在给定的一剂中，可以按足以递送约0.0001mg/kg至约10mg/kg、约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.005mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约0.0001mg/kg至约5mg/kg、约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.005mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.0001mg/kg至约1mg/kg、约0.001mg/kg至约1mg/kg、约0.005mg/kg至约1mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、或约0.1mg/kg至约1mg/kg的剂量水平施用，其中1mg/kg的剂量向每1kg受试者体重提供1mg的mRNA或纳米粒子。在具体实施方案中，可以施用剂量为约0.005mg/kg至约5mg/kg的本发明的mRNA或纳米粒子。
剂量可以每天以相同或不同的量施用一次或多次，以获得期望水平的mRNA表达和/或效果(例如，治疗效果)。递送期望剂量的频率可以例如为一天三次、一天两次、一天一次、隔天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在某些实施方案中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次，十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送期望的剂量。在一些实施方案中，可以例如在外科手术之前或之后，或在急性疾病、病患或病症的情况下施用单剂量。针对任何特定患者的具体的治疗有效、预防有效或其他适当的剂量水平将取决于多种因素，包括：正在治疗的病患的严重程度和身份(如果有的话)；采用的一种或多种mRNA；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和采用的具体药物组合物的排泄率；治疗的持续时间；与采用的具体药物组合物组合使用或碰巧一起使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以与另一种剂(例如，另一种治疗剂、预防剂和/或诊断剂)组合施用。所谓“与……组合”，并不旨在暗示这些剂必须同时施用并且/或者被配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本公开的范围之内。例如，可以组合施用包含一种或多种不同mRNA的一种或多种组合物。组合物可以与一种或多种其他的期望治疗剂或医学过程同时施用，或者在一种或多种其他的期望治疗剂或医学规程之前或之后施用。一般来讲，每种剂都将以针对该剂确定的剂量和/或时间表施用。在一些实施方案中，本公开涵盖结合以下剂递送本发明的组合物，或者其成像组合物、诊断组合物或预防性组合物：这些剂改善前述组合物的生物利用度、减少和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在体内的分布。
可以与本发明的组合物组合施用的示例性治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂和其他治疗剂。细胞毒性剂可以包括例如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登木素生物碱、雷查霉素，以及它们的类似物。放射性离子也可以用作治疗剂，并且可以包括例如放射性碘、锶、磷、钯、铯、铱、钴、钇、钐和镨。其他治疗剂可以包括例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶，以及达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、雷查霉素、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式-二氯二氨铂(II)(DDP)和顺铂)、蒽环霉素(例如，道诺霉素和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素、博来霉素、光神霉素和安曲霉素)和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春花碱、紫杉醇和美登木素生物碱)。
要在组合方案中采用的疗法(治疗剂或过程)的特定组合将考虑期望的治疗剂和/或过程的相容性以及要实现的期望治疗效果。还应当理解，所采用的疗法可以对相同的病患实现期望的效果(例如，可用于治疗癌症的组合物可以与化学治疗剂同时施用)，或者可以实现不同的效果(例如，控制任何不利影响)。
本公开的其他实施方案
E1.一种经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，其编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽，其中所述mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基。
E2.实施方案1的mmRNA，其中该多肽诱导坏死性凋亡。
E3.实施方案2的mmRNA，其中该多肽是混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E4.实施方案3的mmRNA，其中该MLKL多肽包含以SEQ ID NO:1或2示出的氨基酸序列。
E5.实施方案2的mmRNA，其中该多肽是受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E6.实施方案5的mmRNA，其中该RIPK3多肽包含以SEQ ID NO:3至19示出的氨基酸序列中的任一种。
E7.实施方案2的mmRNA，其中该多肽是受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E8.实施方案7的mmRNA，其中该RIPK1多肽包含以SEQ ID NO:62至67示出的氨基酸序列中的任一种。
E9.实施方案2的mmRNA，其中该多肽是具有低pI的直接IAP结合蛋白(DIABLO)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E10.实施方案9的mmRNA，其中该DIABLO多肽包含以SEQ ID NO:26至33示出的氨基酸序列中的任一种。
E11.实施方案2的mmRNA，其中该多肽是具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E12.实施方案11的mmRNA，其中该FADD多肽包含以SEQ ID NO:56至61示出的氨基酸序列中的任一种。
E13.实施方案1的mmRNA，其中该多肽诱导细胞焦亡。
E14.实施方案13的mmRNA，其中该多肽是gasdermin D(GSDMD)，或其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E15.实施方案14的mmRNA，其中该GSDMD多肽包含以SEQ ID NO:20至25示出的氨基酸序列中的任一种。
E16.实施方案13的mmRNA，其中该多肽是半胱天冬酶-4、其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E17.实施方案16的mmRNA，其中该半胱天冬酶-4多肽包含以SEQ ID NO:34至38示出的氨基酸序列中的任一种。
E18.实施方案13的mmRNA，其中该多肽是半胱天冬酶-5、其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E19.实施方案18的mmRNA，其中该半胱天冬酶-5多肽包含以SEQ ID NO:39至43示出的氨基酸序列中的任一种。
E20.实施方案13的mmRNA，其中该多肽是半胱天冬酶-11、其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E21.实施方案20的mmRNA，其中该半胱天冬酶-11多肽包含以SEQ ID NO:44至48示出的氨基酸序列中的任一种。
E22.实施方案13的mmRNA，其中该多肽是NLRP3、其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E23.实施方案22的mmRNA，其中该NLRP3多肽包含以SEQ ID NO:51至52示出的氨基酸序列中的任一种。
E24.实施方案13的mmRNA，其中该多肽为Pyrin结构域、其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E25.实施方案24的mmRNA，其中该Pyrin结构域多肽包含以SEQ ID NO:49至50示出的氨基酸序列中的任一种。
E26.实施方案13的mmRNA，其中该多肽是ASC/PYCARD、其免疫原性细胞死亡诱导片段。
E27.实施方案26的mmRNA，其中该ASC/PYCARD多肽包含以SEQ ID NO:53至54示出的氨基酸序列中的任一种。
E28.前述实施方案中任一项的mmRNA，其中所述mmRNA包含5'UTR、编码该多肽的密码子优化的开放阅读框、3'UTR和所连接核苷的3’加尾区。
E29.实施方案28的mmRNA，其中该mmRNA还包含一个或多个微RNA(miRNA)结合位点。
E30.前述实施方案中任一项的mmRNA，其中该mmRNA是被完全修饰的。
E31.前述实施方案中任一项的mmRNA，其中该mmRNA包含假尿苷(ψ)、假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、2-硫代尿苷(s2U)、2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、N6-甲基-腺苷(m6A)或N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
E32.前述实施方案中任一项的mmRNA，其中该mmRNA包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷，或它们的组合。
E33.前述实施方案中任一项的mmRNA，其中该mmRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷、或α-硫代-腺苷，或它们的组合。
E34.一种脂质纳米粒子，其包含实施方案1至33中任一项的mmRNA。
E35.实施方案34的脂质纳米粒子，其为脂质体。
E36.实施方案34的脂质纳米粒子，其包含阳离子脂质和/或可电离脂质。
E37.实施方案36的脂质纳米粒子，其中该阳离子脂质和/或可电离脂质是2,2-二亚油基-4-甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)或二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)。
E38.实施方案34至37中任一项的脂质纳米粒子，其中该脂质纳米粒子还包含与该脂质纳米粒子的外表面缀合的靶向部分。
E39.一种药物组合物，其包含实施方案1至33中任一项的mmRNA或实施方案34至38中任一项的脂质纳米粒子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
E40.一种用于诱导细胞的免疫原性细胞死亡的方法，该方法包括使细胞与实施方案1至33中任一项的mmRNA、实施方案34至38中任一项的脂质纳米粒子或实施方案39的药物组合物接触，使得发生该细胞的免疫原性细胞死亡。
E41.实施方案40的方法，其中免疫原性细胞死亡的特征在于质膜破裂和细胞的胞质溶胶内容物释放。
E42.实施方案41的方法，其中ATP和HMGB1从该细胞中释放。
E43.实施方案40至42中任一项的方法，其中所述接触在体外或体内发生。
E44.实施方案40至43中任一项的方法，其中该细胞为癌细胞。
E45.实施方案44的方法，其中该癌细胞为肝癌细胞、结肠直肠癌细胞或黑素瘤癌细胞。
E46.实施方案40至45中任一项的方法，其中该细胞为人细胞。
E47.一种刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫原性应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的实施方案1至33中任一项的mmRNA、实施方案34至38中任一项的脂质纳米粒子或实施方案39的药物组合物，使得刺激该受试者体内对肿瘤的免疫原性应答。
E48.实施方案47的方法，其还包括向该受试者施用至少一种增强免疫应答的剂，其中所述至少一种增强免疫应答的剂诱导适应性免疫、刺激1型干扰素、刺激炎症应答、刺激信号传导或刺激树突状细胞动员。
E49.实施方案48的方法，其中所述至少一种剂通过刺激1型干扰素来诱导适应性免疫。
E50.实施方案47的方法，其还包括向该受试者施用至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂。
E51.实施方案50的方法，其中所述至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂为细胞因子或趋化因子。
E52.实施方案47的方法，其还包括向该受试者施用至少一种调控免疫检查点的剂。
E53.实施方案47的方法，其还包括向该受试者施用：(i)至少一种增强免疫应答的剂；(ii)至少一种诱导T细胞激活或致敏的剂；和(iii)至少一种调控免疫检查点的剂。
E54.实施方案47至53中任一项的方法，其中将所述mmRNA、脂质纳米粒子或药物组合物以肠胃外途径施用于受试者。
E55.实施方案54的方法，其中将所述mmRNA、脂质纳米粒子或药物组合物通过输注每周施用一次。
E56.实施方案47至55中任一项的方法，其中该受试者是人。
E57.实施方案47至56中任一项的方法，其中该肿瘤为肝癌或结肠直肠癌。
E58.一种用于刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫原性应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的下列物质：
(i)第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，其编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽，其中所述第一mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；
以及下列中的至少一者：
(ii)编码增强免疫应答的多肽的第二mmRNA，其中所述第二mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；
(iii)编码诱导T细胞激活或致敏的多肽的第三mmRNA，其中所述第三mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；和/或
(iv)编码调控免疫检查点的多肽的第四mmRNA，其中所述第四mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基，
使得在该受试者体内产生对肿瘤的免疫原性应答。
E59.实施方案58的方法，其中该第二mmRNA编码这样的多肽：该多肽诱导适应性免疫、刺激1型干扰素、刺激炎症应答、刺激 信号传导或刺激树突状细胞动员。
E60.实施方案58的方法，其中将第一mmRNA和第二mmRNA施用于受试者。
E61.实施方案58的方法，其中将第一mmRNA、第二mmRNA和第三mmRNA施用于受试者。
E62.实施方案58的方法，其中将第一mmRNA、第二mmRNA、第三mmRNA和第四mmRNA施用于受试者。
E63.实施方案58至62中任一项的方法，其中第一mmRNA、第二mmRNA、第三mmRNA和/或第四mmRNA存在于施用于受试者的相同药物组合物或脂质纳米粒子中。
E64.实施方案58至63中任一项的方法，其中由第一mmRNA编码的多肽选自MLKL、RIPK3、RIPK1、DIABLO、FADD、GSDMD、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-11、NLRP3、ASC/PYCARD和Pyrin。
E65.实施方案58至64中任一项的方法，其中由第二mmRNA编码的多肽选自DIABLO、STING、IRF1、IRF3、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8、STAT1、STAT2、STAT4、STAT6、NFAT、C/EBPb、IKKβ、c-FLIP、RIPK1、IL-27、ApoF、PLP和FLT3。
E66.实施方案58和60至64中任一项的方法，其中由第三mmRNA编码的多肽选自IL-12、IL36g、CCL2、CCL4、CCL20和CCL21。
E67.实施方案58和61至65中任一项的方法，其中由第四mmRNA编码的多肽选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、OX-40激动剂、OX-40L和ICOS途径激动剂。
E68.一种用于刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫原性应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的下列物质：
(i)至少一种第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，其编码诱导免疫原性细胞死亡的多肽，其中所述第一mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；
以及下列中的至少一者：
(ii)编码增强免疫应答的多肽的至少一种第二mmRNA，其中所述第二mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基；和/或
(iii)免疫检查点抑制剂，
使得在该受试者体内产生对肿瘤的免疫原性应答。
E69.实施方案68的方法，其中所述至少一种第一mmRNA编码选自MLKL、Diablo、RIPK3和它们的组合的多肽。
E70.实施方案69的方法，其中第一mmRNA编码MLKL。
E71.实施方案69的方法，其中第一mmRNA编码Diablo。
E72.实施方案69的方法，其中第一mmRNA编码RIPK3。
E73.实施方案69的方法，其中第一mmRNA包括两个mmRNA，一个编码MLKL，一个编码Diablo。
E74.实施方案69的方法，其中第一mmRNA包括两个mmRNA，一个编码MLKL，一个编码RIPK3。
E75.实施方案69的方法，其中第一mmRNA包括两个mmRNA，一个编码RIPK3，一个编码Diablo。
E76.实施方案68至75中任一项的方法，其中第二mmRNA编码STING。
E77.实施方案68至76中任一项的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体。
E78.实施方案68至76中任一项的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
E79.一种编码下述多肽的经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，该多肽增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答，其中所述mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基，并且其中该免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
E80.实施方案79的mmRNA，其中感兴趣抗原是受试者体内的内源性抗原。
E81.实施方案79的mmRNA，其中感兴趣抗原是与所述mmRNA共同施用于受试者的外源性抗原。
E82.实施方案81的mmRNA，其中感兴趣抗原由mmRNA编码。
E83.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其编码组成型活性人STING多肽。
E84.实施方案83的mmRNA，其中该组成型活性人STING多肽包含选自V147L、N154S、V155M、R284M、R284K、R284T、E315Q、R375A和它们的组合的一个或多个突变。
E85.实施方案84的mmRNA，其中该组成型活性人STING多肽包含V155M突变。
E86.实施方案84的mmRNA，其中该组成型活性人STING多肽包含突变R284M/V147L/N154S/V155M。
E87.实施方案84的mmRNA，其中该组成型活性人STING多肽包含以SEQ ID NO:1-10中的任一者示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:199-208、225、1319或1320中的任一者示出的核苷酸序列编码。
E88.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中该mmRNA编码组成型活性IRF3多肽。
E89.实施方案88的mmRNA，其中该组成型活性IRF3多肽包含S396D突变。
E90.实施方案89的mmRNA，其中该组成型活性IRF3多肽包含以SEQ ID NO:11-12中的任一者示出的氨基酸序列。
E91.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中该mmRNA编码组成型活性人IRF7多肽。
E92.实施方案91的mmRNA，其中该组成型活性人IRF7多肽包含选自S475D、S476D、S477D、S479D、L480D、S483D、S487D、氨基酸247-467缺失，以及它们的组合的一个或多个突变。
E93.实施方案91的mmRNA，其中该组成型活性人IRF7多肽包含以SEQ ID NO:14-18中的任一者示出的氨基酸序列。
E94.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中该多肽选自MyD88、TRAM、IRF1、IRF8、IRF9、TBK1、IKKi、STAT1、STAT2、STAT4、STAT6、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、TAK-TAB1、DIABLO、Btk、自激活半胱天冬酶-1和Flt3。
E95.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中该多肽刺激I型干扰素途径信号传导。
E96.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中该多肽刺激NFkB信号传导。
E97.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中该多肽刺激细胞因子产生。
E98.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中由该多肽增强的免疫应答是细胞免疫应答。
E99.实施方案79至82中任一项的mmRNA，其中由该多肽增强的免疫应答是体液免疫应答。
E100.一种组合物，其包含实施方案79、81至99中任一项的mmRNA和编码至少一种感兴趣抗原的第二mmRNA，其中所述第二mmRNA包含一个或多个经修饰的核碱基，并且其中在将该组合物施用于受试者时，该多肽增强对所述至少一种感兴趣抗原的免疫应答。
E101.实施方案100的组合物，其包含编码至少一种感兴趣抗原和增强对所述至少一种感兴趣抗原的免疫应答的多肽这两者的单种mmRNA构建体。
E102.实施方案100的组合物，其包含两种mmRNA构建体，一种编码所述至少一种感兴趣抗原，另一种则编码增强对所述至少一种感兴趣抗原的免疫应答的多肽。
E103.实施方案102的组合物，其中所述两种mmRNA构建体在脂质纳米粒子中共同配制。
E104.实施方案100至103中任一项的组合物，其中所述至少一种感兴趣抗原是至少一种肿瘤抗原。
E105.实施方案104的组合物，其中所述至少一种肿瘤抗原是至少一种突变型KRAS抗原。
E106.实施方案105的组合物，其中所述至少一种突变型KRAS抗原包含选自G12D、G12V、G13D、G12C和它们的组合的至少一个突变。
E107.实施方案105的组合物，其中所述至少一种突变型KRAS抗原包含以SEQ IDNO:95-106和131-132中的任一者示出的氨基酸序列或由以SEQ ID NO:1321或1322示出的核苷酸序列编码。
E108.实施方案105的组合物，其包含编码至少一种突变型KRAS抗原和组成型活性STING多肽的mmRNA，其中该mmRNA编码以SEQ ID NO:107-130中的任一者示出的氨基酸序列。
E109.实施方案100至103中任一项的组合物，其中所述至少一种感兴趣抗原是至少一种病原体抗原。
E110.实施方案109的组合物，其中所述至少一种病原体抗原来自选自病毒、细菌、原生动物、真菌和寄生生物的病原体。
E111.实施方案110的组合物，其中所述至少一种病原体抗原是至少一种病毒抗原。
E112.实施方案111的组合物，其中所述至少一种病毒抗原是至少一种人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
E113.实施方案112的组合物，其中该HPV抗原是HPV16 E6或HPV E7抗原、或它们的组合。
E114.实施方案113的组合物，其中该HPV抗原包含以SEQ ID NO:36-94中的任一者示出的氨基酸序列。
E115.实施方案110的组合物，其中所述至少一种病原体抗原是至少一种细菌抗原。
E116.实施方案79至115中任一项的mmRNA或组合物，其中所述一种或多种mmRNA包含5'UTR、编码该多肽的密码子优化的开放阅读框、3'UTR和所连接核苷的3’加尾区。
E117.实施方案116的mmRNA或组合物，其中所述一种或多种mmRNA还包含一个或多个微RNA(miRNA)结合位点。
E118.实施方案79至117中任一项的mmRNA或组合物，其中所述一种或多种mmRNA是被完全修饰的。
E119.实施方案79至118中任一项的mmRNA或组合物，其中所述一种或多种mmRNA包含假尿苷(ψ)、假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、2-硫代尿苷(s2U)、2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、N6-甲基-腺苷(m6A)或N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
E120.实施方案79至119中任一项的mmRNA或组合物，其中所述一种或多种mmRNA包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷，2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷，或它们的组合。
E121.实施方案79至120中任一项的mmRNA或组合物，其中所述一种或多种mmRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷、或α-硫代-腺苷，或它们的组合。
E122.一种脂质纳米粒子，其包含实施方案79至121中任一项的mmRNA或组合物。
E123.实施方案122的脂质纳米粒子，其为脂质体。
E124.实施方案122的脂质纳米粒子，其包含阳离子脂质和/或可电离氨基脂质。
E125.实施方案124的脂质纳米粒子，其中该阳离子脂质和/或可电离氨基脂质是2,2-二亚油基-4-甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)或二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)。
E126.实施方案122至125中任一项的脂质纳米粒子，其中该脂质纳米粒子还包含与该脂质纳米粒子的外表面缀合的靶向部分。
E127.一种药物组合物，其包含实施方案79至121中任一项的mmRNA或组合物或实施方案122至126中任一项的脂质纳米粒子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
E128.一种用于增强对感兴趣抗原的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用实施方案79至121中任一项的mmRNA或组合物、实施方案122至126中任一项的脂质纳米粒子或实施方案127的药物组合物，使得增强该受试者体内对该感兴趣抗原的免疫应答。
E129.实施方案128的方法，其中增强免疫应答包括刺激细胞因子产生。
E130.实施方案128的方法，其中增强免疫应答包括刺激抗原特异性CD8+ T细胞活性。
E131.实施方案128的方法，其中增强免疫应答包括刺激抗原特异性抗体产生。
E132.实施方案128的方法，其包括在向受试者施用刺激I型干扰素途径信号传导的mRNA组合物之前向该受试者施用刺激树突状细胞发育或活性的mRNA组合物。
E133.一种刺激有需要的受试者体内对肿瘤的免疫原性应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的实施方案79至121中任一项的mmRNA或组合物、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得刺激该受试者体内对肿瘤的免疫原性应答。
E134.实施方案133的方法，其中该肿瘤为肝癌、结肠直肠癌、黑素瘤癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌或头颈癌。
E135.实施方案133的方法，其中该受试者是人。
E136.一种刺激有需要的受试者体内对病原体的免疫原性应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的实施方案79至99和116至121中任一项的mmRNA、或实施方案100至115中任一项的组合物、或其脂质纳米粒子、或其药物组合物，使得刺激该受试者体内对病原体的免疫原性应答。
]E137.实施方案136的方法，其中该病原体选自病毒、细菌、原生动物、真菌和寄生生物。
E138.实施方案137的方法，其中该病原体为病毒。
E139.实施方案138的方法，其中该病原体为人乳头瘤病毒(HPV)。
E140.实施方案137的方法，其中该病原体为细菌。
E141.实施方案136的方法，其中该受试者是人。
E142.一种预防或治疗有需要的受试者体内的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含至少一种mRNA构建体的组合物，所述至少一种mRNA构建体编码：(i)至少一种感兴趣的HPV抗原和(ii)增强针对所述至少一种感兴趣的HPV抗原的免疫应答的多肽，使得增强对所述至少一种感兴趣的HPV抗原的免疫应答。
E143.实施方案142的方法，其中增强针对至少一种感兴趣HPV抗原的免疫应答的多肽为STING多肽。
E144.实施方案142的方法，其中所述至少一种HPV抗原为至少一种E6抗原、至少一种E7抗原，或至少一种E6抗原和至少一种E7抗原的组合。
E145.实施方案142的方法，其中所述至少一种HPV抗原和所述多肽在单独的mRNA上编码，并且在施用于受试者之前在脂质纳米粒子中共同配制。
E146.实施方案142的方法，其中受试者有暴露于HPV的风险，并且该组合物在暴露于HPV之前施用。
E147.实施方案142的方法，其中该受试者感染了HPV或患有HPV相关癌症。
E148.实施方案147的方法，其中该癌症选自宫颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌。
E149.实施方案148的方法，其中该受试者还用免疫检查点抑制剂治疗。
E150.一种组合物，其包含第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)和第二mmRNA，其中该第一mmRNA编码增强对受试者体内的至少一种感兴趣的致癌病毒抗原的免疫应答的多肽，并且该第二mmRNA编码所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原，其中每一种mmRNA都包含一个或多个经修饰的核碱基，并且其中该免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
E151.实施方案150的组合物，其包含编码至少一种感兴趣的致癌病毒抗原和增强对所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原的免疫应答的多肽这两者的单种mmRNA构建体。
E152.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原来源于选自下列的致癌病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)和梅克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)。
E153.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原选自以下HPV抗原：E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2，以及它们的组合。
E154.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原选自以下HBV抗原：HBsAg、HBcAg、HBeAg、HBxAg、Pol，以及它们的组合。
E155.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原选自以下HCV抗原：核心(C,p22)、E1(gp35)、E2(gp70)、NS1(p7)、NS2(p23)、NS3(p70)、NS4A(p8)、NS4B(p27)、NS5A(p56/58)、NS5B(p68)，以及它们的组合。
E156.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原为来自EBV-1或EBV-2的抗原性多肽。
E157.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原选自以下HTLV-1抗原：gag、pol、pro、env、tax、rex、p12、p21、p13、p30、HBZ，以及它们的组合。
E158.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种致癌病毒抗原是来自KSHV亚型A、KSHV亚型B、KSHV亚型C、KSHV亚型D、KSHV亚型E或它们的组合的抗原性多肽。
E159.实施方案150或151的组合物，其中所述至少一种感兴趣的致癌病毒抗原选自以下MCPyV抗原：大T抗原(LT)、小T抗原(sT)、57kT抗原(57kT)、替代性T抗原(ALTO)、主要衣壳蛋白病毒蛋白1(VP1)、次要衣壳病毒蛋白2或3(VP2或VP3)，以及它们的组合。
E160.实施方案150至159中任一项的组合物，其中所述至少一种致癌病毒抗原是由2至20种致癌病毒抗原组成的多联致癌病毒抗原。
E161.实施方案160的组合物，其中该多联致癌病毒抗原包括下列特征中的一种或多种：
a)切割敏感性位点散布在22至20个致癌病毒抗原之间；
b)编码每种致癌病毒抗原的mmRNA彼此直接连接，而不使用接头连接；以及/或者
c)编码每种致癌病毒的mmRNA使用单个核苷酸接头彼此连接。
E162.实施方案150至161中任一项的组合物，其还包含泛素化信号。
E163.实施方案162的组合物，其中该泛素化信号位于该mmRNA的C-末端处。
E164.实施方案161至163中任一项的组合物，其中这些切割位点中的至少一个是APC切割位点。
E165.实施方案164的组合物，其中该切割位点是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的切割位点。
E166.实施方案165的组合物，其中该切割位点是半胱氨酸蛋白酶的切割位点。
E167.实施方案166的组合物，其中该半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶B。
E168.实施方案164的组合物，其中该切割位点包含氨基酸序列GFLG，Arg-↓-NHMec；Bz-Arg-↓-NhNap；Bz-Arg-↓NHMec；Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec；Pro-Gly-↓-Phe；Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-X或Arg-Arg，其中Xaa是任何氨基酸残基。
E169.实施方案150至168中任一项的组合物，还包含回忆抗原。
E170.实施方案169的组合物，其中该回忆抗原是具有编码该回忆抗原的开放阅读框的mRNA。
E171.实施方案169或170的组合物，其中该回忆抗原包含在多联抗原中。
E172.实施方案150至171中任一项的组合物，其还包含内体靶向序列。
E173.实施方案172的组合物，其中该内体靶向序列包含溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)的跨膜结构域的至少一部分。
E174.实施方案172的组合物，其中该内体靶向序列包含恒定链(Ii)的跨膜结构域的至少一部分。
E175.一种组合物，其包含编码增强对来源于HPV的至少一种抗原的免疫应答的多肽的第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)，和编码来源于HPV的至少一种抗原的第二mmRNA，其中每种mmRNA都包含一个或多个经修饰的核碱基。
E176.实施方案175的组合物，其中第二mmRNA编码HPV抗原E6和/或HPV抗原E7。
E177.实施方案175或176的组合物，其中第一mmRNA编码组成型活性人STING多肽。
E178.实施方案150至177中任一项的组合物，其中每种mmRNA都被配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E179.实施方案178的组合物，其中编码致癌病毒抗原的每种mmRNA都配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E180.实施方案179的组合物，其中编码增强对致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA都配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E181.实施方案178至180中任一项的组合物，其中编码致癌病毒抗原的每种mmRNA都配制在相同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA都配制在不同的脂质纳米粒子中。
E182.实施方案178至180中任一项的组合物，其中编码致癌病毒抗原的每种mmRNA都配制在相同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA与编码致癌病毒抗原的每种mmRNA配制在相同的脂质纳米粒子中。
E183.实施方案178至180中任一项的组合物，其中编码致癌病毒抗原的每种mmRNA配制在不同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA与编码每种致癌病毒抗原的每种mmRNA配制在相同的脂质纳米粒子中。
E184.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码致癌病毒抗原的多联体的开放阅读框的mmRNA；
具有编码增强对致癌病毒抗原的该多联体的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
E185.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码致癌病毒抗原的开放阅读框的至少一种mmRNA；
具有编码增强对致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
E186.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码HPV抗原的多联体的开放阅读框的mmRNA；
具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
E187.实施方案186的脂质纳米粒子载体，其中HPV抗原的该多联体包含HPV抗原E6和E7。
E188.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码HPV病毒抗原E6的开放阅读框的mmRNA；
具有编码HPV病毒抗原E7的开放阅读框的mmRNA；
具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂
E189.一种疫苗，其包含：
包含药物组合物的第一纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码第一感兴趣致癌病毒抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对第一感兴趣致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂；
包含药物组合物的第二纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码第二感兴趣致癌病毒抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对第二感兴趣致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂；
包含药物组合物的第三纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码第三感兴趣致癌病毒抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对第三感兴趣致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂；
包含药物组合物的第四纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码第四感兴趣致癌病毒抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对第四感兴趣致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂；或
它们的组合。
E190.一种疫苗，其包含：
包含药物组合物的纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码感兴趣的多联致癌病毒抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对所述感兴趣的多联致癌病毒抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E191.一种疫苗，其包含：
包含药物组合物的第一纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码HPV抗原E6的开放阅读框的mmRNA、具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂；以及
包含药物组合物的第二纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码HPV抗原E7的开放阅读框的mmRNA、具有编码组成型活性人STING多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E192.一种预防感染致癌病毒的受试者体内的肿瘤生长的方法，其包括向该受试者施用实施方案150至191中任一项的组合物、脂质纳米粒子载体、或疫苗，使得该受试者体内的肿瘤生长得到预防。
E193.实施方案192的方法，其中该受试者在施用前没有可检测的肿瘤。
E194.一种抑制感染致癌病毒的受试者体内的肿瘤生长的方法，其包括向该受试者施用实施方案150至191中任一项的组合物、脂质纳米粒子载体、或疫苗，使得该受试者体内的肿瘤生长得到抑制。
E195.实施方案194的方法，其中在施用前形成肿瘤是感染致癌病毒的结果。
E196.一种治疗感染致癌病毒的癌症受试者体内的癌症的方法，其包括向该受试者施用实施方案150至191中任一项的组合物、脂质纳米粒子载体、或疫苗，使得该受试者体内的癌症得到治疗。
E197.实施方案196的方法，其中癌症是感染致癌病毒的结果。
E198.一种个性化癌症疫苗，其包含第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)和第二mmRNA，其中该第一mmRNA编码增强对受试者体内的至少一种感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽，该第二mmRNA编码所述至少一种感兴趣的癌症抗原，其中每一种mmRNA都包含一个或多个经修饰的核碱基，并且其中该免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
E199.实施方案198的个性化癌症疫苗，其包含编码至少一种感兴趣癌症抗原和增强对所述至少一种感兴趣癌症抗原的免疫应答的多肽这两者的单种mmRNA构建体。
E200.实施方案198或199的个性化癌症疫苗，其中所述至少一种感兴趣的癌症抗原是由2至100个肽表位组成的多联癌症抗原。
E201.实施方案200的个性化癌症疫苗，其中该多联癌症抗原包括下列特征中的一种或多种：
a)切割敏感性位点散布在2至100个肽表位之间；
b)编码每个肽表位的mRNA彼此直接连接，而不使用接头连接；
c)编码每个肽表位的mRNA使用单个核苷酸接头彼此连接；
d)每个肽表位包含25至35个氨基酸，并且包括位于中心的SNP突变；
e)这些肽表位的至少30％对来自受试者的I类MHC分子具有最高的亲和力；
f)这些肽表位的至少30％对来自受试者的II类MHC分子具有最高的亲和力；
g)这些肽表位的至少50％对于HLA-A、HLA-B和/或DRB1的预测结合亲和力为IC>500nM；
h)该mRNA编码20个肽表位；
i)这些肽表位的50％对于I类MHC具有结合亲和力，并且这些肽表位的50％对于II类MHC具有结合亲和力；以及/或者
j)编码这些肽表位的mRNA被排列成使得这些肽表位被排序以最大程度减少假表位。
E202.实施方案201的个性化癌症疫苗，其中每个肽表位包含31个氨基酸并且包括位于中心的SNP突变，在所述SNP突变的每一侧都具有15个侧接氨基酸。
E203.实施方案200至202中任一项的个性化癌症疫苗，其中该肽表位为T细胞表位和/或B细胞表位。
E204.实施方案200至203中任一项的个性化癌症疫苗，其中该肽表位包括T细胞表位和B细胞表位的组合。
E205.实施方案200至204中任一项的个性化癌症疫苗，其中这些肽表位中的至少一个是T细胞表位。
E206.实施方案200至205中任一项的个性化癌症疫苗，其中这些肽表位中的至少一个是B细胞表位。
E207.实施方案200至206中任一项的个性化癌症疫苗，其中该T细胞表位包含介于8个与11个之间的氨基酸。
E208.实施方案200至207中任一项的个性化癌症疫苗，其中该B细胞表位包含介于13个与17个之间的氨基酸。
E209.实施方案198至208中任一项的个性化癌症疫苗，其还包含泛素化信号。
E210.实施方案209的个性化癌症疫苗，其中该泛素化信号位于该mmRNA的C-末端处。
E211.实施方案201至210中任一项的个性化癌症疫苗，其中这些切割敏感性位点中的至少一个是APC切割位点。
E212.实施方案211的个性化癌症疫苗，其中该切割位点是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的切割位点。
E213.实施方案212的个性化癌症疫苗，其中该切割位点是半胱氨酸蛋白酶的切割位点。
E214.实施方案213的个性化癌症疫苗，其中该半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶B。
E215.实施方案214的个性化癌症疫苗，其中该切割位点包含氨基酸序列GFLG，Arg-↓-NHMec；Bz-Arg-↓-NhNap；Bz-Arg-↓NHMec；Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec；Pro-Gly-↓-Phe；Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-X或Arg-Arg，其中Xaa是任何氨基酸残基。
E216.实施方案200至215中任一项的个性化癌症疫苗，其中每个肽表位都包含抗原区和MHC稳定区。
E217.实施方案216的个性化癌症疫苗，其中该MHC稳定区的长度为5至10个氨基酸。
E218.实施方案216或217的个性化癌症疫苗，其中该抗原区的长度为5至100个氨基酸。
E219.实施方案200至218中任一项的个性化癌症疫苗，其中这些肽表位已经针对与受试者的MHC的结合强度进行了优化。
E220.实施方案219的个性化癌症疫苗，其中每个表位的TCR面与内源性蛋白的相似性低。
E221.实施方案198至220中任一项的个性化癌症疫苗，其还包含回忆抗原。
E222.实施方案221的个性化癌症疫苗，其中该回忆抗原是感染性疾病抗原。
E223.实施方案221或222的个性化癌症疫苗，其中该回忆抗原是具有编码该回忆抗原的开放阅读框的mRNA。
E224.实施方案221至223中任一者的个性化癌症疫苗，其中该回忆抗原是多联抗原中的肽表位。
E225.实施方案221和223至224中任一项的个性化癌症疫苗，其中该回忆抗原是流感抗原。
E226.实施方案198至225中任一项的个性化癌症疫苗，其还包含内体靶向序列。
E227.实施方案226的个性化癌症疫苗，其中该内体靶向序列包含溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)的跨膜结构域的至少一部分。
E228.实施方案226的个性化癌症疫苗，其中该内体靶向序列包含恒定链(Ii)的跨膜结构域的至少一部分。
E229.实施方案200的个性化癌症疫苗，其中这些肽表位包含至少一个MHC I类表位和至少一个MHC II类表位。
E230.实施方案229的个性化癌症疫苗，其中这些表位的至少30％是MHC I类表位。
E231.实施方案229的个性化癌症疫苗，其中这些表位的至少30％是MHC II类表位。
E232.实施方案198至231中任一项的个性化癌症疫苗，其还包含编码一种或多种传统癌症抗原的ORF。
E233.实施方案198至232中任一项的个性化癌症疫苗，其还包含具有编码一种或多种传统癌症抗原的开放阅读框的mRNA。
E234.实施方案198至233中任一项的个性化癌症疫苗，其中增强对受试者体内的至少一种感兴趣癌症抗原的免疫应答的多肽是组成型活性人STING多肽。
E235.实施方案234的个性化癌症疫苗，其中该组成型活性人STING多肽包含选自V147L、N154S、V155M、R284M、R284K、R284T、E315Q、R375A和它们的组合的一个或多个突变。
E236.实施方案235的个性化癌症疫苗，其中该组成型活性人STING多肽包含V155M突变。
E237.实施方案235的个性化癌症疫苗，其中该组成型活性人STING多肽包含突变R284M/V147L/N154S/V155M。
E238.一种组合物，其构成实施方案198至238中任一项的个性化癌症疫苗。
E239.实施方案238的组合物，其中每种mmRNA都被配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E240.实施方案239的组合物，其中编码感兴趣的癌症抗原的每种mmRNA都配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E241.实施方案240的组合物，其中编码增强对感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA都配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E242.实施方案239至241中任一项的组合物，其中编码感兴趣的癌症抗原的每种mmRNA都配制在相同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对所述感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA都配制在不同的脂质纳米粒子中。
E243.实施方案239至241中任一项的组合物，其中编码感兴趣的癌症抗原的每种mmRNA都配制在相同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA与编码感兴趣的癌症抗原的每种mmRNA配制在相同的脂质纳米粒子中。
E244.实施方案239至241中任一项的组合物，其中编码感兴趣的癌症抗原的每种mmRNA都配制在不同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA与编码每种感兴趣的癌症抗原的每种mmRNA配制在相同的脂质纳米粒子中。
E245.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码感兴趣的多联癌症抗原的开放阅读框的mmRNA；
具有编码增强对感兴趣的多联癌症抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA；
和药学上可接受的载体或赋形剂。
E246.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码感兴趣的癌症抗原的开放阅读框的至少一种mmRNA；
具有编码增强对该感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
E247.一种个性化癌症疫苗，其包含：
包含药物组合物的脂质纳米粒子，其中该药物组合物包含具有在受试者体内编码感兴趣的癌症抗原的开放阅读框的至少一种mmRNA、具有编码增强对所述感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E248.一种个性化癌症疫苗，其包含：
包含药物组合物的脂质纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码感兴趣的多联癌症抗原的开放阅读框的至少一种mmRNA、具有编码增强对所述感兴趣的癌症抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E249.一种用于对受试者接种疫苗的方法，其包括：
向患有癌症的受试者施用实施方案198至248中任一项的个性化癌症疫苗或组合物，以便对该受试者接种疫苗。
E250.一种用个性化癌症疫苗治疗受试者的方法，其包括：从受试者分离样品；通过分析来自该样品的患者转录组和/或患者外显子组来鉴定一组新表位，以产生患者特异性突变组；基于MHC结合强度、MHC结合多样性、预测的免疫原性程度、低自身反应性和/或T细胞反应性从该突变组选择一组用于该疫苗的新表位；制备用于编码这组新表位和增强对这些新表位的免疫应答的多肽的mRNA；以及在从受试者分离该样品的两个月内向受试者施用该个性化癌症疫苗。
E251.实施方案250的方法，其中在从受试者分离该样品的一个月内向受试者施用该个性化癌症疫苗。
E252.实施方案250或251的方法，其中该个性化癌症疫苗还编码一种或多种传统癌症抗原。
E253.实施方案252的方法，其中所述一种或多种传统癌症抗原由编码该组新表位的相同mRNA编码。
E254.实施方案252的方法，其中所述一种或多种传统癌症抗原由与编码该组新表位的mRNA不同的mRNA编码。
E255.实施方案250至254中任一项的方法，其中该个性化癌症疫苗与癌症治疗剂组合施用。
E256.实施方案255的方法，其中该癌症治疗剂为传统癌症疫苗。
E257.一种细菌疫苗，其包含第一经化学修饰的信使RNA(mmRNA)和第二mmRNA，其中该第一mmRNA编码增强对至少一种感兴趣的细菌抗原的免疫应答的多肽，并且该第二mmRNA编码所述至少一种感兴趣的细菌抗原，其中每一种mmRNA都包含一个或多个经修饰的核碱基，并且其中该免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；或
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(vi)中任意一些的组合。
E258.实施方案257的细菌疫苗，其包含编码至少一种感兴趣的细菌抗原和增强对所述至少一种感兴趣的细菌抗原的免疫应答的多肽这两者的单种mmRNA构建体。
E259.实施方案257或258的细菌疫苗，其中所述至少一种感兴趣的细菌抗原是由2至10种细菌抗原组成的多联细菌抗原。
E260.实施方案259的细菌疫苗，其中该多联细菌抗原包括下列特征中的一种或多种：
a)切割敏感性位点散布在2至10个细菌抗原之间；
b)编码每种细菌抗原的mmRNA彼此直接连接，而不使用接头连接；以及/或者
c)编码每种细菌抗原的mmRNA使用单个核苷酸接头彼此连接。
E261.实施方案257至260中任一项的细菌疫苗，其还包含泛素化信号。
E262.实施方案261的细菌疫苗，其中该泛素化信号位于该mmRNA的C-末端处。
E263.实施方案260至262中任一项的细菌疫苗，其中这些切割位点中的至少一个是APC切割位点。
E264.实施方案263的细菌疫苗，其中该切割位点是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的切割位点。
E265.实施方案264的细菌疫苗，其中该切割位点是半胱氨酸蛋白酶的切割位点。
E266.实施方案265的细菌疫苗，其中该半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶B。
E267.实施方案263的细菌疫苗，其中该切割位点包含氨基酸序列GFLG，Arg-↓-NHMec；Bz-Arg-↓-NhNap；Bz-Arg-↓NHMec；Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec；Pro-Gly-↓-Phe；Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-X或Arg-Arg，其中Xaa是任何氨基酸残基。
E268.实施方案257至267中任一项的细菌疫苗，还包含回忆抗原。
E269.实施方案268的细菌疫苗，其中该回忆抗原是感染性疾病抗原。
E270.实施方案268或269的细菌疫苗，其中该回忆抗原是具有编码该回忆抗原的开放阅读框的mRNA。
E271.实施方案268至270中任一项的细菌疫苗，其中该回忆抗原包含在多联抗原中。
E272.实施方案268至271中任一项的细菌疫苗，其中该回忆抗原是流感抗原。
E273.实施方案257至272中任一项的细菌疫苗，其还包含内体靶向序列。
E274.实施方案273的细菌疫苗，其中该内体靶向序列包含溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)的跨膜结构域的至少一部分。
E275.实施方案273的细菌疫苗，其中该内体靶向序列包含恒定链(Ii)的跨膜结构域的至少一部分。
E276.实施方案257至275中任一项的细菌疫苗，其中该疫苗诱导体液免疫应答。
E277.实施方案257至275中任一项的细菌疫苗，其中该疫苗诱导适应性免疫应答。
E278.实施方案277的细菌疫苗，其中该适应性免疫应答包括诱导抗原特异性抗体产生，或者抗原特异性诱导/激活T辅助淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞。
E279.实施方案257至278中任一项的细菌疫苗，其中该感兴趣的细菌抗原来源于金黄色葡萄球菌。
E280.一种组合物，其构成实施方案257至279中任一项的细菌疫苗。
E281.实施方案280的组合物，其中每种mmRNA都被配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E282.实施方案281的组合物，其中编码感兴趣的细菌抗原的每种mmRNA都配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E283.实施方案282的组合物，其中编码增强对感兴趣的细菌抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA都配制在相同或不同的脂质纳米粒子中。
E284.实施方案281至283中任一项的组合物，其中编码感兴趣的细菌抗原的每种mmRNA都配制在相同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对所述细菌抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA都配制在不同的脂质纳米粒子中。
E285.实施方案281至283中任一项的组合物，其中编码感兴趣的细菌抗原的每种mmRNA都配制在相同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对所述细菌抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA与编码细菌抗原的每种mmRNA配制在相同的脂质纳米粒子中。
E286.实施方案281至283中任一项的组合物，其中编码细菌抗原的每种mmRNA都配制在不同的脂质纳米粒子中，并且编码增强对所述细菌抗原的免疫应答的多肽的每种mmRNA与编码每种细菌抗原的每种mmRNA配制在相同的脂质纳米粒子中。
E287.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码细菌抗原的多联体的开放阅读框的mmRNA；
具有编码增强对细菌抗原的该多联体的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
E288.一种包含药物组合物的脂质纳米粒子载体，其中该药物组合物包含：
具有编码细菌抗原的开放阅读框的至少一种mmRNA；
具有编码增强对细菌抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
E289.一种细菌疫苗，其包括：
包含药物组合物的纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码感兴趣的细菌抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对所述感兴趣的细菌抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E290.一种细菌疫苗，其包括：
包含药物组合物的纳米粒子，其中该药物组合物包含具有编码感兴趣的多联细菌抗原的开放阅读框的mmRNA、具有编码增强对所述感兴趣的多联细菌抗原的免疫应答的多肽的开放阅读框的mmRNA，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E291.一种用于对受试者接种疫苗以使其免受感兴趣细菌的感染的方法，该方法包括：
向该受试者施用实施方案257至290中任一项的细菌疫苗、组合物或脂质纳米粒子载体，以便对该受试者接种疫苗。
E292.实施方案291的方法，其中该感兴趣细菌是金黄色葡萄球菌。
E293.实施方案291的方法，其中该感兴趣细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
E294.一种用于治疗患有细菌感染的受试者的方法，其包括：
向该受试者施用实施方案257至290中任一项的细菌疫苗、组合物或脂质纳米粒子载体，以便治疗该受试者。
E295.实施方案294的方法，其中该细菌感染是由金黄色葡萄球菌引起的。
E296.实施方案294的方法，其中该细菌感染是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的。
定义
施用：如本文所用，“施用”是指将组合物递送至受试者或患者的方法。可以选择施用方法以将递送靶向(例如，特异性地递送至)身体的特定区域或系统。例如，施用可以是肠胃外(例如，皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射，以及任何合适的输注技术)、口服、经皮或真皮内、皮肤内、直肠、阴道内、局部(例如，通过散剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻腔、口腔、肠内、玻璃体、瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口腔喷雾剂和/或散剂、鼻喷雾剂和/或气溶胶剂，和/或通过门静脉导管。
大约，约：如本文所用，当应用于一个或多个感兴趣的值时，术语“大约”或“约”是指与所指出的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有所指或根据上下文明显不同，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上属于所指出的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比内的值的范围(除了这样的数字将超过可能值的100％的情况之外)。
癌症：如本文所用，“癌症”是涉及异常和/或不受调节的细胞生长的病症。术语癌症涵盖良性癌症和恶性癌症。示例性的非限制性癌症包括肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童期癌症、原发性未知癌症、Castleman病、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因肿瘤家族(Ewing family of tumor)、眼癌、胆囊癌、胃肠道癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾细胞癌、喉和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征(包括难治性贫血和难治性血细胞减少症)、骨髓增生性赘生物或疾病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)、肝癌(例如，肝细胞癌)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、威耳姆氏肿瘤，以及由癌症治疗引起的继发性癌症。在具体实施方案中，癌症为肝癌(例如，肝细胞癌)或结肠直肠癌。在其他实施方案中，该癌症为基于血液的癌症或造血癌症。
可切割接头：如本文所用，术语“可切割接头”是指可以掺入多顺反子mRNA构建体中，使得可以由相同的mRNA产生等摩尔水平的多个基因的接头，通常为肽接头(例如，长度为约5至30个氨基酸，通常长度为约10至20个氨基酸)。可切割接头的非限制性实例包括2A家族的肽，包括首先在微小核糖核酸病毒中发现的F2A、P2A、T2A和E2A，这些2A家族的肽在掺入mRNA构建体(例如，在两个多肽结构域之间)中时，通过使核糖体跳过在该2A元件的C-末端处合成肽键而起作用，由此导致该2A序列的末端与下游的下一个肽之间出现分离。
缀合的：如本文所用，术语“缀合的”，当相对于两个或更多个部分使用时，意味着这些部分直接地或经由一个或多个用作连接剂的另外的部分彼此物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得这些部分在使用该结构的条件(例如，生理条件)下保持物理缔合。在一些实施方案中，两个或更多个部分可以通过直接共价化学键合而缀合。在其他实施方案中，两个或更多个部分可以通过离子键合或氢键合而缀合。
接触：如本文所用，术语“接触”意味着在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使细胞与mRNA或脂质纳米粒子组合物接触意味着使细胞和mRNA或脂质纳米粒子共用物理连接。使细胞在体内、体外和离体与外部实体接触的方法在生物学领域中是众所周知的。在本公开的示例性实施方案中，使哺乳动物细胞与组合物(例如，本公开的分离的mRNA、纳米粒子或药物组合物)接触的步骤在体内进行。例如，使脂质纳米粒子组合物与可以置于生物体(例如，哺乳动物)内的细胞(例如，哺乳动物细胞)接触可以通过任何合适的施用途径(例如，肠胃外施用于该生物体，包括静脉内、肌肉内、真皮内和皮下施用)来执行。对于体外存在的细胞，使组合物(例如，脂质纳米粒子或分离的mRNA)与细胞接触可以例如通过将该组合物添加到该细胞的培养基中而进行，并且可以涉及或导致转染。此外，纳米粒子组合物可以接触多于一个细胞。
包封：如本文所用，术语“包封”意指包围、围绕或包裹。在一些实施方案中，化合物、多核苷酸(例如，mRNA)或其他组合物可以被完全包封、被部分包封或被基本上包封。例如，在一些实施方案中，本公开的mRNA可以被包封在脂质纳米粒子(例如，脂质体)中。
有效量：如本文所用，剂的术语“有效量”是足以产生有益或期望的结果(例如，临床结果)的剂量，因此，“有效量”取决于正在施用该有效量的背景。例如，在施用治疗癌症的剂的背景下，剂的有效量是相比于未施用该剂时所获得的应答，例如足以实现如本文所定义的对癌症的治疗的量。在一些实施方案中，治疗有效量是待递送剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂或预防剂)的量，该量在施用于患有感染、疾病、病患和/或病症或者易受感染、疾病、病患和/或病症影响的受试者时，足以治疗、改善该感染、疾病、障碍和/或病症的症状，诊断、预防该感染、疾病、病患和/或病症，以及/或者延迟该感染、疾病、病患和/或病症的发作。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一种或多种：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3′端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。例如，可以如下执行对两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算：出于最佳比较目的对这两个序列进行比对(例如，可以为最佳比对而在第一核酸序列和第二核酸序列中的一者或两者中引入空位，并且可以出于比较目的而忽视不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较对应核苷酸位置处的核苷酸。当在第一序列中的位置被第二序列中在对应位置处的相同核苷酸占据时，则这些分子在该位置处是相同的。这两个序列之间的同一性百分比是在考虑了为这两个序列的最佳比对需要引入的空位的数目和每个空位的长度的条件下，这些序列共有的相同位置的数目的函数。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法完成。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用诸如以下文献中所述的那些方法的一些方法来确定：ComputationalMolecular Biology,Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey,1994；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M Stockton Press,New York,1991；这些文献中的每一者都以引用方式并入本文。例如，可以使用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法已经并入ALIGN程序(2.0版)，其使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，且空位罚分为4。作为替代，可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。通常用于测定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo,H.和Lipman,D.，SIAM J AppliedMath.,48:1073(1988)中所公开的那些；该文献以引用方式并入本文。用于测定同一性的技术在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。用于测定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux等人，Nucleic Acids Research,12(1):387,1984，BLASTP、BLASTN和FASTA，Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215,403,1990。
片段：如本文所用，“片段”是指一部分。例如，蛋白质的片段可以包括通过消化从所培养细胞分离的全长蛋白质而获得或通过重组DNA技术而获得的多肽。
富含GC：如本文所用，术语“富含GC”是指包含鸟嘌呤(G)核碱基和/或胞嘧啶(C)核碱基或者它们的衍生物或类似物的多核苷酸(例如，mRNA)或其任何部分(例如，RNA元件)的核碱基组合物，其中GC含量大于约50％。术语“富含GC”是指多核苷酸的全部或一部分，包括但不限于基因、非编码区、5’UTR、3’UTR、开放阅读框、RNA元件、序列基序，或者其包含约50％GC含量的任何离散序列、片段或区段。在本公开的一些实施方案中，富含GC的多核苷酸或其任何部分仅仅由鸟嘌呤(G)核碱基和/或胞嘧啶(C)核碱基组成。
GC含量：如本文所用，术语“GC含量”是指多核苷酸(例如，mRNA)或其一部分(例如，RNA元件)中为鸟嘌呤(G)核碱基和胞嘧啶(C)核碱基、或者它们的衍生物或类似物的核碱基(在DNA中和RNA中的可能核碱基(包括腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、以及它们的衍生物或类似物)的总数中)所占的百分比。术语“GC含量”是指多核苷酸的全部或一部分，包括但不限于基因、非编码区、5’或3’UTR、开放阅读框、RNA元件、序列基序，或者其任何离散序列、片段或区段。
遗传佐剂：如本文所用，“遗传佐剂”是指例如通过刺激细胞因子产生和/或通过刺激抗原特异性效应细胞(例如，CD8 T细胞)产生而增强对疫苗的免疫应答的mRNA构建体(例如，mmRNA构建体)。遗传佐剂mRNA构建体可以例如编码刺激I型干扰素(例如，激活I型干扰素途径信号传导)或促进树突状细胞发育或活性的多肽。
异源：如本文所用，“异源”指示序列(例如，氨基酸序列或编码氨基酸序列的多核苷酸)通常不存在于给定的多肽或多核苷酸中。例如，对应于一种蛋白质的结构域或基序的氨基酸序列可以与第二种蛋白质异源。
疏水性氨基酸：如本文所用，“疏水性氨基酸”是具有不带电的非极性侧链的氨基酸。天然存在的疏水性氨基酸的实例为丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。
免疫增强剂：如本文所用，“免疫增强剂”是指例如通过刺激T细胞、B细胞或树突状细胞的应答(包括但不限于细胞因子产生)、刺激抗体产生或刺激抗原特异性免疫细胞(例如，CD8+ T细胞或CD4+ T细胞)产生，来增强例如对感兴趣抗原(向其施用该免疫增强剂的受试者体内的内源性抗原、或与该免疫增强剂共同施用的外源性抗原)的免疫应答的mRNA构建体(例如，mmRNA构建体)。
起始密码子：如本文所用，术语“起始密码子(initiation codon)”(与术语“起译密码子(start codon)”可互换使用)是指开放阅读框中被核糖体翻译并且由连接的腺嘌呤-尿嘧啶-鸟嘌呤核碱基的三联体组成的第一个密码子。起始密码子由腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)和鸟嘌呤(G)这三者的第一个字母代码示出，并且通常简写为“AUG”。尽管天然mRNA可以使用除AUG之外的密码子作为起始密码子(其在本文中称为“替代性起始密码子”)，但本文所述多核苷酸的起始密码子使用AUG密码子。在翻译起始过程期间，包含起始密码子的序列经由对与核糖体结合的起始子tRNA(Met-tRNAi Met)的反密码子进行互补碱基配对来识别。开放阅读框可以含有多于一个AUG起始密码子，其在本文中称为“供选择的起始密码子”。
该起始密码子在翻译起始中起关键作用。该起始密码子是开放阅读框中被核糖体翻译的第一个密码子。通常，该起始密码子包含核苷酸三联体AUG，但在一些情况下，翻译起始可以在由不同核苷酸组成的其他密码子处发生。真核生物中翻译的起始是个多步骤生化过程，其涉及信使RNA分子(mRNAs)、40S核糖体亚单位、翻译机构的其他组分(例如，真核起始因子；eIF)之间的大量蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA和RNA-RNA相互作用。目前的mRNA翻译起始模型假定起始前复合物(作为替代，“43S起始前复合物”；缩写为“PIC”)通过以5′至3′方向扫描核苷酸，直到遇到驻留在特定翻译促进性核苷酸环境(Kozak序列)之内的第一个AUG密码子，而从该mRNA上的募集位点(典型地为5’帽)易位至起始密码子(Kozak(1989)JCell Biol 108:229-241)。通过PIC的扫描在包含起始子Met-tRNAi Met转移RNA的反密码子的核苷酸与包含该mRNA的起始密码子的核苷酸之间出现互补碱基配对时结束。AUG密码子与Met-tRNAi Met反密码子之间的生产性碱基配对引发一系列结构事件和生物化学事件，最终导致大的60S核糖体亚单位与PIC结合形成有能力进行翻译延伸的活跃核糖体。
插入：如本文所用，“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列中导致与参考序列(例如，在天然存在的分子中发现的序列)相比分别向分子添加一个或多个氨基酸残基或核苷酸的变化。例如，异源多肽(例如，BH3结构域)的氨基酸序列可以在适于插入的位点处插入到支架多肽(例如，SteA支架多肽)中。在一些实施方案中，插入可以是替换，例如，如果形成支架多肽的环(例如，SteA或SteA衍生物的环1或环2)的氨基酸序列被异源多肽的氨基酸序列替换。
插入位点：如本文所用，“插入位点”是支架多肽的适于插入异源多肽的氨基酸序列的位置或区域。应当理解，插入位点还可以指多核苷酸的编码该多肽的位置或区域(例如，多核苷酸的编码该支架多肽中的给定氨基酸的密码子)。在一些实施方案中，将异源多肽的氨基酸序列插入到支架多肽中对该支架多肽的稳定性(例如，构象稳定性)、表达水平和整体二级结构几乎没有或完全没有影响。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指已经从至少一些与其缔合的组分(无论是在自然界中、还是在实验环境中)分离的物质或实体。分离的物质相对于与其缔合的物质，可以具有变化的纯度水平。分离的物质和/或实体可以从至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的最初与其缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂为超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果某种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。
Kozak序列：术语“Kozak序列”(也称为“Kozak共有序列”)是指用于增强基因或开放阅读框的表达的翻译起始增强子元件，其在真核生物中位于5’UTR中。在分析了起始密码子(AUG)周围的单一突变对前胰岛素原基因翻译的影响(Kozak(1986)Cell 44:283-292)之后，Kozak共有序列最初被定义为序列GCCRCC，其中R＝嘌呤。本文所公开的多核苷酸包含Kozak共有序列，或者其衍生物或修饰。(翻译增强子组合物的实例及其使用方法，参见：Andrews等人的美国专利号5,807,707，其全文以引用方式并入本文；Chernajovsky的美国专利号5,723,332，其全文以引用方式并入本文；Wilson的美国专利号5,891,665，其全文以引用方式并入本文。)
遗漏扫描：可能发生称为“遗漏扫描”的现象，由此PIC绕过起始密码子，而是继续向下游扫描，直到识别出供选择或替代性的起始密码子为止。取决于发生的频率，PIC绕过起始密码子可以导致翻译效率降低。此外，可以发生从该下游AUG密码子开始的翻译，这将导致产生不期望的异常翻译产物，这种产物可能无法引发期望的治疗应答。在一些情况下，该异常翻译产物实际上可能引起有害应答(Kracht等人，(2017)Nat Med 23(4):501-507)。
脂质体：如本文所用，所谓“脂质体”，是指包括包围水性内部的含脂质膜的结构。脂质体可以具有一个或多个脂质膜。脂质体包括单层(single-layered)脂质体(在本领域中也称为单层(unilamellar)脂质体)和多层(multi-layered)脂质体(在本领域中也称为多层(multilamellar)脂质体)。
转移：如本文所用，术语“转移”是指癌症从其首次以原发性肿瘤形式出现的位置扩散到体内远端位置的过程。由于该过程产生的继发性肿瘤可以称为“转移”。mRNA：如本文所用，“mRNA”是指信使核糖核酸。mRNA可以是天然存在的或非天然存在的。例如，mRNA可以包含经修饰和/或非天然存在的组分，诸如一个或多个核碱基、核苷、核苷酸或接头。mRNA可以包含帽结构、链终止核苷、茎环、多聚腺苷酸序列和/或多聚腺苷酸化信号。mRNA可以具有编码多肽的核苷酸序列。mRNA的翻译(例如，mRNA在哺乳动物细胞内的体内翻译)可以产生多肽。传统上，mRNA分子的基本组分至少包括编码区、5'-非翻译区(5’-UTR)、3'UTR、5’帽和多聚腺苷酸序列。
微RNA(miRNA)：如本文所用，“微RNA(miRNA)”是可以在基因表达的转录后调节中起作用的小的非编码RNA分子(起作用的方式例如，RNA沉默(诸如通过切割该mRNA、利用缩短其多聚腺苷酸尾来使该mRNA不稳定，和/或干扰核糖体将该mRNA翻译成多肽的效率)。成熟miRNA的长度典型地为约22个核苷酸。
微RNA-122(miR-122)：如本文所用，除非另外指明，否则“微RNA-122(miR-122)”是指来自任何脊椎动物来源(包括例如人)的任何天然miR-122。miR-122典型地在肝脏中高度表达，并且在肝脏中可以调节脂肪酸代谢。肝癌(例如，肝细胞癌)中的miR-122水平降低。miR-122是在肝脏中表达最高的miRNA之一，并且在肝脏中调节靶标，包括但不限于CAT-1、CD320、AldoA、Hjv、Hfe、ADAM10、IGFR1、CCNG1和ADAM17。成熟的人miR-122可以具有序列AACGCCAUUAUCACACUAAAUA(SEQ ID NO:32，对应于hsa-miR-122-3p)或序列UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO:33，对应于hsa-miR-122-5p)。
微RNA-21(miR-21)：如本文所用，除非另外指明，否则“微RNA-21(miR-21)”是指来自任何脊椎动物来源(包括例如人)的任何天然miR-21。肝癌(例如，肝细胞癌)中的miR-21水平相比于正常肝脏中增加。成熟的人miR-21可以具有序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQID NO:34，对应于has-miR-21-5p)或序列5’–CAACACCAGUCGAUGGGCUGU–3’(SEQ ID NO:35，对应于has-miR-21-3p)。
微RNA-142(miR-142)：如本文所用，除非另外指明，否则“微RNA-142(miR-142)”是指来自任何脊椎动物来源(包括例如人)的任何天然miR-142。miR-142典型地在骨髓细胞中高度表达。成熟的人miR-142可以具有序列UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(SEQ ID NO:28，对应于hsa-miR-142-3p)或序列CAUAAAGUAGAAAGCACUACU序列(SEQ ID NO:30，对应于hsa-miR-142-5p)。
微RNA(miRNA)结合位点：如本文所用，“微RNA(miRNA)结合位点”是指miRNA与之结合或缔合的miRNA靶位点或miRNA识别位点、或任何核苷酸序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点代表多核苷酸(例如，mRNA)中的至少miRNA的“种子”区与之结合的核苷酸位置或区域。应当理解，“结合”可以遵循传统的Watson-Crick杂交规则，或可以反映该miRNA与该微RNA位点处或附近的靶序列的任何稳定的缔合。
miRNA种子：如本文所用，miRNA的“种子”区是指成熟miRNA的2至8位区域中的序列，该序列典型地与miRNA结合位点具有完美的Watson-Crick互补性。miRNA种子可以包含成熟miRNA的2至8或2至7位。在一些实施方案中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2至8)，其中对应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2至7)，其中对应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。当提及miRNA结合位点时，miRNA种子序列应当理解为与该miRNA的结合该miRNA结合位点的种子序列具有互补性(例如，部分、基本或完全互补性)。
经修饰的：如本文所用，“经修饰的”或“修饰”是指本文所提供的多核苷酸(例如，mRNA)或分子的状态改变、或者组成或结构改变。多核苷酸和分子可以以各种方式修饰，包括进行化学修饰、结构修饰和/或功能修饰。例如，可以通过掺入一种或多种RNA元件而对多核苷酸进行结构修饰，其中该RNA元件包含提供一种或多种功能(例如，翻译调节活性)的序列和/或一种或多种RNA二级结构。在一些实施方案中，通过引入非天然核苷和/或核苷酸来修饰多核苷酸，例如，在其涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C时。非典型的核苷酸(诸如帽结构)不被认为是“经修饰的”，尽管其与A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构不同。因此，本公开的多核苷酸和分子可以包含一种或多种修饰(例如，可以包含一种或多种化学修饰、结构修饰或功能修饰，包括它们的任意组合)。
纳米粒子：如本文所用，“纳米粒子”是指具有规模小于约1000nm的任何一种结构特征的粒子，与相同材料的块状样品相比，其表现出新颖的特性。常规地，纳米粒子具有规模小于约500nm、小于约200nm或约100nm的任何一种结构特征。同样常规地，纳米粒子具有规模为约50nm至约500nm、约50nm至约200nm或约70nm至约120nm的任何一种结构特征。在示例性实施方案中，纳米粒子是具有约1nm至1000nm量级的一种或多种维度的粒子。在其他示例性实施方案中，纳米粒子是具有约10nm至500nm量级的一种或多种维度的粒子。在其他示例性实施方案中，纳米粒子是具有约50nm至200nm量级的一种或多种维度的粒子。球形纳米粒子的直径将例如介于约50纳米至100纳米或70纳米至120纳米之间。纳米粒子在其运输和特性方面最常表现为一个单元。值得注意的是，将纳米粒子与对应的块状材料区分开的新颖特性典型地以小于1000nm的尺寸规模或约100nm的尺寸开发，但纳米粒子可以具有更大的尺寸，例如，对于椭圆形、管状等的粒子。尽管大多数分子的大小会适合以上要点，但是通常不将单独的分子称为纳米粒子。
核酸：如本文所用，术语“核酸”以其最广泛的含义使用，并且涵盖包括核苷酸的聚合物在内的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、DNA-RNA杂合体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-LNA，和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-LNA)或它们的杂合体。此外，核酸可以是核酸构建体的形式，诸如质粒或载体(例如，病毒载体、表达载体)。
核碱基：如本文所用，术语“核碱基”(作为替代“核苷酸碱基”或“含氮碱基”)是指在核酸中发现的嘌呤或嘧啶杂环化合物，包括天然存在的嘌呤和嘧啶的任何衍生物或类似物，其赋予核酸或者其部分或区段改善的特性(例如，结合亲和力、核酸酶抗性、化学稳定性)。腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶是主要存在于天然核酸中的核碱基。如本领域已知和/或本文所述的其他天然、非天然和/或合成的核碱基可以掺入核酸中。
核苷/核苷酸：如本文所用，术语“核苷”是指含有与核碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或者其衍生物或类似物(在本文中也称为“核碱基”)共价连接的糖分子(例如，RNA中的核糖或DNA中的脱氧核糖)或者其衍生物或类似物但缺少核苷间连接基团(例如，磷酸酯基团)的化合物。如本文所用，术语“核苷酸”是指与核苷间连接基团(例如，磷酸酯基团)共价键合的核苷，或者其任何衍生物、类似物或修饰，用于赋予核酸或者其部分或区段改善的化学特性和/或功能特性(例如，结合亲和力、核酸酶抗性、化学稳定性)。
开放阅读框：如本文所用，术语“开放阅读框”(缩写为“ORF”)是指mRNA分子的编码多肽的区段或区域。ORF包含连续的一段非重叠的框内密码子，从起始密码子开始并以终止密码子结束，并且ORF被核糖体翻译。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或者接受训练有素的专业人员针对特定的疾病或病症的护理的受试者。在具体实施方案中，患者是人患者。在一些实施方案中，患者是患有癌症(例如，肝癌或结肠直肠癌)的患者。
药学上可接受的：短语“药学上可接受的”在本文中用来指在合理医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触，而且没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症，并具有与之相称的合理的效益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述化合物之外并且在患者体内具有基本上无毒和非炎性的特性的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)。赋形剂可以包括例如：抗粘附剂、抗氧化剂、粘结剂、涂料、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或涂料、风味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸(氢)钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧甲基淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转变为其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲基胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括母体化合物的常规无毒盐，其例如由无毒的无机或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般来讲，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中、或在这两者的混合物中反应来制备；一般来讲，优选的是非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的清单可在Remington’sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985，第1418页，Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use，P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑)，Wiley-VCH,2008以及Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)中找到，这些文献中的每一者全文以引用方式并入本文。
多肽：如本文所用，术语“多肽”或“感兴趣多肽”是指典型地通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，其可以天然产生(例如，分离或纯化)或合成产生。
起始前复合物(PIC)：如本文所用，术语“起始前复合物”(作为替代，“43S起始前复合物”；缩写为“PIC”)是指包含40S核糖体亚单位、真核起始因子(eIF1、eIF1A、eIF3、eIF5)和eIF2-GTP-Met-tRNAi Met三元复合物的核糖核蛋白复合物，其内在地能够附接到mRNA分子的5’帽，并且在附接之后能够执行对5’UTR的核糖体扫描。
RNA元件：如本文所用，术语“RNA元件”是指RNA分子的一部分、片段或区段，其提供生物学功能并/或具有生物学活性(例如，翻译调节活性)。通过掺入一种或多种RNA元件(诸如本文所述的那些)修饰多核苷酸为该经修饰的多核苷酸提供了一种或多种期望的功能特性。如本文所述，RNA元件可以是天然存在的、非天然存在的、合成的、工程改造的，或这些的任意组合。例如，提供调节活性的天然存在的RNA元件包括在病毒、原核生物体和真核生物体(例如，人)的整个转录组中发现的元件。已经证实，RNA元件(特别是真核mRNA)和翻译的病毒RNA参与介导细胞中的许多功能。示例性的天然RNA元件包括但不限于翻译起始元件(例如，内部核糖体进入位点(IRES)，参见Kieft等人，(2001)RNA 7(2):194-206)、翻译增强子元件(例如，APP mRNA翻译增强子元件，参见Rogers等人，(1999)J Biol Chem 274(10):6421-6431)、mRNA稳定性元件(例如，富含AU的元件(ARE)，参见Garneau等人，(2007)NatRev Mol Cell Biol 8(2):113-126)、翻译阻遏元件(参见例如，Blumer等人，(2002)MechDev 110(1-2):97-112)、蛋白质结合RNA元件(例如，铁应答元件，参见Selezneva等人，(2013)J Mol Biol 425(18):3301-3310)、细胞质多聚腺苷酸化元件(Villalba等人，(2011)Curr Opin Genet Dev 21(4):452-457)和催化性RNA元件(例如核糖酶，参见Scott等人，(2009)Biochim Biophys Acta 1789(9-10):634-641)。
停留时间：如本文所用，术语“停留时间”是指在沿mRNA分子的离散位置处占据起始前复合物(PIC)或核糖体的时间。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指可以向其施用根据本公开的组合物，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人)和/或植物。在一些实施方案中，受试者可以是患者。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的总体或接近总体程度或水平的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行完整或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。
患有：“患有”疾病、病患和/或病症的个体已经被诊断为患有或表现出疾病、病患和/或病症的一种或多种症状。
靶向部分：如本文所用，“靶向部分”是可以将纳米粒子靶向特定的细胞、组织和/或器官类型的化合物或剂。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用并且/或者引发期望的生物学和/或药理学作用的任何剂。
转染：如本文所用，术语“转染”是指将物质(例如，多核苷酸，诸如mRNA)引入细胞中的方法。
翻译调节活性：如本文所用，术语“翻译调节活性”(与“翻译调节功能”可互换使用)是指调控(例如，调节、影响、控制、改变)翻译装置的活性(包括PIC和/或核糖体的活性)的生物学功能、机制或过程。在一些方面，期望的翻译调节活性促进和/或增强mRNA翻译的翻译保真度。在一些方面，期望的翻译调节活性减少和/或抑制遗漏扫描。受试者：如本文所用，术语“受试者”是指可以向其施用根据本公开的组合物，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人)和/或植物。在一些实施方案中，受试者可以是患者。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、改进、缓和、延迟特定的感染、疾病、病患和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，抑制其进展，降低其严重性和/或降低其发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。治疗可以施用于没有表现出疾病、病患和/或病症的迹象的受试者和/或施用于仅表现出疾病、病患和/或病症的早期迹象的受试者，目的是降低发生与该疾病、病患和/或病症相关联的病理学的风险。
预防：如本文所用，术语“预防”是指部分或完全抑制特定的感染、疾病、病患和/或病症的一种或多种症状或特征的发作。
肿瘤：如本文所用，“肿瘤”是组织的异常生长，无论是良性还是恶性。
未经修饰的：如本文所用，“未经修饰的”是指在以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。“未经修饰的”可以但不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，由此每个经修饰的分子都可以作为“未经修饰的”起始分子用于随后的修饰。
尿苷含量：术语“尿苷含量”或“尿嘧啶含量”是可互换的，并且是指某种核酸序列中存在的尿嘧啶或尿苷的量。尿苷含量或尿嘧啶含量可以表示为绝对值(序列中尿苷或尿嘧啶的总数)或相对值(相对于核酸序列中核碱基总数的尿苷或尿嘧啶百分比)。
尿苷修饰的序列：术语“尿苷修饰的序列”是指序列优化的核酸(例如，合成的mRNA序列)，其相对于候选核酸序列的尿苷含量和/或尿苷模式具有不同的总体尿苷或局部尿苷含量(更高或更低的尿苷含量)或具有不同的尿苷模式(例如，梯度分布或成簇)。在本公开的内容中，术语“尿苷修饰的序列”和“尿嘧啶修饰的序列”被认为是等同的和可互换的。
“高尿苷密码子”被定义为包含两个或三个尿苷的密码子，“低尿苷密码子”被定义为包含一个尿苷的密码子，“无尿苷密码子”是不含任何尿苷的密码子。在一些实施方案中，尿苷修饰的序列包含用低尿苷密码子取代高尿苷密码子、用无尿苷密码子取代高尿苷密码子、用高尿苷密码子取代低尿苷密码子、用无尿苷密码子取代低尿苷密码子、用低尿苷密码子取代无尿苷密码子、用高尿苷密码子取代无尿苷密码子，以及它们的组合。在一些实施方案中，高尿苷密码子可以用另一个高尿苷密码子替换。在一些实施方案中，低尿苷密码子可以用另一个低尿苷密码子替换。在一些实施方案中，无尿苷密码子可以用另一个无尿苷密码子替换。尿苷修饰的序列可以是富含尿苷的或尿苷稀化(uridine rarefied)的。
富含尿苷的：如本文所用，术语“富含尿苷的”和语法变体是指序列优化的核酸(例如，合成的mRNA序列)中尿苷含量(以绝对值或以百分比值表示)相对于对应候选核酸序列的尿苷含量增加。尿苷富集可以通过用含有较少尿苷核碱基的同义密码子取代在候选核酸序列中的密码子来实现。尿苷富集可以是全局的(即，相对于候选核酸序列的整个长度)或局部的(即，相对于候选核酸序列的子序列或区域)。
尿苷稀化的：如本文所用，术语“尿苷稀化的”和语法变型是指序列优化的核酸(例如，合成的mRNA序列)中尿苷含量(以绝对值或以百分比值表示)相对于对应候选核酸序列的尿苷含量降低。尿苷稀化可以通过用含有较少尿苷核碱基的同义密码子取代在候选核酸序列中的密码子来实现。尿苷稀化可以是全局的(即，相对于候选核酸序列的整个长度)或局部的(即，相对于候选核酸序列的子序列或区域)。
等同物和范围
本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验探知根据本文所述公开内容的具体实施方案的许多等同物。本公开的范围不旨在限于以下描述，而是如所附权利要求中所述。
在权利要求中，诸如“一个”、“一种”和“该”的冠词可以表示一个或多于一个，除非相反地指出或从上下文中显而易见不是这样。在组的一个或多个成员之间包括"或"的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个或全部存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关，除非指出相反或根据上下文明显不同。本公开包括其中该组的恰好一个成员存在于、用于给定的产品或过程中，或者以其他方式与给定的产品或过程相关的实施方案。本公开包括其中多于一个或所有的组成员存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关的实施方案。
还应当注意，术语“包括”旨在是开放的，并且允许但不要求包含额外的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”时，因此也涵盖和公开了术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指明或根据上下文和本领域普通技术人员的理解另外显而易见，否则表示为范围的值可以在本公开的不同实施方案中的所指出范围内呈现直至该范围下限的十分之一单位的任何特定的值或子范围，除非上下文另有明确规定。
所有引用的来源(例如参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本文引用的技术)都通过引用并入本申请中，即使引文中没有明确说明也是如此。如果引用来源和本申请的陈述相互矛盾，则以本申请中的陈述为主。
实施例
通过参考以下实施例将更全面地理解本公开。然而，这些实施例不应被理解为限制本公开的范围。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于说明目的，并且可以建议本领域技术人员根据它们做出各种修改或改变，这些修改或改变将包括在本申请的实质和范围以及所附权利要求的范围之内。
实施例1：STING免疫增强剂mRNA构建体
在该实施例中，制备了编码组成型激活形式的人STING的一系列mmRNA构建体，并测试了它们刺激干扰素-β(IFN-β)产生的能力。由这些构建体编码的人STING蛋白通过引入一个或多个点突变而发生组成型激活。测试了下列单个点突变或组合点突变：(i)V155M；(ii)R284T；(iii)V147L/N154S/V155M；和(iv)R284M/V147L/N154S/V155M。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')Nlmp Np)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。无任何表位标签的代表性组成型活性人STING构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1-10示出。编码这些氨基酸序列的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:199-208和1442-1450示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ IDNO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定组成型活性STING构建体是否可以刺激IFN-β产生，将这些构建体转染到人TF1a细胞中。野生型(非组成型活性)的人STING构建体和小鼠STING构建体用作阴性对照。以25,000个细胞/孔的密度将细胞接种在96孔板中，然后使用Lipofectamine 2000将mmRNA构建体(250ng)转染到这些细胞中。在24小时和48小时之后，采集上清液，通过标准ELISA测定IFN-β水平。结果在图1中示出，证明与野生型(非组成型活性)人和小鼠STING对照相比，组成型活性STING构建体刺激了IFN-β产生。虽然所有四种突变型STING构建体均刺激了IFN-β产生，但V155M突变体和R284T突变体显示出最高的活性。这些结果证明了组成型活性STING mRNA构建体能够通过刺激IFN-β产生来增强免疫应答。
在第二组实验中，使用了其转录由干扰素敏感性应答元件(ISRE)驱动的报告基因来测试一组组成型活性STING mRNA构建体激活来源于B16黑素细胞的STING KO小鼠报告细胞系中的ISRE的能力。结果在图2中示出，证明组成型活性STING构建体刺激报告基因表达，从而表明这些构建体能够激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)。
实施例2：IRF3和IRF7免疫增强剂mRNA构建体
在该实施例中，制备了编码组成型激活形式的IRF3或IRF7的一系列mmRNA构建体，并测试了它们激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)的能力。包含S396D点突变而无任何表位标签的代表性组成型活性小鼠和人IRF3构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:11-12示出。编码这些氨基酸序列的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:210-211示出。无任何表位标签的野生型人IRF7构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:13(由以SEQ ID NO:212示出的核苷酸序列编码)示出。无任何表位标签的代表性组成型活性人IRF7构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:14-18示出。编码这些氨基酸序列的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:213-217和142-1459示出。无任何表位标签的代表性截短人IRF7构建体(无活性的“无效”突变)的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:19-20示出。编码这些氨基酸序列的示例性核苷酸序列以SEQ IDNO:218-219示出。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽15’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
使用了实施例1中所使用的其转录由干扰素敏感性应答元件(ISRE)驱动的报告细胞系来测试组成型活性IRF3和IRF7 mRNA构建体激活ISRE的能力。结果在图3A至图3B中示出，其证明组成型活性IRF3构建体(图3A)和组成型活性IRF7构建体(图3B)刺激了报告基因表达，从而表明这些构建体能够激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)。
实施例3：IKKβ、cFLIP和RIPK1免疫增强剂mRNA构建体
在该实施例中，使用其转录由NFκB信号传导途径驱动的荧光素酶报告基因来测试组成型活性IKK、cFLIP和RIPK1 mRNA构建体激活NFκB信号传导的能力。
组成型活性IKKβ构建体包含以下两个点突变：S177E/S181E。组成型活性IKKα或IKKβ构建体包含PEST突变。无任何表位标签的组成型活性IKKβ构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:146-149示出。编码SEQ ID NO:146的蛋白质的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1414和1485示出。包含PEST突变而无任何表位标签的组成型活性IKKα或IKKβ构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:150、152、154和156(由分别以SEQ ID NO:151、153、155和157示出，或分别以SEQ ID NO:1428、1397、1429和1430示出的核苷酸序列编码)示出。组成型活性cFLIP构建体包括cFLIP-L、cFLIP-S(aa 1-227)、cFLIP p22(aa 1-198)、cFLIP p43(aa 1-376)或cFLIP p12(aa 377-480)。无任何表位标签的cFLIP构建体的ORF氨基酸序列以SEQID NO:141-145示出。编码这些cFLIP蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1398-1402和1469-1473示出。各种组成型活性RIPK1构建体的结构进一步描述于例如Yatim,N.等人，(2015)Science 350:328-334或Orozco,S.等人，(2014)Cell Death Differ.21:1511-1521中。无任何表位标签的组成型活性RIPK1构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:158-163示出。编码这些RIPK1蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1403-1408和1474-1479示出。除开放阅读框之外，所有构建体还含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ IDNO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
在第一系列实验中，将cFLIP或IKKβ构建体(12.5ng RNA)连同NFκB-luc报告基因一起转染到B16F10、MC38或HEK293细胞中，并且在转染后24小时进行Dual Luc(双荧光素酶)测定，作为激活NFκB信号传导的指标。结果在图4中示出，证明组成型活性cFLIP和IKKβ构建体刺激报告基因表达，从而表明这些构建体能够激活NFκB信号传导途径。在第二系列实验中，将RIPK1构建体连同NFκB-luc报告基因一起转染到B16F10细胞中，并且在转染后24小时进行Dual Luc测定，作为激活NFκB信号传导的指标。结果在图5中示出，证明组成型活性RIPK1构建体刺激报告基因表达，从而表明这些构建体能够激活NFκB信号传导途径。
实施例4：DIABLO免疫增强剂mRNA构建体
在该实施例中，制备了编码DIABLO的一系列mmRNA构建体，并测试了它们诱导细胞因子产生的能力。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽15’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。无任何表位标签的DIABLO构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:165-172示出。编码SEQ ID NO:169的DIABLO蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1416和1487示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定这些DIABLO构建体是否可以诱导细胞因子产生，将这些构建体转染到SKOV3细胞中。以10,000个细胞/孔的密度将细胞接种在96孔板中，然后使用Lipofectamine2000将mmRNA构建体转染到这些细胞中。测量了DIABLO mmRNA构建体在SKOV3细胞中对产生细胞因子的刺激。对于TNF-α的结果在图6中示出，对于白介素6(IL-6)的结果在图7中示出，证明许多DIABLO mmRNA构建体刺激SKOV3细胞产生细胞因子。
实施例5：免疫增强剂mRNA增强HPV疫苗应答
在该实施例中，检查了对与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂组合使用的基于人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA的疫苗的应答的效力和持久性。已知在宫颈微环境中对人乳头瘤病毒(HPV)的特异性免疫应答在根除感染和消除突变细胞方面起关键作用。然而，已知高风险HPV调控免疫细胞以产生免疫阻抑性微环境(参见例如，Prata,T.T.等人，(2015)Immunology 146:113-121)。因此，非常需要能够产生稳健且持久的免疫应答的HPV疫苗接种方法。
本实施例中使用的HPV疫苗是编码细胞内形式或可溶性形式的HPV16抗原E6和E7(本文中分别称为iE6/E7和sE6/E7)的mRNA构建体。为了产生可溶性形式，将分泌所需的信号肽与该抗原的N-末端融合。该信号肽的序列来源于Igκ链V-III区HAH。在第0天和第14天用iE6/E7或sE6/E7 mRNA疫苗(剂量为0.25mg/kg)，结合对照mRNA构建体(NTFIX)，或STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体(剂量为0.25mg/kg)，对小鼠进行肌肉内免疫。该组成型活性STING免疫增强剂含有V155M突变(对应于SEQ ID NO:1的小鼠形式)。该组成型活性IRF3免疫增强剂含有S396D突变(对应于SEQ ID NO:12)。该组成型活性IRF7免疫增强剂含有内部缺失和6个点突变(对应于SEQ ID NO:18的小鼠形式)。HPV疫苗构建体和免疫增强剂构建体在MC3脂质纳米粒子中共同配制。
在第21天和第53天，在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A(Brefeldin A)；BDBiosciences)与E6肽汇集物(含有37种E6肽，其序列以SEQ ID NO:36-72示出)、E7肽汇集物(含有22种E7肽，其序列以SEQ ID NO:73-94示出)、E6单肽(8种单独的肽)、E7单肽(7种单独的肽)或无肽(对照)存在下，在37℃下对来自每个测试组的小鼠的脾细胞和外周血单核细胞(PBMC)进行4小时的离体再刺激。每种肽以0.2μg/ml的剂量提供。通过IFN-γ或TNF-α的细胞内染色(ICS)来评估CD8疫苗应答。
第21天脾细胞对IFN-γ和TNF-α的E7特异性应答的代表性ICS结果在图8A(IFN-γ)和图8B(TNF-α)中示出。第21天脾细胞对IFN-γ和TNF-α的E6特异性应答的代表性ICS结果在图9A(IFN-γ)和图9B(TNF-α)中示出。图8A至图8B和图9A至图9B中的结果证明，当STING、IRF3或IRF7免疫增强剂与所述疫苗、与比E6表位更强且可变性更小的E7表位，以及与比细胞内形式的抗原更强的可溶性形式的抗原共同配制时，CD8疫苗应答(对细胞内和可溶性这两种抗原形式的应答)大大增强。免疫增强剂引起的这种增强的CD8疫苗应答被证明是持久的，如分别在图10A和图10B中所示的代表性的第21天与第53天的E7特异性脾细胞IFN-γICS数据所证实的。对于PBMC实验观察到与脾细胞数据类似的结果(数据未显示)。STING改善抗原特异性CD8应答的持久性的能力由图11A中所示的IFN-γICS数据(来自用细胞内E6/E7免疫的小鼠的E7特异性应答)和图11B中所示的IFN-γICS数据(来自用可溶性E6/E7免疫的小鼠的E7特异性应答)进一步证明，其中在7周实验过程中，证明在经STING治疗的小鼠中维持了更高百分比的抗原特异性CD8 T细胞。
还检查了活CD45+细胞中的CD8b+细胞的百分比。第21天与第53天脾细胞的结果分别在图12A和图12B中示出。结果证明，免疫增强剂(特别是STING构建体)在第21天而不是第53天扩增了总CD8b+群体。
通过E7-MHC1四聚体染色进一步证实了免疫增强剂构建体增强CD8疫苗应答的能力。第21天与第53天脾细胞的代表性结果分别在图13A和图13B中示出。E7-MHC-1四聚体染色结果与上面讨论的ICS结果一致，但它们的可变性更大。如图14A至图14D所证明，发现大多数四聚体阳性CD8细胞具有“效应记忆”CD62Llo表型。对第21天与第53天的E7-四聚体+CD8细胞的比较证明，该“效应记忆”CD62Llo表型在整个研究期间得以维持。另外的染色实验证明，这些免疫增强剂略微降低了总Foxp3+Treg CD4 T细胞的％(数据未示出)，并且没有改变CD138+浆母细胞的％(数据未示出)。
实施例6：免疫增强剂mRNA增强MC38癌症疫苗应答
在该实施例中，检查了对与STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体组合使用的基于MC38 mRNA的癌症疫苗的应答的效力和持久性。MC38鼠肿瘤模型已被用于鉴定含有能够刺激抗肿瘤T细胞应答的新表位的免疫原性突变型肽(参见例如，Yadav,M.等人，(2014)Nature 515:572-576)。因此，非常需要能够产生针对肿瘤新表位的稳健且持久的免疫应答的癌症疫苗接种方法。
在该实施例中使用的MC38疫苗是编码三种25聚体突变型肽的ADR多联体的mRNA构建体，其含有来源于Adpgk、Dpagt1和Reps1的肿瘤新表位(该疫苗在本文中也称为ADRvax)。该mRNA构建体编码以SEQ ID NO:179示出的开放阅读框，该开放阅读框还包含N-末端的His标签以便于检测。在第0天和第14天用ADRvax mRNA疫苗(剂量为0.25mg/kg)，结合对照mRNA构建体(NTFIX)，或STING、IRF3或IRF7免疫增强剂mRNA构建体(剂量为0.25mg/kg)，对小鼠进行肌肉内免疫。该组成型活性STING免疫增强剂含有V155M突变(对应于SEQ ID NO:1的小鼠形式)。该组成型活性IRF3免疫增强剂含有S396D突变(对应于SEQ ID NO:12)。该组成型活性IRF7免疫增强剂含有内部缺失和6个点突变(对应于SEQ ID NO:18的小鼠形式)。MC38疫苗构建体和免疫增强剂构建体在MC3脂质纳米粒子中共同配制。
在第21天和第35天，在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A；BD Biosciences)与野生型或突变型MC38 ADR肽(每种肽1μg/ml)存在下，在37℃下对来自每个测试组的小鼠的CD8+脾细胞进行4小时的离体再刺激，然后通过细胞内染色(ICS)评估对IFN-γ的CD8疫苗应答。第21天和第35天的CD8+脾细胞对IFN-γ的MC38 ADR特异性应答的代表性ICS结果在图15A(第21天)和图15B(第35天)中示出。对于TNF-α和CD8+PBMC的ICS观察到类似的结果。结果证明，STING免疫增强剂构建体极大地增强了CD8疫苗应答，并且IRF3和IRF7免疫增强剂构建体适度增强了CD8疫苗应答。在第21天观察到用免疫增强剂治疗的小鼠的抗原特异性CD8应答的初始改善(STING治疗与对照相比，约5％对比1％)，该应答继续改善，到第35天(与对照相比，STING治疗的改善最高达15％)，从而证明了该应答的持久性。
还检查了活CD45+细胞中的CD8b+细胞的百分比。第35天的脾细胞和PBMC的结果在图16A中示出，证明这些免疫增强剂构建体扩增了总CD8b+群体。如图16B中所证明，发现大多数CD8+脾细胞和PBMC具有“效应记忆”CD62Llo表型。另外的染色实验证明，STING和IRF7免疫增强剂构建体略微降低了总Foxp3+Treg CD4 T细胞的％(数据未示出)。另外的染色实验证明，免疫增强剂没有改变CD138+浆母细胞的％(数据未示出)。
实施例7：免疫增强剂mRNA增强细菌疫苗应答
在该实施例中，检查了对与STING免疫增强剂组合使用的基于细菌mRNA的疫苗的应答的效力，特别是该免疫增强剂对针对细菌抗原的体液免疫应答(抗体产生)的作用。
在该实施例中使用的细菌疫苗是编码一组已经在本领域中建立以提供针对细菌感染的保护性免疫的细菌抗原肽的mRNA构建体汇集物。因此，该实施例中使用的疫苗是基于多价mRNA的细菌疫苗。这些细菌肽抗原mRNA构建体编码这些肽抗原的ORF，并且还含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。这些构建体任选地还可以编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。
在第0、14和28天，以每种抗原0.2μg或0.8μg的剂量，单独地或与STING免疫增强剂mRNA构建体组合向小鼠施用细菌肽抗原mRNA构建体。该组成型活性STING免疫增强剂含有V155M突变(对应于SEQ ID NO:1的小鼠形式)。在治疗前以及第14、28和35天采集血清。在用单独的细菌肽抗原mRNA构建体治疗的小鼠与用细菌肽抗原mRNA构建体与STING mRNA构建体组合治疗的小鼠之间比较抗体滴度。通过用STING构建体共同治疗，用较高剂量(0.8μg)的细菌抗原肽mRNA构建体治疗的小鼠显示出对抗原特异性抗体滴度的适度影响(数据未示出)。然而，如图17中所示，用STING构建体共同治疗显示出对用较低剂量(0.2μg)的细菌肽抗原mRNA构建体(在图17中称为RNA 0298、2753、2723、2635、1507、0992和0735)治疗的小鼠中的抗原特异性抗体滴度具有显著影响。这些结果证明，STING免疫增强剂增强了针对由细菌mRNA疫苗构建体编码的细菌肽抗原的体液免疫应答，特别是在该细菌mRNA疫苗构建体以较低剂量使用时。
实施例8：KRAS-STING mRNA构建体
已经报道了对各种癌症类型中的Ras突变的综合调查(Prior,I.A.等人，(2012)Cancer Res.72:2457-2467)。该调查证明，结肠直肠癌中最常见的前三种KRAS突变是G12D、G12V和G13D。制备了编码含有这三种突变之一的一种或多种KRAS肽的一系列突变型KRASmRNA构建体，用作基于KRAS抗肿瘤mRNA的疫苗。此外，为了检查这些基于mRNA的免疫增强剂对KRAS疫苗应答的作用，制备了编码在N-末端或C-末端处连接到编码STING作为免疫增强剂的序列的一种或多种突变型KRAS肽的一系列mRNA构建体。因此，在这些KRAS-STING mRNA构建体中，所述一种或多种疫苗抗原和免疫增强剂由相同的mRNA构建体编码。
制备突变型KRAS肽mRNA构建体，这些构建体编码：具有G12D、G12V或G13D突变的15聚体肽(其氨基酸序列分别以SEQ ID NO:95-97示出)；具有G12D、G12V或G13D突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:98-100)；具有G12D、G12V或G13D突变的15聚体肽(分别为SEQ ID NO:101-103)的三个拷贝；或具有G12D、G12V或G13D突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:104-106)的三个拷贝。另外的构建体编码具有G12C突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:131-132)或野生型25聚体肽(SEQ ID NO:133)的一个拷贝或三个拷贝。在某些实施方案中，G12CKRAS突变可以与G12D、G12V或G13D突变或者它们的组合结合使用。编码这些突变型KRAS肽的核苷酸序列在实施例9中提供。
制备在N-末端处具有STING编码序列的突变型KRAS肽-STING mRNA构建体，这些构建体编码：具有G12D、G12V或G13D突变的15聚体肽(其氨基酸序列分别以SEQ ID NO:107-109示出)；具有G12D、G12V或G13D突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:110-112)；具有G12D、G12V或G13D突变的15聚体肽(分别为SEQ ID NO:113-115)的三个拷贝；或具有G12D、G12V或G13D突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:116-118)的三个拷贝。在某些实施方案中，G12CKRAS突变可以与G12D、G12V或G13D突变或者它们的组合结合使用。编码在N-末端处具有STING编码序列的这些KRAS肽-STING构建体的代表性核苷酸序列以SEQ ID NO:220和222示出。
制备在C-末端处具有STING编码序列的突变型KRAS肽-STING mRNA构建体，这些构建体编码：具有G12D、G12V或G13D突变的15聚体肽(其氨基酸序列分别以SEQ ID NO:119-121示出)；具有G12D、G12V或G13D突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:122-124)；具有G12D、G12V或G13D突变的15聚体肽(分别为SEQ ID NO:125-127)的三个拷贝；或具有G12D、G12V或G13D突变的25聚体肽(分别为SEQ ID NO:128-130)的三个拷贝。在某些实施方案中，G12CKRAS突变可以与G12D、G12V或G13D突变或者它们的组合结合使用。编码在C-末端处具有STING编码序列的这些KRAS肽-STING构建体的代表性核苷酸序列以SEQ ID NO:221和223示出。
这些构建体还可以在N-末端或C-末端处编码表位标签以促进检测。可以使用不同的表位标签(例如，FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了测试用一种或多种KRAS突变型肽mRNA疫苗构建体或用一种或多种KRAS突变型肽疫苗-STING免疫增强剂mRNA构建体治疗的小鼠体内的疫苗应答，将小鼠(HLA-A*11:01或HLA-A*2:01；Taconic)用KRAS突变型肽疫苗mRNA构建体(例如，编码SEQ ID NO:95-106中的一者)或用KRAS突变型肽疫苗-STING免疫增强剂mRNA构建体(例如，编码SEQ ID NO:107-130中的一者)治疗。在第1天和第15天对小鼠进行肌肉内免疫(0.5mg/kg)，并在第22天处死小鼠。为了测试CD8疫苗应答，在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A；BD Biosciences)与突变型KRAS肽(G12D、G12V或G13D)或野生型KRAS肽(每种肽1μg/ml)存在下，在37℃下对CD8+脾细胞和PBMC进行4小时的离体再刺激。然后可以通过针对IFN-γ和/或TNF-α的细胞内染色(ICS)来评估CD8疫苗应答。与用KRAS突变型肽疫苗mRNA构建体治疗相比，用KRAS突变型肽疫苗-STING免疫增强剂mRNA构建体治疗的小鼠体内对IFN-γ和/或TNF-α的应答的ICS增强，表明STING免疫增强剂增强了KRAS特异性CD8疫苗应答。
实施例9：免疫增强剂mRNA构建体与激活致癌基因KRAS突变型肽mRNA构建体组合的用途
在该实施例中，将突变型KRAS肽mRNA构建体与单独的组成型活性STING免疫增强剂mRNA构建体组合使用，以增强对突变型KRAS肽的免疫应答。
KRAS是人癌症中最常见的突变致癌基因(约15％)。KRAS突变主要发生在一对“热点”中，并且激活致癌基因。先前的研究已经证实，产生对致癌突变有特异性的T细胞的能力有限。然而，该研究大部分是在最常见的HLA等位基因(A2，在高加索人中的出现率为约50％)的背景下完成的。最近已经证明：(a)特异性T细胞可以在较不常见的HLA等位基因(A11，C8)的背景下针对点突变产生，(b)离体培养这些细胞并将它们转移回患者体内已经在肺癌患者体内介导了显著的肿瘤应答。(N Engl J Med 2016；375:2255-2262，2016年12月8日，DOI:10.1056/NEJMoa1609279)。
如下表5中所示，在CRC(结肠直肠癌)中，只有3种突变(G12V、G12D和G13D)占该恶性肿瘤中的KRAS突变的96％。此外，所有CRC患者都针对KRAS突变分型，作为护理标准。
表5
*http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis？In＝KRAS
在另一个COSMIC数据集中，结肠直肠癌中73.68％的KRAS突变由这3种突变(G12V、G12D和G13D)引起(表6)。
表6
Prior等人研究并总结了分别针对HRAS、KRAS和NRAS的同种型特异性点突变特异性(Prior等人，Cancer Res.2012年5月15日；72(10):2457–2467)。从COSMIC v52发布中整理了表示具有每种点突变的肿瘤的总数的数据。报道了每种癌症类型的每种同种型的最常见突变(参见Prior等人的表2)。
此外，已经在EGFR阻断抗性患者体内鉴定出继发性KRAS突变。RAS位于EGFR下游，并且已经发现它构成了对EGFR阻断疗法的抗性的机制。可以使用本文所公开的组合物和方法来靶向EGFR阻断抗性KRAS突变型肿瘤。在少数病例中，在同一患者体内鉴定出多于一种KRAS突变(最多共同出现四种不同的突变)。Diaz等人报道了获得EGFR阻断之后的这些继发性KRAS突变(参见补充表2)，并且Misale等人则报道了EGFR阻断之后的继发性KRAS突变(参见图3b)(Diaz等人，The molecular evolution of acquired resistance to targetedEGFR blockade in colorectal cancers,Nature 486:537(2012)；Misale等人，Emergenceof KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectalcancer,Nature 486:532(2012))。该突变谱看起来与结肠直肠癌中的原发性肿瘤错义突变体至少有些不同。
如图18中所示，基于对cBioPortal中可用的数据的分析，NRAS在结肠直肠癌中也发生突变，但突变频率低于KRAS。
在该实施例中，向动物施用免疫调节治疗组合物，该组合物包含单独的编码至少一种激活致癌基因突变肽(例如，至少一种激活KRAS突变)的mRNA或与例如，编码以SEQ IDNO:1-10中任一者示出的序列的免疫增强剂mRNA构建体(例如，组成型活性STING mRNA构建体)组合，所述免疫增强剂mRNA构建体诸如编码包含V155M突变的组成型活性人STING蛋白的mRNA构建体，所述组成型活性人STING蛋白具有以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列并且编码以SEQ ID NO:199示出的核苷酸序列。
示例性KRAS突变型肽序列和mRNA构建体在表7至9中示出。
表7：KRAS突变型肽序列
表8：KRAS突变型氨基酸序列
表9：KRAS突变型抗原mRNA序列
化学：尿嘧啶修饰的N1-甲基假尿苷(m1Ψ)
帽：C1
尾：T100
5’UTR序列(标准5’侧接(包括生产性FP+T7位点+5'UTR))：TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(SEQID NO:21)
5’UTR序列(无启动子)：
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC
(SEQ ID NO:194)
3’UTR序列(无XbaI的人3'UTR)：TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(SEQ ID NO:22)
在检查STING免疫增强剂mRNA构建体对体内KRAS抗原应答的作用的第一项研究中，如下向HLA-A*2:01Tg小鼠(Taconic，9659F品系，n＝4)施用编码突变KRAS的mRNA：在第1天施用编码突变KRAS的mRNA(单独地或与STING组合)，在第8天采血，在第15天施用编码突变KRAS的mRNA(单独地或与STING组合)，在第22天处死动物。测试组在表10中如下示出：
表10
将mRNA以0.5mg/kg(每20-g动物10ug)的剂量施用于动物。以1:1的比率施用KRAS构建体和STING构建体。在GolgiPlug(布雷菲德菌素A)存在下，在37℃下测试离体再刺激(每种肽1ug/ml)4小时。测试KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G13D、KRAS G12WT、KRAS G13WT和无肽的细胞内细胞因子染色(ICS)。
测试单独的或与编码组成型活性STING的mRNA组合的编码KRAS突变的mRNA产生T细胞的能力。将编码KRAS突变的mRNA的功效与例如肽疫苗接种进行比较。通过将用单独的KRAS突变型肽治疗同用KRAS突变型肽与STING免疫增强剂的组合治疗进行比较，来确定STING免疫增强剂的作用。例如，如本文所述，可以通过针对IFN-γ和/或TNF-α的细胞内染色(ICS)来评估CD8疫苗应答。与用单独的KRAS突变型肽疫苗mRNA构建体治疗相比，用KRAS突变型肽疫苗与STING免疫增强剂mRNA构建体的组合治疗的小鼠体内对IFN-γ和/或TNF-α的应答的ICS增强，表明STING免疫增强剂增强了KRAS特异性CD8疫苗应答。
在检查STING免疫增强剂mRNA构建体对针对各种不同形式的突变型KRAS肽抗原mRNA构建体的免疫应答的作用的第二项研究中，如下向HLA*A*11:01Tg小鼠(Taconic，9660F品系，n＝4)施用编码各种不同形式的突变KRAS肽抗原mRNA构建体的mRNA与STING免疫增强剂mRNA构建体的组合：在第1天施用编码突变KRAS的mRNA与STING的组合，在第8天采血，在第15天施用编码突变KRAS的mRNA与STING的组合，在第22天处死动物。
测试的突变KRAS构建体的类型如下：(i)编码含有G12D、G12V、G13D或G12C突变的单个突变型KRAS 25聚体肽抗原的mRNA(“单一体(singlet)”)；(ii)编码每种含有G12D、G12V和G13D突变的三种25聚体肽抗原的多联体(从而产生75聚体)的mRNA(“KRAS-3MUT”)；(iii)编码每种含有G12D、G12V、G13D和G12C突变的四种25聚体肽抗原的多联体(从而产生100聚体)的mRNA(“KRAS-4MUT”)；或(iv)共同施用的四种单独的mRNA，每种编码含有G12D、G12V、G13D或G12C突变的单个突变型KRAS 25聚体肽抗原(“单一x 4”)。
G12D 25聚体的氨基酸序列和核苷酸序列分别以SEQ ID NO:98和185示出。G12V25聚体的氨基酸序列和核苷酸序列分别以SEQ ID NO:99和186示出。G13D 25聚体的氨基酸序列和核苷酸序列分别以SEQ ID NO:100和187示出。G12C 25聚体的氨基酸序列和核苷酸序列分别以SEQ ID NO:131和191示出。KRAS-3MUT 75聚体的氨基酸序列和核苷酸序列分别以SEQ ID NO:195和196示出。KRAS-4MUT 100聚体的氨基酸序列和核苷酸序列分别以SEQID NO:197和198示出。KRAS-4MUT 100聚体的另外的核苷酸序列以SEQ ID NO:1321和1322示出。
测试组在表11中如下示出：
表11
将mRNA以0.5mg/kg(每20-g动物10ug)的剂量施用于动物。以1:1的比率施用KRAS构建体和STING构建体。在GolgiPlug(布雷菲德菌素A)存在下，在37℃下测试离体再刺激(每种肽1ug/ml)4小时。测试KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G13D、G12C、KRAS G12WT、KRASG13WT和无肽的细胞内细胞因子染色(ICS)。
测试了编码KRAS突变的各种mRNA与编码组成型活性STING的mRNA的组合产生T细胞应答的能力，以允许比较STING免疫增强剂对各种不同KRAS构建体的作用。例如，如本文所述，可以通过IFN-γ和/或TNF-α的细胞内染色(ICS)来评估CD8疫苗应答。
实施例10：用HPV疫苗与STING免疫增强剂组合进行预防性或治疗性疫苗接种抑制肿瘤生长
在该实施例中，在用TC1肿瘤细胞攻击之前、攻击的同时或之后，用HPV疫苗与STING免疫增强剂的组合治疗小鼠。TC-1是本领域已知的表达HPV16 E7的鼠肿瘤模型(参见例如，Bartkowiak等人，(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112:E5290-5299)。本实施例中使用的HPV疫苗是编码细胞内形式或可溶性形式的HPV16抗原E6和E7(本文中分别称为iE6/E7和sE6/E7，如实施例5中所述)的mRNA构建体。如实施例5中所述，该实施例中使用的组成型活性STING免疫增强剂含有V155M突变。HPV疫苗构建体和免疫增强剂构建体在MC3脂质纳米粒子中共同配制。某些小鼠还用免疫检查点抑制剂(抗CTLA-4或抗PD-1)治疗。
在检查HPV+STING疫苗接种的预防活性的第一组实验中，将C57/B6小鼠如下进行治疗：在(i)第-7天和第-14天或(ii)第1天和第8天肌内注射0.5mg/kg HPV+STING疫苗(编码sE6/E7或iE6/E7)，之后在第1天皮下注射2x 105个TC1细胞。某些小鼠还在第6、9和12天用抗CTLA-4(克隆9H10)或抗PD-1(RMP1-14)治疗。以随时间推移的肿瘤体积报告的代表性结果在图19A至图19C中示出，其中，图19A和图19B示出了在第-14和-7天用sE6/E7(图19A)或iE6/E7(图19B)治疗的小鼠的数据，图19C则示出了在第1天和第8天用sE6/E7治疗的小鼠的数据。结果证明，与对照小鼠(用单独的对照mRNA构建体NTFIX或与免疫检查点抑制剂组合治疗)相比，用HPV+STING疫苗(单独的或与免疫检查点抑制剂组合)治疗的所有小鼠在数周内示出对肿瘤生长的完全抑制。因此，这些实验证明，用HPV疫苗连同STING免疫增强剂一起进行预防性疫苗接种(即，在肿瘤攻击之前或与肿瘤攻击同时)可有效地在体内阻止表达HPV的肿瘤细胞的生长。
在检查HPV+STING疫苗接种的治疗活性的第二组实验中，在第1天向C57/B6小鼠皮下施用2x 105个TC1细胞，然后在第8天和第15天通过肌内注射0.5mg/kg的HPV+STING疫苗(编码sE6/E7)进行治疗。某些小鼠还在第13、16和19天用抗CTLA-4(克隆9H10)或抗PD-1(RMP1-14)治疗。以随时间推移的肿瘤体积报告的代表性结果在图20A至图20I中示出。结果证明，相比于用单独的对照mRNA构建体NTFIX或与免疫检查点抑制剂组合治疗的对照小鼠(图20D至图20F)，或者用单独的sE6/E7构建体与对照DMXAA化合物(STING的化学激活剂)或与免疫检查点抑制剂组合治疗的对照小鼠(图20G至图20I)，用HPV+STING疫苗(单独地或与免疫检查点抑制剂组合)治疗的小鼠显示肿瘤消退(图20A至图20C)。因此，这些实验证明，用HPV疫苗连同STING免疫增强剂一起进行治疗性疫苗接种(即，在肿瘤攻击之后)可有效地在体内诱导表达HPV的肿瘤的消退。
在第三系列实验中，为了检查HPV-STING治疗性疫苗在较大的TC1肿瘤中的功效，向C57/B6小鼠皮下施用2x 105个TC1细胞，并允许肿瘤生长至200mm3或300mm3的体积，然后将其指定为第1天。接着在第1天和第8天通过肌内注射HPV+STING疫苗(编码sE6/E7)来治疗小鼠。治疗组和对应的剂量在表12中提供。
表12
结果在图21中示出，示出了在22天过程中的肿瘤体积(上面是200mm3肿瘤的图，下面是300mm3肿瘤的图)。结果证实，该HPV-STING治疗性疫苗表现出在体内抑制较大的表达HPV的肿瘤的功效。
实施例11：在mRNA疫苗设计中确定最佳的抗原:免疫增强剂质量比
在该实施例中，在以不同的Ag:免疫增强剂比率用感兴趣抗原(Ag)与免疫增强剂组合治疗的动物体内进行研究，然后检查T细胞对该抗原的应答，以确定增强对感兴趣抗原的免疫应答中的最佳Ag:免疫增强剂比率。
在第一组实验中，用编码三种25聚体突变型肽的ADR多联体的MC38疫苗与组成型活性STING免疫增强剂构建体的组合治疗小鼠，该疫苗含有如实施例6中所述的来源于Adpgk、Dpagt1和Reps1的肿瘤新表位(该疫苗在本文中也称为ADRvax)。如实施例5中所述，该实施例中使用的组成型活性STING免疫增强剂含有V155M突变。根据下表13中总结的研究设计，将ADRvax和STING构建体以不同的Ag:STING比率在SM102阳离子脂质纳米粒子(包含化合物25)中共同配制。
表13
在第1天和第15天对小鼠进行肌肉内给药。在第21天，在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A；BD Biosciences)与野生型或突变型MC38 ADR肽(每种肽1μg/ml，汇集)存在下，在37℃下对来自每个测试组的小鼠的CD8+脾细胞进行4小时的离体再刺激，然后通过细胞内染色(ICS)评估对IFN-γ或TNF-α的CD8疫苗应答。第21天的CD8+脾细胞对IFN-γ的MC38ADR特异性应答的代表性ICS结果在图22中示出，对TNF-α的所述特异性应答的代表性ICS结果在图23中示出。使用第21天的PBMC观察到相当的结果。此外，实验进行了54天，第54天脾细胞的结果与针对第21天脾细胞观察到的结果相当。此外，在用各个表位刺激后，还通过针对IFN-γ的ICS评估了对ADRvax内的三个单独表位中的每一个(即，肽Adpk1、Reps1和Dpagt1)的CD8疫苗应答。结果在图24A(对肽Adpk1)、图24B(对肽Reps1)和图24C(对肽Dpagt1)中示出。
结果证明，与对照相比，测试的所有Ag:STING比率(在从1:1至20:1范围内)均显示出STING的佐剂效应。对于作为整体的ADRvax抗原，发现最佳Ag:STING比率为5:1。对于ADRvax之内的各个肽表位，Adpgk1肽的最佳Ag:STING比率为5:1，而Reps1肽的最佳Ag:STING比率为10:1(在有或没有STING的情况下，对第三种肽Dpagt1的应答非常低，这与如本领域已知的它是非优势表位相符)。还发现STING增加了CD45+T细胞中的CD8+细胞的总百分比，同时观察到剂量响应(数据未示出)；并且发现STING增加了CD44hi CD8+细胞(效应/记忆亚群)中的CD62L细胞的总百分比，同时观察到剂量响应(数据未示出)。此外，从PBMC细胞获得的结果与脾细胞的结果一致(数据未示出)。因此，这些实验证实了STING能够充当增强针对ADRvax抗原的免疫应答的免疫增强剂，此外，还证明在确定对于治疗的最佳Ag:免疫增强剂比率时，发现除1:1之外的比率是最佳的(例如，比率5:1或10:1比1:1更有效)。结果还表明，最佳的Ag:免疫增强剂比率可以因所使用的特定的感兴趣抗原不同而异。
在第二组实验中，根据下表14中总结的研究设计，以不同的Ag:STING比率，用如实施例5中所述的编码细胞内E6/E7(iE6/E7)的HPV疫苗与组成型活性STING免疫增强剂构建体组合(在SM102阳离子脂质纳米粒子中共同配制)来治疗非人灵长类动物。
表14
在第一次给药(肌肉内施用)之后24小时未观察到临床发现，表明没有注射部位反应并且初始治疗被安全地接受。在第1天初始给药之后，动物有两周的恢复期，然后在第14天给予动物第二剂，之后是另外两周的恢复期。在第2、16和30天，通过临床病理学(临床化学、血液学和凝血)确定进一步的安全性分析。执行针对CD4和CD8细胞的IFN-γ的抗抗体和ELISpot分析或ICS，以评估在测试的不同比率下，STING对HPV疫苗的免疫应答的增强。
在第三组实验中，在小鼠体内以不同的比率将使用已知鼠表位的模型多联抗原与组成型活性STING免疫增强剂组合，来测试该模型多联抗原。本文称为CA-132的多联抗原包含20个已知的鼠表位，这些鼠表位被认为呈现在CB6小鼠的MHC I类和II类抗原上。这些表位来源于IEDB.org网站，该网站是来自文献的表位公共数据库。预期I类表位将在MHC I类分子上呈现并触发CD8+应答，而预期II类表位将在MHC II类分子上呈现并触发CD4+T细胞应答。CA-132抗原构建体编码I类表位和II类表位这两者，从而允许评估CD4和CD8这两种T细胞应答。此外，据信在多联抗原中包含II类表位(从而触发CD4应答)有助于诱导更强的CD8 T细胞应答。因此，设计CA-132抗原的方法也可以用于设计其他多联抗原构建体(例如，用于个性化癌症疫苗或用于细菌疫苗，如本文所述)。
将CA-132抗原构建体和STING免疫增强剂构建体在SM102阳离子脂质纳米粒子中共同配制，然后以下列剂量肌肉内施用于CB6小鼠：单独的CA-132，以1μg、3μg或10μg施用；单独的STING，以3μg施用；CA-132+STING，以每种3μg或每种1μg(1:1比率)施用；3μg的CA-132和1μg的STING(Ag:STING比率为3:1)；或1μg的CA-132和3μg的STING(Ag:STING比率为1:3)。通过针对IFN-γ的ELISpot分析检查对CA-132抗原构建体之内的I类表位的抗原特异性T细胞应答，其结果在图25中示出。结果证明，当与STING一起配制时，对I类表位的IFN-γ应答增加。通过用CA-132抗原之内的I类表位之一(表位CA-87)再刺激CD8+ T细胞，然后针对IFN-γ进行ELISpot分析证实了这些结果，其结果在图26中示出。这些结果证明，STING能够以1:1、3:1和1:3的Ag:STING比率免疫增强抗原特异性CD8+ T细胞应答。
在第四组实验中，在第1天和第14天以不同的Ag:STING比率用HPV16 E7疫苗(在实施例5中描述)与组成型活性STING免疫增强剂构建体组合来治疗C57/Bl6小鼠。根据下表15中总结的研究设计，将这些mRNA在脂质纳米粒子中共同配制，这些脂质纳米粒子中的化合物25:胆固醇:DSPC:PEG-DMG比率分别为50:38.5:10:1.5。
表15
在第21天处死小鼠，并通过如本文所述的ICS评估CD8+ T细胞的IFN-γ表达。结果在图27中示出，证明STING mRNA构建体在Ag:STING比率为1:1、5:1和10:1时具有很强的免疫增强作用。
总而言之，这些研究证实了STING免疫增强剂构建体能够增强对感兴趣抗原的免疫应答，并且证明了对于治疗的最佳Ag:STING比率的确定。
实施例12：STING在非人灵长类动物中的免疫增强作用
在该实施例中，用编码HPV疫苗的mRNA与STING免疫增强剂的组合治疗非人灵长类动物(食蟹猴)，之后评估抗原特异性T细胞应答和抗体应答。在该实施例中使用的HPV疫苗构建体描述于实施例5中。如实施例5中所述，该实施例中使用的组成型活性STING免疫增强剂构建体含有V155M突变。HPV疫苗构建体和免疫增强剂mRNA构建体在脂质纳米粒子中共同配制，这些脂质纳米粒子中的化合物25:胆固醇:DSPC:PEG-DMG比率分别为50:38.5:10:1.5。测试了不同的STING:Ag比率。用仅编码HPV抗原的mRNA或仅编码STING免疫增强剂的mRNA处理对照动物。
根据下表16中所示的研究设计治疗15只2至5岁、体重2至5kg的雄性食蟹猴。
表16
在第-7天收集PBMC的给药前样品，之后在第1天和第15天用mRNA LNP肌肉内治疗这些动物。在第29天收集PBMC的给药后样品。在研究期间未发现毒性和其他主要的临床观察结果，表明mRNA LNP具有良好的耐受性。
为了检查STING免疫增强剂增强抗原特异性CD8+ T细胞应答的能力，进行了针对TNFα和IL-2的细胞内细胞因子染色(ICS)。在37℃下，用HPV16 E6肽汇集物或HPV16 E7肽汇集物离体刺激PBMC6小时。将用PMA/离子霉素刺激用作阳性对照，并且将仅用培养基刺激用作阴性对照。
对TNFα的ICS的代表性结果在图28A至图28C中示出，其中图28A示出了用E6肽汇集物离体刺激的结果，图28B示出了用E7肽汇集物离体刺激的结果，图28C则示出了用培养基对照离体刺激的结果。在仅用抗原免疫(组1)的给药前组与给药后组之间未观察到TNFα+CD8 T细胞频率增加。仅用STING治疗进行免疫(第2组)对TNFα+CD8 T细胞频率具有边际效果(marginal effect)。相比之下，用STING+Ag免疫的组(第3、4、5组)示出抗原特异性TNFα+CD8 T细胞显著增加。此外，当与第1组对照和第2组对照相比时，用STING:Ag(1:10比率)的“匹配”抗原剂量免疫的第5组示出抗原特异性TNFα+CD8 T细胞显著增加。
对IL-2的ICS的代表性结果在图29A至图29C中示出，其中图29A示出了用E6肽汇集物离体刺激的结果，图29B示出了用E7肽汇集物离体刺激的结果，图29C则示出了用培养基对照离体刺激的结果。在所有免疫动物(组1至5)中都观察到给药前与给药后之间IL-2+CD8T细胞频率的适度增加。然而，在用1:1和1:5的STING:Ag比率治疗的组(第3组和第4组)中IL-2+CD8 T细胞的增加是最可检测的，而用1:10的STING:Ag比率治疗的动物与对照相比，未表现出IL-2+CD8 T细胞增加。IL-2增加与T细胞亚群在活性T细胞应答期间分泌IL-2的已知能力相符。
为了检查NHP中的STING:Ag治疗对抗原特异性抗体应答的作用，进行了E6特异性和E7特异性ELISA。用重组E6(Prospec；#HPV-005His HPV16 E6)或重组E7(ProteinX；#2003207His HPV16E7)涂布多块板。将来自Alpha Diagnostics International的小鼠抗E6单克隆抗体(#HPV16E6 1-M)用作阳性对照。将来自Fisher/Life Technologies的小鼠抗E7单克隆抗体(#280006-EA)用作阳性对照。将来自Jackson ImmunoResearch的抗小鼠IgG-HRP抗体(#715-035-150)用作阳性对照的二抗。将来自Abcam的抗猴IgG-HRP(#ab112767)用作NHP血清的二抗。
在4℃下用重组E6或E7(500ng/孔；100μl/孔)涂布多块板，然后在室温下用TBSSuperBlock封闭1小时。添加一抗(100μl/孔)并在室温下温育1小时。连续稀释阳性对照抗体。以1:5000稀释NHP血清。洗涤之后，添加二抗(100μl/孔)并在室温下温育1小时。以1:5000稀释阳性对照抗小鼠IgG-HRP。对于NHP血清，以1:30,000稀释抗猴IgG-HRP。显色5分钟(抗E6)或10分钟(抗E7)，然后中止显色并在450nm处读数。
抗HPV16 E6 IgG的代表性结果在图30中示出。抗HPV16 E7 IgG的代表性结果在图31中示出。抗E6和抗E7这两者的结果都证明，用STING:Ag(特别是以1:5和1:10的比率)治疗动物引起抗原特异性抗体应答增强。
因此，非人灵长类动物研究的本文所述结果证实，STING在体内免疫增强了抗原特异性T细胞和针对mRNA疫苗抗原的抗体应答。
实施例13：各种KRAS-STING疫苗形式在HLA*A11转基因小鼠体内的免疫原性
在该实施例中，为了检查STING免疫增强剂mRNA构建体对针对各种不同形式的突变型KRAS肽抗原mRNA构建体的免疫应答的作用，如下向HLA*A*11:01Tg小鼠(Taconic，9660F品系，n＝3)施用编码各种不同形式的突变KRAS肽抗原mRNA构建体的mRNA与STING免疫增强剂mRNA构建体的组合：在第0天和第14天施用编码突变KRAS的mRNA与STING的组合，在第21天处死动物。小鼠在第0天为6至9周龄。将mRNA以0.5mg/kg(每20g动物10ug)的剂量施用于动物。以5:1的比率(Ag:STING)施用KRAS构建体和STING构建体。将这些mRNA构建体在SM102阳离子脂质纳米粒子(包含化合物25)中共同配制。
测试的突变KRAS构建体的类型如下：(i)编码含有G12D、G12V、G13D或G12C突变的单个突变型KRAS 25聚体肽抗原的mRNA(“单体”)；(ii)编码每种含有G12D、G12V和G13D突变的三种25聚体肽抗原的多联体(从而产生75聚体)的mRNA(“KRAS-3MUT多联体”)；(iii)编码每种含有G12D、G12V、G13D和G12C突变的四种25聚体肽抗原的多联体(从而产生100聚体)的mRNA(“KRAS-4MUT多联体”)；或(iv)共同施用的四种单独的mRNA，每种编码含有G12D、G12V、G13D或G12C突变的单个突变型KRAS 25聚体肽抗原(“合并的单体”)。这些构建体的氨基酸序列和核苷酸序列如实施例9中所述。还测试了A11-病毒表位多联体抗原与STING或对照mRNA(NTFIX)的组合(“经验证的A11 Ag”)。
测试组在表17中如下示出：
表17
在用于评估针对KRAS抗原的抗原特异性CD8+ T细胞应答的第一组实验中，在GolgiPlug(布雷菲德菌素A)存在下，在37℃下用KRAS单体肽(每种肽2ug/ml)对来自小鼠的第21天脾细胞进行5小时的离体再刺激。对KRAS G12D(aa*7/8-16)、KRAS G12V(aa*7/8-16)、KRAS G13D(aa*7/8-16)、G12C(aa*7/8-16)、KRAS WT(aa*7/8-16)和无肽进行细胞内细胞因子染色(ICS)(IFN-γ)。
KRAS-G12V特异性应答的ICS结果在图32中示出。KRAS-G12D特异性应答的ICS结果在图33中示出。这些结果证明，在用对应的KRAS-STING疫苗(单体或多联体)免疫、然后用同源肽再刺激的小鼠体内检测到抗KRAS-G12V和抗KRAS-G12D特异性CD8+ T细胞。当KRAS突变作为单体或作为多联体施用于小鼠时，观察到相当的IFN-γ阳性CD8+ T细胞％。使用G12V时观察到的应答强于使用G12D时观察到的应答。在该实验中，未观察到抗KRAS G12C应答和抗KRAS G13D应答(数据未示出)。
在用于评估抗原特异性CD8+ T细胞对KRAS抗原的应答的第二组实验中，将来自小鼠的第21天脾细胞与已经用对应的KRAS肽(G12V、G12D或WT对照)冲击的表达HLA*A11的靶细胞(Cos7-A11细胞)共培养，之后进行ICS(IFN-γ)。KRAS-G12V特异性应答的Cos7-A11共培养结果在图34中示出。KRAS-G12D特异性应答的Cos7-A11共培养结果在图35中示出。这些结果证明，在用对应的KRAS-STING疫苗(单体或多联体)免疫、然后用以G12V或G12D冲击的A11+表达细胞系再刺激的小鼠体内检测到抗KRAS-G12V和抗KRAS-G12D特异性CD8+ T细胞应答。因此，这第二组实验中关于检测针对KRAS抗原的抗原特异性CD8+ T细胞应答的结果与来自使用同源肽进行再刺激的第一组实验的结果非常相似。
最后，使用来自用A11-病毒表位多联体免疫的小鼠的第21天脾细胞评估STING增强对已知A*11限制性病毒表位的抗原特异性应答的能力。8个病毒表位(EBV BRLF1、FLU、HIV NEF、EBV、HBV核心抗原、HCV、CMV和BCL-2L1)(每个含有25个氨基酸)形成多联体并且由mRNA编码，从而与STING组合用作A11转基因小鼠体内的抗原(表17中的治疗组9)。A11-病毒表位多联体还与NTFIX对照mRNA共同施用(表17中的治疗组10)。这八个表位中的五个(EBVBRLF1、FLU、HIV NEF、EBV、HBV核心抗原)是经验证的A11结合物，具有相对低的预测IC50；其他三个表位(HCV、CMV和BCL-2L1)对A11具有更温和的预测亲和力，但尚未通过实验验证。这些病毒表位的氨基酸序列以及它们的IC50在下表18中示出。
表18
用各个A*11病毒表位离体再刺激第21天的脾细胞，之后进行ICS(IFN-γ和TNF-α)，以检测抗原特异性CD8+ T细胞应答。这八个病毒表位中的四个(EBV、EBV BRLF1、FLU和HIV NEF)观察到抗原特异性CD8+ T细胞应答，并且如图36中所示，STING增强了对这些病毒表位中的三个(EBV、EBV BRLF1和FLU)的T细胞应答。
因此，本文描述的HLA*A11转基因小鼠的结果证明，STING免疫增强了抗原特异性T细胞抗KRAS应答，以及对其他A11限制性病毒抗原的抗病毒应答，并且能够免疫增强对各种形式(单体和多联体)的疫苗抗原的应答。
实施例14：通过激活1型干扰素和NFκB重构STING的免疫增强作用
在该实施例中，使用HPV疫苗小鼠模型系统来比较STING的免疫增强作用与激活1型干扰素(组成型活性IRF3和IRF7)或激活NFκB(组成型活性IKKβ)的免疫增强剂的免疫增强作用。该STING mRNA构建体(V155M突变)在实施例1中描述。组成型活性IRF3和IRF7mRNA构建体在实施例2中描述。组成型活性IKKβ构建体在实施例3中描述。该HPV疫苗小鼠模型系统在实施例5中描述。用HPV疫苗与以下任一项组合来免疫小鼠：(i)对照构建体(NTFIX)、(ii)STING构建体、(iii)IRF3/IRF7构建体，或(iv)IRF3/IRF7/IKKβ构建体。
在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A；BD Biosciences)与E7单肽(3个单独的肽)或E7肽汇集物存在下，在37℃下对来自每个测试组的小鼠的第21天脾细胞进行4小时的离体再刺激，如实施例5中所述。通过针对IFN-γ或TNF-α的细胞内染色(ICS)来评估CD8疫苗应答。第21天脾细胞对IFN-γ和TNF-α的E7特异性应答的代表性ICS结果在图37A(IFN-γ)和图37B(TNF-α)中示出。实验进行了50天，第50天脾细胞的结果与第21天观察到的结果相当。结果证明，组成型活性IRF3+组成型活性IRF7+组成型活性IKKβ的组合重现了STING介导的佐剂表型。因此，这些结果证明，STING的免疫增强效力可以通过使用激活1型干扰素和NFkB的构建体来重构。
实施例15：通过调控细胞内途径而实现免疫增强作用
在该实施例中，将STING的免疫增强作用与调控细胞内途径的免疫增强剂的免疫增强作用进行比较。测试了编码TAK1、TRAM或MyD88的免疫增强剂mRNA构建体，其中每一种都是在TLR下游起作用的细胞内信号传导蛋白。该组成型活性STING构建体(V155M)在实施例1中描述。由TAK1构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:164(由以SEQ ID NO:1411和1482示出的示例性核苷酸序列编码)示出。由TRAM构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:136(由以SEQ ID NO:1410和1481示出的示例性核苷酸序列编码)示出。由MyD88构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:134(由以SEQ ID NO:1409和1480示出的示例性核苷酸序列编码)和SEQ ID NO:135示出。用编码卵清蛋白作为测试抗原的mRNA与编码以下任一项的mRNA构建体组合来免疫小鼠：(i)STING、(ii)TAK1、(iii)TRAM或(iv)MyD88。将OVA抗原mRNA构建体和免疫增强剂mRNA构建体在脂质纳米粒子中共同配制，这些脂质纳米粒子中的化合物25:胆固醇:DSPC:PEG-DMG比率分别为50:38.5:10:1.5。在第1天和第15天以0.5mg/kg对小鼠进行肌肉内免疫。
在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A；BD Biosciences)与OVA肽(MHC I类)存在下，在37℃下对来自每个测试组的小鼠的第25天脾细胞进行4小时的离体再刺激。通过针对IFN-γ、TNF-α或IL-2的细胞内染色(ICS)来评估CD8疫苗应答。第25天脾细胞对IFN-γ、TNF-α和IL-2的OVA特异性应答的代表性ICS结果在图38A(IFN-γ)、图38B(TNF-α)和图38C(IL-2)中示出。实验进行了50天，第50天脾细胞的结果与第25天观察到的结果相当。结果证明，TAK1、TRAM和MyD88这三种构建体显示出与STING类似的免疫增强活性。因此，这些结果证明，通过使用编码此类细胞内途径的组分(特别是在TLR的下游起作用的组分)的mRNA构建体调控细胞内途径，可以增强免疫应答。
实施例16：通过衔接蛋白并通过诱导炎性体或坏死体而实现免疫增强作用
在该实施例中，使用卵清蛋白作为测试抗原(如实施例15中所述)比较一组mRNA构建体在小鼠体内的免疫增强能力。这组mRNA构建体编码衔接蛋白STING或MAVS(线粒体抗病毒信号传导蛋白)、组成型活性IKKβ(其激活NFκB)、半胱天冬酶1/4(参与诱导炎性体)或MLKL(参与诱导坏死体)。该组成型活性STING构建体(V155M)在实施例1中描述。该组成型活性IKKβ构建体在实施例3中描述，并且编码以SEQ ID NO:152(由以SEQ ID NO:153和1397示出的示例性核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列。由MAVS构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:1387(由以SEQ ID NO:1413和1484示出的示例性核苷酸序列编码)示出。由MLKL构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:1327(由以SEQ ID NO:1412和1483示出的示例性核苷酸序列编码)和1328示出。由半胱天冬酶-1构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:175-178(由以SEQ ID NO:1395和1467示出的示例性核苷酸序列编码)示出。由半胱天冬酶-4构建体编码的代表性氨基酸序列以SEQ ID NO:1352-1356(由以SEQ IDNO:1396和1468示出的示例性核苷酸序列编码)示出。用编码卵清蛋白作为测试抗原的mRNA与编码以下任一项的mRNA构建体组合来免疫小鼠：(i)STING；(ii)MAVS；(iii)IKKβ；(iv)半胱天冬酶1/4+IKKβ；(v)MLKL；或(vi)MLKL+STING。使用NTFIX构建体和DMXAA(STING依赖性先天免疫途径的化学激活剂)作为对照。将OVA抗原mRNA构建体和免疫增强剂mRNA构建体在脂质纳米粒子中共同配制，这些脂质纳米粒子中的化合物25:胆固醇:DSPC:PEG-DMG比率分别为50:38.5:10:1.5。在第1天和第15天以0.5mg/kg对小鼠进行肌肉内免疫。
在GolgiPlugTM(含有布雷菲德菌素A；BD Biosciences)与OVA肽(MHC I类)存在下，在37℃下对来自每个测试组的小鼠的脾细胞进行4小时的离体再刺激。通过针对IFN-γ的细胞内染色(ICS)评估抗原特异性CD8应答。第21天脾细胞对IFN-γ的OVA特异性应答的代表性ICS结果在图39中示出。第50天脾细胞对IFN-γ的OVA特异性应答的代表性ICS结果在图40中示出。结果证明，衔接化合物(STING和MAVS)、诱导炎性体(通过半胱天冬酶1/4+IKKβ)或诱导坏死体(通过MLKL)全都导致抗原特异性CD8应答的免疫增强。此外，与单独的MLKL相比，MLKL和STING的组合表现出增强的活性。此外，第50天的结果证明免疫增强作用是持久的。这些结果证明，可以通过衔接蛋白、通过诱导炎性体或通过诱导坏死体来增强免疫应答。
实施例17：比较组成型活性STING构建体
在该实施例中，用与不同的组成型活性STING突变型mRNA构建体共同配制或共同施用的编码OVA抗原的mRNA构建体来免疫C57/Bl6小鼠。测试的组成型活性STING构建体为：(i)p23(V155M)；(ii)p57(R284M/V147L/N154S/V155M)；(iii)p56(V147L/N154S/V155M)；和(iv)p19(R284M)。测试了与OVA抗原构建体共同配制的所有构建体。还测试了与OVA抗原构建体共同施用但分开配制的p23构建体。在第1天和第14天对小鼠进行免疫。
在第21天处死小鼠，并通过如本文所述的ICS评估CD8+ T细胞的IFN-γ表达。结果在图41A中示出，证明所测试的所有组成型活性STING突变型构建体均表现出能够在体内免疫增强抗原特异性CD8+ T细胞对OVA抗原的应答(与NTFIX对照相比)。此外，当p23构建体与OVA抗原构建体共同配制时以及当它与OVA抗原构建体共同施用但分开配制时，p23构建体都免疫增强抗原特异性CD8+ T细胞应答。此外，在第90天处死小鼠，并通过如本文所述的ICS评估CD8+ T细胞的IFN-γ表达。结果在图41B中示出，证明这些组成型活性STING突变型构建体的免疫增强作用是持久的。
实施例18：CD4 T细胞和CD8 T细胞在STING介导的免疫增强中的作用
在该实施例中，使用CD4耗尽或CD8耗尽的小鼠来评估CD4+ T细胞或CD8+ T细胞在STING介导的免疫增强中的作用。在第一系列实验中，为了耗尽CD4细胞，在实验的第-3、-1、11和13天给小鼠腹膜内注射抗CD4 mAb GK1.5。流式细胞术证实了消耗效率。在第1天和第15天用与STING构建体(V155M)共同配制的HPV16E6/E7抗原疫苗以0.5mg/kg的剂量对小鼠进行肌肉内疫苗接种。该疫苗和STING mRNA构建体以1:1的比率在脂质纳米粒子中共同配制，这些脂质纳米粒子中的化合物25:胆固醇:DSPC:PEG-DMG比率分别为50:38.5:10:1.5。
在第21天和第50天处死小鼠，并通过如本文所述的ICS评估CD8+ T细胞的IFN-γ表达。结果在图42A(第21天)和图42B(第50天)中示出。如通过ICS评估的，针对CD8+ T细胞的TNF-α表达观察到类似的结果(数据未示出)。结果证明，STING介导的佐剂效应在很大程度上不依赖于CD4+ T细胞的帮助。
在第二系列实验中，使用实施例10中描述的TC1模型检查CD4T细胞和CD8 T细胞在HPV-STING疫苗对肿瘤细胞生长的作用中所起的作用。将TC1 HPV细胞(2x 105个细胞)皮下植入到C57/B6小鼠中，并使肿瘤生长至100mm3体积大小，此称为第1天。在第1天和第8天，用与STING构建体(V155M)共同配制(sE6/E7和STING的比率为1:1)的HPV16 E6/E7可溶性抗原疫苗以10μg剂量对小鼠进行肌肉内施用。对照小鼠仅用PBS处理。此外，在第1、4、7、10天，然后每周两次直到研究结束，用抗CD4(GK1.5 mAb)或抗CD8(2.43mAb)治疗小鼠，以分别消耗CD4 T细胞或CD8细胞。对照小鼠未用耗尽的抗体治疗。治疗组和对应的剂量在表19中提供。
表19
结果在图43中示出，示出了在22天过程中的肿瘤体积。结果证明，消耗CD4+ T细胞不会显著影响HPV-STING疫苗的抗肿瘤功效，而消耗CD8+ T细胞确实影响了HPV-STING疫苗的抗肿瘤功效，从而证明该疫苗的这种功效取决于CD8+ T细胞，但不取决于CD4+ T细胞。
实施例19：STING使CD8细胞偏向效应记忆表型
在该实施例中，为了进一步证实实施例5和6中报道的关于CD62Llo效应记忆细胞的结果，进行了另外的实验，其中用与各种浓度的STING免疫增强剂mRNA构建体共同配制的各种浓度的MC38疫苗免疫C57/Bl6小鼠。所使用的Ag和STING的量/比率与如实施例11的表15中所列出的相同。在第1天和第14天对小鼠进行免疫。在第21天和第54天，检查CD62Llo效应记忆细胞在CD44hiCD8+细胞中的百分比。结果在图44A(第21天)和图44B(第54天)中示出。结果证明，STING免疫增强剂mRNA构建体使CD8细胞群偏向效应记忆表型(CD62Llo细胞)。
实施例20：STING在多种不同的抗原:STING比率下免疫增强对多联疫苗的应答
在该实施例中，研究了免疫增强剂(诸如组成型活性STING)是否可以提高对多联疫苗的T细胞应答。将编码CA-132多联体(描述于实施例11中)的mRNA构建体(其编码I类和II类表位)用作疫苗，并且研究了mRNA STING构建体对T细胞对I类和II类表位的应答的作用。CA-132和STING mRNA共同配制并同时递送，或者不共同配制，且延迟递送STING mRNA。在第1天给予动物初免剂量，然后在第15天给予加强剂量。在第21天采集脾细胞。
测试了不同的材料，以便：确定当以各种比率将STING添加到多联疫苗时的免疫原性；将STING与排名靠前的市售佐剂进行比较；确定免疫原性是否取决于STING的给药时间；以及检查未配制的mRNA在与STING一起给药时的免疫原性。测试了以下材料/条件：CA-132(3μg)、CA-132(3μg)与Poly I:C(10μg)、CA-132(3μg)与MPLA(5μg)、STING(1μg)/CA-132(3μg)、STING(0.6μg)/CA-132(3μg)、STING(0.6μg)/CA-57(3μg)、STING(0.6μg)/CA-132(3μg)(24小时后)、STING(0.6μg)/CA-132(3μg)(48小时后)、STING(0.6μg)/CA-132(3μg)(未配制)和STING(6μg)/CA-132(30μg)(未配制)。CA-57是5个II类表位(所有这些表位都包含在CA-132之内)的多联体。
结果在图45至图47中示出。当用II类表位检查抗原特异性IFN-γ应答时，发现STING提高了对mRNA编码的MHC II类表位的免疫应答。STING的表现与市售佐剂(剂量差异为5至10倍)相当。尽管测试的两种比率均有效，但1:5的STING:抗原比率表现优于1:3组合(图45)。使用如上所述并在图46中示出的I类表位获得了类似的结果。同样，发现对于I类表位，1:5的STING:抗原比率表现优于1:3组合。
此外，发现在稍后的时间点(24小时)给予STING产生了与共同递送类似的免疫原性增加(图47)。
在另外的实验中，使用52个鼠表位检查了不同STING:抗原比率的作用。小鼠在第1天接受初免剂量，在第8天接受加强剂量，然后在第15天采集脾细胞。使用ELISpot和FACS评估T细胞对再刺激的应答。在体外再刺激T细胞是使用对应于在该多联体内编码的表位的肽序列进行的。检查了对两种II类表位肽(CA-82和CA-83)和四种I类表位肽(CA-87、CA-93、CA-113和CA-90)的T细胞应答。
相当令人惊讶的是，发现与单独的抗原相比，以所测试的大多数比率添加STING改善了T细胞应答，并且从未有比单独的抗原更差的表现。应答的广度出乎意料。对于所测试的六种抗原(表位)中的四种，以10至30ug总剂量向抗原添加STING始终产生比单独的50ug剂量抗原更高的T细胞应答。因此，STING:抗原的比率存在宽的钟形曲线，从而提高免疫原性。
研究组在表20中如下示出。
表20
在II类表位中，CA-82(图48中所示的结果)和CA-83(图49中所示的结果)示出，以小于1:1(STING:抗原)的比率添加STING相对于仅有抗原的组(包括剂量最高达50μg的单独的抗原)增大了T细胞应答。图49中左图示出，以所有比率添加STING相对于仅有抗原的组增大了T细胞应答。
使用I类表位观察到类似的结果。CA-87(图50中所示的结果)、CA-93(图51中所示的结果)、CA-113(图52中所示的结果)和CA-90(图53中所示的结果)均示出，当与总mRNA剂量相比时，STING:抗原的比率相对于仅有抗原的组产生更高的T细胞应答。
实施例21：STING介导的免疫增强的成倍增加
在该实施例中，为了检查由STING介导的对多种抗原的免疫增强的大小，用STING与各种抗原的组合治疗小鼠。在第一系列实验中，用STING与下列先前描述的抗原之一的组合治疗小鼠：(i)HPV16E7(细胞内)；(ii)HPV16 E7(可溶性)；(iii)MC38 ADR新抗原(细胞内)；或(iv)OVA(可溶性)。将2.5μg HPV16 E7抗原或5μg MC38 ADR新抗原与5μg STING一起施用。将HPV16 E7与E6共同配制，导致对于HPV和ADR这两种抗原，抗原:STING比率都为1:1。在第21天和第50+天，采集脾细胞，并通过如本文所述的细胞内染色(ICS)评估表达IFN-γ的T细胞。将结果计算为免疫应答增加的倍数，并总结在下面的表21(第21天的结果)和表22(第50+天的结果)中。
表21
表22
*＝第35天
在第二系列实验中，用STING与实施例20中所述的CA-132多联体疫苗的组合治疗小鼠，并通过针对IFN-γ表达的ELISpot分析来评估抗原特异性T细胞对该多联体疫苗内的各种表位的应答。将结果计算为免疫应答增加的倍数，并总结在下表23中
表23
| 表位 | 增加的倍数的范围 |
| CA-82 | 0.3-318 |
| CA-83 | 1.7-78 |
| CA-87 | 0.7-974 |
| CA-93 | 1.3-1148 |
| CA-113 | 1.5-725 |
结果证明，虽然STING介导的免疫应答性增加的倍数根据抗原而变化，但相对于单独的抗原(即，抗原+NTFIX mRNA)，对于大多数测试的抗原，STING诱导免疫应答性至少增加2倍，并且对于某些抗原表现出甚至更大的免疫应答性增强(例如，增强超过5倍、超过10倍、超过20倍、超过30倍、超过50倍或超过75倍)。
实施例22：MLKL mmRNA构建体诱导细胞死亡
在该实施例中，制备了编码人或小鼠MLKL的氨基酸残基1-180的一系列mmRNA构建体，并测试了它们诱导细胞死亡的能力。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。在某些构建体中，该3’UTR包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点。无任何表位标签的人和小鼠MLKL 1-180构建体的开放阅读框(ORF)的氨基酸序列分别以SEQ ID NO:1327和1328示出。编码SEQ ID NO:1327的MLKL蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1412和1483示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ IDNO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定MLKL 1-180构建体是否可以诱导细胞死亡，将这些构建体转染到Hep3B人肝细胞瘤细胞中。以20,000个细胞/孔的密度将HeLa细胞接种在96孔板中，然后使用Lipofectamine 2000将mmRNA构建体转染到这些细胞中。24小时之后，使用发光细胞活力测定(Promega)测量细胞死亡。结果在图54中示出，证明MLKL 1-180mmRNA构建体能够诱导HeLa细胞的细胞死亡。
这些结果通过在(Life Technologies)存在下用MLKL 1-180mmRNA构建体和Hep3B细胞进行类似的实验来证实，其中是一种优先被死细胞吸收的DNA染料，用于测量细胞死亡的程度。使用读出系统进行测定细胞活力的实验，其结果在图55中示出，证实MLKL 1-180mmRNA构建体能够诱导Hep3B肝细胞瘤细胞的细胞死亡。
实施例23：MLKL mmRNA构建体导致坏死性凋亡
在该实施例中，检查了MLKL 1-180mmRNA构建体引起坏死性凋亡的能力。坏死性凋亡的特征在于质膜破裂和胞质溶胶内容物渗漏到周围区域中。这可以在体外测定中通过检测渗漏到培养基中的损伤相关分子模式(DAMP)来进行测试。
在第一系列实验中，将MLKL 1-180mmRNA构建体转染到HeLa细胞中(如实施例22中所述)，并且测量ATP(一种DAMP)的释放作为坏死性凋亡的指标。使用ATP测定(Promega)检测ATP的释放。结果在图56中示出，证明MLKL 1-180mmRNA构建体诱导细胞释放ATP，从而表明这些构建体导致坏死性凋亡。
为了证实正在发生坏死性凋亡，进行了第二系列实验，其中将MLKL 1-180mmRNA构建体转染到HeLa细胞中，并且测量HMGB1(另一种DAMP)的释放作为坏死性凋亡的指标。使用HMGB1 ELISA测定检测HMGB1的释放。对于这组实验，用含有mRNA构建体(200ng/孔；1μl体积)、Lipofectamine(0.2μl/孔体积)和Opti-MEM(18.8μl/孔体积)的转染混合物(20μl)转染HeLa细胞(2x104个细胞/100μl/孔)。在转染这些细胞之前，将转染混合物在室温下温育20分钟，然后将转染混合物加到细胞之上。轻轻敲打培养板，并然后在37℃和5％CO2下温育0、1、3和6小时。在这些时间点中的每一个时间点，取出110μl上清液，合并后以1000rpm离心旋转。每次转染取50μl上清液用于标准HMGB1 ELISA。结果在图57中示出，证明MLKL 1-180mmRNA构建体诱导细胞释放HMGB1，从而表明这些构建体导致坏死性凋亡。
第三系列实验检查了用MLKL 1-180mmRNA构建体治疗对细胞表面表达钙网蛋白(CRT)的影响，其中钙网蛋白是一种DAMP分子，其通常位于内质网腔内，但在诱导坏死性凋亡之后易位至垂死细胞的表面，在那里介导巨噬细胞和树突状细胞的吞噬作用。将细胞用空白对照转染、用细胞凋亡诱导构建体(“PUMA”)转染或用MLKL 1-180mmRNA构建体(huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p)转染，然后通过用于表达钙网蛋白的标准方法对细胞表面染色。结果在图58中示出，证明诱导CRT易位至细胞表面的是MLKL构建体，而不是细胞凋亡诱导构建体，从而进一步证实MLKL构建体引起坏死性凋亡。
第四系列实验检查了抑制剂necrosulfonamide(NSA)对MLKL诱导的细胞死亡的影响。NSA是一种特异性靶向MLKL的抑制剂。NSA被证实以浓度依赖性方式(使用作为读出测得；数据未示出)抑制由MLKL构建体诱导的细胞死亡，从而证实观察到的细胞死亡是由MLKL诱导的坏死性细胞死亡。
实施例24：RIPK3和GSDMD mmRNA构建体诱导细胞死亡
在该实施例中，制备了编码RIP3K或GSDMD的一系列mmRNA构建体，并测试了它们诱导细胞死亡的能力。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。无任何表位标签的RIP3K构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1329-1344示出。编码SEQ ID NO:1339的RIPK3蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1415和1486示出。无任何表位标签的GSDMD构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1367-1372示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定RIPK3或GSDMD构建体是否可以诱导细胞死亡，将这些构建体转染到下述三种不同的细胞类型中：HeLa细胞、B16F10细胞和MC38细胞。以5,000个细胞/孔的密度将细胞接种在96孔板中，然后使用Lipofectamine 2000将mmRNA构建体转染到这些细胞中。24小时之后，使用发光细胞活力测定(Promega)测量细胞死亡。结果在图59A(HeLa细胞)、图59B(B16F10细胞)和图59C(MC38细胞)中示出，还示出了MLKL(1-180)构建体的数据用于比较目的。结果证明，RIPK3 mmRNA构建体能够在所有三种细胞类型中诱导细胞死亡，其效力与针对MLKL(1-180)构建体观察到的效力相当。结果进一步证明，GSDMD构建体还能够在所有三种细胞类型中诱导细胞死亡，尽管其效力小于针对MLKL(1-180)构建体观察到的效力。针对进行的实验，使用读出系统观察到类似的结果。
制备了一系列被设计用于寡聚化的另外的RIPK3构建体。这些构建体含有蛋白质结构域(IZ三聚体或亮氨酸拉链手性结构域(EE和RR))，这些蛋白质结构域引起蛋白质的三聚化和寡聚化。诱导RIPK3的二聚体或三聚体形成引起更高分子量的寡聚体形成并诱导坏死性凋亡(参见Yatim等人，Science,2015和Orozco等人，Cell Death Differ,2014，以供参考)。测试这些构建体通过转染到NIH3T3细胞中诱导细胞死亡的能力。在转染后15小时使用读出系统测量细胞死亡。结果在图60和表24中示出，证明将RIPK3构建体多聚化诱导NIH3T3细胞死亡。
表24
检查了多聚化RIPK3构建体诱导DAMP释放的能力，作为这些构建体诱导坏死性凋亡的指标。用实施例23中所示的多聚化RIPK3构建体(RIPK3-IZ三聚体)、细胞凋亡诱导构建体(PUMA)、MLKL1-180构建体(huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p)转染B16F10细胞，以诱导DAMP释放，或者用GFP对照构建体转染。使用HMGB1ELISA测定检测HMGB1的释放。结果在图61中示出，证明使RIPK3构建体多聚化以与MLKL构建体相似的水平诱导HMGB1的释放。
另一系列实验检查了抑制剂GSK’872对RIPK3诱导的细胞死亡的影响。GSK’872是一种特异性靶向RIPK3的抑制剂。GSK’872被证实以浓度依赖性方式(使用作为读出测得；数据未示出)抑制由RIPK3构建体诱导的细胞死亡，从而证实观察到的细胞死亡是由RIPK3诱导的坏死性细胞死亡。
实施例25：DIABLO mmRNA构建体诱导细胞死亡
在该实施例中，制备了编码DIABLO的一系列mmRNA构建体，并测试了它们诱导细胞死亡的能力。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。无任何表位标签的DIABLO构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:165-172示出。编码SEQ ID NO:169的DIABLO蛋白的示例性核苷酸序列以SEQ ID NO:1416和1487示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定DIABLO构建体是否可以诱导细胞死亡，将这些构建体转染到SKOV3细胞中。以10,000个细胞/孔的密度将细胞接种在96孔板中，然后使用Lipofectamine 2000将mmRNA构建体转染到这些细胞中。41小时之后，使用发光细胞活力测定(Promega)测量细胞死亡。结果在图62中示出，证明许多DIABLOmmRNA构建体能够诱导细胞死亡。
实施例26：半胱天冬酶4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-11、Pyrin、NLRP3和ASCmmRNA构建体诱导细胞死亡
在该实施例中，制备编码各种形式的半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-11、Pyrin、NLRP3或ASC的mmRNA构建体并转染到细胞中，以使用用于测量细胞死亡的程度的DNA染料(Life Technologies)检查它们诱导细胞死亡的能力。
在第一系列实验中，制备一组编码各种半胱天冬酶-4、-5或-11蛋白的mmRNA构建体，并测试它们诱导细胞死亡的能力。测试的构建体编码：(i)全长野生型半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11；(ii)全长半胱天冬酶-4、-5或-11加上IZ结构域；(iii)N末端缺失的半胱天冬酶-4、-5或-11加上IZ结构域；(iv)全长半胱天冬酶-4、-5或-11加上DM结构域；或(v)N末端缺失的半胱天冬酶-4、-5或-11加上DM结构域。N末端缺失形式的半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-11含有氨基酸残基81-377，而N末端缺失形式的半胱天冬酶-5含有氨基酸残基137-434。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签(例如，FLAG、Myc、CT、HA、V5)以促进检测。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。无任何表位标签的半胱天冬酶-4构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1352-1356示出。无任何表位标签的半胱天冬酶-5构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1357-1361示出。无任何表位标签的半胱天冬酶-11构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1362-1366示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定半胱天冬酶-4、-5和-11构建体是否可以诱导细胞死亡，使用Lipofectamine 2000将这些构建体转染到HeLa细胞中。24小时之后，使用DNA染料测量细胞死亡。结果在图63中示出，证明所有五种形式的半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5和半胱天冬酶-11mmRNA构建体都能够诱导HeLa细胞的细胞死亡。
在第二系列实验中，制备一组编码各种Pyrin、NLRP3或ASC蛋白的mmRNA构建体，并测试它们诱导细胞死亡的能力。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签(例如，FLAG、Myc、CT、HA、V5)以促进检测。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。无任何表位标签的Pyrin构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1375和1376示出。无任何表位标签的NLRP3构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1373和1374示出。无任何表位标签的ASC构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:1377和1378示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ IDNO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
为了确定Pyrin、NLRP3和ASC构建体是否可以诱导细胞死亡，使用Lipofectamine2000将这些构建体转染到HeLa细胞中。24小时之后，使用DNA染料测量细胞死亡。结果在图64中示出，证明Pyring、NLRP3和ASC这些mmRNA构建体能够诱导HeLa细胞的细胞死亡。
实施例27：组成型活性IRF3和IRF7 mmRNA构建体激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)
在该实施例中，使用了其转录由干扰素敏感性应答元件(ISRE)驱动的报告基因来测试组成型活性IRF3和IRF7 mRNA构建体激活ISRE的能力。制备组成型活性IRF3构建体和IRF7构建体，并在下文进行描述。这些构建体典型地还编码在N-末端或C-末端处的表位标签以促进检测。测试了不同的表位标签(FLAG、Myc、CT、HA、V5)。此外，所有构建体均含有100个核苷酸的帽1 5’帽(7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、5’UTR、3’UTR、多聚腺苷酸尾，并且用1-甲基-假尿苷(m1ψ)完全修饰。包含S396D点突变而无任何表位标签的代表性组成型活性小鼠和人IRF3构建体的ORF氨基酸序列分别以SEQ ID NO:11和12示出。编码这些IRF3蛋白的示例性核苷酸序列分别以SEQ ID NO:210和211示出，并且分别以SEQ ID NO:1452和1453示出。无任何表位标签的代表性组成型活性人IRF7构建体的ORF氨基酸序列以SEQ ID NO:13-20示出。编码这些IRF7蛋白的示例性核苷酸序列分别以SEQ ID NO:212-219和SEQ ID NO:1454-1461示出。在这些构建体中使用的示例性5’UTR以SEQ ID NO:21和1323示出。在这些构建体中使用的示例性3’UTR以SEQ ID NO:22示出。在这些构建体中使用的包含miR-122结合位点和miR-142-3p结合位点的示例性3’UTR以SEQ ID NO:23示出。
结果在图65A至图65B中示出，证明组成型活性IRF3构建体(图65A)和组成型活性IRF7构建体(图65B)都刺激了报告基因表达，从而表明这些构建体能够激活干扰素敏感性应答元件(ISRE)。
实施例28：致敏对用细胞焦亡构建体处理的细胞释放炎性细胞因子的影响
在该实施例中，检查了在用细胞焦亡mRNA构建体转染之前用免疫增强剂致敏细胞对这些细胞释放促炎细胞因子的影响。
该研究的设计在图66中示出。在第1天，以10,000个HeLa细胞/孔的密度将细胞接种在96孔板中。在第2天，用图66中所示免疫增强剂中的一种(组成型活性IKKβ构建体在实施例3中进一步描述)处理细胞。在第3天，用图66中所示的半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5或半胱天冬酶-11mRNA构建体中的一种(半胱天冬酶-4、-5和-11构建体在实施例26中进一步描述)转染细胞。在第4天，收集上清液，通过标准ELISA测定炎性细胞因子IL-18的水平。
结果在图67中示出，证明特别是用具有PEST突变的免疫增强剂IL-1α或组成型活性IKKβ构建体致敏细胞刺激HeLa细胞(特别是用半胱天冬酶-4构建体或半胱天冬酶-5构建体处理过的那些)释放促炎细胞因子。这些结果证明了将免疫增强剂与编码刺激免疫原性细胞死亡的多肽的mRNA构建体组合以便增强促炎应答的益处。
实施例29：单独的刽子手mRNA或与免疫增强剂和/或免疫检查点抑制剂组合的抗肿瘤作用
在该实施例中，检查了刽子手mRNA对小鼠体内肿瘤生长的作用。编码MLKL、RIPK3或DIABLO的刽子手mRNA构建体单独使用或组合使用，以及与免疫增强剂(STING mRNA构建体)和/或免疫检查点抑制剂(抗CTLA4抗体或抗PD-1抗体)组合使用。
在第一组实验中，将携带MC38结肠癌肿瘤(皮下植入5x 105个细胞；治疗时的肿瘤大小为约100至120mm3)的小鼠分为11个治疗组，每周两次用以下mRNA构建体进行肿瘤内治疗4周的时间(第1、4、8、11、17、20、24和27天)，某些组还用如所指示的一种或多种免疫检查点抑制剂治疗：(i)NT-MOD，作为阴性对照；(ii)huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p(每只动物12.5μg)；(iii)DIABLO(每只动物12.5μg)；(iv)muRIPK3-IZ.三聚体(每只动物12.5μg)；(v)huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p(每只动物12.5μg)+抗CTLA4 9H10(5mg/kg，第1天腹膜内施用；2.5mg/kg，第4天和第7天腹膜内施用)；(vi)DIABLO(每只动物12.5μg)+抗CTLA49H10(5mg/kg，第1天腹膜内施用；2.5mg/kg，第4天和第7天腹膜内施用)；(vii)muRIPK3-IZ.三聚体(每只动物12.5μg)+抗CTLA49H10(5mg/kg，第1天腹膜内施用；2.5mg/kg，第4天和第7天腹膜内施用)；(viii)NT-MOD+抗CTLA4 9H10(5mg/kg，第1天腹膜内施用；2.5mg/kg，第4天和第7天腹膜内施用)；(ix)huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p(每只动物12.5μg)+DIABLO(每只动物12.5μg)；(x)huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p(每只动物12.5μg)+DIABLO(每只动物12.5μg)+抗CTLA4 9H10(5mg/kg，第1天腹膜内施用；2.5mg/kg，第4天和第7天腹膜内施用)；以及(xi)抗CTLA4 9H10(5mg/kg，第1天腹膜内施用；2.5mg/kg，第4天和第7天腹膜内施用)+抗PD-1RMP1-14(5mg/kg，腹膜内施用，每周两次，持续2周)，作为阳性对照。
对应于上述11个治疗组的结果在图68A至图68K中示出，示出了在实验的时间过程中小鼠体内的肿瘤体积(mm3)。此外，在第一次瘤内注射之后10小时和24小时收集血清，并使用ProcataPlex(Affymetrix)分析炎性细胞因子的表达。细胞因子分析揭示，治疗组中的IFN-α、IL-6、TNF-α、GROα(CXCL1)、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)和RANTES(CCL5)水平相比对照组升高。
在第二组实验中，将携带MC38结肠癌肿瘤(皮下植入5x 105个细胞；治疗时的肿瘤大小为约100至120mm3)的小鼠分为7个治疗组，并且每周用以下mRNA构建体进行肿瘤内治疗4周的时间(第1、8、15、22天)：(i)NT-MOD，作为阴性对照；(ii)NT-MOD+STING；(iii)MLKL+STING；(iv)Diablo+STING；(v)RIPK3+STING；(vi)MLKL+Diablo+STING；和(vii)RIPK3+Diablo+STING。所有组在第1天用抗CTLA4(腹膜内)以5mg/kg治疗，然后在第4天和第7天以2.5mg/kg治疗。
对应于上述7个治疗组的结果在图69A中示出，示出了在实验的时间过程中小鼠体内的肿瘤体积(mm3)，并且在图69B中示出，示出了在实验过程中所指示治疗组的存活百分比。此外，在第一次瘤内注射之后10小时和24小时收集血清，并使用ProcataPlex(Affymetrix)分析炎性细胞因子的表达。细胞因子分析揭示，治疗组中的IFN-α、IL-6、TNF-α、GROα(CXCL1)、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)和RANTES(CCL5)水平相比对照组升高。
在第三组实验中，将携带MC38结肠癌肿瘤(皮下植入5x 105个细胞)的小鼠分为3个处理组，并且每周用以下mRNA构建体进行肿瘤内治疗4周的时间(第1、8、15、22天)：(i)媒介物对照；(ii)NT-MOD+抗PD-1；(iii)STING+抗-PD-1。以5mg/kg腹膜内给予抗PD1，每周两次，持续2周。
对应于上述3个治疗组的结果在图70A中示出，示出了在实验的时间过程中小鼠体内的肿瘤体积(mm3)，并且在图70B中示出，示出了在实验过程中这些治疗组的存活百分比。
其他实施方案
应当理解，虽然本公开已经结合其具描述加以描述，但是前述描述旨在说明而非限制本公开的范围，本公开的范围是由所附权利要求的范围限定的。其他的方面、优点和变更在以下权利要求的范围之内。
本文所述的所有参考文献都全文以引用方式并入。
序列表汇总
Claims (130)
1.一种编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的多肽的信使RNA(mRNA)，其中所述免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(v)中任意一些的组合。
2.如权利要求1所述的mRNA，其中所述多肽在至少一种Toll样受体(TLR)的下游起作用，从而增强免疫应答。
3.如权利要求1或2所述的mRNA，其中所述多肽刺激I型干扰素(IFN)应答和/或NFκB介导的促炎应答。
4.如权利要求3所述的mRNA，其中所述多肽刺激I型IFN应答，并且其中所述多肽选自STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI和IFI16。
5.如权利要求3所述的mRNA，其中所述多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且其中所述多肽选自STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7。
6.如权利要求1或2所述的mRNA，其中所述多肽是细胞内衔接蛋白。
7.如权利要求6所述的mRNA，其中所述细胞内衔接蛋白选自STING、MAVS和MyD88。
8.如权利要求2所述的mRNA，其中所述多肽是TLR信号传导途径的细胞内信号传导蛋白。
9.如权利要求8所述的mRNA，其中所述细胞内信号传导蛋白选自MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TRAF3、TRAF6、TAK1、TAB2、TAB3、TAK-TAB1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、IKKα、IKKβ、TRAM、TRIF、RIPK1和TBK1。
10.如权利要求2所述的mRNA，其中所述多肽是转录因子。
11.如权利要求10所述的mRNA，其中所述转录因子是IRF3或IRF7。
12.如权利要求2所述的mRNA，其中所述多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成。
13.如权利要求12所述的mRNA，其中所述多肽选自MLKL、RIPK1、RIPK3、DIABLO和FADD。
14.如权利要求2所述的mRNA，其中所述多肽参与细胞焦亡或炎性体形成。
15.如权利要求14所述的mRNA，其中所述多肽选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶11、GSDMD、NLRP3、Pyrin结构域和ASC/PYCARD。
16.如权利要求1至15中任一项所述的mRNA，其包含一个或多个经修饰的核碱基。
17.一种脂质纳米粒子，其包含如权利要求1至16中任一项所述的mRNA。
18.如权利要求17所述的脂质纳米粒子，其还包含编码感兴趣抗原的mRNA。
19.一种组合物，其包含编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的第一多肽的第一mRNA、编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的第二多肽的第二mRNA，以及任选地，编码增强对受试者体内的感兴趣抗原的免疫应答的第三多肽的第三mRNA，其中所述第一多肽、所述第二多肽和所述第三多肽在至少一种Toll样受体(TLR)的下游起作用，从而增强免疫应答，并且其中所述免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(v)中任意一些的组合。
20.如权利要求19所述的组合物，其中：
(i)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且所述第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答；
(ii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且所述第二多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成；
(iii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且所述第二多肽参与细胞焦亡或炎性体形成；
(iv)所述第一多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且所述第二多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成；
(v)所述第一多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且所述第二多肽参与细胞焦亡或炎性体形成；
(vii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答、所述第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且所述第三多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成；或
(viii)所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答、所述第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且所述第三多肽参与细胞焦亡或炎性体形成。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且选自STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI和IFI16；并且所述第二多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且选自STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述第一多肽为组成型活性IRF3，并且所述第二多肽为组成型活性IKKα。
23.如权利要求22所述的组合物，其还包含编码组成型活性IRF7多肽的mRNA。
24.如权利要求20所述的组合物，其中所述第一多肽刺激I型干扰素(IFN)应答，并且选自STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI和IFI16；并且所述第二多肽参与坏死性凋亡或坏死体形成，并且选自MLKL、RIPK1、RIPK3、DIABLO和FADD。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述第一多肽为组成型活性STING，并且所述第二多肽为MLKL多肽。
26.如权利要求20所述的组合物，其中所述第一多肽刺激NFκB介导的促炎应答，并且选自STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6和MKK7；并且所述第二多肽参与细胞焦亡或炎性体形成，并且选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶11、GSDMD、NLRP3、Pyrin结构域和ASC/PYCARD。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述第一多肽为组成型活性IKKβ，并且所述第二多肽为半胱天冬酶-1多肽。
28.如权利要求27所述的组合物，其还包含编码半胱天冬酶-4多肽的mRNA。
29.如权利要求19至28中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二和/或第三mRNA包含一个或多个经修饰的核碱基。
30.一种脂质纳米粒子，其包含如权利要求19至29中任一项所述的组合物。
31.如权利要求30所述的脂质纳米粒子，其还包含编码感兴趣抗原的mRNA。
32.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求29所述的组合物、和任选的药学上可接受的载体，其用于增强个体体内的免疫应答，其中所述治疗包括施用所述脂质纳米粒子或组合物，任选地与第二组合物组合，任选地其中所述第二组合物包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体。
33.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体在制造用于增强个体体内的免疫应答的药物方面的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物，任选地与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合。
34.一种试剂盒，其包括容器和包装说明书，所述容器包含如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求29所述的组合物、和任选的药学上可接受的载体，所述包装说明书包括用于施用所述脂质纳米粒子或组合物以增强个体体内的免疫应答的说明。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述包装说明书还包括用于将所述脂质纳米粒子或组合物与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以增强个体体内的免疫应答的说明。
36.一种试剂盒，其包括药物和包装说明书，所述药物包含如权利要求17、18、30和31中任一项所述的脂质纳米粒子、和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求29所述的组合物、和任选的药学上可接受的载体，所述包装说明书包括用于单独施用所述药物或将所述药物与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以增强个体体内的免疫应答的说明。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括包装说明书，所述包装说明书包括用于在施用第二药物之前、在施用所述第二药物的同时或在施用所述第二药物之后施用第一药物以增强个体体内的免疫应答的说明。
38.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求29所述的组合物、如权利要求33所述的用途或如权利要求36至37中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或它们的组合。
39.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求29所述的组合物、如权利要求33所述的用途或如权利要求36至37中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体。
40.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求29所述的组合物、如权利要求33所述的用途或如权利要求36至37中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及它们的组合。
41.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求29所述的组合物、如权利要求33所述的用途或如权利要求36至37中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。
42.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求29所述的组合物、如权利要求33所述的用途或如权利要求36至37中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自替西木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。
43.如权利要求17、18、30或31中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求29所述的组合物、如权利要求33所述的用途或如权利要求36至37中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
44.一种增强受试者体内对感兴趣抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求18或如权利要求31所述的脂质纳米粒子，使得增强对所述感兴趣抗原的免疫应答。
45.一种组合物，其包含至少一种免疫增强剂mRNA和至少一种编码感兴趣抗原的mRNA，其中所述免疫增强剂在至少一种Toll样受体(TLR)的下游起作用，从而增强免疫应答，并且其中所述免疫应答包括细胞免疫应答或体液免疫应答，其特征在于：
(i)刺激I型干扰素途径信号传导；
(ii)刺激NFkB途径信号传导；
(iii)刺激炎症应答；
(iv)刺激细胞因子产生；
(v)刺激树突状细胞的发育、活性或动员；以及
(vi)(i)至(v)中任意一些的组合。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述免疫增强剂刺激I型干扰素(IFN)应答。
47.如权利要求45或46所述的组合物，其中所述免疫增强剂刺激NFκB介导的促炎应答。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述免疫增强剂刺激I型IFN应答，并且选自STING、MAVS、IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、TBK1、IKKα、IKKi、MyD88、TRAM、TRAF3、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、IPS-1、RIG-1、DAI、IFI16以及它们的组合。
49.如权利要求47所述的组合物，其中所述免疫增强剂刺激NFκB介导的促炎应答，并且选自STING、c-FLIP、IKKβ、RIPK1、Btk、TAK1、TAK-TAB1、TBK1、MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TAB2、TAB3、TRAF6、TRAM、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7以及它们的组合。
50.如权利要求45或46所述的组合物，其中所述免疫增强剂是细胞内衔接蛋白。
51.如权利要求50所述的组合物，其中所述免疫增强剂蛋白选自STING、MAVS、MyD88以及它们的组合。
52.如权利要求46所述的组合物，其中所述免疫增强剂是TLR信号传导途径的细胞内信号传导蛋白。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述细胞内信号传导蛋白选自MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TRAF3、TRAF6、TAK1、TAB2、TAB3、TAK-TAB1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、IKKα、IKKβ、TRAM、TRIF、RIPK1、TBK1，以及它们的组合。
54.如权利要求46所述的组合物，其中所述免疫增强剂是转录因子。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述转录因子是IRF3、IRF7或它们的组合。
56.如权利要求46所述的组合物，其中所述免疫增强剂参与坏死性凋亡或坏死体形成。
57.如权利要求56所述的组合物，其中所述免疫增强剂选自MLKL、RIPK1、RIPK3、DIABLO、FADD，以及它们的组合。
58.如权利要求46所述的组合物，其中所述免疫增强剂参与细胞焦亡或炎性体形成。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述免疫增强剂选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶11、GSDMD、NLRP3、Pyrin结构域、ASC/PYCARD，以及它们的组合。
60.如权利要求45所述的组合物，其中所述免疫增强剂包括组成型活性人STING多肽。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述组成型活性人STING多肽包含选自V147L、N154S、V155M、R284M、R284K、R284T、E315Q、R375A和它们的组合的一个或多个突变。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述组成型活性人STING多肽包含V155M突变。
63.如权利要求61所述的组合物，其中所述组成型活性人STING多肽包含突变R284M/V147L/N154S/V155M。
64.如权利要求60至63中任一项所述的组合物，其还包含第二免疫增强剂mRNA，其中所述第二免疫增强剂mRNA编码MLKL多肽。
65.如权利要求45所述的组合物，其中所述免疫增强剂是MAVS多肽。
66.如权利要求45所述的组合物，其中所述免疫增强剂是组成型活性IRF3多肽。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述组成型活性IRF3多肽包含S396D突变。
68.如权利要求66至67中任一项所述的组合物，其还包含第二免疫增强剂mRNA，其中所述第二免疫增强剂mRNA编码组成型活性人IRF7多肽。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述组成型活性人IRF7多肽包含选自S475D、S476D、S477D、S479D、L480D、S483D、S487D、氨基酸247-467的缺失，以及它们的组合的一个或多个突变。
70.如权利要求68至69中任一项所述的组合物，其还包含第三免疫增强剂mRNA，其中所述第三免疫增强剂mRNA编码IKKβ多肽。
71.如权利要求45至70中任一项所述的组合物，其中所述感兴趣抗原是一种或多种肿瘤抗原。
72.如权利要求45至70中任一项所述的组合物，其中所述感兴趣抗原是一种或多种病原体抗原，并且其中所述病原体是病毒、细菌、原生动物或寄生生物。
73.如权利要求45至70中任一项所述的组合物，其中所述感兴趣抗原是一种或多种个性化癌症抗原。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述个性化癌症抗原是由2至100个肽表位组成的多联癌症抗原。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述多联癌症抗原包括下列特征中的一种或多种：
a)切割敏感性位点散布在所述2至100个肽表位之间；
b)编码每个肽表位的所述mRNA彼此直接连接，而不使用接头连接；
c)编码每个肽表位的所述mRNA使用单个核苷酸接头彼此连接；
d)每个肽表位包含25至35个氨基酸，并且包括位于中心的SNP突变；
e)所述肽表位的至少30％对来自受试者的I类MHC分子具有最高的亲和力；
f)所述肽表位的至少30％对来自受试者的II类MHC分子具有最高的亲和力；
g)所述肽表位的至少50％对于HLA-A、HLA-B和/或DRB1的预测结合亲和力为IC>500nM；
h)所述mRNA编码20个肽表位；
i)所述肽表位的50％对于I类MHC具有结合亲和力，并且所述肽表位的50％对于II类MHC具有结合亲和力；以及/或者
j)编码所述肽表位的所述mRNA被排列成使得所述肽表位被排序以最大程度减少假表位。
76.如权利要求75所述的组合物，其中每个肽表位包含31个氨基酸并且包括位于中心的SNP突变，在所述SNP突变的每一侧都具有15个侧接氨基酸。
77.如权利要求74至76中任一项所述的组合物，其中所述肽表位是T细胞表位、B细胞表位或T细胞表位和B细胞表位的组合。
78.如权利要求74至76所述的组合物，其中所述肽表位包含至少一个MHC I类表位和至少一个MHC II类表位。
79.如权利要求78所述的组合物，其中所述表位的至少30％是MHC I类表位，或者所述表位的至少30％是MHC II类表位。
80.如权利要求45至79中任一项所述的组合物，其中所述增强的免疫应答是细胞免疫应答、体液免疫应答或这两者。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所述增强的免疫应答是T细胞应答，其中所述T细胞应答是抗原特异性CD8+ T细胞应答、CD4+ T细胞应答或这两者。
82.如权利要求80所述的组合物，其中所述增强的免疫应答是B细胞应答，其中所述B细胞应答是抗原特异性抗体应答。
83.如权利要求45至79中任一项所述的组合物，其中所述增强的免疫应答刺激细胞因子产生、刺激抗原特异性CD8+ T细胞应答、刺激抗原特异性CD4+辅助细胞应答、增加所述效应记忆CD62Llo T细胞群、刺激B细胞活性或刺激抗原特异性抗体产生，或者前述应答的任意组合。
84.如权利要求83所述的组合物，其中所述增强的免疫应答包括刺激细胞因子产生，其中所述细胞因子为IFN-γ或TNF-α、或这两者。
85.如权利要求83所述的组合物，其中所述增强的免疫应答包括刺激抗原特异性CD8+ T细胞应答，其中所述抗原特异性CD8+ T细胞应答包括CD8+T细胞增殖或CD8+ T细胞细胞因子产生，或这两者。
86.如权利要求85所述的组合物，其中CD8+ T细胞细胞因子产生增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
87.如权利要求85所述的组合物，其中所述抗原特异性CD8+ T细胞应答包括CD8+ T细胞增殖，并且其中CD8+ T细胞在总T细胞群中的百分比增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
88.如权利要求85所述的组合物，其中所述抗原特异性CD8+ T细胞应答包括效应记忆CD62Llo T细胞在CD8+ T细胞中的百分比增加。
89.如权利要求45至79中任一项所述的组合物，其中对所述感兴趣抗原的所述免疫应答相对于在不存在所述免疫增强剂的情况下对所述抗原的所述免疫应答在大小上成倍增加。
90.如权利要求89所述的组合物，其中所述免疫应答被增加0.3至1000倍、1至750倍、5至500倍、7至250倍，或10至100倍。
91.如权利要求89所述的组合物，其中所述免疫应答被增加2倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或更大倍数。
92.如权利要求45至91中任一项所述的组合物，其中编码所述感兴趣抗原的所述mRNA(“Ag”)和所述免疫增强剂mRNA(“IP”)以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或20:1的Ag:IP质量比配制。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述Ag:IP质量比为1:1、3:1或5:1。
94.如权利要求45至93中任一项所述的组合物，其中每种mRNA都是被完全修饰的。
95.如权利要求94所述的组合物，其中所述mRNA包含假尿苷(ψ)、假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)、2-硫代尿苷(s2U)、2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)、N6-甲基-腺苷(m6A)或N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
96.如权利要求94所述的组合物，其中所述mRNA包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷，2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷，或它们的组合。
97.如权利要求94所述的组合物，其中所述mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷、或α-硫代-腺苷，或它们的组合。
98.一种脂质纳米粒子，其包含如权利要求45至97中任一项所述的组合物。
99.如权利要求98所述的脂质纳米粒子，其中所述脂质纳米粒子中的可电离氨基脂质:磷脂:甾醇:经PEG修饰脂质的摩尔比为约20％至60％:5％至25％:25％至55％:0.5％至15％。
100.如权利要求99所述的脂质纳米粒子，其中所述可电离氨基脂质选自例如2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
101.如权利要求99所述的脂质纳米粒子，其中所述脂质纳米粒子包含化合物25、DSPC、胆固醇和PEG-DMG。
102.如权利要求101所述的脂质纳米粒子，其中所述脂质纳米粒子中的化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为约20％至60％:5％至25％:25％至55％:0.5％至15％。
103.如权利要求102所述的脂质纳米粒子，其中所述脂质纳米粒子中的化合物25:DSPC:胆固醇:PEG-DMG的摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％。
104.一种药物组合物，其包含如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
105.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求104所述的组合物和任选的药学上可接受的载体，其用于增强个体体内的免疫应答，其中所述治疗包括施用所述脂质纳米粒子或组合物，任选地与第二组合物组合，任选地其中所述第二组合物包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体。
106.权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体在制造用于增强个体体内的免疫应答的药物方面的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米粒子和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物，任选地与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合。
107.一种试剂盒，其包括容器和包装说明书，所述容器包含如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求104所述的组合物、和任选的药学上可接受的载体，所述包装说明书包括用于施用所述脂质纳米粒子或组合物以增强个体体内的免疫应答的说明。
108.如权利要求107所述的试剂盒，其中所述包装说明书还包括用于将所述脂质纳米粒子或组合物与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以增强个体体内的免疫应答的说明。
109.一种试剂盒，其包括药物和包装说明书，所述药物包含如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求104所述的组合物、和任选的药学上可接受的载体，所述包装说明书包括用于单独施用所述药物或将所述药物与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以增强个体体内的免疫应答的说明。
110.如权利要求109所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括包装说明书，所述包装说明书包括用于在施用第二药物之前、在施用所述第二药物的同时或施用所述第二药物之后施用第一药物以增强个体体内的免疫应答的说明。
111.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求104所述的组合物、如权利要求106所述的用途或如权利要求108至110中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或它们的组合。
112.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求104所述的组合物，如权利要求106所述的用途或如权利要求108至110中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体。
113.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求104所述的组合物、如权利要求106所述的用途或如权利要求108至110中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及它们的组合。
114.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求104所述的组合物、如权利要求106所述的用途或如权利要求108至110中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。
115.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求104所述的组合物、如权利要求106所述的用途或如权利要求108至110中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自替西木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。
116.如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子、如权利要求104所述的组合物、如权利要求106所述的用途或如权利要求108至110中任一项所述的试剂盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
117.一种用于增强对感兴趣抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求98至103中任一项所述的脂质纳米粒子或如权利要求104所述的药物组合物，使得增强所述受试者体内对所述感兴趣抗原的免疫应答。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述增强的免疫应答是细胞免疫应答、体液免疫应答或这两者。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述增强的免疫应答是T细胞应答，其中所述T细胞应答是抗原特异性CD8+ T细胞应答、CD4+ T细胞应答或这两者。
120.如权利要求118所述的方法，其中所述增强的免疫应答是B细胞应答，其中所述B细胞应答是抗原特异性抗体应答。
121.如权利要求117所述的方法，其中所述增强的免疫应答刺激细胞因子产生、刺激抗原特异性CD8+ T细胞应答、刺激抗原特异性CD4+辅助细胞应答、增加所述效应记忆CD62LloT细胞群、刺激B细胞活性或刺激抗原特异性抗体产生，或者前述应答的任意组合。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述增强的免疫应答包括刺激细胞因子产生，其中所述细胞因子为IFN-γ或TNF-α或这两者。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述增强的免疫应答包括刺激抗原特异性CD8+ T细胞应答，其中所述抗原特异性CD8+ T细胞应答包括CD8+T细胞增殖或CD8+ T细胞细胞因子产生，或这两者。
124.如权利要求123所述的方法，其中CD8+ T细胞细胞因子产生增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
125.如权利要求123所述的方法，其中所述抗原特异性CD8+ T细胞应答包括CD8+ T细胞增殖，并且其中CD8+ T细胞在总T细胞群中的百分比增加至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％。
126.如权利要求123所述的方法，其中所述抗原特异性CD8+ T细胞应答包括效应记忆CD62Llo T细胞在CD8+ T细胞中的百分比增加。
127.如权利要求117至126中任一项所述的方法，其中对所述感兴趣抗原的所述免疫应答相对于在不存在所述免疫增强剂的情况下对所述抗原的所述免疫应答在大小上成倍增加。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述免疫应答被增加0.3至1000倍、1至750倍、5至500倍、7至250倍，或10至100倍。
129.如权利要求127所述的方法，其中所述免疫应答被增加2倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或更大倍数。
130.如权利要求117至126中任一项所述的方法，其中对所述感兴趣抗原的所述免疫应答维持的时间超过10天、超过15天、超过20天、超过25天、超过30天、超过40天、超过50天、超过60天、超过70天、超过80天或超过90天。
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