BR112021000315A2 - cepas bacterianas imunoestimulantes modificadas geneticamente e seus usos - Google Patents

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BR112021000315A2
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Christopher D. Thanos
Laura Hix Glickman
Justin Skoble
Alexandre Charles Michel Iannello
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Actym Therapeutics, Inc.
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Abstract

CEPAS BACTERIANAS IMUNOESTIMULANTES MODIFICADAS GENETICAMENTE E SEUS USOS. É fornecida a liberação de bactérias imunoestimulantes que possuem colonização aumentada de tumores, do microambiente tumoral e/ou de células imunes residentes no tumor, e atividade antitumoral aumentada. As bactérias imunoestimulantes são modificadas por deleção de genes que codificam os flagelos ou modificação dos genes de modo que flagelos funcionais não sejam produzidos, e/ou são modificadas por deleção de pagP ou modificação de pagP para produzir produto de PagP inativo. Como resultado, as bactérias imunoestimulantes são flagelina- e/ou pagP-. As bactérias imunoestimulantes opcionalmente possuem modificações genômicas adicionais de modo que as bactérias sejam auxotróficas para adenosina ou purina. As bactérias opcionalmente são um ou mais de asd-, purl- e msbB-. As bactérias imunoestimulantes, por exemplo, espécies de Salmonella, são modificadas para codificar proteínas imunoestimulantes que conferem atividade antitumoral no microambiente tumoral, e/ou são modificadas de modo que as bactérias infectem preferencialmente células imunes no microambiente tumoral ou células imunes residentes no tumor e/ou induzam menos morte celular em células imunes do que em outras células. Também são fornecidos métodos de inibição do crescimento ou de redução do volume de um tumor sólido por administração das bactérias imunoestimulantes.

Description

CEPAS BACTERIANAS IMUNOESTIMULANTES MODIFICADAS GENETICAMENTE E SEUS USOS PEDIDOS RELACIONADAS
[001] É reivindicado benefício de prioridade para o Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US2018/041713, depositado em 11 de julho de 2018, e publicado como WO 2019/014398 em 17 de janeiro de 2019, e para o Pedido de Patente U.S. co-pendente Nº de Série 16/033.187, depositado em 11 de julho de 2018, e publicado como Publicação U.S. Nº U.S. 2019/0017050 A1 em 17 de janeiro de 2019, cada um para Applicant Actym Therapeutics, Inc., inventores Christopher D. Thanos, Laura Hix Glickman e Justin Skoble; e cada um intitulado “ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF”.
[002] Também é reivindicado benefício de prioridade para Pedido U.S. Provisório Nº de Série 62/789.983, depositado em 08 de janeiro de 2019, para Applicant Actym Therapeutics, Inc., inventores Christopher D. Thanos, Laura Hix Glickman, Justin Skoble e Alexandre Charles Michel Iannello, e intitulado “Engineered Immunostimulatory Bacterial Strains and Uses Thereof”. Também é reivindicado benefício de prioridade para o Pedido U.S. Provisório Nº de Série 62/828.990, depositado em 03 de abril de 2019, para Applicant Actym Therapeutics, Inc., inventores Christopher D. Thanos, Laura Hix Glickman, Justin Skoble e Alexandre Charles Michel Iannello, e intitulado “Salmonella Strains Engineered To Colonize Tumors And The Tumor MicroEnviroment”.
[003] As bactérias imunoestimulantes fornecidas em cada um desses pedidos podem ser modificadas como descrito nesse pedido e essas bactérias são incorporadas por referência nesse relatório descritivo. Quando permitido, o tema de cada um desses pedidos é incorporado por referência em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS FORNECIDA ELETRONICAMENTE
[004] Uma versão eletrônica da Listagem de Sequências é depositada em conjunto, cujo conteúdo é incorporado por referência em sua totalidade. O arquivo eletrônico foi criado em 10 de julho de 2019, tem 457 kilobytes de tamanho, e é intitulado 1704SEQPC.txt.
FUNDAMENTOS
[005] O campo de imunoterapia do câncer já deu passos largos, como evidenciado pelos sucessos clínicos de anticorpos para o ponto de verificação imune anti-CTLA4, anti-PD-1 e anti-PD-L1 (veja, por exemplo, Buchbinder e cols. (2015) J. Clin. Invest. 125: 3.377-3.383; Hodi e cols. (2010) N. Engl. J. Med. 363 (8): 711-723; e Chen e cols. (2015) J. Clin. Invest. 125: 3.384-3.391). Tumores desenvolvem um ambiente profundamente imunossupressivo. Eles iniciam múltiplos mecanismos para evadir da vigilância imune, reprogramar células imunes antitumorais para suprimir a imunidade, e mutar resistência continuamente para as últimas terapias contra o câncer (veja, por exemplo, Mahoney e cols. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14 (8): 561-584). O design de imunoterapias que superem a tolerância e escape imunes e que limitem, ao mesmo tempo, as toxicidades relacionadas à autoimunidade das imunoterapias atuais, desafia o campo de imuno-oncologia. Dessa forma, são necessárias imunoterapias e outras terapias adicionais e inovadoras.
SUMÁRIO
[006] São fornecidas bactérias modificadas para serem imunoestimulantes para terapia anticâncer. Bactérias imunoestimulantes, como fornecidas nesse relatório descritivo, fornecem uma abordagem multifacetada à terapia antitumoral. Bactérias fornecem uma plataforma na qual há diversas avenidas para provocar atividade imunoestimulante antitumoral. Como fornecidas nesse relatório descritivo, bactérias, tais como espécies de Salmonella, possuem um ajuste fino para ter atividade antitumoral potente por aumento de sua habilidade para se acumular em tumores-alvo, células imunes residentes em tumores e/ou no microambiente tumoral (TME). Isso é obtido por modificações que, por exemplo, alteram o tipo de células que podem infectar (tropismo), sua toxicidade, sua habilidade para escapar do sistema imune, por exemplo, do complemento, e/ou dos ambientes nos quais podem replicar. As bactérias imunoestimulantes também podem codificar, por exemplo, produtos que aumentam ou provocam uma resposta imune, e produtos terapêuticos. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, em virtude de sua colonização aumentada de tumores, do microambiente tumoral e/ou de células imunes residentes no tumor, e sua resistência ao complemento e outras respostas imunes antibacterianas, podem ser administradas sistemicamente.
[007] Os genomas das bactérias fornecidas nesse relatório descritivo são modificados para aumentar o acúmulo em tumores e em células imunes residentes no tumor, e também no microambiente tumoral. Isso é efetuado nesse relatório descritivo por deleção ou incapacitação de genes responsáveis por infecção ou invasão de células não tumorais,
por exemplo, células epiteliais, e/ou diminuição da citopatogenicidade das bactérias, particularmente para células imunes e células imunes residentes no tumor.
[008] Bactérias, por sua natureza, estimulam o sistema imune; a infecção bacteriana induz vias e respostas imunes e inflamatórias, algumas das quais são desejáveis para tratamento antitumoral, e outras são indesejáveis. A modificação das bactérias por deleção ou modificação de genes e produtos que resultam em respostas inflamatórias indesejáveis, e adição ou modificação de genes e produtos que induzem respostas imunoestimulantes antitumorais desejáveis, aumenta a atividade antitumoral das bactérias.
[009] Bactérias se acumulam em células e tecidos tumorais, e podem neles replicar, podem lisar células. Bactérias migram dos locais de administração e podem se acumular em outros tumores e células tumorais para fornecer um efeito abscopal. As bactérias fornecidas nesse relatório descritivo são modificadas de modo que preferencialmente infectem e se acumulem em células imunes residentes no tumor, tumores e no microambiente tumoral.
[0010] Nesse relatório descritivo, todas essas propriedades das bactérias são exploradas para produzir bactérias comprovadamente imunoestimulantes com diversas atividades e propriedades antitumorais que podem atuar individualmente e sinergicamente.
[0011] São fornecidas composições, usos destas e métodos que modulam as respostas imunes para o tratamento de doenças, incluindo para o tratamento de câncer. As composições contêm bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo. São fornecidos métodos de tratamento e usos das bactérias para tratamento também. Os indivíduos para tratamento incluem humanos e outros primatas, animais de estimação, tais como cães e gatos, e outros animais, por exemplo, cavalos.
[0012] São fornecidas composições farmacêuticas que contêm as bactérias imunoestimulantes, e métodos e usos destas para tratamento de doenças e distúrbios, particularmente distúrbios proliferativos, por exemplo, tumores, incluindo tumores sólidos e malignidades hematológicas.
[0013] Também são fornecidos métodos de inibição do crescimento ou de redução do volume de um tumor sólido por administração das bactérias imunoestimulantes ou composições farmacêuticas, ou de utilização das composições para tratamento. Por exemplo, são fornecidos métodos de administração ou de utilização de uma composição que contém, para uma dosagem única, uma quantidade eficaz de uma espécie de Salmonella atenuada a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, que possui um tumor sólido canceroso. Subentende-se que todas as modificações ao genoma das bactérias, por exemplo, produtos terapêuticos antitumorais, e outras modificações do genoma bacteriano e dos plasmídeos descritos, podem ser combinadas em qualquer combinação desejada.
[0014] São fornecidas bactérias imunoestimulantes que possuem colonização aumentada de tumores, do microambiente tumoral e/ou de células imunes residentes no tumor, e atividade antitumoral aumentada. As bactérias imunoestimulantes são modificadas por deleção de genes que codificam os flagelos, ou modificação dos genes de modo que flagelos funcionais não sejam produzidos, e/ou deleção de pagP ou modificação de pagP para produzir produto de PagP inativo. Como resultado, as bactérias imunoestimulantes são flagelina- (PC-AB-) e/ou pagP-. Alternativamente, ou adicionalmente, as bactérias imunoestimulantes podem ser pagP-/msbB-.
[0015] As bactérias imunoestimulantes podem ser deficientes em flagelina, por exemplo, por deleção ou ruptura em um gene (ou genes) que codifica os flagelos. Por exemplo, são fornecidas bactérias imunoestimulantes que contêm deleções nos genes que codificam uma ou ambas de subunidades de flagelina fliC e fljB, pela qual a bactéria é deficiente em flagelos, e em que a bactéria do tipo selvagem expressa flagelos. As bactérias imunoestimulantes também podem ter uma deleção ou modificação no gene que codifica endonuclease I (endA), pela qual a atividade de endA é inibida ou eliminada.
[0016] As bactérias imunoestimulantes opcionalmente possuem modificações genômicas adicionais de modo que as bactérias sejam auxotróficas para adenosina ou purina. As bactérias opcionalmente são um ou mais de asd-, purl- e msbB- . As bactérias imunoestimulantes, por exemplo, espécies de Salmonella, são modificadas para codificar proteínas imunoestimulantes que conferem atividade antitumoral no microambiente tumoral, e/ou são modificadas de modo que as bactérias infectem preferencialmente células imunes no microambiente tumoral ou células imunes residentes no tumor, e/ou induzam menos morte celular em células imunes do que em outras células. Também são fornecidos métodos de inibição do crescimento ou de redução do volume de um tumor sólido por administração das bactérias imunoestimulantes.
[0017] São fornecidos métodos de aumento da colonização tumoral de uma bactéria imunoestimulante, por exemplo, uma espécie de Salmonella, por modificação do genoma da bactéria imunoestimulante para ser flagelina- (fliC-/fljB-) e/ou pagP- .
[0018] As bactérias também contêm plasmídeos que codificam produtos terapêuticos, por exemplo, agentes antitumorais, proteínas que aumentam a resposta imune de um indivíduo, e RNA inibidor (RNAi) que visam pontos de verificação imune. Por exemplo, os plasmídeos podem codificar proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes, que aumentam a resposta antitumoral no indivíduo. As bactérias contêm plasmídeos que codificam produtos terapêuticos anticâncer, por exemplo, RNA, incluindo microRNA, shRNA e siRNA, e anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno destes que são projetados para suprimir, inibir, romper ou de algum outro modo silenciar genes e produtos do ponto de verificação imune, e outros alvos que desempenham um papel em vias que são imunossupressoras. As bactérias também podem codificar antígenos tumorais e neoantígenos tumorais nos plasmídeos para estimular a resposta imune contra os tumores. As proteínas codificadas são expressas sob o controle de promotores reconhecidos por eucarióticos, por exemplo, mamíferos e animais, ou virais.
[0019] São fornecidas bactérias imunoestimulantes que contêm um plasmídeo que codifica um produto terapêutico, por exemplo, um produto terapêutico anticâncer; o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que infecte preferencialmente células imunes residentes no tumor e/ou de modo que induza menos morte celular em células imunes residentes no tumor.
[0020] São fornecidas bactérias imunoestimulantes que contêm um plasmídeo que codifica um produto, geralmente um produto terapêutico, por exemplo, um produto terapêutico anticâncer, sob o controle de um promotor eucariótico, e que o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado pelo qual a bactéria é flagelina- (fliC-IfljB) e/ou page-, e pelo qual as bactérias do tipo selvagem possuem flagelos. As bactérias podem ser uma ou ambas de flagelina- (fliC-IfljB) e page-. Essas bactérias imunoestimulantes exibem colonização aumentada de tumores, do microambiente tumoral e/ou de células imunes residentes no tumor, e possuem atividade antitumoral aumentada.
[0021] Entre essas bactérias imunoestimulantes estão aquelas que são flagelina- (fliC-IfljB), e em que o produto terapêutico é um produto anticâncer. Em algumas modalidades, as bactérias são flagelina- (fliC IfljB), e o produto é uma proteína ou ácido nucleico terapêutico anticâncer.
[0022] Entre essas bactérias imunoestimulantes estão aquelas nas quais o produto terapêutico é um polipeptídeo antagonista de TGF-beta, em que o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que a bactéria infecte preferencialmente células imunes residentes no tumor, e/ou o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que induza menos morte celular em células imunes residentes no tumor (diminui a piroptose), pela qual a bactéria imunoestimulante se acumula em tumores ou no microambiente tumoral ou em células imunes residentes no tumor para, desse modo, liberar o polipeptídeo antagonista de TGF-beta ao microambiente tumoral. O antagonista de TGF-beta pode ser selecionado entre um anticorpo anti-TGF-beta, um anticorpo anti-receptor de TGF-beta e um polipeptídeo antagonista de TGF-beta solúvel. O ácido nucleico que codifica o polipeptídeo antagonista de TGF-beta pode incluir ácido nucleico que codifica uma sequência sinalizadora para secreção do polipeptídeo codificado, de modo que ele seja liberado nas células tumorais, células imunes residentes no tumor, e/ou no microambiente tumoral. Em outras modalidades de qualquer uma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, o plasmídeo codifica uma proteína imunoestimulante que confere, aumenta ou contribui para uma resposta imune antitumoral no microambiente tumoral.
[0023] São exemplares de proteínas imunoestimulantes que conferem ou contribuem para imunidade antitumoral no microambiente tumoral um ou mais de: IL-2, IL-7, IL-12p70 (IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-36 gama, IL-2 que teve atenuada a ligação à IL-2Ra, complexo IL-15/cadeia alfa de IL-15R, IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, IL-2 modificada de modo a que não se ligue à IL-2Ra, CXCL9, CXCL10, CXCL11, interferon-α, interferon-0, interferon-γ, CCL3, CCL4, CCL5, proteínas que estão envolvidas ou que efetuam ou potencializam recrutamento/persistência de células T, CD40, ligante de CD40 (CD40L), CD28, OX40, ligante de OX40 (OX40L), 4-1BB, ligante de 4-1BB (4-1BBL), membros da família B7- CD28, antagonistas de CD47, antagonistas do polipeptídeo de TGF-beta, e membros da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR).
[0024] Em outras modalidades das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, o produto terapêutico é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste. Exemplos são um Fab, Fab', F(ab')2, Fv de cadeia única (scFv), Fv, Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), nanobody, fragmento diabody, ou um anticorpo de cadeia única. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste pode ser humanizado ou humano. Exemplar de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste é um antagonista de PD-1, PD-L1, CTLA-4, VEGF, VEGFR2 ou IL-6.
[0025] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, incluindo aquelas descritas acima, podem conter um plasmídeo que codifica um produto terapêutico sob o controle de um promotor eucariótico; o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado, em que a bactéria é pagl3- 1 nisbB- e, opcionalmente, flagelina- /fljB).
[0026] Exemplares de bactérias imunoestimulantes são aquelas que contêm um plasmídeo que codifica uma proteína imunoestimulante, em que: uma proteína imunoestimulante, quando expressa em um indivíduo mamífero, confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral; a proteína imunoestimulante é codificada em um plasmídeo na bactéria sob o controle de um promotor eucariótico; e o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que infecte preferencialmente células imunes residentes no tumor. Em outras modalidades, as bactérias imunoestimulantes contêm uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína imunoestimulante, em que a proteína imunoestimulante, quando expressa em um indivíduo mamífero, confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral; a proteína imunoestimulante é codificada em um plasmídeo na bactéria sob o controle de um promotor eucariótico; e o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que induza menos morte celular em células imunes residentes no tumor. Proteínas imunoestimulantes exemplares incluem citocinas e quimiocinas, e outras proteínas estimulantes imunes, por exemplo, por exemplo, um ou mais de: IL-2, IL-7, IL-12p70 (IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-36 gama, IL-2 que teve atenuada a ligação à IL-2Ra, complexo IL-15/cadeia alfa de IL-15R, IL-18, IL-21, IL-23, IL-36γ, IL-2 modificada de modo a que não se ligue à IL-2Ra, CXCL9, CXCL10, CXCL11, interferon-a, interferon-0, interferon-γ, CCL3, CCL4, CCL5, proteínas que estão envolvidas ou que efetuam ou potencializam recrutamento/persistência de células T, CD40, ligante de CD40, CD28, OX40, ligante de OX40, 4-1BB, ligante de 4-1BB, membros da família B7-CD28, antagonistas de CD47, antagonistas do polipeptídeo de TGF-beta, e membros da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR).
[0027] Essas bactérias imunoestimulantes podem incluir modificação (ou modificações) nos genomas das bactérias imunoestimulantes, de modo que as bactérias exibam um ou ambos de infectar preferencialmente células imunes residentes no tumor, e induzir menos morte celular em células imunes residentes no tumor. As bactérias imunoestimulantes também podem incluir uma mutação no genoma que reduz a toxicidade ou infectividade de células não imunes em um hospedeiro.
[0028] Modificações do genoma bacteriano incluem page- ou pagl3- e flagelina-AB). Em outras modalidades, as bactérias imunoestimulantes são uma ou mais de pull- (purM), nisbB-, purD-, flagelina- (fliC/fljB), page-, adrA:, Csga, QseC- e WA- , por exemplo, flagelina- (fliC /fljB-)IpagP- msbB1 purl-, ou flagelina- (fliCAB-)IpagP- ImsbB-/h11A-. Em outras modalidades, as bactérias imunoestimulantes são WA- e/ou flagelina- (fliCAB-) ou pagl3- ou pagl3- 1 nisbB- ou as bactérias imunoestimulantes são WA- ou as bactérias imunoestimulantes são flagelina- (fliCAB-) e pagl3-. As modificações do genoma, entre outras propriedades, podem aumentar o direcionamento ou colonização do microambiente tumoral e/ou células imunes residentes no tumor, e/ou tornar as bactérias substancialmente ou completamente resistentes à inativação por complemento. Essas propriedades aprimoram o uso das bactérias como produtos terapêuticos, e permitem a administração sistêmica.
[0029] Nas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, o ácido nucleico que codifica o produto terapêutico está ligado operativamente para expressão a um ácido nucleico que codifica um sinal secretório, pelo qual, mediante expressão em um hospedeiro, a proteína imunoestimulante é secretada. O produto terapêutico pode ser uma proteína, por exemplo, uma proteína imunoestimulante, ou um ácido nucleico, por exemplo, um cassete CRISPR ou um RNAi.
[0030] Em todas as modalidades, as bactérias imunoestimulantes podem ser auxotróficas para adenosina, ou para adenosina e adenina. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem incluir modificações no genoma, pelas quais a bactéria preferencialmente infecta células imunes residentes no tumor, e/ou o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que induza menos morte celular em células imunes residentes no tumor (diminui a piroptose), pela qual a bactéria imunoestimulante se acumula em tumores ou no microambiente tumoral ou em células imunes residentes no tumor para, desse modo, liberar um produto terapêutico codificado.
[0031] Nas bactérias imunoestimulantes, o plasmídeo codifica o produto terapêutico sob o controle de um promotor eucariótico de modo que ele seja expresso em um hospedeiro eucariótico, por exemplo, um humano ou outro mamífero. O produto terapêutico geralmente é um produto terapêutico anticâncer, por exemplo, uma proteína terapêutica anticâncer que estimula o sistema imune do hospedeiro. Outros produtos terapêuticos incluem anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno destes, e ácidos nucleicos, por exemplo, RNAi. Esses produtos podem ser projetados para inibir, suprimir ou romper um alvo, por exemplo, um ponto de verificação imune e outros alvos desse tipo que prejudicam a habilidade do sistema imune de um indivíduo para reconhecer as células tumorais.
[0032] As bactérias não modificadas imunoestimulantes podem ser uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa atenuada. As modificações do genoma fornecidas e descritas nesse relatório descritivo atenuam as bactérias fora do microambiente tumoral ou tumores; as modificações, entre outras propriedades, alteram a infectividade das bactérias. Exemplares de bactérias que podem ser modificadas como descrito nesse relatório descritivo é Salmonella, por exemplo, uma cepa de Salmonella typhimurium. Exemplares de cepas de Salmonella typhimurium são cepas atenuadas e do tipo selvagem como, por exemplo, cepas de Salmonella typhimurium derivadas de cepas designadas como AST-100, VNP20009, YS1646 (ATCC #202165), RE88, SL7207, x 8429, x 8431, x 8468, ou uma cepa do tipo selvagem com Nº de Acesso ATCC 14028.
[0033] Como discutido acima, são fornecidas bactérias imunoestimulantes que contêm um plasmídeo que codifica um produto sob o controle de um promotor eucariótico, em que o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado e, por meio dessa modificação, a bactéria é pagP-. A deleção de msbB altera a composição de acil do domínio de Lipídeo A de lipopolissacarídeo (LPS), o componente principal das membranas externas de bactérias Gram-negativas, de tal modo que as bactérias produzam predominantemente LPS penta- acilado ao invés do LPS hexa-acilado mais tóxico e pró- inflamatório. Em S. typhimurium do tipo selvagem, a expressão de pagP resulta em lipídeo A hepta-acilado, enquanto em um mutante msbB+, a indução de pagP resulta em LPS hexa-acilado. Dessa forma, um mutante pagl3-/msbB- produz somente LPS penta- acilado, resultando em indução inferior de citocinas pró- inflamatórias, e tolerabilidade aumentada, o que permite dosagem maior em humanos. Dosagem maior leva à colonização aumentada de tumores, células imunes residentes no tumor e no microambiente tumoral. Por causa da alteração resultante em membranas e estrutura bacterianas, a resposta imune do hospedeiro, por exemplo, atividade de complemento, é alterada de modo que as bactérias não são eliminadas mediante administração sistêmica. Por exemplo, é demonstrado nesse relatório descritivo que cepas mutantes pagP- InisbB- possuem resistência aumentada à inativação de complemento e estabilidade aumentada no soro humano. Essas bactérias também podem ser flagelina- (PC IfljB), o que aumenta ainda mais a tolerabilidade, resistência à inativação de complemento e colonização no tumor/TME/célula imune residente no tumor. As bactérias também podem compreender outras modificações como descritas nesse relatório descritivo, incluindo modificações que alteram as células que podem infectar, resultando em acúmulo no microambiente tumoral, tumores e células imunes residentes no tumor. Dessa forma, as bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser administradas sistemicamente e exibem um nível elevado de colonização no tumor, no microambiente tumoral e/ou em células imunes residentes no tumor. As bactérias imunoestimulantes podem ser pull- (purM), e um ou mais de asd-, nisbB- e uma ou ambas de flagelina- IfljB-) e page-.
[0034] As bactérias imunoestimulantes podem ser aspartato-semialdeído desidrogenase- (asd-), por exemplo, em virtude de ruptura ou deleção de todo ou de uma porção do gene endógeno que codifica aspartato-semialdeído desidrogenase (asd), pela qual asd endógena não é expressa. Essas bactérias imunoestimulantes podem ser modificadas para codificar aspartato-semialdeído desidrogenase (asd) em um plasmídeo sob o controle de um promotor bacteriano, de modo que as bactérias possam ser produzidas in vitro.
[0035] As bactérias imunoestimulantes podem ser tornadas auxotróficas para nutrientes particulares que são ricos ou que se acumulam no microambiente tumoral, por exemplo, adenosina e adenina. Além disso, elas podem ser modificadas para serem auxotróficas para esses nutrientes para reduzir ou eliminar sua habilidade para replicar. Os genes inativados/deletados do genoma bacteriano podem ser complementados por seu fornecimento em um plasmídeo sob o controle de promotores reconhecidos pelo hospedeiro.
[0036] Os produtos codificados nos plasmídeos para expressão em um eucariota, por exemplo, um humano, hospedeiro, estão sob o controle de sequências regulatórias eucarióticas, incluindo promotores eucarióticos, por exemplo, promotores reconhecidos por RNA polimerase II ou III. Esses incluem promotores de RNA polimerase II de mamífero. Promotores virais também podem ser usados. Promotores virais exemplares incluem, sem limitação, um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor SV40, um promotor de vírus de Epstein-Barr (EBV), um promotor de herpes vírus e um promotor de adenovírus. Outros promotores de RNA polimerase II incluem, sem limitação, um promotor de fator de alongamento-1 (EF1) alfa, um promotor UbC (lentivírus), um promotor de PGK (3-fosfoglicerato quinase), e um promotor sintético como, por exemplo, um promotor CAGG (ou CAG). O promotor sintético CAG contém o elemento intensificador precoce de citomegalovírus (CMV) (C); o promotor, o primeiro éxon e o primeiro íntron do gene de beta-actina de galinha (A); e o aceptor de splice do gene de beta-globina de coelho (G). Outros promotores reguláveis ou constitutivos fortes podem ser usados. As sequências regulatórias também incluem terminadores, intensificadores e secretórios e outros sinais de tráfico.
[0037] Os plasmídeos incluídos nas bactérias imunoestimulantes podem estar presentes em número de cópias baixo ou número de cópias médio, por exemplo, por seleção de uma origem de replicação que resulta em número de cópias de médio-para-baixo, por exemplo, uma origem de replicação com número de cópias baixo. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que a atividade antitumoral e outras propriedades das bactérias são aprimoradas quando o plasmídeo está presente em número de cópias baixo para médio, em que número de cópias médio é menos do que 150 ou menos do que cerca de 150 e mais do que 20 ou cerca de 20 ou está entre 20 ou 25 e 150 cópias, e número de cópias baixo é menos do que 25 ou menos do que 20 ou menos do que cerca de 25 ou menos do que cerca de 20 cópias.
[0038] Essas bactérias imunoestimulantes podem ser modificadas de modo que as bactérias infectem preferencialmente células imunes residentes no tumor, e/ou o genoma das bactérias imunoestimulantes pode ser modificado que modo que elas induzam menos morte celular em células imunes residentes no tumor (piroptose diminuída), pela qual as bactérias imunoestimulantes se acumulam em tumores ou no microambiente tumoral ou em células imunes residentes no tumor.
[0039] Como discutido acima, o genoma das bactérias imunoestimulantes também é modificado de modo que as bactérias infectem preferencialmente células imunes, por exemplo, células imunes residentes no tumor, por exemplo, células mielóides, por exemplo, células que são CD45+, e/ou o genoma é modificado de modo que as bactérias induzam menos morte celular em células imunes residentes no tumor (piroptose diminuída) do que as bactérias não modificadas. Como resultado, as bactérias imunoestimulantes se acumulam, ou se acumulam em maior extensão do que aquelas sem as modificações, em tumores ou no microambiente tumoral ou em células imunes residentes no tumor, para, desse modo, liberar o produto terapêutico ou produtos codificados no plasmídeo. As bactérias podem ser um ou mais de flagelina- pagl3-, e nisbB-, e pode incluir outras dessas modificações como descritas nesse relatório descritivo. As bactérias podem ser auxotróficas para adenosina, e/ou pull- (purM) e/ou asdt.
[0040] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem incluir uma modificação do genoma bacteriano, pela qual as bactérias induzem menos morte celular em células imunes residentes no tumor; e/ou uma modificação do genoma bacteriano, pela qual as bactérias se acumulam mais eficazmente em tumores, no microambiente tumoral, ou em células imunes residentes no tumor, por exemplo, células CD45+ residentes no tumor, e células mielóides. Por exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem incluir deleções ou modificações de um ou mais genes ou óperons envolvidos na invasão de SPI-1 (e/ou SPI-2), pela qual as bactérias imunoestimulantes não invadem ou infectam células epiteliais. Exemplares de genes que podem ser deletados ou inativados são um ou mais de avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, invJ, iacP, iagB, spaO, spaP, spaQ, spaR, spay, orgA, orgB, orgC, prgH, prgl, prgJ, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB e sptP. A eliminação da habilidade para infectar células epiteliais também pode ser obtida por modificação por engenharia genética das bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo para conter knockouts ou deleções de genes que codificam proteínas envolvidas em invasão SPI-1-independente, por exemplo, um ou mais dos genes selecionados entre rck, pagN, hlyE, peft,
srgD, srgA, srgB e srgC. Similarmente, as bactérias imunoestimulantes podem incluir deleções em genes e/ou óperons em SPI-2, por exemplo, para modificar geneticamente as bactérias para escapar o vacúolo que contém Salmonella (SCV). Esses genes incluem, por exemplo, sifA, sseJ, sseL, sopD2, pipB2, sseF, sseG, spvB e steA.
[0041] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo também podem conter uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína imunoestimulante que, quando expressa em um indivíduo mamífero, confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral; a proteína imunoestimulante é codificada em um plasmídeo na bactéria sob o controle de um promotor eucariótico. Promotores exemplares incluem, sem limitação, um promotor de fator de alongamento-1 (EF1) alfa, ou um promotor UbC ou um promotor PGK, ou um promotor CAGG ou CAG.
[0042] Adicionalmente, o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que infecte preferencialmente células imunes residentes no tumor. Isso é obtido por deleção ou ruptura de genes bacterianos que participam da invasividade ou infectividade das bactérias, e/ou que participam na indução de morte celular. As bactérias são modificadas para infectar preferencialmente células imunes residentes no tumor, e/ou induzir menos morte celular em células imunes residentes no tumor do que em outras células que as bactérias podem infectar, do que bactérias não modificadas.
[0043] As bactérias imunoestimulantes também podem codificar um produto terapêutico, por exemplo, RNA inibidor (RNAi), proteínas imunoestimulantes como, por exemplo,
citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes, outras proteínas que aumentam a resposta imune em um indivíduo, e outros agentes antitumorais, que, quando expressos em um indivíduo mamífero, conferem ou contribuem para a imunidade antitumoral. O produto terapêutico é codificado em um plasmídeo na bactéria sob o controle de um promotor eucariótico. O genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que induza menos morte celular em células imunes residentes no tumor. O plasmídeo geralmente está presente em número de cópias baixo ou médio.
[0044] Também são fornecidas bactérias imunoestimulantes que codificam uma proteína imunoestimulante em um plasmídeo na bactéria sob o controle de um promotor eucariótico, que, quando expressa em um indivíduo mamífero, confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral. As bactérias imunoestimulantes podem ser modificadas para ter patogenicidade reduzida, pela qual a infecção de células epiteliais e/ou outras células não imunes é reduzida, em relação à bactéria sem a modificação. Estas incluem modificação do sistema de secreção do tipo 3 (T3SS) ou sistema de secreção do tipo 4 (T4SS), por exemplo, modificação da via de SPI-1 de Salmonella, como descrito e exemplificado nesse relatório descritivo. As bactérias ainda podem ser modificadas para induzir menos morte celular, por exemplo, por deleção ou ruptura do ácido nucleico que codifica lipídeo A palmitoiltransferase (pagP), o que reduz a virulência das bactérias.
[0045] O genoma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo pode ser modificado para aumentar ou promover infecção de células imunes,
particularmente células imunes no microambiente tumoral, por exemplo, células fagocíticas. Isso inclui a redução de infecção de células não imunes, por exemplo, células epiteliais, ou o aumento de infecção de células imunes. As bactérias também podem ser modificadas para piroptose diminuída em células imunes. Diversas modificações do genoma bacteriano podem fazer um ou ambos de aumento de infecção de células imunes e diminuição de piroptose. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo incluem essas modificações, por exemplo, deleções e/ou rupturas de genes envolvidos na via de SPI-1 T3SS, por exemplo, ruptura ou deleção de hilA, e/ou ruptura/deleção de genes que codificam flagelina, proteína Rod (PrgJ), proteína Needle (Prgl) e QseC.
[0046] As bactérias imunoestimulantes podem ser um ou mais de pull- (puriVt), nisbB-, pur,0-, flagelina- (PC IfljB), pagl3-, adrA:, Csg,D-, Qser e hilA: e, particularmente, flagelina- (fliC-/f-) e/ou pagl3- e/ou nisbBlpagP-. Por exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem incluir mutações no genoma, por exemplo, deleções ou rupturas gênicas que reduzem a toxicidade ou infectividade de células não imunes em um hospedeiro. Por exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem ser pagl3-. Como outro exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem ser hi1A- e/ou flagelina- (PC IfljB), e também podem ser pagl3-. Dessa forma, por exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem codificar uma proteína imunoestimulante, por exemplo, uma citocina, e as bactérias podem ser modificadas de modo que acumulem e expressem a citocina no microambiente tumoral (TME) liberando, dessa forma, um produto imunoterapêutico antitumoral no ambiente no qual ele possui atividade benéfica, e evitando efeitos colaterais adversos ou tóxicos da expressão em outras células/ambientes. O ácido nucleico que codifica a proteína imunoestimulante pode estar ligado operativamente para expressão de um ácido nucleico que codifica um sinal secretório, pelo qual, mediante expressão em um hospedeiro, a proteína imunoestimulante é secretada no microambiente tumoral.
[0047] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo incluem qualquer uma das cepas e bactérias descritas no Pedido U.S. co-pendente Nº de Série 16/033.187, ou Pedido Internacional publicado Nº PCT/US2018/041713 (publicado como WO 2019/014398), adicionalmente modificadas para expressar uma proteína imunoestimulante e/ou para infectar preferencialmente e/ou para serem menos tóxicas em células imunes no microambiente tumoral ou em células imunes residentes no tumor, como descrito e exemplificado nesse relatório descritivo.
[0048] As bactérias imunoestimulantes podem ser aspartato-semialdeído desidrogenase- (asd-), por exemplo, em virtude de ruptura ou deleção de todo ou de uma porção do gene endógeno que codifica aspartato-semialdeído desidrogenase (asd), pela qual o endógeno asd não é expresso. As bactérias imunoestimulantes podem ser modificadas para codificar aspartato-semialdeído desidrogenase (asd) em um plasmídeo sob o controle de um promotor bacteriano para o crescimento das bactérias in vitro, de modo que as bactérias terão replicação limitada in vivo.
[0049] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem codificar, em um plasmídeo, uma proteína imunoestimulante como um produto terapêutico. A proteína imunoestimulante pode ser uma citocina, por exemplo, uma quimiocina, ou uma molécula coestimulante. Exemplares de proteínas imunoestimulantes são IL-2, IL-7, IL-12p70 (IL-12p40 + IL-12p35), IL-15, IL-15 / complexo de cadeia alfa de IL-15R, IL-36 gama, IL-18, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5, proteínas que estão envolvidas ou que efetuam ou potencializam o recrutamento/persistência de células T, CD40, Ligante de CD40 (CD40L), OX40, Ligante de OX40 (OX40L), 4-1BB, Ligante de 4-1BB (4-1BBL), membros da família B7-CD28 e membros da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR).
[0050] As bactérias imunoestimulantes opcionalmente podem incluir uma sequência de nucleotídeos que codifica RNA inibidor (RNAi) que inibe, suprime ou rompe a expressão de um ponto de verificação imune. O RNAi pode ser codificado em um plasmídeo na bactéria. Os nucleotídeos que codificam a proteína imunoestimulante e, opcionalmente, um RNAi, podem estar em um plasmídeo presente em número de cópias baixo para médio.
[0051] As bactérias imunoestimulantes também podem codificar produtos terapêuticos, por exemplo, RNAi ou um cassete CRISPR que inibe, suprime ou rompe a expressão de um ponto de verificação imune ou outro alvo cuja inibição, supressão ou ruptura aumenta a resposta imune antitumoral em um indivíduo; o RNAi ou cassete CRISPR é codificado em um plasmídeo na bactéria. Outros produtos terapêuticos incluem, por exemplo, anticorpos que se ligam ao pontos de verificação imune para inibir suas atividades.
[0052] RNAi inclui todas as formas de RNA de fita dupla que podem ser usadas para silenciar a expressão de ácidos nucleicos visados. RNAi inclui shRNA, siRNA e microRNA (miRNA). Qualquer uma dessas formas pode ser intercambiada nas modalidades reveladas e descritas nesse relatório descritivo. Em geral, o RNAi é codificado em um plasmídeo na bactéria. Os plasmídeos podem incluir outros ácidos nucleicos heterólogos que codificam produtos de interesse que modulam ou adicionam atividades ou produtos à bactéria, ou outros desses produtos que podem modular o sistema imune de um indivíduo a ser tratado com a bactéria. Genes bacterianos também podem ser adicionados, deletados ou rompidos. Esses genes podem codificar produtos para o crescimento e replicação das bactérias, ou produtos que também modulam a resposta imune do hospedeiro às bactérias.
[0053] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo também podem ser auxotróficas para adenosina, ou para adenosina e adenina.
[0054] Espécies bacterianas para modificação como descrita nesse relatório descritivo, que carregam plasmídeos como descrito nesse relatório descritivo, incluem, sem limitação, por exemplo, cepas de Salmonella, Shigella, Listeria, E. coli, e Bifidobacteriae. Por exemplo, espécies incluem Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e Salmonella enteritidis. Espécies incluem, por exemplo, cepas de Salmonella, Shigella, E. coli, Bifidobacteriae, Rickettsia, Vibrio, Listeria, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Cholera, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella,
Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Bacillus, e Erysipelothrix, ou uma cepa atenuada destas ou uma cepa modificada destas de qualquer uma da lista de cepas bacterianas precedente. Outras espécies bacterianas adequadas incluem Rickettsia, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Franciesella, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Vibrio, Bacillus e Erysipelothrix. Por exemplo, Rickettsia Rikettsiae, Rickettsia prowazekii, Rickettsia tsutsugamuchi, Rickettsia mooseri, Rickettsia sibirica, Bordetella bronchiseptica, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas salmonicida, Franciesella tularensis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Citrobacter freundii, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus sornnus, Brucella abortus, Mycobacterium intracellulare, Legionella pneumophila, Rhodococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustelae, Vibrio cholerae, Bacillus subtilis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Yersinia enterocolitica, Rochalimaea quintana e Agrobacterium tumerfacium.
[0055] Salmonella é exemplificada nesse relatório descritivo e, particularmente, cepas de Salmonella typhimurium. A Salmonella pode ser uma espécie do tipo selvagem ou uma espécie atenuadas. Exemplares de algumas espécies atenuadas são as cepas designadas YS1646 (ATCC #202165) ou VNP20009. Other cepas incluem, RE88, SL7207, x 8429, x 8431, e x 8468. Exemplares de espécies do tipo selvagem ou não atenuadas incluem, por exemplo, a cepa do tipo selvagem depositada como ATCC 14028, ou uma cepa que possui todas as características de identificação de ATCC
14028. As modificações nesse relatório descritivo atenuam qualquer cepa restringindo as células que as bactérias podem infectar ou nas quais podem replicar.
[0056] Essas cepas podem ser adicionalmente modificadas para codificar proteínas imunoestimulantes e/ou proteínas imunomoduladoras. Por exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem codificar proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, que aumentam a resposta imune no microambiente tumoral. As bactérias imunoestimulantes também podem ser modificadas para infectar preferencialmente células imunes no microambiente tumoral ou para infectar células imunes residentes no tumor, e/ou para induzir menos morte celular nessas células imunes, como descrito nesse relatório descritivo. Sequências destas e descrições são fornecidas na descrição detalhada, exemplos e listagem de sequências. As bactérias imunoestimulantes podem ser derivadas de cepas de bactérias atenuadas, ou podem ficar atenuadas em virtude das modificações descritas nesse relatório descritivo, por exemplo, deleção de asd, pela qual a replicação é limitada in vivo.
[0057] Subentende-se que quando genes bacterianos são modificados e citados nesse relatório descritivo, eles são citados com relação à sua designação (nome) em espécies de Salmonella, que é exemplar de bactérias a partir das quais as bactérias imunoestimulantes podem ser produzidas. Aqueles habilitados na técnica reconhecem que outras espécies possuem proteínas correspondentes, mas que sua designação ou nome pode ser diferente do nome em Salmonella. A revelação genérica nesse relatório descritivo, no entanto, pode ser aplicada a outras espécies bacterianas. Por exemplo, como mostrado nesse relatório descritivo, a deleção ou inativação de flagelina (fliC IfljB) em Salmonella e/ou pagP resulta em colonização aumentada de tumores. Genes similares que codificam flagelos, ou funções similares para infecção, podem ser modificados em outras espécies bacterianas para obter colonização tumoral aumentada. Similarmente, a inativação/deleção de produtos bacterianos, por exemplo, os produtos de pagP e/ou msbB, como descrito nesse relatório descritivo, pode reduzir a ativação de complemento e/ou outras respostas inflamatórias aumentando, dessa forma, o direcionamento aos tumores, células imunes residentes no tumor e ao microambiente tumoral. Genes correspondentes em outras espécies que estão envolvidas na ativação da via de complemento ou de outra via inflamatória, podem ser deletados, como exemplificado nesse relatório descritivo para Salmonella.
[0058] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo codificam inibidores de vários genes que reduzem respostas imunes antitumorais, e/ou expressam genes e/ou produtos gênicos que contribuem para respostas imunes antitumorais e/ou produtos que estimulam o sistema imune, por exemplo, proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes e, dessa forma, são imunoestimulantes.
[0059] A auxotrofia para adenosina é imunoestimulante. Outros produtos terapêuticos que podem ser codificados nos plasmídeos são ácidos nucleicos, por exemplo, RNA inibidor (RNAi), por exemplo, shRNA ou microRNA ou siRNA, direcionados à ruptura ou inibição da expressão de TREX1, PD-L1, VISTA (o gene que codifica supressor de Ig do domínio-V da ativação de célula T), TGF-beta e CTNNB1 (o gene que codifica (3- catenina), entre outros, combinações destes, e combinações destes com quaisquer RNAis que inibem, suprimem ou rompem a expressão de outros genes imunossupressores cuja expressão é ativada ou aumentada por tumores ou pelo microambiente tumoral (TME). A expressão desses RNAs explora duas vias imunoestimulantes independentes, e leva à colonização tumoral aumentada em uma única terapia. Os efeitos dessa combinação são aumentados pelas cepas fornecidas nesse relatório descritivo que são auxotróficas para adenosina, o que fornece acúmulo ou recrutamento preferencial em microambientes tumorais imunossupressores ricos em adenosina. A redução de adenosina nesses TMEs aumenta ainda mais os efeitos imunoestimulantes. Essas combinações de traços em qualquer uma das cepas bacterianas conhecidas, ou que podem ser modificadas geneticamente para administração terapêutica, fornecem efeitos imunoestimulantes similares.
[0060] Entre os alvos está TGF-beta, que possui três isoformas: 1, 2 e 3. Entre os alvos está TGF-beta, particularmente a isoforma 1, e não as isoformas 2 e 3. As toxicidades estão associadas à inibição das isoformas 2 e 3. Por exemplo, a toxicidade para válvulas cardíacas está associada à inibição da isoforma 2. A isoforma 1 está presente na maioria dos cânceres (veja, por exemplo, banco de dados de TCGA). É vantajoso inibir apenas a isoforma 1. RNAi pode ser empregado vantajosamente para essa finalidade, pois ele pode ser projetado para reconhecer especificamente um alvo. Para TGF-beta, a inibição específica da isoforma 1 pode ser efetuada visando uma sequência única para a isoforma
1 que não está presente nas isoformas 2 ou 3, ou por seleção de uma sequência para visar as isoformas 1 e 3, e não 2. Também são fornecidas bactérias imunoestimulantes nas quais o plasmídeo codifica um shRNA ou microRNA que inibe, suprime ou rompe especificamente a expressão da isoforma 1 de TGF- beta, mas não a isoforma 2 de TGF-beta ou isoforma 3 de TGF- beta; ou o plasmídeo codifica um shRNA ou microRNA que inibe, suprime ou rompe especificamente a expressão de isoformas 1 e 3 de TGF-beta, mas não isoforma 2.
[0061] RNAi, por exemplo, uma ruptura gênica mediada por miRNA ou shRNA de PD-L1 pelas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, também aumenta a colonização de tumores, do TME e/ou de células imunes residentes no tumor. Foi demonstrado que o knockout de PD- L1 aumenta a infecção por S. typhimurium. Por exemplo, foi observada uma carga bacteriana pelo menos 10 vezes maior em camundongos com knockout de PD-L1 do que em camundongos do tipo selvagem, indicando que PD-L1 é protetor contra infecção por S. typhimurium (veja, por exemplo, Lee e cols. (2010) Immunol. 185: 2.442-2.449).
[0062] Bactérias imunoestimulantes modificadas geneticamente, por exemplo, as bactérias imunoestimulantes de S. typhimurium fornecidas nesse relatório descritivo, contêm múltiplas modalidades sinérgicas para induzir reativação imune de tumores frios para promover respostas imunes antígeno tumoral-específicas inibindo, ao mesmo tempo, vias de ponto de verificação imune que o tumor utiliza para subverter e evadir imunidade antitumoral durável. Estão incluídas em modalidades a auxotrofia de adenosina e a ruptura vascular aumentada. Esse aumento no direcionamento ao tumor por meio de auxotrofia de adenosina e ruptura vascular aumentada aumenta a potência, enquanto localiza a inflamação para limitar exposição à citocina sistêmica e as toxicidades autoimunes observadas com outras modalidades de imunoterapia.
[0063] As proteínas terapêuticas e outros produtos heterólogos, por exemplo, as proteínas imunoestimulantes, anticorpos e RNAs, são expressos em plasmídeos sob o controle de promotores que são reconhecidos pelo maquinário de transcrição da célula eucariótica hospedeira, por exemplo, promotores de RNA polimerase II (RNAP II) e RNA polimerase III (RNAP III). Promotores de RNAP III geralmente são expressos constitutivamente em um hospedeiro eucariótico; promotores de RNAP II podem ser regulados. Os produtos terapêuticos são codificados em plasmídeos expressos estavelmente pelas bactérias. Exemplares dessas bactérias são cepas de Salmonella, geralmente cepas atenuadas, atenuadas por passagem ou outros métodos, ou em virtude de modificações descritas nesse relatório descritivo, por exemplo, auxotrofia de adenosina. Exemplares de cepas de Salmonella são cepas de S. typhimurium modificadas que possuem um gene asd defeituoso. Essas bactérias podem ser modificadas para incluir o carregamento de um gene asd funcional no plasmídeo introduzido; isso mantém a seleção para o plasmídeo, de modo que um sistema de manutenção/seleção de plasmídeo à base de antibiótico não seja necessário. As cepas defeituosas para asd que não contêm um gene asd funcional em um plasmídeo são autolíticas no hospedeiro.
[0064] Os promotores podem ser selecionados para o ambiente da célula tumoral, por exemplo, um promotor expresso em um microambiente tumoral (TME), um promotor expresso em condições hipóxicas ou um promotor expresso em condições nas quais o pH é menos do que 7.
[0065] Plasmídeos podem estar presentes em muitas cópias ou menos. Isso pode ser controlado por seleção de elementos, por exemplo, da origem de replicação. Plasmídeos com número de cópias baixo, médio ou alto e origens de replicação são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem ser selecionados. Em modalidades das bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo, o plasmídeo pode estar presente em número de cópias baixo para médio, por exemplo, cerca de 150 ou 150 e menos cópias, até um número de cópias baixo, que é menos do que cerca de 25 ou cerca de 20 ou 25 cópias. Origens de replicação exemplares são aquelas derivadas de pBR322, p15A, pSC101, pMB1, colE1, colE2, pPS10, R6K, R1, RK2 e pUC.
[0066] Os plasmídeos podem incluir RNAi, de modo que o RNA iniba, suprima ou rompa a expressão de um ponto de verificação imune ou outro alvo e, adicionalmente, seus produtos. Os plasmídeos também podem incluir sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora (cytoLLO), um motivo CpG, uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS) e um elemento de ligação de gene-I induzível por ácido retinóico (RIG-I). A bactéria imunoestimulante que compreende ácido nucleico pode incluir um motivo CpG reconhecido pelo receptor do tipo toll 9 (TLR9). O motivo CpG pode ser codificado no plasmídeo. O motivo CpG pode ser incluído ou ser parte de um gene bacteriano que é codificado no plasmídeo. Por exemplo, o gene que compreende CpGs pode ser asd, codificado no plasmídeo. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem incluir um ou mais de um motivo CpG, um marcador selecionável do gene asd para manutenção do plasmídeo e uma sequência de direcionamento nuclear de DNA.
[0067] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem codificar duas ou mais moléculas de RNA diferentes que inibem, suprimem ou rompem a expressão de um ponto de verificação imune e/ou uma molécula de RNA que codifica um inibidor de um metabólito que é imunossupressor ou está em uma via imunossupressora.
[0068] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser aspartato-semialdeído desidrogenase- (asd-), o que permite o crescimento em meio suplementado com ácido diaminopimélico (DAP), mas limita a replicação in vivo quando administradas a indivíduos para tratamento. Essas bactérias serão autolimitantes, o que pode ser vantajoso para tratamento. A bactéria pode ser asd- em virtude de ruptura ou deleção de todo ou de uma porção do gene endógeno que codifica aspartato-semialdeído desidrogenase (asd), pela qual o asd endógeno não é expresso. Em outras modalidades, o gene que codifica aspartato- semialdeído desidrogenase pode ser incluído no plasmídeo para expressão in vivo.
[0069] Qualquer uma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo pode incluir ácido nucleico, geralmente no plasmídeo, que inclui um motivo CpG ou uma ilha CpG, em que o motivo CpG é reconhecido pelo receptor do tipo toll 9 (TLR9). Ácido nucleio que codifica motivos CpG ou ilhas são numerosos em procariotas e, dessa forma, o motivo CpG pode ser incluído ou ser uma parte de um gene bacteriano que é codificado no plasmídeo. Por exemplo, o gene bacteriano asd contém CpGs imunoestimulantes.
[0070] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser auxotróficas para adenosina, ou adenosina e adenina. Qualquer uma das bactérias nesse relatório descritivo pode ser tornada auxotrófica para adenosina, o que vantajosamente pode aumentar a atividade antitumoral, na medida em que adenosina se acumula em muitos tumores, e é imunossupressora.
[0071] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser deficientes em flagelina, em que a bactéria do tipo selvagem compreende flagelos. Elas podem ser tornadas deficientes em flagelina por ruptura ou deleção de todo ou uma parte do gene ou genes que codificam os flagelos. Por exemplo, são fornecidas bactérias imunoestimulantes que possuem deleções nos genes que codificam uma ou ambas de subunidades de flagelina fliC e fljB, pela qual as bactérias são deficientes em flagelos.
[0072] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem incluir ácido nucleico que codifica cytoLLO, que é uma proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora de secreção periplasmática, de modo que ela se acumula no citoplasma. Essa mutação é vantajosamente combinada com bactérias asct. LLO é uma hemolisina formadora de poros colesterol- dependente de Listeria monocytogenes que medeia o escape fagossomal de bactérias. Quando a cepa autolítica é introduzida em hospedeiros com tumores, por exemplo,
humanos, as bactérias são recolhidas por células imunes fagocíticas e entram no vacúolo. Nesse ambiente, a ausência de DAP impede a replicação bacteriana e resulta em autólise das bactérias no vacúolo. A lise então libera o plasmídeo e a LLO acumulada forma poros na membrana do vacúolo que contém colesterol e permite a liberação do plasmídeo no citosol da célula hospedeira.
[0073] As bactérias imunoestimulantes podem incluir uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS), por exemplo, uma DTS de SV40, codificada no plasmídeo.
[0074] As bactérias imunoestimulantes podem ter uma deleção ou modificação no gene que codifica endonuclease-1 (endA), pela qual a atividade de endA é inibida ou eliminada. Exemplares dessas são bactérias imunoestimulantes que contêm um ou mais de um motivo CpG, um marcador selecionável do gene asd para manutenção do plasmídeo e uma sequência de direcionamento nuclear de DNA.
[0075] As bactérias imunoestimulantes podem conter ácidos nucleicos no plasmídeo que codificam duas ou mais moléculas de RNA diferentes que inibem, suprimem ou rompem a expressão de um ponto de verificação imune ou um molécula de RNA que codifica um inibidor de um metabólito que é imunossupressor ou está em uma via imunossupressora. Os ácidos nucleicos que codificam o RNAi, por exemplo, shRNA ou miRNA ou siRNA, podem incluir a terminador transcricional após o ácido nucleico que codifica RNA. Em todas as modalidades, o RNAi codificado no plasmídeo nas bactérias imunoestimulantes pode ser RNAs hairpin curtos (shRNAs) ou microRNAs (miRNAs).
[0076] As bactérias imunoestimulantes podem adicionalmente codificar um produto terapêutico, por exemplo, RNAi que inibe, suprime, rompe ou silencia a expressão de pontos de verificação imune e outros alvos cuja inibição, supressão, ruptura ou silenciamento é imunoestimulante, ou um anticorpo ou outra proteína de ligação que inibe a expressão desses alvos.
Esses alvos incluem, sem limitação, um ou mais de exonuclease de reparo da extremidade três 1 (TREX1), PD-1, PD-L1 (B7-H1), VEGF, isoforma 1 de TGF-beta, beta-catenina, CTLA-4, PD-L2, PD-2, IDO1, IDO2, SIRPa, CD47, VISTA (B7-H5), LIGHT, HVEM, CD28, LAG3, TIM3, TIGIT, Galectina-9, CEACAM1, CD155, CD112, CD226, CD244 (2B4), B7-H2, B7-H3, ICOS, GITR, B7-H4, B7-H6, CD27, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD137 (4-1BB), CD200, CD272 (BTLA), CD160, CD39, CD73, receptor A2a, receptor A2b, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B, HLA-G, ILT- 2/4, OX40, OX-40L, KIR, TIM1, TIM4, STAT3, Estabilina-1 (CLEVER-1), DNase II e RNase H2. Por exemplo, qualquer uma das bactérias imunoestimulantes pode conter RNA que inibe, suprime ou rompe a expressão de um ou uma combinação de TREX1, PD-L1, VISTA, TGF-beta, por exemplo, isoforma 1 de TGF-beta ou isoformas 1 e 3, beta-catenina, SIRP-alfa, VEGF, RNase H2, DNase II, e CLEVER-1/Estabilina-1. Agrupamento de Diferenciação 47 (CD47), também conhecido como proteína associada à integrina (TAP), é um receptor transmembrana que pertence à superfamília de imunoglobulina de proteínas.
CD47 é expresso ubiquamente em células e serve como um marcador para autorreconhecimento, evitando a fagocitose.
CD47 medeia seus efeitos por meio de interações com várias outras proteínas, incluindo trombospondina (TSP) e proteína reguladora de sinal-alfa (SIRPa). A interação entre SIRPa em células fagocíticas e CD47 em células-alvo ajuda a assegurar que as células-alvo não sejam engolfadas pelas células fagocíticas. Certos cânceres cooptam o mecanismo de evasão imune baseado em CD47 de uma célula por aumento da expressão de CD47 na superfície celular das células de câncer evitando, dessa forma, a depuração pelo sistema imune. O direcionamento a células que expressam CD47 em um indivíduo resulta em toxicidades. A codificação de uma molécula inibidora de CD47, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, por exemplo, um nanobody (veja, por exemplo, Sockolosky e cols. (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113: E2646-E2654) em plasmídeos nas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo resulta em expressão do produto anti- CD47 no microambiente tumoral ou no tumor. Fragmentos de anticorpo anti-CD47 foram codificados em bactérias, por exemplo, E. coli que são administrados por via intratumoral (veja, por exemplo, Chowdhury e cols. (2019) Nature Medicine 25: 1.057-1.063). As bactérias nesse relatório descritivo possuem direcionamento e colonização aumentados do microambiente tumoral, tumores, e/ou células imunes residentes no tumor e, dessa forma, podem liberar mais eficazmente o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CD47. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser administradas sistemicamente para colonizar tumores e o microambiente tumoral.
[0077] São fornecidas bactérias imunoestimulantes nas quais o plasmídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codificam um produto terapêutico que inibe um ponto de verificação imune ou outro alvo de supressão imune. Alvos incluem, sem limitação, TREX1, PD-L1, VISTA, isoforma 1 de
TGF-beta, beta-catenina, SIRP-alfa, VEGF, RNase H2, DNase II, CLEVER-1/Estabilina-1 e CD47. Outros alvos a serem inibidos, suprimidos ou rompidos são selecionados entre qualquer um de CTLA-4, PD-L2, PD-1, PD-2, IDO1, IDO2, LIGHT, HVEM, CD28, LAG3, TIM3, TIGIT, Galectina-9, CEACAM1, CD155, CD112, CD226, CD244 (2B4), B7-H2, B7-H3, ICOS, GITR, B7-H4, B7-H6, CD27, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD137 (4- 1BB), CD200, CD272 (BTLA), CD160, CD39, CD73, receptor A2a, receptor A2b, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B, HLA-G, ILT- 2/4, OX40, OX-40L, KIR, TIM1, TIM4 e STAT3. Exemplares destes estão entre PD-L1 humano (ID. DE SEQ. N°: 31), beta-catenina humana (ID. DE SEQ. N°: 32), SIRPa humana (ID. DE SEQ. N°: 33), humano TREX1 (ID. DE SEQ. N°: 34), humano VISTA (ID. DE SEQ. N°: 35), isoforma 1 de TGF-beta humano (ID. DE SEQ. N°: 193) e VEGF humano (ID. DE SEQ. N°: 194). RNA pode visar ou conter uma sequência nos ácidos nucleicos do ponto de verificação imune apresentados em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 1-30, 36-40 e 195-217. Os plasmídeos em qualquer uma das bactérias imunoestimulantes também podem codificar uma sequência de nucleotídeos que é um agonista de gene I (RIG-I) induzível por ácido retinóico ou um elemento de ligação RIG-I.
[0078] As bactérias imunoestimulantes podem incluir uma ou mais das deleções em genes, por exemplo, as bactérias podem ser um ou mais de purt msbB-, purD-, flagelina- (fliC- IfljB-), pagP-, adrA-, CsgD- e hilA-. As bactérias imunoestimulantes podem ser msbB-. Por exemplo, as bactérias imunoestimulantes podem conter uma deleção de purl, uma deleção de msbB, uma deleção de asd, uma deleção de adrA, e opcionalmente, a CsgD deleção. Exemplares de deleções/modificações de genes bacterianos são qualquer um dos seguintes: uma ou mais de uma mutação em um gene que altera a biossíntese de lipopolissacarídeo, selecionado entre um ou mais de rfaL, rfaG, rfaH, rfaD, rfaP, rFb, rfa, msbB, htrB, firA, pagL, pagP, lpxR, arnT, eptA e lpxT; e/ou uma ou mais de uma mutação que introduz um gene suicida e é selecionado de um ou mais de sacB, nuk, hok, gef, kil ou phlA; e/ou uma ou mais de uma mutação que introduz um gene de lise bacteriana e é selecionado de um ou ambos de hly e cly; e/ou uma mutação em um ou mais fatores de virulência, selecionados entre IsyA, pag, prg, iscA, virG, plc e act; e/ou uma ou mais de uma mutação em um gene que modifica a resposta ao estresse, selecionado entre recA, htrA, htpR, hsp e groEL; e/ou uma mutação em min que rompe o ciclo celular; e/ou uma ou mais mutações em genes que rompem ou inativam funções regulatórias, selecionados entre cya, crp, phoP/phoQ e ompR.
[0079] A bactéria imunoestimulante pode ser uma cepa de Salmonella, Shigella, E. coli, Bifidobacteriae, Rickettsia, Vibrio, Listeria, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Cholera, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Bacillus ou Erysipelothrix, ou uma cepa atenuada destas ou cepa modificada destas de qualquer uma da lista de cepas bacterianas precedente.
Exemplares das bactérias imunoestimulantes são aquelas nas quais o plasmídeo contém um ou mais de uma sequência de ácidos nucleicos que codificam uma proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora (cytoLLO), um motivo CpG, uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS) e um elemento de ligação de gene-I induzível por ácido retinóico (RIG-I).
[0080] Outras bactérias imunoestimulantes exemplares incluem aquelas que são auxotróficas para adenosina, e compreendem: uma deleção no(s) gene(s) que codifica os flagelos; uma deleção em endA; um plasmídeo que codifica CytoLLO; uma sequência de localização nuclear; e um sistema de complementação de plasmídeo de asd; e codificam RNA que inibe, suprime ou rompe a expressão de um ponto de verificação imune ou outro alvo cuja inibição, supressão ou ruptura aumente a resposta imune antitumoral em um indivíduo.
[0081] Essas bactérias imunoestimulantes incluem cepas de Salmonella, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem de Salmonella typhimurium, por exemplo, a cepa depositada sob o Nº de Acesso ATCC 14028, ou uma cepa que possui todas as características de identificação da cepa depositada sob o Nº de Acesso em ATCC 14028. Outras cepas incluem, por exemplo, uma cepa atenuada de Salmonella typhimurium selecionada entre as cepas designadas como AST-100, VNP20009, ou cepas YS1646 (ATCC #202165), RE88, SL7207, x 8429, x 8431 e x 8468.
[0082] As bactérias imunoestimulantes podem conter um ou mais de uma deleção de purl, uma deleção de msbB, uma deleção de asd e uma deleção de adrA, além das modificações que aumentam o acúmulo em células tumorais, no TME e/ou em células imunes residentes no tumor, e/ou modificações que reduzem a morte da célula imune, e podem codificar uma proteína imunoestimulante ou outro produto terapêutico como descrito nesse relatório descritivo. As bactérias imunoestimulantes também podem incluir: uma ou mais de uma mutação em um gene que altera a biossíntese de lipopolissacarídeo selecionado entre um ou mais de rfaL, rfaG, rfaH, rfaD, rfaP, rFb, rfa, msbB, htrB, firA, pagL, pagP, lpxR, arnT, eptA e lpxT; e/ou uma ou mais de uma mutação que introduz um gene suicida e é selecionado entre um ou mais de sacB, nuk, hok, gef, kil e phlA; e/ou uma ou mais de uma mutação que introduz um gene de lise bacteriana e é selecionado entre um ou ambos de hly e cly; e/ou uma mutação em um ou mais fatores de virulência selecionados entre IsyA, pag, prg, iscA, virG, plc e act; e/ou uma ou mais mutações em um gene ou genes que modificam a resposta ao estresse selecionados entre recA, htrA, htpR, hsp e groEL; e/ou uma mutação em min que rompe o ciclo celular; e/ou uma ou mais mutações que rompem ou inativam funções regulatórias selecionadas entre cya, crp, phoP/phoQ e ompR.
[0083] As cepas podem ser um ou mais de msb_B-, asd-, hilA- e/ou flagelina- (MC IfljB) e/ou pag/3-. Em particular, as cepas são flagelina- (PC- IfljB-), por exemplo, flagelina- (fliC- IfljB-), msb_B-, purl- e, opcionalmente, asd- e/ou HilA- . As bactérias podem ser auxotróficas para adenosina, ou adenosina e adenina. Os produtos terapêuticos, por exemplo, RNAi e/ou uma proteína imunoestimulante, e/ou anticorpo ou fragmento deste, são expressos sob o controle de um promotor reconhecido pelo hospedeiro, por exemplo, um promotor de RNAP III ou um promotor de RNAP II, como descrito nesse relatório descritivo. A bactéria imunoestimulante pode ser uma cepa de Salmonella, Shigella, E. coli, Bifidobacteriae, Rickettsia, Vibrio, Listeria, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Cholera, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Bacillus, ou Erysipelothrix, ou uma cepa atenuada destas ou cepa modificada destas de qualquer uma da lista de cepas bacterianas precedente. Geralmente, a cepa é uma que é atenuada no hospedeiro. Cepas de Salmonella, por exemplo, S. typhimurium, são exemplares das bactérias. Cepas exemplares incluem cepas de Salmonella typhimurium derivadas de cepas designadas como AST100, VNP20009 ou cepas YS1646 (ATCC #202165), RE88, SL7207, x 8429, x 8431, x 8468, e a cepa do tipo selvagem ATCC #14028.
[0084] São fornecidas composições que contêm as bactérias imunoestimulantes. Essas composições contêm as bactérias e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. As bactérias imunoestimulantes incluem qualquer uma das descritas nesse relatório descritivo ou em patentes/pedidos incorporados nesse relatório descritivo ou conhecidos por aqueles habilitados na técnica. As bactérias codificam um produto terapêutico, geralmente um produto anticâncer como, por exemplo, um inibidor de um ponto de verificação imune ou uma proteína imunoestimulante que aumenta a atividade antitumoral no microambiente tumoral ou no tumor, por exemplo, uma citocina ou quimiocina ou molécula coestimulante. Os genomas das bactérias podem ser modificados para ter infectividade aumentada de células imunes, e/ou infectividade reduzida de células não imunes, e/ou habilidade reduzida para induzir morte celular de células imunes. Dessa forma, as bactérias são modificadas como descrito nesse relatório descritivo para se acumular em tumores ou no microambiente tumoral ou em células imunes residentes no tumor, e/ou para liberar proteínas imunoestimulantes e outros produtos terapêuticos que promovem atividade antitumoral. As bactérias imunoestimulantes podem adicionalmente conter um plasmídeo que codifica um produto terapêutico anticâncer, por exemplo, RNAi, por exemplo, miRNA ou shRNA, ou um cassete CRISPR, que visam um ponto de verificação imune, ou de algum outro modo aumentam a atividade antitumoral das bactérias.
[0085] Uma dose única é terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma doença ou distúrbio no qual a estimulação imune efetua o tratamento. Exemplares dessas estimulações são uma resposta imune, que inclui, sem limitação, um ou ambos de uma resposta imune específica e uma resposta imune não-específica, respostas imunes tanto específicas quanto não-específicas, uma resposta inata, uma resposta imune primária, imunidade adaptativa, uma resposta imune secundária, uma resposta imune de memória, ativação de célula imune, proliferação de célula imune, diferenciação de célula imune e expressão de citocina.
[0086] São fornecidas composições farmacêuticas que contêm qualquer uma das bactérias imunoestimulantes. Bem como o são usos destas para tratamento de cânceres, e métodos de tratamento de câncer. Métodos e usos incluem o tratamento de um indivíduo que possui câncer, que compreende a administração de uma bactéria imunoestimulante ou da composição farmacêutica a um indivíduo, por exemplo, um humano. Um método de tratamento de um indivíduo que possui câncer, que compreende a administração de uma bactéria imunoestimulante, é fornecido. Métodos e usos incluem terapia combinada, na qual um segundo agente ou tratamento anticâncer é administrado. O segundo agente anticâncer é um agente quimioterápico que resulta em DNA citosólico, ou radioterapia, ou um anti-inibidor de ponto de verificação imune, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1, ou anti-PD-L1 ou anti-CTLA4, ou CAR-células T ou outras células terapêuticas, por exemplo, células-tronco, células TIL e células modificadas para terapia contra o câncer. A terapia combinada também pode incluir anticorpos anti-VEGF ou anti-VEGFR, ou anti-VEGFR2, ou fragmentos destes, ou um anticorpo anti-IL6 ou fragmento deste, ou terapia com vírus oncolítico, ou uma vacina contra o câncer. A administração pode ser por qualquer via convencional, por exemplo, parenteral, e pode incluir agentes adicionais que podem facilitar ou aumentar a liberação. A administração pode ser oral ou retal ou por aerossol no pulmão, ou pode ser por via intratumoral, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea.
[0087] Cânceres incluem tumores sólidos e malignidades hematológicas, por exemplo, sem limitação, linfoma, leucemia, câncer gástrico, e câncer da mama, coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, cólon-reto, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, ossos, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos,
cérvice e fígado.
[0088] As bactérias imunoestimulantes podem ser formuladas em composições para administração, por exemplo, suspensões. Elas podem ser secas e armazenadas como pós. Combinações das bactérias imunoestimulantes com outros agentes anticâncer também são fornecidas.
[0089] Terapias combinadas para tratamento de cânceres e malignidades são fornecidas. As bactérias imunoestimulantes podem ser administradas antes ou concomitantemente com outras terapias contra o câncer, incluindo radioterapia, quimioterapias, particularmente quimioterapias genotóxicas que resultam em DNA citosólico, e imunoterapias, por exemplo, anticorpos anti-inibidor do ponto de verificação, incluindo anticorpos anti-PD-1, anticorpos anti-PD-L1 e anticorpos anti-CTLA4, e outras imunoterapias desse tipo. Outras terapias contra o câncer também incluem anticorpos anti- VEGF, anti-VEGFR, anti-VEGFR2 ou anti-IL6, ou fragmentos destes, vacinas contra o câncer e vírus oncolíticos.
[0090] A administração pode ser por qualquer via adequada, incluindo sistêmica ou local ou tópica, por exemplo, parenteral incluindo, por exemplo, oral ou retal ou por aerossol no pulmão, ou por via intratumoral, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea.
[0091] Também são fornecidos métodos para o aumento da colonização de tumores, células imunes residentes no tumor, e/ou do microambiente tumoral por uma bactéria imunoestimulante. Os métodos incluem, por exemplo, a modificação do genoma de uma bactéria para tornar a bactéria flagelina- (fliC-IfljB) e/ou pagl3-. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que essa modificação (ou modificações)
aumenta surpreendentemente a colonização no tumor/microambiente tumoral/célula imune residente no tumor.
[0092] Os termos e expressões que são empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há a intenção no uso desses termos e expressões para excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções destas, mas reconhece-se que várias modificações são contempladas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0093] A Figura 1 retrata uma representação esquemática do processo usado para deletar o gene asd da cepa YS1646. O gene asd de S. typhimurium cepa YS1646 foi deletado usando sistema de recombinação Red derivado de lambda como descrito em Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-
6.645 (2000)).
[0094] A Figura 2 retrata os níveis de colonização tumoral em tumores injetados e distais após administração IT de AST-104. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com tumores subcutâneos duplos no flanco CT26 (2 x 105 células) nos flancos direito e esquerdo (n = 10 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IT no flanco direito com 5 x 106 CFU da cepa YS1646 que contém um plasmídeo de shRNA de TREX1(AST-104). Em 35 dias pós-implantação do tumor (12 dias após a última dose de AST-104), três camundongos foram sacrificados, e tumores injetados e distais foram homogeneizados (GentleMACsTM, Miltenyi Biotec) e plaqueados em placas LB para enumerar o número de unidades formadoras de colônia (CFU) por grama de tecido tumoral. A figura retrata a CFU média por grama de tecido, ± DP.
[0095] A Figura 3 retrata que o plasmídeo embaralhado CpG possui propriedades imunoestimulantes antitumorais. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5x 106 CFU da cepa YS1646 (AST-100), ou da cepa YS1646 que contém o plasmídeo de controle de shRNA embaralhado (AST-103), ou controle de PBS, nos dias indicados pelas setas. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2 (comprimento x largura). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. TGI é calculado como 1-(volume médio do tumor de teste/volume médio do tumor de controle) x 100. A figura retrata o crescimento tumoral médio de cada grupo, ± SEM. **p < 0,01, teste-t de Student.
[0096] A Figura 4 retrata uma representação esquemática do processo usado para deletar o gene fliC. O gene flic foi deletado do cromossomo de S. typhimurium cepa AST-101 (cepa YS1646 deletada de asd) usando o sistema de recombinação Red derivado de lambda como descrito em Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-6.645 (2000)).
[0097] A Figura 5 retrata que a cepa de deleção de flagelina cresce normalmente em LB. A figura retrata o crescimento de cepas AST-108 ASD (pATI-shTREX1) e AST-112 ASD/FLG (pATI-shTREX1) a 37°C em caldo LB, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices).
[0098] A Figura 6 retrata que o knockout de flagelina aumenta a eficácia antitumoral. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asdlfljB/fliC que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST-113), ou cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST-110), ou controle de PBS, nos dias indicados pelas setas. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2(comprimento x largura). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. TGI foi calculado como 1-(volume médio do tumor de teste/volume médio do tumor de controle) x 100. A figura retrata o crescimento tumoral médio de cada grupo, ± SEM. * p < 0,05, teste-t de Student.
[0099] A Figura 7 retrata que o knockout de flagelina mostra uma assinatura de IFN-gama aumentada. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asdlfljB/fliC que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST- 113), ou cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST-110), ou controle de PBS. Os camundongos foram sangrados 6 horas após a primeira dose e citocinas séricas sistêmicas testadas por dispositivo Luminex 200 (Luminex Corporation) e arranjo citométrico de glóbulos em camundongo (BD Bead Array, FACS Fortessa, software FCAP, todos BD Biosciences). *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, teste-t de Student.
[00100] A Figura 8 retrata que flagelina náo é necessária para colonização tumoral. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asol/fljB/fliC que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST-113), ou cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST-110), ou controle de PBS. Em 35 dias (D35) pós-implantação do tumor (12 dias após a última dose de terapia com Salmonella modificada geneticamente), três camundongos por grupo foram sacrificados, e os tumores foram homogeneizados (GentleMACsTM, Miltenyi Biotec) e plaqueados em placas LB para enumerar o número de unidades formadoras de colônia por grama de tecido tumoral. A figura retrata as unidades formadoras de colônia (CFU) médias por grama de tecido, ± DP.
[00101] A Figura 9 retrata que uma cepa que expressa cytoLLO cresce normalmente in vitro. A figura retrata o crescimento de cepas AST-110 (YS1646 com deleção de asd contendo (pATI-shTREX1)) e AST-115 (YS1646 com deleção de asd e knock-in de cassete de expressão de cytoLLO contendo (pATI-shTREX1)) a 37°C em caldo LB, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices).
[00102] A Figura 10 retrata que AST-115 (cepa com knockout de ASD + knock-in de CytoLLO que carrega plasmídeo shTREX1) demonstra eficácia potente em dose única em um modelo de tumor murídeo CT26. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5x 106 CFU de AST-115 (YS1646 com deleção de asd e knock-in do cassete de expressão de cytoLLO no lócus asd que contém (pATI- shTREX1)), ou controle de PBS, nos dias indicados pelas setas. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2(comprimento x largura). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. TGI foi calculado como 1-(volume médio do tumor de teste/volume médio do tumor de controle) x 100. A figura retrata o crescimento tumoral médio de cada grupo, ± SEM. **p < 0,01, teste-t de Student.
[00103] A Figura 11 retrata que a cepa YS1646 exige níveis de adenosina no microambiente tumoral para crescimento. O crescimento de cepas YS1646 (purl- I msbB) e da cepa parental do tipo selvagem ATCC14028 a 37°C em caldo LB é mostrado, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices).
[00104] A Figura 12 retrata que cepas modificadas geneticamente de ASD, FLG e CytoLLO exigem adenosina elevada para o crescimento. O crescimento de cepas AST-117 (YS1646 Aasd contendo um plasmídeo shTREX-1 com cópia baixa), AST- 118 (YS1646 Aasd/ AfliC/AfljB contendo um plasmídeo shTREX- 1 com cópia baixa), e AST-119 (YS1646 Aasd:LLO contendo um plasmídeo shTREX-1 com cópia baixa) a 37°C em caldo LB é mostrado, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices).
[00105] A Figura 13 retrata que uma cepa com um plasmídeo que codifica asd com origem de replicação com cópia baixa possui cinética de crescimento superior em relação a uma cepa com um plasmídeo que codifica asd com origem de replicação com cópia alta. O crescimento de cepas YS1646, AST-117 (YS1646 Aasd contendo um plasmídeo shTREX-1 com cópia baixa com um gene asd funcional), AST-104 (YS1646 contendo um plasmídeo shTREX-1 de pEQ com cópia baixa sem um gene asd), e AST-110 (YS1646 Aasd contendo um plasmídeo shTREX-1 de pATI com cópia alta com um gene asd funcional) a 37°C em caldo LB é mostrado, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices).
[00106] A Figura 14 retrata que uma cepa com um plasmídeo asd com cópia baixa é mais adaptado do que uma cepa com um plasmídeo asd com cópia alta em células tumorais de camundongo. O crescimento intracelular de cepas AST-117 (YS1646 Aasd contendo um plasmídeo shTREX-1 com cópia baixa com um gene asd funcional) e AST-110 (YS1646 Aasd contendo um plasmídeo shTREX-1 de pATI com cópia alta com um gene asd funcional) é mostrado em células de melanoma de camundongo B16F.10 e células de carcinoma do cólon de camundongo CT26. 5 x 105 células em uma placa de 24 poços foram infectadas com as cepas de S. typhimurium em uma MOI de 5. Após 30 minutos de infecção, o meio foi substituído com meio contendo gentamicina para matar bactérias extracelulares. Nos pontos do tempo indicados, monocamadas de células foram lisadas por choque osmótico e os lisados de células foram diluídos e plaqueados em ágar LB para enumerar CFU.
[00107] A Figura 15 retrata que, in vivo, sistemas de complementação de gene asd resultam em retenção de plasmídeos em tumores infectados por S. typhimurium. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo shTREX1 de pATI (AST-110) ou da YS1646 contendo um plasmídeo shTREX-1 de pEQ sem um gene asd (AST- 104). Em 35 dias pós-implantação do tumor (12 dias após a última dose de terapia com Salmonella modificada geneticamente), três camundongos por grupo foram sacrificados, e os tumores foram homogeneizados usando um homogeneizador GentleMACsTM (Miltenyi Biotec) e plaqueados em placas de ágar LB ou placas de ágar LB com 50 µg/ml de canamicina. A figura retrata a percentagem de CFU resistentes à canamicina em homogeneizados de tecido tumoral, ± DP.
[00108] A Figura 16 retrata que a eficácia terapêutica de uma cepa que contém um plasmídeo com sistema de complementação de gene asd e shTREX1 (AST-110) é aumentada. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo pATI-shTREX1 (AST-110) ou da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo pATI-embaralhado (AST-109), ou da cepa YS1646 que contém um plasmídeo pEQ- shTREX-1 sem um gene asd (AST-104), ou controle de PBS, nos dias indicados pelas setas. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2(comprimento x largura2). Os camundongos foram sacrificados quando tamanho do tumor alcança > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. TGI foi calculado como 1-(volume médio do tumor de teste/volume médio do tumor de controle) x 100. A figura retrata o crescimento tumoral médio de cada grupo, ± SEM.
[00109] A Figura 17 retrata que uma cepa que contém um plasmídeo shTREX1 com cópia baixa (AST-117) possui propriedades antitumorais superiores, comparada com uma cepa que contém um plasmídeo com cópia alta (AST-110). Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo pATI-shTREX1 com uma origem de replicação com número de cópias alto (AST-110) ou da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo pATI-shTREX1 com uma origem de replicação com número de cópias baixo (AST-117), ou controle de PBS, nos dias indicados pelas setas. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2(comprimento x largura2). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. TGI foi calculado como 1-(volume médio do tumor de teste/volume médio do tumor de controle) x 100. A figura retrata o crescimento tumoral médio de cada grupo, ± SEM. * p < 0,05, teste-t de Student.
[00110] As Figuras 18A e 18B retratam que a cepa com plasmídeo com cópia baixa AST-117 coloniza tumores melhor e possui a proporção de colonização do tumor para o baço maior do que a cepa com plasmídeo com cópia alta AST-110. Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo pATI-shTREX1 com uma origem de replicação com número de cópias alto (AST-110) ou da cepa com knockout de asd que contém o plasmídeo pATI-shTREX1 com uma origem de replicação com número de cópias baixo (AST- 117). Em 35 dias pós-implantação do tumor (12 dias após a última dose de terapia com Salmonella modificada geneticamente), 3 camundongos por grupo foram sacrificados, e os tumores foram homogeneizados usando um homogeneizador GentleMACsTM (Miltenyi Biotec) e plaqueados em placas LB para enumerar o número de CFU por grama de tecido tumoral. A Fig. 18A retrata a CFU média por grama de tecido tumoral, ± DP. A Fig. 18B retrata as proporções de colonização do tumor para o baço.
[00111] A Figura 19 retrata que a cepa autolítica (AST- 120) não pode crescer na ausência de DAP. A figura retrata o crescimento da cepa Aasd:cytoLLO que contém um plasmídeo pEQU6-shTREX1 que não contém um gene asd (AST-120) ao longo do tempo em caldo LB isoladamente, ou em caldo LB suplementado com 50 µg/ml de DAP, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices).
[00112] A Figura 20 retrata a atividade antitumoral da cepa autolítica (AST-120). Camundongos BALB/c (6-8 semanas de idade) foram implantados com um tumor subcutâneo único no flanco CT26 (2 x 105 células) (n = 9 por grupo). Camundongos com tumores estabelecidos foram injetados IV com 5 x 106 CFU da cepa Aasd: cytoLLO que contém um plasmídeo pEQU6-shTREX1 que não contém um gene asd (AST-120), ou controle de PBS, nos dias indicados pelas setas. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2(comprimento x largura). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. TGI foi calculado como 1-(volume médio do tumor de teste/volume médio do tumor de controle) x 100. A figura retrata o crescimento tumoral médio de cada grupo, ± SEM. * p < 0,05, teste-t de Student.
[00113] A Figura 21 retrata proteínas que atuam a jusante de HilA na via de SPI-1.
[00114] A Figura 22 retrata o SPI-1 T3SS e a classificação funcional de proteínas codificadas por SPI-1 (adaptada de Kimbrough e Miller (2002) Microbes Infect. 4 (1): 75-82).
[00115] A Figura 23 retrata os efeitos do SPI-1 T3SS sobre macrófagos. Flagelina é detectada por NAIP5/6 e as proteínas Rod e Needle são detectadas por NAIP1/2, o que leva à ativação do inflamassoma de NLRC4 e caspase-1, resultando na liberação de IL-10 e IL-18, e piroptose.
[00116] A Figura 24 retrata a entrada mediada por T3SS- 1 da bactéria para dentro da célula epitelial e do SCV.
[00117] A Figura 25 retrata o reconhecimento de flagelina bacteriana por TLR5 e LPS por TLR4, e o papel que flagelina, LPS, HilA, Prgl e PrgJ desempenham na infecção da célula hospedeira, liberação de citocina, ativação de inflamassoma e piroptose.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00118] DESCRIÇÃO GERAL A. DEFINIÇÕES; B. VISÃO GERAL DAS BACTÉRIAS IMUNOESTIMULANTES; C. IMUNOTERAPÊUTICOS PARA CÂNCER;
1. Imunoterapias;
2. Imunoterapias adotivas;
3. Vacinas contra o câncer e vírus oncolíticos; D. IMUNOTERAPIA BACTERIANA CONTRA O CÂNCER;
1. Terapias bacterianas;
2. Comparação das respostas imunes às bactérias e vírus;
3. Terapia com Salmonella; a. Bactérias com tropismo para tumores; b. Salmonella enterica Sorovar Typhimurium; c. Atenuação bacteriana; i. Mutantes msh13-; ii. Mutantes purl-; iii. Combinações de mutações atenuantes; iv. VNP20009 e outras cepas atenuadas e do tipo selvagem de S. typhimurium; v. S. typhimurium modificada geneticamente para liberar macromoléculas;
4. Aprimoramentos de bactérias imunoestimulantes para aumentar o índice terapêutico; a. Deleção do gene asd;
b. Auxotrofia de adenosina; c. Cepas deficientes em flagelina; d. Salmonella modificada geneticamente para escapar do Vacúolo que Contém Salmonella (SCV); e. Deleções em genes de Salmonella necessários para formação de biofilme; f. Deleções em genes na via biossintética de LPS; g. Deleções de genes de SPI-1 e SPI-2; h. Mutações de endonuclease (endA) para aumentar a liberação de plasmídeo; i. Inibição de RIG-I; j. Inibição de DNase II; k. Inibição de RNase H2; l. Inibição de Estabilina-1/CLEVER-1;
5. Proteínas imunoestimulantes;
6. Modificações que aumentam a captação de bactérias Gram-negativas, por exemplo, Salmonella, por células imunes e reduzem a morte de células imunes;
7. Condições de cultura bacteriana; E. ATENUAÇÃO E COLONIZAÇÃO BACTERIANAS;
1. Deleção de flagelina (MCI fij13);
2. Deleção de genes na via biossintética de LPS;
3. Colonização; F. CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS EXEMPLARES QUE CODIFICAM PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS;
1. Proteínas imunoestimulantes;
2. Anticorpos e fragmentos de anticorpo;
3. RNAs interferentes (RNAi); a. shRNA; b. MicroRNA;
4. Origem de replicação e número de cópias de plasmídeo;
5. Motivos CpG e ilhas CpG;
6. Componentes de manutenção/seleção de plasmídeo;
7. Promotores de RNA Polimerase;
8. Sequências que visam DNA nuclear;
9. CRISPR; G. BACTÉRIAS IMUNOESTIMULANTES DIRECIONADAS AO TUMOR CONTÊM RNAI CONTRA GENES-ALVO IMUNES EXEMPLARES PARA ESTIMULAR IMUNIDADE ANTITUMORAL;
1. TREX1;
2. PD-L1;
3. VISTA;
4. SIRPa;
5. β-catenina;
6. TGF-I3;
7. VEGF;
8. Alvos do ponto de verificação imune exemplares adicionais; H. PRODUÇÃO, COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS;
1. Fabricação; a. Fabricação de banco de células; b. Fabricação de substância farmacológica; c. Fabricação de produto farmacológico;
2. Composições;
3. Formulações; a. Líquidos, injetáveis, emulsões; b. Formulações secas termoestáveis;
4. Composições para outras vias de administração;
5. Dosagens e administração;
6. Embalagem e artigos manufaturados;
I. MÉTODOS DE TRATAMENTO E USOS;
1. Tumores;
2. Administração;
3. Monitoramento; J. EXEMPLOS. A. DEFINIÇÕES
[00119] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados que são comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual a invenção (ou invenções) pertence. Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos publicados e publicações, sequências do GenBank, bancos de dados, websites e outros materiais publicados citados ao longo de toda a revelação nesse relatório descritivo, salvo observação em contrário, são incorporados por referência em sua totalidade. Caso haja várias definições para termos nesse relatório descritivo, aquelas nessa seção prevalecem. Quando é feita referência a uma URL ou a outro identificador ou endereço desse tipo, subentende-se que esses identificadores podem mudar e informação particular na Internet pode ir e vir, mas informação equivalente pode ser encontrada por pesquisa na Internet. Referência a esta evidencia a disponibilidade e disseminação pública dessa informação.
[00120] Como usadas nesse relatório descritivo, bactérias terapêuticas são bactérias que efetuam terapia, por exemplo, terapia contra o câncer ou antitumoral, quando administradas a um indivíduo, por exemplo, um humano.
[00121] Como usadas nesse relatório descritivo, bactérias imunoestimulantes são bactérias terapêuticas que,
quando introduzidas em um indivíduo, se acumulam em tecidos e células imunoprivilegiados, por exemplo, tumores, e replicam e/ou expressam produtos que são imunoestimulantes ou que resultam em imunoestimulação. Por exemplo, as bactérias imunoestimulantes são atenuadas no hospedeiro em virtude de toxicidade ou patogenicidade reduzida e/ou em virtude de produtos codificados que reduzem a toxicidade ou patogenicidade, na medida em que as bactérias imunoestimulantes não podem replicar e/ou expressar produtos (ou possuem replicação/expressão de produto reduzida), exceto primariamente em ambientes imunoprivilegiados. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo são modificadas para codificar um produto ou produtos ou exibir um traço ou propriedade que as torna imunoestimulantes. Esses produtos, propriedades e traços incluem, sem limitação, por exemplo, pelo menos um de: uma proteína imunoestimulante, por exemplo, uma citocina, quimiocina ou molécula coestimulante; RNAi, por exemplo, siRNA (shRNA e microRNA), ou CRISPR, que visa, rompe ou inibe um gene do ponto de verificação imune, por exemplo, TREX1 e/ou PD-L1; ou um inibidor de um ponto de verificação imune, por exemplo, um anticorpo anti-ponto de verificação imune. Bactérias imunoestimulantes também podem incluir uma modificação que torna a bactéria auxotrófica para um metabólito que é imunossupressor ou que está em uma via imunossupressora, por exemplo, adenosina.
[00122] Como usadas nesse relatório descritivo, as designações de cepas VNP20009 (veja, por exemplo, Publicação de Pedido Internacional PCT Nº WO 99/13053; veja também Patente U.S. Nº 6.863.894) e YS1646 e 41.2.9 são usadas de forma intercambiável e cada uma se refere à cepa depositada com a “American Type Culture Collection” (ATCC) e designada o Nº de Acesso 202165. VNP20009 é uma cepa modificada atenuada de Salmonella typhimurium, que contém deleções em msbB e purl, e foi gerada a partir da cepa do tipo selvagem ATCC #14028.
[00123] Como usadas nesse relatório descritivo, as designações de cepas YS1456 e 8.7 são usadas de forma intercambiável e cada uma se refere à cepa depositada com a “American Type Culture Collection” e designada o Nº de Acesso 202164 (veja, Patente U.S. Nº 6.863.894). Como usada nesse relatório descritivo, uma origem de replicação é uma sequência de DNA na qual a replicação é iniciada em um cromossomo, plasmídeo ou vírus. Para DNA pequeno, incluindo plasmídeos bacterianos e pequenos vírus, uma única origem é suficiente.
[00124] A origem de replicação determina o número de cópias do vetor, o que depende da origem de replicação selecionada. Por exemplo, se o vetor de expressão é derivado do plasmídeo com número de cópias baixo pBR322, ele está entre cerca de 25-50 cópias/célula, e se derivado do plasmídeo com número de cópias alto pUC, ele pode ser 150.200 cópias/célula.
[00125] Como usado nesse relatório descritivo, número de cópias médio de um plasmídeo em células é cerca de ou é 150 ou menos do que 150, o número de cópias baixo é 15-30, por exemplo, 20 ou menos do que 20. Número de cópias baixo a médio é menos do que 150. Número de cópias alto é maior do que 150 cópias/célula.
[00126] Como usado nesse relatório descritivo, um motivo
CpG é um padrão de bases que incluem um CpG central não metilado (“p” se refere à ligação fosfodiéster entre nucleotídeos C e G consecutivos) circundado por pelo menos uma base que flanqueia (no lado 3' e no lado 5') do CpG central. Um oligodesoxinucleotídeo CpG é um oligodesoxinucleotídeo que tem pelo menos cerca de dez nucleotídeos de comprimento e inclui um CpG não metilado. Pelo menos o C do 5' CG 3' é não metilado.
[00127] Como usada nesse relatório descritivo, uma sequência de ligação a RIG-I se refere a uma estrutura 5’- trifosfato (5'ppp) diretamente, ou que é sintetizada por RNA pol III de uma sequência poli(dA-dT) que, em virtude de interação com RIG-I, pode ativar IFN tipo I por meio da via de RIG-I. O RNA inclui pelo menos quatro ribonucleotídeos A (A-A-A-A); ele pode conter 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais. A sequência de ligação a RIG-I é introduzida em um plasmídeo na bactéria para transcrição no poli-A.
[00128] Como usada nesse relatório descritivo, uma proteína imunoestimulante é uma que confere, promove, aprimora ou aumenta respostas imunes, particularmente no microambiente tumoral, por exemplo, em tumores e/ou em células imunes residentes no tumor. Proteínas imunoestimulantes incluem, sem limitação, citocinas, quimiocinas, moléculas coestimulantes, e outras proteínas e produtos reguladores imunes. Dessa forma, como usada nesse relatório descritivo, uma “proteína imunoestimulante” é uma proteína que confere, exibe ou promove uma resposta imune antitumoral no microambiente tumoral. Exemplares dessas proteínas são citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes, por exemplo, sem limitação, GM-CSF, IL-2,
IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-12p70 (IL-12p40 + IL- 12p35), complexo IL-15/cadeia alfa de IL-15R, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5, moléculas envolvidas no recrutamento/persistência potencial de células T, CD40, ligante de CD40 (CD40L), OX40, ligante de OX40 (OX40L), 4- 1BB, ligante de 4-1BB (4-1BBL), membros da família B7-CD28, antagonistas de CD47, antagonistas do polipeptídeo de TGF- beta, e membros da superfamília do TNFR.
[00129] Como usadas nesse relatório descritivo, “citocinas” são uma categoria ampla e pouco rígida de pequenas proteínas (-5-20 kDa) que são importantes na sinalização celular. Citocinas incluem quimiocinas, interferons, interleucinas, linfocinas e fatores de necrose tumoral. Citocinas são moléculas de sinalização celular que ajudam na comunicação célula-a-célula em respostas imunes, e estimulam o movimento das células em direção aos locais de inflamação, infecção e trauma. Como usadas nesse relatório descritivo, “quimiocinas” se referem às citocinas quimioatraentes (quimiotáticas) que se ligam aos receptores de quimiocina e incluem proteínas isoladas de fontes naturais, bem como aquelas feitas sinteticamente, como por meios recombinantes ou por síntese química. Quimiocinas exemplares incluem, sem limitação, IL-8, IL-10, GCP-2, GRO- a, GRO-0, GRP-γ, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG (CXCL9), CXCL10, CXCL11, PF4, IP-10, SDF-1a, SDF-10, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, (CCL3), MIP-10 (CCL4), MIP-1y, MIP-2, MIP-2a, MIP-3a, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, ALP, lungcina, Tim-1, eotaxina-1, eotaxina-2, I309, SCYA17, TRAC, RANTES (CCLS), DC-CK-1, linfotactina, ALP, lungcina e fractalcina, e outras conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Quimiocinas estão envolvidas na migração de células imunes aos locais de inflamação, bem como na maturação de células imunes e na geração de respostas imunes adaptativas.
[00130] Como usada nesse relatório descritivo, uma bactéria que é modificada que modo que ela “induz menos morte celular em células imunes residentes no tumor” ou “induz menos morte celular em células imunes” é aquela que é menos tóxica do que a bactéria sem a modificação, ou aquela que possui virulência reduzida, comparada com a bactéria sem a modificação. Exemplares dessas modificações são aquelas que diminuem/eliminam piroptose e que alteram perfis de lipopolissacarídeo (LPS) na bactéria. Essas modificações incluem um ou mais de ruptura ou deleção de genes de flagelina, pagP, ou um ou mais componentes da via de SPI-1, por exemplo, hilA, proteína Rod, proteína Needle e QseC.
[00131] Como usada nesse relatório descritivo, uma bactéria que é “modificada de modo que infecte preferencialmente células imunes residentes no tumor” ou “modificada de modo que infecte preferencialmente células imunes” possui uma modificação em seu genoma que reduz sua habilidade para infectar células diferentes de células imunes. Exemplares dessas modificações são modificações que rompem o sistema de secreção do tipo 3 ou o sistema de secreção do tipo 4 ou outros genes ou sistemas que afetam a habilidade de uma bactéria para invadir uma célula não imune. Por exemplo, a ruptura/deleção de um componente de SPI-1, que é necessário para infecção de células, por exemplo, células epiteliais, mas não afeta a infecção de células imunes, por exemplo, células fagocíticas, por Salmonella. Como usada nesse relatório descritivo, uma “modificação” é em referência à modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou uma sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico e inclui deleções, inserções e substituições de aminoácidos ou nucleotídeos, respectivamente. Métodos de modificação de um polipeptídeo são rotina para aqueles habilitados na técnica, por exemplo, por utilização de metodologias de DNA recombinante.
[00132] Como usada nesse relatório descritivo, uma modificação a um genoma bacteriano ou a um plasmídeo ou gene inclui deleções, substituições e inserções de ácido nucleico.
[00133] Como usada nesse relatório descritivo, interferência de RNA (RNAi) é um processo biológico no qual moléculas de RNA inibem a expressão ou tradução gênica, por neutralização de moléculas de mRNA visadas para inibir a tradução e, desse modo, a expressão de um gene visado.
[00134] Como usadas nesse relatório descritivo, moléculas de RNA que atuam por meio de RNAi são referidas como inibidoras em virtude de seu silenciamento de expressão de um gene visado. O silenciamento da expressão significa que a expressão do gene visado é reduzida ou suprimida ou inibida.
[00135] Como usado nesse relatório descritivo, silenciamento gênico por meio de RNAi significa inibir, suprimir, romper ou silenciar a expressão de um gene visado. Um gene visado contém sequências de nucleotídeos que correspondem às sequências no RNA inibidor, pela qual o RNA inibidor silencia a expressão de mRNA.
[00136] Como usada nesse relatório descritivo, inibição, supressão, ruptura ou silenciamento de um gene visado se refere aos processos que alteram a expressão, por exemplo, tradução, do gene visado, pela qual a atividade ou expressão do produto codificado pelo gene visado é reduzida. Redução inclui um knockout completo ou um knockout parcial, pela qual, com referência à bactéria imunoestimulante fornecida nesse relatório descritivo e administração nesse relatório descritivo, o tratamento é efetuado.
[00137] Como usados nesse relatório descritivo, pequenos RNAs interferentes (siRNAs) são pequenos pedaços de RNA de fita dupla (ds), normalmente com cerca de 21 nucleotídeos de comprimento, com protuberâncias 3' (2 nucleotídeos) em cada extremidade que podem ser usados para “interferir” com a tradução de proteínas por ligação e promoção da degradação de RNA mensageiro (mRNA) em sequências específicas. Ao fazê- lo, siRNAs evitam a produção de proteínas específicas com base nas sequências de nucleotídeos de seus mRNAs correspondentes. O processo é denominado interferência de RNA (RNAi), e também é referido como silenciamento de siRNA ou knockdown de siRNA.
[00138] Como usado nesse relatório descritivo, um RNA hairpin curto ou pequeno-RNA hairpin (shRNA) é uma molécula de RNA artificial com um hairpin turn estreito que pode ser usado para silenciar a expressão do gene-alvo por meio de interferência de RNA (RNAi). A expressão de shRNA em células é tipicamente obtida por liberação de plasmídeos ou por meio de vetores virais ou bacterianos. Como usado nesse relatório descritivo, um microambiente tumoral (TME) é o ambiente celular no qual o tumor existe, incluindo vasos sanguíneos circundantes, células imunes, fibroblastos, células inflamatórias derivadas da medula óssea, linfócitos,
moléculas de sinalização e a matriz extracelular (ECM). Condições que existem incluem, sem limitação, vascularização aumentada, hipóxia, pH baixo, concentração de lactato aumentada, concentração de piruvato aumentada, pressão do líquido intersticial aumentada e metabólitos ou metabolismo alterado, por exemplo, níveis maiores de adenosina, indicativos de um tumor.
[00139] Como usados nesse relatório descritivo, interferons humanos do tipo I (IFNs) são um subgrupo de proteínas de interferon que regulam a atividade do sistema imune. Todos os IFNs do tipo I se ligam a um complexo de receptor da superfície celular específico, por exemplo, o receptor de IFN-α. Interferons do Tipo I incluem IFN-α e IFN-0, entre outros. Proteínas de IFN-0 são produzidas por fibroblastos, e possuem atividade antiviral que está envolvida principalmente em resposta imune inata. Dois tipos de IFN-β são IFN-01 (IFNB1) e IFN-03 (IFNB3).
[00140] Como usada nesse relatório descritivo, a citação de que um ácido nucleico ou RNA codificado visa um gene significa que ele inibe ou suprime ou silencia a expressão do gene por qualquer mecanismo. Geralmente, esse ácido nucleico inclui pelo menos uma porção complementar ao gene visado, em que a porção é suficiente para formar um híbrido com a porção complementar.
[00141] Como usada nesse relatório descritivo, “deleção”, quando se refere a uma sequência de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos, se refere à deleção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, comparada com uma sequência, por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo- alvo ou uma sequência nativa ou do tipo selvagem.
[00142] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “inserção”, quando se refere a uma sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos, descreve a inclusão de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos adicionais, dentro de um alvo, sequência nativa, do tipo selvagem ou outra sequência relacionada. Dessa forma, uma molécula de ácido nucleico que contém uma ou mais inserções comparada com uma sequência do tipo selvagem, contém um ou mais nucleotídeos adicionais dentro do comprimento linear da sequência. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “adições” às sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos descrevem a adição de nucleotídeos ou aminoácidos em um dos terminais comparada com outra sequência.
[00143] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “substituição” ou “troca” se refere à substituição de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência nativa, - alvo, do tipo selvagem ou outra sequência de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos com um nucleotídeo ou aminoácido alternativo, sem alteração do comprimento (como descrito em números de resíduos) da molécula. Dessa forma, uma ou mais substituições em uma molécula não alteram o número de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos da molécula. Substituições de aminoácido comparadas com um polipeptídeo particular podem ser expressas em termos do número do resíduo de aminoácido ao longo do comprimento da sequência de polipeptídeos.
[00144] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “em uma posição que corresponde a”, ou citação de que posições de nucleotídeos ou aminoácidos “correspondem a” posições de nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência revelada, como apresentada na Listagem de Sequências, se refere às posições de nucleotídeos ou aminoácidos identificadas mediante alinhamento com a sequência revelada para maximizar a identidade usando um algoritmo de alinhamento padronizado, por exemplo, o algoritmo GAP. Por alinhamento das sequências, aqueles habilitados na técnica podem identificar resíduos correspondentes, por exemplo, usando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Em geral, para identificar posições correspondentes, as sequências de aminoácidos são alinhadas de modo que a combinação de maior ordem seja obtida (veja, por exemplo, “Computational Molecular Biology”, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova York, 1993; “Computer Analysis of Sequence Data, Part I”, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; “Sequence Analysis in Molecular Biology”, von Heinje, G., Academic Press, 1987; “Sequence Analysis Primer”, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova York, 1991; e Carrillo e cols. (1988) SIAM J. Applied Math. 48: 1.073).
[00145] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alinhamento de uma sequência” se refere ao uso de homologia para alinhar duas ou mais sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. Tipicamente, duas ou mais sequências que estão relacionadas por 50% ou mais de identidade estão alinhadas. Um conjunto alinhado de sequências se refere a 2 ou mais sequências que são alinhadas em posições correspondentes e pode incluir o alinhamento de sequências derivadas de RNAs, por exemplo, ESTs e outros cDNAs, alinhadas com sequência de
DNA genômico. Polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico relacionadas ou variantes podem ser alinhadas por qualquer método conhecido por aqueles habilitados na técnica. Esses métodos tipicamente maximizam combinações, e incluem métodos, por exemplo, a utilização de alinhamentos manuais e por utilização de diversos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por alinhamento das sequências de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, aqueles habilitados na técnica podem identificar porções ou posições análogas, usando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Além disso, aqueles habilitados na técnica também podem empregar resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos correspondentes entre sequências humanas e não humanas. Posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, por utilização de alinhamentos simulados em computador de estrutura de proteína. Em outros casos, regiões correspondentes podem ser identificadas. Aqueles habilitados na técnica também podem empregar resíduos de aminoácidos conservados como guias para encontrar resíduos correspondentes de aminoácidos entre sequências humanas e não humanas.
[00146] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “propriedade” de um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo, se refere qualquer propriedade exibida por um polipeptídeo incluindo, sem limitação, especificidade de ligação, configuração ou conformação estrutural, estabilidade da proteína, resistência à proteólise, estabilidade conformacional, tolerância térmica e tolerância às condições de pH. Alterações em propriedades podem alterar uma “atividade” do polipeptídeo. Por exemplo, uma alteração na especificidade de ligação do polipeptídeo do anticorpo pode alterar a habilidade para se ligar a um antígeno, e/ou várias atividades de ligação, por exemplo, afinidade ou avidez, ou atividades in vivo do polipeptídeo.
[00147] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “atividade” ou “atividade funcional” de um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo, se refere a qualquer atividade exibida pelo polipeptídeo. Essas atividades podem ser determinadas empiricamente. Atividades exemplares incluem, sem limitação, habilidade para interagir com uma biomolécula, por exemplo, por meio de ligação ao antígeno, ligação ao DNA, ligação ao ligante, ou dimerização, ou atividade enzimática, por exemplo, atividade de quinase ou atividade proteolítica. Para um anticorpo (incluindo fragmentos de anticorpo), atividades incluem, sem limitação, a habilidade para se ligar especificamente a um antígeno particular, afinidade de ligação ao antígeno (por exemplo, afinidade alta ou baixa), avidez de ligação ao antígeno (por exemplo, avidez alta ou baixa), on-rate, off-rate, funções efetoras, por exemplo, a habilidade para promover neutralização ou depuração do antígeno, neutralização de vírus, e atividades in vivo, por exemplo, a habilidade para evitar infecção ou invasão de um patógeno, ou para promover depuração, ou para penetrar em um tecido ou líquido ou célula particular no corpo. A avidez pode ser avaliada in vitro ou in vivo com o uso de ensaios reconhecidos, por exemplo, ELISA, citometria de fluxo, ressonância de plásmon de superfície ou ensaios equivalentes para medir on-rate ou off-rate, histologia e microscopia por imunoistoquímica e imunofluorescência, ensaios à base de células, citometria de fluxo e ensaios de ligação (por exemplo, ensaios de panning).
[00148] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligar”, “ligado” ou variações gramaticais deste, se refere à participação de uma molécula em qualquer interação atrativa com outra molécula, resultando em uma associação estável na qual as duas moléculas estão em proximidade íntima entre elas. A ligação inclui, sem limitação, ligações não covalentes, ligações covalentes (por exemplo, ligações covalentes reversíveis e irreversíveis), e inclui interações entre moléculas, por exemplo, sem limitação, proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídeos e pequenas moléculas, por exemplo, compostos químicos, incluindo fármacos.
[00149] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpo” se refere às imunoglobulinas e fragmentos de imunoglobulina, sejam eles naturais ou parcialmente ou totalmente sintéticos, por exemplo, produzidos recombinantemente, incluindo qualquer fragmento destes que contenha pelo menos uma porção da cadeia pesada e região leve variáveis da molécula de imunoglobulina que é suficiente para formar um sítio de ligação ao antígeno e, quando montados, se ligarem especificamente a um antígeno. Dessa forma, um anticorpo inclui qualquer proteína que possui um domínio de ligação que é homólogo ou substancialmente homólogo a um domínio de ligação ao antígeno de imunoglobulina (sítio de combinação de anticorpo). Por exemplo, um anticorpo se refere a um anticorpo que contém duas cadeias pesadas (que podem ser representadas como H e H') e duas cadeias leves (que podem ser representadas como L e L'), em que cada cadeia pesada pode ser uma cadeia pesada de imunoglobulina de comprimento total ou uma porção desta suficiente para formar um sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, cadeias pesadas incluem, sem limitação, cadeias VH, cadeias VH-CH1 e cadeias VH-CH1-CH2-CH3), e cada cadeia leve pode ser uma cadeia leve de comprimento total ou uma porção desta suficiente para formar um sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, cadeias leves incluem, sem limitação, cadeias VL e cadeias VL-CL). Cada cadeias pesadas (H e H') pareia com uma cadeia leve (L e L', respectivamente). Tipicamente, anticorpos minimamente incluem toda ou pelo menos uma porção da cadeia pesada (VH) variável e/ou da cadeia leve (VL) variável. O anticorpo também pode incluir toda ou uma porção da região constante.
[00150] Para os objetivos desse relatório descritivo, o termo anticorpo inclui anticorpos de comprimento total e porções destes, incluindo fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmentos de anticorpo anti-EGFR. Fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, um nanobody (por exemplo, um anticorpo de camelídeo), fragmentos, Fvs ligados por dissulfeto (dsFv), fragmentos Fd, fragmentos Fd', Fvs de cadeia única (scFv), Fabs de cadeia única (scFab), diabodies, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), ou fragmentos de ligação ao antígeno de qualquer um dos acima. Anticorpo também inclui anticorpos sintéticos, anticorpos produzidos recombinantemente, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos não humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e intrabodies. Os anticorpos fornecidos nesse relatório descritivo incluem membros de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY), qualquer subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou sub- subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de imunoglobulina. Anticorpos para terapia humana geralmente são anticorpos humanos ou são humanizados.
[00151] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “fragmento (s) de anticorpo” se refere aos (i) derivados de anticorpo monovalentes e monoespecíficos que contêm as cadeias pesadas e/ou leves variáveis ou fragmentos funcionais de um anticorpo e não possuem uma parte de Fc; e (ii) BiTE (scFv em tandem), DARTs, diabodies e diabodies de cadeia única (scDB). Dessa forma, um fragmento de anticorpo inclui um: Fab, Fab', scFab, scFv, fragmento Fv, nanobody (veja, por exemplo, anticorpos derivados de Camelus bactriamus, Calelus dromaderius ou Lama paccos) (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 5.759.808; e Stijlemans e cols. (2004) J. Biol. Chem. 279: 1.256-1.261), VHH, dAb, unidade de reconhecimento mínima, diabody de cadeia única (scDb), BiTE e DART. Os fragmentos de anticorpo citados possuem um peso molecular abaixo de 60 kDa.
[00152] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ácido nucleico” se refere a pelo menos dois nucleotídeos ou derivados de nucleotídeos ligados, incluindo um ácido desoxirribonucléico (DNA) e um ácido ribonucléico (RNA), unidos juntos, tipicamente por ligações fosfodiéster. Também incluídos no termo “ácido nucleico” estão análogos de ácidos nucleicos como, por exemplo, ácido nucleico peptídico (PNA),
DNA fosforotioato, e outros desses análogos e derivados ou combinações destes. Ácidos nucleicos também incluem derivados de DNA e RNA que contêm, por exemplo, um análogo de nucleotídeo ou uma ligação de “arcabouço” diferente de uma ligação fosfodiéster, por exemplo, uma ligação fosfotriéster, uma ligação fosforamidato, uma ligação fosforotioato, uma ligação tioéster, ou uma ligação peptídica (ácido nucleico peptídico). O termo também inclui, como equivalentes, derivados, variantes e análogos de RNA ou DNA feitos de análogos de nucleotídeo, ácidos nucleicos de fita simples (senso ou anti-senso) e de fita dupla. Desoxirribonucleotídeos incluem desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina e desoxitimidina. Para RNA, a base de uracil é uridina.
[00153] Como usada nesse relatório descritivo, uma molécula de ácido nucleico isolada é aquela que está separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico “isolada”, por exemplo, uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizada quimicamente. Moléculas de ácido nucleico isoladas exemplares fornecidas nesse relatório descritivo incluem moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos.
[00154] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligado operacionalmente”, com referência às sequências de ácidos nucleicos, regiões, elementos ou domínios, significa que as regiões de ácido nucleico estão funcionalmente relacionadas umas com as outras. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um peptídeo-líder pode estar ligado operacionalmente a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pela qual os ácidos nucleicos podem ser transcritos e traduzidos para expressar uma proteína de fusão funcional, em que o peptídeo-líder efetua a secreção do polipeptídeo de fusão. Em alguns casos, o ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo- líder) está ligado operacionalmente a um ácido nucleico que codifica um segundo polipeptídeo e os ácidos nucleicos são transcritos como um único transcrito de mRNA, mas a tradução do transcrito de mRNA pode fazer com que um de dois polipeptídeos seja expresso. Por exemplo, um códon de parada âmbar pode estar localizado entre o ácido nucleico que codifica o primeiro polipeptídeo e o ácido nucleico que codifica o segundo polipeptídeo, de modo que, quando introduzido em uma parcial célula supressora âmbar, o transcrito de mRNA único resultante pode ser traduzido para produzir uma proteína de fusão que contém o primeiro e segundo polipeptídeos, ou pode ser traduzida para produzir somente o primeiro polipeptídeo. Em outro exemplo, um promotor pode estar ligado operacionalmente ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pela qual o promotor regula ou medeia a transcrição do ácido nucleico.
[00155] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sintético”, com referência, por exemplo, a uma molécula de ácido nucleico sintética ou a um gene sintético ou a um peptídeo sintético se refere a uma molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptídeo que é produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.
[00156] Como usados nesse relatório descritivo, os resíduos de alfa-aminoácidos de ocorrência natural são os resíduos daqueles 20 alfa-aminoácidos encontrados na natureza que são incorporados em proteína pelo reconhecimento específico da molécula de tRNA carregada com seu códon de mRNA cognato em humanos.
[00157] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “polipeptídeo” se refere a dois ou mais aminoácidos ligados covalentemente. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo.
[00158] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “peptídeo” se refere a um polipeptídeo que tem de 2 até cerca de ou 40 aminoácidos de comprimento.
[00159] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácido” é um composto orgânico que contém um grupo amino e um grupo ácido carboxílico. Um polipeptídeo contém dois ou mais aminoácidos.
[00160] Para os objetivos desse relatório descritivo, aminoácidos contidos nos anticorpos fornecidos incluem os vinte aminoácidos de ocorrência naturalmente (veja a Tabela abaixo), aminoácidos não naturais, e análogos de aminoácido (por exemplo, aminoácidos nos quais o carbono-alfa possui uma cadeia lateral). Como usados nesse relatório descritivo, os aminoácidos, que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos de polipeptídeos que aparecem nesse relatório descritivo, são identificados de acordo com suas abreviações de três letras ou de uma letra bem conhecidas (veja a Tabela abaixo). Os nucleotídeos, que ocorrem nas várias moléculas de ácido nucleico e fragmentos, são designados com as designações de uma única letra padronizadas usadas rotineiramente na técnica.
[00161] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “resíduo de aminoácido” se refere a um aminoácido formado mediante digestão química (hidrólise) de um polipeptídeo em suas ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácidos descritos nesse relatório descritivo estão geralmente na forma isomérica “L”. Resíduos na forma isomérica “D” podem substituir qualquer resíduo de L-aminoácido, desde que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipeptídeo. NH2 se refere ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipeptídeo. COOH se refere ao grupo carbóxi livre presente no terminal carboxil de um polipeptídeo. De acordo com a nomenclatura-padrão de polipeptídeos descrita em J. Biol. Chem., 243: 3.557-59 (1968) e adotada em 37 C.F.R. §§ 1.821 - 1.822, as abreviações para resíduos de aminoácidos são mostradas na Tabela seguinte: Tabela de Correspondência
SÍMBOLO 1 Letra 3 Letras AMINOÁCIDO Y Tyr Tirosina G Gly Glicina F Phe Fenilalanina M Met Metionina A Ala Alanina S Ser Serina I Ile Isoleucina L Leu Leucina T Thr Treonina
V Val Valina P Pro Prolina K Lys Lisina H His Histidina Q Gln Glutamina E Glu Ácido glutâmico Ácido glutâmico e/ou Z Glx Glutamina W Trp Triptofano R Arg Arginina D Asp Ácido aspártico N Asn Asparagina Ácido aspártico e/ou B Asx Asparagina C Cys Cisteína X Xaa Desconhecido ou outro
[00162] Todas as sequências de resíduos de aminoácidos representadas nesse relatório descritivo por uma fórmula possuem uma orientação da esquerda para a direita na direção convencional do terminal amino para o terminal carboxil. A frase “resíduo de aminoácido” é definida para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência acima, aminoácidos modificados, não naturais e incomuns. Um traço no começo ou final de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos ou a um grupo amino terminal como, por exemplo, NH2, ou a um grupo carboxil terminal como, por exemplo, COOH.
[00163] Em um peptídeo ou proteína, substituições conservativas de aminoácidos adequadas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e geralmente podem ser feitas sem alteração de uma atividade biológica de uma molécula resultante. Aqueles habilitados na técnica reconhecem que, em geral, substituições de aminoácido únicas em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (veja, por exemplo, Watson e cols., “Molecular Biology of the Gene”, 4ª Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224).
[00164] Essas substituições podem ser feitas de acordo com as substituições exemplares apresentadas na Tabela seguinte: Substituições conservativas de aminoácidos exemplares. Resíduo original Substituições conservativas exemplares Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys Asn (N) Gln; His Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp Gly (G) Ala; Pro His (H) Asn; Gln Ile (I) Leu; Val Leu (L) Ile; Val Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; Ile Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr Tyr (Y) Tip; Phe Val (V) Ile; Leu
[00165] Outras substituições também são permissíveis e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com outras substituições conservativas ou não conservativas conhecidas.
[00166] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácidos de ocorrência natural” se referem aos 20 L- aminoácidos que ocorrem em polipeptídeos.
[00167] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácido não natural” se refere a um composto orgânico que possui uma estrutura similar a um aminoácido natural, mas foi modificado estruturalmente para simular a estrutura e reatividade de um aminoácido natural. Aminoácidos de ocorrência não natural, dessa forma, incluem, por exemplo, aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem, sem limitação, os D-estereoisômeros de aminoácidos. Aminoácidos não naturais exemplares são conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e incluem, sem limitação, ácido 2-aminoadípico (Aad), ácido 3-aminoadípico (bAad), β-alanina/ácido β-amino- propiônico (B ai a), ácido 2-aminobutírico (Abu), ácido 4- aminobutírico/ácido piperidínico (4Abu), ácido 6- aminocapróico (Acp), ácido 2-aminoheptanóico (Ahe), ácido 2- aminoisobutírico (Aib), ácido 3-aminoisobutírico (B ai b), ácido 2-aminopimélico (Apm), ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu), Desmosina (Des), ácido 2,2'-diaminopimélico (Dpm), ácido 2,3-diaminopropiônico (Dpr), N-Etilglicina (EtGly), N- etilasparagina (EtAsn), hidroxilisina (Hyl), alo- hidroxilisina (Ahyl), 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4-
hidroxiprolina (4Hyp), isodesmosina (Ide), alo-isoleucina (Aile), N-metilglicina, sarcosina (MeGly), N-metilisoleucina (MeIle), 6-N-metillisina (MeLys), N-metila (MeVal), Nora (Nva), Norleucina (Nle) e ornitina (Orn).
[00168] Como usada nesse relatório descritivo, uma construção de DNA é uma molécula de DNA de fita simples ou dupla, linear ou circular, que contém segmentos de DNA combinados e justapostos de uma forma não encontrada na natureza. Construções de DNA existem como um resultado de manipulação humana, e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.
[00169] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “segmento de DNA” é uma porção de uma molécula de DNA maior que possui atributos especificados. Por exemplo, um segmento de DNA que codifica um polipeptídeo especificado é uma porção de uma molécula de DNA mais longa, por exemplo, um plasmídeo ou fragmento de plasmídeo, que, quando lido da direção 5’ para 3’, codifica a sequência de aminoácidos do polipeptídeo especificado.
[00170] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “polinucleotídeo” significa um polímero de fita simples ou dupla de bases de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeo lidas da extremidade 5’ para a 3’. Polinucleotídeos incluem RNA e DNA, e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. O comprimento de uma molécula de polinucleotídeo é dado nesse relatório descritivo em termos de nucleotídeos (abreviados “nt”) ou pares de bases (abreviadas “bp”). O termo “nucleotídeos” é usado para moléculas de fita simples e dupla quando o contexto permite. Quando o termo é aplicado às moléculas de fita dupla, ele é usado para representar o comprimento global e será subentendido como equivalente ao termo “pares de bases”. Será reconhecido por aqueles habilitados na técnica que as duas fitas de um polinucleotídeo de fita dupla podem diferir ligeiramente em comprimento e que as suas extremidades podem ser escalonadas; dessa forma, todos os nucleotídeos dentro de uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla não podem ser pareados. Essas extremidades não pareadas, em geral, não excederão 20 nucleotídeos de comprimento.
[00171] Como usada nesse relatório descritivo, a produção por métodos recombinantes significa o uso dos métodos bem conhecidos de biologia molecular para a expressão de proteínas codificadas por DNA clonado.
[00172] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ácido nucleico heterólogo” é um ácido nucleico que codifica produtos (ou seja, RNA e/ou proteínas) que não são normalmente produzidos in vivo pela célula na qual ele é expresso, ou ácido nucleico que está em um lócus no qual ele não ocorre normalmente, ou que medeia ou codifica mediadores que alteram a expressão de ácido nucleico endógeno, por exemplo, DNA, por afetar a transcrição, tradução, ou outros processos bioquímicos reguláveis. Ácido nucleico heterólogo, por exemplo, DNA, também é referido como ácido nucleico estranho. Qualquer ácido nucleico, por exemplo, DNA, que aqueles habilitados na técnica reconheceriam ou considerariam como heterólogo ou estranho para a célula na qual é expresso, é englobado nesse relatório descritivo por ácido nucleico heterólogo; ácido nucleico heterólogo inclui ácido nucleico adicionado exogenamente que também é expresso endogenamente. Ácido nucleico heterólogo é geralmente não endógeno para a célula no qual é introduzido, mas foi obtido de outra célula ou preparado sinteticamente ou é introduzido em um lócus genômico no qual não ocorre naturalmente, ou sua expressão está sob o controle de sequências regulatórias ou uma sequência que difere da sequência ou sequências regulatórias naturais.
[00173] Exemplos de ácido nucleico heterólogo nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, ácido nucleico que codifica RNAi, ou uma proteína imunoestimulante, por exemplo, uma citocina, que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral, ou que codifica um anticorpo, fragmento de anticorpo ou outro produto terapêutico ou proteína terapêutica. Nas bactérias imunoestimulantes, o ácido nucleico heterólogo geralmente é codificado no plasmídeo introduzido, mas ele pode ser introduzido no genoma da bactéria, por exemplo, um promotor que altera a expressão de um produto bacteriano. Ácido nucleico heterólogo, por exemplo, DNA, inclui ácido nucleico que pode, de alguma forma, mediar a expressão de DNA que codifica um produto terapêutico, ou ele pode codificar um produto, por exemplo, um peptídeo ou RNA, que, de alguma forma, medeia, diretamente ou indiretamente, a expressão de um produto terapêutico.
[00174] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “terapia celular” envolve a liberação de células a um indivíduo para tratar uma doença ou condição. As células, que podem ser alogênicas ou autóloga, são modificadas ex vivo, por exemplo, por infecção de células com bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, de modo que liberem ou expressem produtos quando introduzidas em um indivíduo.
[00175] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “terapia genética” envolve a transferência de ácido nucleico heterólogo, por exemplo, DNA, em certas células, por exemplo, células-alvo, de um mamífero, particularmente um humano, com um distúrbio ou condição para a qual essa terapia é buscada. O ácido nucleico, por exemplo, DNA, é introduzido nas células-alvo selecionadas de uma forma tal que o ácido nucleico heterólogo, por exemplo, DNA, seja expresso e um produto (ou produtos) terapêutico codificado por ele seja produzido. A terapia genética também pode ser usada para liberar ácido nucleico que codifica um produto gênico que substitui um gene defeituoso ou suplementa um produto gênico produzido pelo mamífero ou pela célula na qual ele é introduzido. O ácido nucleico introduzido pode codificar um composto terapêutico, por exemplo, um fator de crescimento ou inibidor deste, ou um fator de necrose tumoral ou inibidor deste, por exemplo, um receptor deste, que não é produzido normalmente no hospedeiro mamífero ou que não é produzido em quantidades terapeuticamente eficazes ou em um tempo terapeuticamente útil. O ácido nucleico heterólogo, por exemplo, DNA, que codifica o produto terapêutico, pode ser modificado antes da introdução nas células do hospedeiro afetado a fim de aumentar ou de algum outro modo alterar o produto ou expressão deste. A terapia genética também pode envolver a liberação de um inibidor ou repressor ou outro modulador da expressão gênica.
[00176] Como usado nesse relatório descritivo, o termo
“expressão” se refere ao processo pelo qual polipeptídeos são produzidos por transcrição e tradução de polinucleotídeos. O nível de expressão de um polipeptídeo pode ser avaliado usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, por exemplo, métodos de determinação da quantidade do polipeptídeo produzida pela célula hospedeira. Esses métodos podem incluir, sem limitação, a quantificação do polipeptídeo no lisado de células por ELISA, coloração com Azul Coomassie após eletroforese em gel, ensaio de proteína de Lowry e ensaio de proteína de Bradford.
[00177] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “célula hospedeira” é uma célula que é usada para receber, manter, reproduzir e/ou amplificar um vetor. Uma célula hospedeira também pode ser usada para expressar o polipeptídeo codificado pelo vetor. O ácido nucleico contido no vetor é replicado quando a célula hospedeira se divide amplificando, dessa forma, os ácidos nucleicos.
[00178] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “vetor” significa um ácido nucleico replicável do qual uma ou mais proteínas heterólogas podem ser expressas quando o vetor é transformado em uma célula hospedeira apropriada. Referência a um vetor inclui aqueles vetores nos quais um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou fragmento deste pode ser introduzido, tipicamente por digestão de restrição e ligação. Referência a um vetor também inclui aqueles vetores que contêm ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo anti-EGFR modificado. O vetor é usado para introduzir o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo na célula hospedeira para amplificação do ácido nucleico ou para expressão/exibição do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. Os vetores tipicamente permanecem epissomais, mas podem ser projetados para efetuar integração de um gene ou porção deste em um cromossomo do genoma. Também são contemplados vetores que são cromossomos artificiais, por exemplo, cromossomos artificiais de levedura e cromossomos artificiais de mamíferos. A seleção e uso desses veículos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Um vetor também inclui “vetores de vírus” ou “vetores virais”. Vetores virais são vírus modificados geneticamente que estão ligados operativamente aos genes exógenos para transferência (como veículos ou shuttles) dos genes exógenos para células.
[00179] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “vetor de expressão” inclui vetores capazes de expressar DNA que está ligado operativamente com sequências regulatórias, por exemplo, regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão desses fragmentos de DNA. Esses segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um intensificador, um sinal de poliadenilação e semelhantes. Vetores de expressão são geralmente derivados de DNA de plasmídeo ou viral, ou podem conter elementos de ambos. Dessa forma, um vetor de expressão se refere a uma construção de DNA ou RNA recombinante, por exemplo, um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, mediante introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta em expressão do DNA clonado. Vetores de expressão apropriados são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissomais ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.
[00180] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sequência primária” se refere à sequência de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo ou à sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico.
[00181] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “identidade de sequência” se refere ao número de aminoácidos ou bases de nucleotídeos idênticas ou similares em uma comparação entre um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e um de referência. A identidade de sequência pode ser determinada por alinhamento de sequências de sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas para identificar regiões de similaridade ou identidade. Para os objetivos desse relatório descritivo, identidade de sequência é geralmente determinada por alinhamento para identificar resíduos idênticos. O alinhamento pode ser local ou global. Combinações, erros de pareamento e lacunas podem ser identificados entre sequências comparadas. Lacunas são aminoácidos ou nucleotídeos nulos inseridos entre os resíduos de sequências alinhadas, de modo que caracteres idênticos ou similares são alinhados. Geralmente, pode haver lacunas internas e terminais. Quando são utilizadas penalidades de lacuna, a identidade de sequência pode ser determinada sem penalidade para lacunas de extremidade (por exemplo, lacunas terminais não são penalizadas). Alternativamente, a identidade de sequência pode ser determinada sem levar em conta lacunas como o número de posições/comprimentos idênticos da sequência alinhada total x 100.
[00182] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alinhamento global” é um alinhamento que alinha duas sequências do começo ao fim, alinhando cada letra em cada sequência apenas uma vez. Um alinhamento é produzido, independentemente se há ou não similaridade ou identidade entre as sequências. Por exemplo, 50% de identidade de sequência com base no “alinhamento global” significa que, em um alinhamento da sequência completa de duas sequências comparadas cada uma com 100 nucleotídeos de comprimento, 50% dos resíduos são os mesmos. Subentende-se que alinhamento global também pode ser usado na determinação da identidade de sequência até mesmo quando o comprimento das sequências alinhadas não é o mesmo. As diferenças nas extremidades terminais das sequências serão levadas em conta na determinação da identidade de sequência, a menos que “nenhuma penalidade para lacunas de extremidade” seja selecionada. Geralmente, um alinhamento global é usado em sequências que compartilham similaridade significante sobre a maior parte do comprimento. Algoritmos exemplares para realização de alinhamento global incluem o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e cols. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443). Programas exemplares para realização de alinhamento global estão disponíveis publicamente e incluem a Ferramenta de Alinhamento Global de Sequências disponível no website do “National Center for Biotechnology Information” (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), e o programa disponível em deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.
[00183] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alinhamento local” é um alinhamento que alinha duas sequências, mas somente alinha aquelas porções das sequências que compartilham similaridade ou identidade.
[00184] Dessa forma, um alinhamento local determina se subsegmentos de uma sequência estão presentes em outra sequência. Caso não haja similaridade, nenhum alinhamento será retornado. Algoritmos de alinhamento local incluem BLAST ou o algoritmo de Smith-Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Por exemplo, 50% de identidade de sequência com base no “alinhamento local” significa que, em um alinhamento da sequência completa de duas sequências comparadas de qualquer comprimento, uma região de similaridade ou identidade de 100 nucleotídeos de comprimento possui 50% dos resíduos que são os mesmos na região de similaridade ou identidade.
[00185] Para os objetivos desse relatório descritivo, a identidade de sequência pode ser determinada por programas de algoritmo de alinhamento padronizados usados com penalidades de lacuna padronizadas estabelecidas por cada fornecedor. Parâmetros-padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e cols. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., “Atlas of Protein Sequence and Structure”, “National Biomedical Research Foundation”, páginas 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalidade para lacunas de extremidade. Se quaisquer duas moléculas de ácido nucleico possuem sequências de nucleotídeos ou quaisquer dois polipeptídeos possuem sequências de aminoácidos que são pelo menos 80%,
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% “idênticas”, ou outras variações similares em relação a um percentual de identidade, pode ser determinado usando quaisquer algoritmos de computador com base no alinhamento local ou global (veja, por exemplo, software de alinhamento em wikipedia.org/wiki/Sequence, que fornece links para dezenas de bancos de dados e programas de alinhamento conhecidos e disponíveis publicamente). Geralmente, para os objetivos desse relatório descritivo, a identidade de sequência é determinada usando algoritmos de computador com base no alinhamento global, por exemplo, a ferramenta de Alinhamento de Sequência Global de Needleman-Wunsch disponível por
NCBUBLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PageTYPE=BlastHom e); LAlign (William Pearson que implementa o algoritmo de Huang e Miller (Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357)); e programa de Xiaoqui Huang disponível em deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html. Tipicamente, a sequência de comprimento total de cada um dos polipeptídeos ou nucleotídeos comparados é alinhada através do comprimento total de cada sequência em um alinhamento global. O alinhamento local também pode ser usado quando as sequências que estão sendo comparadas são substancialmente do mesmo comprimento.
[00186] Portanto, como usado nesse relatório descritivo, o termo “identidade” representa uma comparação ou alinhamento entre um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e um de referência. Em um exemplo não limitante, “pelo menos 90% idêntica a” se refere às identidades percentuais de 90 a 100% em relação ao polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. A identidade em um nível de 90% ou mais é indicativa do fato de que, supondo, para fins de exemplificação, que um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e de referência com comprimento do 100 aminoácidos ou nucleotídeos são comparados, no máximo 10% (ou seja, 10 de 100) de aminoácidos ou nucleotídeos no polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste diferem daqueles do polipeptídeo de referência. Comparações similares podem ser feitas entre polinucleotídeos de teste e de referência. Essas diferenças podem ser representadas como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente sobre o comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos ou elas podem ser agrupadas em uma ou mais localizações de comprimento variável até o máximo permissível, por exemplo, uma diferença de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças também podem ser causadas por deleções ou truncamentos de resíduos de aminoácidos. Diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácido nucleico ou aminoácido. Dependendo do comprimento das sequências comparadas, no nível de homologias ou identidades acima de cerca de 85-90%, o resultado pode ser independente do programa e dos parâmetros de lacuna configurados; esses níveis elevados de identidade podem ser avaliados prontamente, frequentemente sem se basear em software.
[00187] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “doença ou distúrbio” se refere a uma condição patológica em um organismo que resulta de causa ou condição incluindo, sem limitação, infecções, condições adquiridas, condições genéticas, e caracterizadas por sintomas identificáveis.
[00188] Como usado nesse relatório descritivo, o termo
“tratamento” de um indivíduo com uma doença ou condição significa que os sintomas do indivíduo são parcialmente ou totalmente aliviados, ou permanecem estáticos após tratamento.
[00189] Como usado nesse relatório descritivo, tratamento se refere a quaisquer efeitos que melhora os sintomas de uma doença ou distúrbio. Tratamento engloba profilaxia, terapia e/ou cura. Tratamento também engloba qualquer uso farmacêutico de qualquer bactéria ou composição imunoestimulante fornecida nesse relatório descritivo.
[00190] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “profilaxia” se refere à prevenção de uma doença potencial e/ou à prevenção da piora de sintomas ou progressão de uma doença.
[00191] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “prevenção” ou “profilaxia”, e formas gramaticalmente equivalentes deste, se refere aos métodos nos quais o risco ou probabilidade de desenvolvimento de uma doença ou condição é reduzida.
[00192] Como usado nesse relatório descritivo, um “agente farmaceuticamente eficaz” inclui qualquer agente terapêutico ou agentes bioativos incluindo, sem limitação, por exemplo, anestésicos, vasoconstrictores, agentes dispersantes, e fármacos terapêuticos convencionais, incluindo fármacos de pequena molécula e proteínas terapêuticas.
[00193] Como usado nesse relatório descritivo, um “efeito terapêutico” significa um efeito que resulta de tratamento de um indivíduo que altera, tipicamente melhora ou atenua, os sintomas de uma doença ou condição ou que cura uma doença ou condição.
[00194] Como usada nesse relatório descritivo, uma “terapeuticamente quantidade eficaz” ou uma “dose terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade de um agente, composto, material ou composição que contém um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico após administração a um indivíduo. Dessa forma, ela é a quantidade necessária para a prevenção, cura, melhora, interrupção ou interrupção parcial de um sintoma de uma doença ou distúrbio.
[00195] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “eficácia terapêutica” se refere à habilidade de um agente, composto, material ou composição que contém um composto para produzir um efeito terapêutico em um indivíduo ao qual o agente, composto, material ou composição que contém um composto foi administrado.
[00196] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “quantidade profilaticamente eficaz” ou “dose profilaticamente eficaz” se refere à quantidade de um agente, composto, material ou composição que contém um composto que, quando administrada a um indivíduo, terá o efeito profilático desejado, por exemplo, evitando ou retardando o surgimento, ou recorrência, da doença ou sintomas, reduzindo a probabilidade do surgimento, ou recorrência, da doença ou sintomas, ou reduzindo a incidência de infecção viral. O efeito profilático completo não ocorre necessariamente por administração de uma dose, e pode ocorrer apenas após administração de uma série de doses. Dessa forma, uma quantidade profilaticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.
[00197] Como usado nesse relatório descritivo, o termo
“melhora dos sintomas de uma doença ou distúrbio particular” por um tratamento, por exemplo, por administração de uma composição farmacêutica ou outra terapêutica, se refere a qualquer redução, seja ela permanente ou temporária, duradoura ou transitória, dos sintomas que possa ser atribuída ou associada à administração da composição ou terapêutica.
[00198] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “agente anticâncer” se refere a qualquer agente que seja destrutivo ou tóxico para células e tecidos malignos. Por exemplo, agentes anticâncer incluem agentes que matam células de câncer ou de algum outro modo inibem ou prejudicam o crescimento de tumores ou células de câncer. Agentes anticâncer exemplares são agentes quimioterápicos.
[00199] Como usado nesse relatório descritivo o termo “atividade terapêutica” se refere à atividade in vivo de um polipeptídeo terapêutico. Geralmente, a atividade terapêutica é a atividade que está associada ao tratamento de uma doença ou condição.
[00200] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “indivíduo” se refere a um animal, incluindo um mamífero, por exemplo, um ser humano.
[00201] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “paciente” se refere a um indivíduo humano.
[00202] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “animal” inclui qualquer animal, por exemplo, sem limitação, primatas, incluindo humanos, gorilas e macacos; roedores, por exemplo, camundongos e ratos; aves de criação, por exemplo, galinhas; ruminantes, por exemplo, cabras, vacas, veados, carneiros; porcos e outros animais. Animais não humanos excluem humanos como o animal contemplado. Os polipeptídeos fornecidos nesse relatório descritivo são de qualquer fonte, animal, planta, procariótica e fúngica. A maioria dos polipeptídeos é de origem animal, incluindo origem mamífera.
[00203] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “composição” se refere a qualquer mistura. Ela pode ser uma solução, suspensão, líquido, pó, pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação destes.
[00204] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “combinação” se refere a qualquer associação entre dois ou mais itens. A combinação pode ser dois ou mais itens separados, por exemplo, duas composições ou duas coleções, uma mistura destas, por exemplo, uma mistura única dos dois ou mais itens, ou qualquer variação destes. Os elementos de uma combinação estão geralmente funcionalmente associados ou relacionados.
[00205] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “terapia combinada” se refere à administração de dois ou mais produtos terapêuticos diferentes. Os produtos terapêuticos ou agentes terapêuticos diferentes podem ser fornecidos e administrados separadamente, sequencialmente, intermitentemente, ou podem ser fornecidos em uma composição única.
[00206] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “kit” é uma combinação embalada que opcionalmente inclui outros elementos, por exemplo, reagentes adicionais e instruções para uso da combinação ou elementos desta, para um objetivo que inclui, sem limitação, ativação, administração, diagnóstico e avaliação de uma atividade biológica ou propriedade.
[00207] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “forma de dose unitária” se refere às unidades fisicamente distintas adequadas para indivíduos humanos e animais e embaladas individualmente, como é conhecido na técnica.
[00208] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “formulação de dosagem única” se refere a uma formulação para administração direta.
[00209] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “formulação multidoses” se refere a uma formulação que contém múltiplas doses de um agente terapêutico e que pode ser administrada diretamente para fornecer várias doses únicas do agente terapêutico. As doses podem ser administradas ao longo de um período de minutos, horas, semanas, dias ou meses. Formulações multidoses podem permitir o ajuste da dose, um pool de doses e/ou a divisão de doses. Como formulações multidoses são usadas ao longo do tempo, elas geralmente contêm um ou mais conservantes para evitar o crescimento microbiano.
[00210] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “artigo manufaturado” é um produto que é feito e vendido. Como usado ao longo desse pedido, o termo visa englobar qualquer uma das composições fornecidas nesse relatório descritivo contidas em artigos de embalagem.
[00211] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “líquido” se refere a qualquer composição que possa fluir. Dessa forma, líquidos englobam composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras composições desse tipo.
[00212] Como usado nesse relatório descritivo, um polipeptídeo ou proteína isolado ou purificado (por exemplo, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste) ou porção biologicamente ativa deste (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno isolado) é substancialmente livre de material celular ou de outras proteínas contaminantes da célula ou tecido do qual a proteína é derivada, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas, quando sintetizado quimicamente. Preparações podem ser determinadas como sendo substancialmente livres caso apareçam livres de impurezas prontamente detectáveis, como determinado por métodos de análise padronizados, por exemplo, cromatografia de camada delgada (TLC), eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), usados por aqueles habilitados na técnica para avaliar essa pureza, ou suficientemente puras, de modo que purificação adicional não altere de forma detectável as propriedades físicas e químicas, por exemplo, atividades enzimáticas e biológicas, da substância.
[00213] Métodos para a purificação dos compostos para produzir compostos quimicamente substancialmente puros são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Um composto quimicamente substancialmente puro, no entanto, pode ser uma mistura de estereoisômeros. Nesses casos, a purificação adicional pode aumentar a atividade específica do composto. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “extrato celular” ou “lisado” se refere a uma preparação ou fração que é feita de uma célula lisada ou rompida.
[00214] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “controle” se refere a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra de teste, exceto que ela não é tratada com um parâmetro de teste ou, se ela é uma amostra de plasma, ela pode ser de um normal voluntário não afetado com a condição de interesse. Um controle também pode ser um controle interno.
[00215] Como usadas nesse relatório descritivo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, referência a um polipeptídeo que compreende “um domínio de imunoglobulina” inclui polipeptídeos com um ou diversos domínios de imunoglobulina.
[00216] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ou” é usado para significar “e/ou”, salvo quando explicitamente indicado para se referir somente às alternativas ou quando as alternativas são mutualmente exclusivas.
[00217] Como usadas nesse relatório descritivo, faixas e quantidades podem ser expressas como “cerca de” um valor ou faixa particular. “Cerca de” também inclui a quantidade exata. Dessa forma “cerca de 5 aminoácidos” significa “cerca de 5 aminoácidos” e também “5 aminoácidos.”
[00218] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou circunstância subsequentemente descrito ocorre ou não e que a descrição inclui casos nos quais o referido evento ou circunstância ocorre e casos nos quais ele não ocorre. Por exemplo, uma porção opcionalmente variante significa que a porção é variante ou não variante.
[00219] Como usadas nesse relatório descritivo, as abreviações para quaisquer grupos de proteção, aminoácidos e outros compostos estão, salvo indicação em contrário, de acordo com seu uso comum, abreviações reconhecidas, ou com a “IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature” (veja, Biochem. (1972) 11 (9): 1.726-1.732).
[00220] Para clareza de divulgação, e não como forma de limitação, a descrição detalhada é dividida nas subseções que se seguem. B. VISÃO GERAL DAS BACTÉRIAS IMUNOESTIMULANTES
[00221] São fornecidas bactérias modificadas, denominadas nesse relatório descritivo bactérias imunoestimulantes, que se acumulam e/ou replicam em (ou seja, colonizam) tumores, células imunes residentes no tumor e/ou o microambiente tumoral (TME); e/ou induzem menos morte celular em células imunes residentes no tumor; e/ou codificam produtos terapêuticos, por exemplo, agentes antitumorais, proteínas imunoestimulantes e RNAs inibidores (RNAi), por exemplo, shRNAs e microRNAs (miRNAs), que genes-alvo cuja inibição, supressão ou silenciamento efetua terapia do tumor. Cepas de bactérias para modificação consistem em qualquer uma adequada para uso terapêutico. As bactérias modificadas imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo são para usos e para métodos para o tratamento de câncer. As bactérias são modificadas para esses usos e métodos.
[00222] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo são modificadas por deleção ou modificação de genes bacterianos para atenuar suas respostas inflamatórias, aumentar sua tolerabilidade, aumentar sua resistência ao complemento, aumentar sua infectividade, acúmulo ou colonização de tumores, células imunes residentes no tumor e/ou do TME, diminuir sua indução de morte da célula imune (por exemplo, piroptose diminuída), e para aumentar as respostas imunes antitumorais em hospedeiros tratados com as bactérias. As modificações também podem ser em genes codificados em um plasmídeo nas bactérias. Por exemplo, as bactérias podem ser auxotróficas para adenosina, ou adenosina e adenina, e plasmídeos que codificam produtos terapêuticos, por exemplo, proteínas imunoestimulantes, anticorpos ou RNAi, que inibem genes do ponto de verificação imune no hospedeiro estão incluídos nas bactérias. A atenuação das respostas inflamatórias às bactérias pode ser efetuada por deleção do gene msbB, que diminui TNF-alfa no hospedeiro, e/ou por knocking-out de genes de flagelina e/ou deleção/mutação de pagP. As bactérias são modificadas para estimular a atividade antitumoral do hospedeiro, por exemplo, por adição de plasmídeos que codificam proteínas imunoestimulantes como, por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes, ou RNAi que visam pontos de verificação imune do hospedeiro, e por adição de ácido nucleico com motivos CpGs/CpG.
[00223] Cepas bacterianas podem ser cepas atenuadas, ou cepas que são atenuadas por métodos padronizados, ou que, em virtude das modificações fornecidas nesse relatório descritivo, são atenuadas pelo fato de que sua habilidade para colonizar é limitada primariamente a tecidos e órgãos imunoprivilegiados, particularmente células imunes e tumorais, incluindo tumores sólidos. Bactérias incluem, sem limitação, por exemplo, cepas de Salmonella, Shigella, Listeria, E. coli, e Bifidobacteriae. Por exemplo, espécies incluem Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella disenteriae, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi,
Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, e Salmonella enteritidis. Outras espécies bacterianas adequadas incluem Rickettsia, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Vibrio, Bacillus e Erysipelothrix. Por exemplo, Rickettsia Rikettsiae, Rickettsia prowazekii, Rickettsia tsutsugamuchi, Rickettsia mooseri, Rickettsia sibirica, Bordetella bronchiseptica, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas salmonicida, Francisella tularensis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Citrobacter freundii, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus sornnus, Brucella abortus, Mycobacterium intracellulare, Legionella pneumophila, Rhodococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustelae, Vibrio cholerae, Bacillus subtilis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Yersinia enterocolitica, Rochalimaea quintana, e Agrobacterium tumerfacium.
[00224] As bactérias se acumulam em virtude de uma ou mais propriedades, incluindo, difusão, migração e quimiotaxia para tecidos ou órgãos ou ambientes imunoprivilegiados, ambientes que fornecem nutrientes ou outras moléculas para as quais são auxotróficas, e/ou ambientes que contêm células em replicação que fornecem ambientes adequados para entrada e replicação das bactérias. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo e espécies que efetuam essa terapia incluem espécies de Salmonella, Listeria e E. coli.
[00225] As bactérias contêm plasmídeos que codificam uma proteína terapêutica, por exemplo, uma proteína imunoestimulante ou um inibidor de ponto de verificação imune ou outro produto de estimulação imune ou de bloqueio de imunossupressão. Produtos incluem anticorpos, por exemplo, fragmentos de anticorpo, e nanobodies, RNAi, por exemplo, uma ou mais construções de RNA hairpin curto (sh), microRNAs, ou outras modalidades de RNAi, cuja expressão inibe ou rompe ou suprime a expressão de genes visados, ou de algum outro modo aumenta respostas imunes ou diminui a supressão imune. Os produtos terapêuticos são expressos sob o controle de um promotor eucariótico, por exemplo, um promotor de RNA polimerase (RNAP) II ou III. Tipicamente, promotores de RNAPIII (também referidos como POLIII) são constitutivos, e RNAPII (também referidos como POLII) podem ser regulados. Em alguns exemplos, os shRNAs visam o gene TREX1, para inibir sua expressão.
[00226] Em algumas modalidades, os plasmídeos podem codificar diversos produtos terapêuticos, incluindo proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, e moléculas de RNAi, por exemplo, shRNAs, e anticorpos, incluindo nanobodies, que inibem dois ou mais genes do ponto de verificação imune, por exemplo, TREX1, PD-L1, VISTA, SIRPa, CTNNB1, TGF-beta, CD47, e/ou VEGF e quaisquer outros conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00227] Quando diversos produtos terapêuticos são codificados, a expressão de cada um geralmente está sob o controle de um promotor diferente.
[00228] Entre as bactérias fornecidas nesse relatório descritivo, estão bactérias que são modificadas de modo a serem auxotróficas para adenosina. Isso pode ser obtido por modificação ou deleção de genes envolvidos na síntese, metabolismo ou transporte de purina. Por exemplo, a ruptura do gene tsx em espécies de Salmonella, por exemplo, Salmonella typhi, resulta em auxotrofia de adenosina. Adenosina é imunossupressora e se acumula em altas concentrações em tumores; a auxotrofia para adenosina aumenta a atividade antitumoral das bactérias, pois as bactérias seletivamente replicam em tecidos ricos em adenosina.
[00229] Também são fornecidas bactérias que são modificadas de modo a terem um gene asd defeituoso. Essas bactérias para uso in vivo são modificadas para incluir o carregamento de um gene asd funcional no plasmídeo introduzido; isso mantém a seleção para o plasmídeo, de modo que um sistema de manutenção/seleção de plasmídeo à base de antibiótico não seja necessário. Também é fornecido o uso de cepas defeituosas em asd que não contêm um gene asd funcional em um plasmídeo e são, dessa forma, modificadas geneticamente para serem autolíticas no hospedeiro.
[00230] Também são fornecidas bactérias que são modificadas de modo a serem incapazes de produzir flagelos. Isso pode ser obtido por modificação das bactérias por deleção dos genes que codificam as subunidades de flagelina. As bactérias modificadas desprovidas de flagelina são menos inflamatórias e, portanto, mais bem toleradas, e induzem uma resposta antitumoral mais potente.
[00231] Também são fornecidas bactérias que são modificadas para produzir listeriolisina O (LLO), o que aumenta a liberação de plasmídeo em células fagocíticas.
[00232] Também são fornecidas bactérias modificadas para carregar um plasmídeo que contém CpG com cópia baixa. O plasmídeo ainda pode incluir outras modificações, e pode codificar produtos terapêuticos, por exemplo, proteínas imunoestimulantes, anticorpos e fragmentos destes, e RNAi.
[00233] As bactérias também podem ser modificadas para crescerem de uma forma tal que as bactérias, se uma espécie de Salmonella, expressem menos dos genes tóxicos de SPI-1 (ilha de patogenicidade de Salmonella-1). Em Salmonella, genes responsáveis por virulência, invasão, sobrevida e disseminação extra-intestinal estão localizados em ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPIs).
[00234] As bactérias incluem plasmídeos que codificam RNAi, por exemplo, shRNA ou microRNA, que inibem pontos de verificação, por exemplo, somente PD-L1 ou TREX1, ou TREX1 e um ou mais de um segundo ponto de verificação imune. As bactérias podem ser adicionalmente modificadas para outros traços desejáveis, incluindo para seleção de manutenção do plasmídeo, particularmente para seleção sem antibióticos, para preparação das cepas. As bactérias imunoestimulantes opcionalmente podem codificar polipeptídeos terapêuticos, incluindo polipeptídeos e agentes terapêuticos antitumorais.
[00235] Exemplares das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo são espécies de Salmonella. Exemplares de bactérias para modificação como descritas nesse relatório descritivo são cepas modificadas geneticamente de Salmonella typhimurium, por exemplo, cepa YS1646 (Nº de Catálogo ATCC 202165; também referida como VNP20009; veja, Publicação de Pedido Internacional PCT Nº WO 99/13053) que é modificada geneticamente com plasmídeos ao complemento um knockout do gene asd e manutenção do plasmídeo livre de antibióticos.
[00236] Cepas bacterianas modificadas imunoestimulantes que são tornadas auxotróficas para adenosina são fornecidas nesse relatório descritivo, bem como composições farmacêuticas que contêm essas cepas, formuladas para administração a um indivíduo, por exemplo, um humano, para uso em métodos de tratamento de tumores e cânceres.
[00237] Também são fornecidos métodos ou usos das bactérias imunoestimulantes ou composições farmacêuticas que contêm as bactérias, em que o tratamento compreende terapia combinada, na qual um segundo agente ou tratamento anticâncer é administrado. O segundo agente ou tratamento anticâncer pode ser administrado antes, concomitantemente, depois ou intermitentemente com as bactérias ou composição farmacêutica imunoestimulantes, e inclui imunoterapia, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo; terapia com vírus oncolítico; radiação/radioterapia; e quimioterapia. A imunoterapia pode compreender, por exemplo, a administração de um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 ou anti-CTLA4 ou anti-IL6 ou anti-VEGF ou anti-VEGFR ou anti-VEGFR2, ou um fragmento destes. Terapia combinada também pode incluir cirurgia.
[00238] As bactérias modificadas geneticamente imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo contêm múltiplas modalidades sinérgicas para induzir reativação imune de tumores frios e para promover respostas imunes antígeno tumoral-específicas inibindo, ao mesmo tempo, vias de ponto de verificação imune que o tumor utiliza para subverter e evadir imunidade antitumoral durável.
[00239] O direcionamento aumentado ao tumor por meio de auxotrofia de adenosina e ruptura vascular aumentada aumentou a potência, enquanto localiza a inflamação para limitar exposição à citocina sistêmica e as toxicidades autoimunes observadas com outras modalidades de imunoterapia. Exemplares das bactérias assim modificadas são cepas de S. typhimurium, incluindo tais modificações da cepa YS1646, particularmente cepas ascl-. Por exemplo, como fornecido nesse relatório descritivo, são bactérias imunoestimulantes que fornecem ruptura do gene de PD-L1 mediada por shRNA. Foi demonstrado em camundongos que a ruptura do gene de PD-L1 pode aumentar a colonização tumoral. Foi demonstrado, por exemplo, que a infecção por S. typhimurium em camundongos com knockout de PD-L1 resulta em uma carga bacteriana 10 vezes maior do que em camundongos do tipo selvagem (veja, Lee e cols. (2010) Immunol. 185: 2.442-
2.449). Dessa forma, PD-L1 é protetor contra infecção por S. typhimurium. São fornecidas nesse relatório descritivo bactérias imunoestimulantes, por exemplo, S. typhimurium, que carregam plasmídeos capazes de knockdown mediado de RNAi do gene de TREX1, PD-L1, ou de PD-L1 e TREX1. Essas bactérias fornecem efeitos antitumorais em consequência da combinação de duas vias independentes que levam a respostas imunes antitumorais aumentadas e sustentadas em uma única terapia. C. IMUNOTERAPÊUTICOS PARA CÂNCER
[00240] O meio imunossupressor encontrado dentro do microambiente tumoral (TME) é um condutor da iniciação e progressão tumoral. Cânceres emergem após o sistema imune não conseguir controlar e conter tumores. Múltiplos mecanismos tumor-específicos criam ambientes tumorais nos quais o sistema imune é forçado a tolerar tumores e suas células ao invés de eliminá-los. O objetivo da imunoterapia do câncer é resgatar a habilidade natural do sistema imune para eliminar tumores. A inflamação aguda associada à infecção microbiana foi ligada observacionalmente à eliminação espontânea de tumores por séculos.
1. Imunoterapias
[00241] Várias imunoterapias clínicas do câncer buscaram perturbar o equilíbrio de supressão imune em direção à imunidade antitumoral. Estratégias para estimular a imunidade por administração direta de citocinas como, por exemplo, IL-2 e IFN-α, obtiveram respostas clínicas modestas em uma minoria de pacientes induzindo, ao mesmo tempo, toxicidades sistêmicas sérias relacionadas à inflamação (Sharma e cols. (2011) Nat. Rev. Cancer 11: 805-812).
[00242] O sistema imune desenvolveu várias verificações e contrapesos para limitar a autoimunidade, por exemplo, a supra-regulação da proteína de morte celular programada 1 (PD-1) em células T e sua ligação ao seu ligante cognato, ligante de morte programada 1 (PD-L1), que é expresso tanto em células apresentadoras de antígeno (APCs) quanto em células tumorais. A ligação de PD-L1 a PD-1 interfere com vias de sinalização de célula T CD8+, prejudicando a proliferação e função efetora de células T CD8+, e induzindo tolerância de células T. PD-1 e PD-L1 são dois exemplos de numerosos inibidores dos “pontos de verificação imune”, que funcionam por infra-regulação de respostas imunes. Outros pontos de verificação imune inibidores incluem a proteína associada ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), proteína reguladora de sinal a (SIRPa), supressor de Ig do domínio-V da ativação de célula T (VISTA), ligante de morte programada
2 (PD-L2), indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) 1 e 2, gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), Galectina-9, imunorreceptor de célula T com domínios de Ig e ITIM (TIGIT), célula T contendo domínio de imunoglobulina e mucina-3 (TIM-3, também conhecido como receptor celular do vírus da hepatite A 2 (HAVCR2)), mediador de entrada de herpesvírus (HVEM), CD39, CD73, B7-H3 (também conhecido como CD276), B7-H4, CD47, CD48, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD155, CD160, CD244 (2B4), atenuador de linfócito B e T (BTLA, ou CD272) e molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM1 ou CD66a).
[00243] Anticorpos projetados para bloquear pontos de verificação imune, por exemplo, anti-PD-1 (por exemplo, pembrolizumab, nivolumab) e anti-PD-L1 (por exemplo, atezolizumab, avelumab, durvalumab), tiveram sucesso durável na prevenção de anergia de célula T e quebra da tolerância imune. Somente uma fração de pacientes tratados demonstra benefício clínico, e aqueles que apresentam frequentemente apresentam toxicidades relacionadas à autoimunidade (veja, por exemplo, Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373: 1.490-1.492; Topalian e cols. (2012) N. Engl. J. Med. 366: 3.443-3.447). Isso é ainda evidenciado pela necessidade de terapias, fornecidas nesse relatório descritivo, que são mais eficazes e menos tóxicas.
[00244] Outra estratégia de bloqueio do ponto de verificação inibe a indução de CTLA-4 em células T, que se liga e inibe receptores coestimulantes em APCs, por exemplo, CD80 ou CD86, superando a diferenciação do agrupamento coestimulante 28 (CD28), que se liga aos mesmos receptores, mas com uma afinidade menor. Isso bloqueia o sinal estimulante de CD28, enquanto o sinal inibidor de CTLA-4 é transmitido, evitando a ativação de célula T (veja, Phan e cols. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 8.372-8.377). A terapia anti-CTLA-4 (por exemplo, ipilimumab) possui sucesso clínico e durabilidade em alguns pacientes exibindo, ao mesmo tempo, uma incidência ainda maior de eventos adversos severos relacionados ao sistema imune (veja, por exemplo, Hodi e cols. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 711-723; Schadendorf e cols. (2015) J. Clin. Oncol. 33: 1.889-1.894). Também foi demonstrado que tumores desenvolvem resistência a anticorpos anti-ponto de verificação imune, ressaltando a necessidade por terapias anticâncer mais duráveis, e fornecidas nesse relatório descritivo.
2. Imunoterapias adotivas
[00245] Na busca para reativar um tumor frio para se tornar mais imunogênico, uma classe de imunoterapias conhecidas como terapia celular adotiva (ACT) engloba diversas estratégias para utilizar células imunes e reprogramá-las para que tenham atividade antitumoral (Hinrichs e cols. (2011) Immunol. Rev. 240: 40-51). Terapias à base de células dendríticas introduzem células dendríticas (DCs) modificadas geneticamente com propriedades mais imunoestimulantes. Essas terapias não foram bem-sucedidas, pois elas não conseguem quebrar a tolerância imune ao câncer (veja, por exemplo, Rosenberg e cols. (2004) Nat. Med. 12:
1.279). Um método de utilização de células tumorais inteiras irradiadas contendo antígenos tumorais endógenos e fator de estimulação de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) para estimular o recrutamento de DC, conhecido como GVAX, similarmente não teve sucesso na clínica em função da ausência de habilidade para quebrar a tolerância do tumor (Copier e cols. (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12: 647-653). Uma terapia à base de células autólogas separadas, Sipuleucel-T (Provenge), foi aprovada pelo “Food and Drug Administration” (FDA - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos) em 2010 para câncer de próstata resistente à castração. Ela utiliza APCs recuperadas do paciente e que são rearmadas para expressar antígeno de fosfatase ácida prostática (PAP) para estimular uma resposta de célula T, e depois reintroduzidas após linfoablação. Infelizmente, sua adoção mais ampla foi limitada por taxas baixas observadas de resposta objetiva e altos custos, e seu uso é limitado somente aos estágios iniciais do câncer de próstata (Anassi e cols. (2011) P T 36 (4): 197-202). Similarmente, terapias de células T autólogas (ATCs) colhem as próprias células T do paciente e as reativam ex vivo para superar a tolerância do tumor, e depois as reintroduzem no paciente após linfoablação. ATCs tiveram sucesso clínico limitado, e apenas no melanoma gerando, ao mesmo tempo, questões sérias de segurança e de praticabilidade que limitam sua utilidade (Yee e cols. (2013) Clin. Cancer Res. 19: 1-3).
[00246] Terapias de célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T) são células T colhidas de pacientes que foram reprogramadas geneticamente para expressar uma proteína de fusão entre o receptor de célula T e um domínio extracelular variável de anticorpo Ig. Isso confere a elas propriedades de reconhecimento de antígeno de anticorpos com as propriedades citolíticas de células T ativadas (Sadelain (2015) Clin. Invest. 125: 3.392-4.000). O sucesso foi limitado às malignidades de célula B e hematopoiéticas, ao custo de eventos adversos mortais relacionados ao sistema imune (Jackson e cols. (2016) Nat. Rev. Clin. Oncol. 13: 370-383). Tumores também podem sofrer mutações para escapar do reconhecimento por um antígeno-alvo, incluindo CD19 (Ruella e cols., (2016) Comput. Struct. Biotechnol. 1 14: 357-362) e EGFRvIII (O'Rourke e cols. (2017) Sci. Transl. Med. Jul 19; 9: 399) fomentando, dessa forma, o escape imune. Além disso, enquanto as terapias de CAR-T são aprovada e são aprovadas no contexto de malignidades hematológicas, elas enfrentam um obstáculo significante quanto à praticabilidade para tratar tumores sólidos: a superação da natureza altamente imunossupressora do microambiente de tumores sólidos. Diversas modificações adicionais às terapias de CAR-T existentes serão necessárias para potencialmente fornecer praticabilidade contra tumores sólidos (Kakarla e cols. (2014) Cancer J. Março-Abril; 20 (2): 151-155). Quando a segurança de CAR-Ts for significantemente aumentada e sua eficácia expandida aos tumores sólidos, a praticabilidade e os custos associados a essas terapias trabalhosas continuarão a limitar sua adoção mais ampla.
3. Vacinas contra o câncer e vírus oncolíticos
[00247] Tumores frios são desprovidos de infiltração de células T e células dendríticas (DC), e não são inflamados por células T (Sharma e cols. (2017) Cell 9; 168 (4): 707- 723). Na busca para reativar um tumor frio torná-lo mais imunogênico, outra classe de imunoterapias fortalece microorganismos que podem se acumular em tumores, naturalmente ou em virtude de modificação por engenharia genética. Esses incluem vírus projetados para estimular o sistema imune para expressar antígenos tumorais ativando e reprogramando, dessa forma, o sistema imune para rejeitar o tumor.
Vacinas à base de vírus contra o câncer falharam clinicamente de forma ampla por diversos fatores, incluindo imunidade preexistente ou adquirida para o próprio vetor viral, bem como a ausência de imunogenicidade suficiente aos antígenos tumorais expressos (Larocca e cols. (2011) Cancer J. 17 (5): 359-371). A ausência de ativação de adjuvante adequada de APCs também dificultou outras vacinas contra o câncer não-vetor viral, por exemplo, vacinas de DNA.
Vírus oncolíticos, em contraste, buscam preferencialmente replicar em células tumorais em divisão sobre tecido saudável e, em consequência, a lise da célula tumoral subsequente leva à morte da célula tumoral imunogênica e disseminação viral adicional.
O vírus oncolítico Talimogene laherparepvec (T- VEC), que usa um vírus do herpes simples modificado em combinação com a citocina recrutadora de DC GM-CSF, é aprovado pelo FDA para melanoma metastático (Bastin e cols. (2016) Biomedicines 4(3): 21). Embora demonstre benefício clínico em alguns pacientes com melanoma, e com menos toxicidades imunes do que com outras imunoterapias, a via de administração intratumoral e condições de fabricação têm sido limitantes, bem como sua ausência de eficácia em tumor distal e aplicação mais ampla para outros tipos de tumor.
Outras vacinas à base de vírus oncolítico (0V), tais como aqueles que utilizam paramixovírus, reovírus e picornavírus, entre outros, tiveram limitações similares na indução de imunidade antitumoral sistêmica (Chiocca e cols. (2014) Cancer Immunol.
Res. 2 (4): 295-300). A administração sistêmica de vírus oncolíticos apresenta desafios únicos.
Mediante administração I.V., o vírus é rapidamente diluído exigindo, dessa forma, altas titulações que podem levar à hepatotoxicidade. Além disso, caso exista imunidade preexistente, o vírus é rapidamente neutralizado no sangue, e a imunidade adquirida então restringe a dosagem repetida (Maroun e cols. (2017) Future Virol. 12 (4): 193-213).
[00248] Das limitações de vetores de vacina de base viral e vírus oncolíticos, as maiores limitações podem ser o vírus propriamente dito. Antígenos virais possuem afinidades surpreendentemente maiores para os receptores de célula T (TCR) humanos, comparados com antígenos tumorais (Aleksic e cols. (2012) Eur. J. Immunol. 42 (12): 3.174-3.179). Antígenos tumorais, apresentados juntamente com antígenos de vetor viral por MEIC-1 na superfície de APCs até mesmo altamente ativadas, serão superados pela ligação aos TCRs, resultando em imunidade antitumoral antígeno-específica muito pobre. Um vetor imunoestimulante direcionado ao tumor, como fornecido nesse relatório descritivo, que não forneça por ele próprio epitopos de célula T de alta afinidade, pode contornar essas limitações. D. IMUNOTERAPIA BACTERIANA CONTRA O CÂNCER
1. Terapias bacterianas
[00249] O reconhecimento de que bactérias possuem atividade anticâncer vem dos anos de 1800, quando vários médicos observaram regressão de tumores em pacientes infectados com Streptococcus pyogenes. William Coley começou o primeiro estudo que utiliza bactérias para o tratamento de cânceres em estágio final, e desenvolveu uma vacina composta por S. pyogenes e Serratia marcescens, que foi usada com sucesso para tratar diversos cânceres, incluindo sarcomas,
carcinomas, linfomas e melanomas. Desde então, diversas bactérias, incluindo espécies de Clostridium, Mycobacterium, Bifidobacterium, Listeria, por exemplo, L. monocytogenes, e espécies de Escherichia, foram estudadas como fontes de vacinas anticâncer (veja, por exemplo, Publicação de Pedido Internacional PCT Nº WO 1999/013053; Publicação de Pedido Internacional PCT Nº WO 2001/025399; Bermudes e cols. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5: 194-199; Patyar e cols. (2010) Journal of Biomedical Science 17: 21; Pawelek e cols. (2003) Lancet Oncol. 4: 548-556).
[00250] Bactérias podem infectar células animais e humanas, e algumas possuem a habilidade inata para liberar DNA no citosol de células, e essas são vetores candidatos para terapia gênica. Bactérias também são adequadas para terapia, pois podem ser administradas oralmente, se propagam prontamente in vitro e in vivo, e podem ser armazenadas e transportadas em um estado liofilizado. A genética bacteriana é facilmente manipulada, e os genomas completos para muitas cepas foram totalmente caracterizados (Felgner e cols. (2016) mbio 7(5): e01220-16). Como resultado, bactérias têm sido usadas para liberar e expressar uma ampla variedade de genes, incluindo aqueles que codificam citocinas, inibidores da angiogênese, toxinas e enzimas conversoras de pró-fármacos. Salmonella, por exemplo, tem sido usada para expressar moléculas imunoestimulantes como IL-18 (Loeffler e cols. (2008) Cancer Gene Ther. 15 (12): 787-794), LIGHT (Loeffler e cols. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (31): 12.879-12.883) e ligante de Fas (Loeffler e cols. (2008) J. Natl. Cancer Inst. 100: 1.113-1.116) em tumores. Vetores bacterianos também são mais baratos e mais fáceis de produzir do que vetores virais, e a liberação bacteriana é favorável em relação à liberação viral, pois ela pode ser eliminada rapidamente por antibióticos, se necessário, tornando-a uma alternativa mais gura.
[00251] Para serem usadas, no entanto, as próprias cepas não podem ser patogênicas ou não podem ser patogênicas após modificação para uso como um terapêutico. Por exemplo, no tratamento de câncer, as cepas bacterianas terapêuticas devem ser atenuadas ou tornadas suficientemente atóxicas de modo a não causar doença sistêmica e/ou choque séptico, mas ainda manterem algum nível de infectividade para colonizar eficazmente tumores. Foram descritas bactérias modificadas geneticamente que devem ser usadas como agentes antitumorais para provocar efeitos tumoricidas diretos e/ou para liberar moléculas tumoricidas (Clairmont e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002; Bermudes, D. e cols. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5: 194-199; Zhao, M. e cols. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 755-760; Zhao, M. e cols. (2006) Cancer Res. 66: 7.647-7.652). Entre essas estão cepas biomodificadas geneticamente de Salmonella enterica sorovar Typhimurium (S. typhimurium). Essas bactérias se acumulam preferencialmente > 1.000 vezes mais em tumores do que em tecidos normais e se dispersam homogeneamente em tecidos tumorais (Pawelek, J. e cols. (1997) Cancer Res. 57: 4.537-
4.544; Low, K. B. e cols. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 37- 41). A replicação preferencial permite que as bactérias produzam e liberem diversos agentes terapêuticos anticâncer em altas concentrações diretamente dentro do tumor minimizando, ao mesmo tempo, a toxicidade para tecidos normais. Essas bactérias atenuadas são seguras em camundongos, porcos e macacos quando administradas por via intravenosa (Zhao, M. e cols. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 755-760; Zhao, M. e cols. (2006) Cancer Res 66:
7.647-7.652; Tjuvajev J. e cols. (2001) J. Control. Release 74: 313-315; Zheng, L. e cols. (2000) Oncol. Res. 12: 127- -135), e certas cepas vivas atenuadas de Salmonella demonstraram ser bem toleradas após administração oral em experimentos clínicos humanos (Chatfield, S.N. e cols. (1992) Biotechnology 10: 888-892; DiPetrillo, M.D. e cols. (1999) Vaccine 18: 449-459; Hohmann, E.L. e cols. (1996) J. Infect. Dis. 173: 1.408-1.414; Sirard, J.C. e cols. (1999) Immunol. Rev. 171: 5-26). O óperon de S. typhimurium phoP/phoQ é um sistema regulador bacteriano de dois componentes típico composto por uma quinase sensora associada à membrana (PhoQ) e um regulador transcricional citoplasmático (PhoP: Miller, S.I. e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5.054-5.058; Groisman, E.A. e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7.077-7.081). PhoP/phoQ é necessário para virulência, e sua deleção resulta em sobrevida pobre dessa bactéria em macrófagos e uma atenuação acentuada em camundongos e humanos (Miller, S.I. e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5.054-5.058; Groisman, E.A. e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7.077-
7.081; Galan, J.E. e Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6: 433-443; Fields, P.I. e cols. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 189-193). Cepas de deleção de PhoP/phoQ foram empregadas como veículos de liberação de vacinas eficazes (Galan, J.E. e Curtiss, R. III. (1989) Microb. Pathog. 6: 433-443; Fields, P.I. e cols. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 189-193; Angelakopoulos, H. e Hohmann, E.L. (2000)
Infect Immun 68: 213-241). Salmonella atenuada tem sido usada para liberação direcionada de proteínas tumoricidas (Bermudes, D. e cols. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5: 194-199; Tjuvaj ev J. e cols. (2001) J. Control. Release 74: 313-315).
[00252] Terapias contra o câncer à base de bactérias demonstraram benefício clínico limitado. Diversas espécies bacterianas, incluindo Clostridium novyi (Dang e cols. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (26): 15.155-15.160; Publicações de Patentes U.S. Nos 2017/0020931, 2015/0147315; Patentes U.S. Nos 7.344.710; 3.936.354), Mycobacterium bovis (Publicações de Patentes U.S. Nos 2015/0224151, 2015/0071873), Bifidobacterium bifidum (Kimura e cols. (1980) Cancer Res. 40: 2.061-2.068), Lactobacillus casei (Yasutake e cols. (1984) Med. Microbiol. Immunol. 173 (3): 113-125), Listeria monocytogenes (Le e cols. (2012) Clin. Cancer Res. 18 (3): 858-868; Starks e cols. (2004) J. Immunol. 173:420-427; Publicação de Patente U.S. Nº 2006/0051380) e Escherichia coli (Patente U.S. Nº 9.320.787) foram estudadas como possíveis agentes para terapia anticâncer.
[00253] A cepa de Bacillus Calmette-Guerin (BCG), por exemplo, é aprovada para o tratamento de câncer da bexiga em humanos, e é mais eficaz do que quimioterapia intravesical, sendo usada frequentemente como um tratamento de primeira- linha (Gardlik e cols. (2011) Gene Therapy 18: 425-431). Outra abordagem utiliza Listeria monocytogenes, uma bactéria intracelular viva atenuada capaz de induzir sensibilização potente de célula T CD8+ aos antígenos tumorais expressos em camundongos (Le e cols. (2012) Clin. Cancer Res. 18 (3):
858-868). Em um experimento clínico da vacina à base de Listeria que incorpora o antígeno tumoral mesotelina, junto com uma vacina GVAX alogênica à base de câncer pancreático em uma abordagem de sensibilização-reforço, uma sobrevida mediana de 6,1 meses foi observada em pacientes com câncer pancreático avançado, versus uma sobrevida mediana de 3,9 meses para pacientes tratados com a vacina GVAX isoladamente (Le e cols. (2015) J. Clin. Oncol. 33 (12): 1.325-1.333). Esses resultados não foram replicados em um estudo de fase 2b maior, o que possivelmente aponta para as dificuldades na tentativa de induzir imunidade a um autoantígeno de afinidade baixa como, por exemplo, mesotelina.
[00254] Cepas bacterianas podem ser modificadas como descrito e exemplificado nesse relatório descritivo para expressar RNA inibidor (RNAi), por exemplo, shRNAs e microRNAs, que inibem ou rompem TREX1 e/ou PD-L1 e, opcionalmente, um ou mais genes adicionais do ponto de verificação imune. As cepas podem ser atenuadas por métodos padronizados e/ou por deleção ou modificação de genes, e por alteração ou introdução de genes que tornam as bactérias capazes de crescer in vivo primariamente em ambientes imunoprivilegiados, por exemplo, o TME, em células tumorais e tumores sólidos. Cepas para modificação como descritas nesse relatório descritivo podem ser selecionadas entre, por exemplo, Shigella, Listeria, E. coli, Bifidobacteriae e Salmonella. Por exemplo, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella disenteriae, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum e Salmonella enteritidis. Outras espécies bacterianas adequadas incluem Rickettsia, Klebsiella, Bordetella,
Neisseria, Aeromonas, Franciesella, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Vibrio, Bacillus e Erysipelothrix. Por exemplo, Rickettsia Rikettsiae, Rickettsia prowazecki, Rickettsia tsutsugamuchi, Rickettsia mooseri, Rickettsia sibirica, Bordetella bronchiseptica, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas salmonicida, Franciesella tularensis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Citrobacter freundii, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus sornnus, Brucella abortus, Mycobacterium intracellulare, Legionella pneumophila, Rhodococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustelae, Vibrio cholerae, Bacillus subtilis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Yersinia enterocolitica, Rochalimaea quintana, e Agrobacterium tumerfacium. Quaisquer bactérias terapêuticas conhecidas, incluindo imunoestimulantes, podem ser modificadas como descrito nesse relatório descritivo.
2. Comparação das respostas imunes às bactérias e vírus
[00255] Bactérias, como vírus, possuem a vantagem de serem naturalmente imunoestimulantes. Bactérias e vírus sabidamente contêm estruturas conservadas conhecidas como Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs), que são percebidos por Receptores de Reconhecimento de Padrão (PRRs) da célula hospedeira. O reconhecimento de PAMPs por PRRs desencadeia cascatas de sinalização a jusante que resultam na indução de citocinas e quimiocinas, e iniciação de respostas imunes que levam à depuração do patógeno (Iwasaki e Medzhitov (2010) Science 327 (5963): 291-295). A forma pela qual o sistema imune inato é engajado por PAMPs, e daquele tipo de agente infeccioso, determina a resposta imune adaptativa apropriada para combater o patógeno invasor.
[00256] Uma classe de PRRs conhecida como Receptores Toll-Like (TLRs) reconhece PAMPs derivados de origens bacterianas e virais, e estão localizados em vários compartimentos dentro da célula. TLRs se ligam a uma gama de ligantes, incluindo lipopolissacarídeo (TLR4), lipoproteínas (TLR2), flagelina (TLRS), motivos CpG não metilados em DNA (TLR9), RNA de fita dupla (TLR3) e RNA de fita simples (TLR7 e TLR8) (Akira e cols. (2001) Nat. Immunol. 2 (8): 675-680; Kawai e Akira (2005) Curr. Opin. Immunol. 17 (4): 338-344). A vigilância do hospedeiro de S. typhimurium, por exemplo, é amplamente mediada por meio de TLR2, TLR4 e TLRS (Arpaia e cols. (2011) Cell 144 (5): 675-688). Esses TLRs sinalizam por meio de moléculas adaptadoras MyD88 e TRIF para mediar a indução de citocinas pró-inflamatórias NF-kB-dependentes como, por exemplo, TNF-α, IL-6 e IFN-γ (Pandey e cols. (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7 (1): a016246).
[00257] Outra categoria de PRRs consistem na família do receptor nod-like (NLR). Esses receptores residem no citosol de células hospedeiras e reconhecem PAMPS intracelulares. Por exemplo, foi demonstrado que flagelina de S. typhimurium ativa o via de inflamassoma de NLRC4/NAIPS, resultando na clivagem de caspase-1 e indução das citocinas pró- inflamatórias IL-1β e IL-18, levando à morte celular piroptótica de macrófagos infectados (Fink e cols. (2007) Cell Microbiol. 9 (11): 2.562-2.570).
[00258] Embora o engajamento de TLR2, TLR4, TLRS e do inflamassoma induza citocinas pró-inflamatórias que medeiam a depuração bacteriana, elas ativam uma cascata de sinalização dirigida predominantemente por NF-KB que leva ao recrutamento e ativação de neutrófilos, macrófagos e células T CD4+, mas não das DCs e células T CD8+ que são necessárias para a imunidade antitumoral (Lui e cols. (2017) Signal Transduct Target Ther. 2: 17.023). A fim de ativar imunidade antitumoral mediada por célula T CD8+, a sinalização de interferon do tipo I IRF3/IRF7-dependente é crucial para ativação de DC e apresentação cruzada de antígenos tumorais para promover sensibilização de célula T CD8+ (Diamond e cols. (2011) J.
Exp.
Med. 208 (10): 1.989-2.003; Fuertes e cols. (2011) J.
Exp.
Med. 208 (10): 2.005-2.016). Interferons do tipo I (IFN-α, IFN-β são as citocinas de assinatura induzidas por duas vias de sinalização TLR-dependente e TLR- independente distintas.
A via TLR-dependente para indução de IFN-β ocorre após endocitose de patógenos, pela qual TLR3, 7, 8 e 9 detectam elementos de DNA e RNA derivados de patógenos dentro dos endossomos.
TLRs 7 e 8 reconhecem nucleosídeos e nucleotídeos virais, e agonistas sintéticos destes, tais como Resiquimod e Imiquimod, foram validados clinicamente (Chi e cols. (2017) Frontiers in Pharmacology 8: 304). dsRNA sintético, por exemplo, ácido poliinosínico:policitidílico (poly (I:C)) e poli ICLC, um análogo que é formulado com poli L lisina para resistir à digestão por RNase, é um agonista para vias de TLR3 e MDAS e um indutor poderoso de IFN-β (Caskey e cols. (2011) Exp.
Med. 208 (12): 2.357-66). A detecção por TLR9 de motivos CpG endossômicos está presente em DNA viral e bacteriano também pode induzir IFN-β por meio de IRF3. Adicionalmente, foi demonstrado que TLR4 induz IFN-β por meio de ativação de
TRIF MyD88-independente de IRF3 (Owen e cols. (2016) mBio.7:1 e02051-15). Foi subsequentemente demonstrado que a ativação por TLR4 de DCs era independente de IFN do tipo I e, portanto, a habilidade de TLR4 para ativar DCs por meio de IFN do tipo I provavelmente não é biologicamente relevante (Hu e cols. (2015) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112:45). Além disso, não foi demonstrado que a sinalização de TLR4 recruta ou ativa diretamente células T CD8+.
[00259] Das vias de IFN do tipo I TLR-independentes, uma é mediada por reconhecimento pelo hospedeiro de RNA de fita simples (ss) e fita dupla (ds) no citosol. Estes são percebidos por RNA helicases, incluindo gene I (RIG-I) induzível por ácido retinóico, gene associado à diferenciação de melanoma 5 (MDA-5), e por meio da fosforilação mediada por proteína adaptadora do estimulador do promotor de IFN-0 1 (IPS-1; também conhecido como proteína de sinalização antiviral mitocondrial ou MAVS) do fator de transcrição de IRF-3, levando à indução de IFN-β (Ireton e Gale (2011) Viruses 3 (6): 906-919). Elementos de ligação de RIG-I sintéticos também foram descobertos involuntariamente em vetores de shRNA lentivirais comuns, na forma de uma sequência de dinucleotídeos AA no sítio de início da transcrição do promotor U6. Sua deleção subsequente no plasmídeo evitou perturbação da ativação de IFN do tipo I fora-do-alvo (Pebernard e cols. (2004) Differentiation 72: 103-111).
[00260] O segundo tipo de via de indução de interferon do tipo I TLR-independente é mediada pelo Estimulador de Genes de Interferon (STING), uma proteína citosólica adaptadora residente no ER que é agora reconhecida como o mediador central para apercepção de dsDNA citosólico de patógenos infecciosos ou dano aberrante da célula hospedeira (Barber (2011) Immunol.
Rev. 243 (1) :99-108). A sinalização de STING ativa o eixo da quinase de ligação TANK (TBK1)/IRF3 e o eixo de sinalização de NF-kB, resultando na indução de IFN-0 e outras citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias que ativam fortemente a imunidade inata e adaptativa (Burdette e cols. (2011) Nature 478 (7370): 515-518). A percepção de dsDNA citosólico por meio de STING exige GMP-AMP cíclico sintase (cGAS), uma nucleotidil transferase da célula hospedeira que se liga diretamente a dsDNA e, em resposta, sintetiza um segundo mensageiro de dinucleotídeo cíclico (CDN), GMP-AMP cíclico (cGAMP), que se liga e ativa STING (Sun e cols. (2013) Science 339 (6121): 786-791; Wu e cols. (2013) Science 339 (6121): 826-830). CDNs derivados de bactérias como, por exemplo, c-di-AMP produzido por Listeria monocytogenes intracelular também podem se ligar diretamente à STING murídea, mas a apenas 3 dos 5 alelos de STING humana.
Diferentemente dos CDNs produzidos por bactérias, nos quais os dois nucleosídeos de purina estão unidos por uma ponte de fosfato com ligações 3'-3', a ponte de fosfato internucleotídeos no cGAMP sintetizado por cGAS de mamíferos é unida por uma ligação não canônica 2'-3'. Essas moléculas 2'-3' se ligam à STING com afinidade 300 vezes melhor do que CDNs 3'-3' bacterianos e, dessa forma, são ligantes fisiológicos mais potentes de STING humana (veja, por exemplo, Civril e cols. (2013) Nature 498 (7454): 332-337; Diner e cols. (2013) Cell Rep. 3 (5): 1.355-1.361; Gao e cols. (2013) Sci.
Signal 6(269): p11; Ablasser e cols. (2013) Nature 503 (7477): 530-534).
[00261] A via de sinalização de cGAS/STING em humanos pode ter se desenvolvido ao longo do tempo para responder preferencialmente aos patógenos virais em relação aos patógenos bacterianos, e isso pode explicar por que vacinas bacterianas que abrigam antígenos do tumor do hospedeiro se transformaram em vetores pobres para sensibilização de células T CD8+ em humanos.
A ativação de células T CD8+ TLR- independente por sinalização de IFN do tipo I STING- dependente por DCs convencionais é o mecanismo primário pelo qual vírus são detectados, com produção de IFN do tipo I TLR-dependente por DCs plasmocitóides operando somente quando a via de STING foi inativada viralmente (Hervas-Stubbs e cols. (2014) J.
Immunol. 193: 1.151-1.161). Além disso, para bactérias como, por exemplo, S. typhimurium, embora capazes de indução de IFN-β por meio de TLR4, células T CD8+ não são induzidas nem necessárias para depuração ou imunidade protetora (Lee e cols. (2012) Immunol.
Lett. 148 (2): 138- 143). A ausência de epitopos de células T CD8+ fisiologicamente relevantes para muitas cepas de bactérias, incluindo S. typhimurium, impediu tanto o desenvolvimento da vacina bacteriana quanto imunidade protetora às infecções subsequentes, até mesmo pelas mesmas cepas genéticas (Lo e cols. (1999) J.
Immunol. 162: 5.398-5.406). Dessa forma, imunoterapias do câncer baseadas em bactérias são biologicamente limitadas em sua habilidade para induzir IFN do tipo I para recrutar e ativar células T CD8+, necessárias para promover apresentação cruzada de antígeno tumoral e imunidade antitumoral durável.
Dessa forma, a modificação por engenharia genética de uma imunoterapia bacteriana fornecida nesse relatório descritivo para induzir sinalização de IFN do tipo I TLR-independente, do tipo viral, ao invés de sinalização imune bacteriana TLR-dependente, induzirá preferencialmente imunidade antitumoral mediada por célula T CD8+.
[00262] STING ativa a imunidade inata em resposta à percepção de ácidos nucleicos no citosol. A sinalização a jusante é ativada por meio de ligação de CDNs, que são sintetizados por bactérias ou pela enzima cGAS do hospedeiro em resposta à ligação ao dsDNA citosólico. CDNs bacterianos e produzidos pelo hospedeiro possuem estruturas de ponte de fosfato distintas, o que diferencia sua capacidade para ativar STING. IFN-β é a citocina de assinatura de STING ativada, e IFN do tipo I induzido viralmente, ao invés de IFN induzido por bactérias, é necessário para imunidade antitumoral mediada por célula T CD8+ eficaz. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo incluem aquelas que são agonistas de STING.
3. Terapia com Salmonella
[00263] Salmonella é exemplar de um gênero bacteriano que pode ser usado como uma terapêutica contra o câncer. A Salmonella exemplificada nesse relatório descritivo é uma espécie atenuada ou uma que, em virtude das modificações para uso como uma terapêutica contra o câncer, possui toxicidade reduzida. a. Bactérias com tropismo para tumores
[00264] Diversas espécies bacterianas demonstraram replicação preferencial dentro de tumores sólidos quando injetadas em um local distal. Essas incluem, sem limitação, espécies de Salmonella, Bifidobacterium, Clostridium e Escherichia. Acredita-se que as propriedades naturais de direcionamento ao tumor das bactérias, combinadas com a resposta imune inata do hospedeiro à infecção bacteriana medeiem a resposta antitumoral. Foi demonstrado que esse tropismo por tecido tumoral reduz o tamanho de tumores em graus variáveis. Um fator contribuinte para o tropismo pelo tumor dessas espécies bacterianas é a habilidade para replicar em ambientes anóxicos ou hipóxicos. Várias dessas bactérias naturalmente trópicas para tumores foram adicionalmente modificadas geneticamente para aumentar a potência da resposta antitumoral (revisão em Zu e cols. (2014) Crit. Rev. Microbiol. 40 (3): 225-235; e Felgner e cols. (2017) Microbial Biotechnology 10 (5): 1.074-10.78). b. Salmonella enterica Sorovar Typhimurium
[00265] Salmonella enterica Sorovar Typhimurium (S. typhimurium) é exemplar de uma espécie bacteriana para uso como um produto terapêutico anticâncer. Uma abordagem para a utilização de bactérias para estimular a imunidade do hospedeiro contra o câncer tem sido através do anaeróbio facultativo Gram-negativo S. typhimurium, que preferencialmente se acumula em áreas hipóxicas e necróticas no corpo, incluindo microambientes tumorais. S. typhimurium se acumula nesses ambientes em função da disponibilidade de nutrientes da necrose tecidual, do extravasamento da vasculatura tumoral e sua probabilidade aumentada de sobreviver no microambiente tumoral de evasão do sistema imune (Baban e cols. (2010) Bioengineered Bugs 1 (6): 385- 294). S. typhimurium é capaz de crescer sob condições tanto aeróbicas quanto anaeróbicas; portanto, ela é capaz de colonizar pequenos tumores que são menos hipóxicos e tumores grandes que são mais hipóxicos.
[00266] S. typhimurium é um patógeno facultativo Gram- negativo, que é transmitido por meio da via fecal-oral. Ela causa infecções gastrintestinais localizadas, mas também entra na corrente sanguínea e sistema linfático após ingestão oral, infectando tecidos sistêmicos como, por exemplo, o fígado, baço e pulmões. A administração sistêmica de S. typhimurium do tipo selvagem hiperestimula a indução de TNF- α, levando a uma cascata de citocinas e choque séptico, os quais, se não tratados, podem ser fatais. Como resultado, cepas bacterianas patogênicas, por exemplo, S. typhimurium, devem ser atenuadas para evitar infecção sistêmica, sem suprimir completamente sua habilidade para colonizar eficazmente tecidos tumorais. A atenuação é frequentemente obtida por mutação de uma estrutura celular que pode provocar uma resposta imune, por exemplo, a membrana externa bacteriana, ou limitação de sua habilidade para replicar na ausência de nutrientes suplementares.
[00267] S. typhimurium é um patógeno intracelular que é rapidamente recolhido por células mielóides, por exemplo, macrófagos, ou ela pode induzir sua própria captação em células não fagocíticas como, por exemplo, células epiteliais. Uma vez dentro das células, ela pode replicar dentro de um vacúolo que contém Salmonella (SCV) e também pode escapar para o citosol de algumas células epiteliais. Muitos dos determinantes moleculares da patogenicidade de S. typhimurium foram identificados e os genes estão agrupados em ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPIs). As duas ilhas de patogenicidade mais bem caracterizadas são SPI-1, que é responsável pela mediação da invasão bacteriana de células não fagocíticas, e SPI-2, que é necessária para replicação dentro do SCV (Agbor e McCormick (2011) Cell Microbiol. 13 (12): 1.858-1.869). Ambas essas ilhas de patogenicidade codificam estruturas macromoleculares denominadas sistemas de secreção do tipo três (T3SS) que podem translocar proteínas efetoras através da membrana do hospedeiro (Galan e Wolf-Watz (2006) Nature 444: 567-573). c. Atenuação bacteriana
[00268] Bactérias terapêuticas para administração como um tratamento contra o câncer devem ser atenuadas. Vários métodos para a atenuação de patógenos bacterianos são conhecidos na técnica. Mutações auxotróficas, por exemplo, tornam as bactérias incapazes de sintetizar um nutriente essencial, e deleções/mutações em genes como, por exemplo, aro, pur, gua, thy, nad e asd (Publicação de Patente U.S. Nº 2012/0009153) são amplamente usadas. Nutrientes produzidos por vias de biossíntese que envolvem esses genes estão frequentemente indisponíveis em células hospedeiras e, dessa forma, a sobrevida bacteriana é desafiadora. Por exemplo, a atenuação de Salmonella e outras espécies pode ser obtida por deleção do gene aroA, que é parte da via de chiquimato, conectando a glicólise à biossíntese de aminoácidos aromáticos (Felgner e cols. (2016) MBio 7 (5): e01220-16). A deleção de aroA, portanto, resulta em auxotrofia bacteriana para aminoácidos aromáticos e atenuação subsequente (Publicações de Patentes U.S. Nos 2003/0170276, 2003/0175297, 2012/0009153, 2016/0369282; Publicações de Pedido Internacional Nos WO 2015/032165 e WO 2016/025582).
[00269] Similarmente, outras enzimas envolvidas em uma via de biossíntese para aminoácidos aromáticos, incluindo aroC e aroD, foram deletadas para obter atenuação (Publicação de Patente U.S. Nº 2016/0369282; Publicação de Pedido Internacional de Patente Nº WO 2016/025582). Por exemplo, S. typhimurium cepa SL7207 é auxotrófica para aminoácido aromático (mutante aroA”); cepas A1 e A1-R são auxotróficas para leucina-arginina.
[00270] VNP20009 é uma auxotrófica para purina (mutante purl). Como mostrado nesse relatório descritivo, ela também é auxotrófica para o nucleosídeo imunossupressor adenosina.
[00271] Mutações que atenuam bactérias também incluem, sem limitação, mutações em genes que alteram a biossíntese de lipopolissacarídeo, por exemplo, rfaL, rfaG, rfaH, rfaD, rfaP, rFb, rfa, msbB, htrB, firA, pagL, pagP, lpxR, arnT, eptA, e lpxT; mutações que introduzem um gene suicida, por exemplo, sacB, nuk, hok, gef, kil ou phlA; mutações que introduzem um gene de lise bacteriana, por exemplo, hly e cly; mutações em fatores de virulência, por exemplo, IsyA, pag, prg, iscA, virG, plc e act; mutações que modificam a resposta ao estresse, por exemplo, recA, htrA, htpR, hsp e groEL; mutações que rompem o ciclo celular, por exemplo, min; e mutações que rompem ou inativam funções regulatórias, por exemplo, cya, crp, phoP/phoQ, e ompR (Publicações de Patentes U.S. Nos 2012/0009153, 2003/0170276, 2007/0298012; Patente U.S. Nº 6.190.657; Publicação de Pedido Internacional Nº WO 2015/032165; Feigner e cols. (2016) Gut Microbes 7 (2): 171-177; Broadway e cols. (2014) J. Biotechnology 192: 177-178; Frahm e cols. (2015) mBio 6(2): e00254-15; Kong e cols. (2011) Infection and Immunity 79 (12): 5.027-5.038; Kong e cols. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109 (47): 19.414-19.419). Idealmente, as atenuações genéticas compreendem deleções de genes ao invés de mutações pontuais para evitar mutações compensatórias espontâneas que possam resultar em reversão para um fenótipo virulento. i. Mutantes msbB-
[00272] A biossíntese da enzima lipídeo A miristoiltransferase, codificada pelo gene msbB em S. typhimurium, catalisa a adição de um grupo miristil terminal ao domínio de Lipídeo A de lipopolissacarídeo (LPS) (Low e cols. (1999) Nat. Biotechnol. 17 (1): 37-41). A deleção de msbB, dessa forma, altera a composição de acil do domínio de Lipídeo A de LPS, o componente principal das membranas externas de bactérias Gram-negativas. Essa modificação reduz significantemente a habilidade do LPS para induzir choque séptico, atenuando a cepa bacteriana e reduzindo a produção potencialmente prejudicial de TNFa reduzindo, dessa forma, a toxicidade sistêmica. Mutantes msbB de S. typhimurium mantêm sua habilidade para colonizar preferencialmente tumores em relação a outros tecidos em camundongos e retêm atividade antitumoral aumentando, dessa forma, o índice terapêutico de produtos imunoterapêuticos à base de Salmonella (Publicações de Patentes U.S. Nos 2003/0170276, 2003/0109026, 2004/0229338, 2005/0225088, 2007/0298012).
[00273] Por exemplo, a deleção de msbB na cepa VNP20009 de S. typhimurium resulta na produção de um LPS predominantemente penta-acilado, que é menos tóxico do que o LPS hexa-acilado nativo e permite a liberação sistêmica sem a indução de choque tóxico (Lee e cols. (2000) International Journal of Toxicology 19: 19-25). Outras mutações de LPS podem ser introduzidas nas cepas bacterianas fornecidas nesse relatório descritivo, incluindo nas cepas de Salmonella, que reduzem dramaticamente a virulência e,
dessa forma, fornecem toxicidade menor, e permitem a administração de doses maiores. ii. Mutantes purr
[00274] Bactérias imunoestimulantes que podem ser atenuadas tornando-as auxotróficas para um ou mais nutrientes essenciais, por exemplo, purinas (por exemplo, adenina), nucleosídeos (por exemplo, adenosina) ou aminoácidos (por exemplo, arginina e leucina), são empregados. Em particular, em modalidades das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, por exemplo, S. typhimurium, as bactérias são tornadas auxotróficas para adenosina, que preferencialmente se acumula em microambientes tumorais. Dessa forma, as cepas de bactérias imunoestimulantes descritas nesse relatório descritivo são atenuadas, pois elas precisam de adenosina para o crescimento, e elas preferencialmente colonizam TMEs, que, como discutido abaixo, possui uma abundância de adenosina. Fosforribosilaminoimidazol sintetase, uma enzima codificada pelo gene purl (sinônimo com o gene purM), está envolvida em uma via de biossíntese de purinas. A ruptura do gene purl, dessa forma, torna as bactérias auxotróficas para purinas.
[00275] Além de serem atenuados, os mutantes purl estão enriquecidos no ambiente tumoral e possuem atividade antitumoral significante (Pawelek e cols. (1997) Cancer Research 57: 4.537-4.544). Foi descrito previamente que essa colonização resulta da alta concentração de purinas presente no líquido intersticial de tumores como resultado de seu turnover celular rápido. Como as bactérias pull- são incapazes de sintetizar purinas, elas precisam de uma fonte externa de adenina, e acreditava-que isso levaria ao seu crescimento restrito no microambiente tumoral enriquecido em purina (Rosenberg e cols. (2002) J. Immunotherapy 25 (3): 218-225). Embora a cepa VNP20009 fosse inicialmente relatada como contendo uma deleção do gene purl (Low e cols. (2003) Methods in Molecular Medicine Vol. 90, Suicide Gene Therapy: 47-59), análise subsequente do genoma inteiro de VNP20009 demonstrou que o gene purl não está deletado, mas está rompido por uma inversão cromossômica (Broadway e cols. (2014) Journal of Biotechnology 192: 177-178). Todo o gene está contido dentro de duas partes do cromossomo de VNP20009 que é flanqueado por sequências de inserção (uma das quais possui uma transposase ativa).
[00276] Foi demonstrado nesse relatório descritivo que cepas mutantes purl de S. typhimurium são auxotróficas para o nucleosídeo adenosina, que está altamente enriquecido em microambientes tumorais.
[00277] Dessa forma, quando se utiliza VNP20009, não é necessário introduzir qualquer modificação adicional para obter auxotrofia de adenosina. Para outras cepas e bactérias, o gene purl pode ser rompido como foi observado em VNP20009, ou ele pode conter uma deleção de todo ou uma porção do gene purl para evitar reversão para um gene do tipo selvagem. iii. Combinações de mutações atenuantes
[00278] Uma bactéria com múltiplas atenuações genéticas por meio de deleções de genes em regiões muito diferentes do cromossomo é desejável para imunoterapias bacterianas, pois a atenuação pode ser aumentada, enquanto se diminui a possibilidade de reversão para um fenótipo virulento por aquisição de genes por recombinação homóloga com um material genético do tipo selvagem. A restauração da virulência por recombinação homóloga exigiria a ocorrência de dois eventos de recombinação separados dentro do mesmo organismo. Idealmente, as combinações de mutações de atenuação selecionadas para uso em um agente imunoterapêutico aumentam a tolerabilidade sem diminuição da potência aumentando, dessa forma, o índice terapêutico. Por exemplo, a ruptura dos genes msbB e purl em S. typhimurium cepa VNP20009 tem sido usada para direcionamento e supressão do crescimento de tumores, e provoca toxicidade baixa em modelos animais (Clairmont e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002; Bermudes e cols. (2000) “Cancer Gene Therapy: Past Achievements and Future Challenges”, editado por Habib Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nova York, páginas 57-63; Low e cols. (2003) “Methods in Molecular Medicine”, Vol. 90, Suicide Gene Therapy: 47-59; Lee e cols. (2000) International Journal of Toxicology 19: 19-25; Rosenberg e cols. (2002) J. Immunotherapy 25 (3): 218-225; Broadway e cols. (2014) J. Biotechnology 192: 177-178; Loeffler e cols. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (31): 12.879-12.883; Luo e cols. (2002) Oncology Research 12: 501-508). Quando VNP20009 (msbB- /purl) foi administrado aos camundongos que abrigam tumores singênicos ou de xenoenxerto humano, as bactérias se acumulavam preferencialmente dentro dos componentes extracelulares de tumores em proporções que excedem 300-
1.000 para 1, reduziam a indução de TNFa e demonstraram regressão do tumor e prolongaram a sobrevida, comparados com camundongos de controle (Clairmont e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002).
[00279] Resultados do experimento clínico de Fase 1 em humanos, no entanto, revelaram que, embora VNP20009 fosse relativamente segura e bem tolerada, foi observado acúmulo pobre em tumores de melanoma humano, e muito pouca atividade antitumoral foi demonstrada (Toso e cols. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1): 142-152). Doses maiores, que são necessárias para manifestar qualquer atividade antitumoral, não foram possíveis em função de toxicidade.
[00280] Dessa forma, são necessários aprimoramentos adicionais. A bactéria imunoestimulante fornecida nesse relatório descritivo aborda esse problema. iv. VNP20009 e outras cepas de S. typhimurium atenuadas e do tipo selvagem
[00281] A cepa de partida pode ser uma cepa não atenuada do tipo selvagem, por exemplo, uma cepa que possui todas as características de identificação de ATCC 14028. A cepa é então modificada para aumentar sua especificidade ou direcionamento ao microambiente tumoral ou às células tumorais e/ou às células imunes residentes no tumor. Ela também pode ser modificada para ser auxotrófica para adenosina. A cepa pode ser tornada flagelina- (fliC-AB-) e, opcionalmente, um ou mais de msb_B-, purl/M e pagP-. As cepas também podem ser asd-. As cepas modificadas codificam um produto terapêutico em um plasmídeo, geralmente presente em número de cópias baixo para médio, sob o controle de um promotor reconhecido por um hospedeiro mamífero, por exemplo, RNA polimerase II ou III. Sequências regulatórias adicionais para o controle da expressão no microambiente tumoral e tráfico nas células também podem ser incluídas.
[00282] Exemplares de uma bactéria terapêutica que pode ser modificada como descrito nesse relatório descritivo é a cepa designada como VNP20009 (ATCC # 202165, YS1646), que é derivada da cepa Nº de Acesso ATCC 14028. A cepa designada VNP20009 (ATCC # 202165, YS1646), era um candidato clínico, e pelo menos 50.000 vezes atenuada para segurança por deleção dos genes msbB e purl (Clairmont e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002; Low e cols. (2003) “Methods in Molecular Medicine”, Vol. 90, Suicide Gene Therapy: 47-59; Lee e cols. (2000) International Journal of Toxicology 19:19- 25).
[00283] Cepas de Salmonella similares que são atenuadas também são contempladas. Como descrito acima, a deleção de msbB altera a composição do domínio de Lipídeo A de lipopolissacarídeo, o componente principal de membranas externas bacterianas Gram-negativas (Low e cols. (1999) Nat. Biotechnol. 17 (1): 37-41). Isso evita o choque séptico induzido por lipopolissacarídeos, atenuando a cepa bacteriana e reduzindo a toxicidade sistêmica reduzindo, ao mesmo tempo, a produção potencialmente prejudicial de TNFa (Dinarello, C.A. (1997) Chest 112 (6 Supl.): 3.215-3.295; Low e cols. (1999) Nat. Biotechnol. 17 (1): 37-41). A deleção do gene purl torna as bactérias auxotróficas para purinas, o que atenua ainda mais as bactérias e as enriquece no microambiente tumoral (Pawelek e cols. (1997) Cancer Res. 57: 4.537-4.544; Broadway e cols. (2014) J. Biotechnology 192: 177-178).
[00284] O acúmulo de VNP20009 em tumores resulta de uma combinação de fatores, que incluem: a invasividade inerente da cepa parental, Número de Acesso ATCC 14028, sua habilidade para replicar em ambientes hipóxicos, e sua necessidade de concentrações elevadas de purinas que estão presentes no líquido intersticial de tumores. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que VNP20009 também é auxotrófica para o nucleosídeo adenosina, que pode se acumular até níveis patologicamente elevados no microambiente tumoral e contribuem para um microambiente tumoral imunossupressor (Peter Vaupel e Arnulf Mayer “Oxygen Transport to Tissue XXXVII”, Advances in Experimental Medicine and Biology 876 capítulo 22, páginas 177-183). VNP20009 foi administrada em camundongos que abrigam tumores singênicos ou de xenoenxerto humano, e as bactérias se acumularam preferencialmente dentro dos componentes extracelulares de tumores em proporções que excedem 3001.000 para 1 e demonstraram inibição do crescimento tumoral, bom como sobrevida prolongada, comparados com camundongos de controle (Clairmont e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002).
[00285] Os resultados do experimento clínico de Fase 1 revelaram que, embora VNP20009 fosse relativamente segura e bem tolerada, foi observado acúmulo pobre em tumores de melanoma humano, e muito pouca atividade antitumoral foi demonstrada (Toso e cols. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (1): 142-152). Doses maiores, que seriam necessárias para afetar qualquer atividade antitumoral, não foram possíveis em função da toxicidade que se correlacionava com níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias. As modificações fornecidas nesse relatório descritivo, incluindo a deleção de flagelina (fliC-AB), e modificações de pagP- e/ou hilA- opcionais, aumentam significantemente o acúmulo das bactérias imunoestimulantes em tumores, no microambiente tumoral e/ou em células imunes residentes no tumor, por exemplo, células mielóides. Outras modificações que aumentam o direcionamento às células imunes e eliminam a infecção de outras células, por exemplo, células epiteliais, aumentam o acúmulo das bactérias nos tumores e no microambiente tumoral. Modificações adicionais para tornar as bactérias do tipo selvagem auxotróficas para adenosina aumentam ainda mais o acúmulo no microambiente tumoral.
[00286] Outras cepas de S. typhimurium podem ser usadas para liberação direcionada ao tumor de proteínas terapêuticas e terapia como, por exemplo, auxotrófica para leucina-arginina A-1 (Zhao e cols. (2005) PNAS 102 (3): 755- 760; Yu e cols. (2012) Scientific Reports 2: 436; Patente U.S. Nº 8.822.194; Publicação de Patente U.S. Nº 2014/0178341) e seu derivado AR-1 (Yu e cols. (2012) Scientific Reports 2: 436; Kawagushi e cols. (2017) Oncotarget 8 (12): 19.065-19.073; Zhao e cols. (2006) Cancer Res. 66 (15): 7.647-7.652; Zhao e cols. (2012) Cell Cycle 11 (1): 187-193; Tome e cols. (2013) Anticancer Research 33: 97-102; Murakami e cols. (2017) Oncotarget 8 (5): 8.035-
8.042; Liu e cols. (2016) Oncotarget 7 (16): 22.873-22.882; Binder e cols. (2013) Cancer Immunol. Res. 1 (2): 123-133); cepa mutante aroA- de S. typhimurium SL7207 (Guo e cols. (2011) Gene Therapy 18: 95-105; Publicações de Patentes U.S. Nos 2012/0009153, 2016/0369282 e 2016/0184456) e seu derivado anaeróbio obrigatório YB1 (WO 2015/032165; Yu e cols. (2012) Scientific Reports 2: 436; Leschner e cols. (2009) PLoS ONE 4(8): e6692; Yu e cols. (2012) Scientific Reports 2:436); cepa mutante aroA-/aroD- de S. typhimurium BRD509, a derivado da cepa SL1344 (WT) (Yoon e cols. (2017) European J. of Cancer 70: 48-61); cepa mutante asol-/cya-/crp- de S. typhimurium x4550 (Sorenson e cols. (2010) Biology: Targets
& Therapy 4: 61-73) e cepa phoP/phoQ- de S. typhimurium LH430 (WO 2008/091375).
[00287] A cepa VNP20009 não exibiu um benefício clínico em um estudo que envolve pacientes com melanoma avançado, mas o tratamento foi administrado com segurança a pacientes com câncer avançado. Uma dose máxima tolerada (MTD) foi estabelecida. Dessa forma, essa cepa, bem como outras cepas bacterianas similarmente modificadas geneticamente, pode ser usada como um material de partida para veículos de liberação terapêutica, de direcionamento a tumores. As modificações fornecidas nesse relatório descritivo fornecem uma estratégia para aumentar eficácia, por aumento da eficiência antitumoral e/ou da segurança e tolerabilidade do agente terapêutico. v. S. typhimurium modificada geneticamente para liberar macromoléculas
[00288] S. typhimurium também foi modificada para liberar o antígeno tumor-associado (TAA) survivina (SVN) às APCs para sensibilizar a imunidade adaptativa (Publicação de Patente U.S. Nº 2014/0186401; Xu e cols. (2014) Cancer Res. 74 (21): 6.260-6.270). SVN é um inibidor da proteína de apoptose (IAP) que prolonga a sobrevida celular e fornece controle do ciclo celular, e está superexpressa em todos os tumores sólidos e pobremente expressa em tecidos normais. Essa tecnologia utiliza a Ilha de Patogenicidade de Salmonella 2 (SPI-2) e seu sistema de secreção do tipo III (T3SS) para liberar os TAAs no citosol de APCs, que então são ativadas para induzir células T CD8+ TAA-específicas e imunidade antitumoral (Xu e cols. (2014) Cancer Res. 74 (21):
6.260-6.270). Similar às vacinas de TAA baseadas em Listeria,
essa abordagem se mostrou promissora em modelos em camundongo, mas ainda tem que demonstrar sensibilização de célula T antígeno tumoral-específica eficaz em humanos.
[00289] Além da liberação gênica, S. typhimurium também tem sido usada para a liberação de pequenos RNAs interferentes (siRNAs) e RNAs hairpin curtos (shRNAs) para terapia contra o câncer. Por exemplo, S. typhimurium atenuada foi modificada para expressar certos shRNAs, tais como aqueles que visam STAT3 e IDO1 (PCT/US2007/074272 e Patente U.S. Nº 9.453,227). VNP20009 transformada com um plasmídeo de shRNA contra o gene imunossupressor indolamina desoxigenase (IDO), silenciou com sucesso a expressão de IDO em um modelo de melanoma murídeo, resultando em morte da célula tumoral e infiltração significante do tumor por neutrófilos (Blache e cols. (2012) Cancer Res. 72 (24):
6.447-6.456). A combinação desse vetor com a co- administração de uma hialuronidase, por exemplo, PH2O solúvel PEGuilado (PEGPH2O; uma enzima que depleta hialuronano extracelular), mostra resultados positivos no tratamento de tumores de adenocarcinoma pancreático ductal (Manuel e cols. (2015) Cancer Immunol. Res. 3 (9): 1.096-
1.107; Publicação de Patente U.S. Nº 2016/0184456). EM outro estudo, foi verificado que uma cepa de S. typhimurium atenuada por uma deleção phoP/phoQ e que expressa um shRNA específico para transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3), inibe o crescimento tumoral e reduz o número de órgãos metastáticos, estendendo a vida de camundongos C57BL6 (Zhang e cols. (2007) Cancer Res. 67 (12): 5.859-5.864). Em outro exemplo, S. typhimurium cepa SL7207 foi usada para a liberação de shRNA que visa CTNNB1, o gene que codifica β-
catenina (Guo e cols. (2011) Gene Therapy 18: 95-105; Publicações de Patentes U.S. Nos 2009/0123426, 2016/0369282), enquanto S. typhimurium cepa VNP20009 foi usada na liberação de shRNA que visa a STAT3 (Manuel e cols. (2011) Cancer Res. 71 (12): 4.183-4.191; Publicações de Patentes U.S. Nos 2009/0208534, 2014/0186401, 2016/0184456; WO 2008/091375; WO 2012/149364). siRNAs que visam os genes de autofagia Atg5 e Beclinl foram liberados as células tumorais usando cepas de S. typhimurium A1-R e VNP20009 (Liu e cols. (2016) Oncotarget 7 (16): 22.873-22.882). É necessário o aprimoramento dessas cepas de modo que colonizem mais eficazmente tumores, o TME e/ou células imunes residentes no tumor, e também estimulem a resposta imune, e possuam outras propriedades vantajosas, por exemplo, as bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo. Modificações de várias bactérias foram descritas na Publicação de Pedido Internacional PCT Nº WO 2019/014398 e Publicação U.S. Nº 2019/0017050 A1. As bactérias descritas em uma cada dessas publicações, também descritas nesse relatório descritivo, podem ser modificadas como descrito nesse relatório descritivo para aprimorar ainda mais as propriedades imunoestimulantes e de direcionamento a tumores.
[00290] As bactérias podem ser modificadas como descrito nesse relatório descritivo para terem efeitos inflamatórios reduzidos e, dessa forma, para serem menos tóxicas. Como resultado, por exemplo, dosagens maiores podem ser administradas. Qualquer uma dessas cepas de Salmonella, bem como das outras espécies de bactérias, conhecidas por aqueles habilitados na técnica e/ou listadas acima e nesse relatório descritivo, pode ser modificada como descrito nesse relatório descritivo, por exemplo, por introdução de auxotrofia de adenosina, um plasmídeo que codifica um produto terapêutico, por exemplo, uma proteína imunoestimulante e/ou RNAi, por exemplo, miRNA ou shRNA, ou um anticorpo ou fragmento deste, para a inibição de um ponto de verificação imune, e outras modificações como descritas nesse relatório descritivo. Exemplares são as espécies de S. typhimurium descritas nesse relatório descritivo.
[00291] As cepas bacterianas fornecidas nesse relatório descritivo são modificadas geneticamente para liberar moléculas terapêuticas. As cepas nesse relatório descritivo liberam proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, que promovem uma resposta imune antitumoral no microambiente tumoral. As cepas também podem incluir modificações genômicas que reduzem piroptose de células fagocíticas fornecendo, dessa forma, uma resposta imune mais robusta, e/ou reduzem ou eliminam a habilidade para infectar/invadir células epiteliais, mas retêm a habilidade para infectar/invadir células fagocíticas, de modo que se acumulam mais eficazmente em tumores e em células imunes residentes no tumor. As cepas bacterianas também podem ser modificadas para codificar produtos terapêuticos incluindo, por exemplo, RNAi direcionado e inibidor para pontos de verificação imune, e também para outros alvos desse tipo.
4. Aprimoramentos de bactérias imunoestimulantes para aumentar o índice terapêutico
[00292] Também são fornecidos nesse relatório descritivo aprimoramentos às bactérias imunoestimulantes que reduzem toxicidade e aumentam a atividade antitumoral. Exemplares desses aprimoramentos são os seguintes. Eles são descritos com relação à Salmonella, particularmente S. typhimurium; subentende-se que aqueles habilitados na técnica podem efetuar aprimoramentos similares em outras espécies bacterianas e outras cepas de Salmonella. a. Deleção do gene asd
[00293] O gene asd em bactérias codifica uma aspartato- semialdeído desidrogenase. Mutantes asd- de S. typhimurium possuem um requisito obrigatório para ácido diaminopimélico (DAP), que é necessário para síntese da parede celular e passarão por lise em ambientes desprovidos de DAP. Essa auxotrofia de DAP pode ser usada para seleção de plasmídeo e manutenção da estabilidade do plasmídeo in vivo sem o uso de antibióticos quando o gene asd é complementado em trans em um plasmídeo. A seleção não baseada em antibióticos de sistemas de plasmídeos é vantajosa e permite: 1) o uso de antibióticos administrados como mecanismo de depuração rápida no caso de sintomas adversos, e 2) o aumento de escala da produção sem antibióticos, na qual esse uso é comumente evitado. O sistema de complementação do gene asd permite essa seleção (Galan e cols. (1990) Gene 28: 29-35). Espera- se que o uso do sistema de complementação do gene asd para manter plasmídeos no microambiente tumoral aumente a potência de S. typhimurium modificada geneticamente para liberar plasmídeos que codificam genes ou RNAs interferentes.
[00294] Um uso alternativo para um mutante asd de S. typhimurium é explorar a auxotrofia de DAP para produzir uma cepa autolítica (ou suicida) para a liberação de macromoléculas às células infectadas sem a habilidade para colonizar persistentemente tumores hospedeiros. A deleção do gene asd torna as bactérias auxotróficas para DAP quando desenvolvidas in vitro ou in vivo.
Um exemplo descrito nesse relatório descritivo fornece uma deleção da cepa asd que é auxotrófica para DAP e contém um plasmídeo adequado para liberação de RNAi, por exemplo, shRNA ou miRNA, que não contém um gene de complementação asd, resultando em uma cepa que é defeituosa para replicação in vivo.
Essa cepa é propagada in vitro na presença de DAP e cresce normalmente, e depois é administrada como um agente imunoterapêutico a um hospedeiro mamífero no qual DAP não está presente.
A cepa suicida é capaz de invadir células hospedeiras, mas não é capaz de replicar em função da ausência de DAP em tecidos mamíferos, lisando automaticamente e liberando seu conteúdo citosólico (por exemplo, plasmídeos ou proteínas). Nos exemplos fornecidos nesse relatório descritivo, uma cepa VNP20009 com o gene asd deletado foi adicionalmente modificada para expressar uma proteína LLO desprovida de sua sequência sinalizadora de secreção periplasmática endógena, fazendo com que ela se acumule no citoplasma da Salmonella.
LLO é uma hemolisina formadora de poros colesterol- dependente de Listeria monocytogenes que medeia o escape fagossomal de bactérias.
Quando a cepa autolítica é introduzida em camundongos com tumor, as bactérias são recolhidas por células imunes fagocíticas e entram no vacúolo que contém Salmonella (SCV). Nesse ambiente, a ausência de DAP evitará a replicação bacteriana, e resulta em autólise das bactérias no SCV.
A lise da cepa suicida permitirá, então, a liberação do plasmídeo e a LLO acumulada que formará poros na membrana do SVC que contém colesterol, e permitirá a liberação do plasmídeo no citosol da célula hospedeira.
b. Auxotrofia de adenosina
[00295] Metabólitos derivados das vias de triptofano e ATP/adenosina são condutores importantes na formação de um ambiente imunossupressivo dentro do tumor. Adenosina, que existe na forma livre dentro e fora das células, é um efetor da função imune. A adenosina diminui a ativação de NF-KB induzida pelo receptor de célula T, e inibe IL-2, IL-4 e IFN-γ. A adenosina diminui a citotoxicidade da célula T, aumenta a anergia de célula T e aumenta a diferenciação de célula T em células T reguladoras (Treg) Foxp3+ ou Lag-3+. Em células NK, a adenosina diminui a produção de IFN-γ, e suprime a citotoxicidade de célula NK. A adenosina bloqueia a adesão e extravasamento de neutrófilos, diminui a fagocitose, e atenua os níveis de superóxido e óxido nítrico. A adenosina também diminui a expressão de TNF-α, IL-12 e MIP-1a sobre macrófagos, atenua a expressão de MEW Classe II e aumenta os níveis de IL-10 e IL-6. A atividade de imunomodulação de adenosina ocorre após sua liberação no espaço extracelular do tumor e ativação de receptores de adenosina (ADRs) na superfície de células-imunes alvo, células de câncer ou células endoteliais. Os níveis elevados de adenosina no microambiente tumoral resultam em imunossupressão local, o que limita a capacidade do sistema imune para eliminar células de câncer.
[00296] A adenosina extracelular é produzida pelas atividades sequenciais de ectoenzimas associadas à membrana, CD39 e CD73, que são expressas em células estromais do tumor, que juntas produzem adenosina por fosfo-hidrólise de ATP ou ADP produzido por células mortas ou moribundas. CD39 converte ATP (ou ADP) extracelular em 5’-AMP, que é convertido em adenosina por 5’-AMP. A expressão de CD39 e CD73 em células endoteliais está aumentada sob as condições hipóxicas do microambiente tumoral aumentando, dessa forma, os níveis de adenosina. A hipóxia do tumor pode resultar de suprimento sanguíneo inadequado e vasculatura tumoral desorganizada, prejudicando a liberação de oxigênio (Carroll e Ashcroft (2005) Expert. Rev. Mol. Med. 7 (6): 1-16). A hipóxia, que ocorre no microambiente tumoral, também inibe adenilato quinase (AK), que converte adenosina em AMP, levando a concentrações extracelulares de adenosina muito altas. A concentração extracelular de adenosina no microambiente tumoral hipóxico foi medida em 10-100 µM, que é até cerca de 100-1.000 vezes maior do que a concentração extracelular de adenosina típica de aproximadamente 0,1 µM (Vaupel e cols. (2016) Adv Exp Med Biol. 876: 177-183; Antonioli e cols. (2013) Nat. Rev. Can. 13: 842-857). Como as regiões hipóxicas em tumores são distais aos microvasos, a concentração local de adenosina em algumas regiões do tumor pode ser maior do que em outras.
[00297] Para os efeitos diretos para inibir o sistema imune, a adenosina também pode controlar o crescimento e disseminação de células de câncer por efeitos sobre a proliferação, apoptose e angiogênese de células de câncer. Por exemplo, a adenosina pode promover a angiogênese, primariamente por meio da estimulação de receptores A2A e A2B. A estimulação dos receptores em células endoteliais pode regular a expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e E-selectina em células endoteliais, manter a integridade vascular e promover o crescimento de vasos (Antonioli e cols. (2013) Nat. Rev. Can. 13: 842-857). A ativação de um ou mais de A2A, A2B ou A3 em várias células por adenosina pode estimular a produção dos fatores pró- angiogênicos, por exemplo, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), interleucina-8 (IL-8) ou angiopoietina 2 (Antonioli e cols. (2013) Nat. Rev. Can. 13: 842-857).
[00298] Adenosina também pode regular diretamente a proliferação, apoptose e metástase da célula tumoral por meio de interação com receptores em células de câncer. Por exemplo, estudos demonstraram que a ativação de receptores A1 e A2A promove a proliferação da célula tumoral em algumas linhagens de célula de câncer de mama, e a ativação de receptores A2B possui propriedades de promoção do crescimento de câncer em células de carcinoma do cólon (Antonioli e cols. (2013) Nat. Rev. Can. 13: 842-857). A adenosina também pode desencadear a apoptose de células de câncer, e vários estudos correlacionaram essa atividade com a ativação da via apoptótica extrínseca por meio de A3 ou da via apoptótica intrínseca por meio de A2A e A2B (Antonioli e cols. (2013)). A adenosina pode promover a migração e metástase da célula tumoral, por aumento da motilidade celular, adesão à matriz extracelular e expressão de proteínas de adesão celular e receptores para promover movimento e motilidade das células.
[00299] A liberação extracelular de trifosfato de adenosina (ATP) ocorre por células imunes estimuladas e células danificadas, moribundas ou estressadas. O inflamassoma do domínio contendo pirina 3 (NLRP3) da família NLR, quando estimulado por essa liberação extracelular de ATP, ativa caspase-1 e resulta na secreção das citocinas IL- β e IL-18, as quais, por sua vez, ativam respostas imunes inatas e adaptativas (Stagg e Smyth (2010) Oncogene 29:
5.346-5.358). ATP é catabolizado em adenosina pelas enzimas CD39 e CD73. A adenosina ativada atua como um metabólito altamente imunossupressor por meio de um mecanismo de feedback-negativo e possui um efeito pleiotrópico contra vários tipos de células imunes no microambiente tumoral hipóxico (Stagg e Smyth (2010) Oncogene 29: 5.346-5.358). Os receptores de adenosina A2A e A2B são expressos em diversas células imunes e são estimulados por adenosina para promover alterações da sinalização mediada por cAMP, resultando em fenótipos imunossupressores de células T, células B, células NK, células dendríticas, mastócitos, macrófagos, neutrófilos e células T NK. Como resultado disso, os níveis de adenosina podem se acumular até mais de cem vezes sua concentração normal em tecidos patológicos, por exemplo, tumores sólidos, que comprovadamente superexpressam ectonucleotidases, por exemplo, CD73. Também foi demonstrado que a adenosina promove angiogênese e desenvolvimento tumoral. Dessa forma, uma bactéria modificada geneticamente que é auxotrófica para adenosina exibiria direcionamento e colonização de tumores aumentados.
[00300] Bactérias imunoestimulantes, por exemplo, Salmonella typhi, podem ser tornadas auxotróficas para adenosina por deleção do gene tsx (Bucarey e cols. (2005) Infection and Immunity 73 (10): 6.210-6.219) ou por deleção de purD (Husseiny (2005) Infection and Immunity 73 (3):
1.598-16.05). Nas bactérias Gram-negativas Xanthomonas oryzae, foi demonstrado que um knockout do gene purD é auxotrófico para adenosina (Park e cols. (2007) FEMS Microbiol. Lett. 276: 55-59). Como exemplificado nesse relatório descritivo, S. typhimurium cepa VNP20009 é auxotrófica para adenosina em função de sua deleção de purl e, dessa forma, a modificação adicional para torná-la auxotrófica para adenosina não é necessária. Dessa forma, modalidades das cepas bacterianas imunoestimulantes, como fornecidas nesse relatório descritivo, são auxotróficas para adenosina. Essas bactérias auxotróficas replicam seletivamente no microambiente tumoral, aumentando ainda mais o acúmulo e replicação das bactérias administradas em tumores e diminuindo os níveis de adenosina dentro e em torno de tumores reduzindo ou eliminando, dessa forma, a imunossupressão causada por acúmulo de adenosina. Exemplares dessas bactérias fornecidas nesse relatório descritivo é uma cepa modificada de S. typhimurium contendo mutações purT /msbB- para fornecer auxotrofia de adenosina. c. Cepas deficientes em flagelina
[00301] Flagelos são organelas na superfície de bactérias que são compostos por um filamento longo anexado por meio de um gancho a um motor giratório que pode girar no sentido horário ou anti-horário para fornecer um meio para locomoção. Flagelos em S. typhimurium são importantes para quimiotaxia e para o estabelecimento de uma infecção por meio da via oral, em função da habilidade para mediar a motilidade através da camada mucosa no trato gastrintestinal. Embora tenha sido demonstrado que os flagelos são necessários para quimiotaxia e colonização de cilindróides tumorais in vitro (Kasinskas e Forbes (2007) Cancer Res. 67 (7): 3.201-3.209), e motilidade tenha se provado importante para penetração do tumor (Toley e Forbes (2012) Integr. Biol. (Camb). 4 (2): 165-176), os flagelos não são necessários para colonização tumoral em animais quando as bactérias são administradas por via intravenosa (Stritzker e cols. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300: 449-456). Cada filamento flagelar é composto por dezenas de milhares de subunidades de flagelina. O cromossomo de S. typhimurium contém dois genes, fliC e fljB, que codificam monômeros antigenicamente distintos de flagelina. Mutantes defeituosos tanto para fliC quanto para fljB são não móveis e avirulentos quando administrados pela via oral de infecção, mas mantêm a virulência quando administrados parenteralmente.
[00302] A flagelina é um determinante pró-inflamatório importante da Salmonella (Zeng e cols. (2003) J. Immunol. 171:3668-3674), e é reconhecida diretamente por TLR5 na superfície de células, e por NLCR4 no citosol (Lightfield e cols. (2008) Nat. Immunol. 9 (10): 1.171-1.178). Ambas as vias levam a respostas pró-inflamatórias resultando na secreção de citocinas, incluindo IL-113, IL-18, TNF-α e IL-
6. Foram feitas tentativas para tornar a imunoterapia do câncer à base de Salmonella mais potente por aumento da resposta pró-inflamatória à flagelina por modificação por engenharia genética das bactérias para secretar flagelina B de Vibrio vulnificus, que induz inflamação maior do que flagelina codificada por fliC e fljB (Zheng e cols. (2017) Sci. Transl. Med. 9 (376): eaak9537).
[00303] Nesse relatório descritivo, bactérias Salmonella, S. typhimurium, são modificadas geneticamente para não possuírem ambas as subunidades de flagelina fliC e fljB, para reduzir a sinalização pró-inflamatória. Por exemplo, como mostrado nesse relatório descritivo, uma cepa de Salmonella desprovida de msbB, que resulta em indução reduzida de TNF-alfa, é combinada com knockouts de fliC e fljB. Isso resulta em uma cepa de Salmonella que possui uma redução combinada na indução de TNF-alfa e redução no reconhecimento por TLR5. Essas modificações podem ser combinadas com msbB-, flir e fljB-, e transformadas com um plasmídeo imunoestimulante, opcionalmente contendo CpGs, e uma molécula terapêutica, por exemplo, um anticorpo ou molécula (s) de RNAi que visa um ponto de verificação imune, por exemplo, TREX1, PD-L1, VISTA, SIRP-alfa, TGF-beta, beta- catenina, CD47, VEGF, e combinações destes. As bactérias resultantes possuem sinalização pró-inflamatória reduzida, mas atividade antitumoral robusta.
[00304] Por exemplo, como fornecido nesse relatório descritivo, um mutante duplo fliC e fljB foi construído na cepa de S. typhimurium com asd deletado VNP20009. VNP20009, que é atenuada para virulência por ruptura de purl/purM, também foi modificada geneticamente para conter uma deleção de msbB que resulta na produção de uma subunidade de lipídeo A que é menos toxigênica do que lipídeo A do tipo selvagem. Isso resulta na produção reduzida de TNF-α no modelo em camundongo após administração intravenosa, comparada com cepas com lipídeo A do tipo selvagem. A cepa resultante é exemplar de cepas que são atenuadas para inflamação bacteriana por modificação de lipídeo A para reduzir a sinalização de TLR2/4, e deleção das subunidades de flagelina para reduzir o reconhecimento por TLR5 e indução de inflamassoma. A deleção das subunidades de flagelina combinada com modificação do LPS permite maior tolerabilidade no hospedeiro, e dirige a resposta imunoestimulante em direção à liberação de interferência de
RNA contra alvos desejados no TME que provocam uma resposta antitumoral e promovem uma resposta imune adaptativa ao tumor. d. Salmonella modificada geneticamente para escapar do Vacúolo que Contém Salmonella (SCV)
[00305] Salmonella, por exemplo, S. typhimurium, são patógenos intracelulares que replicam primariamente em um compartimento ligado à membrana denominado um Vacúolo que Contém Salmonella (SCV). Em algumas linhagens de células epiteliais em uma frequência baixa, foi demonstrado que S. typhimurium escapa para o citosol onde pode replicar. Salmonella modificada geneticamente para escapar do SCV com eficiência maior será mais eficiente na liberação de macromoléculas, por exemplo, plasmídeos, na medida em que a bicamada lipídica do SCV é uma barreira potencial. Também são fornecidos nesse relatório descritivo Salmonella e métodos que possuem frequência aumentada de escape do SCV. Isso é obtido por deleção de genes necessários para formação de filamento induzida por Salmonella (SIF). Esses mutantes possuem uma frequência aumentada de escape do SCV e podem replicar no citosol.
[00306] Por exemplo, a liberação de plasmídeo aumentada com o uso de um mutante sifA de S. typhimurium foi demonstrada. O gene sifA codifica SPI-2, proteína efetora secretada por T3SS-2 que mimetiza ou ativa uma família RhoA de GTPases do hospedeiro (Ohlson e cols. (2008) Cell Host & Microbe 4: 434-446). Outros genes que codificam efetores secretados envolvidos na formação de SIF podem ser visados. Esses incluem, por exemplo, sseJ, sseL, sopD2, pipB2, sseF, sseG, spvB e steA. O aumento do escape de S. typhimurium por prevenção de formação de SIF libera bactérias vivas no citosol, onde podem replicar.
[00307] Outro método para aumentar o escape de S. typhimurium pelo SCV e aumentar a liberação de macromoléculas como, por exemplo, plasmídeos, é a expressão de uma hemolisina heteróloga que resulta em formação de poro, ou ruptura da membrana do SCV. Uma hemolisina desse tipo é a proteína Listeriolisina 0 (LLO) de Listeria monocytogenes, que é codificada pelo gene hlyA. LLO é uma citolisina formadora de poros colesterol-dependente que é secretada por L. monocytogenes e é primariamente responsável pelo escape fagossomal e entrada no citosol de células hospedeiras. A secreção de LLO por S. typhimurium pode resultar em escape bacteriano e levar à replicação no citosol. Para evitar que S. typhimurium intata escape do SCV e replique no citosol, os nucleotídeos que codificam a sequência sinalizadora podem ser removidos do gene. Dessa forma, a LLO ativa está contida dentro do citoplasma da S. typhimurium e LLO só é liberada quando as bactérias passam por lise. Como fornecido nesse relatório descritivo, VNP20009 modificada geneticamente para expressar cytoLLO para aumentar a liberação de plasmídeos para expressão de RNAs interferentes aos alvos, por exemplo, TREX1, pode aumentar a potência terapêutica das bactérias imunoestimulantes. e. Deleções em genes de Salmonella necessários para formação de biofilme
[00308] Bactérias e fungos são capazes de formar estruturas multicelulares denominadas biofilmes. Biofilmes bacterianos estão envolvidos dentro de uma mistura de polissacarídeos, glicoproteínas e glicolipídeos secretados e associados à parede celular, bem como DNA extracelular, conhecidos coletivamente como substâncias poliméricas extracelulares. Essas substâncias poliméricas extracelulares protegem as bactérias de várias agressões, por exemplo, agentes de limpeza, antibióticos e peptídeos antimicrobianos. Biofilmes bacterianos permitem a colonização de superfícies, e são uma causa de infecção significante de próteses, por exemplo, portas de injeção e cateteres. Biofilmes também podem se formar em tecidos durante a evolução de uma infecção, o que leva a aumentos na duração de persistência e derramamento bacterianos, e limita a eficácia de terapias antibióticas. A persistência crônica de bactérias em biofilmes está associada com tumorigênese aumentada, por exemplo, em infecção por S. typhi da vesícula biliar (Di Domenico e cols. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:
1.887).
[00309] A formação de biofilme por S. typhimurium é regulada por CsgD. CsgD ativa o óperon csgBAC, o que resulta na produção aumentada das subunidades de fímbrias Curli CsgA e CsgB (Zakikhani e cols. (2010) Molecular Microbiology 77 (3): 771-786). CsgA é reconhecida como uma PAMP por TLR2 e induz a produção de IL-8 por macrófagos humanos (Tukel e cols. (2005) Molecular Microbiology 58 (1): 289-304). Além disso, CsgD aumenta indiretamente a produção de celulose por ativação do gene adrA que codifica diguanilato ciclase. O monofosfato de diguanosina cíclico de pequena molécula (c- di-GMP) gerado por AdrA é um mensageiro secundário ubíquo encontrado em quase todas as espécies bacterianas. O aumento mediado por AdrA em c-di-GMP aumenta a expressão do gene de celulose sintetase bcsA, que, por sua vez, aumenta a produção de celulose por meio de estimulação dos óperons bcsABZC e bcsEFG. A redução na capacidade de bactérias imunoestimulantes como, por exemplo, S. typhimurium, para formar biofilmes pode ser obtida por meio da deleção de genes envolvidos na formação de biofilme como, por exemplo, csgD, csgA, csgB, adrA, bcsA, bcsB, bcsZ, bcsE, bcsF, bcsG, dsbA ou dsbB (Anwar e cols. (2014) Plos One 9(8): e106095).
[00310] S. typhimurium pode formar biofilmes em tumores sólidos como proteção contra fagocitose por células hospedeiras imunes. Mutantes de Salmonella que não podem formar biofilmes são recolhidos mais rapidamente por células fagocíticas do hospedeiro e são depurados de tumores infectados (Crull e cols. (2011) Cellular Microbiology 13 (8): 1.223-1.233). Esse aumento na localização intracelular dentro de células fagocíticas pode reduzir a persistência de bactérias extracelulares, e aumenta a eficácia da liberação de plasmídeo e knockdown de genes por interferência de RNA, como descrito nesse relatório descritivo. Bactérias imunoestimulantes modificadas geneticamente para reduzir a formação de biofilme aumentarão a taxa de depuração de tumores/tecidos e, portanto, aumentarão a tolerabilidade da terapia, e evitarão a colonização de próteses em pacientes aumentando, dessa forma, o benefício terapêutico dessas cepas. Os miméticos de adenosina podem inibir a formação de biofilme por S. typhimurium, indicando que a concentração elevada de adenosina no microambiente tumoral pode contribuir para a formação de biofilme associada aos tumores (Koopman e cols. (2015) Antimicrob Agents Chemother 59:76 - 84). Como fornecidas nesse relatório descritivo, cepas vivas de bactérias atenuadas, por exemplo, S. typhimurium, que contêm uma ruptura de purl (e, portanto, colonizam tumores ricos em adenosina), e também são impedidas de formar biofilmes, por deleção de um ou mais genes necessários para formação de biofilme, são modificadas geneticamente para liberar plasmídeos que codificam RNA interferente para estimular uma resposta imune antitumoral robusta.
[00311] O gene adrA codifica uma diguanilato ciclase que produz c-di-GMP, que é necessário para formação de biofilme por S. typhimurium. c-di-GMP se liga e é um agonista para a proteína citosólica STING do hospedeiro. Como descrito acima, agonistas de STING são buscados como tratamentos anticâncer, adjuvantes de vacinas, e para que bactérias modificadas geneticamente secretem dinucleotídeos cíclicos para uso em imunoterapias (Libanova 2012, poster em AACR Synlogic 2018). Bactérias imunoestimulantes que são reduzidas na produção de c-di-GMP por meio da deleção de adrA são contraintuitivas, mas mutantes bacterianos, por exemplo, mutantes de S. typhimurium, que são incapazes de formar biofilmes (incluindo um mutante adrA), demonstraram terapêutico potencial reduzido em modelos de tumor em camundongos (Crull e cols. (2011) Cellular Microbiology 13 (8): 1.223-1.233). Vários alelos humanos de STING são refratários à ligação a 3'3' CDNs produzidos por bactérias (Corrales e cols. (2015) Cell Reports 11: 1.022-1.023).
[00312] Como descrito nesse relatório descritivo, cepas bacterianas, por exemplo, cepas de S. typhimurium, que são modificadas geneticamente para serem auxotróficas de adenosina, e são reduzidas em sua habilidade para induzir citocinas pró-inflamatórias por modificação do LPS e/ou deleção de flagelina, e/ou deleção de genes necessários para formação de biofilme, e adicionalmente modificadas para liberar RNAs interferentes, promovem respostas imunes antitumorais robustas. f. Deleções em genes na via biossintética de LPS
[00313] O LPS de bactérias Gram-negativas é o componente principal do folheto externo da membrana bacteriana. Ele é composto por três partes principais, lipídeo A, um oligossacarídeo central não repetitivo, e o antígeno 0 (ou polissacarídeo 0). O antígeno 0 é a porção mais externa em LPS e serve como uma camada protetora contra permeabilidade bacteriana; no entanto, a composição de açúcar do antígeno 0 varia amplamente entre cepas. O lipídeo A e o oligossacarídeo central variam menos, e estão mais tipicamente conservados dentro de cepas da mesma espécie. Lipídeo A é a porção de LPS que contém atividade de endotoxina. Ele é tipicamente um dissacarídeo decorado com múltiplos ácidos graxos. Essas cadeias hidrofóbicas de ácido graxo ancoram o LPS na membrana bacteriana, e o resto do LPS se projeta da superfície celular. O domínio de Lipídeo A é responsável por boa parte da toxicidade de bactérias Gram- negativas. Tipicamente, LPS no sangue é reconhecido como um padrão molecular associado a patógeno (PAMP) significante e induz uma resposta pró-inflamatória profunda. LPS é o ligante para um complexo receptor ligado à membrana que compreende CD14, MD2 e TLR4. TLR4 é uma proteína transmembrana que pode sinalizar por meio das vias de MyD88 e TRIF para estimular a via de NFKB e resultar na produção de citocinas pró- inflamatórias, por exemplo, TNF-α e IL-β, cujo resultado pode ser choque endotóxico, que pode ser fatal. LPS no citosol de células de mamíferos pode se ligar diretamente aos domínios CARD de caspases 4, 5 e 11, levando à autoativação e morte celular piroptótica (Hagar e cols. (2015) Cell Research 25: 149-150). A composição de lipídeo A e a toxigenicidade de variantes de lipídeo A são bem documentadas. Por exemplo, um lipídeo A monofosforilado é bem menos inflamatório do que lipídeo A com múltiplos grupos fosfato. O número e comprimento das cadeias acil no lipídeo A também podem ter um impacto profundo sobre o grau de toxicidade. Lipídeo A canônico de E. coli possui seis cadeias acil, e essa hexa-acilação é potentemente tóxica. Lipídeo A de S. typhimurium é similar àquele de E. coli; ele é um dissacarídeo de glucosamina que carrega quatro cadeias hidroxiacil primárias e duas secundárias (Raetz e Whitfield (2002) Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700).
[00314] Como descrito acima, mutantes msbB de S. typhimurium não podem passar por miristoilação terminal de seu LPS e produzem predominantemente LPS penta-acilado que é significantemente menos tóxico do que lipídeo A hexa- acilado. A modificação de lipídeo A com palmitato é catalisada por palmitoil transferase (PagP). A transcrição do gene pagP está sob o controle do sistema PhoP/PhoQ, que é ativado por concentrações baixas de magnésio, por exemplo, dentro do SCV. Dessa forma, o teor de acil de S. typhimurium é variável, e com bactérias do tipo selvagem ele pode ser hexa- ou penta-acilado.
[00315] A habilidade de S. typhimurium para palmitar seu lipídeo A aumenta a resistência aos peptídeos antimicrobianos que são secretados em fagolisossomos.
[00316] Em S. typhimurium do tipo selvagem, a expressão de pagP resulta em um lipídeo A que é hepta-acilado. Em um mutante msbB (no qual a cadeia acil terminal do lipídeo A não pode ser adicionada), a indução de pagP resulta em um LPS hexa-acilado (Kong e cols. (2011) Infection and Immunity 79 (12): 5.027-5.038). Foi demonstrado que LPS hexa-acilado é o mais pró-inflamatório. Embora outros grupos tenham buscado explorar esse sinal pró-inflamatório, por exemplo, por deleção de pagP para permitir que somente LPS hexa- acilado seja produzido (Felgner e cols. (2016) Gut Microbes 7 (2): 171-177; Felgner e cols. (2018) Oncoimmunology 7 (2): e1382791), isso pode levar a uma baixa tolerabilidade, em decorrência da natureza pró-inflamatória mediada por TNF-α do LPS e paradoxalmente menos imunidade adaptativa (Kocijancic e cols. (2017) Oncotarget 8 (30): 49.988-
50.001).
[00317] LPS é um agonista de TLR-4 potente que induz TNF- α e IL-6. As toxicidades dose-limitantes no experimento clínico de VNP20009 I.V. (Toso e cols. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (1): 142-152) a 1E9 CFU/m2 eram mediadas por citocina (febre, hipotensão), com níveis de TNF-α > 100.000 pg/ml e níveis de IL-6 > 10.000 pg/ml no soro em 2 horas. Apesar da deleção de msbB em VNP20009 e sua pirogenicidade reduzida, o LPS ainda pode ser tóxico em doses altas, possivelmente em decorrência da presença de LPS hexa-acilado. Dessa forma, uma cepa pagP/msb_B- é mais bem tolerada em doses maiores, na medida em que não pode produzir LPS hexa-acilado, e permitirá dosagem em humanos iguais ou acima de 1E9 CFU/m2. Dosagem maior pode levar à colonização tumoral aumentada, aumentando a eficácia terapêutica das bactérias imunoestimulantes.
[00318] São fornecidas nesse relatório descritivo cepas vivas atenuadas de Salmonella, por exemplo, a cepa de S. typhimurium exemplar, que só pode produzir LPS penta- acilado, que contêm uma deleção do gene msbB (que evita a miristoilação terminal de lipídeo A, como descrito acima), e que ainda são modificadas por deleção de pagP (que evita a palmitoilação). Uma cepa modificada para produzir LPS penta-acilado permite níveis menores de citocinas pró- inflamatórias, sensibilidade aumentada aos peptídeos antimicrobianos, tolerabilidade aumentada e imunidade antitumoral aumentada quando adicionalmente modificada para expressar RNAs interferentes contra pontos de verificação imune, por exemplo, TREX1. g. Deleções de genes de SPI-1 e SPI-2
[00319] Como descrito acima, a patogênese, em certas espécies bacterianas, incluindo espécies de Salmonella, por exemplo, S. typhimurium, envolve um agrupamento de genes denominado ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPIs; veja a FIG. 22) A SPI designada SPI-1 medeia a invasão de células epiteliais. Os óperons e genes e suas funções estão retratados na Figura 22. Os genes de SPI-1 incluem, sem limitação: avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, invJ, iacP, iagB, spaO, spaP, spaQ, spaR, spaS, orgA, orgB, orgC, prgH, prgI, prgf, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB e sptP. A deleção de um ou mais desses genes reduz ou elimina a habilidade da bactéria para infectar células epiteliais, mas não afeta sua habilidade para infectar ou invadir células fagocíticas, incluindo células imunes fagocíticas.
[00320] Salmonella invade células epiteliais intestinais não fagocíticas usando um sistema de secreção do tipo 3
(T3SS) codificado pela ilha de patogenicidade de Salmonella 1, que forma uma estrutura do tipo agulha que injeta proteínas efetoras diretamente no citosol de células hospedeiras. Essas proteínas efetoras levam ao rearranjo do citoesqueleto da célula eucariótica para facilitar a invasão do epitélio intestinal, e também induz citocinas pró- inflamatórias. O lócus SPI-1 inclui 39 genes que codificam componentes desse sistema de invasão (veja, Figura 22, reproduzida de Kimbrough e Miller (2002) Microbes Infect. 4 (1): 75-82).
[00321] SPI-1 codifica um sistema de secreção do tipo 3 (T3SS) que é responsável por translocalização de proteínas efetoras para dentro do citosol de células hospedeiras que podem causar rearranjos de actina que levam à captação de Salmonella. A SPI-1 T3SS é essencial para o cruzamento da camada epitelial do intestino, mas é dispensável para infecção quando bactérias são injetadas parenteralmente. A injeção de algumas proteínas e o próprio complexo em agulha também podem induzir ativação de inflamassoma e piroptose de células fagocíticas. Essa morte celular pró-inflamatória pode limitar a iniciação de uma resposta imune adaptativa robusta por indução direta da morte de células apresentadoras de antígeno (APCs), bem como modificação do meio de citocina para evitar a geração de células T de memória. Os genes de SPI-1 compreendem diversos óperons, incluindo: sitABCD, sprB, avrA, hilC, orgABC, prgKJIH, hilD, hilA, iagB, sptP, sicC, iacP, sipADCB, sicA, spaOPQRS, invFGEABCH e invH.
[00322] T3SSs são complexos que desempenham um papel importante na infectividade de bactérias Gram-negativas, por injeção de efetores protéicos bacterianos diretamente em células hospedeiras de uma forma ATP-dependente.
Complexos de T3SS cruzam as membranas bacterianas interna e externa e criam um poro em membranas de células eucarióticas mediante contato com uma célula hospedeira.
Eles consistem em um aparelho de exportação, um complexo em agulha e um translocon na ponta da agulha (Fig. 22). O complexo em agulha inclui a proteína Needle Prgl, um corpo basal, que ancora o complexo nas membranas bacterianas e consiste nas proteínas PrgH, PrgK e InvG, e outras proteínas, incluindo InvH, PrgJ (proteína Rod) e InvJ.
O translocon, que forma o poro na célula hospedeira, é um complexo das proteínas SipB, SipC e SipD.
O aparelho de exportação, que permite a translocalização das proteínas efetoras, é composto pelas proteínas SpaP, SpaQ, SpaR, SpaS, InvA, InvC e OrgB.
Uma plataforma de separação citoplasmática, que estabelece a ordem específica de secreção de proteína, é composta pelas proteínas SpaO, OrgA e OrgB (Manon e cols. (2012), “Salmonella”, Capítulo 17, eds.
Annous e Gurtler, Rijeka, páginas 339-364). Os efetores se translocam para dentro da célula hospedeira por T3SS-1 incluem SipA, SipC, SopB, SopD, SopE, SopE2 e SptP, que são essenciais para invasão da célula.
Por exemplo, mutantes sipA de S. typhimurium exibem invasão diminuída em 60-80%, a deleção sipC resulta em uma diminuição de 95% na invasão, e a deleção sopB resulta em uma diminuição de 50% na invasão (Manon e cols. (2012), “Salmonella”, Capítulo 17, eds.
Annous e Gurtler, Rijeka, páginas 339-364). Outros efetores incluem AvrA, que controla inflamação induzida por Salmonella.
Chaperones, que se ligam às proteínas secretadas e as mantêm em uma conformação que é competente para secreção, incluem SicA, InvB e SicP.
Reguladores transcricionais incluem HilA, HilD, InvF, SirC e SprB. Proteínas de SPI-1 T3SS não classificadas, que possuem várias funções na secreção do tipo III, incluem OrgC, InvE, InvI, IacP e IagB (veja a Figura 22, adaptada de Kimbrough e cols. (2002) Microbes Infect. 4 (1): 75-82).
[00323] Dessa forma, a inativação da invasão SPI-1- dependente, por meio da inativação ou knockout de um ou mais genes envolvidos na via de SPI-1, elimina a habilidade das bactérias para infectar células epiteliais. Esses genes incluem, sem limitação, um ou mais de: avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, iacP, iagB, spaO, spaP, spaQ, spaR, spaS, orgA, orgB, orgC, prgH, prgl, prgJ, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB e sptP.
[00324] Foi demonstrado que mutantes de Salmonella sem o T3SS-1 invadem numerosas linhagens/tipos de célula, por um mecanismo de invasão independente de T3SS-1, que envolve várias proteínas, incluindo as invasinas Rck, PagN e HlyE. O óperon rck contém 6 quadros de leitura aberta: peft, srgD, srgA, srgB, rck e srgC. peft codifica um regulador transcricional do óperon pef, que está envolvido na biossíntese das fímbrias Pef. Essas fímbrias estão envolvidas na formação de biofilme, adesão ao intestino delgado murídeo e acúmulo de líquido no camundongo lactente. SrgA oxida a ligação dissulfeto de PefA, a subunidade estrutural principal das fímbrias Pef. srgD codifica um suposto regulador transcricional; SrgD junto com Pen funcionam para induzir a regulação negativa sinérgica da expressão gênica flagelar. srgB codifica uma suposta proteína da membrana externa, e srgC codifica um suposto regulador transcricional (Manon e cols. (2012), Salmonella, Capítulo 17, eds. Annous e Gurtler, Rijeka, páginas 339- 364). Rck é uma proteína da membrana externa de 17 kDa codificada pelo plasmídeo de virulência grande de S. enteritidis e S. Typhimurium, que induz adesão e invasão de células epiteliais, e confere um nível elevado de resistência à neutralização por complemento, por prevenção da formação do complexo de ataque à membrana. Um mutante rck exibiu uma diminuição de 2-3 vezes na invasão da célula epitelial, comparado com a cepa do tipo selvagem, enquanto a superexpressão de Rck leva à invasão aumentada. Rck induz entrada na célula por um processo mediado por receptor, que promove remodelagem de actina local e extensões à membrana fracas e intimamente aderentes. Dessa forma, Salmonella pode entrar nas células por dois mecanismos distintos: o mecanismo de gatilho mediado pelo complexo de T3SS-1, e um mecanismo de zíper induzido por Rck (Manon e cols. (2012), Salmonella, Capítulo 17, eds. Annous e Gurtler, Rijeka, páginas 339- 364).
[00325] A invasina PagN é uma proteína da membrana externa que também comprovadamente participa da invasão por Salmonella. A expressão de pagN é regulada por phoP. Estímulos específicos, por exemplo, ambientes acidificados do fagossomo de macrófagos ou concentrações baixas de Mg', são percebidos por PhoQ, que então ativa PhoP para regular genes específicos. Foi demonstrado que a deleção de pagN em S. typhimurium resulta em uma diminuição de 3 vezes na invasão de enterócitos, sem alteração da adesão celular. Embora o mecanismo de entrada mediado por PagN não seja totalmente compreendido, foi demonstrado que a polimerização de actina é necessária para invasão. Estudos demonstraram que PagN é necessário para sobrevida de Salmonella em camundongos BALB/c, e que um mutante pagN é menos competitivo para a colonização do baço de camundongos do que a cepa parental. Como pagN é ativado por PhoP, ele é expresso principalmente intracelularmente, em que a ilha de SPI-1 que codifica T3SS-1 é infra-regulada. Dessa forma, é possível que bactérias que saem de células epiteliais ou macrófagos tenham um nível ótimo de expressão de PagN, mas tenham expressão baixa de T3SS-1, o que pode mediar interações subsequentes com outras células encontradas após destruição da célula hospedeira, indicando um role para PagN na patogênese de Salmonella (Manon e cols. (2012), Salmonella, Capítulo 17, eds. Annous e Gurtler, Rijeka, páginas 339- 364).
[00326] hlyE compartilha mais do que 90% de identidade de sequência com a hemolisina de E. coli HlyE (ClyA). A proteína HlyE lisa células epiteliais quando exportada de células bacterianas por meio da liberação de vesícula da membrana externa, e este envolvida na invasão da célula epitelial. HlyE também está envolvida no estabelecimento de infecção sistêmica por Salmonella (Manon e cols. (2012), Salmonella, Capítulo 17, eds. Annous e Gurtler, Rijeka, páginas 339-364). A eliminação da habilidade para infectar células epiteliais também pode ser obtida por modificação por engenharia genética das bactérias imunoestimulantes desse relatório descritivo para conter knockouts ou deleções de genes que codificam proteínas envolvidas em invasão SPI- 1-independente, por exemplo, um ou mais dos genes rck, pagN, hlyE, peft, srgD, srgA, srgB e srgC.
[00327] Como descrito nesse relatório descritivo, são fornecidas bactérias imunoestimulantes que são modificadas de modo a não infectarem células epiteliais, mas que retêm a habilidade para infectar células fagocíticas, incluindo células imunes residentes no tumor direcionando eficazmente, dessa forma, as bactérias imunoestimulantes ao microambiente tumoral. Isso é obtido por deleção ou knockout de qualquer uma das proteínas em SPI-1 incluindo, sem limitação, deleções de um ou mais de: avrA, hilA, hilD, invA, invB, invC, invE, invF, invG, invH, invI, inv.]; iacP, iagB, spaO, spaP, spaQ, spaR, spay, orgA, orgB, orgC, prgH, prgl, prgJ, prgK, sicA, sicP, sipA, sipB, sipC, sipD, sirC, sopB, sopD, sopE, sopE2, sprB, e sptP, bem como um ou mais de rck, pagN, hlyE, peft, srgD, srgA, srgB, rck e srgC.
[00328] As bactérias imunoestimulantes que não infectam células epiteliais podem ser adicionalmente modificadas como descrito nesse relatório descritivo para codificar produtos que estimulam o sistema imune incluindo, por exemplo, citocinas. As bactérias geralmente possuem uma deleção de asd para torná-las incapazes de replicar em um hospedeiro mamífero.
[00329] Por exemplo, são fornecidas cepas de S. typhimurium modificadas por deleção de um ou mais genes de SPI-1, e também modificadas por uma ou mais de uma deleção de purl, uma deleção de msbB e uma deleção de asd, e por liberação de plasmídeos que codificam proteínas que estimulam o sistema imune, por exemplo, genes que codificam citocinas imunoestimulantes. Por exemplo, são fornecidas bactérias com deleções de um gene regulador (por exemplo, hilA ou invF) necessário à expressão do sistema de secreção associado a SPI-1 do tipo 3 (T3SS-1), um gene estrutural de T3SS-1 (por exemplo, invG ou prgH), e/ou um gene efetor de T3SS-1 (por exemplo, sipA ou avrA). Como discutido acima, esse sistema de secreção é responsável por injeção de proteínas efetoras dentro do citosol de células hospedeiras não fagocíticas, por exemplo, células epiteliais que causam a captação das bactérias; a deleção de um ou mais desses genes elimina a infecção/invasão de células epiteliais. A deleção de um ou mais dos genes, por exemplo, hilA, fornece bactérias imunoestimulantes que podem ser administradas por via intravenosa ou por via intratumoral, resultando em infecção de células fagocíticas, que não exige o SPI-1 T3SS para captação, e também prolonga a longevidade dessas células fagocíticas. A mutação hilA também reduz a quantidade de citocinas pró-inflamatórias, aumentando a tolerabilidade da terapia, bem como a qualidade da resposta imune adaptativa.
[00330] Salmonella também possuem uma ilha de patogenicidade de Salmonella 2 (SPI-2), que codifica outra T3SS que é ativada após entrada da bactéria dentro da célula hospedeira, e interfere com a maturação do fagossomo, resultando na formação de um vacúolo especializado que contém Salmonella (SCV), em que a Salmonella reside durante a sobrevida e replicação intracelulares. Efetores de SPI-2 T3SS incluem SseB, SseC, SseD e SpiC, que são responsáveis pela montagem do revestimento de F-actina em torno de bactérias intracelulares; esse revestimento de actina promove fusão do SCV com vesículas contendo actina ou propelidas com actina, e evita que ela se funda com compartimentos desfavoráveis. SifA é responsável pela formação de filamentos induzidos por Salmonella (SIFs), que são túbulos que conectam os SCVs individuais na célula infectada. sifA é essencial para a manutenção da integridade do SCV, e mutantes sifA são liberados dentro do citosol de células hospedeiras. SseF e SseG são componentes da SPI-2 T3SS que estão envolvidos no posicionamento de SCV e processos de tráfico celular que direcionam os materiais necessários à sobrevida e replicação da bactéria ao SCV. SseF e SseG também estão envolvidos na formação de SIF. Outros efetores de SPI-2 T3SS incluem PipB2, SopD2 e SseJ, que estão envolvidos na formação de SIF e SCV, e manutenção da integridade do vacúolo; SpvC, SseL e SspH1, que estão envolvidos na sinalização imune do hospedeiro; e SteC, SspH2, SrfH/SseI e SpvB, que estão envolvidos na formação do rede de F-actina do SCV, na migração de fagócitos infectados, na inibição da polimerização de actina, e na desmontagem do corpo-P em células infectadas (Coburn e cols. (2007) Clinical Microbiology Reviews 20(4): 535-549; Figueira e Holden (2012) Microbiology 158: 1.147-1.161).
[00331] As bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo podem incluir deleções ou modificações em qualquer um dos genes de SPI-2 T3SS que afetam a formação ou integridade do SCV e estruturas associadas, por exemplo, SIFs. Esses mutantes possuem uma frequência aumentada de escape do SCV e podem replicar no citosol. Por exemplo, bactérias imunoestimulantes, por exemplo, espécies de Salmonella, modificadas geneticamente para escapar do SCV são mais eficientes na liberação de macromoléculas, por exemplo, plasmídeos, na medida em que a bicamada lipídica do SCV é uma barreira potencial. Isso é obtido por deleção ou mutação de genes necessários para formação de filamento induzida por Salmonella (SIF) incluindo, por exemplo, sifA, sseJ, sseL, sopD2, pipB2, sseF, sseG spvB, e steA.
[00332] As bactérias imunoestimulantes que podem escapar do SCV podem ser adicionalmente modificadas como descrito nesse relatório descritivo para codificar produtos que estimulam o sistema imune incluindo, por exemplo, citocinas. As bactérias geralmente possuem uma deleção de asd para torná-las incapazes de replicar em um hospedeiro mamífero. h. Mutações de endonuclease (endA) para aumentar a liberação de plasmídeo
[00333] O gene endA (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 250) codifica uma endonuclease (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 251) que medeia a degradação de DNA de fita dupla no periplasma de bactérias Gram-negativas. As cepas de E. coli de laboratório mais comuns são endA-, na medida em que uma mutação no gene endA permite rendimentos maiores de DNA de plasmídeo. Esse gene é conservado entre espécies. Para facilitar a liberação de DNA de plasmídeo intacto, o gene endA das bactérias modificadas geneticamente imunoestimulantes é deletado ou mutado para evitar sua atividade de endonuclease. Exemplares dessas mutações é uma substituição de aminoácido E208K (Durfee, e cols. (2008) J. Bacteriol. 190 (7): 2.597-2.606) ou uma mutação correspondente na espécie de interesse. endA, incluindo E208K, é conservado entre espécies bacterianas, incluindo Salmonella. Dessa forma, a mutação E208K pode ser usada para eliminar a atividade de endonuclease em outras espécies, incluindo espécies de Salmonella. Aqueles habilitados na técnica podem introduzir outras mutações ou deleções para eliminar a atividade de endA.
[00334] A realização dessa mutação ou a deleção ou ruptura do gene para eliminar a atividade do endA nas bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo, por exemplo, em Salmonella, aumenta a eficiência de liberação de DNA de plasmídeo intacto aumentando, dessa forma, a expressão dos RNAs, por exemplo, o shRNA e/ou miRNA, visando qualquer um ou dois ou mais dos pontos de verificação imune, codificados no plasmídeo aumentando, dessa forma, o knockdown mediado por RNAi dos genes do ponto de verificação e aumentando a eficácia antitumoral. i. Inibição de RIG-I
[00335] Das vias de IFN do tipo I TLR-independentes, uma é mediada por reconhecimento pelo hospedeiro de RNA de fita simples (ss) e fita dupla (ds) no citosol. Estes são percebidos por RNA helicases, incluindo gene I (RIG-I) induzível por ácido retinóico, gene associado à diferenciação de melanoma 5 (MDA-5), e por meio da fosforilação mediada por proteína adaptadora do fator de transcrição de IRF-3 do estimulador do promotor de IFN-β 1 (IPS-1), levando à indução de IFN do tipo I (Ireton e Gale (2011) Viruses 3 (6): 906-919). RIG-I reconhece dsRNA e ssRNA que abrigam 5'-trifosfatos. Essa porção pode se ligar diretamente a RIG-I, ou ser sintetizada a partir de um modelo de poli(dA-dT) pela RNA polimerase poli-DNA-dependente III (Pol III) (Chiu, Y. H. e cols. (2009) Cell 138 (3): 576-91). Um modelo de poli(dA-dT) contendo duas sequências de dinucleotídeos AA ocorre no sítio de início da transcrição do promotor U6 em um vetor de clonagem de shRNA lentiviral comum. Sua deleção subsequente no plasmídeo evita a ativação de IFN do tipo I (Pebernard e cols. (2004) Differentiation.
72: 103-111). Uma sequência de ligação a RIG-I pode ser incluída nos plasmídeos fornecidos nesse relatório descritivo; a inclusão pode aumentar a imunoestimulação que aumenta a atividade antitumoral das bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo. j. Inibição de DNase II
[00336] Outra nuclease responsável pela degradação de DNA estranho e próprio é DNase II, uma endonuclease que reside no compartimento endossômico e degrada DNA após apoptose. A ausência de DNase II (Dnase2a em camundongos) resulta no acúmulo de DNA endossômico que escapa para o citosol e ativa a sinalização de cGAS/STING (Lan YY e cols. (2014) Cell. Rep. 9 (1): 180-192). Similar a TREX1, a deficiência de DNase II em humanos se apresenta com interferonopatias tipo I autoimunes. No câncer, as células tumorais moribundas que são engolfadas por macrófagos residentes no tumor evitam a ativação de cGAS/STING e autoimunidade potencial por meio de digestão por DNase II de DNA dentro do compartimento endossômico (Ahn e cols. (2018) Cancer Cell 33: 862-873). Dessa forma, modalidades das cepas bacterianas imunoestimulantes, como fornecidas nesse relatório descritivo, codificam RNAi, por exemplo, shRNA ou miRNA que inibem, suprimem ou rompem a expressão de DNase II, que podem inibir DNase II no microambiente tumoral provocando, dessa forma, acúmulo de DNA tumoral apoptótico endocitosado no citosol, onde ele pode atuar como um agonista de cGAS/STING potente. k. Inibição de RNase 112
[00337] Embora TREX1 e DNase II funcionem para limpar o acúmulo de DNA aberrante, RNase H2 funciona similarmente para eliminar acúmulo patogênico de híbridos RNA:DNA no citosol. Similar a TREX1, deficiências em RNase H2 também contribuem para o fenótipo autoimune da síndrome de Aicardi- Goutieres (Rabe, B. (2013) J. Mol. Med. 91: 1.235-1.240). Especificamente, foi demonstrado que a perda de RNase H2 e subsequente acúmulo de híbridos RNA:DNA ou substratos de ribonucleotídeo embebidos no genoma ativa a sinalização de cGAS/STING. (MacKenzie e cols. (2016) EMBO J. 15 de abril; 35 (8): 831-44). Dessa forma, modalidades das cepas bacterianas imunoestimulantes, como fornecidas nesse relatório descritivo, codificam RNAi, por exemplo, shRNA ou miRNA que inibem, suprimem ou rompem a expressão de RNAse H2 para, dessa forma, inibir RNase H2, resultando em híbridos RNA:DNA derivados do tumor e derivados destes, que ativam a sinalização de cGAS/STING e imunidade antitumoral. l. Inibição de Estabilina-1/CLEVER-1
[00338] Outra molécula expressa primariamente em monócitos e envolvida na regulação de imunidade é estabilina- 1 (nome do gene STAB1, também conhecido como CLEVER-1, FEEL- 1). Estabilina-1 é uma proteína transmembrana do tipo I que está supra-regulada em células endoteliais e macrófagos após inflamação e, em particular, em macrófagos associados ao tumor (Kzhyshkowska e cols. (2006) J. Cell. Mol. Med. 10 (3): 635-649). Mediante ativação inflamatória, estabilina-1 atua como um limpador e ajuda na cicatrização de feridas e depuração de corpo apoptótico, e pode evitar lesão tecidual, por exemplo, fibrose hepática (Rantakari e cols. (2016) PNAS 113 (33): 9.298-9.303). Foi demonstrado que a supra- regulação de estabilina-1 inibe diretamente respostas de célula T antígeno-específicas, e o knockdown por siRNA em monócitos aumenta sua função pró-inflamatória (Palani, S. e cols. (2016) J. Immunol. 196: 115-123). Dessa forma, modalidades das cepas bacterianas imunoestimulantes, como fornecidas nesse relatório descritivo, codificam RNAi, por exemplo, shRNA ou miRNA que inibem, suprimem ou rompem a expressão de Estabilina-1/CLEVER-1 no microambiente tumoral aumentando, dessa forma, as funções pró-inflamatórias de macrófagos residentes no tumor.
5. Proteínas imunoestimulantes
[00339] As bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo podem ser modificadas para codificar uma proteína imunoestimulante que promove ou induz ou aumenta uma resposta antitumoral. A proteína imunoestimulante pode ser codificada em um plasmídeo na bactéria, sob o controle de um promotor eucariótico, por exemplo, um promotor reconhecido por RNA polimerase II, para expressão em um indivíduo eucariótico, particularmente no indivíduo para o qual a bactéria imunoestimulante deve ser administrada, por exemplo, um humano. O ácido nucleico que codifica a proteína imunoestimulante pode incluir, além do promotor eucariótico, outros sinais regulatórios para expressão ou tráfico nas células, por exemplo, para secreção ou expressão na superfície de uma célula.
[00340] Proteínas imunoestimulantes são aquelas que, no ambiente apropriado, por exemplo, um microambiente tumoral (TME), podem promover ou participar ou aumentar uma resposta antitumoral pelo indivíduo ao qual a bactéria imunoestimulante é administrada. Proteínas imunoestimulantes incluem, sem limitação, citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes. Estas incluem citocinas, por exemplo, sem limitação, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-18; quimiocinas, por exemplo, sem limitação, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 e CXCL11; e/ou moléculas coestimulantes, por exemplo, sem limitação, CD40, CD40L, OX40, OX40L, 4-1BB, 4-1BBL, membros da superfamília de TNF/TNFR e membros da família B7-CD28. Outras dessas proteínas imunoestimulantes que são usadas para tratamento de tumores ou que podem promover, intensificar ou de algum outro modo aumentar ou provocar uma resposta antitumoral, conhecidas por aqueles habilitados na técnica, são contempladas para codificação nas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo.
[00341] O genoma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo também pode ser modificado para aumentar ou promover infecção de células imunes, particularmente células imunes no microambiente tumoral, por exemplo, células fagocíticas. As bactérias também podem ser modificadas para piroptose diminuída em células imunes. As bactérias imunoestimulantes incluem aquelas, por exemplo, que possuem modificações que rompem/inibem a via de SPI-1, por exemplo, ruptura ou deleção de hilA, e/ou ruptura/deleção de genes de flagelina, proteína Rod, proteína Needle e/ou pagP, como detalhado e exemplificado em outra parte nesse relatório descritivo. Bactérias imunoestimulantes que codificam citocinas e quimiocinas
[00342] Em algumas modalidades, as bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo são modificadas geneticamente para expressar citocinas para estimular o sistema imune incluindo, sem limitação, IL-2, IL-7, IL-12 (IL-12p70 (IL12p40 + IL-12p35)), IL-15 (e o complexo de cadeia alfa de IL-151L-15R), e IL-18. Citocinas estimulam células imunes efetoras e células estromais no local do tumor, e aumentam o reconhecimento da célula tumoral por células citotóxicas. Em algumas modalidades, as bactérias imunoestimulantes podem ser modificadas geneticamente para expressar quimiocinas como, por exemplo, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 e CXCL11. IL-2
[00343] Interleucina-2 (IL-2), que foi a primeira citocina aprovada para o tratamento de câncer, está implicada na ativação do sistema imune por vários mecanismos, incluindo a ativação e promoção de crescimento de CTL, a geração de células killer (LAK) ativadas por linfocina, a promoção de Treg célula crescimento e proliferação, a estimulação de TILs, e a promoção de proliferação e diferenciação de células T, células B e células NK. IL-2 recombinante (rIL-2) é aprovada pelo FDA para o tratamento de carcinoma metastático de célula renal (RCC) e melanoma metastático (Sheikhi e cols. (2016) Iran J. Immunol. 13 (3): 148-166). IL-7
[00344] IL-7, que é um membro da superfamília de IL-2, está implicada na sobrevida, proliferação e homeostasia de células T. Foi demonstrado que mutações no receptor de IL-7 resultam na perda de células T, e no desenvolvimento de imunodeficiência combinada severa (SCID), ressaltando o papel crucial que IL-7 tem no desenvolvimento de célula T. IL-7 é uma citocina homeostática que fornece sinais contínuos a células T naïve e de memória em repouso, e que se acumula durante condições de linfopenia, levando a um aumento tanto na proliferação de células T quanto na diversidade do repertório de células T. Em comparação com IL-2, IL-7 é seletiva para expansão de células T CD8+ em relação a células T reguladoras CD4+FOXP3+. Foi demonstrado que IL-7 recombinante aumenta as respostas de célula T antígeno- específicas após vacinação e terapia celular adotiva em camundongos. IL-7 também participa na promoção de recuperação de células T após quimioterapia de transplante de célula-tronco hematopoiética. Experimentos clínicos em fase inicial em pacientes com malignidade avançada demonstraram que IL-7 recombinante é bem tolerada e possui toxicidade limitada em doses biologicamente ativas (ou seja, nas quais os números de células T CD4+ e CD8+ circulantes aumentavam por 3-4 vezes) (Lee, S. e Margolin, K. (2011) Cancers 3: 3.856-3.893). Foi demonstrado que IL-7 possui efeitos antitumorais em tumores como, por exemplo, gliomas, melanomas, linfomas, leucemia, câncer de próstata e glioblastoma, e a administração in vivo de IL-7 em modelos murídeos resultou em crescimento diminuído de células de câncer. Também foi demonstrado que IL-7 aumenta os efeitos antitumorais de IFN-γ em tumores de glioma em ratos, e para induzir a produção de IL-1a, IL-β e TNF-α por monócitos, o que resulta na inibição do crescimento de melanoma. Adicionalmente, a administração de IL-7 recombinante após o tratamento de sarcomas pediátricos resultou na promoção de recuperação imune (Lin e cols. (2017) Anticancer Research 37: 963-968). IL-12 (IL-12p70, IL-12p40 + IL-12p35)
[00345] IL-12 bioativa (IL-12p70), que promove imunidade mediada por células, é um heterodímero, composto por subunidades p35 e p40, enquanto monômeros e homodímeros de
IL-12p40 atuam como antagonistas de IL-12. IL-12, que é secretada por células apresentadoras de antígeno, promove a secreção de IFN-γ por células NK e T, inibe angiogênese tumoral, resulta na ativação e proliferação de células NK, células T CD8+ e células T CD4+, aumenta a diferenciação de células CD4+ Th0 em células Th1, e promove citotoxicidade mediada por células anticorpo-dependente (ADCC) contra células tumorais. Foi demonstrado que IL-12 exibe efeitos antitumorais em modelos murídeos de melanoma, carcinoma do cólon, carcinoma mamário e sarcoma (Kalinski e cols. (2001) Blood 97: 3.466-3.469; Sheikhi e cols. (2016) Iran J. Immunol. 13 (3): 148-166; Lee, S. e Margolin, K. (2011) Cancers 3: 3.856-3.893). IL-15 e IL-15:IL-15Ra
[00346] IL-15 é estruturalmente similar à IL-2 e, embora tanto IL-2 quanto IL-15 forneçam estimulação precoce para a proliferação e ativação de células T, IL-15 bloqueia a apoptose induzida por IL-2, que é um processo que leva à eliminação de células T estimuladas e indução de tolerância de células T, limitando respostas de célula T de memória e potencialmente limitando a eficácia terapêutica de IL-2 isoladamente. IL-15 também suporta a persistência de células T CD8+ de memória para a manutenção de imunidade antitumoral de longo prazo, e demonstrou atividade antitumoral significante em modelos pré-clínicos murídeos por meio da ativação direta de células T CD8+ efetoras de uma forma antígeno-independente. Am adição às células T CD8+, IL-15 é responsável pelo desenvolvimento, proliferação e ativação de células efetoras natural killer (NK) (Lee, S. e Margolin, K. (2011) Cancers 3: 3.856-3.893; Han e cols. (2011) Cytokine
56 (3): 804-810).
[00347] IL-15 e receptor de IL-15 alfa (IL-15Ra) são expressos coordenadamente por células apresentadoras de antígeno como, por exemplo, monócitos e células dendríticas, e IL-15 é apresentado in trans por IL-15Ra ao complexo receptor IL-15nyc expresso nas superfícies de células T CD8+ e células NK. Foi demonstrado que complexos 1L-15:IL15-Ra solúveis modulam respostas imunes por meio do complexo IL- 15nyc, e foi demonstrado que a atividade biológica de IL-15 está aumentada 50 vezes por sua administração em um complexo pré-formado de IL-15 e IL-15Ra solúvel, que possui uma meia- vida aumentada, comparada com IL-15 isoladamente. Esse aumento significante na eficácia terapêutica de IL-15 por pré-associação com IL-15Ra foi demonstrado em modelos murídeos de tumor (Han e cols. (2011) Cytokine 56(3):804- 810). IL-18
[00348] IL-18 induz a secreção de IFN-γ por células NK e T CD8+, aumentando sua toxicidade. IL-18 também ativa macrófagos e estimula o desenvolvimento de células T CD4+ helper Th1. IL-18 demonstrou atividade antitumoral promissora em vários modelos pré-clínicos em camundongos. Por exemplo, a administração de IL-18 recombinante (rIL-18) resultou na regressão de melanoma ou sarcoma em camundongos singênicos por meio da ativação de respostas mediadas por células T CD4+ e/ou células NK. Outros estudos mostraram que os efeitos antitumorais de IL-18 eram mediados por IFN-γ e envolviam mecanismos antiangiogênicos. A combinação de IL- 18 com outras citocinas, por exemplo, IL-12, ou com moléculas coestimulantes, por exemplo, CD80, aumenta os efeitos antitumorais mediados por IL-18. Experimentos clínicos de Fase I em pacientes com tumores sólidos e linfomas avançados mostraram que a administração de IL-18 era segura, e que resultou em atividade moduladora imune e no aumento dos níveis séricos de IFN-γ e GM-CSF em pacientes e respostas clínicas modestas. Experimentos clínicos mostraram que IL- 18 pode ser combinada com outro agentes terapêuticos anticâncer, por exemplo, anticorpos monoclonais, fármacos citotóxicos ou vacinas (Fabbi e cols. (2015) J. Leukoc. Biol. 97: 665-675; Lee, S. e Margolin, K. (2011) Cancers 3: 3.856-
3.893).
[00349] Foi verificado que uma cepa atenuada de Salmonella typhimurium, modificada geneticamente para expressar IL-18, inibiu o crescimento de tumores s.c. ou metástases pulmonares em camundongos singênicos sem quaisquer efeitos tóxicos após administração sistêmica.
[00350] O tratamento com essa bactéria modificada geneticamente induziu o acúmulo de células T, células NK e granulócitos em tumores, e resultou na produção intratumoral de citocinas (Fabbi e cols. (2015) J. Leukoc. Biol. 97: 665- 675). Quimiocinas
[00351] Quimiocinas são uma família de citocinas pequenas que medeiam a migração de leucócitos para áreas de lesão ou inflamação e estão envolvidas na mediação de respostas imunes e inflamatórias. As quimiocinas são classificadas em quatro subfamílias, com base na posição de resíduos de cisteína em suas sequências, especificamente ligantes de XC-, CC-, CXC- e CX3C-quimiocina, ou XCL, CCL, CXCL e CX3CL. Os ligantes de quimiocina se ligam aos seus receptores cognatos e regulam a circulação, guiamento e retenção de células imunes, com cada par de ligante-receptor de quimiocina regulando seletivamente certo tipo de célula imune. Diferentes quimiocinas atraem diferentes populações de leucócitos, e formam um gradiente de concentração in vivo, com células imunes atraídas se movendo através do gradiente em direção à concentração maior de quimiocina (Argyle D. e Kitamura, T. (2018) Front. Immunol. 9: 2.629; Dubinett e cols. (2010) Cancer J. 16 (4): 325-335). Quimiocinas podem aumentar a resposta imune antitumoral por aumento da infiltração de células imunes no tumor, e facilitando o movimento de células apresentadoras de antígeno (APCs) para os linfonodos que drenam o tumor, o que sensibiliza células T e células B naïve (Lechner e cols. (2011) Immunotherapy 3 (11): 1.317-1.340). As bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo podem ser modificadas geneticamente para codificar quimiocinas incluindo, sem limitação, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 e CXCL11. CCL3, CCL4, CCL5
[00352] CCL3, CCL4 e CCL5 compartilham um grau elevado de homologia, e se ligam ao CCR5 (CCL3, CCL4 e CCL5) e CCR1 (CCL3 e CCL5) em vários tipos de células, incluindo DCs e células T imaturas, tanto em humanos quanto em camundongos. Foi demonstrado que células T terapêuticas induzem quimiotaxia de células imunes inatas aos locais de tumor, por meio da secreção tumor-específica de CCL3, CCL4 e CCL5 (Dubinett e cols. (2010) Cancer J. 16 (4): 325-335).
[00353] A indução da resposta de célula T helper tipo 1 (Th1) libera CCL3. Estudos in vivo e in vitro de camundongos indicaram que CCL3 é quimiotática tanto para neutrófilos quanto para monócitos; especificamente, CCL3 pode mediar a mobilização de células precursoras mielóides (MPC) da medula óssea, e possui efeitos reguladores e estimulantes de MPC. Células de carcinoma ovariano humano transfectadas com CCL3 mostraram infiltração aumentada de células T e macrófagos dentro do tumor, levando a uma resposta antitumoral aumentada, e indicaram que a quimiotaxia mediada por CCL3 de neutrófilos suprimia o crescimento tumoral. DCs transfectadas com o gene associado ao antígeno tumoral de melanoma humano (MAGE)-1 que foram recrutadas por CCL3 exibiam efeitos antitumorais superiores, incluindo proliferação de linfócitos, capacidade citolítica, sobrevida aumentadas e crescimento tumoral diminuído em um modelo em camundongo de melanoma. Um uso combinatório de CCL3 com uma plataforma antígeno-específica para MAGE-1 também tem sido feito no tratamento de câncer gástrico. A produção de CCL3 por CT26, um tumor de cólon murídeo altamente imunogênico, tornou mais lento in vivo o crescimento tumoral; foi indicado que esse processo era dirigido pelo acúmulo CCL3-dependente de células natural killer (NK) e, dessa forma, IFNγ, resultando na produção de CXCL9 e CXLC10 (Allen e cols. (2017) Oncoimmunology 7 (3): e1393598; Schaller e cols. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13 (11): 1.049-1.060).
[00354] CCL3 tem sido usada como um adjuvante para o tratamento de câncer.
[00355] A administração de uma variante ativa de CCL3, ECI301, após ablação por radiofrequência aumentou as respostas tumor-específicas para carcinoma hepatocelular de camundongo, e esse mecanismo foi ainda demonstrado como sendo dependente da expressão de CCR1. CCL3 também teve sucesso como um adjuvante em cânceres sistêmicos, em que camundongos vacinados com CCL3 e IL-2 ou fator de estimulação de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) em um modelo de leucemia/linfoma exibiram sobrevida aumentada (Schaller e cols. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13 (11): 1.049-
1.060).
[00356] CCL3 e CCL4 participam do direcionamento da infiltração de células T CD8+ para locais de tumores primários no melanoma e cânceres do cólon. A produção de CCL4 pelo tumor leva ao acúmulo de DCs CD103+; a supressão de CCL4 por meio de uma via de WNT/β-catenina-dependente evitava a infiltração de DCs CD103+ de tumores de melanoma (Spranger e cols. (2015) Nature 523 (7559): 231-235). Também foi demonstrado que CCL3 aumenta a infiltração de células T CD4+ e CD8+ para o local do tumor primário em um modelo em camundongo de câncer do cólon (Allen e cols. (2017) Oncoimmunology 7 (3): e1393598).
[00357] A ligação de CCL3 ou CCLS aos seus receptores (CCR1 e CCRS, respectivamente), move DCs, monócitos e memória e células T efetoras imaturas da circulação para dentro de locais de inflamação ou infecção. Por exemplo, a expressão de CCLS em tumores cólon-retais contribui para quimioatração e sobrevida de linfócitos T. CCL3 e CCLS têm sido usados isoladamente ou em terapia combinada para induzir regressão de tumor e imunidade em vários modelos pré-clínicos. Por exemplo, estudos demonstraram que a injeção subcutânea de células de ovário de hamster chinês geneticamente modificadas para expressar CCL3 resultou em inibição do tumor e infiltração neutrofílica. Em outro estudo, a expressão de CCLS de adenovírus oncolítico recombinante (Ad-RANTES-E1A)
resultou na regressão do tumor primário e metástase bloqueada em um modelo murídeo de carcinoma mamário (Lechner e cols. (2011) Immunotherapy 3 (11): 1.317-1.340).
[00358] Em um estudo traducional de câncer cólon-retal, CCLS induziu um “padrão de resposta antiviral” em macrófagos. Em consequência da migração mediada por CXCR3 de linfócitos na margem invasiva de metástases hepáticas no câncer cólon- retal, CCLS é produzida. O bloqueio de CCRS, do receptor CCLS, resulta em morte do tumor, dirigida por macrófagos que produzem IFN e espécies reativas ao oxigênio. Embora macrófagos estejam presentes no microambiente tumoral, a inibição de CCRS induz uma mudança fenotípica de um fenótipo M2 para um M1. O bloqueio de CCRS também leva a respostas clínicas em pacientes com câncer cólon-retal (Halama e cols. (2016) Cancer Cell 29 (4): 587-601).
[00359] CCL3, CCL4 e CCL5 podem ser usadas no tratamento de condições que incluem tumores linfáticos, câncer da bexiga, câncer cólon-retal, câncer de pulmão, melanoma, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer cervical ou câncer do fígado (Publicação de Patente U.S. Nº US 2015/0232880; Publicações de Patente Internacional Nos WO 2015/059303, WO 2017/043815, WO 2017/156349 e WO 2018/191654). CXCL9, CXCL10, CXCL11
[00360] CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10) e CXCL11 (ITAC) são induzidas pela produção de IFN-γ. Essas quimiocinas se ligam a CXCR3, preferencialmente expressa em células T ativadas, e funcionam tanto de forma angiostática quanto no recrutamento e ativação de leucócitos. O prognóstico no câncer cólon-retal está fortemente correlacionado com células T infiltrantes no tumor, particularmente células T efetoras Th1 e CD8+; a expressão intratumoral elevada de CXCL9, CXCL10 e CXCL11 é indicativa de bom prognóstico. Por exemplo, em uma amostra de 163 pacientes com câncer do cólon, aqueles com níveis elevados de CXCL9 ou CXCL11 mostraram sobrevida pós-operatória aumentada, e pacientes com expressão elevada de CXC tiveram números significantemente maiores de células T CD3+, células T-helper CD4+ e células T citotóxicas CD8+. Em metástases hepáticas de pacientes com câncer cólon-retal, os níveis de CXCL9 e CXCL10 estavam aumentados na margem invasiva e se correlacionavam com a densidade de célula T efetora. A estimulação da migração de linfócitos por meio da ação de CXCL9 e CXCL10 on CXCR3 leva à produção de CCL5 na margem invasiva (Halama e cols. (2016) Cancer Cell 29 (4): 587-601; Kistner e cols. (2017) Oncotarget 8 (52): 89.998-90.012).
[00361] In vivo, CXCL9 funciona como um quimioatraente para linfócitos infiltrantes no tumor, linfócitos ativados do sangue periférico, células natural killer (NK) e linfócitos Th1. CXCL9 também é crucial para supressão mediada por célula T de tumores cutâneos. Por exemplo, quando combinada com IL-2 sistêmica, CXCL9 demonstrou que inibe o crescimento tumoral por meio da infiltração intratumoral aumentada de células mononucleares CXCR3+. Em um modelo murídeo de carcinoma do cólon, uma combinação da proteína de fusão huKS1/4-IL-2 com terapia gênica com CXCL9 obteve um efeito antitumoral superior e prolongou a expectativa de vida por meio da quimioatração e ativação de linfócitos T CD8+ e CD4+ (Dubinett e cols. (2010) Cancer J. 16 (4): 325- 335; Ruelmann e cols. (2001) Cancer Res. 61 (23): 8.498-
8.503).
[00362] CXCL10, produzida por monócitos ativados, fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos, é quimiotática para células T ativadas e pode atuar como um inibidor da angiogênese in vivo. Foi demonstrado que a expressão de CXCL10 em tumores cólon-retais contribui para a quimioatração de linfócitos T citotóxicos e sobrevida mais longa. Foi demonstrado que a administração de citocinas imunoestimulantes, por exemplo, IL-12, aumenta os efeitos antitumorais gerados por CXCL10. Uma vacina de DC sensibilizada com um lisado de célula tumoral e transfectada com CXCL10 aumentou a proteção imunológica e a eficácia em camundongos; os animais mostraram uma resistência a um ataque do tumor, um crescimento tumoral mais lento e tempo de sobrevida mais longo. Estudos in vivo e in vitro em camundongos usando uma proteína de fusão CXCL10-mucina-GPI resultou em tumores com níveis maiores de células NK recrutadas, comparados com tumores não tratados com a proteína de fusão. Interferons (que podem ser produzidos por células dendríticas plasmocitóides; essas células estão associadas com lesões de melanoma primário e podem ser recrutadas para o local de um tumor por CCL20) podem atuar em subconjuntos de DC do tumor, por exemplo, DCs CD103+, que demonstraram que produzem CXCL9/10 em um modelo em camundongo de melanoma e estavam associadas com CXCL9/10 em doença humana. CXCL10 também mostrou expressão maior em amostras de melanoma humano metastático em relação a amostras de melanoma primário. Terapeuticamente, a terapia adjuvante de melanoma com IFN-α supra-regula a produção de CXCL10, enquanto o agente quimioterápico cisplatina induz CXCL9 e CXCL10
(Dubinett e cols. (2010) Cancer J. 16 (4): 325-335; Kuo e cols. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5: 271; Li e cols. (2007) Scand. J. Immunol. 65 (1): 8-13; Muenchmeier e cols. (2013) PLoS One 8 (8): e72749).
[00363] A expressão de CXCL10/11 e CXCR3 foi estabelecida em queratinócitos humanos derivados de carcinomas de célula basal (BCCs). CXCL11 também é capaz de promover expressão de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) imunossupressora em carcinoma de célula basal humano, bem como aumentar a proliferação de queratinócitos, o que poderia reduzir a atividade antitumoral de quaisquer células T efetoras CXCR3+ infiltrantes (Kuo e cols. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5: 271).
[00364] CXCL9, CXCL10 e CXCL11 podem ser codificadas em vírus oncolíticos para o tratamento de câncer (Publicação de Patente U.S. Nº US 2015/0232880; Publicação de Patente Internacional Nº WO 2015/059303). Vírus oncolíticos pseudotipados ou uma bactéria modificada geneticamente que codifica o gene para CXCL10 também podem ser usados para tratar câncer (Publicações de Patente Internacional Nos WO 2018/006005 e WO 2018/129404). Moléculas coestimulantes
[00365] Moléculas coestimulantes aumentam a resposta imune contra células tumorais, e vias coestimulantes são inibidas por células tumorais para promover tumorigênese. As bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo podem ser modificadas geneticamente para expressar moléculas coestimulantes como, por exemplo, CD40, CD40L, 4-1BB, 4- 1BBL, OX40 (CD134), OX40L (CD252), outros membros da superfamília do TNFR (por exemplo, CD27, GITR, CD30, Fas receptor, TRAIL-R, TNF-R, HVEM, RANK), B7 e CD28. As bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo também podem ser modificadas geneticamente para expressar anticorpos agonistas contra moléculas coestimulantes para aumentar a resposta imune antitumoral. Superfamília do receptor de TNF
[00366] A superfamília de ligantes de TNF (TNF SF) e seus receptores (TNFRSF) estão envolvidos na proliferação, diferenciação, ativação e sobrevida de células tumorais e células imunes efetoras. Membros dessa família incluem CD30, Fas-L, TRAIL-R e TNF-R, que induzem apoptose, e CD27, OX40L, CD40L, GITR-L e 4-1BBL, em regulam respostas de células imunes B e T. Outros membros incluem mediador de entrada de herpesvírus (HVEM) e CD27. A expressão de TNFSF e TNFRSF pelas bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo pode aumentar a resposta imune antitumoral. Foi demonstrado, por exemplo, que a expressão de 4-1BBL em tumores murídeos aumenta a imunogenicidade, e a injeção intratumoral de células dendríticas (DCs) com expressão aumentada de OX40L pode resultar em rejeição de tumor em modelos murídeos. Estudos também demonstraram que a injeção de um adenovírus que expressa GITR recombinante em células de melanoma B16 promove infiltração de células T e reduz o volume do tumor. Anticorpos estimulantes contra moléculas como, por exemplo, 4-1BB, OX40 e GITR, também podem ser codificados pelas bactérias imunoestimulantes para estimular o sistema imune. Por exemplo, foi demonstrado que anticorpos monoclonais agonistas anti-4-1BB aumentam as respostas antitumorais de CTL, e foi demonstrado que anticorpos agonistas anti-OX40 aumentam a atividade antitumoral em modelos de tumor transplantável. Adicionalmente, foi verificado que anticorpos agonistas anti-GITR aumentam as respostas antitumorais e a imunidade (Lechner e cols. (2011) Immunotherapy 3 (11): 1.317-1.340; Peggs e cols. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157: 9-19). CD40 e CD40L
[00367] CD40, que é um membro da superfamília do receptor de TNF, é expressa por APCs e células B, enquanto seu ligante, CD40L (CD154), é expresso por células T ativadas. A interação entre CD40 e CD40L estimula células B a produzir citocinas, resultando em ativação de célula T e morte da célula tumoral. Estudos demonstraram que respostas imunes antitumorais são prejudicadas com expressão reduzida de CD40L em células T ou CD40 em células dendríticas. CD40 é expressa na superfície de vários tumores de célula B, por exemplo, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica e leucemia linfocítica crônica, e foi demonstrado que sua interação com CD40L aumenta a expressão de B7.1/CD80, B7.2/CD86 e moléculas HLA da classe II nas células tumorais CD40+, bem como aumenta suas habilidades de apresentação de antígeno. A expressão transgênica de CD40L em um modelo murídeo de mieloma múltiplo resultou na indução de células T CD4+ e CD8+, respostas imunes antitumorais locais e sistêmicas e crescimento tumoral reduzido. Anticorpos agonistas anti-CD40 também induziram respostas antitumorais de célula T (Marin-Acevedo e cols. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11: 39; Dotti e cols. (2002) Blood 100 (1): 200-207; Murugaiyan e cols. (2007) J. Immunol. 178: 2.047-2.055). 4-1BB e 4-1BBL
[00368] 4-1BB (CD137) é um coestimulante de receptor induzível que é expresso por células T, células NK e APCs, incluindo DCs, células B e monócitos, que se liga ao seu ligante, 4-1BBL, para desencadear a proliferação e ativação de células imunes. 4-1BB resulta em respostas de células T ativadas mais longas e mais disseminadas. Foi demonstrado que proteínas de fusão agonistas anti-4-1BB e 4-1BBL aumentam a atividade antitumoral por mediação imune, por exemplo, contra tumores de sarcoma e mastocitoma, mediada por células T CD4+ e CD+ e atividade de CTL tumor-específica (Lechner e cols. (2011) Immunotherapy 3 (11): 1.317-1.340; Marin- Acevedo e cols. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11: 39). OX40 e OX40L
[00369] OX40 (CD134) é um membro da superfamília do receptor de TNF que é expresso em células T efetoras ativadas, enquanto seu ligante, OX40L, é expresso em APCs, incluindo DCs, células B e macrófagos, após ativação por agonistas de TLR e sinalização de CD40-CD40L. A sinalização de OX40-OX4OL resulta na ativação, potenciação, proliferação e sobrevida de células T, bem como na modulação da função de célula NK e inibição da atividade supressora de Tregs. A sinalização por meio de OX40 também resulta na secreção de citocinas (IL-2, IL-4, IL-5 e IFN-γ), reforço de respostas de células Th1 e Th2. O reconhecimento de antígenos tumorais por TILs resulta em expressão aumentada de OX40 pelos TILs, que foi correlacionada com prognóstico melhorado. Estudos demonstraram que o tratamento com anticorpos agonistas anti- OX40 ou proteínas de fusão Fc-OX40L resulta em respostas de célula T CD4+ tumor-específicas aumentadas e sobrevida aumentada em modelos murídeos de melanoma, sarcoma, carcinoma do cólon e câncer de mama, enquanto Fc-OX40L incorporado em vacinas de célula tumoral protegeu camundongos de ataque subsequente com células de carcinoma da mama (Lechner e cols. (2011) Immunotherapy 3 (11): 1.317-
1.340; Marin-Acevedo e cols. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11: 39). Família de B7-CD28
[00370] CD28 é uma molécula coestimulante expressa na superfície de células T que atua como um receptor para B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), que são moléculas coestimulantes expressas em células apresentadoras de antígeno. A sinalização de CD28-B7 é necessária para ativação e sobrevida de células T, e prevenção de anergia de célula T, e resulta na produção de interleucinas como, por exemplo, IL-6.
[00371] A sensibilização ótima de células T exige dois sinais: (1) reconhecimento pelo receptor de célula T (TCR) de antígenos apresentados por WIC e (2) sinais coestimulantes que resultam da ligação de célula T CD28 com B7-1 (CD80) ou B7-2 (CD86) expresso em APCs. Após ativação de célula T, receptores de CTLA-4 são induzidos, que então ganham a competição com CD28 pela ligação aos ligantes B7-1 e B7-2. A apresentação de antígeno por células tumorais é pobre em consequência de sua ausência de expressão de moléculas coestimulantes como, por exemplo, B7-1/CD80 e B7-2/CD86, resultando em uma incapacidade de ativar o complexo receptor de célula T. Como resultado, a supra-regulação dessas moléculas nas superfícies de células tumorais pode aumentar sua imunogenicidade. A imunoterapia de tumores sólidos e malignidades hematológicas foi induzida com sucesso por B7,
por exemplo, por meio da expressão pela célula tumoral de B7, ou proteínas de fusão B7 solúvel-imunoglobulina. A expressão mediada por vírus pelo tumor de B7, em combinação com outros ligantes coestimulantes como, por exemplo, ICAM- 3 e LFA-3, foi bem-sucedida em experimentos pré-clínicos e clínicos para o tratamento de leucemia linfocítica crônica e melanoma metastático. Adicionalmente, proteínas de fusão de B7 solúvel demonstraram resultados promissores na imunoterapia de tumores sólidos como imunoterapias de agente único (Lechner e cols. (2011) Immunotherapy 3 (11): 1.317-
1.340; Dotti e cols. (2002) Blood 100 (1): 200-207).
6. Modificações que aumentam a captação de bactérias Gram- negativas, por exemplo, Salmonella, por células imunes e reduzem a morte de células imunes
[00372] O genoma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo pode ser modificado para aumentar ou promover infecção de células imunes, particularmente células imunes no microambiente tumoral, por exemplo, células fagocíticas. Isso inclui a redução de infecção de células não imunes, por exemplo, células epiteliais, ou o aumento de infecção de células imunes. As bactérias também podem ser modificadas para piroptose diminuída em células imunes. Diversas modificações do genoma bacteriano podem fazer um ou ambos de aumento de infecção de células imunes e diminuição de piroptose. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo incluem essas modificações, por exemplo, deleções e/ou rupturas de genes envolvidos na via de SPI-1 T3SS, por exemplo, ruptura ou deleção de hilA, e/ou ruptura/deleção de genes que codificam flagelina, proteína Rod e proteína
Needle.
[00373] O fenótipo invasivo de bactérias Gram-negativas, por exemplo, Salmonella, pode resultar da atividade de genes codificados em vias que promovem a invasão de células hospedeiras. A ilha de patogenicidade de Salmonella-1 (SPI- 1) associada à invasão de Salmonella é exemplar. SPI-1 inclui o sistema de secreção do tipo 3 (T3SS), que é responsável por translocalização de proteínas efetoras para dentro do citosol de células hospedeiras. Essas proteínas podem causar rearranjos de actina que levam à captação de Salmonella. Efetores de T3SS medeiam a captação de S. typhimurium em células hospedeiras não fagocíticas, por exemplo, células epiteliais. Foi demonstrado que o SPI-1 T3SS é essencial para o cruzamento da camada epitelial do intestino, mas é dispensável para infecção quando bactérias são injetadas parenteralmente, por exemplo. Mutantes de SPI-1 possuem defeitos na invasão da célula epitelial, reduzindo dramaticamente a virulência oral, mas são recolhidos normalmente por células fagocíticas, por exemplo, macrófagos (Kong e cols. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (47):
19.414-19.419). As cepas imunoestimulantes de S. typhimurium fornecidas nesse relatório descritivo podem ser modificadas geneticamente com mutações em genes de SPI-1 T3SS, evitando sua captação por células epiteliais, e concentrando-as nas células imunes, por exemplo, macrófagos, aumentando a resposta imune antitumoral.
[00374] Efetores de T3SS também ativam o inflamassoma de NLRC4 em macrófagos, ativando caspase-1 e levando à morte celular por meio de piroptose. A piroptose é uma forma altamente inflamatória de morte celular programada que ocorre mais frequentemente após infecção com patógenos intracelulares, e desempenha um papel na resposta antimicrobiana. Essa morte celular pró-inflamatória pode limitar a iniciação de uma resposta imune adaptativa robusta por indução direta da morte de células apresentadoras de antígeno (APCs), bem como modificação do meio de citocina para evitar a geração de células T de memória. SPI-1 induz piroptose por injeção de flagelina, proteínas Needle e Rod (PrgI/J), enquanto a flagelina extracelular estimula a sinalização de TLRS. Dessa forma, a modificação genética das bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo para conter mutações nos genes envolvidos na piroptose pode aumentar o efeito imune antitumoral por redução da morte celular em células imunes, por exemplo, macrófagos. Piroptose de macrófagos
[00375] O inflamassoma de NLRC4 de macrófagos, que desempenha um papel nas respostas imunes inatas e antimicrobianas, é um complexo multiproteínas grande que reconhece patógenos citosólicos e fornece a ativação autocatalítica de caspase-1. A ativação de caspase-1 induz a maturação e liberação das citocinas pró-inflamatórias IL- β e IL-18, e desencadeia a piroptose, uma forma inflamatória rápida de morte celular de macrófagos. A infecção por certas bactérias Gram-negativas que codificam sistemas de secreção do tipo 3 ou 4, por exemplo, Salmonella typhimurium e Pseudomonas aeruginosa, desencadeia a ativação do inflamassoma de NLRC4 mediante reconhecimento de ligantes bacterianos, por exemplo, proteína Needle, proteína Rod e flagelina, após translocalização para dentro do citosol da célula hospedeira pelo sistema de secreção do tipo III da ilha de patogenicidade-1 Stm (SPI-1 T3SS). A piroptose não está limitada aos macrófagos; a morte caspase-1-dependente foi observada em células dendríticas após infecção com Salmonella (Li e cols. (2016) Scientific Reports 6: 37.447; Chen e cols. (2014) Cell Reports 8: 570-582; (Fink e Cookson (2007) Cellular Microbiology 9 (11): 2.562-2.570)). Como mostrado nesse relatório descritivo, o knockout de genes no genoma de Salmonella envolvidos na indução de piroptose aumenta a resposta imune antitumoral. Isso evita a perda de células imunes, incluindo macrófagos, após infecção bacteriana. Por exemplo, genes que codificam hilA, proteína Rod (PrgJ), proteína Needle (Prgl), flagelina e/ou QseC podem sofrer knockout/serem rompidos nas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo. hilA
[00376] A ilha de patogenicidade de Salmonella-1 (SPI-1) associada à invasão, incluindo o sistema de secreção do tipo 3 (T3SS), é responsável pela translocalização de proteínas efetoras para dentro do citosol de células hospedeiras, causando rearranjos de actina que levam à captação de Salmonella. hilA é um ativador transcricional para genes de SPI-1, e sua expressão é regulada por sinais ambientais como, por exemplo, oxigênio, osmolaridade, pH e fase de crescimento. Condições subótimas reprimem a expressão de hilA suprimindo, dessa forma, o fenótipo invasivo da bactéria (Kong e cols. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (47):
19.414-19.419). Efetores de T3SS medeiam a captação de S. typhimurium em células hospedeiras não fagocíticas, por exemplo, células epiteliais. O SPI-1 T3SS é essencial para o cruzamento da camada epitelial do intestino, mas é dispensável para infecção, por exemplo, quando as bactérias são injetadas parenteralmente. Mutantes de SPI-1 possuem defeitos na invasão da célula epitelial, reduzindo a virulência oral, mas são recolhidos normalmente por células fagocíticas, por exemplo, macrófagos. As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo incluem aquelas com deleção ou ruptura do gene hilA e/ou de outros genes na via de T3SS. Quando essas bactérias são administradas, por exemplo, por via intravenosa ou por via intratumoral, a infecção é concentrada em direção às células fagocíticas, por exemplo, macrófagos e células dendríticas, que não necessitam do SPI-1 T3SS para captação. Isso aumenta o perfil de segurança das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo. Isso evita invasão fora-do-alvo da célula e evita transmissão fecal-oral.
[00377] Além da redução da captação de Salmonella por células não fagocíticas, por exemplo, células epiteliais, a deleção ou ruptura de hilA e/ou de outros genes nessa via também prolonga a longevidade das células fagocíticas, por prevenção de piroptose em macrófagos induzindo, dessa forma, menos morte celular em macrófagos humanos, comparadas com bactérias que não contêm uma deleção em hilA. Por exemplo, cepas de Salmonella deficientes em HilA impedem a piroptose ao evitarem a ativação de inflamassoma, mas mantêm a sinalização de TLRS. A deleção/ruptura de HilA também permite a secreção prolongada de citocinas, por exemplo, aquelas codificadas pelas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, e o tráfico de macrófagos para tumores aumentando, desse modo, a eficácia das bactérias imunoestimulantes. Por exemplo, em comparação com S.
typhimurium contendo hilA intacto, por exemplo, VNP20009, os mutantes de deleção de hilA, exemplificados nesse relatório descritivo, ainda reduzem a quantidade de citocinas pró- inflamatórias, por exemplo, IL-6, aumentando a tolerabilidade da terapia, bem como a qualidade da resposta imune adaptativa. Flagelina
[00378] Flagelina de bactérias, por exemplo, Salmonella, além de SPI-1 T3SS, é necessária para o desencadeamento de piroptose em macrófagos, e pode ser detectada pelo inflamassoma de NLRC4 do macrófago. Flagelina, que é o componente principal do flagelo, é reconhecida por TLR5. Salmonella codifica dois genes de flagelina, fliC e fljB; a eliminação de subunidades de flagelina diminui a piroptose em macrófagos. Por exemplo, S. typhimurium com deleções em fliC e fljB resultou em secreção de IL-β significantemente reduzida, comparada com a cepa do tipo selvagem, enquanto a captação celular e a replicação intracelular da bactéria permaneceram não afetadas. Isso demonstra que flagelina desempenha um papel significante na ativação do inflamassoma. Adicionalmente, foi verificado que cepas de S. typhimurium modificadas geneticamente para expressar constitutivamente FliC induzem piroptose de macrófagos (Li e cols. (2016) Scientific Reports 6: 37.447; Fink e Cookson (2007) Cellular Microbiology 9 (11): 2.562-2.570; Winter e cols. (2015) Infect. Immun. 83 (4): 1.546-1.555). O genoma das bactérias imunoestimulantes desse relatório descritivo podem ser modificadas para deletar ou mutar os genes de flagelina fliC e fljB em S. typhimurium, levando à morte celular diminuída de células imunes residentes no tumor, por exemplo, macrófagos, e aumentando a resposta imune antitumoral das bactérias imunoestimulantes. Proteína Rod (PrgJ)
[00379] NLRC4 também detecta S. typhimurium aflagelada. A resposta flagelina-independente foi descoberta em consequência da detecção de PrgJ, que é a proteína Rod de SPI-1 T3SS em S. typhimurium. A liberação de proteína PrgJ purificada ao citosol do macrófago resultou em ativação de caspase-1 rápida NLRC4-dependente, bem como secreção de IL- β, similar aos efeitos induzidos por flagelina (Miao e cols. (2010) PNAS 107 (7): 3.076-3.080). Dessa forma, a mutação ou knockout do gene que codifica PrgJ em S. typhimurium pode reduzir a piroptose de macrófagos, o que aumenta o efeito imune antitumoral das bactérias imunoestimulantes, por preservação de células imunes que são suscetíveis a serem mortas pelas bactérias. Proteína Needle (Prgl)
[00380] Prgl, que é a proteína Needle de SPI-1 T3SS em S. typhimurium, também é reconhecida e ativa NLRC4. A liberação de S. typhimurium Prgl ao citosol de macrófagos primários humanos derivados de monócitos resultou em secreção de IL-10 e subsequente morte celular, enquanto uma Salmonella mutante que expressa Prgl, mas não flagelina, demonstrou que ativa o inflamassoma em macrófagos primários derivados de monócitos em pontos do tempo mais tarde do que cepas que expressam flagelina (Kortmann e cols. (2015) J. Immunol. 195: 815-819). As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser modificadas para mutar ou deletar o gene que codifica proteína Needle em S. typhimurium, evitando piroptose da célula imune, e aumentando o efeito imune antitumoral. QseC
[00381] QseC é uma histidina quinase sensora da membrana altamente conservada que é encontrada em muitas bactérias Gram-negativas, responde ao ambiente e regula a expressão de vários fatores de virulência, incluindo o gene flhDC que codifica o regulador principal da biossíntese do flagelo em S. typhimurium; o gene sopB, que codifica uma proteína que desempenha um papel na invasão de células não fagocíticas, na maturação inicial e regulação de tráfico do vacúolo que contém Salmonella (SCV), e na inibição de fusão SCV- lisossomo; e o gene sifA, que é necessário para manutenção do SCV e integridade da membrana. Foi demonstrado que a inibição seletiva de QseC por LED209 inibe a virulência bacteriana sem supressão do crescimento de S. typhimurium, por inibição da ativação mediada por QseC da expressão de genes relacionados à virulência (por exemplo, flhDC, sifA e sopB), e protege parcialmente camundongos de morte após infecção com S. typhimurium ou Francisella tularensis. Foi constatado que o bloqueio de QseC inibe a ativação de caspase-1, a liberação de IL-10 e piroptose de macrófagos induzida por S. typhimurium, por inibição de ativação em excesso do inflamassoma nos macrófagos infectados. A inibição de QseC também suprimiu a expressão gênica e motilidade flagelar, e suprimiu as capacidades de invasão e replicação de S. typhimurium em células epiteliais (Li e cols. (2016) Scientific Reports 6: 37.447). Dessa forma, a modificação das bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo, para mutação ou knockout do gene que codifica QseC, pode aumentar a resposta imune antitumoral por concentração da infecção por S. typhimurium em células não epiteliais, e por redução de morte celular em células imunes, por exemplo, por prevenção de piroptose em macrófagos.
7. Condições de cultura bacteriana
[00382] As condições de cultura para bactérias podem influenciar sua expressão gênica. Foi documentado que S. typhimurium pode induzir morte celular pró-inflamatória caspase-dependente rápida de macrófagos, mas de não células epiteliais, dentro de 30 a 60 min de infecção por um mecanismo que envolve o SPI-1 e seu T3SS-1 associado (Lundberg et. al (1999) Journal of Bacteriology 181 (11):
3.433-3.437). Sabe-se agora que essa morte celular é mediada por ativação do inflamassoma que subsequentemente caspase-1 ativa, que promove a maturação e liberação de IL-β e IL-18 e inicia uma nova forma de morte celular denominada piroptose (Broz e Monack (2011) Immunol. Rev. 243 (1): 174-190). Essa atividade piroptótica pode ser induzida por utilização de bactérias em fase log, enquanto bactérias em fase estacionária não induzem essa morte celular rápida em macrófagos. Os genes de SPI-1 são induzidos durante crescimento em fase log. Dessa forma, por colheita de S. typhimurium a ser usada terapeuticamente na fase estacionária, pode ser evitada a piroptose rápida de macrófagos. Macrófagos são mediadores importantes do sistema imune inato e podem atuar para secretar citocinas que são cruciais para o estabelecimento de respostas antitumorais apropriadas. Além disso, a limitação de citocinas pró- inflamatórias, por exemplo, a secreção de IL-10 e IL-18, aumentará a tolerabilidade da terapia dom S. typhimurium administrada. Como fornecida nesse relatório descritivo, S.
typhimurium imunoestimulante colhida na fase estacionária será usada para induzir respostas antitumorais. E. ATENUAÇÃO E COLONIZAÇÃO BACTERIANAS
1. Deleção de flagelina (MCI 11j13)
[00383] São fornecidas bactérias imunoestimulantes, por exemplo, a espécie de Salmonella S. typhimurium, modificada geneticamente para não possuir ambas as subunidades de flagelina fliC e fljB, para reduzir a sinalização pró- inflamatória. Por exemplo, como mostrado nesse relatório descritivo, uma cepa de Salmonella desprovida de msbB, que resulta em indução reduzida de TNF-alfa, é combinada com knockouts de fliC e fljB. A cepa de Salmonella resultante possui uma redução combinada na indução de TNF-alfa e redução no reconhecimento por TLRS. Essas modificações, msbB-, flir e fljB-, podem ser combinadas com um plasmídeo bacteriano, opcionalmente contendo CpGs, e também um cassete de expressão de cDNA para fornecer expressão de uma proteína terapêutica sob o controle de um promotor eucariótico como, por exemplo, uma proteína imunoestimulante, por exemplo, uma citocina ou quimiocina, por exemplo, IL-2, e/ou também moléculas inibidoras, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, por exemplo, nanobodies, e/ou molécula (s) de RNAi, que visa um ponto de verificação imune, por exemplo, TREX1, PD-L1, VISTA, SIRP-alfa, TGF-beta, beta-catenina, CD47, VEGF, e combinações destes. As bactérias resultantes possuem sinalização pró-inflamatória reduzida e atividade antitumoral robusta. Por exemplo, como exemplificado nesse relatório descritivo, um mutante duplo fliC- e fljB- foi construído na cepa de S. typhimurium com asd deletado cepa VNP20009 ou em uma Salmonella typhimurium do tipo selvagem,
por exemplo, uma que possui todas as características de identificação da cepa depositada sob o Nº de Acesso ATCC
14028. VNP20009, que é um derivado de ATCC 14028, foi atenuada para virulência por ruptura de purkpurM, e também foi modificada geneticamente para conter uma deleção de msbB que resulta na produção de uma subunidade de lipídeo A de LPS que é menos toxigênica do que lipídeo A do tipo selvagem. Isso resulta na produção reduzida de TNF-α no modelo em camundongo após administração intravenosa, comparada com cepas com lipídeo A do tipo selvagem.
[00384] Um mutante duplo fliC e fljB- foi construído em uma cepa do tipo selvagem de S. typhimurium e também modificada geneticamente para conter as deleções de asd, purkpurM e msbB. A bactéria é opcionalmente page-. As cepas resultantes são exemplares de cepas que são atenuadas para inflamação bacteriana por modificação de lipídeo A para reduzir a sinalização de TLR2/4, e deleção das subunidades de flagelina para reduzir o reconhecimento por TLRS e indução de inflamassoma. A deleção das subunidades de flagelina combinada com modificação do LPS permite maior tolerabilidade no hospedeiro, e dirige a resposta imunoestimulante em direção à produção de proteínas imunoestimulantes. A liberação de interferência de RNA pelas bactérias modificadas contra alvos desejados no TME provoca uma resposta antitumoral e promove uma resposta imune adaptativa ao tumor.
2. Deleção de genes na via biossintética de LPS
[00385] O LPS de bactérias Gram-negativas é o componente principal do folheto externo da membrana bacteriana. Ele é composto por três partes principais, lipídeo A, um oligossacarídeo central não repetitivo, e o antígeno 0 (ou polissacarídeo 0). O antígeno 0 é a porção mais externa em LPS e serve como uma camada protetora contra permeabilidade bacteriana, no entanto, a composição de açúcar do antígeno 0 varia amplamente entre cepas.
O lipídeo A e o oligossacarídeo central variam menos, e são mais tipicamente conservados dentro de cepas da mesma espécie.
Lipídeo A é a porção de LPS que contém atividade de endotoxina.
Ele é tipicamente um dissacarídeo decorado com múltiplos ácidos graxos.
Essas cadeias hidrofóbicas de ácido graxo ancoram o LPS na membrana bacteriana, e o resto do LPS se projeta da superfície celular.
O domínio de Lipídeo A é responsável por boa parte da toxicidade de bactérias Gram-negativas.
Tipicamente, LPS no sangue é reconhecido como um padrão molecular associado a patógeno (PAMP) significante, e induz uma resposta pró-inflamatória profunda.
LPS é o ligante para um complexo receptor ligado à membrana que compreende CD14, MD2 e TLR4. TLR4 é uma proteína transmembrana que pode sinalizar por meio das vias de MyD88 e TRIF para estimular a via de NFKB e resultar na produção de citocinas pró- inflamatórias, por exemplo, TNF-α e IL-β, cujo resultado pode ser choque endotóxico, que pode ser fatal.
LPS no citosol de células de mamíferos pode se ligar diretamente aos domínios CARD de caspases 4, 5 e 11, levando à autoativação e morte celular piroptótica (Hagar e cols. (2015) Cell Research 25: 149-150). A composição de lipídeo A e a toxigenicidade de variantes de lipídeo A é bem documentada.
Por exemplo, um lipídeo A monofosforilado é bem menos inflamatório do que lipídeo A com múltiplos grupos fosfato.
O número e comprimento das cadeias acil no lipídeo
A também podem ter um impacto profundo sobre o grau de toxicidade. Lipídeo A canônico de E. coli possui seis cadeias acil, e essa hexa-acilação é potentemente tóxica. Lipídeo A S. typhimurium é similar àquele de E. coli; ele é um dissacarídeo de glucosamina que carrega quatro cadeias hidroxiacil primárias e duas secundárias (Raetz e Whitfield (2002) Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700). Como descrito acima, mutantes ms17B- de S. typhimurium não podem passar por miristoilação terminal de seu LPS e produzem predominantemente lipídeo A penta-acilado que é significantemente menos tóxico do que lipídeo A hexa- acilado. A modificação de lipídeo A com palmitato é catalisada por palmitoil transferase (PagP). A transcrição do gene pagP está sob o controle do sistema PhoP/PhoQ, que é ativado por concentrações baixas de magnésio, por exemplo, dentro do SCV. Dessa forma, o teor de acil de S. typhimurium é variável e, com bactérias do tipo selvagem, ele pode ser hexa- ou penta-acilado. A habilidade de S. typhimurium para palmitar seu lipídeo A aumenta a resistência aos peptídeos antimicrobianos que são secretados em fagolisossomos.
[00386] Em S. typhimurium do tipo selvagem, a expressão de pagP resulta em um lipídeo A que é hepta-acilado. Em um mutante msbB- (no qual a cadeia acil terminal do lipídeo A não pode ser adicionada), a indução de pagP resulta em um LPS hexa-acilado (Kong e cols. (2011) Infection and Immunity 79 (12): 5.027-5.038). Foi demonstrado que LPS hexa-acilado é o mais pró-inflamatório. Embora outros grupos tenham buscado explorar esse sinal pró-inflamatório, por exemplo, por deleção de pagP para permitir que somente LPS hexa- acilado seja produzido (Felgner e cols. (2016) Gut Microbes
7 (2): 171-177; Felgner e cols. (2018) Oncoimmunology 7 (2): e1382791), isso pode levar a uma baixa tolerabilidade, em decorrência da natureza pró-inflamatória mediada por TNF-α do LPS e paradoxalmente menos imunidade adaptativa (Kocijancic e cols. (2017) Oncotarget 8 (30): 49.988-
50.001). É eExemplificada nesse relatório descritivo uma cepa viva atenuada de S. typhimurium que só pode produzir LPS penta-acilado, que contém uma deleção do gene msbB (que evita a miristoilação terminal de lipídeo A, como descrito acima), e é adicionalmente modificada por deleção de pagP (que evita a palmitoilação). Uma cepa modificada para produzir LPS penta-acilado permitirá níveis menores de citocinas pró-inflamatórias, estabilidade aumentada no sangue e resistência para fixação de complemento, sensibilidade aumentada aos peptídeos antimicrobianos, tolerabilidade aumentada e imunidade antitumoral aumentada quando adicionalmente modificada para expressar proteínas imunoestimulantes heterólogas e/ou RNAs interferentes contra pontos de verificação imune.
[00387] Como fornecido nesse relatório descritivo, um mutante pagP- também foi construído em uma cepa com asd, msbB, purkpurM e fliCAB deletados de S. typhimurium VNP20009 ou S. typhimurium do tipo selvagem. As cepas resultantes são exemplares de cepas que são atenuadas para inflamação bacteriana por modificação de lipídeo A para reduzir a sinalização de TLR2/4, e deleção das subunidades de flagelina para reduzir o reconhecimento por TLRS e indução de inflamassoma, e deleção de pagP para produzir LPS penta- acilado. A deleção das subunidades de flagelina combinada com modificação do LPS permite maior tolerabilidade no hospedeiro, e maior estabilidade no sangue e resistência para fixação de complemento, fornecendo tráfico aumentado até o local do tumor, a fim de direcionar a resposta imunoestimulante em direção à produção de qualquer produto gênico, por exemplo, proteínas imunoestimulantes e/ou liberação de interferência de RNA contra alvos desejados no TME para provocar uma resposta antitumoral e promover uma resposta imune adaptativa ao tumor.
3. Colonização
[00388] VNP20009 é uma terapia microbiana à base de S. typhimurium atenuada contra o câncer que foi desenvolvida para o tratamento de câncer. VNP20009 é atenuada por meio de deleção dos genes msbB e purl (purM). A deleção de purl torna o micróbio auxotrófico para purinas ou adenosina. A deleção do gene msbB reduziu a toxicidade associada ao lipopolissacarídeo (LPS) por prevenção da adição de um grupo miristil terminal ao domínio de Lipídeo A (Kahn e cols., (1998) Mol. Microbiol. 29: 571-579).
[00389] Há uma diferença entre camundongo e humanos na habilidade de VNP20009 para colonizar tumores. A administração sistêmica de VNP20009 resultou em colonização de tumores em camundongos; enquanto a administração sistêmica de VNP20009 em pacientes humanos resultou em muito pouca colonização. Foi demonstrado que, em camundongos, VNP20009 mostrou um grau elevado de colonização tumoral após administração sistêmica (Clairmont e cols., (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002; e Bermudes e cols. (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18: 219-33). Em um Estudo de Fase 1 em pacientes com melanoma avançado, no entanto, muito pouca VNP20009 foi detectada em tumores humanos após uma infusão intravenosa de 30 minutos (veja Toso e cols., (2002) J.
Clin Oncol. 20: 142-52). Pacientes que entraram em um estudo de acompanhamento que avalia uma infusão de VNP20009 mais longa, de quatro horas, também demonstraram uma ausência de VNP20009 detectável após biópsia do tumor (Heimann e cols. (2003) J.
Immunother. 26: 179-180). Após administração intratumoral, a colonização de um derivado de VNP20009 foi detectada (Nemunaitis e cols. (2003) Cancer Gene Ther. 10: 737-44). A administração intratumoral direta de VNP20009 aos tumores humanos resultou em colonização tumoral, indicando que tumores humanos podem ser colonizados em um nível elevado, e que a diferença na colonização tumoral entre camundongos e humanos ocorre apenas após administração sistêmica.
Foi demonstrado nesse relatório descritivo (veja, por exemplo, o Exemplo 25) que VNP20009 é inativada por complemento humano, o que leva a uma colonização tumoral baixa.
São fornecidas cepas que fornecem resistência aumentada ao complemento.
Essas cepas contêm modificações no genoma bacteriano e também podem carregar um plasmídeo, tipicamente em número de cópias baixo ou médio, para codificar genes para fornecer replicação (asd sob o controle de um promotor eucariótico), e ácido nucleico (ou ácidos nucleicos) que codifica um produto (ou produtos) terapêutico, por exemplo, sem limitação, RNAi, proteína imunoestimulante, por exemplo, citocinas, e outros genes terapêuticos desse tipo, como descrito em outra parte nesse relatório descritivo.
A tabela abaixo resume os genótipos/modificações bacterianos, seus efeitos funcionais, e os efeitos/benefícios.
Genótipo/ Efeito funcional Efeito/benefício
Modificação Auxotrofia de Enriquecimento tumor- purina/adenosina específico Apurl Replicação limitada em tecido saudável Reconhecimento por TLR4 Modificação do diminuído revestimento de AinsbB Perfil de citocina superfície de reduzido
LPS Segurança aumentada Remove elemento inflamatório e imunossupressor principal Knockout de AFLG Reconhecimento por TLR5 flagelos diminuído Perfil de citocina reduzido Segurança aumentada Remove elemento inflamatório e Modificações do imunossupressor revestimento de principal ApagP superfície de Reconhecimento por TLR4 LPS diminuído Perfil de IL-6 reduzido Segurança aumentada Liberação de plasmídeo Acisd (no Manutenção de aumentada genoma) plasmídeo Manutenção de plasmídeo
Promotor eucariótico limita a expressão às células que contêm o plasmídeo Expressão de Expressão de longo prazo produtos gênicos no THE (ou seja, asd Plasmídeo sob o controle codificado no plasmídeo de promotor sob o controle de reconhecido pelo promotor reconhecido hospedeiro pelo hospedeiro) Expressão de produto (ou produtos) terapêutico
[00390] As cepas fornecidas nesse relatório descritivo são AFLG e/ou ApagP. Adicionalmente, as cepas são um ou mais de Apurl (ApurM), AmsbB e Aasd (no genoma bacteriano). O plasmídeo é modificado para codificar produtos sob o controle de promotores reconhecidos pelo hospedeiro (por exemplo, promotores eucarióticos, por exemplo, promotores de RNA polimerase II, incluindo aqueles de eucariotas, e vírus animais). Os plasmídeos podem codificar asd para permitir a replicação in vivo, bem como ácidos nucleicos com other funções benéficas e produtos gênicos, como descrito em outra parte nesse relatório descritivo.
[00391] As bactérias imunoestimulantes são derivadas de cepas bacterianas adequadas. As cepas bacterianas podem ser cepas atenuadas, ou cepas que são atenuadas por métodos padronizados, ou que, em virtude das modificações fornecidas nesse relatório descritivo, são atenuadas pelo fato de que sua habilidade para colonizar é limitada primariamente a tecidos e órgãos imunoprivilegiados, particularmente células imunes e tumorais, incluindo tumores sólidos. Bactérias incluem, sem limitação, por exemplo, cepas de Salmonella, Shigella, Listeria, E. coli e Bifidobacteriae. Por exemplo, espécies incluem Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella disenteriae, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, e Salmonella enteritidis. Outras espécies bacterianas adequadas incluem Rickettsia, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Vibrio, Bacillus e Erysipelothrix. Por exemplo, Rickettsia Rikettsiae, Rickettsia prowazekii, Rickettsia tsutsugamuchi, Rickettsia mooseri, Rickettsia sibirica, Bordetella bronchiseptica, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas salmonicida, Francisella tularensis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Citrobacter freundii, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus sornnus, Brucella abortus, Mycobacterium intracellulare, Legionella pneumophila, Rhodococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustelae, Vibrio cholerae, Bacillus subtilis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Yersinia enterocolitica, Rochalimaea quintana, e Agrobacterium tumerfacium.
[00392] Exemplares das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo são espécies de Salmonella. Exemplares de bactérias para modificação como descritas nesse relatório descritivo são cepas do tipo selvagem de Salmonella, por exemplo, a cepa que possui todas as características de identificação da cepa depositada na
ATCC como Nº de Acesso 14028. As cepas modificadas geneticamente de Salmonella typhimurium, por exemplo, cepa YS1646 (Nº de Catálogo ATCC 202165; também referida como VNP20009; veja, Publicação de Pedido Internacional Nº WO 99/13053,) que é modificada geneticamente com plasmídeos para complementar um knockout do gene asd e manutenção do plasmídeo livre de antibióticos. As cepas são então modificadas para deletar os genes de flagelina e/ou para deletar pagP. As cepas também são tornadas auxotróficas para purinas, particularmente adenosina, e são asd- e msbB-. O gene asd também pode ser fornecido em um plasmídeo para replicação no hospedeiro eucariótico. Essas deleções e plasmídeos são descritos em outra parte nesse relatório descritivo. Qualquer um dos ácidos nucleicos que codificam produtos terapêuticos e proteínas e produtos imunoestimulantes, descritos em outra parte nesse relatório descritivo e/ou conhecidos por aqueles habilitados na técnica, pode ser incluído no plasmídeo. O plasmídeo geralmente está presente em número de cópias baixo para médio como descrito em outra parte nesse relatório descritivo. Produtos terapêuticos incluem proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, que promovem uma resposta imune antitumoral no microambiente tumoral e outros produtos desse tipo descritos nesse relatório descritivo. F. CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS EXEMPLARES QUE CODIFICAM
PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS
[00393] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo são modificadas. Elas incluem modificações ao genoma bacteriano e à expressão bacteriana e invasão da célula hospedeira, como discutido abaixo, de modo a aprimorar ou aumentar o direcionamento ou acúmulo em tumores, células imunes residentes no tumor e no microambiente tumoral e, além disso, para incluir plasmídeos que codificam produtos que são expressos nas bactérias por inclusão de um promotor bacteriano no hospedeiro, ou por inclusão de um promotor eucariótico apropriado e outras regiões reguladoras, como apropriado. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que as bactérias imunoestimulantes que são flagelina- (fliC- IfljB) e/ou pagP- e, opcionalmente, WA- , exibem colonização tumoral aumentada e, dessa forma, podem superar os problemas prévios encontrados com VNP20009, que não conseguiu colonizar adequadamente tumores em humanos. A atividade clínica de VNP20009 foi desapontadora, em parte em decorrência de sua habilidade pobre para colonizar tumores humanos (Nemunaitis e cols. (2003) Cancer Gene Ther. 10 (10): 737-744; Toso e cols. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (1): 142- 152; Heimann e cols. (2003) J. Immunother. 26 (2): 179-180).
[00394] Para introduzir os plasmídeos, as bactérias são transformadas como o uso de métodos padronizados, por exemplo, eletroporação, com plasmídeos de DNA purificados construídos com ferramentas e métodos de biologia molecular rotineiros (síntese de DNA, amplificação por PCR, digestão com enzima de restrição de DNA e ligação de fragmentos de extremidade coesiva compatível com ligase). Como discutido ao longo desse relatório descritivo, os plasmídeos codificam um ou mais produtos terapêuticos, incluindo proteínas, por exemplo, anticorpos e fragmentos destes, e proteínas imunoestimulantes, por exemplo, interleucinas, sob o controle de promotores reconhecidos pelo hospedeiro. As proteínas imunoestimulantes codificadas estimulam o sistema imune, particularmente no microambiente tumoral. Os anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo e anticorpos de cadeia única, podem inibir pontos de verificação imune.
[00395] O plasmídeo pode codificar, por exemplo, um produto terapêutico ou proteína terapêutica que é um ou mais de GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12p70 (IL-12p40 + IL-12p35), IL- 15, complexo IL-15/cadeia alfa de IL-15R, IL-2 que teve atenuada uma ligação à IL-2Ra, IL-18, IL-36 gama, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5, proteínas que estão envolvidas ou que efetuam ou potencializam recrutamento/persistência de células T, CD40, ligante de CD40, OX40, ligante de OX40, 4-1BB, ligante de 4-1BB, membros da família B7-CD28, um antagonista do polipeptídeo de TGF- beta, um antagonista de CD47, interferon-α, interferon-0, interferon-γ, ou membros da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR).
[00396] As bactérias podem codificar outros produtos nos plasmídeos, por exemplo, uma ou mais construções de RNA hairpin curto (sh), ou outro inibidor de RNA modalidades, cuja expressão inibe, suprime ou rompe a expressão de genes visados. Os produtos terapêuticos, por exemplo, as proteínas imunoestimulantes, anticorpos e RNAi, por exemplo, construções de shRNA ou microRNA, são expressos sob o controle de um promotor eucariótico, por exemplo, um promotor de RNA polimerase (RNAP) II ou III. Tipicamente, promotores de RNAPIII (também referidos como POLIII) são constitutivos, e RNAPII (também referidos como POLII) podem ser regulados. Em alguns exemplos, os shRNAs visam o gene TREX1, para inibir sua expressão. Em algumas modalidades os plasmídeos codificam diversos produtos terapêuticos. Quando diversos produtos, por exemplo, RNAi's, são codificados, a expressão de cada um pode estar sob o controle de promotores diferentes, ou os produtos podem ser codificado de forma policistrônica.
[00397] Os ácidos nucleicos que codificam os produtos terapêuticos/proteínas podem estar sob o controle de um promotor eucariótico que é um promotor de RNA polimerase II ou um promotor de RNA polimerase III. O promotor de RNA polimerase II pode ser um promotor viral ou um promotor de RNA polimerase II de mamífero. O promotor viral pode ser um selecionado entre promotores virais bem conhecidos. Exemplares destes são um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor SV40, um promotor de vírus de Epstein-Barr (EBV), um promotor de herpes vírus e um promotor de adenovírus.
[00398] O produto terapêutico pode estar sob o controle de um promotor de RNA polimerase II (RNAP II)eucariótico. Muitos desses promotores são muito bem conhecidos.
[00399] Exemplares desses promotores é um promotor de RNAPII selecionado entre, por exemplo, um promotor de fator de alongamento-1 (EF1) alfa, um promotor de ubiquitina C (UBC), um promotor de fosfoglicerato quinase 1 (PGK), um promotor de CAG (que consiste: (C) no elemento intensificador precoce de citomegalovírus (CMV), (A) no promotor, no primeiro éxon e no primeiro íntron do gene de beta-actina de galinha, e (G) no aceptor de splice do gene de beta-globina de coelho), um promotor de EIF4a1 (fator de iniciação eucariótico 4A), um promotor de CBA (beta actina de galinha), um promotor de MND, um promotor de GAPDH e um promotor de CD68. MND é um promotor sintético que contém a região U3 de a LTR de MoMuLV modificada com intensificador do vírus do sarcoma mieloproliferativo (promotor de MND derivado do vírus da leucemia murídea (intensificador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativo deletada, sítio de ligação ao iniciador de d1587rev substituído; veja, por exemplo, Li e cols. (2010) J. Neurosci. Methods vol. 189: 56-64).
[00400] Como fornecidas nesse relatório descritivo, cepas bacterianas, por exemplo, cepas de Salmonella, incluindo S. typhimurium, são modificadas ou identificadas para serem auxotróficas para adenosina no microambiente tumoral, e/ou o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado de modo que infecte preferencialmente células imunes residentes no tumor e/ou de modo que induza menos morte celular em células imunes residentes no tumor, e as bactérias são modificadas para carregar plasmídeos que codificam um produto terapêutico, por exemplo, uma proteína imunoestimulante, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, por exemplo, um anticorpo antitumoral ou fragmento deste ou anticorpo anti-ponto de verificação, e outros produtos, por exemplo, RNAi.
1. Proteínas imunoestimulantes
[00401] Como discutido abaixo, e em outra parte nesse relatório descritivo, são fornecidas bactérias imunoestimulantes que contêm sequências de nucleotídeos que codificam produtos gênicos, por exemplo, proteínas imunoestimulantes, para conferir, aumentar ou aprimorar respostas imunes no microambiente tumoral. Essas bactérias imunoestimulantes são modificadas para infectar preferencialmente tumores, incluindo células imunes residentes no tumor, e/ou o genoma das bactérias imunoestimulantes é modificado de modo que elas induzam menos morte celular em células imunes residentes no tumor, pela qual as bactérias imunoestimulantes se acumulam em células tumorais para, desse modo, liberar as proteínas imunoestimulantes às células visadas para estimular a resposta imune contra o tumor.
As bactérias imunoestimulantes podem ainda codificar um antígeno tumoral para aumentar a resposta contra o tumor particular.
Qualquer uma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo e descritas acima e abaixo pode ser modificada para codificar uma proteína imunoestimulante.
Geralmente, a proteína imunoestimulante está sob o controle de um promotor de RNA polimerase II (RNAPII), e também é codificada no plasmídeo para secreção, mediante expressão, no microambiente tumoral.
Qualquer uma das bactérias descritas nesse relatório descritivo para modificação, por exemplo, qualquer uma das cepas de Salmonella, Shigella, E. coli, Bifidobacteriae, Rickettsia, Vibrio, Listeria, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Cholera, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Bacillus e Erysipelothrix, ou uma cepa atenuada destas ou uma cepa modificada destas codificam a proteína imunoestimulante de modo que ele seja expressa nas células do indivíduo infectado.
As bactérias imunoestimulantes incluem aquelas que são modificadas, como descrito nesse relatório descritivo, para colonizar, para se acumular ou para infectar preferencialmente, tumores, células imunes residentes no tumor e/ou o TME.
[00402] Como discutido na seção D5, e em outra parte nesse relatório descritivo, as bactérias imunoestimulantes podem codificar proteínas imunoestimulantes, por exemplo, citocinas, incluindo quimiocinas, que aumentam ou estimulam ou provocam uma resposta imune antitumoral, particularmente quando expressas em tumores, no microambiente tumoral e/ou em células imunes residentes no tumor.
[00403] As bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo podem ser modificadas para codificar uma proteína imunoestimulante que promove ou induz ou aumenta uma resposta antitumoral. A proteína imunoestimulante pode ser codificada em um plasmídeo na bactéria, sob o controle de um promotor eucariótico, por exemplo, um promotor reconhecido por RNA polimerase II, para expressão em um indivíduo eucariótico, particularmente no indivíduo para o qual a bactéria imunoestimulante deve ser administrada, por exemplo, um humano. O ácido nucleico que codifica a proteína imunoestimulante pode incluir, além do promotor eucariótico, outros sinais regulatórios para expressão ou tráfico nas células, por exemplo, para secreção ou expressão na superfície de uma célula.
[00404] Proteínas imunoestimulantes são aquelas que, no ambiente apropriado, por exemplo, um microambiente tumoral (TME), podem promover ou participar ou aumentar uma resposta antitumoral pelo indivíduo ao qual a bactéria imunoestimulante é administrada. Proteínas imunoestimulantes incluem, sem limitação, citocinas, quimiocinas e moléculas coestimulantes. Estas incluem citocinas, por exemplo, sem limitação, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-18; quimiocinas, por exemplo, sem limitação, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 e CXCL11; e/ou moléculas coestimulantes, por exemplo, sem limitação, CD40, CD40L, OX40, OX40L, 4-1BB, 4-1BBL, GM-C SF, membros da superfamília de TNF/TNFR e membros da família B7- CD28. Outras dessas proteínas imunoestimulantes que são usadas para tratamento de tumores ou que podem promover, intensificar ou de algum outro modo aumentar ou provocar uma resposta antitumoral, conhecidas por aqueles habilitados na técnica, são contempladas para codificação nas bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo.
[00405] Em algumas modalidades, as bactérias imunoestimulantes nesse relatório descritivo são modificadas geneticamente para expressar citocinas para estimular o sistema imune incluindo, sem limitação, IL-2, IL-7, IL-12 (IL-12p70 (IL12p40 + IL-12p35)), IL-15 (e o complexo de cadeia alfa de IL-151L-15R) e IL-18. Citocinas estimulam células imunes efetoras e células estromais no local do tumor, e aumentam o reconhecimento da célula tumoral por células citotóxicas. Em algumas modalidades, as bactérias imunoestimulantes podem ser modificadas geneticamente para expressar quimiocinas como, por exemplo, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 e CXCL11. Essas modificações e bactérias que as codificam são discutidas acima, e exemplificadas abaixo.
2. Anticorpos e fragmentos de anticorpo
[00406] São fornecidas bactérias imunoestimulantes que contêm sequências de nucleotídeos que codificam produtos gênicos, por exemplo, anticorpos e fragmentos de anticorpo, para conferir, aumentar ou aprimorar respostas imunes antitumorais. Esses incluem anticorpos e fragmentos de anticorpo que visam pontos de verificação imune, por exemplo, CTLA-4, PD-1, PD-Ll, CD47, ou que visam antígenos tumorais e neoantígenos tumorais, incluindo aqueles identificados do tumor de um indivíduo a ser tratado, entre outros, e, por exemplo, anticorpos anti-IL-6 que modulam, particularmente inibem, a supressão imune. Os anticorpos ou fragmentos destes, por exemplo, scFv e outros anticorpos de cadeia única, por exemplo, camelídeos e nanobodies, podem ser codificados em um plasmídeo na bactéria, sob o controle de sequências e sigais regulatórios eucarióticos, incluindo um promotor eucariótico, por exemplo, um promotor reconhecido por RNA polimerase II, para expressão em um indivíduo eucariótico, particularmente no indivíduo para o qual a bactéria imunoestimulante deve ser administrada, por exemplo, um humano. O ácido nucleico que codifica os anticorpos e fragmentos de anticorpo pode incluir, além do promotor eucariótico, outros sinais regulatórios para expressão e/ou tráfico nas células, por exemplo, para secreção ou expressão na superfície de uma célula.
[00407] Essas bactérias imunoestimulantes são aquelas fornecidas nesse relatório descritivo cujos genomas são modificados para infectar preferencialmente tumores, incluindo células imunes residentes no tumor, e/ou para eliminar infecção de células que não são células-alvo, e/ou de modo que induzam menos morte celular em células imunes residentes no tumor, pela qual as bactérias imunoestimulantes se acumulam em células tumorais para, desse modo, liberar o anticorpo ou fragmento de anticorpo às células visadas para estimular a resposta imune contra o tumor. As bactérias imunoestimulantes também ou alternativamente podem codificar um antígeno ou neoantígeno tumoral para aumentar a resposta contra o tumor particular.
Qualquer uma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo e descritas acima e abaixo pode ser modificada para codificar um anticorpo ou fragmento deste. Geralmente, o anticorpo ou fragmento deste está sob o controle de um promotor de RNA polimerase II (RNAPII), e também é codificado no plasmídeo para secreção, mediante expressão, no microambiente tumoral. Qualquer uma das bactérias descritas nesse relatório descritivo para modificação, por exemplo, qualquer uma das cepas de Salmonella, Shigella, E. coli, Bifidobacteriae, Rickettsia, Vibrio, Listeria, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Cholera, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Bacillus e Erysipelothrix, ou uma cepa atenuada destas ou uma cepa modificada destas, codifica o anticorpo ou fragmento deste de modo que ele seja expresso nas células do indivíduo infectado. As bactérias imunoestimulantes incluem aquelas que são modificadas, como descrito nesse relatório descritivo, para colonizar, para se acumular ou para infectar preferencialmente, tumores, células imunes residentes no tumor e/ou o microambiente tumoral.
[00408] Anticorpos terapêuticos e fragmentos destes são bem conhecidos. Por exemplo, há inúmeros anticorpos anti- CTLA4, anti-PD-1 e anti-PD-L1 e fragmentos de ligação ao antígeno destes, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv de cadeia única (scFv), Fv, Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), nanobodies de camelídeos, e diabody de fragmentos, anticorpos de cadeia única, e anticorpos humanizados e humanos que são conhecidos. Por exemplo, anticorpos que se ligam a PD-1 ou PD-L1 e inibem a atividade inibidora de PD- 1, e que têm sido usados em imunoterapia antitumoral são conhecidos. Anticorpos anti-PD-1 exemplares incluem, sem limitação, qualquer um daqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 7.943.743, 8.008.449 e 8.735.553; Publicações U.S. Nos 2005/0180969 e 2007/0166281; e Publicação de Pedido Internacional de Patente Nº WO 2008/156712. Anticorpos anti- PD-L1 incluem, sem limitação, qualquer um daqueles descritos nas Publicações U.S. Nos 2013/0034559 e 2013/0045202; Patentes U.S. Nos 7.943.743, 8.217.149, 8.679.767 e
8.779.108; e Publicações de Pedido Internacional Nos WO 2010/077634 e WO 2013/019906. Vários anticorpos, que se ligam e inibem a atividade de CTLA-4, foram descritos, e têm sido usados em imunoterapia antitumoral. Anticorpos anti-CTLA4 incluem, sem limitação, qualquer um daqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 6.682.736 e 6.984.720; Publicações U.S. Nos 2002/0086014 e 2009/0074787; Patente Européia Nº EP 1262193; e Publicação de Pedido Internacional de Patente Nº WO 2000/037504. Anticorpos anti-CTLA4 incluem Ipilimumab (também denominado MDX-010 ou 10D1) e Tremelimumab (também denominado Ticilimumab ou CP-675,206). Esses anticorpos anti-CTLA4 foram envolvidos em diversos experimentos clínicos para o tratamento de cânceres. Ipilimumab é aprovado pelo FDA para o tratamento de melanoma e esteve em experimentos clínicos para outros cânceres, por exemplo, câncer de próstata, câncer de pulmão e carcinoma de célula renal (RCC). Tremelimumab foi investigado em experimentos clínicos para o tratamento de câncer cólon-retal (CRC), câncer gástrico, melanoma e câncer de pulmão de célula não-
pequena (NSCLC). Inibidores do ponto de verificação exemplares incluem, sem limitação, agentes anti-CTLA4, agentes anti-PD-1, agentes anti-PD-L1 e outros, dos quais são exemplares os seguintes: Proteínas e inibidores exemplares que visam pontos de verificação imune Anticorpo/ Função do proteína de Sinônimos de nomes de alvo Alvo fusão código CTLA4 Receptor Ipilimumab (MDX-CTLA-4; BMS-734016; inibidor Tremelimumab MDX-010) (Ticilimumab; CP- 675,206) PD-1 Receptor MK-3475 (Pembrolizumab; inibidor AMP-224 Lambrolizumab; SCH 900475) Nivolumab (anti-PD-1 proteína de Pidilizumab fusão AMP-224) (BMS- 936558; MDX-1106; ONO- 4538) (CT-011) PD-L1 Ligante para MDX-1105 BMS- (RG7446) PD-1 936559 MED14736 MPDL33280A
[00409] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser modificadas geneticamente para expressar qualquer anticorpo/fragmento de ligação ao antígeno deste incluindo, sem limitação, os anticorpos anti- ponto de verificação (antagonistas/inibidores do ponto de verificação) descritos nesse relatório descritivo, e conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
3. RNAs interferentes (RNAi)
[00410] Os plasmídeos nas cepas bacterianas imunoestimulantes desse relatório descritivo codificam os ácidos nucleicos de RNAi que visam os pontos de verificação imune e outros alvos de interesse, como descrito acima. RNAi inclui shRNA, siRNA e microRNA. A interferência de RNA (RNAi) permite a supressão sequência-seletiva da expressão gênica em células eucarióticas com o uso de pequenos RNAs interferentes (siRNAs), que são moléculas de dsRNA curtas, sintéticas, com uma sequência homóloga ao gene-alvo. A tecnologia de RNAi fornece uma ferramenta poderosa para a depleção de transcritos relacionados a doenças. a. shRNA
[00411] Os siRNAs, que têm tipicamente cerca de 19-29 pares de bases de comprimento, funcionam por degradação de sequências de mRNA específicas do hospedeiro, impossibilitando a tradução em seus respectivos produtos de proteína, silenciando eficazmente a expressão do gene-alvo. RNAs hairpin curtos (shRNAs), que contêm uma alça hairpin justa, são amplamente usados em RNAi. shRNAs contêm duas sequências de RNA complementares, cada uma com 19-29 bps de comprimento, ligadas por um espaçador de alça de 4-15 nucleotídeos. A sequência de RNA que é complementar à sequência do gene-alvo (e é, dessa forma, idêntica à sequência de mRNA), é conhecida como a fita “senso”, enquanto a fita que é complementar ao mRNA (e idêntica à sequência do gene-alvo) é conhecida como a fita “anti-senso” ou “guia”. Os transcritos de shRNA são processados por uma enzima RNase III conhecida como Dicer em duplexos de siRNA. O produto é então carregado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) com proteínas Argonauta (Ago) e outras proteínas de ligação ao RNA. O RISC então localiza a fita anti-senso, ou “guia”, em sua sequência de mRNA complementar, que é subsequentemente clivada por Ago (Patente U.S. Nº
9.624.494). O uso de shRNA e preferido em relação ao de siRNA, pois tem um custo mais compensador, concentrações intracelulares elevadas de siRNA estão associadas com efeitos fora-do-alvo, e porque a concentração de siRNA fica diluída após divisão celular. O uso de shRNA, por outro lado, resulta em knockdown gênico estável, de longo prazo, sem a necessidade de múltiplas rodadas de transfecção (Moore e cols. (2010) Methods Mol. Bio. 629: 141-158). Alvos de interesse para RNAi, por exemplo, silenciamento mediado por microRNA e siRNA/shRNA, incluem, sem limitação, genes do desenvolvimento como, por exemplo, citocinas e seus receptores, inibidores de ciclina quinase, neurotransmissores e seus receptores, fatores de crescimento/diferenciação e seus receptores; oncogenes como, por exemplo, BCL2, ERBA, ERBB, JUN, KRAS, MYB, MYC; genes supressores de tumor como, por exemplo, BRCAJ, BRCA2, MCC, p53; e enzimas como, por exemplo, ACC sintases e oxidases, ATPases, álcool desidrogenases, amilases, catalases, DNA polimerases, RNA polimerases, quinases, lactases e lipases (Patentes U.S. Nos 7.732.417, 8.829.254, 8.383.599,
8.426.675, 9.624.494; Publicação de Patente U.S. Nº 2012/0009153). De interesse particular são alvos do ponto de verificação imune, por exemplo, PD-1, PD-2, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, IDO 1 e 2, CTNNB1 ((3-catenina), SIRPa, VISTA, RNase H2, DNase II, CLEVER-1/Estabilina-1, LIGHT, HVEM, LAG3, TIM3, TIGIT, Galectina-9, KIR, GITR, TIM1, TIM4, CEACAM1, CD27, CD47, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD112,
CD137(4-1BB), CD155, CD160, CD200, CD226, CD244 (2B4), CD272 (BTLA), B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, ICOS, A2aR, A2bR, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B, HLA-G, ILT-2/4, OX40 e OX-40L. Other targets incluem MDR1, Arginase 1, iNOs, IL-10, TGF-β, pGE2, STAT3, VEGF, VEGFR, KSP, HER2, Ras, EZH2, NIPP1, PP1, TAK1 e PLK1 (Publicações de Patentes U.S. Nos 2008/091375, 2009/0208534, 2014/0186401, 2016/0184456, 2016/0369282; Publicações de Pedido Internacional Nos WO 2012/149364, WO 2015/002969, WO 2015/032165, WO 2016/025582).
[00412] RNAi expresso, por exemplo, shRNAs, medeia o knockdown estável, de longo prazo, de seus transcritos-alvo por todo o tempo em que os shRNAs são transcritos. Promotores de RNA Pol II e III são usados para dirigir a expressão de construções de shRNA, dependendo do tipo de expressão necessária. Consistente com seus papéis celulares normais na produção de pequenos RNAs endógenos, abundantes, promotores Pol III (por exemplo, U6 ou H1) dirigem níveis elevados de expressão constitutiva de shRNA, e seus pontos de iniciação e sinais de terminação (4-6 timidinas) da transcrição são bem definidos. shRNAs dirigidos pelo promotor Pol II podem ser expressos tecido-especificamente e são transcritos como precursores mais longos que simulam pri-miRNAs e possuem sinais cap e poli-A que devem ser processados. Esses miRNAs/shRNAs artificiais são incorporados eficientemente em RISC, contribuindo para uma inibição mais potente da expressão do gene-alvo; isso permite níveis menores de expressão de shRNA e pode evitar a saturação de componentes na via de RNAi. Uma vantagem adicional de promotores Pol II é que um único transcrito pode expressar simultaneamente vários miRNAs e simular shRNAs. A estratégia de multiplexação pode ser usada para o knockdown simultâneo da expressão de dois ou mais alvos terapêuticos, ou para vidar vários sítios em um único produto gênico (veja, por exemplo, Publicação U.S. Nº 2009/0208534). b. MicroRNA
[00413] microRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA de fita simples, curtas, não codificadoras, que têm aproximadamente ou exatamente 20-24 nucleotídeos de comprimento. miRNAs de ocorrência natural estão envolvidos na regulação pós- transcricional da expressão gênica; miRNAs não codificam genes. Foi demonstrado que miRNAs regulam a proliferação e sobrevida celulares, bem como a diferenciação celular. miRNAs inibem a tradução ou promovem a degradação de RNA por ligação aos mRNAs-alvo que compartilham complementaridade de sequência. Eles afetam a estabilidade e tradução de mRNAs; miRNAs inibem a tradução, e/ou promovem a degradação de RNA, por ligação aos mRNAs-alvo que compartilham complementaridade de sequência. miRNAs, que ocorrem em eucariotas, são transcritos por RNA Pol II em transcritos primários capped e poliadenilados que contêm hairpin, conhecidos como miRNAs primários, ou pri-miRNAs. Esses pri- miRNAs são clivados pela enzima Drosha ribonuclease III e seu co-fator Pasha/DGCR8 em miRNA hairpins precursores com aproximadamente 70 nucleotídeos de comprimento, conhecidos como miRNAs precursores, ou pré-miRNAs, que são então transportados do núcleo para dentro do citoplasma, e clivados por Dicer ribonuclease III no duplexo miRNA:miRNA*, com produtos de fita senso e anti-senso que têm aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento. O miRNA maduro é incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que reconhece e se liga aos mRNAs-alvo, normalmente na região não traduzida-3’ (UTR), por meio de pareamento da bases imperfeito com o miRNA, resultando na inibição da tradução, ou desestabilização/degradação do mRNA-alvo (veja, por exemplo, Auyeung e cols. (2013) Cell 152 (4): 844-85).
[00414] Como descrito nesse relatório descritivo, a regulação da expressão gênica por interferência de RNA (RNAi), frequentemente usa RNAs hairpin curtos (shRNAs) para inibir, romper ou de algum outro modo interferir com a expressão de genes visados. Embora usados vantajosamente, e usados nesse relatório descritivo, em alguns casos, shRNAs podem ser substratos ruins para fatores da biogênese de pequeno RNA, eles podem ser processados em uma mistura heterogênea de pequenos RNAs, e seus transcritos precursores podem se acumular nas células, resultando na indução de efeitos não específicos sequência-independentes, e levando à toxicidade in vivo. miRNAs são contemplados para uso nesse relatório descritivo. Arcabouços do tipo miRNA, ou miRNAs artificiais (amiRNAs), podem ser usados para reduzir efeitos não específicos sequência-independentes (Watanabe e cols. (2016) RNA Biology 13 (1): 25-33; Fellmann e cols. (2013) Cell Reports 5: 1.704-1.713). Além de perfis de segurança aprimorados, amiRNAs são mais facilmente transcritos por Pol II do que shRNAs, permitindo a expressão regulada e célula- específica. miRNAs artificiais (amiRNAs), em comparação com shRNAs, podem silenciar eficazmente e, em alguns casos, mais potentemente, a expressão gênica, sem a geração de grandes quantidades de RNAs inibidores (McBride e cols. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (15): 5.868-5.873). Esse efeito foi determinado como sendo causado pelo processamento mais eficaz de siRNA por precursores de pré-miRNA do que por transcritos de shRNA (Boden e cols. (2004) Nucl. Acid Res. 32 (3): 1.154-1.158).
[00415] Foi demonstrado que miRNAs regulam vários processos celulares, incluindo proliferação e sobrevida celulares, sinalização intracelular, metabolismo celular e diferenciação celular. Em 1993, o primeiro miRNA foi identificado em C. elegans (Lee e cols. (1993) Cell 75: 843- 854), e mais tarde, miRNAs de mamíferos foram identificados (Pasquinelli e cols. (2000) Nature 408 (6808): 86-89). Mais do que 17.000 miRNAs em 142 espécies foram identificadas, com mais do que 1.900 miRNAs identificados em humanos, muitos deles foram associados a diversas doenças, incluindo câncer (por exemplo, miR-15 e miR-16 em B-CLL, miR-125b, miR-145, miR-21, miR-155 e miR-210 no câncer de mama, miR-155 e let- 7a no câncer de pulmão, miR-145 no câncer gástrico, miR-29b no câncer do fígado); infecções virais (por exemplo, miR-122 e miR-155 na infecção por HCV, mir-28, miR-125b, miR-150, miR-223 e miR-382 na infecção por HIV-1, miR-21 e miR-223 na infecção pelo vírus influenza); doenças relacionadas ao sistema imune (por exemplo, miR-145, miR-34a, miR-155 e miR- 326 na esclerose múltipla, miR-146a no lúpus eritematoso sistêmico, miR-144, miR-146a, miR-150, miR-182, miR-103 e miR-107 no diabetes tipo II, miR-200a, miR-200b, miR-429, miR-122, miR-451 e miR-27 em doença hepática gordurosa não alcoólica, miR-29c, miR-34a, miR-155 e miR-200b na esteatohepatite não alcoólica); e doenças neurodegenerativas (por exemplo, miR-30b, miR-30c, miR-26a, miR-133b, miR-184* e let-7 na doença de Parkinson, miR-29b-1, miR-29a e miR-9 na doença de Alzheimer) (Li e Kowdley (2012) Genomics
Proteomics Bioinformatics 10: 246-253).
[00416] Estudos demonstraram que miRNAs endógenos específicos estão supra-regulados ou infra-regulados em certos cânceres. Por exemplo, miR-140 está infra-regulado no câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC) e foi verificado que sua superexpressão suprime PD-L1 (Xie e cols. (2018) Cell Physiol. Biochem. 46:654-663); miR-197 está infra-regulado no NSCLC resistente quimioterapia à base de platina, resultando em quimiorresistência, tumorigenicidade e metástase (Fujita e cols. (2015) Mol. Ther. 23 (4): 717- 727); e foi constatado que vários miRNAs estão infra- regulados em células de câncer para permitir a expressão de PD-L1, incluindo miR-200, miR-34a e miR-138 (Yee e cols. (2017) J. Biol. Chem. 292 (50): 20.683-20.693). Vários miRNAs também estão supra-regulados, por exemplo, miR-21, miR-17 e miR-221, no câncer de pulmão (Xie e cols. (2018) Cell Physiol. Biochem. 46: 654-663).
[00417] MicroRNA-103 (miR-103) foi identificado como o microRNA mais supra-regulado em células endoteliais como resultado de estresse genotóxico e dano do DNA após radiação. Foi verificado que miR-103 levava à infra-regulação dos genes TREX1, TREX2 e FANCF, e a diminuição na expressão de TREX1 foi identificada como o mecanismo principal pelo qual miR- 103 medeia morte celular e suprime angiogênese (Wilson e cols. (2016) Nature Communications 7: 13.597). Como a perda de TREX1 resulta no acúmulo de dsDNA e ssDNA, reparo de DNA defeituoso e liberação de citocinas, a expressão de miR-103 supra-regula significantemente as quimiocinas pró- inflamatórias IP-10, RANTES, MIG, e as citocinas IL-15, IL- 12 e IFN-γ, e essa supra-regulação era causada por uma diminuição mediada por miR-103 nos níveis de TREX1. Estudos também revelaram um aumento significante nos receptores coestimulantes CD40 e CD160, e uma diminuição nos números de macrófagos e neutrófilos PD-L1+ nos tumores 4T1. A regulação de TREX1 por miR-103 é, portanto, um modulador potente do TME imune. Outros miRNAs que visam TREX1 incluem miR-107 (Patente U.S. Nº 9.242.000), miR-27a e miR-148b (Patente U.S. Nº 8.580.757). miRNA-103 pode ser usado nos plasmídeos nesse relatório descritivo para inibir TREX1.
[00418] miRNAs artificiais (amiRNAs) podem ser liberados às células e usados para silenciar genes-alvo por criação de um vetor de siRNA ou shRNA baseado em microRNA (shRNAmir). O arcabouço de miR-30a é frequentemente usado em mamíferos, e aproximadamente 200-300 bases do transcrito de miRNA primário são incluídas no vetor, com o miRNA hairpin colocado no centro do fragmento, e a sequência da haste do miRNA natural sendo substituída com a sequência que codifica siRNA/shRNA de interesse. Promotores virais, por exemplo, promotores de CMV, MSCV e TLR; promotores celulares, por exemplo, EIF-1a; promotores quiméricos induzíveis, por exemplo, tet-CMV; e promotores tecido-específicos, podem ser usados (Chang e cols. (2013) Cold Spring Harb Protoc; doi:
10.1101/pdb.prot075853). Outros miRNAs que podem ser usados incluem mir-16-2 (Watanabe e cols. (2016) RNA Biology 13 (1): 25-33), miR-155 (Chung e cols. (2006) Nuc. Acids Res. 34: e53), miR17-92 (Liu e cols. (2008) Nuc. Acids Res. 36 (9): 2.811-2.824), miRNA miR-15a, miR-16, miR-19b, miR-20, miR-23a, miR-27b, miR-29a, miR-30b, miR-30c, miR-104, miR- 132s, miR-181, miR-191, miR-223 (Patente U.S. Nº 8.426.675), e Let-7 (WO 2009/006450; WO 2015/032165).
[00419] shRNAmirs são limitados pela baixa eficácia de sequências de shRNA previstas computacionalmente, particularmente quando expressos sob condições de cópia baixa ou única.
[00420] miRNAs artificiais de terceira geração, por exemplo, miR-E (baseado em miR-30a) e miR-3G (baseado em miR-16-2) foram desenvolvidos, e foi verificado que exibem silenciamento gênico mais forte em vetores de expressão à base tanto de Pol II quanto de Pol III, em comparação com shRNAmirs, em função do processamento aumentado e acúmulo de RNAs-guias definidos precisamente. miR-E, que foi desenvolvido pela descoberta do motivo CNNC conservado que aumenta o processamento de miRNA dentro das sequências que flanqueiam a haste 3p, é diferente de miR-30a endógeno em três aspectos: a haste de miR-E não possui saliência e possui a guia desejada na fita oposta; dois pares de bases conservados que flanqueiam a alça foram mutados de CU/GG para UA/UA; e sítios de restrição XhoI/EcoRI foram introduzidos nas regiões flanqueadoras para clonagem de shRNA (Fellmann e cols. (2013) Cell Reports 5: 1.704-1.713). Foi constatado que miR-E é mais potente do que miR-30a, mas o processamento simétrico das fitas tanto 3p quanto 5p de miR-30a não favorece a liberação fita-guia em relação à liberação da fita passageira, que não é ótima. Adicionalmente, a clonagem em miR-E usando óligos mais longos do que 100 nt é cara e demorada (Watanabe e cols. (2016) RNA Biology 13 (1): 25-33).
[00421] O amiRNA designado miR-16-2 (veja, por exemplo, Watanabe e cols. (2016) RNA Biology 13 (1): 25-33, veja a FIG. 1) é uma alternativa ao arcabouço de amiRNA de terceira geração (3G); ele é expresso em vários tecidos, é naturalmente assimétrico (a fita madura é derivada exclusivamente do braço 5p ou 3p da haste), e seus segmentos de haste e alça são pequenos e rígidos, simplificando a clonagem do vetor. miR-3G é gerado por clonagem do fragmento de aproximadamente 175 bp que contém a haste e alça de miR- 16-2, e os 35 bps que flanqueiam um dos lados da haste, no vetor. miR-3G inclui a modificação adicional de miR-16-2 por introdução de sítios de clonagem, por exemplo, MluI e EcoRI, nas sequências que flanqueiam os braços 5p e 3p, respectivamente, e com pareamento de base total com a haste- guia (anti-senso) e passageira (senso), com a exceção de um erro de pareamento na posição 1 em relação à fita-guia.
Os sítios de restrição permitem a geração de novas construções de direcionamento por meio de oligonucleotídeos de DNA duplexados de 88-mer sem comprometer a estrutura secundária prevista do hairpin de miR-16-2 e elementos flanqueadores.
Adicionalmente, um dos dois motivos CNNC e o motivo GHG (intensificadores do processamento de pequeno RNA) são modificados na sequência flanqueadora 3p de miR-16-2. siRNAs que visam o(s) gene(s) de interesse são então permutados com os primeiros 21 nucleotídeos da sequência-guia 5p e sequências passageiras 3p maduras.
Estudos determinaram que miR-E e miR-3G eram igualmente potentes. miR-3G fornece um sistema de RNAi atraente, em função do tamanho menor de seu cassete de expressão (aproximadamente 175 nucleotídeos vs. aproximadamente 375 para miR-E), e do método de clonagem em etapa única simplificado e com custo compensador para sua produção.
Como com shRNAs, bactérias podem ser usadas como vetores para a liberação in vivo de microRNAs.
Por exemplo,
foi demonstrado que S. typhimurium atenuada pode ser usada como um vetor para a liberação oral de plasmídeos que expressam miRNA contra CCL22 em camundongos com inflamação. A infra-regulação de a expressão do gene de CCL22 por esse método foi bem-sucedida tanto in vitro quanto in vivo em modelos em camundongo de dermatite atópica (Yoon e cols. (2012) DNA and Cell Biology 31 (3): 289-296). Para os objetivos desse relatório descritivo, um miRNA 16-2 pode ser usado para produzir miRNAs para serem usados no lugar do shRNA. As sequências para o shRNA podem ser usadas para o design de miRNAs.
[00422] DNA que codifica RNAi para ruptura e/ou inibição e/ou direcionamento de quaisquer genes-alvo selecionados, por exemplo, qualquer ponto de verificação imune descrito nesse relatório descritivo ou conhecido por aqueles habilitados na técnica, é inserido em um arcabouço de microRNA, por exemplo, o arcabouço de microRNA apresentado no ID. DE SEQ. N°: 249, e abaixo. Qualquer arcabouço de microRNA adequado conhecido por aqueles habilitados na técnica pode ser usado; geralmente, esses arcabouços se baseiam em um microRNA de ocorrência natural e são modificados para expressão do RNAi. Exemplares desses arcabouços é um com base no miR-16-2 (ID. DE SEQ. N°: 248). A sequência do arcabouço de microRNA modificado é:
[00423] 5'-
CCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCGTAGT
GAAATATATATTAAACTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCG TCGAC-3' (ID. DE SEQ. N°: 249)
[00424] em que os N's representam sequências de nucleotídeos anti-senso e senso complementares, geralmente com comprimento de 18-26, por exemplo, 19-24, 19-22, 19-20, pares de bases, que visam o gene a ser silenciado, e são inseridas antes e depois da alça de microRNA. RNAs, por exemplo, ARI-205 (ID. DE SEQ. N°: 214) e ARI-206 (ID. DE SEQ. N°: 215), são construções exemplares com base no arcabouço de microRNA do ID. DE SEQ. N°: 249, que codificam sequências com homologia de 21 e 22 pares de bases, respectivamente. ARI-207 (ID. DE SEQ. N°: 216) e ARI-208 (ID. DE SEQ. N°: 217) são construções exemplares com base no arcabouço de microRNA do ID. DE SEQ. N°: 249, que codificam sequências com homologia de 19 pares de bases. Outro exemplo, é a construção designada ARI-201, que é a construção de microRNA ARI-205, em que os N’s são substituídos com uma sequência de nucleotídeos que visa PD-L1 de camundongo. A construção designada ARI-202 representa a construção de microRNA ARI-206, em que os N’s são substituídos com sequências que visam PD-L1 de camundongo. Aqueles habilitados na técnica podem prontamente construir microRNAs para inclusão em plasmídeos como descritos e exemplificados nesse relatório descritivo usando o arcabouço de miR-16-2, ou outros arcabouços adequados conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
4. Origem de replicação e número de cópias de plasmídeo
[00425] Plasmídeos são moléculas de DNA de fita dupla circulares extracromossômicas que se replicam autonomamente que são mantidas dentro de bactérias por meio de uma origem de replicação. O número de cópia influencia a estabilidade do plasmídeo. Um número de cópias alto geralmente resulta em maior estabilidade do plasmídeo quando o particionamento aleatório ocorre na divisão celular. Um número alto de plasmídeos geralmente diminui a taxa de crescimento, possivelmente permitindo, dessa forma, que as células com poucos plasmídeos dominem a cultura, na medida em que crescem mais rápido. A origem de replicação também determina a compatibilidade do plasmídeo: sua habilidade para replicar em conjunto com outro plasmídeo dentro da mesma célula bacteriana.
[00426] Plasmídeos que utilizam o mesmo sistema de replicação não podem coexistir na mesma célula bacteriana. Diz-se que pertencem ao mesmo grupo de compatibilidade. A introdução de uma nova origem, na forma de um segundo plasmídeo do mesmo grupo de compatibilidade, mimetiza o resultado da replicação do plasmídeo residente. Dessa forma, qualquer replicação posterior é evitada até depois de dois plasmídeos terem sido segregados para células diferentes para criar o número de cópias correto pré-replicação. Número de Nº do ID. DE Origem de replicação cópia SEQ. pMB1 15-20 254 p15A 10-12 255 pSC101 —5 256 pBR322 15-20 243 ColE1 15-20 257 pPS10 15-20 258 RK2 —5 259 R6K (origem alfa) 15-20 260 R6K (origem beta) 15-20 261 R6K (origem gama) 15-20 262 P1 (oriR) Baixo 263 R1 Baixo 264 pWSK Baixo 265 ColE2 10-15 266 pUC (pMB1) 500-700 267 F1 300-500 268
[00427] Diversas origens de replicação bacterianas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A origem pode ser selecionada para obter um número de cópias desejado. Origens de replicação contêm sequências que são reconhecidas como sítios de iniciação de replicação do plasmídeo por meio de DNA polimerases DNA-dependentes (Solar e cols. (1998) Microbiology and Molecular Biology Reviews 62 (2): 434-464). Diferentes origens de replicação fornecem níveis de cópias de plasmídeo variáveis dentro de cada célula e podem variar de 1 a centenas de cópias por célula. Origens de replicação bacterianas de plasmídeo comumente usadas incluem, sem limitação, origens derivadas de pMB1, que possuem derivados de cópia muito alta, origens de ColE1, p15A, pSC101, pBR322, e outras, que possuem números de cópias baixos. Essas origens são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A origem pUC19 resulta em número de cópias de 500-700 cópias por célula. A origem pBR322 possui um número conhecido de cópias de 15-20. Essas origens só variam por um único par de bases. O número de cópias da origem ColE1 é 15-20, e derivados como, por exemplo, pBluescript, possuem números de cópia que variam de 300-500. A origem p15A, que está em pACYC184, por exemplo, resulta em um número de cópias de aproximadamente 10. As origens pSC101 conferem um número de cópias de aproximadamente 5. Other vetores com número de cópias baixo dos quais as origens podem ser obtidas incluem, por exemplo, pWSK29, pWKS30, pWKS129 e pWKS130 (veja, Wang e cols. (1991) Gene 100: 195-199). Números de cópias de médios a baixos são menos do que 150, ou menos do que 100. Números de cópias baixos são menos do que 20, 25 ou 30. Aqueles habilitados na técnica podem identificar plasmídeos com números de cópias baixos ou altos. Por exemplo, para determinar experimentalmente se o número de cópias é alto ou baixo realiza-se um miniprep. Um plasmídeo de cópia alta deve gerar entre 3-5 µg de DNA por 1 ml de cultura em LB; um plasmídeo de cópia baixa irá gerar entre 0,2-1,1 μg de DNA por ml de cultura em LB.
[00428] Sequências de plasmídeos bacterianos, incluindo identificação e sequência da origem de replicação, são bem conhecidas (veja, por exemplo, snapgene.com/resources/plasmid files/basic cloning vectors/pBR322/).
[00429] Plasmídeos de cópia alta são selecionados para expressão de proteínas heterólogas in vitro, pois a dosagem do gene está aumentada em relação aos genes cromossômicos e rendimentos específicos maiores de proteína e, para bactérias terapêuticas, dosagens terapêuticas maiores de produtos codificados terapêuticos. Foi demonstrado nesse relatório descritivo, no entanto, que, para liberação de plasmídeos que codificam interferência de RNA (RNAi), por exemplo, por S. typhimurium, como descritos nesse relatório descritivo, embora fosse parecer que um plasmídeo com cópia alta seria idealmente adequado, terapeuticamente, um número de cópias menor é mais eficaz.
[00430] A exigência de que as bactérias mantenham os plasmídeos com cópia alta pode ser um problema se a molécula expressa é tóxica para o organismo. As necessidades metabólicas para a manutenção desses plasmídeos podem ter um custo de adequação replicativa in vivo. O número de cópias de plasmídeo ótimo para liberação de RNAs interferentes pode depender do mecanismo de atenuação da cepa modificada geneticamente para liberar o plasmídeo. Se necessário, aqueles habilitados na técnica, em vista da revelação desse relatório descritivo, podem selecionar um número de cópias apropriado para uma espécie e cepa de bactérias imunoestimulantes particulares. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que um número de cópias baixo pode ser vantajoso.
5. Motivos CpG e ilhas CpG
[00431] Motivos de citidina-fosfato-guanosina (CpG) não metilados são prevalentes no DNA genômico bacteriano, mas não no de vertebrados. DNA patogênico e oligodesoxinucleotídeos sintéticos (ODN) que contêm motivos CpG ativam mecanismos de defesa do hospedeiro, levando a respostas imunes inatas e adquiridas. Os motivos CpG não metilados contêm um dinucleotídeo CG não metilado central mais regiões flanqueadoras. Em humanos, quatro classes distintas de ODN CpG foram identificadas com base em diferenças na estrutura e natureza da resposta imune que induzem. ODNs tipo-K (também referidos como tipo-B) contêm de 1 a 5 motivos CpG, tipicamente em um arcabouço de fosforotioato. ODNs tipo-D (também referidos como tipo-A) possuem um arcabouço misto fosfodiéster/fosforotioato e possuem um único motivo CpG, flanqueado por sequências palindrômicas que permitem a formação de uma estrutura haste- alça, bem como motivos poli-G nas extremidades 3’ e 5’. ODNs tipo-C possuem um arcabouço de fosforotioato e contêm múltiplos motivos CpG palindrômicos que podem formar estruturas ou dímeros haste-alça. ODN CpG Classe-P possuem um arcabouço de fosforotioato e contêm múltiplos motivos CpG com palíndromos duplos que podem formar hairpins em suas extremidades 3’ ricas em GC (Scheiermann e Klinman (2014) Vaccine 32 (48): 6.377-6.389). Para os objetivos desse relatório descritivo, os CpGs são codificados no DNA de plasmídeo; eles podem ser introduzidos como um motivo, ou em um gene.
[00432] Receptores Toll-like (TLRs) são receptores cruciais para a percepção de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e ativação de imunidade inata contra patógenos (Akira e cols. (2001) Nat. Immunol. 2 (8): 675- 680). TLR9 reconhece motivos CpG hipometilados em DNA de procariotas que não ocorrem naturalmente em DNA de mamíferos (McKelvey e cols. (2011) J. Autoimmunity 36: 76-86). O reconhecimento de motivos CpG mediante fagocitose de patógenos em endossomos em subconjuntos de células imunes induz sinalização de interferon do tipo I IRF7-dependente e ativa imunidade inata e adaptativa.
[00433] Bactérias imunoestimulantes, por exemplo, espécies de Salmonella, por exemplo, S. typhimurium, cepas que carregam plasmídeos contendo ilhas CpG, são fornecidas nesse relatório descritivo. Essas bactérias podem ativar TLR9 e induzir imunidade inata e adaptativa mediada por IFN do tipo I. Como exemplificado nesse relatório descritivo, plasmídeos bacterianos que contêm ilhas CpG hipometiladas podem provocar respostas imunes inatas e adaptativas antitumorais que, em combinação com RNAi codificado no plasmídeo, por exemplo, RNAi que visa pontos de verificação imune, por exemplo, o shRNA ou miRNA que visa TREX1 e, dessa forma, ativação da via de STING mediada por TREX1, podem ter atividade antitumoral sinérgica ou aumentada. Por exemplo, o gene asd (ID. DE SEQ. N°: 48) codifica uma frequência elevada de ilhas CpG hipometiladas. Motivos CpG podem ser incluídos em combinação com qualquer RNAi descrito ou aparente a partir da descrição nesse relatório descritivo nas bactérias imunoestimulantes e, dessa forma, aumentar ou aprimorar as respostas imunes antitumorais em um indivíduo tratado.
[00434] CpGs imunoestimulantes podem ser incluídos nos plasmídeos, por inclusão de um ácido nucleico, tipicamente de um gene bacteriano, que codifica um produto gênico, e também por adição de um ácido nucleico que codifica motivos CpG. Os plasmídeos nesse relatório descritivo podem incluir motivos CpG. Motivos CpG exemplares são conhecidos (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 8.232.259, 8.426.375 e
8.241.844). Esses incluem, por exemplo, oligonucleotídeos imunoestimulantes sintéticos, entre 10 e 100, 10 e 20, 10 e 30, 10 e 40, 10 e 50, 10 e 75 pares de bases de comprimento, com a fórmula geral: (CpG)n, em que n é o número de repetições.
[00435] Geralmente, pelo menos uma ou duas repetições são usadas; bases não-CG podem estar entremeadas.
[00436] Aqueles habilitados na técnica estão muito familiarizados com o uso geral de motivos CpG para indução de uma resposta imune por modulação de TLRs, particularmente TLR9.
6. Componentes de manutenção/seleção de plasmídeo
[00437] A manutenção de plasmídeos em ambientes laboratoriais é normalmente assegurada pela inclusão de um gene de resistência antibiótica no plasmídeo e uso de antibióticos nos meios de crescimento. Como descrito acima, o uso de um mutante de deleção de asd complementado com um gene asd funcional no plasmídeo permite a seleção do plasmídeo in vitro sem o uso de antibióticos, e permite a manutenção do plasmídeo in vivo. O sistema de complementação do gene asd permite essa seleção/manutenção (Galan e cols. (1990) Gene 28: 29-35). O uso do sistema de complementação do gene asd para manter plasmídeos no microambiente tumoral aumenta a potência de S. typhimurium e de outras cepas bacterianas imunoestimulantes, modificadas geneticamente para liberar plasmídeos que codificam produtos terapêuticos, por exemplo, proteínas imunoestimulantes, anticorpos, fragmentos de anticorpo ou RNAs interferentes.
7. Promotores de RNA Polimerase
[00438] Os plasmídeos fornecidos nesse relatório descritivo são projetados para codificar RNAs interferentes que visam pontos de verificação imune e outros alvos, como descrito acima. O cassete de expressão de RNA contém um promotor para transcrição em células humanas como, por exemplo, um promotor H1 ou um promotor U6, ou um promotor de CMV. U6 e H1 são promotores de RNA polimerase III (RNAP III), que são para a produção e processamento de pequenos RNAs. O promotor de CMV é reconhecido por RNA polimerase II, e é mais passível de expressão de trechos longos de RNA do que RNAP III. O promotor precede o RNA interferente, por exemplo, um shRNA, siRNA ou miRNA, como descrito acima.
[00439] Em células eucarióticas, DNA é transcrito por três tipos de RNA polimerases; RNA Pol I, II e III. RNA Pol
I transcreve somente genes de RNA ribossômico (rRNA), RNA Pol II transcreve DNA em mRNA e pequenos RNAs nucleares (snRNAs), e RNA Pol III transcreve DNA em 5S rRNA ribossômico (tipo I), RNA de transferência (tRNA) (tipo II) e outros pequenos RNAs como, por exemplo, snRNAs U6 (tipo III). shRNAs são tipicamente transcritos in vivo sob o controle de promotores de RNA Pol III de tipo III eucariótico, por exemplo, o promotor U6 humano, que transcreve o componente de snRNA U6 do spliceossomo, e o promotor H1 humano, que transcreve o componente de RNA de RNase P. Os promotores U6 e H1 são mais adequados do que outros promotores Pol III ou Pol II, pois são estruturalmente simples, com um sítio de início da transcrição bem definido, e dirigem naturalmente a transcrição de pequenos RNAs. Promotores U6 e H1 não carregam as sequências necessárias para transcrição de qualquer coisa a jusante do sítio de início da transcrição (Makinen e cols. (2006) J. Gene Med. 8: 433-441). Dessa forma, eles são os promotores mais óbvios para uso na expressão de shRNA.
[00440] O uso de outros promotores como, por exemplo, promotores de tRNA tipo II pol III, embora bem-sucedido na expressão de shRNAs, resulta em transcritos de dsRNA mais longos, que podem induzir uma resposta de interferon. Promotores de RNA pol II, por exemplo, o promotor de citomegalovírus humano (CMV), também podem ser usados (Patentes U.S. Nos 8.202.846 e 8.383.599), mas são mais frequentemente utilizados para expressão de trechos longos de RNA. Estudos demonstraram que a adição do intensificador do promotor de CMV perto do promotor U6 pode aumentar sua atividade, aumentando a síntese de shRNA e aumentando o silenciamento gênico (Xia e cols. (2003) Nucleic Acids Res. 31 (17): e100; Nie e cols. (2010) Genomics Proteomics Bioinformatics 8 (3): 170-179). Promotores de RNA pol II são tipicamente evitados na transcrição de shRNA em função da geração de DNA citoplasmático, que leva a uma resposta pró- inflamatória de interferon. Nesse caso, uma resposta de interferon mediada por DNA citoplasmático em células tumorais infectadas por S. typhimurium possui benefício antitumoral, especialmente no contexto de inibição de TREX1, como fornecido nesse relatório descritivo. promotores procarióticos, incluindo promotores T7, pBAD e pepT, podem ser utilizados quando a transcrição ocorre em uma célula bacteriana (Guo e cols. (2011) Gene Therapy 18: 95-105; Publicações de Patente U.S. Nos 2012/0009153, 2016/0369282; Publicações de Pedido Internacional Nos WO 2015/032165, WO 2016/025582).
[00441] Promotores de RNA pol III geralmente são usados para expressão constitutiva de shRNA.
[00442] Para expressão induzível, promotores de RNA pol II são usados. Exemplos incluem o promotor pBAD, que é induzível por L-arabinose; promotores induzíveis por tetraciclina como, por exemplo, TRE-tight, IPT, THE-CMV, Tet-ON e Tet-OFF; LTR retroviral; promotores induzíveis por IPTG como, por exemplo, Lad, promotores responsivos a Lac- O; promotores do sistema LoxP-stop-LoxP (Patente U.S. Nº
8.426.675; Publicação de Patente Internacional Nº WO 2016/025582); e pepT, que é um promotor induzido por hipóxia (Yu e cols. (2012) Scientific Reports 2: 436). Esses promotores são bem conhecidos. Exemplares desses promotores são os promotores U6 humano (ID. DE SEQ. N°: 73) e H1 humano
(ID. DE SEQ. N°: 74). ID. DE Nome Sequência SEQ. Nº U6 humano as ggtcgggcag gaagagggcc 721 Promotor de tatttcccat gattccttca tatttgcata RNA pol III tacgatacaa ggctgttaga gagataatta 781 gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 841 73 aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 901 ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaact 961 ag H1 humano atatttgca tgtcgctatg Promotor de 721 tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat 74 RNA pol III gtctttggat ttgggaatct tataagttct 781 gtatgagacc actccctagg
[00443] Promotores tecido-específicos incluem promotor TRP2 para células de melanoma e melanócitos; promotor MMTV ou promotor WAP para mama e células de câncer de mama, promotor de Vilina ou promotor FABP para células intestinais, promotor RIP para células beta pancreáticas, promotor de ceratina para queratinócitos, promotor de Probasina para epitélio prostático, promotor de Nestina ou promotor GFAP para células/cânceres do sistema nervoso central (SNC), promotor de Tirosina Hidroxilase S100 ou promotor de neurofilamento para neurônios, promotor de proteína secretora de célula clara para câncer de pulmão, e promotor de miosina-alfa em células cardíacas (Patente U.S. Nº
8.426.675).
8. Sequências que visam DNA nuclear
[00444] Sequências de direcionamento nuclear de DNA (DTS), tais como as DTS de SV40, medeiam a translocalização de sequências de DNA por meio do complexo de poro nuclear. O mecanismo desse transporte é relatado como sendo dependente da ligação de proteínas de ligação ao DNA que contêm sequências de localização nuclear. A inclusão de uma DTS em um plasmídeo para aumentar transporte e expressão nucleares foi demonstrada (Dean, D.A. e cols. (1999) Exp. Cell Res. 253 (2): 713-722), e foi usada para aumentar a expressão gênica por plasmídeos liberados por S. typhimurium (Kong e cols. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109 (47): 19.414-
19.419).
[00445] Terminadores transcricionais Rho-independentes ou de classe I, por exemplo, o terminador T1 do gene rrnB de E. coli, contêm sequências de DNA que formam estruturas secundárias que causam dissociação do complexo de alongamento da transcrição. Terminadores transcricionais devem ser incluídos no plasmídeo a fim de evitar a expressão de RNAs interferentes pelo maquinário transcricional de S. typhimurium. Isso assegura que a expressão do RNA interferente codificado, por exemplo, shRNA, microRNA e siRNA, seja confinada ao maquinário transcricional da célula hospedeira.
[00446] Os plasmídeos usados para transformação de Salmonella, por exemplo, S. typhimurium, como uma terapia contra o câncer descrita nesse relatório descritivo, contêm todos ou alguns dos seguintes atributos: 1) uma ilha CpG, 2) uma origem de replicação bacteriana, 3) um marcador selecionável do gene asd para manutenção do plasmídeo, 4) um ou mais cassetes de expressão de RNA interferente humano, 5) sequência de direcionamento nuclear de DNA, e 6) terminadores transcricionais.
9. CRISPR
[00447] Uma bactéria imunoestimulante, que codifica um cassete CRISPR, pode ser usada para infectar células imunes, mielóides ou hematopoiéticas humanas a fim de fazer o knockout sítio-específico de um gene–alvo de interesse. A cepa usada pode ser asct e pode conter um plasmídeo que não possui o cassete asd complementar e contém um cassete kan. A fim de crescer a cepa in vitro em meios líquidos, DAP é adicionado para complementar a deficiência genética de asct. Após infecção de células humanas, a cepa não pode mais replicar, e o plasmídeo codificado pelo cassete CRISPR é liberado. A cepa também pode ser hilA- ou desprovida de uma ou mais partes de SPI-1, ou desprovida de flagelina, ou qualquer combinação destas, o que reduz ou evita a piroptose (morte celular mediada por reação inflamatória) de células fagocíticas. G. BACTÉRIAS IMUNOESTIMULANTES DIRECIONADAS AO TUMOR CONTÊM RNAI CONTRA GENES-ALVO IMUNES EXEMPLARES PARA
ESTIMULAR IMUNIDADE ANTITUMORAL
[00448] RNAi contra qualquer alvo imune pode ser codificado nos plasmídeos. Esses incluem, sem limitação, qualquer um discutido na revelação nesse relatório descritivo, e qualquer um conhecido por aqueles habilitados na técnica. A discussão seguinte descreve alvos exemplares. Os plasmídeos podem conter qualquer RNAi contra esses alvos incluindo, sem limitação, shRNA, siRNA e microRNA.
1. TREX1
[00449] Em certas modalidades fornecidas nesse relatório descritivo, as bactérias imunoestimulantes codificam RNA inibidor, por exemplo, shRNA, que inibe ou rompe ou suprime a expressão de TREX1. O produto enzimático codificado por TREX1, localizado a montante de cGAS, é um mediador da via de interferon do tipo I. TREX1 codifica a 3’-DNA exonuclease principal em células de mamíferos (também denominada DNase III). Proteínas TREX1 humanas são cataliticamente eficientes como exonucleases bacterianas (Mazur e Perrino (2001) J. Biol. Chem. 276:17.022-17.029). Bactérias imunoestimulantes que inibem a expressão de TREX1 por processos diferentes de silenciamento de RNA também são contempladas nesse relatório descritivo. Para as bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo, por exemplo, aquelas que expressam shRNA contra TREX1, a perda de atividade de TREX1 e ativação subsequente de ruptura vascular induzida por cGAS/STING aumentam a colonização tumoral de S. typhimurium. O gene TREX1 codifica uma proteína que tem 314 aminoácidos de comprimento (Mazur e cols. (2001) J. Biol. Chem 276:
17.022-17.029), existe como um homodímero, e não possui atividade de endonuclease. TREX1 está entre várias proteínas envolvidas no reparo de DNA que é danificado por estresse genotóxico exógeno, incluindo irradiação UV e compostos que danificam DNA. TREX1 pode funcionar como uma exonuclease de edição para DNA pol 0 por excisão de nucleotídeos com erro de pareamento da extremidade 3’ (Mazur e cols. (2001) J. Biol. Chem 276: 17.022-17.029). ssDNA é degradado 3-4 vezes mais eficientemente do que dsDNA (Lindahl e cols. (2009) Biochem. Soc. Trans. 37 (Parte 3), 535-538). Mutações nos resíduos D18 e D200, frequentemente associadas com doenças autoimunes, impedem que a enzima TREX1 degradem dsDNA e reduzem sua habilidade para degradar ssDNA. A enzima TREX1 se transloca do retículo endoplasmático para o núcleo após dano do DNA, indicando seu envolvimento na replicação de DNA danificado. A ativação e supra-regulação de TREX1 por promotor foram observadas como resultado de exposição ao UVC em fibroblastos de camundongo, e células de camundongo com TREX1 null demonstraram hipersensibilidade à luz UVC (Tomicic e cols. (2013) Bloch. Biophys. Acta 1.833: 1.832-
1.843).
[00450] Mutações que resultam em perda de TREX1 foram identificadas em pacientes com uma doença hereditária rara, síndrome de Aicardi-Goutieres (AGS), que possui sobreposição fenotípica com as doenças autoimunes lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e lúpus pérnio (Aicardi e Goutieres, (2000) Neuropediatrics 31(3): 113). Mutações em TREX1 também estão associadas com vasculopatia retiniana com leucodistrofia cerebral. Doenças autoimunes mediadas por TREX1 estão associadas à incapacidade da célula para evitar autoimunidade por meio da degradação de ssDNA e dsDNA que se acumulam no citoplasma. Camundongos TREX1 null sofrem de miocardite inflamatória, resultando em insuficiência circulatória, que é causada por produção crônica de citocina (Morita e cols. (2004) Mol. Cell. Biol. 24 (15): 6.719-6.727; Yang e cols. (2007) Cell 131 (5): 873-886; Tomicic e cols. (2013) Bioch. Biophys. Acta 1.833 (8): 1.832-1.843). Dessa forma, a deficiência de TREX1 induz imunidade inata após o acúmulo citoplasmático de DNA, resultando em uma resposta inflamatória (Wang e cols. (2009) DNA Repair (Amst) 8: 1.179-
1.189). Foi constatado que a fonte do DNA que se acumula no citosol de células deficientes em TREX1 é, em parte, derivada de retroelementos endógenos que escapam do núcleo danificado, na medida em que TREX1 sabidamente metaboliza DNA transcrito de forma reversa (RT) (Stetson e cols. (2008) Cell 134 (4): 587-598). Na infecção pelo HIV, o RT DNA de HIV se acumula no citosol de células T e macrófagos infectados, e normalmente desencadeariam ativação de cGAS/STING de imunidade antiviral. TREX1 digere esse DNA viral e permite escape imune do HIV (Yan e cols. (2010) Nat. Immunol. 11 (11): 1.005-1.013). Dessa forma, TREX1 atua como um regulador negativo de STING, e pode ser explorado para evadir a detecção por vários retrovírus, por exemplo, vírus da leucemia murídea (MLV), vírus da imunodeficiência símia (SIV), e muitos outros (Hasan e cols. (2014) Front. Microbiol. 5: 193).
[00451] Como STING, TREX1 é expresso na maioria dos tipos de células de mamíferos, com os produtores cruciais de citocinas em camundongos TREX1 null se originando de macrófagos e células dendríticas (Ahn e cols. (2014) J. Immunol. 193 (9): 4.634-4.642). Dados indicam que TREX1 é responsável por degradação de auto-DNA que pode extravasar de um núcleo danificado para dentro do citosol, onde ele de outro modo se ligaria e ativaria cGAS e levaria à autoimunidade (Barber (2015) Nat. Rev. Immunol. 15 (12): 760-770). Dando suporte a isso, camundongos TREX1 null e células deficientes em TREX1 que também não possuem cGAS estão completamente protegidos da ativação de interferon do tipo I e autoimunidade letal (Ablasser e cols. (2014) J. Immunol. 192 (12): 5.993-5.997; Gray e cols. (2015) J. Immunol. 195 (5): 1.939-1.943). Em uma alça de feedback negativo, interferon do tipo I e IFNγ tipo II can também induzem TREX1 e, dessa forma, TREX1 serve para limitar ativação autoimune aberrante (Tomicic e cols. (2013) Bloch. Biophys. Acta 1.833: 1.832-1.843).
[00452] Foi verificado que linfócitos derivados de um paciente com síndrome de Aicardi-Goutieres, contendo TREX1 mutado, inibem a angiogênese e o crescimento de células de neuroblastoma, o efeito sendo aumentado pela presença de IFN-α (Pulliero e cols. (2012) Oncology Reports 27: 1.689-
1.694). També foi demonstrado que o uso de microRNA-103 inibe a expressão de TREX1, rompendo o reparo de DNA e angiogênese, e resultando em crescimento tumoral diminuído in vivo (veja, Publicação de Patente U.S. Nº 2014/0127284, Cheresh e cols.).
[00453] TREX1 é um regulador negativo da ativação e função pró-inflamatória de macrófagos. Foi verificado que macrófagos TREX1 null exibem produção aumentada de TNF-α e IFN-α, níveis maiores de CD86, e apresentação aumentada de antígeno às células T, bem como depuração apoptótica de células T prejudicada (Pereira-Lopes e cols. (2013) J. Immunol. 191: 6.128-6.135). A incapacidade para digerir adequadamente DNA apoptótico em macrófagos TREX1 null gera quantidades elevadas de DNA citosólico aberrante, que se liga a cGAS e ativa a via de STING para produzir níveis maiores de interferon do tipo I (Ahn e cols. (2014) J. Immunol. 193: 4.634-4.642). Nem todos os tipos de células são sensíveis aos efeitos imunoestimulantes do knockdown de Trex 1, no entanto. Em um estudo de tipos de células individuais, foi verificado que células dendríticas, macrófagos, fibroblastos e queratinócitos produzem IFN do tipo I mediante knockdown de TREX1, enquanto células B,
cardiomiócitos, neurônios e astrócitos não produzem (Peschke e cols. (2016) J. Immunol. 197: 2.157-2.166). Dessa forma, a inibição da função de TREX1 em células fagocíticas que engolfaram S. typhimurium aumentaria sua atividade pró- inflamatória, ao mesmo tempo dirigindo o acúmulo de DNA citosólico de células tumorais fagocitadas que podem então ativar a via de cGAS/STING. O uso de microRNA-103 inibiu a expressão de TREX1, rompendo o reparo de DNA e angiogênese, e resultando em crescimento tumoral diminuído in vivo (veja, Publicação U.S. Nº 2014/0127284, Cheresh e cols.).
[00454] Estudos verificaram que a expressão de cGAS e/ou STING está inibida em mais de um terço dos cânceres cólon- retais, enquanto a expressão de STING é perdida em muitos melanomas primários e metastáticos e cânceres HPV+. A sinalização de STING permanece intacta em todas as APCs residentes no tumor que mostra continuamente o ambiente antigênico do TME, incluindo DCs CD103/CD8a+ da linhagem Batf3 que apresentam de forma cruzada antígenos tumorais às células T CD8+, e essas APCs também fagocitarão prontamente S. typhimurium ou serão ativadas por IFN do tipo I de macrófagos circundantes que fagocitaram S. typhimurium contendo knockdown do gene TREX1.
[00455] A inativação de TREX1 aumenta uma resposta imune por permitir que o acúmulo citosólico de dsDNA se ligue à enzima GMP-AMP cíclico (cGAMP) sintase (cGAS), um sensor de DNA citosólico que desencadeia a produção de interferons do tipo I e outras citocinas por meio da ativação da via de sinalização de STING (Sun e cols. (2013) Science 339 (6121): 786-791; Wu e cols. (2013) Science 339 (6121): 826-830). Foi demonstrado que a ativação da via de STING induz imunidade antitumoral inata e adaptativa potente (Corrales e cols. (2015) Cell Reports 11: 1.018-1.030).
[00456] Dessa forma, modalidades das cepas bacterianas imunoestimulantes, como fornecidas nesse relatório descritivo, são administradas para inibir TREX1 em APCs residentes no tumor e induzir ativação de cGAS/STING ativando, dessa forma, essas DCs para apresentar de forma cruzada antígenos do tumor do hospedeiro às células T CD8+ e induzir regressão do tumor local e sistêmica e imunidade antitumoral durável (Corrales e cols. (2015) Cell Reports 11: 1.018-1.030; Zitvogel et cd.(2015) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 16: 393-405).
[00457] As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo expressam RNAi contra TREX1, e a perda de TREX1 e ativação subsequente de ruptura vascular induzida por cGAS/STING aumentam a colonização tumoral de S. typhimurium.
2. PD-L1
[00458] A proteína de morte celular programada 1 (PD-1) é um receptor inibidor imune que está envolvido na regulação negativa de respostas imunes. Seu ligante cognato, ligante de morte programada 1 (PD-L1), é expresso em APCs e, mediante ligação à PD-1 em células T, leva à perda de célula T CD8+ função efetora, induzindo tolerância de células T. A expressão de PD-L1 está frequentemente associada com agressividade do tumor e sobrevida reduzida em certos cânceres humanos (Gao e cols. (2009) Clin. Cancer Res. 15 (3): 971-979).
[00459] Anticorpos projetados para bloquear pontos de verificação imune, por exemplo, anti-PD-1 (por exemplo,
pembrolizumab, nivolumab) e anticorpos anti-PD-L1 (por exemplo, atezolizumab, avelumab, durvalumab), tiveram sucesso durável na prevenção de anergia de célula T e quebra da tolerância imune. Somente uma fração de pacientes tratados exibe benefício clínico, e aqueles que o fazem frequentemente apresentam toxicidades relacionadas à autoimunidade (Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373 (16): 1.490-1.492; Topalian e cols. (2012) N. Engl. J. Med. 366 (26): 2.443-54). Além da aquisição de toxicidade, a terapia de PD-1/PD-L1 frequentemente leva à resistência, e o uso concomitante de anticorpos anti-CTLA-4 (por exemplo, ipilimumab) mostrou sucesso limitado em experimentos clínicos com toxicidade aditiva significante. Para limitar a toxicidade e aumentar a potência do bloqueio de PD-L1, bactérias imunoestimulantes com um shRNA para PD-L1, como fornecidas nesse relatório descritivo, apresentarão sinergia com ativação por TLR de células imunes tanto para ativar quanto para potencializar a imunidade antitumoral.
3. VISTA Outros pontos de verificação não redundantes na ativação imune podem apresentar sinergia com PD-1/PD-L1 e CTLA-4, por exemplo, supressor da ativação de célula T de imunoglobulina (Ig) de domínio-V (VISTA). VISTA é expresso primariamente em APCs, particularmente em células mielóides infiltrantes no tumor e células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSC) e, em um grau menor, em células T reguladoras (Tregs CD4+ Foxp3+) (Wang e cols. (2011) J. Exp. Med. 208 (3): 577-592). Similar à PD-L1, a supra-regulação de VISTA suprime diretamente a proliferação e função citotóxica de células T (Liu e cols. (2015) PNAS 112 (21):
6.682-6.687). Foi demonstrado que o direcionamento por anticorpo monoclonal de VISTA remodela o microambiente tumoral em camundongos, aumentando a ativação de APC e intensificando a imunidade antitumoral (LeMercier e cols. (2014) Cancer Res. 74 (7): 1.933-1.944). Clinicamente, foi demonstrado que a expressão de VISTA está supra-regulada em macrófagos residentes no tumor após tratamento com terapia anti-CTLA-4 no câncer de próstata, demonstrando regulação compensatória de pontos de verificação imune (Gao e cols. (2017) Nat. Med. 23 (5): 551-555). Supostamente a maioria da expressão de VISTA está localizada no compartimento intracelular de células mielóides, e não na superfície, o que pode limitar a eficácia da abordagem de anticorpo monoclonal (Deng e cols. (2016) J. Immunother. Cancer 4: 86). A habilidade para inibir VISTA de dentro da APC usando bactérias de direcionamento a tumores contendo shRNA a VISTA, como fornecidas nesse relatório descritivo, inibirá mais eficientemente e completamente a função de supressão de células T de VISTA, levando à imunidade antitumoral e regressão do tumor mediada por ativação de célula T.
4. SIRPa
[00460] Um mecanismo pelo qual as células tumorais escapam da remoção é evitar sua fagocitose por células imunes inatas. A fagocitose é inibida por expressão de superfície de CD47, que é amplamente expressa em células hematopoiéticas e não hematopoiéticas (Liu e cols. (2015) PLoS ONE 10 (9): e0137345). Mediante ligação de CD47 ao seu receptor, a proteína reguladora de sinal alfa (SIRPa), um sinal inibidor para fagocitose, é iniciada. SIRPa é expressa abundantemente em células fagocíticas, incluindo macrófagos, granulócitos e DCs. Dessa forma, a interação proteína-proteína entre CD47 e SIRPa representa outra classe de pontos de verificação imune únicos para APCs, e macrófagos residentes no tumor, em particular. A eficácia de CD47 na prevenção de fagocitose é evidenciada pelo fato de que ela está frequentemente supra- regulada em uma ampla variedade de tumores, o que permite que eles evitem ser fagocitados por APCs no microambiente tumoral (Liu e cols. (2015) Nat. Med. 21 (10): 1.209-1.215). Vários métodos para bloquear a interação CD47/SIRPa foram examinados, incluindo o desenvolvimento de anticorpos anti- CD47 ou anti-SIRPa ou fragmentos de anticorpo, o uso de pequenos peptídeos que que se ligam a uma das proteínas, ou o knockdown da expressão de CD47 (Publicações de Patentes U.S. Nos 2013/0142786, 2014/0242095; Publicação de Patente Internacional Nº WO 2015/191861; McCracken e cols. (2015) Clin. Cancer Res. 21 (16): 3.597-3.601). Para essa finalidade, vários anticorpos monoclonais que visam diretamente SIRPa estão em desenvolvimento clínico, isoladamente ou em combinação com anticorpos de direcionamento a tumores (por exemplo, Rituximab, Daratumumab, Alemtuzumab, Cetuximab) que podem aumentar a fagocitose de células tumorais opsonizadas por anticorpo, em um processo conhecido como fagocitose celular anticorpo- dependente (ADCP) (McCracken e cols. (2015) Clin. Cancer Res. 21 (16): 3.597-3.601; Yanagita e cols. (2017) KY Insight 2 (1) :e89140).
[00461] A interação CD47/SIRPa também serve para preservar a longevidade de células sanguíneas vermelhas evitando-se sua eliminação fagocítica (Murata e cols. (2014) J. Biochem. 155 (6): 335-344). Dessa forma, terapias administradas sistemicamente como, por exemplo, anticorpos anti-CD47 que rompem amplamente essa interação resultaram em toxicidades relacionadas à anemia (Huang e cols. (2017) J. Thorac. Dis. 9(2): E168-E174). Terapias sistêmicas à base de SIRPa também trazem o risco de eventos adversos, por exemplo, dano de órgãos por criação de macrófagos sistêmicos hiperfagocíticos autofágicos. O uso de bactérias imunoestimulantes de direcionamento a tumores que contêm um shRNA a SIRPa, como fornecidas nesse relatório descritivo, localizará a ruptura CD47/SIRPa ao microambiente tumoral e eliminará esses eventos adversos. Além disso, a inibição de SIRPa no contexto de ativação bacteriana por vias de sinalização pró-inflamatórias mediada por TLR ativará potentemente esses macrófagos para se tornarem hiperfagocíticos contra células tumorais vizinhas (Bian e cols. (2016) PNAS. 113(37): E5434—E5443).
5. β-catenina
[00462] As vias do ponto de verificação imune exemplificam as múltiplas camadas de regulação que existem para evitar hiperativação imune e autoimunidade, e as dificuldades na subversão dessas vias para promover imunidade antitumoral. Um mecanismo pelo qual tumores se desenvolveram para serem refratários às terapias do ponto de verificação é por meio de sua ausência de infiltração de células T e de células dendríticas (DC), descrita como sem células T inflamadas, ou “tumores frios” (Sharma e cols. (2017) Cell 9; 168 (4): 707-723). Foram identificados vários mecanismos intrínsecos do tumor que levem à exclusão de células T antitumorais e resistência à imunoterapia. No melanoma, em particular, o perfilamento molecular de tumores refratários à terapia do ponto de verificação revelou uma assinatura de β-catenina elevada e seus genes-alvo a jusante, que se correlaciona com a ausência de linfócitos infiltrantes no tumor (Gajewski e cols. (2011) Curr. Opin. Immunol. 23 (2): 286-292).
[00463] CTNNB1 é um oncogene que codifica β-catenina, e pode induzir a expressão dos genes c-Myc e ciclina D1, resultando em proliferação tumoral. Mutações em CTNNB1 estão associadas com certos cânceres. O silenciamento gênico de CTNNB1/β-catenina com o uso de vetores de shRNA de S. typhimurium pode ser usado no tratamento de câncer (Guo e cols. (2011) Gene Therapy 18: 95-105; Publicações de Patentes U.S. Nos 2012/0009153, 2016/0369282; Publicação de Patente Internacional Nº WO 2015/032165). Por exemplo, o silenciamento do shRNA de CTNNB1, usando S. typhimurium cepa SL7207 como um vetor de liberação, reduziu a proliferação e crescimento tumorais em camundongos com xenoenxerto SW480, quando comparadas com células de controle, e expressão reduzida de c-Myc e ciclina D1 (Guo e cols. (2011) Gene Therapy 18: 95-105). O silenciamento de CTNNB1 para o tratamento de hepatoblastoma também pode ser obtido com o uso de miRNA, com ou sem produtos terapêuticos de anticorpo contra os pontos de verificação imune PD-1 e PD-L1 (Publicação de Pedido Internacional Nº WO 2017/005773). O uso de siRNA ou shRNA que visa CTNNB1, liberado por meio de vetores alternativos como, por exemplo, lipossomos, para o tratamento de cânceres relacionados a CTNNB1, incluindo adenocarcinomas e carcinomas de célula escamosa, também pode ser efetuado (Publicações de Patentes U.S. Nos 2009/0111762, 2012/0294929).
[00464] A sinalização elevada de β-catenina inibe diretamente que a quimiocina CCL4 recrute CD103/CD8a+ DCs da linhagem Batf3 evitando, dessa forma, que elas sensibilizassem células T CD8+ antígeno tumoral-específicas (Spranger e cols. (2015) Nature 523 (7559): 231-235). β- catenina é o principal mediador a jusante da via de sinalização WNT, uma via crucial do desenvolvimento embrionário que também é crítica para regeneração tecidual do adulto, homeostasia e hematopoiese (Clevers e cols. (2012) Cell 149 (6): 1.192-1.205). A sinalização excessiva de WNT/β- catenina foi implicada em diversos cânceres (Tai e cols. (2015) Oncologist 20 (10): 1.189-1.198). Consequentemente, foram buscadas várias estratégias para visar a sinalização de WNT/β-catenina, mas o sucesso foi dificultado pela ausência de especificidade para o microambiente tumoral, resultando em toxicidades fora-do-alvo para células-tronco intestinais, turnover ósseo e hematopoiese (Kahn (2014) Nat. Rev. Drug Dis. 13 (7): 513-532). As bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo superam esses problemas.
[00465] Por exemplo, uma vantagem da utilização de bactérias imunoestimulantes com shRNA para β-catenina como fornecidas nesse relatório descritivo é o aumento da infiltração mediada por quimiocina de DCs sensibilizantes de células T e a conversão de um tumor frio em um microambiente tumoral inflamado com células T, sem as toxicidades sistêmicas das modalidades terapêuticas existentes. Além disso, a ativação bacteriana de vias de sinalização imune inata por TLR apresenta sinergia com a inibição de β-catenina para promover ainda mais a ativação imune e imunidade antitumoral.
6. TGF-β O fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) é uma citocina pleiotrópica com diversos papéis na embriogênese, cicatrização de feridas, angiogênese e regulação imune. Ele existe em três isoformas em células de mamíferos, TGF-01, TGF-02 e TGF-03; TGF-01 é o mais predominante em células imunes (Esebanmen e cols. (2017) Immunol. Res. 65: 987-994). O papel do TGF-β como um imunossupressor é possivelmente sua função mais dominante. Sua ativação de uma forma latente no microambiente tumoral, em particular, possui efeitos imunossupressores profundos sobre DCs e sua habilidade para tolerizar células T antígeno- específicas. TGF-β também pode converter diretamente células T CD4+ Th1 em Tregs imunossupressoras, promovendo ainda mais tolerância do tumor (Travis e cols. (2014) Annu. Rev. Immunol. 32: 51-82). Com base em suas funções imunossupressoras tumor-específicas, e independente de suas propriedades conhecidas de promoção do crescimento e metástase de células de câncer, a inibição de TGF-β é um alvo para a terapia contra o câncer. A sinalização elevada de TGF-β foi demonstrada em vários tipos de tumores humanos, incluindo CRC, HCC, PDAC e NSCLC (Colak e cols. (2017) Trends in Cancer 3: 1). A inibição sistêmica de TGF-β pode levar a toxicidades autoimunes inaceitáveis, e sua inibição deve estar localizada ao microambiente tumoral. Dessa forma, as bactérias imunoestimulantes de direcionamento a tumores com RNAi, por exemplo, shRNA, a TGF-β, fornecidas nesse relatório descritivo, ou um shRNA para TGF-I3RII, quebra a tolerância imune do tumor e estimula a imunidade antitumoral.
7. VEGF
[00466] A angiogênese, ou o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, é uma etapa essencial para que qualquer microambiente tumoral se estabeleça. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) é o mitógeno crítico para proliferação endotelial e angiogênese, e a inibição de VEGF no microambiente tumoral diminui acentuadamente a vascularidade do tumor privando, dessa forma, o tumor de seu suprimento sanguíneo (Kim e cols. (1993) Nature 362 (6423): 841-4). Essa pesquisa inicial levou ao desenvolvimento do anticorpo monoclonal inibidor de VEGF, bevacizumab (Avastin; Genentech), o qual, em combinação com quimioterapia, se tornou o tratamento-padrão para CRC metastático.
[00467] A administração sistêmica de bevacizumab também demonstrou toxicidades significantes, incluindo várias fatalidades em um experimento de Fase II de NSCLC, amplamente em decorrência de hemorragias. Dessa forma, vários antiangiogênicos da geração seguinte foram avaliados, por exemplo, o anticorpo anti-receptor de VEGF 2 ramucirumab (Cyramza, Imclone) e o inibidor antiangiogênico de tirosina quinase axitinib (Inlyta, Pfizer), embora nenhum tenha sido capaz de superar a toxicidade sistêmica ou aumentar acentuadamente a sobrevida livre de progressão (Alshangiti e cols. (2018) Curr. Oncol. 25 (Supl. 1): 545-558). Embora a atividade antitumoral da terapia com anti-VEGF tenha sido promissora, a toxicidade sistêmica é claramente limitante. Dessa forma, uma terapia que vise somente o microambiente tumoral, por exemplo, bactérias imunoestimulantes de direcionamento a tumores com shRNA para VEGF, fornecidas nesse relatório descritivo, libera terapia antiangiogênica local e evita, ao mesmo tempo, toxicidade sistêmica. Essa modalidade terapêutica possui a vantagem adicional de ser recolhida em células mielóides, que predominantemente produzem VEGF no microambiente tumoral, o que terá um impacto máximo sobre a progressão do tumor (Osterberg e cols. (2016) Neuro-Oncology. 18(7):939-949).
8. Alvos do ponto de verificação imune exemplares adicionais
[00468] Alvos do ponto de verificação exemplares para os quais RNAi, por exemplo, microRNA e shRNA, pode ser preparado ou são exemplificados nesse relatório descritivo, incluem, sem limitação: Alvo do ponto de verificação CTLA-4 PD-L1 (B7-H1) PD-L2 PD-1, PD-2 IDO1 IDO2 Alvo do ponto de verificação SIRP alfa, CD47 VISTA (B7-H5)
LIGHT
HVEM CD28 LAG3, TIM3, TIGIT Galectina-9 CEACAM1, CD155, CD112, CD226, CD244 (2B4), B7-H2, B7-H3, CD137,
ICOS, GITR, B7-H4. B7-H6 CD137, CD27, CD40/CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD137(4- 1BB), CD200, CD272 (BTLA), CD160 receptor A2a, receptor A2b, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B OX40/0X-40L, BTLA, ICOS, HLA-G, ILT-2/4 KIR, GITR, TIM1, TIM4 Outros alvos exemplares incluem, sem limitação: Alvo CTNNB1 (beta-catenina) STAT3 BCL-2 MDR1 Arginase 1 iNOS TGF-I3 IL-10 pGE2
VEGF
KSP HER2
KRAS TAK1 PLK1
K-Ras (Ras) H. PRODUÇÃO, COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[00469] Também são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para a fabricação de composições e formulações farmacêuticas que contêm qualquer uma das bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo e excipientes ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas podem ser usadas no tratamento de doenças, por exemplo, doenças ou condições hiperproliferativas, por exemplo, um tumor ou câncer. As bactérias imunoestimulantes podem ser administradas em uma terapia de agente único, ou podem ser administradas em uma terapia combinada com um agente ou tratamento adicional. As composições podem ser formuladas para administração em dosagem única ou para administração em múltiplas dosagens. Os agentes podem ser formulados para administração direta. As composições também podem ser fornecidas como uma formulação líquida ou seca.
1. Fabricação a. Fabricação de banco de células
[00470] Como o ingrediente ativo do imunoterapêutico descrito nesse relatório descritivo é composto por bactérias autorreplicantes modificadas geneticamente, a composição selecionada será expandida em uma série de bancos de células que serão mantidos para armazenamento de longo prazo e como o material de partida para a fabricação da substância farmacológica. Bancos de células são produzidos sob as boas práticas de fabricação (cGMP) atuais em uma instalação de fabricação apropriada pelo “Code of Federal Regulations” (CFR) 21 parte 211 ou outra autoridade regulatória relevante.
Como o agente ativo do imunoterapêutico é uma bactéria viva, os produtos descritos nesse relatório descritivo são, por definição, não estéreis e não podem ser terminalmente esterilizados. Deve-se ter cuidado para assegurar que procedimentos assépticos sejam usados por todo o processo de fabricação para evitar contaminação. Dessa forma, todas as matérias-primas e soluções devem ser esterilizadas antes do uso no processo de fabricação.
[00471] Um banco de células principal (MCB) é produzido por isolamento serial sequencial de colônia única da cepa bacteriana selecionada para assegurar que nenhum contaminante esteja presente no material de partida. Um vaso de cultura estéril contendo meios estéreis (podem ser meios complexos, por exemplo, LB ou MSBB, ou meios definidos, por exemplo, M9 suplementado com nutrientes apropriados) é inoculado com uma única colônia bacteriana bem isolada e é permitido que as bactérias repliquem, por exemplo, por incubação a 37°C com agitação. As bactérias são então preparadas para criopreservação por suspensão em uma solução contendo um agente ou agentes crioprotetores.
[00472] Exemplos de agentes crioprotetores incluem: proteínas como, por exemplo, albumina sérica humana ou bovina, gelatina, imunoglobulinas; carboidratos, incluindo monossacarídeos (galactose, D-manose, sorbose etc.) e seus derivados não redutores (por exemplo, metilglicosídeo), dissacarídeos (trehalose, sacarose etc.), ciclodextrinas, e polissacarídeos (rafinose, maltodextrinas, dextranas etc.); aminoácidos (glutamato, glicina, alanina, arginina ou histidina, triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina etc.); metilaminas como, por exemplo, betaína; polióis como,
por exemplo, álcoois de açúcar triídricos ou superiores, por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propileno glicol; polietileno glicol; tensoativos, por exemplo, plurônico; ou compostos de organo- enxofre como, por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO), e combinações destes. Soluções de criopreservação podem incluir um ou mais agentes crioprotetores em uma solução que também podem conter sais (por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e/ou agentes de tamponamento como, por exemplo, fosfato de sódio, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES), e outros agentes de tamponamento desse tipo conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00473] A suspensão das bactérias em solução criopreservação pode ser obtida por adição de um agente ou agentes crioprotetores concentrados ao material da cultura para obter uma concentração final que preserve a viabilidade das bactérias durante o processo de congelamento e descongelamento (por exemplo, concentração final de glicerol de 0,5% a 20%), ou por colheita das bactérias (por exemplo, por centrifugação) e suspensão em uma solução crioconservante que contém a concentração final apropriada de agente (ou agentes) crioprotetor. A suspensão de bactérias em solução de criopreservação é então preenchida em frascos estéreis apropriados (de plástico ou vidro) com um sistema de fechamento do recipiente que é capaz de manter a integridade do fechamento sob condições congeladas (por exemplo, tampas de butila e lacres crimpados). Os frascos do banco de células principal são então congelados (lentamente por meio de um congelador com taxa controlada, ou rapidamente por meio de colocação direta em um congelador). O MCB é então armazenado congelado em uma temperatura que preserve a viabilidade de longo prazo (por exemplo, a ou abaixo de - 60°C). O material congelado do banco de células principal é cuidadosamente caracterizado para assegurar a identidade, pureza e atividade por regulação pelas autorizadas apropriadas.
[00474] Bancos de células de trabalho (WCBs) são produzidos basicamente da mesma forma que o banco de células principal, mas o material de partida é derivado do MCB. O material do MCB pode ser transferido diretamente para dentro de um vaso de fermentação contendo meios estéreis e expandido como acima. As bactérias são então suspensas em uma solução de criopreservação, preenchidas em recipientes, lacradas e congeladas em ou abaixo de -20°C. Múltiplos WCBs podem ser produzidos a partir do material do MCB, e o material do WCB pode ser usado para fazer bancos de células adicionais (por exemplo, um banco de células de trabalho do fabricante (MWCB). WCBs são armazenados congelados e caracterizados para assegurar a identidade, pureza e atividade. O material do WCB é tipicamente o material de partida usado na produção da substância farmacológica de produtos biológicos como, por exemplo, bactérias modificadas geneticamente. b. Fabricação de substância farmacológica
[00475] A substância farmacológica é fabricada com o uso de processos assépticos sob cGMP como descrito acima. O material do banco de células de trabalho é tipicamente usado como o material de partida para a fabricação da substância farmacológica sob cGMP, no entanto, outros bancos de células podem ser usados (por exemplo, MCB ou MWCB). O processamento asséptico é usado para a produção de todas as terapias celulares, incluindo terapias à base de células bacterianas. As bactérias do banco de células são expandidas por fermentação, e isso pode ser obtido por produção de uma pré- cultura (por exemplo, em um frasco em agitação) ou por inoculação direta de um fermentador. A fermentação é obtida em um biorreator ou frasco estéril que pode ser descartável de uso único ou reutilizável. As bactérias são colhidas por concentração (por exemplo, por centrifugação, centrifugação contínua ou filtração por fluxo tangencial). As bactérias concentradas são purificadas dos componentes dos meios e metabólitos bacterianos por troca dos meios com tampão (por exemplo, por diafiltração). O produto farmacológico a granel é formulado e conservado como um intermediário (por exemplo, por congelamento ou secagem) ou é processado diretamente em um produto farmacológico. A substância farmacológica é testada para identidade, força, pureza, potência e qualidade. c. Fabricação de produto farmacológico
[00476] O produto farmacológico é definido como a formulação final da substância ativa contida em seu recipiente final. O produto farmacológico é fabricado usando processos assépticos sob cGMP. O produto farmacológico é produzido a partir da substância farmacológica. A substância farmacológica é descongelada ou reconstituída, se necessário, e depois formulada na força-alvo apropriada. Como o componente ativo do produto farmacológico consiste em bactérias vivas modificadas geneticamente, a força é determinada pelo número de CFUs contidas dentro da suspensão.
O produto a granel é diluído em uma formulação final apropriada para armazenamento e uso como descrito abaixo. Os recipientes são preenchidos, e lacrados com um sistema de fechamento do recipiente e o produto farmacológico é rotulado. O produto farmacológico é armazenado em uma temperatura apropriada para preservar a estabilidade e é testada para a identidade, força, pureza, potência e qualidade e liberado para uso humano caso atenda aos critérios de aceitação especificados.
2. Composições
[00477] Composições farmaceuticamente aceitáveis são preparadas tendo em vista aprovações por uma agência reguladora ou outra agência preparada de acordo com farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais e em humanos. As composições podem ser preparadas como soluções, suspensões, pós ou formulações de liberação sustentada. Tipicamente, os compostos são formulados em composições farmacêuticas com o uso de metodologias e procedimentos bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, “Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms”, Quartaª Edição, 1985, 126). A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
[00478] As composições podem ser formuladas para administração por qualquer via conhecida por aqueles habilitados na técnica incluindo administração intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, por injeção intraperitoneal, subcutânea, intratumoral, epidural, nasal, oral, vaginal, retal, tópica, local, óptica, por inalação, bucal (por exemplo, sublingual) e transdérmica ou qualquer via. Outros modos de administração também são contemplados. A administração pode ser local, tópica ou sistêmica, dependendo do local de tratamento. A administração local a uma área que necessita de tratamento pode ser obtida, por exemplo, sem limitação, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo para feridas após cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante. As composições também podem ser administradas com outros agentes biologicamente ativos, sequencialmente, intermitentemente ou na mesma composição. A administração também pode incluir sistemas de liberação controlada incluindo formulações de liberação controlada e dispositivos de liberação controlada, por exemplo, por meio de uma bomba.
[00479] A via mais adequada em qualquer caso específico depende de diversos fatores, por exemplo, da natureza da doença, do progresso da doença, da gravidade da doença e da composição particular que é usada. As composições farmacêuticas podem ser formuladas em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração. Em particular, as composições podem ser formuladas em quaisquer preparações farmacêuticas adequadas para administração sistêmica, local, intraperitoneal, oral ou direta. Por exemplo, as composições podem ser formuladas para administração por via subcutânea, por via intramuscular, por via intratumoral, por via intravenosa ou por via intradérmica. Podem ser empregados métodos de administração para diminuir a exposição do agente ativo a processos de degradação, por exemplo, intervenção imunológica por meio de respostas antigênicas e imunogênicas. Exemplos desses métodos incluem administração local no local de tratamento ou infusão contínua.
[00480] As bactérias imunoestimulantes podem ser formuladas em preparações farmacêuticas adequadas como, por exemplo, soluções, suspensões, comprimidos, comprimidos dispersíveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações ou elixires de liberação sustentada, para administrações orais, bem como preparação em emplastro transdérmico e inaladores de pó seco.
[00481] Tipicamente, os compostos são formulados em composições farmacêuticas com o uso de metodologias e procedimentos bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, “Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms”, Quarta Edição, 1985, 126). Geralmente, o modo de formulação depende da via de administração. As composições podem ser formuladas em forma seca (liofilizada ou outras formas de vitrificação) ou líquida. Quando as composições são fornecidas em forma seca, elas podem ser reconstituídas imediatamente antes do uso por adição de um tampão apropriado, por exemplo, uma solução salina estéril.
3. Formulações a. Líquidos, injetáveis, emulsões
[00482] A formulação geralmente é feita para ser adequada à via de administração.
[00483] A administração parenteral, geralmente caracterizada por injeção ou infusão, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intratumoral, por via intravenosa ou por via intradérmica, é contemplada nesse relatório descritivo. Preparações de bactérias para administração parenteral incluem suspensões prontas para injeção (administração direta) ou suspensões congeladas que são descongeladas antes do uso, produtos solúveis secos, por exemplo, pós liofilizados, prontos para serem combinados com uma solução para ressuspensão imediatamente antes do uso, e emulsões.
[00484] Formulações secas termoestáveis, tais como formulações liofilizadas, podem ser usadas para armazenamento de doses unitárias para uso posterior.
[00485] A preparação farmacêutica pode estar em uma forma líquida congelada, por exemplo, uma suspensão. Se fornecido em forma líquida congelada, o produto farmacológico também pode ser fornecido como uma preparação concentrada para ser descongelada e diluída até uma concentração terapeuticamente eficaz antes do uso.
[00486] As preparações farmacêuticas também podem ser fornecidas em uma forma de dosagem que que não necessita de descongelamento ou diluição para uso. Essas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, como apropriado, por exemplo, agentes de suspensão (por exemplo, sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, ou óleos vegetais fracionados); e conservantes adequados para uso com produtos terapêuticos microbianos. As preparações farmacêuticas podem ser apresentadas em forma seca, por exemplo, liofilizada ou atomizada, para reconstituição com água ou outro veículo adequado estéril antes do uso.
[00487] Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose ou glicerol. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas. Se administradas por via intravenosa, carreadores adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), e outras soluções tamponadas usadas para hidratação intravenosa. Para administração intratumoral, soluções contendo agentes espessantes como, por exemplo, glicose, polietileno glicol, e polipropileno glicol, emulsões oleosas e misturas destes podem ser apropriados para manter a localização do injetado.
[00488] As composições farmacêuticas podem incluir carreadores ou outros excipientes. Por exemplo, as composições farmacêuticas fornecidas nesse relatório descritivo podem conter qualquer um ou mais de um diluente(s), adjuvante(s), antiaderente(s), ligante(s), revestimento(s), enchimento(s), flavorizante(s), corante(s), lubrificante(s), glidante(s), conservante(s), detergente(s) ou sorvente(s) e uma combinação destes, ou veículo com o qual as bactérias terapêuticas modificadas são administradas. Por exemplo, carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsificantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis. Formulações, incluindo preparações líquidas, podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas podem incluir carreadores como, por exemplo, um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual as composições são administradas. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin. Essas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou agente, geralmente em forma purificada ou forma parcialmente purificada, junto com uma quantidade adequada de carreador de modo a fornecer a forma para administração adequada ao paciente. Esses carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, por exemplo, água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de gergelim. Água é um carreador típico.
[00489] Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. As composições podem conter, juntamente com um ingrediente ativo: um diluente como, por exemplo, lactose, sacarose, fosfato dicálcico ou carboximetilcelulose; um lubrificante, por exemplo, estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco; e um ligante como, por exemplo, amido, gomas naturais, como, por exemplo, goma acácia, gelatina, glicose, melaço, polivinilpirrolidina, celuloses e derivados destas, povidona, crospovidonas e outros ligantes desse tipo conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água e etanol. Por exemplo, excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Uma composição, se desejado, também pode conter outras quantidades menores de substâncias auxiliares atóxicas como, por exemplo, agentes umidificantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH, estabilizantes, intensificadores da solubilidade, e outros agentes desse tipo como, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.
[00490] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsificantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção Isotônica de Dextrose, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e Ringer-Lactato. Veículos parenterais não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersantes incluem carboximetilcelulose sódica, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsificantes incluem, por exemplo, polissorbatos, por exemplo, Polissorbato 80 (TWEEN 80). Agentes sequestrantes ou quelantes de íons metálicos, como, por exemplo, EDTA, podem ser incluídos. Carreadores farmacêuticos também incluem polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático para ajuste do pH. Conservantes não antimicrobianos podem ser incluídos.
[00491] As composições farmacêuticas também podem conter outras quantidades menores de substâncias auxiliares atóxicas como, por exemplo, agentes umidificantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH, estabilizantes, intensificadores da solubilidade, e outros agentes desse tipo como, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas. A implantação de um sistema de liberação lenta ou liberação sustentada, de modo que um nível de dosagem constante seja mantido (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 3.710.795), também está contemplada nesse relatório descritivo. A percentagem de composto ativo contida nessas composições parenterais é altamente dependente da sua natureza específica, bem como da atividade do composto e das necessidades do indivíduo. b. Formulações secas termoestáveis
[00492] As bactérias podem ser secas. Formulações secas termoestáveis como, por exemplo, pós liofilizados ou atomizados e vidro vitrificado, podem ser reconstituídas para administração como soluções, emulsões e outras misturas. A formulação seca termoestável pode ser preparada a partir de qualquer uma das formulações líquidas como, por exemplo, das suspensões, descritas acima. As preparações farmacêuticas podem ser apresentadas em forma liofilizada ou vitrificada para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso.
[00493] A formulação termoestável é preparada para administração por reconstituição do composto seco com uma solução estéril. A solução pode conter um excipiente que aumenta a estabilidade ou outro atributo farmacológico da substância ativa ou solução reconstituída, preparada a partir do pó. A formulação termoestável é preparada por dissolução de um excipiente como, por exemplo, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outro agente adequado, em um tampão adequado como, por exemplo, citrato, fosfato de sódio ou potássio ou outro tampão desse tipo conhecido por aqueles habilitados na técnica. A seguir, a substância farmacológica é adicionada à mistura resultante, e agitada até ficar misturada. A mistura resultante é dividida em frascos para secagem. Cada frasco conterá uma dosagem única contendo 1 x 105 a 1 x 1011 CFUs por frasco. Após secagem, o produto frasco é lacrado com um sistema de fechamento do recipiente que evita a entrada de umidade ou contaminantes no frasco lacrado. O produto seco pode ser armazenado sob condições apropriadas, por exemplo, a -20°C, 4°C, ou em temperatura ambiente. A reconstituição dessa formulação seca com água ou uma solução-tampão fornece uma formulação para uso em administração parenteral. A quantidade exata depende da indicação tratada e composto selecionado. Essa quantidade pode ser determinada empiricamente.
4. Composições para outras vias de administração
[00494] Dependendo da condição tratada, outras vias de administração, além da parenteral, por exemplo, aplicação tópica, emplastros transdérmicos, administração oral e retal, também são contempladas nesse relatório descritivo. As suspensões e pós descritos acima podem ser administrados oralmente ou podem ser reconstituídos para administração oral. Formas de dosagem farmacêutica para administração retal são supositórios retais, cápsulas e comprimidos e cápsulas em gel para efeito sistêmico. Supositórios retais incluem corpos sólidos para inserção no reto, que derretem ou amolecem na temperatura corporal liberando um ou mais ingredientes farmacologicamente ou terapeuticamente ativos.
[00495] Substâncias farmaceuticamente aceitáveis em supositórios retais são bases ou veículos e agentes para elevar o ponto de fusão. Exemplos de bases incluem manteiga de cacau (óleo de cacau), glicerina-gelatina, Carbowax (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Combinações das várias bases podem ser usadas. Agentes para elevar o ponto de fusão de supositórios incluem espermaceti e cera. Supositórios retais podem ser preparados pelo método de compressão ou por moldagem. O peso típico de um supositório retal é cerca de 2 a 3 g. Comprimidos e cápsulas para administração retal são fabricados usando a mesma substância farmaceuticamente aceitável e pelos mesmos métodos que para formulações para administração oral. Formulações adequadas para administração retal também podem ser fornecidas como supositórios de dose unitária. Esses podem ser preparados por misturação da substância farmacológica com um ou mais carreadores sólidos convencionais, por exemplo, manteiga de cacau, e depois moldando a mistura resultante.
[00496] Para administração oral, as composições farmacêuticas podem assumir a forma, por exemplo, de comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinil pirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); enchimentos (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica.
[00497] Formulações adequadas para administração bucal (sublingual) incluem, por exemplo, losangos contendo o composto ativo em uma base flavorizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto; e pastilhas contendo o composto em uma base inerte como, por exemplo, gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.
[00498] Misturas tópicas são preparadas como descrito para a administração local e sistêmica. As misturas resultantes podem ser soluções, suspensões, emulsões ou semelhantes, e são formuladas como cremes, géis, pomadas, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, sprays, supositórios, bandagens, emplastros dérmicos ou quaisquer outras formulações adequadas para administração tópica.
[00499] As composições podem ser formuladas como aerossóis para aplicação tópica, por exemplo, por inalação (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.044.126; 4.414.209 e 4.364.923, que descrevem aerossóis para liberação de um esteróide útil para tratamento de doenças pulmonares). Essas formulações para administração ao trato respiratório podem estar na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador,
ou como um pó microfino for insuflação, isoladamente ou em combinação com um carreador inerte como, por exemplo, lactose. Nesse caso, as partículas da formulação tipicamente terão diâmetros de menos do que 50 mícrons, ou menos do que 10 mícrons.
[00500] Os compostos podem ser formulados para aplicação local ou tópica, por exemplo, para aplicação tópica à pele e membranas mucosas, por exemplo, nos olhos, na forma de géis, cremes e loções e para aplicação no olho ou para aplicação intracisterna ou intraespinhal. A administração tópica é contemplada para liberação transdérmica e também para administração aos olhos ou mucosas, ou para terapias por inalação. Soluções nasais do composto ativo isoladamente ou em combinação com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis também podem ser administradas.
[00501] Formulações adequadas para administração transdérmica são fornecidas. Elas também podem ser fornecidas em qualquer formato adequado, por exemplo, emplastros distintos adaptados para permanecer em contato íntimo com a epiderme do receptor por um período de tempo prolongado. Esses emplastros contêm o composto ativo em uma solução aquosa opcionalmente tamponada de, por exemplo, concentração de 0,1 a 0,2 M com relação ao composto ativo. Formulações adequadas para administração transdérmica também podem ser liberadas por iontoforese (veja, por exemplo, Tyle, P., (1986) Pharmaceutical Research 3(6):318-326) e tipicamente assumem a forma de uma solução aquosa opcionalmente tamponada do composto ativo.
[00502] Composições farmacêuticas também podem ser administradas por formulações de liberação controlada e/ou dispositivos de liberação (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 3.536.809; 3.598.123; 3.630.200; 3.845.770;
3.916.899; 4.008.719; 4.769.027; 5.059.595; 5.073.543;
5.120.548; 5.591.767; 5.639.476; 5.674.533 e 5.733.566).
5. Dosagens e administração
[00503] As composições podem ser formuladas como composições farmacêuticas para administração por dosagem única ou dosagem múltipla. As bactérias imunoestimulantes podem ser incluídas em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejados no paciente tratado. Por exemplo, a concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajustada de modo que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente por testagem das bactérias imunoestimulantes em sistemas in vitro e in vivo conhecidos como, por exemplo, por utilização dos ensaios descritos nesse relatório descritivo ou conhecidos na técnica. Por exemplo, podem ser empregadas técnicas clínicas padronizadas. Ensaios in vitro e modelos animais podem ser empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A dose precisa, que pode ser determinada empiricamente, pode depender da idade, peso, área de superfície corporal e da condição do paciente ou animal, as bactérias imunoestimulantes particulares administradas, da via de administração, do tipo de doença a ser tratada e da severidade da doença.
[00504] Dessa forma, subentende-se que a dosagem e duração precisas do tratamento dependem da doença que está sendo tratada e podem ser determinadas empiricamente com o uso de protocolos de testagem conhecidos ou por extrapolação dos dados de testes in vivo ou in vitro. Concentrações e valores de dosagem também podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Subentende-se ainda que, para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e do julgamento professional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de concentração apresentadas nesse relatório descritivo são apenas exemplares e não visam limitar o escopo ou uso de composições e combinações que as contêm. As composições podem ser administradas de hora em hora, diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente ou uma vez. Geralmente, os regimes de dosagem são escolhidos para limitar a toxicidade. Deve ser observado que o médico assistente saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapia para uma dosagem menor em função de toxicidade, ou disfunções da medula óssea, fígado ou rim ou de outro tecido. Inversamente, o médico assistente também saberia como e quando ajustar o tratamento para níveis maiores se a resposta clínica não for adequada (impedindo efeitos colaterais tóxicos).
[00505] As bactérias imunoestimulantes são incluídas na composição em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil. Por exemplo, a quantidade é aquela que obtém um efeito terapêutico no tratamento de uma doença ou condição hiperproliferativa, por exemplo, câncer.
[00506] Compostos farmaceuticamente e terapeuticamente ativos e seus derivados são tipicamente formulados e administrados em formas de dosagem unitárias ou formas de dosagem múltiplas. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada de composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o carreador, veículo ou diluente farmacêutico necessário. Formas de dosagem unitárias incluem, sem limitação, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, suspensões parenterais e soluções ou suspensões orais, e emulsões óleo-em-água que contêm quantidades adequadas dos compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis destes. As formas de dose unitárias podem estar contidas em frascos, ampolas e seringas ou comprimidos ou cápsulas embalados individualmente. As formas de dosagem unitárias podem ser administradas em frações ou múltiplos destas. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitárias idênticas embaladas em um único recipiente para serem administradas em forma de dose unitária segregada. Exemplos de formas de doses múltiplas incluem frascos, garrafas de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de mililitros ou galões. Dessa forma, uma forma de dose múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não são segregadas na embalagem. Geralmente, podem ser preparadas formas de dosagem ou composições que contêm ingrediente ativo na faixa de 0,005% a 100%, com o restante de um carreador atóxico. As composições farmacêuticas podem ser formuladas em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração.
[00507] As preparações parenterais de dose unitária são embaladas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. O volume de solução líquida ou preparação de pó reconstituído, contendo o composto farmaceuticamente ativo, depende da doença a ser tratada e do artigo manufaturado particular escolhido para ser embalado. Todas as preparações para administração parenteral devem ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica.
[00508] Como indicado, as composições fornecidas nesse relatório descritivo podem ser formuladas para qualquer via conhecida por aqueles habilitados na técnica incluindo, sem limitação, administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, injeção intraperitoneal, epidural, vaginal, retal, local, óptica, transdérmica ou qualquer via de administração. Formulações adequadas para essas vias são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. As composições também podem ser administradas com outros agentes biologicamente ativos, sequencialmente, intermitentemente ou na mesma composição.
[00509] As composições farmacêuticas podem ser administradas por formulações de liberação controlada e/ou dispositivos de liberação (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 3.536.809; 3.598.123; 3.630.200; 3.845.770;
3.847.770; 3.916.899; 4.008.719; 4.687.660; 4.769.027;
5.059.595; 5.073.543; 5.120.548; 5.354.556; 5.591.767;
5.639.476; 5.674.533 e 5.733.566). Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar composições selecionadas, e são contemplados para uso nesse relatório descritivo, e essas partículas podem ser feitas facilmente.
6. Embalagem e artigos manufaturados
[00510] Também são fornecidos artigos manufaturados que contêm materiais de embalagem, qualquer composição farmacêutica fornecida nesse relatório descritivo, e um rótulo que indica que as composições devem ser usadas para o tratamento de doenças ou condições como descritas nesse relatório descritivo. Por exemplo, o rótulo pode indicar que o tratamento é para um tumor ou câncer.
[00511] Combinações de bactérias imunoestimulantes descritas nesse relatório descritivo e outro agente terapêutico também podem ser embaladas em um artigo manufaturado. Em um exemplo, o artigo manufaturado contém uma composição farmacêutica que contém a composição de bactérias imunoestimulantes e nenhum agente ou tratamento adicional. Em outros exemplos, o artigo manufaturado ainda inclui outro agente terapêutico, por exemplo, um agente anticâncer diferente. Nesse exemplo, os agentes também podem ser fornecidos juntos ou separadamente, para embalagem como artigos manufaturados.
[00512] Os artigos manufaturados fornecidos nesse relatório descritivo contêm materiais de embalagem. Materiais de embalagem para uso na embalagem produtos farmacêuticos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.323.907,
5.052.558 e 5.033.252, cada uma delas incorporada nesse relatório descritivo em sua totalidade. Exemplos de materiais de embalagem farmacêutica incluem, sem limitação, embalagens em blister, garrafas, tubos, inaladores, bombas, bolsas, frascos, recipientes, seringas, garrafas, e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e modo de administração e tratamento desejados. Exemplares de artigos manufaturados são recipientes que incluem câmara única e recipientes de câmara dupla. Os recipientes incluem, sem limitação, tubos, garrafas e seringas. Os recipientes podem ainda incluir uma agulha para administração intravenosa.
[00513] A escolha da embalagem depende dos agentes, e se essas composições serão embaladas juntas ou separadamente. Em geral, a embalagem é não reativa com as composições nela contidas. Em outros exemplos, alguns dos componentes podem ser embalados como uma mistura. Em outros exemplos, todos componentes são embalados separadamente. Dessa forma, por exemplo, os componentes podem ser embalados como composições separadas que, após misturação imediatamente antes da administração, podem ser administradas diretamente juntas. Alternativamente, os componentes podem ser embalados como composições separadas para administração separadamente.
[00514] Composições selecionadas, incluindo artigos manufaturados destas, também podem ser fornecidas como kits. Kits podem incluir uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo e um item para administração fornecido como um artigo manufaturado. As composições podem estar contidas nesse item para administração ou também podem ser fornecidas separadamente para serem adicionadas posteriormente. O kit, opcionalmente, pode incluir instruções para aplicação incluindo dosagens, regimes de dosagem e instruções para modos de administração. Os kits também podem incluir uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo e um item para diagnóstico. I. MÉTODOS DE TRATAMENTO E USOS
[00515] Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo incluem métodos de administração ou utilização das bactérias imunoestimulantes, para o tratamento de indivíduos que possuem uma doença ou condição cujos sintomas podem ser melhorados ou reduzidos por administração dessas bactérias,
por exemplo, câncer. Em exemplos particulares, a doença ou condição é um tumor ou um câncer.
[00516] Adicionalmente, métodos de terapias combinadas com um ou mais agentes adicionais para tratamento, por exemplo, um agente anticâncer, por exemplo, um vírus oncolítico, um agente imunoterapêutico e/ou um agente anti- hialuronano, por exemplo, uma hialuronidase, também são fornecidos. As bactérias podem ser administradas por qualquer via adequada incluindo, sem limitação, a via parenteral, sistêmica, tópica e local, por exemplo, intratumoral, intravenosa, retal, oral, intramuscular, mucosa e outras vias. Por causa das modificações das bactérias descritas nesse relatório descritivo, problemas associados à administração sistêmica são solucionados. São fornecidas formulações adequadas para cada via de administração. Aqueles habilitados na técnica podem estabelecer regimes e doses adequadas e selecionar vias.
1. Tumores
[00517] As bactérias imunoestimulantes, combinações, usos e métodos fornecidos nesse relatório descritivo são aplicáveis para o tratamento de todos os tipos de tumores, incluindo cânceres, particularmente tumores sólidos, incluindo câncer de pulmão, câncer da bexiga, câncer de pulmão de célula não-pequena, cânceres gástricos, cânceres da cabeça e pescoço, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer renal, câncer de mama, câncer cólon-retal e câncer de próstata. Os métodos também podem ser usados para cânceres hematológicos.
[00518] Tumores e cânceres sujeitos ao tratamento pelos usos e métodos fornecidos nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, aqueles que se originam no sistema imune, sistema esquelético, músculos e coração, mama, pâncreas, trato gastrintestinal, sistema nervoso central e periférico, sistema renal, sistema reprodutivo, sistema respiratório, pele, sistemas de tecido conjuntivo, incluindo articulações, tecidos gordurosos e sistema circulatório, incluindo paredes dos vasos sanguíneos. Exemplos de tumores que podem ser tratados com as bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo incluem carcinomas, gliomas, sarcomas (incluindo lipossarcoma), adenocarcinomas, adenossarcomas e adenomas. Esses tumores podem ocorrer em praticamente todas as partes do corpo incluindo, por exemplo, na mama, coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, ossos, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos, cérvice ou fígado.
[00519] Tumores do sistema esquelético incluem, por exemplo, sarcomas e blastomas como, por exemplo, osteosarcoma, condrossarcoma e condroblastoma. Tumores do músculo e coração incluem tumores de músculos esqueléticos e lisos, por exemplo, leiomiomas (tumores benignos de músculo liso), leiomiossarcomas, rabdomiomas (tumores benignos de músculo esquelético), rabdomiossarcomas e sarcoma cardíaco. Tumores do trato gastrintestinal incluem, por exemplo, tumores da boca, esôfago, estômago, intestino delgado, cólon e tumores cólon-retais, além de tumores de órgãos secretórios gastrintestinais como, por exemplo, das glândulas salivares, fígado, pâncreas e do trato biliar. Tumores do sistema nervoso central incluem tumores do cérebro, retina e medula espinhal, e também podem se originar em tecido conjuntivo associado, ossos, vasos sanguíneos ou tecido nervoso.
[00520] O tratamento de tumores do sistema nervoso periférico também é contemplado. Tumores do sistema nervoso periférico incluem tumores malignos da bainha nervosa periférica. Tumores do sistema renal incluem aqueles dos rins, por exemplo, carcinoma de célula renal, bem como tumores dos ureteres e bexiga. Tumores do sistema reprodutivo incluem tumores do cérvice, útero, ovário, próstata, testículos e glândulas secretórias relacionadas.
[00521] Tumores do sistema imune incluem tanto tumores de origem sanguínea quanto tumores sólidos, incluindo linfomas, por exemplo, tanto de Hodgkin quanto não-Hodgkin. Tumores do sistema respiratório incluem tumores das passagens nasais, brônquios e pulmões. Tumores da mama incluem, por exemplo, carcinoma lobular e ductal. Outros exemplos de tumores que podem ser tratados pelas bactérias imunoestimulantes e métodos fornecidos nesse relatório descritivo incluem sarcoma de Kaposi, neoplasias do SNC, neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas e metástases cerebrais, melanoma, carcinomas e sarcomas gastrintestinais e renais, rabdomiossarcoma, glioblastoma (por exemplo, glioblastoma multiforme) e leiomiossarcoma. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados como fornecidos nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, linfoma, blastoma, tumores neuroendócrinos, mesotelioma, schwanoma, meningioma, melanoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos desses cânceres incluem malignidades hematológicas, por exemplo, linfoma de Hodgkin; linfomas não-Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico/leucemia linfocítica crônica pequena, micose fungóide, linfoma de célula do manto, linfoma folicular, linfoma de célula B grande difuso, linfoma da zona marginal, leucemia de célula pilosa e leucemia linfoplasmocítica), tumores de células precursoras de linfócitos, incluindo leucemia/linfoma linfoblástico agudo de célula B e leucemia/linfoma linfoblástico agudo de célula T, timoma, tumores das células T e NK maduras, incluindo leucemias de célula T periféricas, leucemia de célula T/linfomas de célula T do adulto e leucemia linfocítica granular grande, histiocitose de célula de Langerhans, neoplasias mielóides como, por exemplo, leucemias mielógenas agudas, incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda e leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicas e distúrbios mieloproliferativos crônicos, incluindo leucemia mielógena crônica; tumores do sistema nervoso central como, por exemplo, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma e retinoblastoma; tumores sólidos da cabeça e pescoço (por exemplo, câncer nasofaríngeo, carcinoma da glândula salivar e câncer esofágico), tumores do pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), tumores do sistema digestivo (por exemplo, câncer gástrico ou do estômago incluindo câncer gastrintestinal, câncer do ducto biliar ou trato biliar, câncer do cólon, câncer retal, câncer cólon-retal e carcinoma anal), tumores do sistema reprodutivo (por exemplo, câncer testicular, peniano ou de próstata, câncer uterino, vaginal, vulvar, cervical, ovariano e endometrial), tumores da pele (por exemplo,
melanoma, carcinoma de célula basal, câncer de célula escamosa, ceratose actínica, melanoma cutâneo), tumores do fígado (por exemplo, câncer do fígado, carcinoma hepático, câncer hepatocelular e hepatoma), tumores ósseos (por exemplo, osteoclastoma e cânceres ósseos osteolíticos), tumores de tecidos e órgãos adicionais (por exemplo, câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer do rim ou renal, câncer da tireóide, câncer de mama, câncer do peritônio e sarcoma de Kaposi), tumores do sistema vascular (por exemplo, angiossarcoma e hemangiopericitoma), tumor de Wilms, retinoblastoma, osteosarcoma e sarcoma de Ewing.
2. Administração
[00522] Na prática dos usos e métodos nesse relatório descritivo, as bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo podem ser administradas a um indivíduo, incluindo um indivíduo que possui um tumor ou que possui células neoplásicas, ou um indivíduo a se imunizado. Uma ou mais etapas podem ser realizadas antes, simultaneamente ou depois da administração das bactérias imunoestimulantes ao indivíduo incluindo, sem limitação, diagnóstico do indivíduo com uma condição apropriada para administração das bactérias imunoestimulantes, determinação da imunocompetência do indivíduo, imunização do indivíduo, tratamento do indivíduo com um agente quimioterápico, tratamento do indivíduo com radiação ou tratamento do indivíduo cirurgicamente.
[00523] Para modalidades que incluem a administração das bactérias imunoestimulantes a um indivíduo que apresenta um tumor para fins terapêuticos, o indivíduo tipicamente foi previamente diagnosticado com uma condição neoplásica. Os métodos diagnósticos também podem incluir a determinação do tipo de condição neoplásica, determinação do estágio das condições neoplásicas, determinação do tamanho de um ou mais tumores no indivíduo, determinação da presença ou ausência de células metastáticas ou neoplásicas nos linfonodos do indivíduo, ou determinação da presença de metástases do indivíduo.
[00524] Algumas modalidades dos métodos terapêuticos para administração das bactérias imunoestimulantes a um indivíduo podem incluir uma etapa de determinação do tamanho do tumor primário ou do estágio da doença neoplásica, e se o tamanho do tumor primário é igual ou acima de um volume limiar, ou se o estágio da doença neoplásica está em ou acima de um estágio limiar, uma bactéria imunoestimulante é administrada ao indivíduo. Em uma modalidade similar, se o tamanho do tumor primário está abaixo de um volume limiar, ou se o estágio da doença neoplásica está em ou abaixo de um estágio limiar, a bactéria imunoestimulante não é ainda administrada ao indivíduo; esses métodos podem incluir o monitoramento do indivíduo até que o tamanho do tumor ou estágio da doença neoplásica alcance uma quantidade limiar, e depois a administração da bactéria imunoestimulante ao indivíduo. Tamanhos limiares podem variar de acordo com vários fatores, incluindo a taxa de crescimento do tumor, a habilidade da bactéria imunoestimulante para infectar um tumor e a imunocompetência do indivíduo. Geralmente o tamanho limiar será um tamanho suficiente para que uma bactéria imunoestimulante se acumule e replique no tumor ou perto dele, sem ser completamente removida pelo sistema imune do hospedeiro, e tipicamente também será um tamanho suficiente para sustentar uma infecção bacteriana por um tempo suficientemente longo para que o hospedeiro monte uma resposta imune contra as células tumorais, tipicamente cerca de uma semana ou mais, cerca de dez dias ou mais, ou cerca de duas semanas ou mais. Estágios limiares exemplares são qualquer estágio além do menor estágio (por exemplo, Estágio I ou equivalente), ou qualquer estágio no qual o tumor primário é maior do que um tamanho limiar, ou qualquer estágio no qual células metastáticas são detectadas.
[00525] Qualquer modo de administração de um microorganismo a um indivíduo pode ser usado, desde que o modo de administração permita que as bactérias imunoestimulantes entrem em um tumor ou metástase. Os modos de administração podem incluir, sem limitação, administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica, intratumoral, multipunção, por inalação, intranasal, oral, intracavitária (por exemplo, administração à bexiga por meio de um cateter, administração ao intestino por supositório ou enema), aural, retal e ocular.
[00526] Aqueles habilitados na técnica podem selecionar qualquer modo de administração compatível com o indivíduo e com as bactérias, e que também provavelmente resulte em que as bactérias alcancem os tumores e/ou metástases. A via de administração pode ser selecionada por aqueles habilitados na técnica de acordo com qualquer um de diversos fatores, incluindo a natureza da doença, o tipo de tumor e as bactérias particulares contidas na composição farmacêutica. A administração ao local-alvo pode ser realizada, por exemplo, por liberação balística, como um sistema de dispersão coloidal, ou a administração sistêmica pode ser realizada por injeção em uma artéria.
[00527] O regime de dosagem pode ser qualquer um de diversos métodos e quantidades, e pode ser determinado por aqueles habilitados na técnica de acordo com fatores clínicos conhecidos. Uma dose única pode ser terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma doença ou distúrbio no qual a estimulação imune efetua o tratamento. Exemplares dessa estimulação é uma resposta imune, que inclui, sem limitação, uma ou ambas de uma resposta imune específica e resposta imune não-específica, respostas tanto específicas quanto não específicas, resposta inata, resposta imune primária, imunidade adaptativa, resposta imune secundária, resposta imune de memória, ativação de célula imune, proliferação de célula imune, diferenciação de célula imune e expressão de citocina.
[00528] Como é conhecido nas ciências médicas, as dosagens para um indivíduo podem depender de muitos fatores, incluindo da espécie do indivíduo, do tamanho, da área de superfície corporal, da idade, sexo, imunocompetência e saúde geral, das bactérias particulares a serem administradas, da duração e via de administração, do tipo e estágio da doença, por exemplo, do tamanho do tumor, e de outros compostos como, por exemplo, fármacos que estão sendo administrados concomitantemente. Além dos fatores acima, esses níveis podem ser afetados pela infectividade das bactérias e da natureza das bactérias, como pode ser determinado por aqueles habilitados na técnica.
[00529] Nos presentes métodos, níveis de dosagem mínimos apropriados de bactérias podem ser níveis suficientes para que as bactérias sobrevivam, cresçam e repliquem em um tumor ou metástase. Níveis mínimos exemplares para administração de uma bactéria a um humano de 65 kg podem incluir pelo menos cerca de 5 x 106 unidades formadoras de colônia (CFU), pelo menos cerca de 1 x 107 CFU, pelo menos cerca de 5 x 107 CFU, pelo menos cerca de 1 x 108 CFU ou pelo menos cerca de 1 x 109 CFU.
[00530] Nos presentes métodos, níveis de dosagem máximos apropriados de bactérias podem ser níveis que não são tóxicos para o hospedeiro, níveis que não causam esplenomegalia de 3x ou mais, níveis que não resultam em colônias ou placas em tecidos ou órgãos normais após cerca de 1 dia ou após cerca de 3 dias ou após cerca de 7 dias. Níveis máximos exemplares para administração de uma bactéria a um humano de 65 kg podem incluir no máximo cerca de 5 x 1011 CFU, no máximo cerca de 1 x 1011 CFU, no máximo cerca de 5 x 1010 CFU, no máximo cerca de 1 x 1010 CFU ou no máximo cerca de 1 x 109 CFU.
[00531] Os métodos e usos fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir uma única administração de bactérias imunoestimulantes a um indivíduo ou múltiplas administrações de bactérias imunoestimulantes a um indivíduo ou outros de diversos regimes, incluindo terapias combinadas com outros produtos terapêuticos e/ou tratamentos antitumorais. Esses incluem, terapias celulares, por exemplo, administração de células imunes modificadas; terapia de CAR-T; terapia de CRISPR; imunoterapia, por exemplo, inibidores do ponto de verificação imune, por exemplo, anticorpos e fragmentos de anticorpo; quimioterapia e compostos quimioterápicos, por exemplo, análogos de nucleosídeo; cirurgia; terapia com vírus oncolítico; e radioterapia.
[00532] As bactérias imunoestimulantes, ou composições farmacêuticas que contêm as bactérias imunoestimulantes, podem ser usadas em métodos de tratamento, em que o tratamento compreende terapia combinada, na qual um segundo agente ou tratamento anticâncer é administrado. O segundo agente ou tratamento anticâncer é administrado antes, concomitantemente, depois ou intermitentemente com a bactéria ou composição farmacêutica imunoestimulante, e pode ser uma imunoterapia, terapia com vírus oncolítico, radiação, quimioterapia ou cirurgia, por exemplo. A imunoterapia pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno, incluindo um anticorpo anti-PD-1, ou anti-PD-L1, ou anti-CTLA4, ou anti-IL6, ou anti-VEGF, ou anti-VEGFR ou anti-VEGFR2, ou fragmentos deste.
[00533] Em algumas modalidades, uma única administração é suficiente para estabelecer bactérias imunoestimulantes em um tumor, em que as bactérias podem colonizar e podem causar ou aumentar uma resposta antitumoral no indivíduo. Em outras modalidades, as bactérias imunoestimulantes fornecidas para uso nos métodos nesse relatório descritivo podem ser administradas em ocasiões diferentes, separadas no tempo tipicamente por pelo menos um dia. Administrações separadas podem aumentar a probabilidade de liberação de uma bactéria a um tumor ou metástase, em que uma administração prévia pode ter sido ineficaz na liberação da bactéria a um tumor ou metástase. Em modalidades, administrações separadas podem aumentar as localizações em um tumor ou metástase onde a colonização/proliferação bacteriana pode ocorrer ou pode de algum outro modo aumentar a titulação de bactérias acumuladas no tumor, o que pode aumentar a provocação ou intensificação de da resposta imune antitumoral de um hospedeiro.
[00534] Quando são realizadas administrações separadas, cada administração pode ser uma quantidade de dosagem que é a mesma ou diferente em relação às outras quantidades de dosagem da administração. Em uma modalidade, todas as quantidades de dosagem da administração são as mesmas. Em outras modalidades, uma primeira quantidade de dosagem pode ser uma quantidade de dosagem maior do que uma ou mais quantidades de dosagem subsequentes, por exemplo, pelo menos 10x maior, pelo menos 100x maior, ou pelo menos 1.000x maior do que quantidades de dosagem subsequentes. Em um exemplo de um método de administrações separadas nas quais a primeira quantidade de dosagem é maior do que uma ou mais quantidades de dosagem subsequentes, todas as quantidades de dosagem subsequentes podem ser as mesmas, uma quantidade menor em relação à primeira administração.
[00535] Administrações separadas podem incluir qualquer número de duas ou mais administrações, incluindo duas, três, quatro, cinco ou seis administrações. Aqueles habilitados na técnica podem prontamente determinar o número de administrações a serem realizadas, ou a conveniência de realização de uma ou mais administrações adicionais, de acordo com métodos conhecidos na técnica para o monitoramento de métodos terapêuticos e outros métodos de monitoramento fornecidos nesse relatório descritivo. Consequentemente, os métodos fornecidos nesse relatório descritivo incluem métodos de fornecimento ao indivíduo de uma ou mais administrações de bactérias imunoestimulantes, em que o número de administrações pode ser determinado pelo monitoramento do indivíduo e, com base nos resultados do monitoramento, determinar se deve ou não ser fornecida uma ou mais administrações adicionais. A decisão sobre se deve ou não ser fornecida uma ou mais administrações adicionais pode ser feita com base em diversos resultados de monitoramento incluindo, sem limitação, indicação de crescimento tumoral ou inibição do crescimento tumoral, aparecimento de novas metástases ou inibição de metástase, a titulação de anticorpo antibacteriano do indivíduo, a titulação de anticorpo antitumoral do indivíduo, a saúde global do indivíduo e o peso do indivíduo.
[00536] O período de tempo entre administrações pode ser qualquer um de diversos períodos de tempo. O período de tempo entre administrações pode depender de qualquer um de diversos fatores, incluindo etapas de monitoramento, como descrito em relação ao número de administrações, o período de tempo para que um indivíduo monte uma resposta imune, o período de tempo para que um indivíduo depure bactérias de tecido normal, ou o período de tempo para colonização/proliferação bacteriana no tumor ou metástase. Em um exemplo, o período de tempo pode depender do período de tempo para que um indivíduo monte uma resposta imune; por exemplo, o período de tempo pode ser maior do que o período de tempo para que um indivíduo monte uma resposta imune, por exemplo, maior do que cerca de uma semana, maior do que cerca de dez dias, maior do que cerca de duas semanas ou maior do que cerca de um mês; em outro exemplo, o período de tempo pode ser menor do que o período de tempo para que um indivíduo monte uma resposta imune, por exemplo, menor do que cerca de uma semana, menor do que cerca de dez dias, menor do que cerca de duas semanas ou menor do que cerca de um mês. Em outro exemplo, o período de tempo pode depender do período de tempo para colonização/proliferação bacteriana no tumor ou metástase; por exemplo, o período de tempo pode ser maior do que a quantidade de tempo para que um sinal detectável surja em um tumor ou metástase após administração de um microorganismo que expressa um marcador detectável, por exemplo, cerca de 3 dias, cerca de 5 dias, cerca de uma semana, cerca de dez dias, cerca de duas semanas ou cerca de um mês.
[00537] Os métodos usados nesse relatório descritivo também podem ser realizados por administração de composições, por exemplo, suspensões e outras formulações, que contêm as bactérias imunoestimulantes fornecidas nesse relatório descritivo. Essas composições contêm as bactérias e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, como fornecido nesse relatório descritivo ou conhecido por aqueles habilitados na técnica.
[00538] Como discutido acima, os usos e métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem incluir a administração de um ou mais compostos terapêuticos, por exemplo, compostos antitumorais ou outras terapêuticas contra o câncer, a um indivíduo, além da administração de bactérias imunoestimulantes ao indivíduo. Os compostos terapêuticos podem atuar independentemente, ou em conjunto com as bactérias imunoestimulantes, para efeitos terapêuticos sobre o tumor. Compostos terapêuticos que podem atuar independentemente incluem qualquer um de diversos compostos quimioterápicos conhecidos que podem inibir o crescimento tumoral, inibir o crescimento e/ou formação de metástases, diminuir o tamanho de um tumor ou metástase, eliminar um tumor ou metástase, sem reduzir a habilidade das bactérias imunoestimulantes para se acumular em um tumor, replicar no tumor, e causar ou aumentar uma resposta imune antitumoral no indivíduo.
Exemplos desses agentes quimioterápicos incluem, sem limitação, agentes alquilantes como, por exemplo, tiotepa e ciclofosfamida; alquil sulfonatos como, por exemplo, bussulfan, improssulfan e piposulfan; erógenos como, por exemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais como, por exemplo, aminoglutetimida, mitotano, trilostano; antiandrogênios como, por exemplo, flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; antibióticos como, por exemplo, aclacinomicinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carrubicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antiestrogênios incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, cetotifeno, LY 117018, onapristona e toremifeno (Fareston); antimetabólitos como, por exemplo, metotrexato e 5-fluoruracil (5-FU); análogos de ácido fólico como, por exemplo, denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; aziridinas como, por exemplo, benzodepa, carboquona, meturedepa e uredepa; etileniminas e metil-melaminas incluindo altretamina,
trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilol melamina; repositor de ácido fólico como, por exemplo, ácido folínico; mostradas nitrogenadas como, por exemplo, clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostrada uracil; nitrosouréias como, por exemplo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; análogos de platina como, por exemplo, cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; proteínas como, por exemplo, arginina deiminase e asparaginase; análogos de purina como, por exemplo, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; pirimidina análogos como, por exemplo, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU; taxanos, como, por exemplo, paclitaxel e docetaxel e formas albuminadas destes (ou seja, nab-paclitaxel e nab- docetaxel), inibidor de topoisomerase RFS 2000; inibidor de timidilato sintase (por exemplo, Tomudex); quimioterápicos adicionais, incluindo aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatrexato; defosfamida; demecolcina; diaziquona; difluormetilornitina (DMFO); eflornitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSKg; razoxana; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona;
2,2’,2’-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; clorambucil; gemcitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; Navelbina; Novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; CPT-11; ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; e inibidores de topoisomerase como, por exemplo, irinotecan. Sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima também podem ser usados.
[00539] Compostos terapêuticos que atuam em conjunto com as bactérias imunoestimulantes incluem, por exemplo, compostos que aumentam as propriedades de evocação de respostas imunes das bactérias, por exemplo, por aumento da expressão do RNAi, por exemplo, shRNA e miRNA, que inibem, suprimem ou rompem a expressão dos genes do ponto de verificação, por exemplo, PD-L1, ou TREX1 ou outros genes do ponto de verificação, ou compostos que que podem aumentar ainda mais a colonização/proliferação bacteriana. Por exemplo, um composto de alteração da expressão gênica pode induzir ou aumentar a transcrição de um gene em uma bactéria, por exemplo, um gene exógeno, por exemplo, que codifica shRNA que inibe, suprime ou rompe a expressão de um ou mais genes do ponto de verificação provocando, dessa forma, uma resposta imune. Qualquer um de uma ampla variedade de compostos que podem alterar a expressão gênica são conhecidos na técnica, incluindo IPTG e RU486. Genes exemplares cuja expressão pode ser supra-regulada incluem proteínas e moléculas de RNA,
incluindo toxinas, enzimas que podem converter um pró- fármaco em um fármaco antitumoral, citocinas, proteínas de regulação da transcrição, shRNA, siRNA e ribozimas.
Em outras modalidades, compostos terapêuticos que podem atuar em conjunto com as bactérias imunoestimulantes para aumentar a colonização/proliferação ou as propriedades de evocação de respostas imunes das bactérias são compostos que podem interagir com um produto gênico expresso por bactérias, e essa interação pode resultar em uma morte aumentada de células tumorais ou uma resposta imune antitumoral aumentada no indivíduo.
Um composto terapêutico que pode interagir com um produto gênico expresso por bactérias pode incluir, por exemplo, um pró-fármaco ou outro composto que possui pouca ou nenhuma toxicidade ou outra atividade biológica em sua forma administrada ao indivíduo, mas, após interação com um produto gênico expresso por bactérias, o composto pode desenvolver uma propriedade que resulta em morte da célula tumoral incluindo, sem limitação, citotoxicidade, habilidade para induzir apoptose ou habilidade para desencadear uma resposta imune.
Diversas substâncias do tipo pró-fármaco são conhecidas na técnica, incluindo ganciclovir, 5-fluoruracil, 6-metilpurina desoxirribosídeo, cefalosporina- doxorrubicina, ácido 4-[(2-cloroetil)(2- mesuloxietil)amino]benzoil-L-glutâmico, acetominofeno, ácido indol-3-acético, CB1954, 7-etil-1044-(1-piperidino)- 1-piperidino]carboniloxicampototecina, bis-(2- cloroetil)amino-4-hidroxifenilaminometanona 28, 1- clorometil-5-hidróxi-1,2-diidro-3H-benz[e]indol, epirrubicina-glucoronida, 5'-desóxi-5-fluoruridina, citosina arabinosida e linamarina.
3. Monitoramento
[00540] Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem ainda incluir uma ou mais etapas de monitoramento do indivíduo, monitoramento do tumor e/ou monitoramento das bactérias imunoestimulantes administradas ao indivíduo. Qualquer uma de diversas etapas de monitoramento pode ser incluída nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo incluindo, sem limitação, monitoramento do tamanho do tumor, monitoramento da presença e/ou tamanho de metástases, monitoramento dos linfonodos do indivíduo, monitoramento do peso do indivíduo ou outros indicadores de saúde, incluindo marcadores do sangue ou da urina, monitoramento da titulação de anticorpo antibacteriano, monitoramento da expressão bacteriana de um produto gênico detectável, e monitoramento direto da titulação bacteriana em um tumor, tecido ou órgão de um indivíduo.
[00541] O objetivo do monitoramento pode ser simplesmente para avaliação do estado de saúde do indivíduo ou do progresso do tratamento terapêutico do indivíduo, ou pode ser para determinar se é ou não justificada uma administração adicional da mesma bactéria imunoestimulante ou de uma bactéria imunoestimulante diferente, ou para determinar quando ou se deve ou não ser administrado um composto ao indivíduo, em que o composto pode atuar para aumentar a eficácia do método terapêutico, ou o composto pode atuar para diminuir a patogenicidade das bactérias administradas ao indivíduo.
[00542] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir o monitoramento de um ou mais genes expressos por bactérias. Bactérias, tais como aquelas fornecidas nesse relatório descritivo ou de algum outro modo conhecidas na técnica, podem expressar um ou mais produtos gênicos detectáveis incluindo, sem limitação, proteínas detectáveis.
[00543] Como fornecida nesse relatório descritivo, a medição de um produto gênico detectável expresso em uma bactéria pode fornecer uma determinação precisa do nível de bactérias presente no indivíduo. Como adicionalmente fornecida nesse relatório descritivo, a medição da localização do produto gênico detectável, por exemplo, por métodos de imageamento que incluem métodos tomográficos, pode determinar a localização das bactérias no indivíduo. Consequentemente, os métodos fornecidos nesse relatório descritivo que incluem o monitoramento de um produto gênico bacteriano detectável podem ser usados para determinar a presença ou ausência das bactérias em um ou mais órgãos ou tecidos de um indivíduo, e/ou a presença ou ausência das bactérias em um tumor ou metástases de um indivíduo. Além disso, os métodos fornecidos nesse relatório descritivo que incluem o monitoramento de um produto gênico bacteriano detectável podem ser usados para determinar a titulação de bactérias presente em um ou mais órgãos, tecidos, tumores ou metástases. Métodos que incluem o monitoramento da localização e/ou titulação de bactérias em um indivíduo podem ser usados para determinação da patogenicidade de bactérias, na medida em que a infecção bacteriana e, particularmente, o nível de infecção, de tecidos normais e órgãos pode indicar a patogenicidade das bactérias. Os métodos que incluem o monitoramento da localização e/ou titulação de bactérias imunoestimulantes em um indivíduo podem ser realizados em vários pontos do tempo e, consequentemente, podem determinar a taxa de replicação bacteriana em um indivíduo, incluindo a taxa de replicação bacteriana em um ou mais órgãos ou tecidos de um indivíduo; consequentemente, métodos que incluem o monitoramento de um produto gênico bacteriano podem ser usados para determinação da competência de replicação das bactérias.
Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem ser usados para quantificar a quantidade de bactérias imunoestimulantes presente em diversos órgãos ou tecidos, e tumores ou metástases e podem, dessa forma, indicar o grau de acúmulo preferencial das bactérias em um indivíduo; consequentemente, o monitoramento do produto gênico bacteriano pode ser usado em métodos de determinação da habilidade das bactérias para se acumularem em um tumor ou metástases em preferência para tecidos ou órgãos normais.
Na medida em que as bactérias imunoestimulantes usadas nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem se acumular em um tumor inteiro ou podem se acumular em vários locais em um tumor, e também podem se acumular em metástases, os métodos fornecidos nesse relatório descritivo para o monitoramento de um produto gênico bacteriano podem ser usados para determinar o tamanho de um tumor ou o número de metástases presentes em um indivíduo.
O monitoramento dessa presença de produto gênico bacteriano em um tumor ou metástase ao longo de um intervalo de tempo pode ser usado para avaliar alterações no tumor ou metástases, incluindo o crescimento ou encolhimento de um tumor, ou o desenvolvimento de novas metástases ou o desaparecimento de metástases, e também pode ser usado para determinar a taxa de crescimento ou encolhimento de um tumor,
ou o desenvolvimento de novas metástases ou o desaparecimento de metástases, ou a alteração na taxa de crescimento ou o encolhimento de um tumor, ou o desenvolvimento de novas metástases ou o desaparecimento de metástases. Consequentemente, o monitoramento de um produto gênico bacteriano pode ser usado para o monitoramento uma doença neoplásica em um indivíduo, ou para determinação da eficácia de tratamento de uma doença neoplásica, por determinação da taxa de crescimento ou encolhimento de um tumor, ou de desenvolvimento de novas metástases ou de desaparecimento de metástases, ou da alteração na taxa de crescimento ou de encolhimento de um tumor, ou de desenvolvimento de novas metástases ou de desaparecimento de metástases.
[00544] Qualquer uma de diversas proteínas detectáveis pode ser detectada por monitoramento, cujos exemplos são qualquer uma de diversas proteínas fluorescentes (por exemplo, proteínas fluorescentes verdes), qualquer uma de diversas luciferases, proteínas de transferência ou outras proteínas de ligação ao ferro; ou receptores, proteínas de ligação e anticorpos, em que um composto que se liga especificamente ao receptor, proteína de ligação ou anticorpo pode ser um agente detectável ou pode ser marcado com uma substância detectável (por exemplo, um radionuclídeo ou agente de imageamento).
[00545] O tamanho do tumor e/ou de metástase pode ser monitorado por qualquer um de diversos métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de avaliação externos ou métodos de imageamento tomográficos ou magnéticos. Além dos métodos conhecidos na técnica, os métodos fornecidos nesse relatório descritivo, por exemplo, o monitoramento da expressão de genes bacterianos, podem ser usados para o monitoramento do tamanho do tumor e/ou de metástase.
[00546] O monitoramento do tamanho ao longo de vários pontos do tempo pode fornecer informação em relação ao aumento ou à diminuição no tamanho de um tumor ou metástase, e também pode fornecer informação em relação à presença de tumores e/ou metástases adicionais no indivíduo. O monitoramento do tamanho do tumor ao longo de vários pontos do tempo pode fornecer informação em relação ao desenvolvimento de uma doença neoplásica em um indivíduo, incluindo à eficácia de tratamento de uma doença neoplásica em um indivíduo.
[00547] Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem incluir o monitoramento da titulação de anticorpo em um indivíduo, incluindo anticorpos produzidos em resposta à administração de bactérias imunoestimulantes a um indivíduo. As bactérias administradas nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem provocar uma resposta imune a antígenos bacterianos endógenos. As bactérias administradas nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem provocar uma resposta imune aos genes exógenos expressos pelas bactérias. As bactérias administradas nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem provocar uma resposta imune a antígenos tumorais.
[00548] O monitoramento da titulação de anticorpo contra antígenos bacterianos, produtos gênicos exógenos expressos por bactérias ou antígenos tumorais pode ser usado para monitorar a toxicidade das bactérias, para monitoramento da eficácia de métodos de tratamento ou para monitoramento do nível de produto gênico ou anticorpos para produção e/ou colheita.
[00549] O monitoramento da titulação de anticorpo pode ser usado para monitorar a toxicidade das bactérias. A titulação de anticorpo contra bactérias pode variar ao longo do período de tempo após administração das bactérias ao indivíduo, em que, em alguns pontos do tempo particulares, uma titulação de anticorpo anti-(antígeno bacteriano) baixa pode indicar uma toxicidade maior, enquanto em outros pontos do tempo uma titulação de anticorpo anti-(antígeno bacteriano) alta pode indicar uma toxicidade maior. As bactérias usadas nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem ser imunogênicas, e podem, portanto, provocar uma resposta imune logo após a administração das bactérias ao indivíduo. Geralmente, bactérias imunoestimulantes contra as quais o sistema imune de um indivíduo pode montar uma resposta imune forte podem ser bactérias que possuem toxicidade baixa quando o sistema imune do indivíduo pode remover as bactérias de todos os órgãos ou tecidos normais. Dessa forma, em algumas modalidades, uma titulação de anticorpo alta contra antígenos bacterianos logo após a administração das bactérias a um indivíduo pode indicar toxicidade baixa das bactérias.
[00550] Em outras modalidades, o monitoramento da titulação de anticorpo pode ser usado para monitorar a eficácia de métodos de tratamento. Nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo, a titulação de anticorpo, por exemplo, titulação de anticorpo anti-(antígeno tumoral), pode indicar a eficácia de um método terapêutico, por exemplo, um método terapêutico para tratar doença neoplásica. Os métodos terapêuticos fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir a evocação ou o aumento de uma resposta imune contra um tumor e/ou metástase. Dessa forma, por monitoramento da titulação de anticorpo anti- (antígeno tumoral), é possível monitorar a eficácia de um método terapêutico na evocação ou no aumento de uma resposta imune contra um tumor e/ou metástase.
[00551] Em outras modalidades, o monitoramento da titulação de anticorpo pode ser usado para o monitoramento do nível de produto gênico ou anticorpos para produção e/ou colheita. Como fornecidos nesse relatório descritivo, os métodos podem ser usados para a produção de proteínas, moléculas de RNA ou outros compostos, particularmente moléculas de RNA por exemplo, shRNA, por expressão de um gene exógeno em um microorganismo que se acumulou em um tumor. O monitoramento da titulação de anticorpo contra a proteína, molécula de RNA ou outro composto pode indicar o nível de produção da proteína, molécula de RNA ou outro composto pelo microorganismo acumulado no tumor, e também pode indicar diretamente o nível de anticorpos específicos para essa proteína, molécula de RNA ou outro composto.
[00552] Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem incluir métodos de monitoramento da saúde de um indivíduo. Alguns dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo são métodos terapêuticos, incluindo métodos terapêuticos para doença neoplásica. O monitoramento da saúde de um indivíduo pode ser usado para determinar a eficácia do método terapêutico, como é conhecido na técnica. Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo também podem incluir uma etapa de administração a um indivíduo de uma bactéria imunoestimulante, como fornecida nesse relatório descritivo. O monitoramento da saúde de um indivíduo pode ser usado para determinar a patogenicidade de uma bactéria imunoestimulante administrada a um indivíduo. Qualquer um de diversos métodos diagnósticos da saúde para o monitoramento de doença, por exemplo, doença neoplásica, doença infeciosa ou doença relacionada ao sistema imune, pode ser usado, como é conhecido na técnica. Por exemplo, o peso, pressão sanguínea, pulso, respiração, cor, temperatura ou outro estado observável de um indivíduo pode indicar a saúde de um indivíduo. Além disso, a presença ou ausência ou nível de um ou mais componentes em uma amostra de um indivíduo pode indicar a saúde de um indivíduo.
[00553] Amostras típicas podem incluir amostras de sangue e urina, em que a presença ou ausência ou nível de um ou mais componentes pode ser determinado por realização, por exemplo, de um teste diagnóstico de painel de sangue ou de painel de urina. Componentes exemplares indicativos da saúde de um do indivíduo incluem, sem limitação, contagem de células sanguíneas brancas, hematócrito e concentração de proteína C-reativa.
[00554] Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir o monitoramento de uma terapia, em que podem ser feitas decisões terapêuticas com base nos resultados do monitoramento. Os métodos terapêuticos fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir a administração a um indivíduo de bactérias imunoestimulantes, em que as bactérias podem se acumular preferencialmente em um tumor e/ou metástase, e em que as bactérias podem causar ou aumentar uma resposta imune antitumoral. Esses métodos terapêuticos podem incluir diversas etapas, incluindo múltiplas administrações de uma bactéria imunoestimulante particular, administração de uma segunda bactéria imunoestimulante, ou administração de um composto terapêutico. A determinação da quantidade, momento ou tipo de bactérias imunoestimulantes ou composto para administrar ao indivíduo pode se basear em um ou mais resultados do monitoramento do indivíduo. Por exemplo, a titulação de anticorpo em um indivíduo pode ser usada para determinar se é ou não desejável administrar uma bactéria imunoestimulante e, opcionalmente, um composto, a quantidade de bactérias e/ou composto a ser administrada, e o tipo de bactérias e/ou composto a ser administrado, em que, por exemplo, uma titulação baixa de anticorpo pode indicar a conveniência da administração de uma bactéria imunoestimulante adicional, uma bactéria imunoestimulante diferente, e/ou um composto terapêutico, por exemplo, um composto que induz expressão de gene bacteriano ou um composto terapêutico que é eficaz independente das bactérias imunoestimulantes.
[00555] Em outro exemplo, o estado de saúde global de um indivíduo pode ser usado para determinar se é ou não desejável administrar uma bactéria imunoestimulante e, opcionalmente, um composto, a quantidade de bactéria ou composto a ser administrada, e o tipo de bactéria e/ou composto a ser administrado, em que, por exemplo, a determinação de que o indivíduo é saudável pode indicar a conveniência da administração de bactérias adicionais, bactérias diferentes, ou um composto terapêutico, por exemplo, um composto que induz expressão de um gene bacteriano (por exemplo, shRNA que inibe um ou mais genes do ponto de verificação). Em outro exemplo, o monitoramento de um produto gênico detectável expresso por bactérias pode ser usado para determinar se é desejável administrar uma bactéria imunoestimulante e, opcionalmente, um composto, a quantidade de bactéria e/ou composto a ser administrada, e o tipo de bactéria e/ou composto a ser administrado, em que, por exemplo, a determinação de que o indivíduo é saudável pode indicar a conveniência da administração de bactérias adicionais, bactérias diferentes ou um composto terapêutico, por exemplo, um composto que induz expressão de um gene bacteriano (por exemplo, shRNA que inibe um ou mais genes do ponto de verificação). Esses métodos de monitoramento podem ser usados para determinar se o método terapêutico é ou não eficaz, se o método terapêutico é ou não patogênico para o indivíduo, se as bactérias se acumularam ou não em um tumor ou metástase, e se as bactérias se acumularam ou não em tecidos ou órgãos normais. Com base nessas determinações, a conveniência e forma de métodos terapêuticos adicionais podem ser derivadas.
[00556] Em outro exemplo, o monitoramento pode determinar se as bactérias imunoestimulantes se acumularam ou não em um tumor ou metástase de um indivíduo. Após essa determinação, pode ser feita uma decisão para se administrar adicionalmente bactérias adicionais, uma bactéria imunoestimulante diferente e, opcionalmente, um composto ao indivíduo. J. EXEMPLOS
[00557] Os exemplos seguintes são incluídos somente para fins ilustrativos e não visam limitar o escopo da invenção. Resumo de algumas cepas bacterianas imunoestimulantes modificadas geneticamente exemplares e nomenclatura:
Nº da Fundo da Alvos de Plasmídeo Nome alternativo Cepa cepa RNAi AST- Nenhum YS1646 Nenhum VNP 20009 100 AST- ASD (knockout do Nenhum YS1646-ASD Nenhum 101 gene asd) AST- YS1646 (pEQU6 — pEQU6 YS1646 Nenhum 102 plasmídeo) Scramble AST- pEQU6 YS1646 YS1646 (pEQU6-shSCR) 103 (shRNA) muTREX1 YS1646 (pEQU6- AST- pEQU6 YS1646 (shRNA) shTREX1) 104 ARI-108 muPD-L1 AST- YS1646 (pEQU6- pEQU6 YS1646 (shRNA) 105 shPDL1) ARI-115 muTREX1 YS1646 (pEQU6- AST- pEQU6 YS1646 (microRNA) niTREXi) 106 ARI-203 AST- Scramble pATI-U6 YS1646-ASD ASD (pATI-shSCR) 107 (shRNA) muTREX1 AST- ASD (pATI- pATI-U6 YS1646-ASD (shRNA) 108 shTREX1) ARI-108 AST- Scramble ASD (pATIKan- pATIKAN-U6 YS1646-ASD 109 (shRNA) shSCR) muTREX1 AST- ASD (pATIKan- pATIKAN-U6 YS1646-ASD (shRNA) 110 shTREX1) ARI-108
Nº da Fundo da Alvos de Plasmídeo Nome alternativo Cepa cepa RNAi YS1646- ASD/FLG (knockout AST- Nenhum ASD- Nenhum de asd e 111 fljb-fliC flagelina) YS1646- muTREX1 ASD/FLG (pATI- AST- pATI-U6 ASD- (shRNA) shTREX1) 112 fljb-fliC ARI-108 YS1646- muTREX1 ASD/FLG (pATI-U6 AST- pATI-U6 ASD- (shRNA) Kan 113 fljb-fliC ARI-108 shTREX1) YS1646- ASD/LLO (knockout AST- ASD- de asd / Nenhum Nenhum 114 LLO knockin de cytoLLO) YS1646- muTREX1 ASD/LLO (pATIKan- AST- pATI-U6 ASD- (shRNA) shTREX1) 115 LLO ARI-108 AST- pATIKanpBRo ASD (pATIKanLow- YS1646-ASD Scramble 116 ri -U6 shSCR) pATIKanpBRo muTREX1 ASD (pATIKanLow- AST- ri -U6 YS1646-ASD (shRNA) shTREX1) 117 ARI-108 pATlKanpBRo YS1646- muTREX1 ASD/FLG AST- ri -U6 ASD- (shRNA) (pATIKanLow- 118 fljb-fliC ARI-108 shTREX1) pATlKanpBRo YS1646- muTREX1 ASD/LLO AST- ri -U6 ASD- (shRNA) (pATIKanLow- 119 pMTL-LLO ARI-108 shTREX1) AST- pEQU6 YS1646- muTREX1 ASD/LLO(pEQU6-
Nº da Fundo da Alvos de Plasmídeo Nome alternativo Cepa cepa RNAi 120 ASD- (microRNA) miTREX1) Suicida pMTL-LLO ARI-203 AST- muVISTA YS1646 (pEQU6- pEQU6 YS1646 121 ARI-157 shVISTA) AST- muTGF-beta YS1646 (pEQU6- pEQU6 YS1646 122 ARI-149 TGF-beta) muBeta- YS1646 (pEQU6- AST- pEQU6 YS1645 Catenina Beta-Catenina) 123 ARI-166
[00558] Subentende-se que essas cepas são listadas para referência; as mesmas deleções e inserções podem ser efetuadas em uma cepa do tipo selvagem de Salmonella typhimurium, por exemplo, a cepa depositada sob o Nº de Acesso em ATCC 14028, ou uma cepa que possui todas as características de identificação desta. A cepa do tipo selvagem pode adicionalmente ser tornada auxotrófica para adenosina por seleção ou deleções apropriadas. A construção e uso dessas cepas são descritos no Pedido Internacional Publicado PCT Nº WO 2019/014398, e na Publicação de Pedido U.S. Nº 2019/0017050. Exemplo 1 Cepa modificada geneticamente com knockout do gene asd de Salmonella
[00559] A Cepa AST-101 foi preparada. Ela é uma cepa atenuada de Salmonella typhimurium derivada da cepa YS1646 (que pode ser adquirida de ATCC, Nº de Catálogo 202165) que foi modificada geneticamente para ser asd (um knockout do gene asd). Nesse exemplo, a cepa de Salmonella typhimurium
YS1646 com deleção do gene asd foi modificada geneticamente usando modificações do método de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-6.645 (2000)) como esquematizado na Fig. 1, e descrito abaixo. Os métodos e produtos resultantes nesse exemplo e todos os exemplos abaixo podem ser usados com outras bactérias de partida, por exemplo, Salmonella typhimurium do tipo selvagem, por exemplo, a cepa depositada sob o Nº de Acesso em ATCC 14028. Introdução do plasmídeo auxiliar Lambda Red em YS1646
[00560] A cepa YS1646 foi preparada para ser eletrocompetente como descrito previamente (Sambrook J., (1998) “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, 2ª Edição. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory) por crescimento de uma cultura em LB e concentrando 100 vezes e lavando três vezes com glicerol 10% bem gelado. A cepa eletrocompetente foi eletroporada com o plasmídeo auxiliar Lambda Red pKD46 (ID. DE SEQ. N°: 218) usando uma cubeta com lacuna de 0,2 cm nas seguintes configurações: 2,5 kV, 186 ohms, 50 µF. Transformantes que carregam pKD46 foram desenvolvidos em 5 ml de meio SOC com ampicilina e 1 mM de L-arabinose a 30°C e selecionados em placas de ágar LB contendo ampicilina. Um clone de YS1646 contendo o plasmídeo auxiliar Lambda Red pKD46 foi então tornado eletrocompetente, como descrito acima para YS1646. Construção do cassete de knockout do gene asd
[00561] O gene asd do genoma de YS1646 (Broadway e cols. (2014) J. Biotechnology 192: 177-178) foi usado para o design do cassete de knockout do gene asd. Um plasmídeo contendo 204 e 203 bp de homologia para as regiões à esquerda e à direita, respectivamente, do gene asd, foi transformado em células DH5-alfa competentes. Um cassete do gene de canamicina flanqueado por sítios lox P foi clonado nesse plasmídeo. O cassete de knockout do gene asd foi então amplificado por PCR usando iniciadores asd-1 e asd-2 (Tabela 1) e purificado em gel. Execução de deleção do gene asd
[00562] A cepa YS1646 que carrega o plasmídeo pKD46 foi eletroporada com o cassete de knockout do gene asd linear purificado em gel. As células eletroporadas foram recuperadas em meio SOC e plaqueadas sobre placas Ágar LB suplementado com canamicina (20 µg/ml) e ácido diaminopimélico (DAP, 50 µg/ml). Durante essa etapa, Lambda Red recombinase induz recombinação homóloga do gene cromossômico asd com o cassete de kan (em função da presença de sequências homólogas que flanqueiam a montante e a jusante do gene cromossômico asd), e ocorre o knockout da cópia cromossômica do gene asd. A presença do gene asd rompido nos clones resistentes à canamicina selecionados foi confirmada por amplificação por PCR com iniciadores do genoma de YS1646 que flanqueiam os sítios de ruptura (iniciador asd-3) e do sítio de clonagem múltipla (iniciador scFv-3) (Tabela 1). As colônias também foram plaqueadas em réplicas sobre placas LB com e sem DAP suplementar para demonstrar auxotrofia de DAP. Todos os clones com a deleção do gene asd eram incapazes de crescer na ausência de DAP suplementar, demonstrando auxotrofia de DAP. Tabela 1. Informação de iniciadores. Nome do Sequência do iniciador ID. DE iniciador SEQ. Nº asd-1 ccttcctaacgcaaattccctg 219 asd-2 ccaatgctctgcttaactcctg 220 asd-3 gcctcgccatgtttcagtacg 221 asd-4 ggtctggtgcattccgagtac 222 scFv-3 cataatctgggtccttggtctg 223 c Remoção do cassete do gene de canamicina
[00563] O marcador selecionável kan foi removido por utilização do sistema de recombinação sítio-específico Cre/loxP. O mutante KanR do gene asd- YS1646 foi transformado com pJW168 (um plasmídeo sensível à temperatura que expressa a cre recombinase, ID. DE SEQ. N°: 224). Colônias AmpR foram selecionadas a 30°C; pJW168 foi subsequentemente eliminado por crescimento a 42°C. Um clone selecionado (AST-101) foi então testado para perda de kan por plaqueamento de réplicas em placas de ágar LB com e sem canamicina, e confirmada por verificação por PCR usando iniciadores do genoma de YS1646 que flanqueiam os sítios de ruptura (iniciador asd-3 e asd- 4, para sequência do iniciador, veja a Tabela 1). Caracterização da cepa mutante com deleção de asd AST-101
[00564] O mutante asd AST-101 foi incapaz de crescer em placas de ágar LB a 37°C, mas foi capaz de crescer em placas LB contendo 50 µg/ml de ácido diaminopimélico (DAP). A taxa de crescimento do mutante asd foi avaliada em meio líquido LB e ele foi incapaz de crescer em LB líquido, mas foi capaz de crescer em LB suplementado com 50 pg/ml de DAP, como determinado por medição da absorbância a 600 nM. Confirmação de sequência da sequência do lócus asd de AST-101 após deleção do gene asd
[00565] A cepa de deleção do gene asd AST-101 foi verificada por sequenciamento de DNA usandos os iniciadores asd-3 e asd-4. O sequenciamento da região que flanqueia o asd lócus foi realizado e a sequência confirmou que o gene asd foi deletado do cromossomo de YS1646. Exemplo 2 Geração de cepas modificadas de Salmonella typhimurium de Salmonella typhimurium do tipo selvagem
[00566] Os genes purl, msbB e asd foram deletados individualmente do genoma da cepa do tipo selvagem de Salmonella typhimurium ATCC 14028 usando o sistema de recombinação Red derivado de lambda, como descrito em Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-
6.645 (2000)), para gerar uma cepa-base designada 14028:Apurl/AmsbBlAasd. Os genes de flagelina fljB e fliC foram subsequentemente deletados para gerar a cepa 14028:Apurl/AmsbB/Aasdl AfljBl AfliC, e o gene pagP foi então deletado para gerar a cepa 14028: Apurl/AmsbB/ Aasdl AfljBl AfliCI ApagP. Cepas 14028: Apurl/AmsbB/ Aasdl AfljBI AfliC e 14028: Apurl/AmsbB/ Aasdl AfljBl AfliC ApagP foram eletroporadas com um plasmídeo que contém um gene asd funcional, para complementar a deleção cromossômica de asd e assegurar a manutenção do plasmídeo in vivo, e um cassete de expressão eucariótica que codifica a proteína fluorescente vermelha mCherry sob o controle do promotor EF1-a. Exemplo 3 Alvos de Salmonella typhimurium modificada demonstram inibição do crescimento tumoral robusta em múltiplos modelos murídeos singênicos de tumor PD-L1
[00567] O sistema imune desenvolveu várias verificações e contrapesos para limitar a autoimunidade. A proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e ligante de morte programada 1 (PD-L1) são dois exemplos de numerosos inibidores dos “pontos de verificação imune”, que funcionam por infra-regulação de respostas imunes. A ligação de PD-L1 a PD-1 interfere com vias de sinalização de célula T CD8+, prejudicando a proliferação e função efetora de células T CD8+, e induzindo tolerância de células T (Topalian e cols. (2012) N. Engl. J. Med. 366: 3.443-3.447).
[00568] A colonização de tumor de uma cepa modificada de Salmonella typhimurium que libera shRNA para o knockdown do gene PD-L1 rompe sua ligação a PD-1, e sua inibição da função de célula T CD8+. A inibição do ponto de verificação PD- L1/PD-1 tem boa sinergia com a S. typhimurium imunoestimulante que contém DNA de plasmídeo CpG, tudo em uma modalidade terapêutica. No lugar de um RNAi, a bactéria imunoestimulante pode ser modificado para codificar um fragmento de ligação ao antígeno ou anticorpo de cadeia única que inibe PD-L1 ou PD-1, para inibir a via de PD-1.
[00569] Para demonstrar a eficácia in vivo da cepa YS1646 que contém um plasmídeo que codifica shRNA contra PD-L1 (AST- 105), ou outro inibidor de PD-L1 ou da via de PD-1, essa cepa, em comparação com a cepa AST-102 (que contém um plasmídeo de controle que também contém motivos CpG) foi avaliada em um modelo murídeo de carcinoma do cólon. Para esse experimento, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (10 camundongos por grupo) foram inoculados SC no flanco direito com carcinoma do cólon murídeo CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados por via intravenosa
(IV) duas vezes, com intervalo de quatro dias, com 5 x 106 CFUs de AST-105 ou AST-102, ou receberam a administração IV de um anticorpo anti-PD-L1 (4 mg/kg, BioXCell clone 10F.9G2). Seis horas após a primeira dose IV, os camundongos foram sangrados, e plasma foi coletado e avaliado para citocinas pró-inflamatórias usando o kit “Mouse Inflammation Cytometric Bead Array” e analisado por FACS (BD Biosciences).
[00570] O tratamento com a cepa AST-105 demonstrou controle do tumor estatisticamente significante, comparado com o tratamento com a cepa de controle contendo plasmídeo AST-102 (69% de TGI, p = 0,05, dia 25). A inibição do crescimento tumoral também foi maior para o tratamento com AST-105 (que expressa shPD-L1) do que pela administração sistêmica de um anticorpo anti-PD-L1 (68% de TGI vs. anti- PD-L1).
[00571] Comparando a produção de citocinas pró- inflamatórias inatas em 6 horas pós-injeção IV, as citocinas provocadas pela cepa AST-105 eram significantemente maiores, comparado com o anticorpo anti-PD-L1 (p < 0,05), e bem maiores do que aquelas por AST-102. Esses dados demonstram que a inibição de PD-L1 dentro do microambiente tumoral, comparada com a administração sistêmica de anticorpo anti- PD-L1, ativa singularmente citocinas pró-inflamatórias potentes que induzem imunidade antitumoral e promovem inibição do crescimento tumoral em um modelo murídeo de carcinoma do cólon. Exemplo 4 Administração intratumoral de S. typhimurium modificada shTREX1 fornece colonização do tumor distal e respostas antitumorais completas em um modelo murídeo de flanco duplo de carcinoma do cólon
[00572] Uma marca registrada da indução de imunidade adaptativa a um tumor é a habilidade para induzir regressão de um tumor não tratado, distal. Para avaliar a habilidade da cepa YS1646 que contém os plasmídeos de shRNA pEQU6 para induzir inibição primária e distal do crescimento tumoral em um modelo murídeo de flanco duplo de carcinoma do cólon, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (10 camundongos por grupo) foram inoculados SC nos flancos direito e esquerdo com carcinoma do cólon murídeo CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados por via intratumoral (IT) duas vezes, com intervalo de quatro dias, no tumor do flanco direito com 5 x 106 CFUs de AST-104, (pEQU6 shTREX1 em YS1646), AST-105 (pEQU6 shPD-L1 em YS1646) ou AST-102 (controle de plasmídeo em YS1646), e comparados com controle de PBS.
[00573] A injeção IT de AST-104 e AST-105 induziu inibição significante do crescimento tumoral no tumor injetado, comparado com o controle de PBS (AST-105 — 60,5% de TGI, p = 0,03; AST-104 — 61,4% de TGI, p = 0,03 dia 25). Diferentemente de AST-105, somente AST-104 induziu inibição significante do crescimento do tumor não tratado, distal, comparado com PBS (60% de TGI, p < 0,0001, dia 25), e inibição significante do crescimento do tumor distal, comparado com AST-102 que contém o controle de plasmídeo (p = 0,004, dia 25). A cepa AST-104 também demonstrou regressão significante do tumor e sobrevida aumentada, comparado com controle de PBS (p = 0,0076, teste Log-rank (Mantel-Cox)) com 2/10 remissões completas.
[00574] Para determinar se as bactérias colonizam tumores injetados, bem como tumores distais, camundongos com tumor tratados com AST-104 foram sacrificados e tumores foram coletados. Tumores injetados e distais foram transferidos para tubos M e foram homogeneizados em PBS usando um “gentleMACSTM Dissociator” (Miltenyi Biotec). Homogeneizados do tumor foram diluídos serialmente e plaqueados em placas de ágar LB e incubados a 37°C para determinação de unidades formadoras de colônia (CFU). Como mostrado na Fig. 2, o tumor distal foi colonizado na mesma extensão que o tumor injetado, indicando que as cepas de Salmonella modificadas geneticamente dosada com uma via de administração intratumoral são capazes de transitar e colonizar lesões distais. Esses dados demonstram a potência da administração das bactérias imunoestimulantes por via intratumoral com a habilidade para colonizar sistemicamente lesões tumorais distais preferencialmente em relação a outros órgãos, e a potência de ativação da via de Interferon Tipo I STING, levando à regressão sistêmica do tumor e remissão completa. Exemplo 5 Cepas modificadas de S. typhimurium com plasmídeos que contêm elementos CpG demonstram atividade antitumoral aumentada, comparadas com a cepa parental YS1646
[00575] Receptores Toll-like (TLRs) são receptores cruciais para a percepção de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e ativação de imunidade inata contra patógenos (Akira e cols. (2001) Nat. Immunol. 2 (8): 675- 680). Desses, TLR9 é responsável por reconhecimento de motivos CpG hipometilados em DNA patogênico que não ocorrem naturalmente em DNA de mamíferos (McKelvey e cols. (2011) J.
Autoimmunity 36: 76).
[00576] O reconhecimento de motivos CpG mediante fagocitose de patógenos em endossomos em subconjuntos de células imunes induz sinalização IFR7-dependente de interferon do tipo I e ativa imunidade inata e adaptativa. Foi demonstrado nesse relatório descritivo, que a cepa de S. typhimurium YS1646 que carrega plasmídeos de Salmonella typhimurium modificada que contêm motivos CpG (YS1646 pEQU6 Scramble) ativam similarmente TLR9 e induzem imunidade inata e adaptativa mediada por IFN do tipo I, comparada com a cepa YS1646 sem um plasmídeo.
[00577] Os motivos CpG nos plasmídeos modificados geneticamente usados aqui são mostrados na Tabela 2. O plasmídeo pEQU6 shSCR (shRNA não-cognato) na cepa AST-103 possui 362 motivos CpG, indicando que a liberação de plasmídeo baseada em Salmonella pode ser imunoestimulante e possui um efeito antitumoral, quando comparada com a mesma Salmonella sem transformação com esse plasmídeo. Para avaliar a habilidade de plasmídeos contendo CpG dentro de YS1646 para induzir inibição do crescimento tumoral em um modelo murídeo de carcinoma do cólon, camundongos BALB/c- fêmeas com 6-8 semanas de idade (9 camundongos por grupo) foram inoculados por via subcutânea (SC) no flanco direito com CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV semanalmente com três doses de 5 x 106 CFUs de YS1646 (AST- 100) ou YS1646 contendo um plasmídeo shRNA embaralhado com motivos CpG (AST-103), e comparado com controle de PBS. Tabela 2. Motivos CpG nos plasmídeos modificados geneticamente.
Número de Motivos ID. DE SEQ. Nome da sequência CpG Nº Origem pBR322 80 243 pEQU6 (shSCR) 362 244 Asd Gene ORF 234 242 pATI-2.0 538 245
[00578] Como mostrado na Fig. 3, a cepa YS1646 (AST-100) demonstrou controle modesto do tumor (32% de TGI, p = ns, dia 28), comparado com PBS. A cepa AST-103, que varia de YS1646 apenas pela adição do plasmídeo contendo CpG que codifica um shRNA embaralhado não-cognato, demonstrou inibição altamente significante do crescimento tumoral, comparada com YS1646 isoladamente, não transformada e, portanto, desprovida de um plasmídeo (p = 0,004, dia 32).
[00579] O gene asd possui 234 motivos CpG (Tabela 2), indicando que um plasmídeo que o contém pode ter propriedades imunoestimulantes. Como mostrado na Fig. 16, AST-109 (YS1646-ASD com shRNA embaralhado) teve 51% de inibição do crescimento tumoral vs. PBS isoladamente, indicativo de um forte efeito imunoestimulante.
[00580] Esses dados demonstram as propriedades imunoestimulantes potentes de DNA de plasmídeo contendo motivos CpG que ativam TLR9 dentro de um cepa atenuada de direcionamento a tumores de S. typhimurium. Exemplo 6 Síntese de vetor Complementação da deleção de asd por expressão de asd por plasmídeos
[00581] Um plasmídeo (pATIU6) foi sintetizado quimicamente e montado (ID. DE SEQ. N°: 225). O plasmídeo continha as seguintes características: uma origem de replicação de cópia alta (pUC19), um promotor U6 para dirigir a expressão de um hairpin curto, um gene de resistência à ampicilina flanqueado por sítios de restrição HindIII para remoção subsequente, e o gene asd que contém 85 pares de bases de sequência a montante do códon de início (ID. DE SEQ. N°: 246). Nesse vetor, shRNAs que visam TREX1 murídeo ou uma sequência de shRNA não-cognato, embaralhada, foram introduzidos por digestão de restrição com SpeI e XhoI e ligação e clonagem em E. coli DH5-alfa. Os plasmídeos resultantes, designados pATI-shTREX1 e pATI-shSCR, respectivamente, foram amplificados em E. coli e purificados para transformação na cepa com knockout de asd AST-101 por eletroporação e seleção clonal em placas LB Amp para produzir cepas AST-108, e AST-107, respectivamente. Mutantes asd- complementados com plasmídeos derivados de pATIU6 foram capazes de crescer em ágar LB e meio líquido na ausência de DAP.
[00582] Em uma iteração subsequente, o gene de resistência à ampicilina (AmpR) de pATI-shTREX1 foi substituído com um gene de resistência à canamicina. Isso foi obtido por digestão de plasmídeo pATI-shTREX1 com HindIII, seguido por purificação em gel para remover o gene AmpR. A amplificação por PCR do gene de resistência à canamicina (KanR) usando os iniciadores APR-001 e APR-002 (ID. DE SEQ. N°: 226 e ID. DE SEQ. N°: 227), digestão com HindIII e ligação no plasmídeo purificado em gel, digerido pATIU6. Em iterações subsequentes, uma única mutação pontual foi introduzida no plasmídeo pATIKan na origem de replicação pUC19 usando o kit “Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit” (New England Biolabs) e os iniciadores APR-003 (ID. DE SEQ. N°: 228) e APR-004 (ID. DE SEQ. N°: 229) para trocar o nucleotídeo T na posição 148 para um C. Essa mutação torna a origem de replicação homóloga à origem de replicação pBR322 a fim de reduzir o número de cópias de plasmídeo. ID. do Nº DO iniciador ID. DE Descrição Sequência SEQ. Kan APR-001 AAAAAAGCTTGCAGCTCTGGCCCGTG 226 Iniciador F Kan AAAAAAGCTTTTAGAAAAACTCATCGA 227 APR-002 Iniciador R GCATCAA ATGA pATI ori ACACTAGAAGgACAGTATTTGGTATCT 228 APR-003 T148CF G pATI ori 229 APR-004 T148CR AGCCGTAGTTAGGCCACC pATI2.0
[00583] Foi projetado e sintetizado um plasmídeo que contém as seguintes características: uma origem de replicação pBR322, uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS) de SV40, um terminador rrnB, um promotor U6 para dirigir a expressão de shRNAs, seguido por sítios de restrição flanqueadores para clonagem do promotor e shRNAs ou microRNAs, o gene asd, um terminador rrnG, e um gene de resistência à canamicina flanqueado por sítios HindIII para a cura e um sítio de clonagem múltipla (ID. DE SEQ. N°: 247). Além disso, foi projetado e sintetizado um plasmídeo para expressão de dois shRNA ou microRNAs separados. Esses plasmídeo contém as seguintes características: uma origem de replicação pBR322, uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS) de SV40, um terminador rrnB, um promotor U6 para dirigir a expressão de shRNAs, seguido por sítios de restrição flanqueadores para clonagem do promotor e shRNAs ou microRNAs, um promotor H1 para dirigir a expressão de um segundo shRNA ou microRNA, uma sequência de vedação de 450 bp gerada aleatoriamente colocada entre os promotores H1 e U6, o gene asd, um terminador rrnG e um gene de resistência à canamicina flanqueado por sítios HindIII para a cura e um sítio de clonagem múltipla (ID. DE SEQ. N°: 245). Exemplo 7 Cepa de S. typhimurium modificada geneticamente com knockout de flagelina pela deleção dos Genes fliC e f/jB
[00584] No exemplo nesse relatório descritivo, as cepas de S. typhimurium foram modificadas geneticamente para não possuir ambas as subunidades de flagelina fliC e fljB para reduzir a sinalização pró-inflamatória. As deleções de fliC e fljB foram sequencialmente modificadas geneticamente no cromossomo da cepa com o gene asd deletado YS1646 (AST-101). A deleção de fliC
[00585] Nesse exemplo, fliC foi deletado do cromossomo da cepa AST-101 usando modificações do método de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-6.645 (2000)) como descrito em detalhe no Exemplo 1 e retratado esquematicamente na Fig. 4. Foram ordenadas sequências do braço de homologia sintéticas do gene fliC que continham 224 e 245 bases de sequência homóloga que flanqueiam o gene fliC, clonado em um plasmídeo denominado pSL0147 (ID. DE SEQ. N°: 230). Um cassete do gene de canamicina flanqueado por sítios cre/lox p foi então clonado em pSL0147; o cassete de knockout do gene fliC foi então amplificado por PCR com os iniciadores flic-1 (ID. DE SEQ. N°: 232) e flic-2 (ID. DE SEQ. N°: 233) e purificado em gel e introduzido na cepa AST-101 que carrega o plasmídeo de recombinação sensível à temperatura Lambda Red pKD46 por eletroporação. As células eletroporadas foram recuperadas em meio SOC+DAP e plaqueadas em placas Ágar LB suplementado com canamicina (20 pg/ml) e ácido diaminopimélico (DAP, 50 µg/ml). As colônias foram selecionadas e avaliadas quanto à inserção do fragmento de knockout por PCR usando os iniciadores flic-3 (ID. DE SEQ. N°: 234) e flic-4 (ID. DE SEQ. N°: 235). pKD46 foi então curado por cultivo da cepa resistente à canamicina selecionada a 42°C e avaliado quanto à perda de resistência à ampicilina. O marcador de resistência à canamicina foi então curado por eletroporação de um plasmídeo sensível à temperatura que expressa a Cre recombinase (pJW1680) e colônias AmpR foram selecionadas a 30°C; pJW168 foi subsequentemente eliminado por crescimento de culturas a 42°C. Os clones com knockout de fliC selecionados foram então testados quanto à perda do marcador de canamicina por PCR usando iniciadores que flanqueiam os sítios de ruptura (flic- 3 e flic-4) e avaliação da mobilidade eletroforética em géis de agarose. A deleção de fljB
[00586] fljB foi então deletado na cepa com asd/fliC deletados YS1646 usando modificações dos métodos descritos acima. Sequências do braço de homologia sintéticas do gene fljB que continham 249 e 213 bases da sequência à esquerda e à direita, respectivamente, que flanqueiam o gene fliC,
foram sintetizadas e clonadas em um plasmídeo denominado pSL0148 (ID.
DE SEQ.
N°: 231). Um cassete do gene de canamicina flanqueado por sítios cre/loxP foi então clonado em pSL0148 e o cassete de knockout do gene fljB foi então amplificado por PCR com os iniciadores flajb-1 (ID.
DE SEQ.
N°: 236) e fljb-2 (ID.
DE SEQ.
N°: 237) e purificado em gel e introduzido em AST-101 que carrega o plasmídeo de recombinação sensível à temperatura Lambda Red pKD46 por eletroporação.
O gene de resistência à canamicina foi então curado por recombinação mediada por cre como descrito acima, e os plasmídeos sensíveis à temperatura foram curados por crescimento em uma temperatura não permissiva.
As sequências com knockout dos genes fliC e fljB foram amplificadas por PCR usando os iniciadores flic-3 e flic-4 ou fljb-3 (ID.
DE SEQ.
N°: 238) e fljb-4 (ID.
DE SEQ.
N°: 239), e verificadas por sequenciamento de DNA.
Esse mutante asdifliC-IfljB- derivado de YS1646 foi designado AST-111. Informação de sequência do iniciador.
Nome do Sequência do iniciador ID.
DE SEQ. iniciador Nº flic-1 CGTTATCGGCAATCTGGAGGC 232 flic-2 CCAGCCCTTACAACAGTGGTC 233 flic-3 GTCTGTCAACAACTGGTCTAACGG 234 flic-4 AGACGGTCCTCATCCAGATAAGG 235 fljb-1 TTCCAGACGACAAGAGTATCGC 236 fljb-2 CCTTTAGGTTTATCCGAAGCCAGAATC 237 fljb-3 CACCAGGTTTTTCACGCTGC 238 fljb-4 ACACGCATTTACGCCTGTCG 239 Caracterização in vitro de cepa modificada geneticamente de S. typhimurium com knockout de flagelina
[00587] A cepa mutante asd- derivada de YS1646 que abriga as deleções tanto de fliC quanto de fljB, nesse relatório descritivo referida como AST-111 ou ASD/FLG, foi avaliada quanto à motilidade swimming repicando 10 microlitros de de um dia para as culturas outro em placas swimming (LB contendo 0,3% de ágar e 50 mg/ml de DAP). Embora fosse observada motilidade para YS1646 e para a cepa com asd deletado AST- 101, nenhuma motilidade era evidente com a cepa com asd/fliC/fljB deletado AST-111. A cepa AST-111 foi então eletroporada com pATIshTREX1 (um plasmídeo que contém um gene asd e um shRNA que visa TREX1), para produzir AST-112, e sua taxa de crescimento na ausência de DAP foi avaliada.
Como mostrado na Fig. 5, a cepa ASD/FLG (pATI-shTREX1) AST- 112 foi capaz de replicar em LB na ausência de DAP suplementar, e cresceu em uma taxa comparável com a cepa asd que contém pATIshTREX1 (AST-108). Esses dados demonstram que a eliminação de flagelina não diminui a adequação de S. typhimurium in vitro.
A eliminação de subunidades de flagelina diminui a piroptose em macrófagos.
Para demonstrar isso, 5 x 105 células de macrófagos de camundongo RAW-dualTM (InvivoGen, San Diego, Ca.) foram infectadas com a cepa com asd/fliCAB deletados que abriga um plasmídeo shTREX1 com cópia baixa, designado AST-118, ou a cepa com asd deletado que abriga o mesmo plasmídeo (AST-117) em uma MOI de aproximadamente 100 em um ensaio de proteção de gentamicina.
Após 24 horas de infecção, os sobrenadantes da cultura foram coletados e avaliados quanto à liberação de lactato desidrogenase como um marcador de morte celular usando um “PierceTM LDH Cytotoxicity Assay Kit” (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma.). AST-117 induziu 75% de liberação de LDH máxima, enquanto AST-118 induziu 54% de liberação de LDH máxima, demonstrando que a deleção dos genes de flagelina reduz a piroptose induzida por S. typhimurium. Cepa com knockout de ASD/FLG que contém plasmídeo shTrex1 demonstra atividade antitumoral aumentada, respostas aumentadas de interferon gama e colonização tumoral aumentada em camundongos, comparada com a cepa parental asd.
[00588] Para avaliar o impacta das cepas com knockout de flagelina administradas em um modelo murídeo de carcinoma do cólon, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (10 camundongos por grupo) foram inoculados SC no flanco direito com CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV com três doses por semana de 5 x 106 CFUs da cepa ASD/FLG que contém o plasmídeo pATIKan-shTREX1 (AST- 113) ou a cepa ASD com o mesmo plasmídeo pATIKan-shTREX1 (AST-110), e comparado com o controle de PBS. Seis horas após a primeira dose IV, os camundongos foram sangrados, e plasma foi coletado e avaliado para citocinas pró- inflamatórias usando o kit “Mouse Inflammation Cytometric Bead Array” e analisado por FACS (BD Biosciences).
[00589] Como mostrado na Fig. 6, a cepa AST-113, incapaz de produzir flagelos e que contém o plasmídeo pAT1shTrex1 (ASD/FLG pATI-shTREX1) demonstrou controle aumentado do tumor, comparada com a cepa ASD pATI-shTREX1 parental AST- 110, e controle do tumor significante, comparada com o controle de PBS (54% de TGI, p = 0,02, dia 17).
[00590] Na comparação dos níveis de citocinas séricas sistêmicas em 6 horas pós-injeção IV, as citocinas provocadas pela cepa AST-113 eram comparáveis para TNF-α e IL-6, quando comparada com a cepa parental AST-110, capaz de produzir flagelos. Os níveis da citocina imune antitumoral potente IFN-γ eram significantemente maiores com AST-113, comparada com AST-110, indicando que a cepa deficiente em flagelina pode fornecer potência antitumoral superior em relação à cepa parental com knockout de asd (Fig. 7).
[00591] Em 35 dias pós-implantação do tumor (12 dias após a última dose de terapia com Salmonella modificada geneticamente), três camundongos por grupo foram sacrificados, e os tumores foram homogeneizados e plaqueados em placas LB para enumerar o número de unidades formadoras de colônia (CFUs) por grama de tecido tumoral como descrito acima. Como mostrado na Fig. 8, a cepa AST-113, deletada de fliC e fljB e que contém o plasmídeo pATIshTREX1, foi capaz de colonizar tumores pelo menos tão bem quanto a cepa que só possuía a deleção do gene asd e continha o mesmo plasmídeo (AST-110). AST-113 colonizou tumores com uma média de 1,2 x 107 CFU por grama de tecido, comparada com uma média de 2,1 x 106 CFU/g de tumor para AST-110, indicando que a ausência de flagelina pode levar a uma colonização tumoral aumentada por mais do que 5 vezes que de cepas com flagelos funcionais. Em conjunto, esses dados demonstram que, contrário à expectativa da técnica, não apenas os flagelos não são necessários para colonização tumoral, mas sua perda pode aumentar a colonização tumoral e a imunidade antitumoral. Exemplo 8 S. typhimurium modificada geneticamente para expressar cytoLLO para liberação de plasmídeo aumentada
[00592] Nesse exemplo, a cepa com asd deletado YS1646 descrita no Exemplo 1 (AST-101) foi adicionalmente modificada para expressar a proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora que se acumula no citoplasma da cepa de Salmonella (referida nesse relatório descritivo cytoLLO). LLO é uma citolisina formadora de poros colesterol-dependente que é secretada por Listeria monocytogenes e medeia o escape fagossomal de bactérias. Um gene que codifica LLO, com códons 2-24 deletados, foi sintetizado com códons otimizados para expressão em Salmonella. A sequência do quadro de leitura aberta de cytoLLO está no ID. DE SEQ. N°: 240. O gene de cytoLLO foi colocado sob o controle de um promotor que induz a transcrição em S. typhimurium (ID. DE SEQ. N°: 241, reproduzido abaixo). O cassete de expressão de cytoLLO foi inserido em cópia única no lócus de knockout de asd da cepa com asd deletado AST-101 usando modificações do método de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:
6.640-6.645), como descrito no Exemplo 1. Sequência de promotor que dirige a expressão de cytoLLO
[00593] Attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtataatgcagcaag (ID. DE SEQ. Nº: 241) Promotor de LLO
[00594] A cepa com asd deletado com o cassete de expressão de cytoLLO inserido no lócus asd (referido nesse relatório descritivo ASD/LLO ou AST-114) foi adicionalmente modificada por eletroporação com um plasmídeo pATI que codifica um gene asd que permite que a cepa cresça na ausência de DAP exógeno e seleciona manutenção do plasmídeo, e também contém um promotor U6 que dirige a expressão de shTREX1 como descrito no Exemplo 6 (referido nesse relatório descritivo ASD/LLO (pATI-shTREX1) ou AST-115). Como mostrado na Fig. 9, a cepa ASD/LLO (pATI-shTREX1) AST-115 cresceu em uma taxa comparável à cepa com asd deletado que contém o mesmo plasmídeo (pATI-shTREX1), AST-110, demonstrando que o knockin de LLO não impacta a adequação bacteriana in vitro. S. typhimurium modificada geneticamente para produzir cytoLLO demonstra atividade antitumoral potente
[00595] Para determinar se o knockin do gene cytoLLO fornecia eficácia antitumoral, a cepa ASD/LLO (pATI-shTREX1) AST-115 foi avaliada em um modelo murídeo de carcinoma do cólon. Para esse estudo, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (8 camundongos por grupo) foram inoculados SC no flanco direito com CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV com uma dose única de 5 x 106 CFUs de AST-115, e comparados com controle de PBS.
[00596] Como mostrado na Fig. 10, a adição do gene cytoLLO na cepa asd- ASD/LLO (pATI-shTREX1) demonstrou controle do tumor altamente significante, comparada com o controle de PBS (76% de TGI, p = 0,002, dia 28), e eficácia comparável após uma dose única com estudos prévios nos quais cepas contendo o plasmídeo de shRNA de TREX1 foram dadas em múltiplas doses. Esses dados demonstram a vantagem mediada por cytoLLO da liberação de mais plasmídeo para dentro do citosol, resultando em knockdown maior do gene aumentando, dessa forma, a eficácia terapêutica de RNAi contra alvos como, por exemplo, TREX1. Exemplo 9 Cepas de S. typhimurium auxotróficas para adenosina
[00597] As cepas fornecidas nesse relatório descritivo são modificadas geneticamente para serem auxotróficas para adenosina. Como resultado, elas são atenuadas in vivo, pois são incapazes de replicar nas concentrações baixas de adenosina de tecido normal e, portanto, a colonização ocorre primariamente no microambiente de tumores sólidos, no qual os níveis de adenosina estão elevados. A cepa de Salmonella YS1646 (AST-100) é um derivado da cepa ATCC 14028 do tipo selvagem, e foi modificada geneticamente para ser auxotrófica para purina em função da ruptura do gene purl (Low e cols., (2004) Methods Mol. Med. 90: 47-60). A análise subsequente do genoma inteiro de YS1646 demonstrou que o gene purl (sinônimo com purM) não foi, de fato, deletado, mas, ao invés disso, foi rompido por uma inversão cromossômica (Broadway e cols. (2014) J. Biotechnol. 20: 177-178), e que todo o gene ainda está contido dentro de duas partes do cromossomo YS1646 que é flanqueado por sequências de inserção (uma das quais possui uma transposase ativa). A presença da sequência genética completa do gene purl rompido por meio de um reengajamento cromossômico deixa aberta a possibilidade de reversão para um gene do tipo selvagem. Embora tenha sido demonstrado previamente que a auxotrofia para purina de YS1646 fosse estável após passagem serial in vitro, não estava claro se a taxa de reversão era (Clairmont e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181: 1.996-2.002).
[00598] Foi demonstrado nesse relatório descritivo que, quando fornecido com adenosina, YS1646 é capaz de replicar em meio mínimo; embora a cepa parental do tipo selvagem ATCC 14028 possa crescer em meio mínimo que não é suplementado com adenosina. YS1646 foi desenvolvido de um dia para o outro em meio LB lavado com meio mínimo M9 e diluído em M9 meio mínimo não contendo adenosina, ou concentrações crescentes de adenosina. O crescimento foi medido usando um espectrofotômetro SpectraMax® M3 (Molecular Devices) a 37°C, lendo a OD600 a cada 15 minutos.
[00599] Como mostrado na Fig. 11, a cepa YS1646 era capaz de replicar quando adenosina era fornecida em concentrações que variam de 11 a 300 micromolar, mas era completamente incapaz de replicar em M9 isoladamente ou M9 suplementado com 130 nanomolar de adenosina. Esses dados demonstram que mutantes de purl são capazes de replicar em concentrações de adenosina que são encontradas no microambiente tumoral, mas não em concentrações encontradas em tecidos normais. As cepas modificadas geneticamente auxotróficas de adenosina exemplificadas nesse relatório descritivo incluem cepas nas quais todo, ou porções do quadro de leitura aberta de purl, são deletadas do cromossomo para evitar reversão para o tipo selvagem. Essas deleções de genes podem ser obtidas utilizando o sistema Lambda Red como descrito no Exemplo 1.
[00600] Cepas de Salmonella que contêm uma ruptura de purl, adicionalmente modificadas geneticamente para conter uma deleção do gene asd (ASD) como descrito no Exemplo 1, ou que contêm uma deleção do gene asd adicionalmente modificadas geneticamente para terem deleções de fliC e fljB (ASD/FLG), como descrito no Exemplo 7, ou mutantes asd- adicionalmente modificados geneticamente para expressar cytoLLO (ASD/LLO) como descrito no Exemplo 8, e complementados com um plasmídeo com número de cópias baixo (pATIlow) que expressam asd como descrito no Exemplo 6 (Cepas AST-117, AST-118 e AST-119, respectivamente), também foram avaliadas quanto ao crescimento em meio mínimo M9.
[00601] Os dados na Fig. 12 mostram que cada cepa era capaz de replicar quando adenosina era fornecida em concentrações que variam de 11 a 300 micromolar, mas era completamente incapaz de replicar em M9 isoladamente ou M9 suplementado com 130 nanomolar de adenosina. Exemplo 10 Caracterização e uso de do sistema de complementação do gene asd in vitro Crescimento de Cepas com complementação do gene asd
[00602] Para avaliar a adequação das cepas bacterianas contendo plasmídeos, foram feitas curvas de crescimento em meio líquido LB usando uma leitora de placas Spectramax a 37°C, lendo a OD600 a cada 15 minutos. Como mostrado na Fig. 13, a cepa YS1646, que contém um plasmídeo de cópia baixa pEQU6-shTREX1 (AST-104), cresceu comparavelmente à cepa YS1646, que não continha um plasmídeo (AST-100). Uma mutante da cepa asd- que abriga um plasmídeo shTREX1 com cópia alta com um gene asd que pode complementar a deleção de asd (AST- 110) foi capaz de replicar em LB na ausência de DAP, mas cresceu mais lentamente do que a cepa YS1646. Uma cepa com asd deletado que contém um plasmídeo de expressão shTREX-1 com uma origem de replicação com número de cópias baixo e um gene asd que pode complementar a deleção de asd (pATIlow- shTREX1), cepa AST-117, cresceu em uma taxa mais rápida do que AST-110.
[00603] Esses dados demonstram que plasmídeos com número de cópias baixo que complementam a deleção do gene asd são superiores aos plasmídeos com número de cópias alto, na medida em que permitem taxas de replicação de S. typhimurium in vitro mais rápidas. Crescimento intracelular de cepas asd complementadas
[00604] Para medir a adequação dos mutantes asd- complementados com asd em plasmídeos de cópia alta e baixa, a habilidade de cepas bacterianas para replicar intracelularmente em linhagens de células tumorais de camundongo foi avaliada usando um ensaio de proteção de gentamicina. Nesse ensaio, células de melanoma de camundongo B16.F10 ou células de câncer do cólon de camundongo CT26 foram infectadas com cepas mutantes asd- de Salmonella que contêm plasmídeos que contêm um gene asd complementar e possuem uma origem de replicação de cópia alta, AST-110 (ASD pATI-shTREX1), ou uma origem de replicação de cópia baixa, AST-117 (ASD pATI cópia baixa-shTREX1). As células foram infectadas em uma multiplicidade de aproximadamente 5 bactérias por célula por 30 minutos, e depois as células foram lavadas com PBS, e meio contendo gentamicina foi adicionado para matar bactérias extracelulares. As bactérias intracelulares não são mortas por gentamicina, na medida em que ela não consegue cruzar a membrana celular. Em vários pontos do tempo após infecção, monocamadas de células foram lisadas por choque osmótico com água e os lisados de células foram diluídos e plaqueados em ágar LB para enumerar unidades formadoras de colônia (CFU) sobreviventes.
[00605] Como mostrado na Fig. 14, a cepa mutante asd- complementada com um plasmídeo com cópia alta, AST-110, teve um declínio inicial em CFUs, mas foi capaz de crescer em células B16.F10, mas não em células CT26, demonstrando que o sistema de complementação do gene asd é suficiente para dar suporte ao crescimento dentro de células tumorais de mamíferos. A cepa mutante asd- que contém o plasmídeo com cópia baixa, AST-117, foi capaz de invadir e replicar em ambos os tipos de células, demonstrando que a complementação do gene asd em um plasmídeo com cópia baixa permite crescimento robusto do mutante asd- dentro de células de mamíferos. A cepa com um plasmídeo com cópia baixa replicou até números maiores em ambos os tipos de células tumorais, comparada com a cepa com um plasmídeo com cópia alta. Isso demonstra que cepas de Salmonella com plasmídeos com cópia baixa possuem adequação aumentada em relação às cepas com plasmídeos com cópia alta. Manutenção de plasmídeo em tumores com o uso do sistema de complementação de asd
[00606] Nesse exemplo, camundongos com tumor de CT26 foram tratados com a cepa YS1646 que contém um plasmídeo que expressa um shRNA que visa TREX1 (pEQU6-TREX1), cepa AST- 104, ou uma cepa com asd deletado YS1646 que contém um plasmídeo com um gene asd funcional e um shRNA que visa TREX1 (pATI-shTREX1), cepa AST-110. Em 12 dias após a injeção final de Salmonella, os tumores foram homogeneizados, e os homogeneizados foram diluídos serialmente e plaqueados em placas de ágar LB para enumerar o número total de CFUs presente, ou em placas LB contendo canamicina para enumerar o número de colônias resistentes à canamicina.
[00607] Como mostrado na Fig. 15, S. typhimurium que não teve pressão seletiva para manter o plasmídeo de shRNA, AST- 104, demonstrou perda de plasmídeo, na medida em que o percentual de colônias resistentes à canamicina (KanR) foi menor do que 10%. A cepa que usava o sistema de complementação do gene asd para manutenção do plasmídeo, AST-110, teve números quase idênticos de CFUs resistentes à canamicina e sensíveis à canamicina. Esses dados demonstram que o sistema de complementação do gene asd é suficiente para manter o plasmídeo no contexto do microambiente tumoral em camundongos. Eficácia antitumoral aumentada usando o sistema de complementação de asd
[00608] O sistema de complementação de asd é desenhado para evitar perda de plasmídeo e potencializar a eficácia antitumoral da liberação do inibidor de RNA por cepas de S. typhimurium in vivo. Para testar isso, cepas com asd deletado que contêm o plasmídeo shTREX1 (AST-110) ou controle embaralhado (AST-109) que contém um cassete de gene asd funcional foram comparadas com YS1646 que contém pEQU6- shTREX1 (AST-104, um plasmídeo que não possui um cassete do gene asd e, portanto, não possui um mecanismo para manutenção do plasmídeo) quanto à eficácia antitumoral em um modelo murídeo de carcinoma do cólon. Para esse experimento, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (8 camundongos por grupo) foram inoculados SC no flanco direito com CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV duas vezes, no dia 8 e dia 18, com 5 x 106 CFUs de AST-109 (ASD transformada com pATI-shScramble), AST-110 (ASD transformada com pATI-shTREX1) ou AST-104 (YS1646 transformada com pEQU6- shTREX1) e comparados com controle de PBS.
[00609] Como mostrado na Fig. 16, a cepa YS1646 AST-104 demonstrou controle do tumor, comparada com PBS (70% de TGI, dia 28), apesar de sua perda de plasmídeo demonstrada ao longo do tempo. A cepa asd- que contém o controle embaralhado em um plasmídeo pATI com o sistema de complementação do gene asd (AST-109) demonstrou controle do tumor, comparada com PBS (51% de TGI, dia 25), indicando que a liberação mantida de plasmídeos CpG estimula uma resposta antitumoral. A cepa asd- que contém plasmídeo com o sistema de complementação do gene asd e shTREX1 (AST-110) demonstrou a maior inibição do crescimento tumoral, comparada com PBS (82% de TGI, p = 0,002, dia 25). Esses dados demonstram que é obtida potência aumentada por prevenção de perda de plasmídeo usando o sistema de complementação de asd e liberação de shTREX1, quando comparada com YS1646 que contém plasmídeos sem sistemas de complementação de gene ou shTREX1. Cepas de S. typhimurium com plasmídeos com cópia baixa demonstram eficácia antitumoral e colonização tumoral superiores, comparados com plasmídeos com cópia alta
[00610] A fim de comparar a eficácia antitumoral do plasmídeo shTREX1 com cópia baixa com o sistema de complementação de asd, em relação ao plasmídeo de cópia alta shTREX1 em um modelo murídeo de carcinoma do cólon, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (10 camundongos por grupo) foram inoculados SC no flanco direito com CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV com duas doses por semana de 5 x 106 CFUs de AST-117 (ASD (pATI Low- shTREX1)) ou AST-110 (ASD (pATI-shTREX1) e foram comparados com injeções de PBS como um controle negativo. Como mostrado na Fig. 17, a cepa com o plasmídeo com cópia baixa, AST-117, demonstrou eficácia antitumoral superior, comparada com a cepa com o plasmídeo com cópia alta AST-110 (Alta: 59% de TGI, Baixa: 79% de TGI, p = 0,042, dia 25).
[00611] Ao final desse estudo de inibição do crescimento tumoral, 4 camundongos de cada grupo foram sacrificados, e os tumores e os baços foram homogeneizados como descrito acima para avaliar a colonização tumoral e as proporções de colonização do tumor para o baço. Como mostrado na Fig. 18A, a cepa que contém o plasmídeo com cópia baixa, AST-117, colonizou os tumores em um nível maior do que 100 vezes mais do que a cepa com o plasmídeo com cópia alta, AST-110. Quando a proporção de colônias recuperadas do tumor e baço foi calculada, AST-117 teve uma proporção de colonização do tumor para o baço mais do que 10 vezes maior, comparada com AST- 110 (Fig. 18B), demonstrando que a cepa com o plasmídeo com cópia baixa tinha especificidade maior para colonização tumoral do que a cepa com o plasmídeo com cópia alta. Esses dados demonstram um atributo previamente desconhecido que S. typhimurium modificada geneticamente para liberar plasmídeos que codificam RNAs interferentes possui capacidades de colonização de tumores e eficácia antitumoral aumentadas quando os plasmídeos possuem origens de replicação com número de cópias baixo. Exemplo 11 Modificação por engenharia genética de uma cepa autolítica de S. typhimurium para liberação de RNAi
[00612] Como descrito acima, o gene asd em S. typhimurium codifica aspartato semialdeído desidrogenase. A deleção desse gene torna as bactérias auxotróficas para ácido diaminopimélico (DAP) quando crescidas in vitro ou in vivo. Esse exemplo emprega uma cepa com deleção de asd (descrita no Exemplo 1) que é auxotrófica para DAP e contém um plasmídeo adequado para liberação de RNAi que não contém uma complementação do gene asd, de modo que a cepa é defeituosa para replicação in vivo. Essa cepa é propagada in vitro na presença de DAP e cresce normalmente, e depois é administrada como um agente imunoterapêutico a hospedeiros mamíferos nos quais DAP não está presente, o que resulta em autólise das bactérias. As cepas autolíticas são capazes de invadir células hospedeiras, mas não são capazes de replicar em função da ausência de DAP em tecidos mamíferos; essa combinação de atributos permite o knockdown gênico mediado por RNAi e segurança aumentada em relação às cepas replicantes.
[00613] Nesse exemplo, a cepa com asd deletado YS1646 (AST-101, descrita no Exemplo 1) foi adicionalmente modificada para expressar cytoLLO para gerar a cepa AST-114 (descrita no Exemplo 8), e foi eletroporada para conter um plasmídeo que codifica ARI-203 (um microRNA que visa TREX1), para fazer a cepa AST-120 (ASD/LLO (pEQU6-miTREX1)). Quando essa cepa é introduzida em camundongos com tumor, as bactérias são recolhidas por células hospedeiras e entram no vacúolo que contém Salmonella (SCV). Nesse ambiente, a ausência de DAP impede a replicação, e resulta em lise das bactérias no SCV. A lise de AST-120 permite a liberação do plasmídeo, e a cytoLLO acumulada forma poros na membrana do SVC que contém colesterol, resultando em liberação eficiente do plasmídeo para dentro do citosol da célula hospedeira.
[00614] A habilidade da cepa autolítica AST-120 para replicar em LB na presença ou ausência de DAP foi avaliada usando um espectrofotômetro SpectraMax® M3 (Molecular Devices) a 37°C, lendo a OD600 a cada 15 minutos. Como mostrado na Fig. 19, AST-120 é capaz de crescer robustamente em LB suplementado com 50 µg/ml de DAP, mas não pode replicar em LB isoladamente.
Atenuação aumentada de S. typhimurium autolítica em camundongos Para determinar se a cepa autolítica AST-120, modificada geneticamente para liberar cytoLLO e um microRNA que visa TREX1, foi atenuada para virulência, um estudo de dose letal mediana (LD50) foi realizado.
Doses crescentes de AST-120, que variam de 1 x 106 a 5 x 107 CFUs, foram administradas IV a camundongos C57BL/6 (uma cepa de camundongo que é altamente sensível a LPS). Após administração IV, AST-120 foi bem tolerada em todas as doses com perda de peso transitória observada após uma dose única.
Uma segunda dose foi administrada 7 dias após a primeira dose e um camundongo entre quatro, no maior nível de dose (5 x 107 CFUs), foi encontrado moribundo e precisou ser sacrificado.
Todos os outros camundongos que receberam a administração de AST-120 apresentaram perda de peso transitória, mas se recuperaram.
Esses dados indicam que a LD50 para a cepa autolítica de S. typhimurium que libera um microRNA que visa TREX1 (AST-120) é maior do que 5 x 107 CFUs.
A LD50 para a cepa VNP20009 sabidamente é de aproximadamente 5 x 106 CFUs em camundongos C57BL/6 (Lee e cols. (2000) International Journal of Toxicology 19: 19-25), demonstrando que AST-120 é pelo 10 vezes menos atenuada, comparada com VNP20009. Atividade antitumoral de S. typhimurium autolítica Para determinar se a cepa autolítica AST-120, modificada geneticamente para liberar cytoLLO e um microRNA que visa TREX1, foi capaz de fornecer uma resposta antitumoral, camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade (10 camundongos por grupo) foram inoculados SC no flanco direito com CT26 (2 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV com uma dose única de 5 x 106 CFUs da cepa autolítica AST-120 (ASD/LLO (pEQU6-miTREX1)) e comparados com camundongos tratados com PBS como um controle. Como mostrado na Fig. 20, uma resposta antitumoral foi detectada após apenas uma dose única, comparados com animais tratados com PBS isoladamente (52,4% de TGI, p = 0,02, dia 17). Em conjunto, esses dados demonstram que S. typhimurium modificada geneticamente para ser autolítica por meio de auxotrofia de DAP e modificada geneticamente para conter um plasmídeo para liberação de RNAi que visa TREX1, são perfeitamente atenuadas e podem provocar uma resposta antitumoral. Exemplo 12 Cepas exemplares modificadas geneticamente para tolerabilidade aumentada Deleção de adrA ou csgD
[00615] Nesse exemplo, uma cepa viva atenuada de Salmonella typhimurium que contém uma deleção de purl, uma deleção de msbB, uma deleção do gene asd, e é modificada geneticamente para liberar plasmídeos que codificam RNA interferente, é adicionalmente modificada para deletar adrA, um gene necessário para formação de biofilme por Salmonella typhimurium. Salmonella que não pode formar biofilmes é recolhida mais rapidamente por células fagocíticas do hospedeiro e é depurada mais rapidamente. Esse aumento na localização intracelular aumenta a eficácia de liberação de plasmídeo e knockdown gênico por interferência de RNA. A taxa de depuração aumentada de tumores/tecidos aumenta a tolerabilidade da terapia, e a ausência de formação de biofilme evita a colonização de próteses e vesículas biliares em pacientes. Em outro exemplo, uma cepa viva atenuada de Salmonella typhimurium que contém uma deleção de purl, uma deleção de msbB, uma deleção do gene asd e é modificada geneticamente para liberar plasmídeos que codificam RNA interferente, é adicionalmente modificada para deletar csgD. Esse gene é responsável por ativação de adrA, e também induz expressão das fímbrias curli, um agonista de TLR2. A perda de csgD também evita a formação de biofilme, com o benefício adicional de inibição da ativação de TLR2 reduzindo ainda mais, dessa forma, a virulência bacteriana e aumentando a liberação de RNAi. Deleção de pagP
[00616] Nesse exemplo, uma cepa viva atenuada de S. typhimurium que contém uma deleção de purl, uma deleção de msbB, e uma deleção do gene asd, e é modificada geneticamente para liberar plasmídeos que codificam RNA interferente, é adicionalmente modificada para deletar pagP. O gene pagP é induzido durante o ciclo de vida infeccioso de S. typhimurium e codifica uma enzima que faz a palmitoilação de lipídeo A. Em S. typhimurium do tipo selvagem, a expressão de pagP resulta em um lipídeo A que é hepta-acilado. Em um mutante msbB-, no qual a cadeia acil terminal do lipídeo A não pode ser adicionada, a expressão de pagP resulta em um LPS hexa- acilado. Foi demonstrado que LPS hexa-acilado é o mais pró- inflamatório.
[00617] Nesse exemplo, uma cepa deletada de pagP e msbB pode produzir somente LPS penta-acilado, permitindo menos citocinas pró-inflamatórias, tolerabilidade aumentada, imunidade adaptativa aumentada quando as bactérias são modificadas geneticamente para liberar RNAs interferentes. Deleção de hilA
[00618] Nesse exemplo, uma cepa viva atenuada de Salmonella typhimurium que contém uma deleção de purl, uma deleção de msbB, e uma deleção do gene asd, e é modificada geneticamente para liberar plasmídeos que codificam RNA interferente, é adicionalmente modificada para deletar hilA. hilA é um gene regulador que é necessário para a expressão do sistema de secreção do tipo 3 (T3SS) associado à ilha de patogenicidade de Salmonella 1 (SPI-1). Esse sistema de secreção é responsável por injeção de proteínas efetoras dentro do citosol de células hospedeiras não fagocíticas, por exemplo, células epiteliais, que causam a captação de S. typhimurium modificada. Foi demonstrado que o SPI-1 T3SS é essencial para o cruzamento da camada epitelial do intestino, mas é dispensável para infecção quando bactérias são injetadas parenteralmente. A injeção de algumas proteínas e do próprio complexo em agulha também pode induzir ativação de inflamassoma e piroptose de células fagocíticas. Essa morte celular pró-inflamatória pode limitar a iniciação de uma resposta imune adaptativa robusta por indução direta da morte de células apresentadoras de antígeno (APCs), bem como modificação do meio de citocina para evitar a geração de células T de memória. Nesse exemplo, a deleção adicional dp gene hilA de uma cepa terapêutica de Salmonella typhimurium que é administrada por via intravenosa ou por via intratumoral concentra a infecção por Salmonella typhimurium contra células fagocíticas que não necessitam do SPI-1 T3SS para captação, e depois prolonga a longevidade dessas células fagocíticas. A mutação de hilA reduz a quantidade de citocinas pró-inflamatórias, aumentando a tolerabilidade da terapia, bem como a qualidade da resposta imune adaptativa. Exemplo 13 Mutantes de deleção de HilA crescem normalmente in vitro.
[00619] O gene hilA foi deletado da cepa YS1646 de S. typhimurium com o gene asd deletado, e a cepa YS1646 deletada de asd, e os genes de flagelina fljB e fliC, usando o sistema de recombinação Red derivado de lambda como descrito em Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-
6.645 (2000)) para fazer as cepas HilA/ASD e HilA/FLG/ASD, respectivamente. Essas cepas foram então eletroporadas com um plasmídeo que contém um gene asd funcional (para complementar o gene asd deletado e para assegurar manutenção do plasmídeo in vivo) e um cassete de expressão eucariótica contendo o promotor U6 que dirige a expressão de um microRNA que visa TREX-1 murídeo (pATI-miTREX1). As taxas de crescimento in vitro de cepas HilA/ASD (pATI-miTREX1) e HilA/FLG/ASD (pATI-miTREX1) foram então determinadas e comparadas com as cepas ASD (pATI-miTREX1) e YS1646 a 37°C em caldo LB, como medido por OD600 usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices). Cada cepa modificada cresceu em uma taxa comparável com a cepa parental YS1646 in vitro, indicando que a deleção de hilA não reduz a adequação das bactérias in vitro. Exemplo 14 Mutantes de deleção de HilA induzem menos morte celular em células monocíticas humanas
[00620] Para avaliar se um mutante de deleção de hilA induzia menos piroptose do que cepas capazes de produzir SPI-1, células monocíticas THP-1 humanas foram infectadas com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1.000 bactérias com cepas YS1646, ASD (pATI-miTREX1), FLG/ASD (pATI-miTREX1) e HilA/ASD (pATI-miTREX1). Após 1 hora de infecção, as bactérias extracelulares foram removidas e o meio foi substituído com meio contendo gentamicina a 100 µg/ml para matar bactérias extracelulares. Em 4 horas pós-infecção, as células foram colhidas e a viabilidade das células THP-1 foi avaliada usando captação de reagente CellTiter-Glo (Promega) e medição da luminescência usando uma leitora de placas de 96 poços Spectramax (Molecular Devices). Embora a infecção com YS1646 tenha resultado em 86% de morte celular, a infecção com HilA/ASD (pATI-miTREX1) só resultou em 46% de morte celular. O % de células mortas para as cepas ASD (pATI- miTREX1) e FLG/ASD (pATI-miTREX1) demonstrou fenótipos intermediários com 77% e 68% de morte celular, respectivamente. Esses dados demonstram que cepas com hilA deletado induzem menos morte celular em células monocíticas humanas do que cepas de S. typhimurium capazes de expressar SPI-1. Exemplo 15 Mutantes de deleção de HilA possuem capacidade reduzida para infectar células epiteliais humanas
[00621] Células HeLa foram infectadas com uma multiplicidade de infecção de 500 bactérias com cepas YS1646, ASD (pATI-miTREX1), FLG/ASD (pATI-miTREX1) e HilA/ASD (pATI- miTREX1). Após 1 hora, as bactérias extracelulares foram removidas e o meio foi substituído com meio contendo gentamicina a 100 µg/ml para matar bactérias extracelulares.
Em 4 horas pós-infecção, as células foram colhidas e lisadas por choque osmótico, e os números de unidades formadoras de colônia de bactérias viáveis foram enumerados por diluição serial e plaqueamento em placas de ágar LB. 4,6 x 103 CFUs por poço foram recuperadas com YS1646, e somente 2,0 x 102 CFUs foram recuperadas com a cepa HilA/ASD (pATI-miTREX1). As cepas ASD (pATI-miTREX1) e FLG/ASD (pATI-miTREX1) demonstraram fenótipos intermediários com 8,0 x 102 CFUs e 6,0 x 102 CFUs recuperadas, respectivamente. Esses dados demonstram que cepas com hilA deletado induzem menos captação em células epiteliais humanas do que cepas de S. typhimurium capazes de expressar SPI-1. Exemplo 16 Mutantes de deleção de PagP possuem LPS penta-acilado e induzem citocinas inflamatórias reduzidas
[00622] O gene pagP foi deletado da cepa de S. typhimurium com gene asd deletado YS1646 (que contém uma deleção de purl/M e msbB), usando o sistema de recombinação Red derivado de lambda como descrito em Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-6.645 (2000)) para gerar a cepa PagP/ASD. Essa cepa foi então eletroporada com um plasmídeo que contém um gene asd funcional (para complementar o gene asd deletado e para assegurar manutenção do plasmídeo in vivo) e um cassete de expressão eucariótica contendo o promotor U6 que dirige a expressão de um microRNA que visa TREX-1 murídeo (pATI-miTREX1) para gerar a cepa PagP/ASD (pATI-miTREX1). O Lipídeo A foi então extraído dessa cepa e avaliado por espectrometria de massa por Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-MS) e comparada com cepa de S.
typhimurium do tipo selvagem ATCC 14028, cepa YS1646 (que é deletada para msbB e purM), e cepa YS1646 deletada para o gene asd e complementada com o plasmídeo pATI-miTREX1. Salmonella do tipo selvagem tinha um pico menor de lipídeo A com uma massa de 2.034, e um pico principal com uma massa de 1,796, que corresponde às espécies hepta-aciladas e hexa- aciladas, respectivamente, em decorrência da presença de genes msbB e purM funcionais. As cepas com msbB deletado YS1646 e ASD (pATI-miTREX1) tiveram picos principais em 1.828 e 1.585, que correspondem a uma mistura de LPS hexa-acilado e penta-acilado. A cepa com msbB e pagP deletados, PagP/ASD (pATI-TREX1), só tinha um único pico com uma massa de 1.585. Esses dados demonstram que a deleção de pagP evita a palmitoilação do LPS restringindo-a, dessa forma, a uma única espécie penta-acilada.
[00623] Para determinar se o LPS penta-acilado das cepas mutantes de pagP reduzia a sinalização de TLR-4, 4 µg de LPS purificado das cepas descritas acima foram adicionados às células monocíticas THP-1 humanas, e os sobrenadantes foram avaliados 24 horas mais tarde quanto à presença de citocinas inflamatórias usando um kit de arranjo citométrico de glóbulos (CBA) (BD Biosciences). O LPS da cepa PagP- induziu 1/4 da quantidade de TNF-alfa, comparado com LPS do tipo selvagem, e 7 vezes menos IL-6 do que o tipo selvagem. O LPS mutante pagP- induziu 22 vezes menos IL-6 do que YS1646, demonstrando que a espécie de LPS penta-acilada de um mutante pagP- é significantemente menos inflamatória em células humanas, e indicando que o mutante pagP- seria mais bem tolerado em humanos. Exemplo 17
Mutantes de deleção de FLG, HilA e PagP são mais atenuadas do que a cepa YS1646 em camundongos Para determinar se as cepas modificadas descritas acima são mais atenuadas do que a cepa YS1646, foi realizado um estudo de dose letal mediana (LD50). Camundongos C57BL/6 foram injetados por via intravenosa com concentrações crescentes de cepas YS1646, FLG/ASD (pATI-TREX1), HilA/ASD (pATI-TREX1) ou PagP/ASD (pATI-TREX1). Foi verificado que a LD50 para a cepa YS1646 é de 1,6 x 106 CFUs, o que é consistente com relatos publicados dessa cepa.
A LD50 para a cepa HilA/ASD (pATI-TREX1) foi determinada como sendo de 5,3 x 106 CFUs, demonstrando uma redução de 3 vezes na virulência.
A LD50 para a cepa PagP/ASD (pATI-TREX1) foi determinada como sendo de 6,9 x 106 CFUs, demonstrando uma redução de 4 vezes na virulência.
A LD50 para a cepa FLG/ASD (pATI-TREX1) foi determinada como sendo > 7 x 106 CFUs, demonstrando uma redução de > 4,4 vezes na virulência, comparada com a cepa YS1646. Esses dados indicam que as modificações genéticas descritas acima reduzem a virulência da terapia com S. typhimurium e levarão à tolerabilidade aumentada em humanos.
No experimento clínico de Fase I de VNP20009 (Toso e cols. (2002) J.
Clin.
Oncol. 20 (1): 142- 152), a presença das bactérias em tumores de pacientes só foi observada parcialmente nas duas maiores doses testadas, 3E8 CFU/m2 (33% de presença) e 1E9 CFU/m2 (50% de presença), indicando que a dose tolerável de VNP20009 era muito baixa para obter colonização.
Por aumento da tolerabilidade das cepas por meio das modificações descritas acima, podem ser administradas doses maiores do que VNP20009. Isso aumenta tanto a percentagem de pacientes que terão seus tumores colonizados, quanto o nível de colonização terapêutica por tumor. Exemplo 18 Mutantes de deleção de HilA demonstram atividade antitumoral significante em camundongos e atividade comparável aos mutantes de deleção de fljB/fliC
[00624] A mutação hilA- deve evitar a supra-regulação do T3SS, e evitar morte celular piroptótica de macrófagos infectados. Isso deve aumentar a tolerabilidade e eficácia antitumoral das cepas-alvo que contêm plasmídeo in vivo. Para testar isso, cepas AhilA/Aasd que contêm o plasmídeo miTREX1 (HilA/ASD (pATI-miTrex1)) ou controle de veículo foram comparadas com cepas AfljB/ AfliC/ Aasd que contêm o plasmídeo miTREX1 (FLG/ASD (pATI-miTrex1)) quanto à eficácia tumoral em um modelo murídeo de carcinoma do cólon. Camundongos C57BL/6-fêmeas com 6-8 semanas de idade (9 camundongos por grupo) foram inoculados S.C. no flanco direito com MC38 (5 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados I.V. no dia 8 com 3 x 105 CFUs de cepas HilA/ASD (pATI-miTrex1), FLG/ASD (pATI-miTrex1) ou controle de veículo de PBS. Os pesos corporais e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada 1/2(comprimento x largura). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC. Os dados demonstram que a cepa HilA/ASD (pATI-miTrex1) induz controle potente do tumor,
comparada com PBS (83,6% de TGI, dia 25), incluindo 1/9 regressões completas do tumor. Esses dados eram comparáveis como aqueles observados com a cepa FLG/ASD (pATI-miTrex1), comparada com PBS (82,8% de TGI, dia 25). Dessa forma, a cepa AhilA fornece potência comparável ou maior em um modelo de tumor murídeo que a cepa AfljB/AfliC. Exemplo 19 Mutantes de deleção HilA demonstram citocinas sistêmicas significantemente menores do que a cepa parental VNP20009, e colonização aumentada comparada com os mutantes de deleção fljB/fliC
[00625] Para testar o impacto das cepas AhdA/Aasd e AfljB/AfliC/Aasd sobre a colonização tumoral e tolerabilidade, comparada com a cepa parental VNP20009. Essas cepas, que contêm o plasmídeo miTREX1, foram avaliadas em um modelo murídeo de carcinoma do cólon. Camundongos C57BL/6-fêmeas com 6-8 semanas de idade (3 camundongos por grupo) foram inoculados S.C. no flanco direito com células MC38 (5 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados I.V. no dia 8 com 3 x 105 e 1 x 105 CFUs de HilA/ASD (pATI-miTrex1), FLG/ASD (pATI-miTrex1), VNP20009 ou controle de veículo de PBS. Os camundongos foram sangrados 2 horas pós-dosagem, e o soro avaliado quanto às citocinas sistêmicas por um arranjo citométrico de glóbulos para inflamação em camundongos (BD Biosciences) em um citômetro de fluxo (Novocyte). No dia 3 pós-dosagem I.V., os camundongos foram sacrificados, e os tumores, baços e fígados foram colhidos e pesados. Os tecidos foram homogeneizados em 10 ml PBS estéril (tubos M, GentleMacs, Miltenyi Biotec), e depois diluições seriais de
10 vezes foram realizadas e plaqueadas em placas de ágar LB (Caldo Luria) contendo LB + canamicina (Sigma). No dia seguinte, unidades formadoras de colônia (CFUs) foram contadas e CFUs totais foram avaliadas por grama de tecido.
[00626] Foi demonstrado que os níveis séricos de citocina de IL-6 em camundongos consistem no correlato mais preciso de tolerabilidade clínica. Os níveis de IL-6 de VNP20009 na dose de 3e5 CFU teve média de 11,755 pg/ml, comparados com o nível de base 18 pg/ml de controle de PBS. Os níveis de IL-6 de HilA/ASD (pATI-miTrex1) e FLG/ASD (pATI-miTrex1) na dose de 3e5 CFU foram, ambos, significantemente menores do que os níveis de VNP20009 (3,570 pg/ml e 3,850 pg/ml, respectivamente). Esses dados demonstram a tolerabilidade significantemente aumentada das cepas mutantes, comparadas com a cepa parental VNP20009. A comparação da colonização de tumores, baços e fígados 3 dias pós-dosagem I.V. de 1e5 CFU, a colonização global dos baços entre HilA/ASD (pATI-miTrex1) e FLG/ASD (pATI-miTrex1) era comparável (HilA: 2,1e4 CFU/g, vs. FLG: 1,2e4 CFU/g), enquanto a cepa FLG/ASD (pATI-miTrex1) teve colonização um pouco menor no fígado (HilA: 7,4e3 CFU/g, vs. FLG: 1,5e3 CFU/g). Foi demonstrado que a colonização tumoral da cepa HilA/ASD (pATI-miTrex1) está em uma média de 2,6e4 CFU/g, que era significantemente maior do que os níveis indetectáveis encontrados nos tumores de FLG/ASD (pATI- miTrex1) no mesmo ponto do tempo. Esses dados demonstram as propriedades de alto grau de tolerabilidade e colonização tumoral aumentada da cepa AhilA/Aasd. Exemplo 20 Cepas moduladores imunes de S. typhimurium demonstram expressão de proteínas heterólogas em monócitos humanos
[00627] Como descrito acima, o gene hilA e os genes de flagelina fljB e fliC foram deletados da cepa YS1646 de S. typhimurium com o gene asd deletado, gerando as cepas HilA/ASD e FLG/ASD, respectivamente. Além disso, a cepa FLG/ASD foi adicionalmente modificada para expressar a proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora (cytoLLO) que se acumula no citoplasma da cepa de Salmonella (FLG/ASD/cLLO). Essas cepas foram eletroporadas com um plasmídeo que contém um cassete de expressão para o promotor EF1a e a citocina IL-2 murídea (muIL-2). Além disso, a cepa FLG/ASD foi eletroporada com um plasmídeo de expressão para IL-156 como um controle para uma citocina não-cognata. Foram criadas construções adicionais usando o promotor de CMV.
[00628] Para determinar se essas cepas que contêm plasmídeos de expressão poderiam infectar monócitos humanos e induzir a produção de IL-2 murídea, células monocíticas THP-1 humanas foram plaqueadas a 50.000 células/poço em RPMI (Corning) + Soro Nu 10% (Gibco) um dia antes da infecção. As células foram infectadas em uma MOI de 50 por uma hora em RPMI, e depois lavadas 3 vezes com PBS, e ressuspensas em RPMI + 100 µg/ml de Gentamicina (Sigma). Os sobrenadantes foram coletados 48 horas mais tarde de uma placa de 96 poços e avaliados quanto à concentração de IL-2 murídea por ELISA (R&D Systems). Foi constatado que a concentração de IL-2 detectada nos poços de controle de FLG/ASD-IL156 é muito baixa, como esperado, e provavelmente reflete alguma reatividade cruzada para IL-2 humana endógena (6,52 pg/ml). Em contraste, a cepa FLG/ASD-IL-2 induziu uma média de 35,1 pg/ml de IL-2, e uma concentração ainda maior de IL-2 foi medida com a cepa FLG/ASD/cLLO, 59,8 pg/ml. Os maiores níveis foram detectados na cepa HilA/ASD-IL-2, 103,4 pg/ml. Esses dados demonstram a praticabilidade da expressão e secreção de proteínas heterólogas funcionais, por exemplo, IL-2, das cepas da plataforma moduladora imune de S. typhimurium. Exemplo 21 Infecção celular com mutante AhilA leva a menos infecção de célula epitelial humana
[00629] Para demonstrar que cepas de S. typhimurium com hilA deletado são reduzidas em sua habilidade para infectar células epiteliais, células de carcinoma cervical HeLa foram infectadas com as seguintes cepas de S. typhimurium: YS1646, YS1646 Aasd e YS1646 Aasd/AhilA, que contêm plasmídeos que codificam um gene asd funcional para manutenção do plasmídeo. 1 x 106 células HeLa foram colocadas em uma placa de 24 poços com DMEM e FBS 10%. As células foram infectadas com culturas em fase log de S. typhimurium por 1 hora, e depois as células foram lavadas com PBS e o meio foi substituído com meio contendo 50 pg/ml de gentamicina para matar bactérias extracelulares. Após 4 horas, as monocamadas de células HeLa foram lavadas com PBS e lisadas com Triton 1% X 100 tampão de lise para liberar bactérias intracelulares. Os lisados foram diluídos serialmente e plaqueados em placas de ágar LB para quantificar o número de bactérias intracelulares. A cepa com a deleção hilA teve uma redução de 90% em CFUs recuperadas, comparada com as cepas com um gene hilA funcional, demonstrando que a deleção de hilA diminui significantemente a infecção por S. typhimurium de células de derivação epitelial. Exemplo 22
Infecção celular com mutantes AhilA ou AfljB/AfliC leva a menos piroptose em macrófagos humanos
[00630] Para demonstrar que cepas de S. typhimurium AhilA ou AfljBI AfliC são reduzidas em sua habilidade para causar morte celular em macrófagos, células de macrófagos humanos THP-1 foram infectadas com as seguintes cepas de S. typhimurium: YS1646, YS1646 Aasd, YS1646 Aasdl AfljBI AfliC e YS1646 Aasd/AhilA, que contêm plasmídeos que codificam um gene asd funcional para assegurar manutenção do plasmídeo. 5 x 104 células foram colocadas em uma placa de 96 poços com DMEM e FBS 10%. As células foram infectadas com culturas lavadas em fase log de S. typhimurium por 1 hora em uma MOI de 100 CFUs por célula, e depois as células foram lavadas com PBS, e o meio foi substituído com meio contendo 50 pg/ml de gentamicina para matar bactérias extracelulares, e 50 ng/ml de interferon gama. Após 24 horas, as células THP-1 foram coradas com reagente CellTiter-Glo® (Promega), e a percentagem de células viáveis foi determinada usando um ensaio luminescente de viabilidade celular usando uma leitora de placas Spectramax para quantificar a luminescência. As células infectadas com a cepa de deleção de hilA tiveram aproximadamente 72% de células viáveis, enquanto as células infectadas por YS1646 tiveram apenas 38% de viabilidade, demonstrando que a deleção de hilA evita a morte celular de macrófagos humanos. As células infectadas com as cepas que contêm plasmídeo YS1646 Aasd e YS1646 Aasdl AfljBI AfliC tiveram 40% e 51% de viabilidade, respectivamente, indicando que a deleção dos genes de flagelina também evitou a morte celular de macrófagos humanos.
Exemplo 23 Infecção de macrófagos humanos com uma cepa imunoestimulante de S. typhimurium que contém um plasmídeo que codifica um cassete de expressão de IL-2 leva à secreção de IL-2
[00631] Macrófagos humanos THP-1 foram infectados com as seguintes cepas de S. typhimurium: YS1646 Aasd/AfljB/AfliC, YS1646 Aasd-cytoLLO, e YS1646 Aasdl AhilA, que contêm plasmídeos que codificam um cassete de expressão para IL-2 murídea sob um promotor eucariótico, e um gene asd funcional para assegurar manutenção do plasmídeo. 5 x 104 células foram colocadas em uma placa de 96 poços com DMEM e FBS 10%. As células foram infectadas com culturas lavadas em fase log de S. typhimurium por 1 hora em uma MOI de 50 CFUs por célula, e depois as células foram lavadas com PBS e o meio foi substituído com meio contendo 50 µg/ml de gentamicina para matar bactérias extracelulares. Após 48 horas, os sobrenadantes celulares foram removidos e testados para IL- 2 murídea usando um “R&D SystemsTM Mouse IL-2 Quantikine ELISA Kit”. As células restantes foram coradas com reagente CellTiter-Glo® (Promega), e a percentagem de células viáveis foi determinada usando um ensaio luminescente de viabilidade celular usando uma leitora de placas Spectramax para quantificar a luminescência. As cepas YS1646 Aasd/AfljB/AfliC, YS1646 Aasd-cytoLLO, e YS1646 Aasdl AhilA, que contêm plasmídeos que codificam um cassete de expressão for IL-2 murídea, expressaram 35 pg/ml, 60 pg/ml e 103 pg/ml de IL-2, respectivamente. Exemplo 24 Cepas de S. typhimurium que expressam IL-2 murídea demonstram inibição potente do crescimento tumoral in vivo
[00632] As cepas imunoestimulantes de S. typhimurium que contêm deleções em hilA ou os genes de flagelina fljB e fliC na cepa YS1646 de S. typhimurium foram combinadas com a deleção do gene asd para formar as cepas YS1646 Aasdl AMA e YS1646 Aasd/AfljB/AfliC, respectivamente. Essas cepas foram eletroporadas com um plasmídeo que contém um cassete de expressão para o promotor EF1a e a citocina IL-2 murídea.
[00633] Para mostrar que as cepas de S. typhimurium que contêm os plasmídeos de expressão de IL-2 induzem eficácia antitumoral, as cepas que contêm o plasmídeo muIL-2, ou as cepas Aasd/AfljB/AfliC que contêm o plasmídeo muIL-2, foram comparadas com controle de veículo. Camundongos C57BL/6- fêmeas com 6-8 semanas de idade (5 camundongos por grupo) foram inoculados S.C. no flanco direito com células MC38 (5 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos no flanco foram injetados IV no dia 8 com 5 x 105 CFUs de Aasdl AhdA (pATI-muIL-2), Aasd/AfljB/AfliC (pATI- muIL-2) ou controle de veículo de PBS. Os pesos corporais e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Foram realizadas medições do tumor usando paquímetros eletrônicos (Fowler, Newton, MA). O volume do tumor foi calculado usando a fórmula elipsóide modificada, 1/2(comprimento x largura). Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor alcançava > 20% do peso corporal ou se tornasse necrótico, de acordo com as regulamentações da IACUC.
[00634] O experimento demonstrou que a cepa Aasdl AhdA (pATI-muIL-2) provocou controle do tumor significante, comparada com PBS (P = 0,003, dia 21). Esses dados eram comparáveis como aqueles observados com a cepa
Aasd/AfljB/AfliC (pATI-muIL-2), que também demonstrou inibição significante do crescimento tumoral, comparada com PBS (P = 0,005, dia 21). Dessa forma, ambas as cepas demonstram a habilidade de IL-2 expressa para inibir potentemente a inibição do crescimento tumoral em um modelo de carcinoma cólon-retal. Exemplo 25 Cepas page, fljB-/fliC- e pagP/fljB/fliC demonstram viabilidade significantemente maior no soro humano comparadas com VNP20009 (YS1646)
[00635] Como descrito nesse relatório descritivo, VNP20009 (YS1646) exibe colonização tumoral limitada em humanos após administração sistêmica. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que VNP20009 é inativada por fatores do complemento no sangue humano. Para que isso seja demonstrado, as cepas YS1646 e E. coli D10B foram comparadas com bactérias imunoestimulantes exemplares fornecidas nesse relatório descritivo que contêm mutações adicionais que alteram a superfície das bactérias. Essas cepas foram YS1646 (pagP), YS1646 (fljB-/fliC) e YS1646 (pagP-/fljB-/fliC). Essas três cepas, além de culturas de YS1646 e E. coli D10B, foram incubadas com soro ou soro inativado por aquecimento (HI) do pool de sangue de camundongo ou pool de sangue de doadores humanos saudáveis (n = 3), por 3 horas a 37°C. Após incubação com soro, as bactérias foram diluídas serialmente e plaqueadas em placas de ágar LB, e as unidades formadoras de colônia (CFUs) foram medidas.
[00636] No soro de camundongo, todas as cepas permaneceram 100% viáveis e eram completamente resistentes à inativação de complemento. No soro humano, todas as cepas eram 100% viáveis no soro inativado por aquecimento. A cepa de E. coli D10B foi completamente eliminada após 3 horas em soro humano total. A cepa YS1646 exibiu somente 6,37% de colônias vivas, demonstrando que a colonização tumoral da cepa clínica YS1646 era limitada em decorrência da inativação de complemento no sangue humano. Para a cepa YS1646 (cepa fljB-/flin, 31,47% de colônias vivas permaneceram, e para a cepa YS1646 (pagP), 72,9% de colônias vivas permaneceram, após incubação com soro humano por 3 horas. A cepa combinada YS1646 (pagP-/fljB-/flin foi completamente resistente ao complemento no soro humano.
[00637] Esses dados explicam por que VNP20009 teve colonização tumoral muito baixa quando administrada sistemicamente. Foi demonstrado nesse relatório descritivo que VNP20009 (YS1646) é altamente sensível à inativação de complemento no soro humano, mas não soro de camundongo. Esses dados explicam por que foi observada colonização tumoral limitada em humanos, enquanto tumores em camundongos foram colonizados em um nível elevado. As deleções fljBAC ou pagP, ou a combinação dessas mutações, resgatam parcialmente ou completamente esse fenótipo. Dessa forma, a estabilidade aumentada observada no soro humano com as cepas de deleção fljBAC, pagP, ou pagP/fljB/fliC fornece colonização aumentada de tumores humanos. Esses dados e outros fornecidos nesse relatório descritivo (veja, por exemplo, os Exemplos 7, 16 e 17, acima) mostram que a deleção dos flagelos e/ou pagP aumenta a colonização tumoral, aumenta a tolerabilidade e aumenta a atividade antitumoral das bactérias imunoestimulantes.
[00638] O Exemplo 16 demonstra que LPS de bactérias imunoestimulantes que são pagP- induziu 22 vezes menos IL-6 do que LPS de YS1646 e, portanto, bactérias pagP- são menos inflamatórias em células humanas. O Exemplo 17 demonstra que cada um e todos os mutantes de deleção de FLG, HilA e PagP são mais atenuados do que YS1646.
[00639] Bactérias imunoestimulantes, por exemplo, cepas de Salmonella, incluindo cepas do tipo selvagem, que são uma ou ambas de flagelina- e pagP- exibem propriedades que aumentam a colonização do tumor/microambiente tumoral e aumentam a atividade antitumoral. Essas cepas podem ser usadas para liberar uma carga terapêutica, por exemplo, um produto imunoterapêutico e/ou outro produto antitumoral, e também podem incluir modificações que aprimoram as propriedades terapêuticas, por exemplo, deleção de hilA, e/ou msbB, auxotrofia de adenosina, e outras propriedades como descritas em outra parte nesse relatório descritivo. As cepas resultantes são mais eficazmente direcionadas ao tumor/microambiente tumoral, em virtude das modificações que alteram a infectividade, toxicidade para certas células, e exigências nutricionais, por exemplo, auxotrofia para purinas, que são fornecidas no ambiente tumoral. Exemplo 26 Cepas bacterianas imunoestimulantes fljB-/fliC- demonstram colonização célula mielóide-específica de tumores in vivo
[00640] Os genes asd e de flagelina (fljB/fliC) foram deletados da cepa YS1646, que é purl- ImsbB-, usando o sistema de recombinação Red derivado de lambda como descrito previamente (veja, Datsenko e Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6.640-6.645), para gerar a cepa YS1646 AFLG/AASD. A Cepa YS1646 AFLG/AASD foi então transformada por eletroporação com o plasmídeo bacteriano pRPSM-mCherry, que contém: 1) um cassete de expressão asd funcional para complementar a deleção cromossômica de asd para manutenção do plasmídeo in vivo, e 2) um cassete de expressão constitutiva de mCherry sob o controle do promotor bacteriano rpsm (rpsm-mCherry). Colônias bacterianas transformadas com esse plasmídeo tinham cor visivelmente vermelha, em função da expressão da proteína fluorescente vermelha mCherry.
Para avaliar a colonização tumoral, a cepa bacteriana transformada (YS1646 AFLG/AASD (pRPSM-mCherry)) foi testada in vivo em um modelo murídeo de carcinoma do cólon.
Camundongos C57BL/6-fêmeas com 6-8 semanas de idade (3 camundongos por grupo) foram inoculados por via subcutânea no flanco direito com células MC38 (5 x 105 células em 100 µl de PBS). Camundongos com tumores estabelecidos, grandes, no flanco, foram injetados por via intravenosa com 1 x 106 CFUs de YS1646 AFLG/AASD (pRPSM-mCherry). Os tumores foram colhidos 3 dias mais tarde e dissociados em uma suspensão de célula única (Miltenyi Biotec). As células foram coradas com corante de viabilidade fixável Zombie AquaTM (BioLegend), que penetra em células mortas, mas não em células vivas.
As células foram incubadas com os seguintes anticorpos: anti- CD45 de camundongo Brilliant Violet 510TM (clone 30-F11, BioLegend); anti-CD8a de camundongo Brilliant Violet 421TM (clone 53-6.7, BioLegend); PE anti-camundongo CD3c (clone 145-2C11, BioLegend); FITC anti-CD4 de camundongo (clone RM4-5, BioLegend); anti-CD11b de camundongo/humana PE/Cy7 (clone M1/70, BioLegend); anti-Ly6C de camundongo Brilliant Violet 785TM (clone HK1.4, BioLegend); anti-Ly6G de camundongo Brilliant Violet 605TM (clone 1A8, BioLegend); APC anti-F4/80 de camundongo (clone BM8, BioLegend); e anti-CD24 de camundongo PercP/Cy5.5 (clone M1/69, Biolegend). As células foram então separadas por citometria de fluxo (Novocyte) usando os vários marcadores de superfície e mCherry+ (PE Texas Red), para determinar/localizar captação bacteriana pelas células colhidas.
[00641] Células CD45-, que incluem células estromais e tumorais, não demonstraram colonização bacteriana detectável, com 0,076% de células sendo positivas para mCherry, comparado com um nível de coloração basal de 0,067%. Células mielóides infiltrantes no tumor CD45+ eram positivas para mCherry, com 7,27% de monócitos, 3,33% de células dendríticas (DCs) e 8,96% de macrófagos sendo positivos para mCherry, indicando captação das bactérias YS1646 AFLG/AASD (pRPSM-mCherry). Uma cepa de controle, contendo flagelos intactos, foi testada em paralelo. Diferentemente da cepa AFLG, a cepa de controle flagelina+ infectou células CD45-, com 0,36% das células CD45- sendo positivas para mCherry, o que era 5,37 vezes maior do que a coloração basal (0,067%). A cepa de controle flagelina+ também infectou populações mielóides CD45+, com 5,71% de monócitos, 5,56% de DCs e 9,52% de macrófagos sendo positivos para mCherry.
[00642] Esses dados indicam que cepas com knockout de flagelos se acumulam nas populações de células mielóides do tumor, mas não no tumor ou nas células estromais, enquanto cepas com flagelos intactos infectam todos os tipos de células. Dessa forma, cepas com knockout de flagelos demonstram colonização tumoral mielóide-específica in vivo. Exemplo 27 Cepas com knockout de flagelos (AfljB/AfliC) e ApagP demonstram tolerabilidade aumentada e imunogenicidade diminuída in vivo
[00643] O gene pagP foi deletado das cepas de S. typhimurium YS1646 DASD e YS1646 AFLG/AASD, gerando as cepas YS1646 APagP/AASD e YS1646 APagP/AFLG/AASD, respectivamente. As cepas YS1646 AFLG/AASD, YS1646 APagP/AASD e YS1646 APagP/AFLG/AASD foram transformadas por eletroporação com plasmídeos que codificam o gene asd, bem como com um cassete de expressão eucariótica que codifica IL-2 murídea (muIL-2). Para testar a tolerabilidade dessas cepas in vivo, um estudo de LD50 foi realizado em camundongos BALB/c-fêmeas com 6-8 semanas de idade. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com 3 x 105, 1 x 106, 3 x 106, 1 x 107 ou 3 x 107 CFUs de cepas YS1646, YS1646 AFLG/AASD (muIL-2), YS1646 APagP/AASD (muIL-2) ou YS1646 APagP/AFLG/AASD (muIL-2). Os camundongos foram então monitorados quanto à morbidade e mortalidade, e os valores da LD50 foram calculados. Os resultados são mostrados na tabela abaixo. Cepa bacteriana LD50 (CFUs) YS1646 7,24 x 106 YS1646 AFLG/AASD (muIL-2) 2,07 x 107 YS1646 APagP/AASD (muIL-2) 1,39 x 107 YS1646 APagP/AFLG/AASD (muIL-2) Não calculada
[00644] Os valores da LD50 para as cepas YS1646 AFLG/AASD (muIL-2) e YS1646 APagP/AASD (muIL-2) foram maiores do que o valor da LD50 para a cepa parental YS1646, indicando que a tolerabilidade dos mutantes de deleção flagelina- e pagP, que expressam IL-2 murídea, eram maiores in vivo. A LD50 para a cepa YS1646 APagP/AFLG/AASD (muIL-2) não foi calculada, na medida em que nenhum animal morreu durante a duração do estudo, mas foi maior do que 6,2 x 107 CFUs, representando um aumento de quase 10 vezes na tolerabilidade, comparada com a cepa parental YS1646.
[00645] Para comparar a imunogenicidade das diferentes cepas bacterianas, camundongos que sobreviveram à dose de 3 x 106 CFU (N = 5, exceto YS1646, em que N = 4) foram sangrados no dia 40 pós-dosagem intravenosa, e anticorpos séricos anti- Salmonella foram titulados. Os soros de camundongos tratados com as várias cepas mutantes bacterianas, e de camundongos de controle, foram semeados em uma placa de PCR de 96 poços e diluídos serialmente em PBS. Culturas das cepas de S. typhimurium que contêm o plasmídeo pRPSM-mCherry foram centrifugadas e lavadas, e depois ressuspensas em tampão de fixação de citometria de fluxo. Para o ensaio, 25 µl das culturas bacterianas mCherry+, contendo 1 x 106 CFUs, foram adicionados aos soros e incubados por 25 minutos em temperatura ambiente. Após incubação, as amostras bacterianas foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS por centrifugação a 4.000 RPM por 5 min, e depois ressuspensas em PBS contendo um anticorpo secundário Fc de cabra anti-camundongo Alexa Fluor® 488 (diluição de 1/400 do estoque), e incubadas por 25 minutos em temperatura ambiente no escuro. As amostras foram então lavadas três vezes com PBS por centrifugação a 4.000 RPM por 5 min, ressuspensas em PBS, e analisadas por citometria de fluxo (Novocyte). Os resultados mostraram que os camundongos injetados com a cepa parental YS1646 tiveram as maiores titulações séricas de anticorpo, com intensidade de fluorescência média (MFI) na média de 29,196 ± 20,730. Soros de camundongos injetados com a cepa YS1646 AFLG/DASD (muIL-2) tiveram uma MFI de 7,941 ±
9,290; soros de camundongos injetados com a cepa YS1646 APagP/AASD (muIL-2) tiveram uma MFI de 3,454 ± 3,860; e soros de camundongos injetados com a cepa YS1646 APagP/AFLG/AASD (muIL-2), tiveram as menores titulações séricas de anticorpo, com uma MFI de 2,295 ± 2,444. Os dados demonstram que a deleção dos genes que codificam os flagelos (fljB/fliC) ou pagP resultam em cepas com imunogenicidade diminuída, e que a combinação de mutações (APagP/AFLG) diminui ainda mais a imunogenicidade, comparada com a cepa parental sem as deleções.
[00646] No geral, os dados demonstram a tolerabilidade aumentada e a imunogenicidade diminuída das cepas AFLG e APagP, com a cepa APagP/AFLG/AASD demonstrando a tolerabilidade mais favorável e a menor imunogenicidade.
[00647] Como modificações serão evidentes para aqueles habilitados na técnica, deseja-se que essa invenção só seja limitada escopo das reivindicações em anexo.

Claims (161)

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS
1. Bactéria imunoestimulante, caracterizada por compreender um plasmídeo que codifica um produto terapêutico sob o controle de um promotor eucariótico, em que: o produto terapêutico é um produto anticâncer terapêutico; o genoma da bactéria imunoestimulante é modificado, pela qual a bactéria é desprovida flagelos; e a bactéria do tipo selvagem compreende flagelos.
2. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser flagelina- (fliC- /fljB-) e pagP-.
3. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser flagelina- (fliC- /fljB-) e pagP- e msbB-, pela qual a bactéria imunoestimulante possui lipopolissacarídeo penta-acilado (LPS).
4. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por ser pagP-/msbB-.
5. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer terapêutico é uma proteína imunoestimulante que confere ou contribui para uma resposta imune antitumoral no microambiente tumoral.
6. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a proteína imunoestimulante que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral é uma citocina.
7. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a proteína imunoestimulante que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral é uma quimiocina.
8. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a proteína imunoestimulante que confere ou contribui para uma resposta imune antitumoral no microambiente tumoral é selecionada entre uma ou mais de: IL-2, IL-7, IL-12p70 (IL-12p40 + IL- 12p35), IL-15, IL-36 gama, IL-2 que teve atenuada a ligação à IL-2Ra, complexo IL-15/cadeia alfa de IL-15R, IL-18, IL- 21, IL-23, IL-36γ, IL-2, modificada de modo a possuir ligação atenuada ou não se ligue à IL-2Ra, CXCL9, CXCL10, CXCL11, interferon-α, interferon-β, interferon-γ, CCL3, CCL4, CCL5, proteínas que estão envolvidas ou que efetuam ou potencializam recrutamento/persistência de células T, CD40, ligante de CD40, CD28, OX40, ligante de OX40, 4-1BB, ligante de 4-1BB, membros da família B7-CD28, antagonistas de CD47, antagonistas do polipeptídeo de TGF-beta, e membros da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR).
9. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o produto terapêutico é um polipeptídeo antagonista de TGF- beta.
10. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer é um antagonista de TGF-beta selecionado entre um anticorpo anti-TGF-beta, um anticorpo anti-receptor de TGF-beta e um polipeptídeo antagonista de TGF-beta solúvel.
11. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo antagonista de TGF-beta compreende ácido nucleico que codifica uma sequência sinalizadora para secreção do polipeptídeo codificado.
12. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o produto terapêutico é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste.
13. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste é um fragmento de ligação ao antígeno que é selecionado entre um Fab, Fab', F(ab’)2, Fv de cadeia única (scFv), Fv, dsFv, nanobody, fragmento diabody e um anticorpo de cadeia única.
14. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste é humanizado ou é humano.
15. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste é um antagonista de PD-1, PD-L1, CTLA-4, VEGF, VEGFR2 ou IL-6.
16. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de que a bactéria é pagP-.
17. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é uma ou mais de purI- (purM-), msbB-, purD-, flagelina- (fliC-/fljB-), pagP-, adrA-, csgD-, qseC- e hilA-.
18. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é hilA- e/ou flagelina- (fliC- /fljB-).
19. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por ser pagP-.
20. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizada por ser pagP-/msbB-.
21. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o produto terapêutico está ligado operativamente para expressão a um ácido nucleico que codifica um sinal secretório, pelo qual, mediante expressão em um hospedeiro, o produto terapêutico é secretado.
22. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizada pelo fato de que a bactéria é auxotrófica para adenosina, ou para adenosina e adenina.
23. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é aspartato-semialdeído desidrogenase- (asd-).
24. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizada por ser aspartato- semialdeído desidrogenase- (asd-), em que a bactéria é asd- em virtude de ruptura ou deleção de todo ou uma porção do gene endógeno que codifica aspartato-semialdeído desidrogenase (asd), pela qual asd endógena não é expressa.
25. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24, caracterizada por codificar aspartato-semialdeído desidrogenase (asd) no plasmídeo sob o controle de um promotor bacteriano.
26. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizada por ser msbB-.
27. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, caracterizada por ser purI- (purM- ).
28. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizada por ser asd-, purI-, msbB- e uma ou ambas de flagelina- (fliC-/fljB-) e pagP-.
29. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizada por ser auxotrófica para adenosina.
30. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo está presente em número de cópias baixo ou número de cópias médio.
31. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo compreende uma origem de replicação com número de cópias de médio-para-baixo.
32. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo compreende uma origem de replicação com número de cópias baixo.
33. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo está presente em número de cópias baixo.
34. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o número de cópias médio é menos do que 150 ou menos do que cerca de 150 e mais do que 20 ou cerca de 20 ou está entre 20 ou 25 e 150 cópias.
35. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o número de cópias baixo é menos do que 25 ou menos do que 20 ou menos do que cerca de 25 ou menos do que cerca de 20 cópias.
36. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizada pelo fato de que a origem de replicação no plasmídeo é selecionada entre as origens derivadas de pBR322, p15A, pSC101, pMB1, colE1, colE2, pPS10, R6K, R1, RK2 e pUC.
37. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizada por codificar um produto terapêutico em um plasmídeo na bactéria, em que a expressão do produto está sob o controle de sinais regulatórios eucarióticos.
38. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37, caracterizada pelo fato de que o produto terapêutico anticâncer é uma proteína que estimula o sistema imune do hospedeiro.
39. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o produto terapêutico é um ácido nucleico ou uma proteína.
40. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-39, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer terapêutico é expresso sob o controle de um promotor eucariótico que é um promotor de RNA polimerase II ou um promotor de RNA polimerase III.
41. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor de RNA polimerase II que é um promotor viral ou um promotor de RNA polimerase II de mamífero.
42. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor viral selecionado entre um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor SV40, um promotor de vírus de Epstein-Barr (EBV), um promotor de herpes vírus e um promotor de adenovírus.
43. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-42, caracterizada pelo fato de que o promotor é ativo em um microambiente tumoral (TME) de um indivíduo eucariótico.
44. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o promotor é ativo em condições hipóxicas, ou em condições nas quais o pH é menos do que 7.
45. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-40, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer terapêutico está sob o controle de um promotor que é selecionado entre um promotor de fator de alongamento-1 (EF1) alfa, ou um promotor UBC ou um promotor PGK, um promotor CAGG, um promotor EIF4a1, um promotor CBA (actina beta de galinha), um promotor MND e um promotor de CD68.
46. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor de EF1 alfa.
47. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor viral que é um promotor tardio.
48. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47, caracterizada por compreender um plasmídeo que codifica o produto anticâncer terapêutico, em que: a bactéria imunoestimulante é uma espécie de Salmonella; a bactéria imunoestimulante é uma auxotrófica de adenosina, e é flagelina- (fliC-/fljB-); e o produto terapêutico codificado no plasmídeo é expresso sob o controle de sequências regulatórias eucarióticas.
49. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-48, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o produto terapêutico no plasmídeo está ligado operativamente às sequências regulatórias reconhecidas por um hospedeiro eucariótico.
50. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que as sequências regulatórias compreendem um terminador e/ou promotores selecionados entre genes de SV40, hGH, BGH, beta- globulina de galinha e rbGlob (globulina de coelho).
51. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-50, caracterizada por compreender uma mutação no genoma da bactéria que reduz toxicidade ou infectividade de células não imunes em um hospedeiro.
52. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-51, caracterizada pelo fato de que a bactéria é pagP-.
53. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-52, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é flagelina- (fliC-/fljB-) e/ou pagP-, e um ou mais de purI- (purM-), msbB-, purD-, adrA-, csgD-, qseC-, e hilA-.
54. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-53, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o produto terapêutico no plasmídeo está ligado operativamente ao ácido nucleico que codifica um sinal secretório, pelo qual, mediante expressão em um hospedeiro, o produto é secretado.
55. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-54, caracterizada pelo fato de que a proteína imunoestimulante que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral é codificada no plasmídeo de modo que, quando expressa, ela está ancorada à membrana.
56. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que a proteína imunoestimulante que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral é um polipeptídeo antagonista de TGF-beta que é um anticorpo anti-TGF-beta.
57. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que ácido nucleico que codifica o polipeptídeo antagonista de TGF-beta compreende ácido nucleico que codifica uma sequência sinalizadora para secreção do polipeptídeo codificado.
58. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-54, caracterizada pelo fato de que a proteína imunoestimulante que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral é uma interleucina.
59. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a interleucina é IL-2 que é modificada de modo a que não se ligue à IL-2Ra, pela qual a proliferação de células T reguladoras é reduzida ou inibida.
60. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-59, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo compreende um ou mais de uma sequência (s) de ácidos nucleicos que codifica proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora (cytoLLO), um motivo CpG, uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS) e um elemento de ligação de gene-I induzível por ácido retinóico (RIG-I).
61. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-60, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo codifica uma sequência de nucleotídeos que é um agonista de gene I (RIG-I) induzível por ácido retinóico.
62. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61, caracterizada por ser modificada para ter patogenicidade reduzida, pela qual a infecção de células epiteliais e/ou outras células não imunes é reduzida em relação à bactéria sem a modificação.
63. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-62, caracterizada por possuir uma modificação no sistema de secreção do tipo 3 ou no sistema de secreção do tipo 4.
64. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-63, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante compreende uma deleção de purI, uma deleção de msbB, uma deleção de asd e uma deleção de adrA.
65. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, caracterizada por compreender um ácido nucleico que inclui um motivo CpG, em que o motivo CpG é reconhecido por receptor do tipo toll 9 (TLR9).
66. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que compreende um motivo CpG é codificado no plasmídeo.
67. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-66, caracterizada por compreender um ácido nucleico que codifica um motivo CpG, em que o ácido nucleico que codifica o motivo CpG está incluído ou é parte de um gene bacteriano que é codificado no plasmídeo.
68. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o gene que compreende um motivo CpG é asd, em que o asd é codificado no plasmídeo.
69. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-68, caracterizada pelo fato de que a bactéria codifica asd em um plasmídeo, e sua expressão está sob o controle de um promotor bacteriano para expressão quando cultivo da bactéria in vitro.
70. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-69, caracterizada por ser msbB-/asd- /purI-.
71. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-70, caracterizada pelo fato de que prgH e/ou prgK estão inativados ou deletados.
72. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-71, caracterizada por compreender um ácido nucleico que codifica cytoLLO, que é proteína listeriolisina O (LLO) desprovida da sequência sinalizadora.
73. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-72, caracterizada por compreender uma sequência de direcionamento nuclear de DNA (DTS) codificada no plasmídeo.
74. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que a DTS é uma DTS de SV40.
75. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-74, caracterizada por possuir uma deleção ou modificação no gene que codifica endonuclease I (endA), pela qual a atividade de endA é inibida ou eliminada.
76. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-75, caracterizada por compreender um ou mais de um motivo CpG, um marcador selecionável do gene asd para manutenção do plasmídeo e uma sequência de direcionamento nuclear de DNA.
77. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-76, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante compreende uma deleção de purI, uma deleção de msbB, uma deleção de asd e, opcionalmente, uma deleção de adrA.
78. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-77, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante compreende: uma ou mais de uma mutação em um gene que altera a biossíntese de lipopolissacarídeo, selecionado entre um ou mais de rfaL, rfaG, rfaH, rfaD, rfaP, rFb, rfa, msbB, htrB, firA, pagL, pagP, lpxR, arnT, eptA e lpxT; e/ou uma ou mais de uma mutação que introduz um gene suicida e é selecionado entre um ou mais de sacB, nuk, hok, gef, kil e phlA; e/ou uma ou mais de uma mutação que introduz um gene de lise bacteriana e é selecionado entre um ou ambos de hly e cly; e/ou uma mutação em um ou mais fatores de virulência selecionados entre IsyA, pag, prg, iscA, virG, plc e act; e/ou uma ou mais de uma mutação em um gene que modifica a resposta ao estresse selecionado entre recA, htrA, htpR, hsp e groEL; e/ou uma mutação em min que rompe o ciclo celular; e/ou uma ou mais de uma mutação em um gene que rompe ou inativa funções regulatórias selecionado entre cya, crp, phoP/phoQ e ompR.
79. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-78, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer terapêutico é um anticorpo antitumoral ou fragmento deste, ou é uma citotoxina.
80. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer é um anticorpo antitumoral ou fragmento deste que é um Fab, Fab', scFab, scFv, fragmento Fv ou nanobody.
81. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer terapêutico é uma citotoxina selecionada entre ricina, saporina e toxina Shiga.
82. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o produto anticâncer terapêutico é um anticorpo antitumoral ou fragmento de ligação ao antígeno deste que é um inibidor de ponto de verificação imune.
83. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 79 ou 82, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-PD-1, anti-CTLA4, anti-PD-L1, anti-VEGF, anti-VEGFR ou anti-IL6, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
84. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de cadeia única.
85. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-84, caracterizada pelo fato de que a bactéria codifica um antígeno tumoral.
86. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral é um neoantígeno.
87. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86, caracterizada por codificar um RNA inibidor (RNAi) ou um cassete CRISPR, em que: o RNAi inibidor ou cassete CRISPR é codificado em um plasmídeo na bactéria sob o controle de um promotor eucariótico; e o RNAi ou cassete CRISPR inibe ou rompe ou suprime um ponto de verificação imune.
88. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-87, caracterizada pelo fato de que: o produto anticâncer terapêutico é uma proteína imunoestimulante que confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral, e/ou é uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA inibidor (RNAi); e, em que o produto terapêutico, quando expresso em um indivíduo mamífero, confere ou contribui para imunidade antitumoral no microambiente tumoral.
89. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-88, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma cepa de Salmonella, Shigella, E. coli, Bifidobacteriae, Rickettsia, Vibrio, Listeria, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas, Francisella, Cholera, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Bacillus, ou Erysipelothrix, ou uma cepa atenuada destas ou cepa modificada destas de qualquer uma da lista de cepas bacterianas precedente.
90. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-89, caracterizada pelo fato de que a bactéria não modificada é uma bactéria atenuada.
91. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-89, caracterizada pelo fato de que a bactéria não modificada é uma cepa do tipo selvagem.
92. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-91, caracterizada por ser uma cepa de Salmonella.
93. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 92, caracterizada por ser uma cepa de Salmonella typhimurium.
94. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-93, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é derivada da cepa AST-100 (VNP20009 ou YS1646), ou cepa ATCC 14028, ou uma cepa que possui todas as características de identificação da cepa ATCC 14028.
95. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-94, caracterizada pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é derivada de uma cepa de Salmonella typhimurium selecionada entre cepas designadas como AST-100, VNP20009, YS1646 (ATCC #202165), RE88, SL7207, χ 8429, χ 8431, χ 8468 ou cepa ATCC 14028 do tipo selvagem.
96. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-95, caracterizada por compreender ácido nucleico que codifica duas das proteínas terapêuticas.
97. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pelo fato de que promotores e terminadores diferentes controlam a expressão de cada proteína terapêutica.
98. Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica as proteínas terapêuticas é expresso por um único promotor e compreende um único terminador, e a sequência que codifica cada proteína compreende um Sítio Interno de Entrada de Ribossomo (IRES), pelo qual o ácido nucleico codificado é policistrônico.
99. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-98, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a proteína terapêutica está sob o controle de um promotor selecionado entre promotores de EF-1 alfa, CMV, eIF4A1, CAG, MND ou GAPDH.
100. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-99, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a proteína terapêutica compreende terminadores selecionados entre um terminador de SV40, um terminador do gene que codifica hormônio de crescimento humano (HGH), um terminador do gene que codifica hormônio de crescimento bovino (BGH), e um terminador do gene que codifica coelho beta-globulina (rbGlob).
101. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-99, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo que codifica o produto terapêutico compreende uma construção que inclui um intensificador, um promotor, o quadro de leitura aberta que codifica a proteína terapêutica e uma cauda poliA.
102. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-99, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo que codifica o produto terapêutico compreende uma construção que inclui um ou mais de um intensificador, um promotor, um IRES, o quadro de leitura aberta que codifica o produto terapêutico e uma cauda poliA.
103. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-99, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo que codifica o produto terapêutico compreende uma construção que inclui um intensificador, um promotor, um IRES, uma sequência de localização, o quadro de leitura aberta que codifica o produto terapêutico e uma cauda poliA.
104. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 101-103, caracterizada pelo fato de que a construção no plasmídeo que codifica o produto terapêutico compreende um Elemento Regulador Pós- transcricional do Vírus da Hepatite da Marmota (WHP) (WPRE).
105. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-104, caracterizada pelo fato de que a bactéria foi tratada com polimixina para reduzir pirogenicidade.
106. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender a bactéria imunoestimulante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-105 em um veículo farmaceuticamente aceitável.
107. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 106, caracterizada por ser formulada para administração sem diluição.
108. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 106 ou 107, caracterizada por ser formulada como uma dose única.
109. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 106-108, caracterizada por ser formulada para administração parenteral.
110. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 106-108, caracterizada por ser formulada para administração sistêmica.
111. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 106-108, caracterizada por ser formulada para administração intratumoral ou intraperitoneal.
112. Método de tratamento de câncer, caracterizado por compreender um tumor sólido ou uma malignidade hematológica em um indivíduo, que compreende a administração da bactéria imunoestimulante conforme definida com qualquer uma das reivindicações 1-105, ou a composição farmacêutica conforme definida com qualquer uma das reivindicações 106-111.
113. Método de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que a bactéria imunoestimulante ou composição farmacêutica é administrada sistemicamente.
114. Método de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que a bactéria imunoestimulante ou composição farmacêutica é administrada por via intratumoral ou é administrada por via intraperitoneal.
115. Uso da bactéria imunoestimulante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-105, ou da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 106-111, caracterizada por ser usada tratamento de um câncer que compreende um tumor sólido ou uma malignidade hematológica em um indivíduo.
116. Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-105, ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 106-111, caracterizada por ser usada para tratamento de um câncer que compreende um tumor sólido ou uma malignidade hematológica em um indivíduo.
117. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-116, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
118. Método ou uso ou Bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-117, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende um tumor sólido.
119. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-117, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende uma malignidade hematológica.
120. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112, 113, e 115-117, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende a administração sistêmica da bactéria imunoestimulante ou composição farmacêutica.
121. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-120, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende terapia combinada na qual um segundo agente ou tratamento anticâncer é administrado.
122. Método ou uso ou Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ou tratamento anticâncer é administrado antes, concomitantemente, depois ou intermitentemente com a bactéria imunoestimulante ou composição farmacêutica.
123. Método ou uso ou Bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ou tratamento anticâncer é uma imunoterapia.
124. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ou tratamento anticâncer compreende terapia com vírus oncolítico.
125. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 121-123, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ou tratamento anticâncer compreende a administração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.
126. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ou tratamento anticâncer compreende radiação ou quimioterapia.
127. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 123 ou 125, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ou tratamento anticâncer é uma imunoterapia que compreende a administração de um anticorpo anti-PD-1, ou anti-PD-L1, ou anti-CTLA4, ou anti-IL6, ou anti-VEGF, ou anti-VEGFR2, ou fragmento deste.
128. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 121-123, 125, e 127, caracterizado pelo fato de que: o segundo agente ou tratamento anticâncer compreende a administração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e o fragmento de anticorpo é um scFv ou a nanobody.
129. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 114-128, caracterizado pelo fato de que a administração da bactéria imunoestimulante é parenteral.
130. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 115-128, caracterizado pelo fato de que a administração da bactéria imunoestimulante é oral ou retal ou por aerossol no pulmão ou intratumoral.
131. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 115-128, caracterizado pelo fato de que a administração da bactéria imunoestimulante é por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea.
132. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-131, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado entre leucemia, linfoma, câncer gástrico, e câncer da mama, coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, cólon-reto, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, ossos, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos, cérvice e fígado.
133. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-132, caracterizado pelo fato de que a bactéria imunoestimulante é uma espécie de Salmonella, Shigella, Listeria ou E. coli.
134. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-133, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma espécie de Salmonella.
135. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-134, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma cepa de Salmonella typhimurium.
136. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a Salmonella typhimurium é derivada de uma cepa do tipo selvagem de Salmonella typhimurium que possui todas as características de identificação da cepa depositada sob o Nº de Acesso ATCC 14028 ou é a cepa depositada sob o Nº de Acesso ATCC 14028.
137. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 114-136, caracterizado pelo fato de que administração da bactéria imunoestimulante é por administração intraperitoneal ou intratumoral.
138. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-137, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui câncer metastático.
139. Método ou uso ou bactéria imunoestimulante de acordo com qualquer uma das reivindicações 112-138, caracterizado pelo fato de que a bactéria é flagelina- e pagP-/msbB-.
140. Célula isolada, caracterizada por compreender a bactéria imunoestimulante conforme definida com qualquer uma das reivindicações 1-105.
141. Célula de acordo com a reivindicação 140,
caracterizada por ser uma célula imune, uma célula-tronco, uma célula tumoral, ou uma linhagem de célula primária.
142. Célula de acordo com a reivindicação 140, caracterizada por ser uma célula hematopoiética.
143. Célula de acordo com a reivindicação 140, caracterizada por ser uma célula T.
144. Célula de qualquer uma das reivindicações 140-143, caracterizada por ser produzida ex vivo por infecção da célula com a bactéria imunoestimulante.
145. Célula isolada ou células cultivadas, caracterizadas por compreender a bactéria imunoestimulante conforme definida qualquer uma das reivindicações 1-105.
146. Célula de acordo com a reivindicação 145, caracterizada por ser uma célula T, ou uma célula hematopoiética.
147. Célula de acordo com a reivindicação 145 ou 146, caracterizada por ser produzida ex vivo por infecção da célula com a bactéria imunoestimulante.
148. Método de tratamento de câncer, caracterizado por compreender a administração da célula conforme definida qualquer uma das reivindicações 140-147 a um indivíduo com um câncer que compreende um tumor sólido ou é uma malignidade hematológica.
149. Método de acordo com a reivindicação 148, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende um tumor sólido.
150. Método de acordo com a reivindicação 148 ou 149, caracterizado pelo fato de que o câncer é metastático.
151. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 148-150, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado entre linfoma, leucemia, câncer gástrico, e câncer da mama, coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, cólon-reto, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, ossos, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos, cérvice e fígado.
152. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 140-147, caracterizada por ser usada para o tratamento de câncer.
153. Uso de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende um tumor sólido ou uma malignidade hematológica.
154. Uso de acordo com a reivindicação 152 ou 153, caracterizado pelo fato de que o câncer é metastático.
155. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 152-154, em que o câncer é selecionado entre linfoma, leucemia, câncer gástrico, e câncer da mama, coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, cólon-reto, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, ossos, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos, cérvice e fígado.
156. Método de aumento da habilidade de uma bactéria terapêutica para colonizar um tumor, caracterizado por compreender a modificação do genoma, pela qual a bactéria é flagelina- (fliC-/fljB-) e/ou pagP-, e em que a bactéria compreende um plasmídeo que codifica um produto terapêutico que é um agente ou tratamento anticâncer.
157. Método de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que a bactéria terapêutica é uma bactéria imunoestimulante.
158. Método de acordo com a reivindicação 156 ou 157,
caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma espécie de Salmonella.
159. Método de acordo com a reivindicação 158, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma Salmonella typhimurium.
160. Método de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que a Salmonella typhimurium é derivada de uma Salmonella typhimurium do tipo selvagem que possui todas as características de identificação da cepa depositada sob o Nº de Acesso ATCC 14028.
161. Método de acordo com a reivindicação 157, caracterizado pelo fato de que a bactéria é a bactéria imunoestimulante conforme definida com qualquer uma das reivindicações 1-105.
BR112021000315-0A 2018-07-11 2019-07-11 cepas bacterianas imunoestimulantes modificadas geneticamente e seus usos BR112021000315A2 (pt)

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WO (1) WO2020014543A2 (pt)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2463181B (en) 2007-05-14 2013-03-27 Univ New York State Res Found Induction of a physiological dispersion response in bacterial cells in a biofilm
US9765117B2 (en) * 2015-08-24 2017-09-19 Romek Figa Peptides for treating cancer
CA3011283A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
US11471494B2 (en) 2017-01-06 2022-10-18 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
CN108359667B (zh) * 2018-01-06 2021-01-05 武汉泽智生物医药有限公司 沉默程序性死亡受体-配体表达的siRNA序列及其应用
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
SG11202100023XA (en) * 2018-07-11 2021-01-28 Actym Therapeutics Inc Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
CN110859951A (zh) * 2019-09-23 2020-03-06 中国药科大学 Cd200蛋白和cd200融合蛋白在制备治疗银屑病药物中的应用
CN116249779A (zh) 2019-11-12 2023-06-09 阿克蒂姆治疗有限公司 免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途
CN111471646B (zh) * 2020-04-20 2022-07-05 安徽中盛溯源生物科技有限公司 利用非抗生素筛选的游离型质粒载体制备iPSC的方法
IL300447A (en) 2020-08-12 2023-04-01 Actym Therapeutics Inc Bacteria-based ingredients that stimulate the immune system, treatments and platforms for delivering RNA
WO2022094847A1 (zh) * 2020-11-05 2022-05-12 中国科学院深圳先进技术研究院 工程细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用
CN112746117B (zh) * 2020-12-25 2022-10-28 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) 肠出血性大肠杆菌检测的引物组及其应用和试剂盒
WO2022150779A1 (en) * 2021-01-11 2022-07-14 Synlogic Operating Company, Inc. Methods of treating cancer using recombinant microorganisms expressing a sting agonist
CN112852698B (zh) * 2021-01-30 2022-11-29 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用
US20240115671A1 (en) * 2021-02-09 2024-04-11 University Of Massachusetts Intracellular delivery of therapeutic proteins designed to invade and autonomously lyse and methods of use thereof
WO2022203308A1 (ko) * 2021-03-22 2022-09-29 클립스비엔씨 주식회사 신규한 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이의 용도
CN113583928A (zh) * 2021-07-09 2021-11-02 长江大学 一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株及构建方法
CA3235418A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment
WO2023105076A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Prokarium Limited Combination cancer therapy
CN114349950A (zh) * 2021-12-15 2022-04-15 深圳先进技术研究院 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用
CN114344463B (zh) * 2022-01-10 2023-07-28 南方医科大学南方医院 血管生成抑制剂在对恶性肿瘤转移患者增强远隔效应中的应用
WO2023246840A1 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Wuhan Houxian Biopharmaceutical Co. Ltd. Combination of il-12 and ox40l for cancer immunotherapy
CN115678841A (zh) * 2022-11-18 2023-02-03 广东医科大学附属医院 一种增强人脐带间充质干细胞免疫抑制功能的组合物及应用

Family Cites Families (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US3936354A (en) 1974-04-29 1976-02-03 Lapointe Jean Rock Anti-tumour product of bacterial origin
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
GB8322007D0 (en) 1983-08-16 1983-09-21 Wellcome Found Pharmaceutical delivery system
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
US5997881A (en) 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
CA2286210A1 (en) 1997-04-18 1998-10-29 Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf) Attenuated salmonella strain used as a vehicle for oral immunization
CN1253551C (zh) * 1997-09-10 2006-04-26 维昂药品公司 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6024961A (en) 1997-11-14 2000-02-15 Washington University Recombinant avirulent immunogenic S typhi having rpos positive phenotype
KR100849443B1 (ko) 1998-12-23 2008-07-31 화이자 인크. Ｃｔｌａ－４에 대한 인간 단일클론 항체
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
JP2001010973A (ja) 1999-06-29 2001-01-16 Dnavec Research Inc がんワクチン
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
WO2001025399A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Vion Pharmaceuticals, Inc. Non-invasive tumor imaging by tumor-targeted bacteria
ATE378348T1 (de) 2000-01-14 2007-11-15 Us Health Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
US6872547B1 (en) 2000-10-11 2005-03-29 Washington University Functional balanced-lethal host-vector systems
IL149701A0 (en) 2001-05-23 2002-11-10 Pfizer Prod Inc Use of anti-ctla-4 antibodies
US7344710B2 (en) 2001-11-21 2008-03-18 The Johns Hopkins University Combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
EP1480548A4 (en) 2002-02-06 2006-02-01 Univ Johns Hopkins Med METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING SYSTEMIC IMMUNE RESPONSE AGAINST A SPECIFIC ORGAN OR TISSUE
EP2380440B1 (en) * 2002-04-15 2016-03-09 Washington University Regulated attenuation of live vaccines to enhance cross protective immunogenicity
US7195757B2 (en) * 2002-04-15 2007-03-27 Washington University Modulation of immune responses to foreign antigens expressed by recombinant attenuated bacterial vectors
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
US7390646B2 (en) 2003-09-17 2008-06-24 The Regents Of The University Of California Bacterial vectors and methods of use thereof
US20070298012A1 (en) 2003-12-16 2007-12-27 Ivan King Compositions and Methods for Tumor-Targeted Delivery of Effector Molecules
JP2005299711A (ja) 2004-04-07 2005-10-27 Shonan Plastic Mfg Co Ltd 更生管及びその敷設方法
US8221739B2 (en) 2004-04-29 2012-07-17 Botanic Oil Innovations, Inc. Method of cancer treatment
US20050244375A1 (en) 2004-04-29 2005-11-03 Leonard Arnold S Composition and method of cancer treatment
US8501198B2 (en) 2004-06-07 2013-08-06 Qu Biologics Inc. Tissue targeted antigenic activation of the immune response to treat cancers
JP2008504822A (ja) 2004-06-29 2008-02-21 アンチキャンサー インコーポレーテッド 癌選択的栄養要求株
US20070166281A1 (en) 2004-08-21 2007-07-19 Kosak Kenneth M Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods for their synthesis
EP1655370A1 (en) 2004-11-05 2006-05-10 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung Bacterial vector
US20090123426A1 (en) 2004-12-17 2009-05-14 Chiang Li Compositions for Bacterial Mediated Gene Silencing and Methods of Using the Same
CA2596845C (en) 2005-02-10 2016-11-08 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of diagnosing and treating cancer using b-catenin splice variants
MX2007011767A (es) 2005-03-23 2007-10-18 Pfizer Prod Inc Terapia de combinacion de anticuerpo anti-ctla4 e indolinona para el tratamiento del cancer.
PL2439273T3 (pl) 2005-05-09 2019-08-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku programowanej śmierci komórki 1(pd-1) oraz metody leczenia nowotworów z wykorzystaniem przeciwciał anty-pd-1 samodzielnie lub w połączeniu z innymi immunoterapeutykami
US20070044164A1 (en) 2005-05-31 2007-02-22 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing microRNAs
RS54271B1 (en) 2005-07-01 2016-02-29 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. HUMAN MONOCLONIC ANTIBODIES FOR LIGAND PROGRAMMED DEATH 1 (PD-L1)
US8426375B2 (en) 2005-10-12 2013-04-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
WO2007084992A2 (en) 2006-01-19 2007-07-26 The University Of Chicago Prognosis and therapy predictive markers and methods of use
US20070207171A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Cerus Corporation Engineered listeria and methods of use thereof
AU2006341192A1 (en) 2006-03-20 2007-10-11 Vrije Universiteit Brussel Live attenuated salmonella vaccine
WO2007130604A2 (en) 2006-05-04 2007-11-15 Baylor Research Institute Anti-tumor activity of an oncolytic adenovirus-delivered oncogene sirna
CN1974759B (zh) 2006-07-26 2010-06-09 吉林大学 运载重组质粒的减毒沙门氏菌及其在抗肿瘤中的应用
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US7421354B2 (en) 2006-10-13 2008-09-02 General Electric Company Systems and methods for reducing an effect of a disturbance
EP2170959B1 (en) 2007-06-18 2013-10-02 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
EP2171078B1 (en) 2007-06-29 2016-08-10 Boston Biomedical, Inc. Enabling the use of long dsrna for gene targeting in mammalian and other selected animal cells
WO2009023525A2 (en) 2007-08-09 2009-02-19 Dharmacon, Inc. Methods of modulating mesenchymal stem cell differentiation
US7998461B2 (en) 2007-11-15 2011-08-16 University Of Massachusetts Salmonella cancer therapeutics and related therapeutic methods
EP2085466A1 (en) 2008-01-29 2009-08-05 AEterna Zentaris GmbH Non-pathogenic and/or attenuated bacteria capable of inducing apoptosis in macrophages, process of manufacturing and uses thereof
KR101042541B1 (ko) 2008-07-25 2011-06-17 한국생명공학연구원 외막소체를 생산하는 재조합 ｇ（－） 박테리아 및 이를이용한 다가항원이 실린 외막소체의 제조방법
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
WO2010040033A2 (en) 2008-10-03 2010-04-08 Creation One Formulators, Llc Methods and compositions for modulating an immune response with immunogenic oligonucleotides
WO2010045620A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
WO2010057009A1 (en) 2008-11-14 2010-05-20 Cequent Pharmaceuticals, Inc. E. coli mediated gene silencing of beta-catenin
CN114835812A (zh) 2008-12-09 2022-08-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
US20120009153A1 (en) 2009-08-13 2012-01-12 Hongnian Guo Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using the same
LT3279215T (lt) 2009-11-24 2020-04-10 Medimmune Limited Tiksliniai surišantys agentai prieš b7-h1
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US20130017218A1 (en) 2010-02-12 2013-01-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Live bacterial vaccine safety
ES2699630T3 (es) 2010-04-23 2019-02-12 Cold Spring Harbor Laboratory Novedosos ARNhc diseñados estructuralmente
WO2011143624A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanized and chimeric monoclonal antibodies to cd47
US9598697B2 (en) 2010-05-28 2017-03-21 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
WO2012149364A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Diamond Don J Tumor associated vaccines and compositions for disrupting tumor-derived immunosuppression for use in combination cancer immunotherapy
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
AU2012290121B2 (en) 2011-08-01 2015-11-26 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using PD-1 axis binding antagonists and MEK inhibitors
WO2013056352A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
EP2620159A1 (en) 2012-01-24 2013-07-31 Institut Pasteur Improved cancer treatment by immunotherapy with bcg or antigenically related non-pathogenic mycobacteria
US8829254B2 (en) 2012-02-14 2014-09-09 Honeywell International Inc. Process for making 1,3,3,3-tetrafluoropropene
CN103374538B (zh) 2012-04-27 2017-12-01 山东新创生物科技有限公司 包含戈氏梭菌(Clostridiumghonii)的衍生细菌菌株的组合物及其使用方法
US9127284B2 (en) 2012-05-04 2015-09-08 The University Of Hong Kong Modified bacteria and their uses thereof for the treatment of cancer or tumor
AU2013286335B2 (en) 2012-07-05 2017-08-10 Vaximm Ag DNA vaccine for use in pancreatic cancer patients
ES2391108B1 (es) 2012-07-26 2013-10-07 Universitat Autonoma De Barcelona Uso de mycobacterium brumae para el tratamiento del cáncer de vejiga
US10131712B2 (en) * 2012-08-14 2018-11-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with T-cell redirecting bispecific antibodies and checkpoint inhibitors
US9242000B2 (en) 2012-10-18 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Micro-RNAs and micro-RNA inhibitors to modulate blood vessel growth, patterning, tumor growth and malignant disease and method for making and using them
SG10201610161UA (en) 2012-11-06 2017-01-27 Aduro Biotech Inc Facultatively attenuated bacterial species and methods of preparation and use thereof
BR112015013431A2 (pt) 2012-12-12 2017-11-14 Vasculox Inc anticorpos monoclonais ou respectivos fragmentos ligantes de antígenos, composição farmacêutica, e usos de anticorpo monoclonal ou respectivo fragmento ligante de antígenos
US9539290B2 (en) 2012-12-24 2017-01-10 Anticancer Inc. Individualized bacterial treatment of pancreatic cancer
KR102214794B1 (ko) 2013-01-02 2021-02-10 디코이 바이오시스템즈 인코퍼레이티드 박테리아를 사용하는 암 치료용 조성물 및 방법
KR20210084651A (ko) 2013-04-18 2021-07-07 틸트 바이오세러퓨틱스 오이 향상된 입양 세포 치료
SG10202108497TA (en) 2013-04-19 2021-09-29 Sutro Biopharma Inc Expression of biologically active proteins in a bacterial cell-free synthesis system using cell extracts with elevated levels of exogenous chaperones
DK2996473T3 (da) * 2013-05-18 2019-11-04 Aduro Biotech Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til aktivering af "stimulator af interferon-gen"-afhængig signalering
WO2014189996A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Nikolai Khodarev Anti-tumor therapy
AU2014284396A1 (en) 2013-07-03 2016-02-04 City Of Hope Anticancer combinations
US10987432B2 (en) * 2013-09-05 2021-04-27 The University Of Hong Kong Therapeutic delivery and expression system, methods and uses thereof
CN112552401B (zh) 2013-09-13 2023-08-25 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
CN103468626B (zh) * 2013-09-27 2016-05-11 南开大学 制备特异性沙门氏菌h:6诊断血清的工程菌株及构建方法
CN105658233B (zh) 2013-10-04 2020-09-04 安吉尼科分子传输公司 使用携带药物的、双特异性配体靶向的微细胞和干扰素-γ的联合肿瘤治疗
EA036414B1 (ru) 2013-10-25 2020-11-09 Псайоксус Терапьютикс Лимитед Онколитические аденовирусы, содержащие трансгены
WO2015109012A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Integrated Biotherapeutics, Inc. Targeting immunological functions to the site of bacterial infections using cell wall targeting domains of bacteriolysins
WO2015108595A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 Nikolai Khodarev Anti-tumor therapy
CN106413745A (zh) * 2014-03-05 2017-02-15 阿德瓦希斯公司 用于提高效应t细胞与调节性t细胞的比率的方法和组合物
WO2015142875A1 (en) * 2014-03-17 2015-09-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods using modified salmonella
JP6712952B2 (ja) 2014-03-31 2020-06-24 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 固形腫瘍悪性病変を処置するための、抗ｃｔｌａ−４抗体および／または抗ｐｄ−１抗体と組み合わせた、細菌、細菌産物、および他の免疫調節性実体の使用
US11103538B2 (en) 2014-08-12 2021-08-31 University Of Massachusetts Targeting epigenetic regulators using a bacterial delivery system
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
CA2982128A1 (en) 2015-04-09 2016-10-13 The Regents Of The University Of California Engineered bacteria for production and release of therapeutics
EP3288572A4 (en) 2015-04-28 2018-12-05 Albert Einstein College of Medicine, Inc. Treatment of cancer using recall antigens delivered by attenuated bacteria
WO2017005773A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Universite de Bordeaux Use of catenin- beta 1-targeting micrornas for treating liver cancer
EP3347460A4 (en) 2015-09-08 2019-04-10 Sillajen, Inc. MODIFIED ONCOLYTIC VACCINE VIRUSES EXPRESSING CYTOKINE AND CARBOXYESTERASE AND METHODS OF USE THEREOF
AU2016318773A1 (en) 2015-09-09 2018-04-12 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
CA3011283A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
CN108778301A (zh) 2016-03-10 2018-11-09 永恒生物科技股份有限公司 通过联合疗法来治疗实体瘤或淋巴瘤的方法
RU2021127872A (ru) 2016-06-30 2021-11-09 Онкорус, Инк. Доставка терапевтических полипептидов посредством псевдотипированных онколитических вирусов
WO2018011289A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Vaximm Ag Process for the production of a dna vaccine for cancer immunotherapy
AU2017321609C1 (en) 2016-08-30 2023-11-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Drug delivery compositions and uses thereof
JP2019532657A (ja) * 2016-10-26 2019-11-14 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 免疫応答を増強するためのメッセンジャーリボ核酸及びその使用方法
US11576936B2 (en) 2016-12-07 2023-02-14 Salspera, Llc Methods of synergistic treatment of cancer
US11471494B2 (en) 2017-01-06 2022-10-18 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
JP2020516654A (ja) 2017-04-13 2020-06-11 センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 組み合わせがん免疫療法
CN110573624A (zh) 2017-04-14 2019-12-13 永恒生物科技股份有限公司 治疗膀胱癌的方法
US11236135B2 (en) 2017-04-27 2022-02-01 Helmholtz-Zentrum Fur Infektionsforschung Gmbh Salmonella and immunogenic composition containing the same as well as its use
JP7097438B2 (ja) 2017-07-11 2022-07-07 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用
US10493113B2 (en) * 2017-11-14 2019-12-03 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating disease using a Blautia strain
US20210113628A1 (en) * 2018-03-12 2021-04-22 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to modify immune response
WO2019183117A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Multivir Inc. Methods and compositions comprising genetically engineered vaccines for the treatment and prevention of cancer
SG11202100023XA (en) * 2018-07-11 2021-01-28 Actym Therapeutics Inc Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020047161A2 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
US20200270613A1 (en) * 2019-02-27 2020-08-27 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
SG11202108459QA (en) * 2019-02-27 2021-09-29 Actym Therapeutics Inc Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
KR102477129B1 (ko) * 2019-11-06 2022-12-13 엘지전자 주식회사 무선 통신 시스템에서 신호 송수신 방법 및 장치
CN116249779A (zh) * 2019-11-12 2023-06-09 阿克蒂姆治疗有限公司 免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途

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