CN116916944A - 基于免疫刺激性细菌的疫苗、治疗剂和rna递送平台 - Google Patents

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CN116916944A CN202180069973.9A CN202180069973A CN116916944A CN 116916944 A CN116916944 A CN 116916944A CN 202180069973 A CN202180069973 A CN 202180069973A CN 116916944 A CN116916944 A CN 116916944A
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Abstract

提供了减毒的免疫刺激细菌，其基因组经过修饰以例如降低毒性和提高抗肿瘤活性，例如通过增加在肿瘤微环境中的积累，特别是在肿瘤驻留的骨髓细胞中的积累，提高对补体失活的抵抗力，减少免疫细胞死亡，促进适应性免疫，及增强T细胞功能。还提供了用作疫苗和用于递送mRNA的免疫刺激细菌。吞噬细胞定植的增加改善了编码的治疗产物向肿瘤微环境和肿瘤的递送，并允许所述免疫刺激细菌的全身施用。所述吞噬细胞定植的增加还提供了免疫刺激细菌用于直接组织施用以用作疫苗的用途。

Description

基于免疫刺激性细菌的疫苗、治疗剂和RNA递送平台
相关申请
本申请要求于2020年8月12日提交的美国临时专利申请No.63/064,869的优先权权益，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM”，申请人是ActymTherapeutics,Inc.，以及发明人是Laura Hix Glickman、Christopher D.Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae和Haixing Kehoe。
本申请还要求于2021年3月13日提交的美国临时专利申请No.63/188,443的优先权权益，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORM”，申请人是ActymTherapeutics,Inc.，以及发明人是Laura Hix Glickman、Christopher D.Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae和Haixing Kehoe。
本申请还要求于2021年3月13日提交的美国专利申请No.17/320,200的优先权权益，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA DELIVERY PLATFORMS AND THEIR USE FORDELIVERY OF THERAPEUTIC PROTEIN”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是Laura Hix Glickman、Christopher D.Thanos、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、Haixing Kehoe、Bret Nicholas Peterson和Chingnam Cheung。
这个申请还涉及2020年11月12日提交的共同未决国际专利申请No.PCT/US2020/060307并于2021年5月20日发布为WO 2021/097144，题目为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIADELIVERY PLATFORMS AND THEIR USE FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC PRODUCTS”，申请人是Actym Therapeutics,Inc.，以及发明人是Christopher D.Thanos、Laura HixGlickman、Alexandre Charles Michel Iannello、Chris Rae、Haixing Kehoe、BretNicholas Peterson和Chingnam Cheung。
这个申请还涉及2020年2月27日提交的共同未决国际专利申请No.PCT/US2020/020240并于2020年9月3日发布为WO 2020/176809，以及2020年3月19日提交的共同未决美国专利申请No.16/824,500并于2020年8月27日发布为美国专利No.US2020-0270613 A1，题目均为“IMMUNOSTIMULATORY BACTERIA ENGINEERED TO COLONIZE TUMORS,TUMOR-RESIDENT IMMUNE CELLS,AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT”，申请人是ActymTherapeutics,Inc.，以及发明人是Christopher D.Thanos、Laura Hix Glickman、JustinSkoble、Alexandre Charles Michel Iannello和Haixing Kehoe。
这个申请还涉及2018年7月11日提交的国际专利申请No.PCT/US2018/041713及2019年1月17日发布为WO 2019/014398，及涉及2018年7月11日提交的共同未决美国专利申请No.16/033,187(目前已许可)及2019年1月17日发布为美国公开号No.2019/0017050A1，题目均为“ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF”。
这个申请还涉及2019年7月11日提交的国际专利申请PCT/US2019/041489，且2020年1月16日发布为WO 2020/014543，题目为“ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIALSTRAINS AND USES THEREOF”。
在这些申请中的每一个申请中提供的免疫刺激细菌可以如本申请中所述进行修饰，并且这些细菌通过引用并入本文。在允许的情况下，这些申请中的每一个申请的主题均通过引用整体并入。
通过引用并入以电子方式提供的序列表
与本申请一起提交序列表的电子版本，其内容通过引用整体并入。该电子文件创建于2021年8月12日，大小为868kb，名称为1708SEQPC0.tx。
发明领域
提供了具有被修饰的基因组的减毒免疫刺激细菌，以例如降低不希望的炎症应答和毒性，及提高抗肿瘤活性和/或免疫刺激活性，通过提高对补体失活的抗性，通过减少免疫细胞死亡，通过促进适应性免疫及通过增强T细胞功能而实现。对于抗癌应用的吞噬细胞定植的增加改善了编码的治疗产物向肿瘤微环境和肿瘤的递送，并允许所述免疫刺激细菌的全身施用等途径。对于用作疫苗，通过适当施用，所述细菌可以在吞噬细胞中定植，包括在被病原体定植的组织中定植。
发明背景
抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1免疫检查点抗体的临床成功证明，癌症免疫治疗领域取得了长足进步(见例如Buchbinder et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3377-3383；Hodiet al.(2010)N.Engl.J.Med.363(8):711-723；和Chen et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3384-3391)。肿瘤已经进化出一种极度的免疫抑制环境。其启动多种机制以逃避免疫监视，重新编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫性，并且持续突变出对最新癌症疗法的抗性(见例如Mahoney et al.(2015)Nat.Rev.Drug Discov.14(8):561-584)。设计克服免疫耐受和逃逸及同时限制目前的免疫疗法的自身免疫相关毒性的免疫治疗方法和癌症治疗方法在免疫肿瘤学领域是个挑战。因此，需要额外的和创新的免疫疗法和其它疗法。
发明概述
本文提供的是免疫刺激细菌，由于其能够有效地定植于肿瘤、特别是肿瘤驻留免疫细胞，并且由于编码的有效载荷导致抗肿瘤免疫应答，因此是癌症治疗剂。由于其在肿瘤和肿瘤微环境中定植的能力，本文提供的免疫刺激细菌可用于治疗免疫荒漠(免疫排除)的肿瘤，这些肿瘤微环境和肿瘤中的T细胞浸润很少或没有。这些肿瘤包括有基质屏障的肿瘤。本文提供的免疫刺激细菌可以将对免疫疗法有抗性或无反应的所谓“冷”肿瘤变成“热”肿瘤。
这些免疫刺激细菌包括本文所述的基因组修饰，由此其是TLR2/4/5减弱的，如通过消除鞭毛、msbB-/pagP-表型及其它突变如消除卷曲菌毛以及其它突变如ansB-表型。这些细菌可以在体内增殖。在细菌中的质粒中编码的有效载荷是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分。特别是，这些产物包括功能获得突变，使I型IFN组成型表达。这些免疫刺激细菌还可以编码一种或多种细胞因子，如IL-15，特别是IL-15/IL-15Rα链复合物，并可以编码肿瘤相关抗原和/或双特异性T细胞衔接蛋白抗体。对于癌症治疗，所述细菌可以被全身性施用。
本文还提供了免疫刺激细菌，其可被用作和/或配制成疫苗施用于组织，如通过肌肉注射、吸入和其它这种直接途径施用。这些细菌被设计为在体内不复制，及因此包含营养缺陷型如thyA-，由此其不表达活性胸苷酸合酶，并且其在细菌中识别的启动子的控制下编码有效载荷。如果旨在使其将蛋白质有效载荷递送至接种的宿主，则编码的有效载荷包括序列或被设计成能在细菌宿主中被翻译。如果旨在使其递送RNA，则编码核酸被设计成使细菌核糖体不能翻译其，但使真核生物核糖体可以翻译其。例如，这可以通过在编码核酸中包括一个IRES来实现。所述疫苗的有效载荷包括编码免疫抗原或蛋白质的核酸，如病毒或细菌病原体的抗原。有效载荷还可以包括免疫刺激蛋白，如产物如STING，特别是修饰的STING，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，还任选细胞因子，如IL-15，如IL-15/IL-15Rα链复合物。所述疫苗根据合适的施用途径而配制，包括气雾剂和乳剂、片剂和粉剂。
提供了免疫刺激细菌，其含有基因组修饰和编码一种或多种治疗产物的质粒，如抗癌治疗剂或相关治疗。所述基因组修饰导致免疫刺激细菌在肿瘤微环境中和肿瘤驻留的免疫细胞中积累，在此其表达编码的治疗产物。本文提供的免疫刺激细菌编码一种或多种互补产物，刺激或诱导或导致在受试者产生强力的抗癌应答。
由于抗肿瘤应答和抗病毒应答之间的免疫应答相似性，本文提供的免疫刺激细菌也可用于治疗感染性疾病。所述免疫刺激细菌可以编码抗病毒或抗细菌治疗剂，如病毒或细菌产物的抑制剂，或病毒或细菌产物表达的抑制剂，或病毒或细菌的抗原。来自免疫刺激细菌和治疗性抗病原体产物的免疫应答、以及对免疫刺激蛋白和其它这种治疗药物的免疫应答的组合，提供了一种治疗性免疫刺激细菌，用于预防接种和/或治疗感染性疾病，特别是与病毒感染有关的疾病，如慢性病毒感染和潜伏病毒感染。值得关注的是慢性病毒感染，如肝炎病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、麻疹病毒以及长期感染受试者的其它这种病毒的感染。所述免疫刺激细菌也可用于治疗急性感染，如慢性流感、牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)和冠状病毒的初次感染，如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，引起COVID-19)。靶向的致病菌还包括例如埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)物种。
本文提供的免疫刺激细菌可以编码来自病原体的抗原，如病毒抗原，并作为疫苗来预防感染，或治疗现有的感染。抗原包括但不限于本领域技术人员已知的任何引起免疫保护应答或改善由病原体引起的疾病的抗原。这些免疫刺激细菌由于能够在免疫细胞如抗原呈递细胞中积累，可以激发T细胞对病原体如病毒的应答。例如，正如本文所详细描述的，本文提供的免疫刺激细菌是缺少可以抑制T细胞功能的天冬酰胺酶II的那些细菌。可以使用本文描述和提供的任何免疫刺激细菌。例如，本文描述并表明，如通过修饰细菌基因组以消除活性酶的表达来消除天冬酰胺酶II的活性，可用于编码抗原或抗原组合。由此产生的细菌促进抗病原体如抗病毒的T细胞应答。如来自病原体、细菌或病毒的抗原或其它具有在免疫细胞如抗原呈递细胞中积累的能力抗原的组合表达，提供了免受病原体感染的保护作用。例如，所述免疫刺激细菌可以编码病毒抗原，如来自病毒家族或跨病毒家族共享的基本病毒核心蛋白的抗原。例如，在冠状病毒如SARS-COV2的情况下，来自核衣壳和/或非结构性M蛋白的抗原，可以增强CD8+T细胞对严重保守和较少突变的核心蛋白的应答，从而提供广泛的泛冠状病毒保护，以提供有效的疫苗和治疗。用于免疫和/或治疗的这种冠状病毒和冠状病毒家族的蛋白质和抗原是已知的，示例在此描述，且为本领域的技术人员已知。除了棘突蛋白、其部分和修饰的刺突蛋白外，为此已经鉴定了其它蛋白质。见例如Cohen et al.,(2021)Cell Reports Medicine 2:1000354。
所述免疫刺激细菌可以编码抗病毒治疗剂或抗细菌治疗剂。这种治疗剂包括病毒基因和蛋白质的抑制剂，如复制和/或包装所需的蛋白质，或者所述免疫刺激细菌可以编码一种治疗剂，其阻止病毒与促进或供病毒进入靶细胞的受体的结合或相互作用。在一些实施方案中，编码的治疗蛋白如抗原或抗原性蛋白的表达可以在原核生物启动子的控制下进行。在其它实施方案中，所述蛋白质可以在真核生物启动子的控制下表达。启动子的选择取决于是否要在细菌中表达，如在施用前，如本文所述的在宿主中翻译的mRNA的递送，或在递送后，所述蛋白质要在宿主细胞如免疫细胞中表达。
本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，如缺失、破坏和其它改变，导致编码的产物无活性，如改变基因的全部或部分的方向，从而使功能性基因产物不被表达。在所提供的免疫刺激细菌中，其是被修饰的细菌以使所产生的细菌是msbB-/purI-的那些细菌。在一些实施方案中，所述细菌是msbB-和purI-，由此至少msbB和/或purI基因的编码部分的全长被缺失。所述细菌的基因组也可以被修饰，从而使所述细菌缺少鞭毛。这在正常表达鞭毛的细菌中实现。在这种细菌中，例如沙门氏菌属(Salmonella)中的fliC和fljB基因，或其它物种中与fliC和fljB相当的基因，可以被缺失或以其它方式修饰，由此所述功能性基因产物不被表达。所述细菌也可以被修饰，由此其是腺苷营养缺陷型，和/或是msbB-/pagP-。还提供了免疫刺激细菌和含有其的药物组合物，其中所述细菌不表达L-天冬酰胺酶II，由此所述细菌是ansB-。消除编码的天冬酰胺酶活性改善或保留了T细胞的活力/活性。治疗性细菌，如用作疫苗的灭活或减毒细菌，可以通过修饰细菌基因组来消除天冬酰胺酶活性而得到改良。这种疫苗的示例是BCG(卡介苗Bacillus Calmette-Guérin)和相关疫苗，其被用来对结核病进行免疫接种。众所周知，卡介苗的效力不一；消除天冬酰胺酶可以提高这种疫苗的效力，因为内源性细菌天冬酰胺酶会抑制或降低T细胞活性。
本文提供了含有在真核启动子控制下的编码治疗产物或治疗产物组合的质粒的免疫刺激细菌。所述细菌的基因组可含有选自以下的修饰，例如一种、两种或更多种修饰：
a)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖(LPS)，其中：
通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖；和
与野生型细菌相比，六酰化脂多糖显著减少至少10倍，或不存在；
b)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌具有减弱的Toll样受体(TLR)2、TLR4和/或TLR5的识别；
c)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活卷曲菌毛和/或纤维素的合成；
d)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成；
e)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌对于嘌呤、腺苷或ATP是营养缺陷型的；
f)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌缺少鞭毛；
g)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞；
h)缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞，并且不能在肿瘤驻留骨髓细胞中复制；和
i)缺失或破坏lppA和lppB之一或二者，以降低或消除脂蛋白在膜中的表达，由此编码的治疗蛋白质在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中的表达增加。
例如，所述免疫刺激细菌含有a)、d)和f)的修饰，包括缺失、插入和置换，或c)和d)的修饰，或a)、c)、d)、e)和f)的修饰，或a)、c)、d)、e)、f)和i)的修饰，或a)、d)、f)和i)的修饰，或c)、d)和i)的修饰，或f)和i)的修饰，或a)至i)的修饰，或a)、b)、d)和f)的修饰，或a)、b)、c)和d)的修饰，以及a)至i)的其它组合。缺失或破坏包括对基因的任何修饰，从而不表达活性基因产物。
特别地，提供了免疫刺激细菌，其基因组通过基因的全部或足够部分的缺失或破坏、包括插入而被修饰，由此所述细菌具有减弱的TLR2、TLR4和TLR5的识别。这种细菌的毒性很低，在肿瘤微环境和肿瘤驻留的骨髓细胞(如巨噬细胞)中积累/定植。这些细菌含有编码治疗产物特别是互补产物组合的质粒，所述产物如细胞因子和修饰的STING多肽，包括功能获得/组成型活性的STING蛋白、STING嵌合体，以及包括功能获得(GOF)突变的嵌合STING蛋白。所述细胞因子包括例如IL-15/IL-15Rα链复合物(在此也称为IL-15Rα/IL-15sc，或IL-15/IL-15Rα，或IL-15复合物)或IL-15或IL-12、或其它抗肿瘤免疫刺激的细胞因子或趋化因子。所述细菌还可以另外编码其它产物，如抗肿瘤抗体。本文描述并提供了产物的组合。刺激或促进抗肿瘤应答和/或递送治疗产物的产物组合，在本文的整个公开中都有描述，所述产物由免疫刺激细菌递送，所述细菌的基因组被修饰以使细菌具有低毒性并有效地定植于肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞例如巨噬细胞。这种细菌的示例是那些物种，如沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特菌属(Listeria)和大肠杆菌(E.coli)，其被修饰为不具有鞭毛，并被修饰为含有具有五乙酰化脂质A的脂多糖(LPS)，例如通过使细菌成为msbB-/pagP-而修饰。这些细菌还可以通过消除卷曲菌毛和/或减少或消除纤维素的产生和生物膜的形成来进行修饰，例如通过修饰细菌使其成为csgD-。本文表明，具有这些修饰的细菌没有最大耐受剂量(MTD)，并表现出高的肿瘤定植。
在所有实施方案中，所述免疫刺激细菌还可以包含或进一步包含编码鞭毛的基因的缺失或破坏，由此所述细菌是鞭毛蛋白-(如fliC-/fljB-)并且不产生鞭毛，其中野生型细菌具有鞭毛。所述免疫刺激细菌可以是嘌呤营养缺陷型，例如腺苷营养缺陷型；或腺苷、腺嘌呤和/或ATP营养缺陷型。所述免疫刺激细菌也可以是purI-。所述免疫刺激细菌也可以是pagP-。所述免疫刺激细菌也可以是天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)，例如当细菌是asd-时，由于编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的全部或部分破坏或缺失，从而内源性asd不表达。所述细菌可以在质粒上编码在细菌启动子控制下的天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。所述免疫刺激细菌也可以是msbB-，或可以是pagP-/msbB-。例如，所述免疫刺激细菌可以是asd-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-，或者可以是asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)和pagP-。
提供了免疫刺激细菌，其含有在真核启动子控制下编码治疗产物的质粒，或在多个真核启动子或单个启动子控制下编码多个产物。所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失基因的足够部分或通过破坏基因而被修饰，由此所述细菌是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(如fliC-/fljB-)和pagP-中的一种或多种细菌。本文提供的免疫刺激细菌还包括具有缺失或破坏的分别编码主要外膜脂蛋白Lpp1(LppA)和Lpp2(LppB)的基因lppA(lpp1)和/或lppB(lpp2)的那些细菌，以消除或基本上减少所编码的脂蛋白的表达。特别地，所述细菌是lppA-和lppB-。提供了免疫刺激细菌，其含有在真核调节序列控制下编码抗癌治疗剂或抗病原体治疗剂的质粒，并且是lppA-和lppB-。例如，所述免疫刺激细菌可以是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-(如fliC-/fljB-)、pagP-、lppA-和lppB-。
在本文的实施方案中，所述治疗产物是抗癌治疗剂或用于癌症治疗的治疗剂。所述编码的产物可以与编码分泌信号的核酸可操作地连接，由此当表达时，所述治疗产物被分泌，例如从肿瘤驻留免疫细胞中分泌。
任何免疫刺激细菌还可以具有涉及沙门氏菌(Salmonella)致病岛1(SPI-1)侵袭的一个或多个基因或操作子被缺失或失活，由此所述免疫刺激细菌不会侵入或感染上皮细胞。例如，所述一种或多种基因/操作子选自以下：avrA，hilA，hilD，invA，invB，invC，invE，invF，invG，invH，invI，invJ，iacP，iagB，spaO，spaQ，spaR，spaS，orgA，orgB，orgC，prgH，prgI，prgJ，prgK，sicA，sicP，sipA，sipB，sipC，sipD，sirC，sopB，sopD，sopE，sopE2，sprB，和sptP。
所述免疫刺激细菌中的质粒可以以低拷贝数或中等拷贝数存在。所述质粒可以含有中等至低拷贝数的复制起点，例如低拷贝数的复制起点。在一些实施方案中，所述质粒以较高的拷贝数存在。一般而言，中等拷贝数小于150或小于约150，大于20或约20，或介于20或25和150之间；低拷贝数小于25，或小于20，或小于约25，或少于约20个拷贝。具体而言，低至中等拷贝数小于约150个拷贝，或小于150个拷贝；低拷贝数小于约25个拷贝，或小于25个拷贝。
编码的治疗产物包括核酸和蛋白质。所述质粒可以编码两种或更多种治疗产物。示例的产物包括但不限于细胞因子、组成型诱导I型干扰素(IFN)的蛋白质和共刺激受体或配体。下文描述了进一步的示例组合。在一些实施方案中，所述共刺激分子缺少在抗原呈递细胞(APC)上表达的全部或部分胞质结构域，由此截短的分子能够通过共刺激受体向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失的胞质结构域或其缺失的部分而不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
编码的治疗产物可以与编码真核宿主识别的调节序列的核酸例如分泌信号可操作地连接，以实现从包含所述细菌或质粒的细胞中分泌。在免疫刺激细菌编码两种或更多种产物的实施方案中，每种产物的表达可以在单独启动子的控制下。或者，可以在单个启动子的控制下表达两种或更多种产物，并且每种产物由编码例如内部核糖体进入位点(IRES)或2A肽的核酸分开，以实现每种编码的治疗产物的单独表达。示例的2A肽是T2A、F2A、E2A或P2A，其可以在编码治疗产物的核酸的侧翼，以实现在单个启动子的控制下表达的治疗产物的单独表达。所述治疗产物在真核启动子如RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子的控制下表达。这些启动子包括是病毒启动子的RNA聚合酶II启动子，或哺乳动物RNA聚合酶II启动子，例如但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein-Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子、腺病毒启动子、延伸因子-1(EF-1)α启动子、UBC启动子、PGK启动子、CAGG启动子、腺病毒2或5晚期启动子、EIF4A1启动子、CAG启动子或CD68启动子。所述质粒进一步可包括其它真核调节序列，例如选自SV40、人生长激素(hGH)、牛生长激素(bGH)、MND(一种合成的启动子，其含有用骨髓增殖性肉瘤病毒增强子修饰的MoMuLV LTR的U3区)、鸡β-球蛋白和rbGlob(兔球蛋白)基因的终止子和/或启动子，以控制治疗产物的表达。其它调节序列包括polyA尾、土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。
编码的治疗产物包括本文和原始权利要求中描述的任何产物，例如编码是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的蛋白质的核酸，或其变体。I型干扰素包括干扰素-α和干扰素-β。变体包括当在受试者中表达时导致I型IFN组成型表达的那些变体。这些包括不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸来导致I型IFN表达的功能获得(GOF)变体。这些蛋白质的示例是选自以下的蛋白质：STING，RIG-I，MDA-5，IRF-3，IRF-5、IRF-7，IRF-8、TRIM56，RIP1，Sec5，TRAF3，TRAF2，TRAF6，STAT1，LGP2，DDX3，DHX9，DDX1，DDX9，DDX21，DHX15，DHX33，DHX36，DDX60和SNRNP200，及其具有增加的活性或导致I型干扰素(IFN)组成型表达的变体。变体包括STING、RIG-I、IRF-3或MDA5的变体，其中由于病毒感染而被磷酸化的一个或多个丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基被天冬氨酸(D)置换，由此产生的变体是组成型诱导I型IFN的磷酸模拟物，以及本领域技术人员已知和/或本文所述的任何变体。变体包括例如其中突变选自以下的那些变体：a)在STING中，参考SEQ ID NO:305-309，选自以下的一个或多个突变：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A，N154S/R284G，和S324A/S326A；b)在MDA5中，参考SEQ ID NO:310，选自以下一个或多个突变：T331I，T331R，A489T，R822Q，G821S，A946T，R337G，D393V，G495R，R720Q，R779H，R779C，L372F，和A452T；c)在RIG-I中，参考SEQ ID NO:311，E373A和C268F之一或二者；及d)在IRF-3中，参考SEQ ID NO:312，S396D，如含有参考SEQ ID NO:305-309选自以下一个或多个氨基酸置换的变体STING：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A，N154S/R284G，和S324A/S326A，及其保守置换，及其组合。
所述免疫刺激细菌还可以编码在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子或共刺激分子。这些的实例是选自以下一种或多种的蛋白质：IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，经过修饰而不与IL-2Ra结合的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，CCL3，CCL4，CCL5，参与或实现或增强T细胞募集和/或持续性的蛋白质，CD40，CD40配体(CD40L)，CD28，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，B7-CD28家族成员，CD47拮抗剂，抗IL-6抗体或IL-6结合诱饵受体，TGF-β多肽拮抗剂和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。选自CD40、CD40配体、CD28、OX40、OX40配体、4-1BB和4-1BB配体的共刺激分子可以被截短，使得该分子缺少在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其一部分；并且截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失的或部分缺失或截短的胞质结构域而不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号，以消除免疫抑制反向信号传导。其它这种蛋白质是TGF-β多肽拮抗剂，例如抗TGF-β抗体或其片段、抗TGF-β受体抗体或其片段，可溶性TGF-β拮抗剂多肽或TGF-β结合诱饵受体。
所述质粒可以编码治疗性抗体或其抗原结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、纳米抗体(nanobody)、双特异抗体(diabody)片段或单链抗体。实例包括但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2或IL-6的拮抗剂。
所述质粒可以编码互补产物，其表达导致增强的抗肿瘤或其它活性。例如，一种修饰的如本文所述的组成型活性和/或嵌合STING蛋白与细胞因子如IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15Rα-IL-15sc)的组合具有协同活性。
如本文所述，本文提供的免疫刺激细菌可通过编码针对其获得希望的免疫应答、或免疫、或免疫保护的抗原而作为疫苗使用。这里的免疫刺激细菌可用于递送RNA，如mRNA或其它形式的RNA，以用作疫苗或用于递送治疗剂。如本文所述，所述细菌含有一个质粒，所述质粒在细菌识别的细菌或其它原核生物启动子的控制下编码感兴趣的产物，如治疗产物，如来自病原体的抗原。编码核酸盒包括调节序列或其它序列，其阻断或抑制或阻止细菌核糖体的翻译，但允许或供或加强如人细胞中存在的真核细胞核糖体的翻译。所述细菌被修饰，由此其不能在真核生物中生长或复制，例如使细菌是asd-，其需要DAP在体外生长，或是ThyA-，其需要胸苷单磷酸前体以生长，但可以在体外培养使其产生编码的RNA。技术人员可以通过修饰内源性基因如通过缺失、插入、置换、转位或任何终止修饰使基因或产物失活，从而不产生活性酶。见SEQ ID NO:464是示例的沙门氏菌属ThyA基因，及SEQ ID NO:465是编码的蛋白质。编码免疫用蛋白质和/或抗原的RNA在质粒中被编码，但所述编码核酸包括翻译信号/序列，因此细菌不能翻译这种RNA。由此产生的细菌将编码的RNA递送至宿主吞噬细胞，在那里被宿主细胞核糖体翻译。是ThyA-的免疫刺激细菌具有基因组修饰，如插入、缺失、置换或其它变化，导致胸苷酸合酶无活性或消除其产生，该酶催化dUMP还原甲基化为dTMP，这是一种DNA生物合成前体(dTTP的前体)。
可以引入其它营养素和基本产物的营养缺陷体，以代替或补充asd的失活/缺失。其它生长所需的基因或基因产物的缺失或失活，如生产营养素的基因，可以用来代替或补充asd，并包括例如thyA(见例如Loessner et al.(2006)FEBS Lett 265:81-88)。用于产生这种产物的所述细菌基因组的表达或生产或其它减弱突变的消除，导致施用后体内细菌细胞死亡时释放编码的大分子。Asd是细菌细胞壁合成的一种基本酶；ThyA是DNA合成所需的一种酶。各自基因的突变使所述菌株对二氨基庚二酸(DAP)或胸苷单磷酸前体是营养缺陷型。剥夺互补底物后，这种细菌会因无DAP或胸腺嘧啶饥饿致死，导致细菌蛋白和质粒的释放。Asd的失活或消除导致大分子的释放；ThyA(产生ΔThyA细菌)表达/活性的消除或失活在胸苷饥饿时不导致大分子包括蛋白质和质粒的释放(Leossner et al.(2006)FEBS Lett265:81-88)。因此，ΔThyA对于在体内将质粒递送至宿主细胞是有利的，因为所述细菌不会过早地释放其内容物。由于本文提供的细菌感染或积聚在骨髓细胞中，例如消耗细菌的吞噬细胞如巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞，因此完整的ΔThyA细菌在靶向的细胞内释放编码治疗产物的质粒。
所述细菌经过基因组修饰，使其是减毒的例如本文的细菌，其中与没有这种基因组修饰的细菌相比，toll样受体(TLR)2、4和5的应答降低，且任选编码rck(补体杀伤抗性)基因以减少补体的失活，并根据需要包括修饰，使其主要或仅感染吞噬细胞，例如组织驻留的巨噬细胞。本文表明，基因组修饰，如降低TLR2、4、5应答的修饰组合是人抗原呈递细胞产生I型IFN的必要条件。
提供了含有基因组修饰的细菌，与没有所述基因组修饰的细菌相比，其中toll样受体(TLR)2、4和5的应答降低。这种修饰包括那些导致五酰化LPS和消除鞭毛的修饰，如缺少鞭毛的pagP-/msbB-细菌，以及那些缺陷的或不产生或表达天冬酰胺酶II的修饰，如那些Δasn细菌。所述细菌还可以包含进一步的基因组修饰，如由此其对所需的营养素或因子是营养缺陷型的一种或多种修饰，因此其不能在真核宿主中复制，但在提供所述营养素或因子时可以在体外复制，如胸苷营养缺陷型(ΔThyA)，例如通过基因组修饰使其不能产生或表达胸苷酸合酶(ΔThyA)，或Asd。
本文提供的组合了部分或全部这些特征的细菌被用来表达治疗产物，包括抗癌产物和抗原，这取决于其预期用途。对于施用于癌症的受试者，在肿瘤驻留的骨髓细胞中积累的细菌编码抗癌治疗剂，如导致刺激免疫应答的产物，和/或导致抑制免疫抑制的产物，或编码治疗肿瘤的产物，以及那些编码可协同作用于治疗癌症的组合产物的细菌。本文提供的积累在或感染吞噬细胞的细菌，也可用于没有癌症的受试者，例如通过递送或编码抗原或递送RNA以作为疫苗。各种实施方案和性质与产物的组合以及用途，在本文的整个公开中都有描述。
在一些实施方案中，所述细菌包括含有编码产物的核酸的质粒，或包括编码产物的RNA，其中所述核酸或RNA编码的产物是来自病原性病毒、细菌、寄生虫的抗原序列，或者是肿瘤抗原，由此当编码的抗原在宿主中表达时，宿主对所述病原性病毒、细菌、寄生虫或肿瘤抗原产生免疫保护性应答或免疫应答，或编码的产物是治疗产物；所述抗原序列的表达是在原核生物启动子的控制下，因此编码抗原的RNA在细菌中产生；编码抗原的核酸包含抑制或阻止细菌核糖体翻译编码RNA但不抑制或阻止真核生物宿主核糖体翻译编码的RNA的调节序列，从而使细菌中的翻译与转录脱离；所得细菌在施用于真核生物受试者时，可选择性地感染吞噬细胞，并将核酸递送至吞噬细胞，在其中RNA被翻译。
在体外培养以产生所述RNA的细菌，在施用后感染吞噬细胞并递送其内容物，但其没有活力和/或不复制，从而为宿主细胞提供RNA，如mRNA，宿主细胞翻译RNA以产生编码的产物，如免疫原性蛋白或抗原。所述RNA通常是mRNA，也可以是其它形式的RNA，如RNAi或eRNA(循环RNA)，以及其它治疗形式。用于这个目的的免疫刺激细菌可包括以高或更高(通常为150或更高)拷贝数编码RNA的质粒，以增加RNA的递送量。本文对各种实施方案进行了描述、主张和示例说明。所述mRNA可以编码病原体蛋白、病原体抗原、肿瘤抗原、治疗肿瘤或感染的治疗产物，以及其组合。所述mRNA可以是合成的，例如那些为免疫而设计的mRNA(见例如美国专利出版物20190351040，以及其它描述用于免疫或治疗的mRNA)。所得细菌是用于治疗或免疫的疫苗。所述有效载荷可包括作为佐剂的产物，即免疫刺激蛋白，其诱导I型干扰素(IFN)与免疫抗原/蛋白协同激活T细胞。
在一些实施方案中，本文提供的免疫刺激细菌含有编码两种或更多种治疗性蛋白质的质粒，所述治疗性蛋白质选自：a)在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白质；b)一种或多种蛋白质，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或其具有增加的增加I型干扰素表达的活性的变体，或其导致I型IFN组成型表达的变体；和c)抗癌抗体或其抗原结合部分。例如，免疫刺激蛋白可以是共刺激分子，其是缺少在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其足够部分的分子，由此截短的共刺激分子能通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且不能向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。在一些实施方案中，免疫刺激细菌编码至少两种治疗产物，所述治疗产物选自细胞因子、组成型诱导I型IFN的蛋白质、共刺激分子和抗癌抗体或其抗原结合部分，其可以在单个启动子的控制下。例如，编码至少两种或所有产物的核酸的表达在单个启动子的控制下，并且编码每种产物的核酸被编码2A多肽的核酸分开，由此在翻译时，每种产物单独表达。编码每种产物的核酸可以与编码指导所表达的产物从细胞中分泌的序列的核酸可操纵地连接。
提供了编码两种或更多种治疗产物的免疫刺激细菌，其中至少一种产物选自a)和至少一种产物选自b)，并且a)是IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-23、IL-36γ、与IL-2Ra结合减弱的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物(在本文也称作IL-15/IL-15Rα、IL-15复合物或其它变化用语)、IL-18、经修饰使其不与IL-2Ra结合的IL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、CCL3、CCL4、CCL5、参与或影响或增强T细胞募集和/或持续性的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员、TGF-β多肽拮抗剂或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员；以及b)是STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-5、IRF-7、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60或SNRNP200。其还可以编码TGF-β抑制性抗体、TGF-β结合诱饵受体、抗IL-6抗体和IL-6结合诱饵受体中的一种或多种。
编码的治疗产物组合的示例是以下任何治疗产物组合：IL-2和IL-12p70；IL-2和IL-21；IL-2、IL-12p70和STING GOF变体；IL-2、IL-21、和STING GOF变体；IL-2、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；IL-2、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；IL-15/IL-15Rα和IL-21；IL-15/IL-15Rα、IL-12p70，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα、IL-21，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和IL-21；IL-12p70、IL-21，和STING GOF变体；IL-12p70、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和STING GOF变体；IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和IL-18；IL-12p70、IL-18，和STING GOF变体；IL-12p70、IL-18、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-2，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体、IL-2，和IL-21；TGF-β诱饵受体、IL-2、IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-2、IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-2、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-2、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα，和IL-21；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα、IL-21、和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体，及4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-12p70，和IL-21；TGF-β诱饵受体、IL-12p70、IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-12p70、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体和IL-12p70；TGF-β诱饵受体、IL-12p70、和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体、IL-12p70，和IL-18；TGF-β诱饵受体、IL-12p70、IL-18，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体、IL-12p70、IL-18、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-2，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体、IL-2，和IL-21；抗-CTLA-4抗体、IL-2、IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-2、IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-2、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体、IL-2、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα，和STINGGOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα，和IL-21；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体、IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70，和IL-21；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70，和STINGGOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70，和IL-18；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-18，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体、IL-12p70、IL-18、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-2，和IL-12p70；CD40激动剂、IL-2，和IL-21；CD40激动剂、IL-2、IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-2、IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-2、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂、IL-2、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα，和IL-21；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂、IL-15/IL-15Rα、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂、IL-12p70，和IL-21；CD40激动剂、IL-12p70、IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-12p70、IL-21、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂和IL-12p70；CD40激动剂、IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-12p70、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂、IL-12p70，和IL-18；CD40激动剂、IL-12p70、IL-18，和STING GOF变体；CD40激动剂、IL-12p70、IL-18、STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；和CD40激动剂和STING GOF变体。
其它产物的组合包括例如IL-15和STING功能获得变体，包括如本文提供的具有功能获得突变的STING嵌合体，或IL-15Rα-IL-15sc和STING功能获得变体，包括具有功能获得突变的STING嵌合体。其它产物或其组合包括双特异性T细胞衔接蛋白 和STING蛋白，如修饰的GOF STING蛋白或STING嵌合体。如本文所述；/>和IL-15；/>和IL-15Rα-IL-15sc；/>IL-15和STING蛋白，如修饰的GOF STING蛋白或嵌合的STING蛋白；及/>IL-15Rα-IL-15sc和STING蛋白，如修饰的GOF STING蛋白或嵌合STING蛋白，其中/>靶包括例如DLL3、EGFR、Her2、CEA、间皮素、PSMA、EpCAM、CD74、叶酸受体、Nectin4、EphA2、CA-IX、B7H3、Siglec-15、Muc1、Lewis Y抗原以及其它这种肿瘤抗原/肿瘤靶。
还提供了含有肿瘤抗原和STING功能获得变体或STING嵌合体的治疗组合物；肿瘤抗原和IL-15的治疗组合物；肿瘤抗原和IL-15Rα-IL-15sc的治疗组合物；肿瘤抗原、IL-15和STING功能获得变体或STING嵌合体的治疗组合物；以及肿瘤抗原、IL-15Rα-IL-15sc和STING功能获得变体或STING嵌合体的治疗组合物。这些产物可以在免疫刺激细菌中编码。所述肿瘤抗原可以是本文列出或描述的任何抗原(例如在实施例35中)，或本领域已知的抗原。
产物的组合还包括抗原和免疫刺激蛋白的组合。所述抗原可以是肿瘤抗原，也可以是免疫抗原，如病原性抗原，其中病原体包括例如细菌、原生动物、病毒和朊病毒，以及其它导致疾病和病症的朊病毒样颗粒。所述抗原包括本文所描述或列出的，或本领域内已知的任何抗原。例如，所述组合包括一或多种抗原和IFNα2的组合；一或多种抗原和IFN-β的组合；一或多种抗原、IFNα2和IFN-β的组合；一或多种抗原和具有突变S396D的IRF3 GOF变体的组合；以及一或多种抗原、IFNα2和具有突变S396D的IRF3 GOF变体的组合。
在本文提供的免疫刺激细菌中编码的其它产物和产物组合，包括但不限于IFNα2和具有S396D突变的IRF3 GOF变体的组合；IFNα2和IFN-β；FLT-3L(FMS样酪氨酸激酶3配体；见例如SEQ ID NO:436)；唾液酸酶(见例如SEQ ID NO:435)；仅IL-12p70的IL-12p35亚单位；天青蛋白(Azurin)；一种膜锚定/拴住的细胞因子或分子，例如IL-2、IL-12、IL-12p35、IL-21、IL-15、IL-15Rα-IL-15sc或FLT-3L；或TLR8激动剂，例如TL38激动剂是polyU或polyU/G、microRNA，或是miR-21。
还提供了修饰的非人干扰素基因刺激因子(STING)蛋白和STING蛋白嵌合体，以及递送载体，包括本文中描述的任何一种，药物组合物，编码或含有这些STING蛋白的细胞，及其治疗癌症的用途和方法。具体而言，本文提供的免疫刺激细菌编码如本文所述的修饰的非人STING蛋白、非人STING蛋白和STING嵌合体。这些由免疫刺激细菌编码的STING蛋白在本文中提供并在全文中进行了描述。本文提供的是：
1.修饰的非人STING蛋白，其中所述非人STING蛋白具有低于人STING蛋白的NF-κB活化活性，并且任选与野生型(WT)人STING蛋白相比具有较高的I型干扰素活化活性。这些非人STING蛋白经过修饰以包括一个或多个突变，由此其具有增加的活性，或在没有胞质核酸信号传导的情况下组成型起作用。所述突变通常是发生在人干扰素病中的氨基酸突变，例如上文针对人STING描述的那些突变。将相应的突变引入非人物种STING蛋白中，其中通过比对鉴定相应的氨基酸残基。此外，在一些实施方案中，STING蛋白的C末端尾区(CTT)中的TRAF6结合位点被缺失，从而降低了NF-κB信号传导活性。
提供了修饰的STING蛋白，特别是人STING蛋白，其是嵌合体，其中来自一个物种例如人的STING蛋白中的CTT(C末端尾)区域被来自具有与人STING相比较低NF-κB信号传导活性和/或较高I型IFN信号传导活性的另一个物种的STING蛋白的CTT置换。此外，在这些嵌合体中任选缺失TRAF6结合位点。
所述修饰的STING蛋白也包括在本公开全文中描述的突变。
还提供了递送载体，如免疫刺激细菌，以及本文提供的或本领域技术人员已知的任何递送载体，例如包括例如外来体、纳米颗粒、微细胞、细胞、脂质体、溶酶体、溶瘤病毒和其它病毒载体，其编码上述1至3任一项的修饰的STING蛋白。
还提供了递送载体，如免疫刺激细菌，以及本文提供的或本领域技术人员已知的任何递送载体，包括例如外来体、纳米颗粒、微细胞、细胞、脂质体、溶酶体、溶瘤病毒和其它病毒载体，其编码来自非人物种的未经修饰的STING，所述非人物种STING蛋白与人STING相比具有降低的NF-κB信号传导活性降低并且任选与人STING相比具有增加的I型干扰素刺激/信号传导活性。
还提供了细胞(如果是人的话，不是受精卵)，例如用于细胞治疗的细胞，例如T细胞和干细胞，以及用于产生如本文所述STING蛋白的细胞。还提供了含有所述STING蛋白、或递送载体、或细胞、或其组合的药物组合物。
提供了通过施用如本文所述任何免疫刺激细菌治疗癌症和接种的用途和方法。
本文描述了评估STING的NF-κB活性(信号传导活性)和I型干扰素刺激活性或干扰素-β刺激活性的测定法和方法，并且也是本领域技术人员已知的方法。方法包括例如在deOliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175中描述的方法，其中特别描述了来自不同物种包括人的STING蛋白的干扰素-β和NF-κB信号传导活性，从而鉴定了来自不同物种的具有低于人STING的NF-κB活性的STING蛋白，以及具有相当于或高于人STING的干扰素-β活性的那些STING蛋白。de Oliveira Mann et al.(2019)提供了每种物种中STING的物种比对和鉴定域，包括CTT域(另见de Oliveira Mann et al.(2019)的补充信息)。
非人STING蛋白可以是但不限于来自以下物种的STING蛋白：袋獾(Sarcophilusharrisii；SEQ ID NO:349)，狨猴(Callithrix jacchus；SEQ ID NO:359)，牛(Bos taurus；SEQ ID NO:360)，猫(Felis catus；SEQ ID NO:356)，鸵鸟(Struthio camelus australis；SEQ ID NO:361)，朱鹮(Nipponia nippon；SEQ ID NO:362)，腔棘鱼(Latimeriachalumnae；SEQ ID NO:363-364)、野猪(Sus scrofa；SEQ ID NO:365)、蝙蝠(Rousettusaegyptiacus；SEQ ID NO:366)、海牛(Trichechus manatus latirostris；SEQ ID NO:367)、鬼鲨(Callorhinchus milii；SEQ ID NO:368)，和小鼠(Mus musculus；SEQ ID NO:369)。这些脊椎动物STING蛋白很容易激活人体细胞中的免疫信号传导，表明STING信号传导的分子机制在脊椎动物中是共有的(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。
本文示出凭借感染骨髓细胞例如肿瘤驻留和组织驻留巨噬细胞的能力，并在至少有限的时间内保持活力，和/或递送质粒(所述质粒编码导致I型IFN表达的治疗产物和/或其它免疫刺激产物，例如不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸以使I型IFN表达的功能获得(GOF)变体)，本文提供的免疫刺激细菌可以将具有M2表型的巨噬细胞转化为M1或M1样以及免疫抑制特性降低或消除、而免疫刺激、抗肿瘤或抗病毒特性增强或增加的巨噬细胞。提供了含有编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，其中所述细菌对巨噬细胞、包括人巨噬细胞的感染，将M2巨噬细胞转化为M1表型或M1样表型巨噬细胞。提供了含有编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，所述治疗产物在巨噬细胞中的表达导致M2巨噬细胞例如人M2巨噬细胞转化或转化为M1或M1样表型。具有这种特性的免疫刺激细菌包括本文提供的任何细菌，其含有导致肿瘤驻留(在患有癌症的受试者中)和组织驻留骨髓细胞感染的基因组修饰。这些基因组修饰包括导致细菌不具有鞭毛的那些修饰，其中野生型细菌有鞭毛，以及其它修饰，例如导致细菌是pagP-/msbB-的那些修饰。其它修饰包括导致天冬酰胺酶活性消除的修饰，例如在感染骨髓细胞的细菌中产生ansB-细菌的修饰，从而增强T细胞活性，以及改变脂多糖(LPS)的其它修饰。本文提供的这些免疫刺激性细菌将免疫抑制性吞噬性巨噬细胞转化为免疫刺激性吞噬性巨噬细胞，这些巨噬细胞能够在原位向CD8+T细胞交叉呈递抗原，并迁移到淋巴结中以引发CD4+和CD8+T细胞。
包括在巨噬细胞中编码治疗产物的免疫刺激细菌，所述治疗产物促进或导致M2巨噬细胞的转化，或将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型，M1样表型具有M1巨噬细胞的一些或全部特征。示例的治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达、特别是组成型表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的那些产物。这包括治疗产物的功能获得(GOF)变体，其是胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，并且不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸(CDN)来导致I型IFN的表达，例如本文描述和提供的变体和非人STING蛋白、STING嵌合体及具有功能获得突变的STING嵌合体。所述细菌包括可以如本文所述进行修饰的任何细菌，包括本文列出的物种，例如沙门氏菌物种和菌株。
还提供了含有与原核启动子可操作地连接的核酸的免疫刺激细菌，其中：所述核酸包含缺少原核细胞翻译所需序列的RNA，由此所述RNA在细菌中产生，但不翻译成蛋白质。例如，所述RNA缺少Shine-Dalgarno序列，并包含一个内部核糖体进入位点(IRES)和/或一个翻译通读2A肽。IRES序列阻止原核生物核糖体的翻译，但供于真核生物核糖体的翻译。所述细菌包括免疫刺激细菌，其中2A肽是T2A、P2A、E2A或F2A中的一种或多种，以从多顺反子构建体中产生分立的产物。
还提供了本文所述的免疫刺激细菌，其可以是将RNA递送至真核细胞如骨髓细胞的递送载体。这些细菌包括与原核启动子可操作地连接的核酸，其中：所述核酸和原核启动子通常在质粒上编码，但在一些实施方案中在细菌基因组中编码；所述核酸包含缺少细菌核糖体翻译所需序列的RNA，由此所述RNA在细菌中产生，并且其中：所述RNA缺少Shine-Dalgarno序列，并包含一个内部核糖体进入序列(IRES)，或一个翻译通读2A肽。所述原核生物启动子当与编码治疗性蛋白(或非细菌蛋白)的核酸可操作地连接时，可以是细菌启动子或噬菌体启动子，如噬菌体启动子。识别噬菌体启动子的RNA聚合酶可以在细菌基因组中编码，或在质粒上编码以便在细菌中表达。示例的原核生物启动子包括本领域技术人员已知的任何启动子，包括但不限于包含启动子的全部或足够部分(足以启动可操作地连接的核酸的转录)，其序列分别如SEQ ID NO:393-396任一所示：
attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtataatgcagcaag(SEQ ID NO:393)，
ttatgcttgacgctgcgtaaggtttttgttataatacaccaag(SEQ ID NO:394)，或
attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtaaatgcagcaag(SEQ ID NO:395)，或
gatcccggagttcatgcgtgatgcaatgaaagtgccgttctacttcggtgggacctcactgcttatcgttgttgtcgtgattatggactttatggctcaagtgcaaactctgatgatgtccagtcagtatgagtctgcattgaagaaggcgaacctgaaaggctacggccgttaattggtcgcctgagaagttacggagagtaaaaatgaaagttcgtgcttccgtcaagaaattatgccgtaactgcaaaatcgttaagcgtgatggtgtcatccgtgtgatttgcagtgccgagccgaagcataaacagcgccaaggctgattttttcgcatatttttcttgcaaagttgggttgagctggctagattagccagccaatcttttgtatgtctgtacgtttccatttgagtatcctgaaaacgggcttttcagcatggtacgtacatattaaatagtaggagtgcatagtggcccgtatagcaggcattaacattcctgatcagaaacacgccgtgatcgcgttaacttcgatctacggtgtcggcaagacccgttctaaagccatcctggctgcagcgggtatcgctgaaaatgttaagatcctctagatttaagaaggagatatacat(Salmonella rpsm启动子；SEQ ID NO:396)。
如本文所述，这些免疫刺激细菌包含基因组修饰，由此所述细菌感染组织驻留的骨髓细胞，和/或肿瘤驻留的骨髓细胞，或者在没有肿瘤的受试者中感染吞噬细胞如巨噬细胞。所述细菌感染细胞并递送RNA，所述RNA在真核宿主细胞中被翻译。这种细菌的示例是那些被修饰为没有鞭毛的细菌，例如通过缺失或破坏参与产生鞭毛的基因而修饰。所述细菌是在没有基因组修饰的情况下具有鞭毛的物种和菌株。
还提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物例如蛋白质与赋予改良的药理学性质如药代动力学或药效学性质如增加的血清半衰期的部分连接。因此，提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含Fc结构域或半衰期延长部分，例如人血清白蛋白或其一部分。半衰期延长方式或方法包括例如PEG化、糖基化修饰、唾液酸化、PASylation(用长度约为100至200个残基的PAS氨基酸的聚合物修饰)，ELPylation(见例如Floss et al.(2010)Trends Biotechnol.28(1):37-45)，HAPylation(用甘氨酸均聚物修饰)，与人血清白蛋白融合，与GLK融合，与CTP融合，GLP融合，与人免疫球蛋白(IgG)的恒定片段(Fc)结构域融合，与转铁蛋白融合，与非结构化多肽融合，例如XTEN(也称为rPEG，其是含有A、E、G、P、S和T的非精确重复肽序列的基因融合；见例如Schellenberger et al.(2009)Nat.Biotechnol.27(12):1186-1190)，以及增加尺寸、增加流体动力学半径、改变电荷或靶向受体以再循环而不是清除以及这种修饰和融合的组合等其它这种修饰和融合。
还提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含B7蛋白跨膜结构域，或其中治疗产物通过内源的或添加的GPI锚而是GPI锚定的。编码的治疗产物可包含与胶原蛋白的融合物。
任何和所有实施方案中的免疫刺激细菌可以是任何合适的物种。在提及特定基因和基因修饰的情况下，所述基因和修饰是对应于作为示例物种的沙门氏菌所提及的基因和修饰的那些基因和修饰。物种和菌株包括例如以下物种的菌株：立克次体属(Rickettsia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，博德特氏菌属(Bordetella)，奈瑟菌属(Neisseria)，气单胞菌属(Aeromonas)，弗朗西斯氏菌属(Francisella)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，衣原体属(Chlamydia)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，布鲁氏菌属(Brucella)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，支原体属(Mycoplasma)，军团菌属(Legionella)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，螺杆菌属(Helicobacter)，弧菌属(Vibrio)，芽孢杆菌属(Bacillus)，和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)。例如立克次氏体立克次体(Rickettsia rickettsiae)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)，恙虫立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)，莫塞氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)，西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)，支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，嗜泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila)，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)，假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，马红球菌(Rhodococcus equi)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，小肠结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)，五日热罗卡利马氏体菌(Rochalimaeaquintana)或根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)。
本文提供的是包含基因组修饰的基因组修饰的细菌，由此与没有所述基因组修饰的细菌相比，TLR2、TLR4和TLR5的信号传导减少，其中：
所述细菌包含进一步的基因组修饰，由此其对所需的营养素或因子是营养缺陷的，因此其不能在真核宿主中复制，但在提供该营养素或因子时可以在体外复制；
所述细菌包含含有核酸的质粒，或包含编码病原性病毒、细菌或寄生虫的抗原性序列的RNA，或编码肿瘤抗原的RNA，由此当编码的抗原在宿主体内表达时，该宿主对所述病原性病毒、细菌或寄生虫产生免疫保护性应答；
抗原性序列的表达是在原核生物启动子的控制下，因此编码抗原的RNA在细菌中产生；
编码抗原的核酸包含抑制或阻止细菌核糖体翻译编码的RNA、但不抑制或阻止真核生物宿主核糖体翻译编码的RNA的调节序列，从而使细菌中的翻译与转录脱离；
所得细菌在施用于真核生物受试者时感染吞噬细胞，并将核酸递送至吞噬细胞中，在其中RNA被翻译。
编码抗原性序列的核酸可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列，从而促进或增强宿主细胞的翻译，抑制或阻止细菌翻译。IRES可以是血管内皮生长因子和1型胶原蛋白诱导蛋白(VCIP；见例如SEQ ID NO:432)，编码抗原的核酸可以包含VCIP IRES或其它抑制细菌翻译的IRES。所述IRES或VCIP IRES可以包括在质粒中，其位置在启动子的3’和抗原编码序列的5’位置。
所述病原体可以是细菌或病毒，或者编码的抗原可以是肿瘤抗原。本文提供的免疫刺激细菌可以是预防或治疗病毒感染或细菌感染的疫苗，包括慢性病毒感染和急性感染。所述感染可以来自肝炎病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、Epstein-Barr病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、麻疹病毒以及其它长期感染受试者的病毒的感染。所述感染原可以是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)，或严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，引起COVID-19)。
所述病原体可以是埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或卟啉单胞菌属(Porphyromonas)的物种，或者所述病原体可以是牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)、SARS-CoV或大肠杆菌(E.coli)。
这些免疫刺激细菌中的质粒可以进一步编码免疫刺激蛋白或其它佐剂，或者可以编码免疫刺激蛋白或其它治疗蛋白的组合。所述免疫刺激蛋白可以是STING蛋白，例如包括功能获得突变的蛋白，或者是嵌合的STING蛋白。所述细菌可以包含编码治疗产物组合的质粒。所述免疫刺激蛋白和/或其它治疗蛋白可以作为多顺反子序列的一部分在质粒上编码，抗原在所述细菌识别的原核启动子控制下用；或者所述免疫刺激蛋白和/或其它治疗蛋白可以在真核宿主识别的真核启动子控制下在质粒上编码。所述原核生物启动子可以是细菌启动子或细菌噬菌体启动子，所述真核生物宿主可以是人。
所述免疫刺激细菌可以包含编码在原核生物启动子控制下表达的抗原及任何其它蛋白质的mRNA，这些蛋白质是通过在体外培养细菌产生。所述免疫刺激细菌可包含基因组修饰，由此所述细菌缺少鞭毛，并产生具有五酰化的LPS，和/或所述细菌可以是asd-，和/或是腺苷营养缺陷型，和/或csgD-和/或ansB。
所述细菌可包含编码TLR8激动剂的核酸。
所述细菌可以是msbB-/pagP-，和/或可以缺少鞭毛，和/或可以是asd-。
所述细菌可以是埃希氏菌属(Escherichia)、李斯特菌属(Listeria)或沙门氏菌属(Salmonella)的物种或菌株。例如，所述细菌可以是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)菌株，未修饰的沙门氏菌菌株是野生型菌株，或是减毒菌株。所述免疫刺激细菌可以来自AST-100菌株(VNP20009或YS1646)，或来自ATCC 14028菌株，或来自具有ATCC14028菌株的所有鉴定特征的菌株。
如本文所述，所述免疫刺激细菌可以含有一种或多种基因组修饰，这些修饰是基因的缺失、插入、破坏和其它修饰中的一种或多种，由此不产生所述基因编码的产物，或如果产生则无活性。
本文还提供了药物组合物，其包含在药学上可接受的运载体中的本文所述或提供的任何免疫刺激细菌。所述药物组合物可以配制成疫苗，例如配制成液体、粉末或片剂。还提供了所述细菌或药物组合物用于治疗或预防(减少发病风险)疾病或病症或感染或癌症的方法和用途，以及所述细菌用于递送RNA如mRNA的用途，以及为受试者递送所述RNA的方法，包括施用本文的细菌。
还提供了包含编码一种或多种产物的质粒的细菌，其中所述产物是治疗产物，且细菌中的质粒编码所述产物以产生不被所述细菌翻译的mRNA。
通过本文所述的修饰，可以使细菌减毒，或使其具有低毒性或无毒性。示例的细菌是沙门氏菌种(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株。本文提供的免疫刺激细菌包括内源性编码和表达或被修饰以编码和表达编码补体杀伤抗性(rck)基因例如沙门氏菌rck基因的那些免疫刺激细菌。例如，治疗性大肠杆菌经过修饰以编码rck，由此其可以全身施用。如本文所述并且如权利要求中所述，还提供了治疗癌症、特别是人癌症的递送载体、细胞、药物组合物、方法、用途和治疗。还提供了伴随诊断和选择治疗对象的方法，以及监测治疗的方法。这些在下文以及权利要求中进行了描述，这些权利要求全部并入本节中。
附图简述
图1A-1C描述了质粒pATI-1.75和pATI-1.76中的插入体(分别见图1A和1B)。图1C描述了Shine-Dalgarno序列被Kozak序列置换，以在真核细胞如骨髓细胞中翻译。
图2描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与袋獾STING(SEQ ID NO:349)蛋白的比对。
图3描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与狨猴STING(SEQ ID NO:359)蛋白的比对。
图4描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与牛STING(SEQ ID NO:360)蛋白的比对。
图5描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与猫STING(SEQ ID NO:356)蛋白的比对。
图6描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与鸵鸟STING(SEQ ID NO:361)蛋白的比对。
图7描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与朱鹮STING(SEQ ID NO:362)蛋白的比对。
图8描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与腔棘鱼STING(SEQ ID NO:363)蛋白的比对。
图9描述了野生型人STING(SEQ ID NO:306)与斑马鱼STING(SEQ ID NO:348)蛋白的比对.
图10描述了野生型人STING(SEQ ID NO:305)与野猪STING(SEQ ID NO:365)蛋白的比对。
图11描述了野生型人STING(SEQ ID NO:305)与蝙蝠STING(SEQ ID NO:366)蛋白的比对。
图12描述了野生型人STING(SEQ ID NO:305)与海牛STING(SEQ ID NO:367)蛋白的比对。
图13描述了野生型人STING(SEQ ID NO:305)与鬼鲨STING(SEQ ID NO:368)蛋白的比对。
图14描述了野生型人STING(SEQ ID NO:305)与小鼠STING(SEQ ID NO:369)蛋白的比对。
发明详述
大纲
A.定义
B用于癌症治疗的免疫刺激细菌概述
1.细菌癌症免疫疗法
2.现有靶向肿瘤微环境的治疗
a.自体T细胞疗法的局限性
b.病毒疫苗平台
c.细菌癌症疗法
i.李斯特菌(Listeria)
ii.沙门氏菌种(Salmonella)
iii.VNP20009
iv.野生型菌株
3.现有细菌癌症免疫疗法的局限性
C.免疫刺激细菌的修饰和增强以增加治疗指数和增加肿瘤驻留骨髓细胞中的积累
1.LPS生物合成途径中的基因缺失
a.msbB缺失
b.pagP缺失或失活
2.营养缺陷型
a.purI缺失/破坏
b.腺苷营养缺陷
c.胸苷营养缺陷
3.质粒维持和递送
a.asd缺失
b.endA缺失/破坏
4.鞭毛蛋白敲除菌株
5.工程化细菌以促进适应性免疫和增强T细胞功能
L-天冬酰胺酶II(ansB)缺失/破坏
6.产生卷曲菌毛所需的沙门氏菌基因中的缺失/破坏
csgD缺失
7.改良对补体的抗性
Rck表达
8.缺失沙门氏菌和其它革兰氏阴性菌中脂蛋白表达所需的基因
9.强大的免疫刺激细菌，其基因组针对抗肿瘤治疗进行优化，并编码治疗产物，包括多种治疗产物
10.递送RNA、包括mRNA和其它形式RNA以在真核宿主中表达的疫苗和细菌
11.针对特定抗原、包括来自病原体和肿瘤的抗原的细菌疫苗，用作抗病原体治疗和疫苗，以及抗癌治疗和/或预防
12.M2表型巨噬细胞转化为M1和M1样表型巨噬细胞
D.编码刺激肿瘤微环境中的免疫应答的遗传有效载荷的具有增强的治疗指数的免疫刺激细菌
1.免疫刺激蛋白质
a.细胞因子和趋化因子
b.共刺激分子
2.刺激免疫应答和/或I型IFN的组成型活性蛋白，非人STING蛋白，STING嵌合体和修饰形式
a.组成型STING表达和功能获得突变
b.组成型IRF3表达和功能获得突变
c.非人STING蛋白及其具有增强或组成型活性的变体，以及STING嵌合体及其具有增强或组成型活性的变体
d.作为胞质DNA/RNA传感器的其它基因产物及其组成型变体
i.RIG-I
ii.MDA5/IFIH1
iii.IRF7
e.其它I型IFN调节蛋白
3.抗体和抗体片段
a.TGF-β
b.双特异性scFvs和T细胞衔接蛋白
c.抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4抗体
i.抗-PD-1/抗-PD-L1抗体
ii.抗-CTLA-4抗体
d.其它示例的检查点靶
4.免疫调节蛋白的组合可以具有协同效应和/或互补效应
5.激活前药的分子
6.递送组合疗法的免疫刺激细菌
E.作为抗病毒治疗剂和针对其它感染原的治疗剂的免疫刺激细菌
F.构建编码治疗产物的示例性粒用于细菌递送
1.用于蛋白质异源表达的组成型启动子
2.多种治疗产物的表达盒
a.单一启动子构建体
b.双重/多重启动子构建体
3.调节元件
a.转录后调节元件
b.聚腺苷酸化信号序列和终止子
c.增强子
d.分泌信号
e.改良细菌适应性
4.复制起点和质粒拷贝数
5.CpG基序和CpG岛
6.质粒维持/选择组分
7.DNA核靶向序列
G.用作疫苗和治疗剂的示例细菌菌株和作用机制
1.示例的免疫刺激细菌--原位癌症疫苗接种的作用机制(MOA)
2.用于外周癌症疫苗接种的示例免疫刺激细菌及其作用机制
3.用于病原体疫苗接种的示例免疫刺激细菌及作用机制
H.药物制备、组合物和制剂
1.制备
a.细胞库制备
b.原料药(drug substance)制备
c.药物产物制备
2.组合物
3.制剂
a.流体、注射剂、乳剂
b.干燥的热稳定制剂
4.用于其它施用途径的组合物
5.剂量和施用
6.包装和制备产物
I.治疗方法和用途
1.选择患者以进行治疗和监测治疗的诊断
a.患者选择
b.评估或检测免疫刺激细菌活性的诊断表明治疗的有效性
2.肿瘤
3.施用
4.监测
J.实施例
A.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则本文整个公开内容中所指的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其它公开的材料均通过引用整体并入。在本文的术语有多种定义的情况下，以本节中的定义为准。在提到URL或其它这样的标识符或地址的地方，应当理解，这样的标识符可改变并且互联网上的特定信息可以发生变化，但是可以通过检索互联网来找到等价信息。对其的引用证实了这种信息的可得性和公开传播。
如本文所用，“治疗细菌”是当施用于受试者如人时实现治疗如抗癌或抗肿瘤疗法的细菌。
如本文所用，“免疫刺激细菌”是治疗细菌，当被引入受试者时，其会累积在免疫豁免组织和细胞中，例如肿瘤、肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞中，并复制和/或表达免疫刺激性或导致免疫刺激的产物。例如，由于免疫刺激细菌除了主要在免疫豁免环境如肿瘤微环境(TME)中之外不能复制和/或表达产物(或具有降低的复制/产物表达)，所以由于降低的毒性或致病性和/或由于所编码的产物降低的毒性或致病性，因此所述免疫刺激细菌在宿主中被减毒。本文提供的免疫刺激细菌被修饰以编码一种或多种产物或表现出使其具有免疫刺激性的性状或性质。所述免疫刺激细菌还包括基因组修饰，从而使内源性产物不被表达。可以说所述细菌在这种产物中被缺失。本领域的技术人员认识到，基因可以通过缺失、破坏、包括转座或插入转座子、插入和任何其它消除基因产物的变化而失活。这可以通过插入、缺失和/或破坏、包括转座或包含转座子来实现。被失活的基因的实例包括例如msbB、pagP、ansB、编码卷曲菌毛的基因、编码鞭毛的基因从而使所述细菌缺少鞭毛，以及本文所述和/或本领域技术人员已知的其它修饰。本领域的技术人员还理解，各种细菌物种中的相应基因可能有不同的名称。在免疫刺激细菌中编码的产物、性质和性状包括但不限于例如以下中的至少一种：免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子或共刺激分子；胞质DNA/RNA传感器或其功能获得或组成型活性变体(例如STING、IRF3、IRF7、MDA5、RIG-I)；RNAi，如siRNA(shRNA和microRNA)，或CRISPR，其靶向、破坏或抑制免疫检查点基因如TREX1、PD-1、CTLA-4和/或PD-L1；抗体及其片段，例如抗免疫检查点抗体、抗IL-6抗体、抗VEGF抗体或TGF-β抑制性抗体；其它抗体构建体，例如双特异性T细胞衔接蛋白(抗体)；可溶性TGF-β受体，其用作诱饵以结合TGF-β或TGF-β拮抗多肽；和IL-6结合诱饵受体。免疫刺激细菌还可以包括修饰，所述修饰使细菌对于是免疫抑制性或在免疫抑制途径中的代谢物如腺苷呈营养缺陷型。
如本文所用，菌株名称VNP20009(见例如国际PCT申请公开号WO 99/13053，也参见美国专利号6,863,894)、YS1646和41.2.9可互换使用，均是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号为202165的菌株。NP20009是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的修饰的减毒株，含有在msbB和purI中缺失或其它修饰，由野生型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株ATCC#14028产生。
如本文所用，菌株名称YS1456和8.7可互换使用，均是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号为202164的菌株(参见美国专利号6,863,894)。
如本文所用，提及细菌“衍生自”特定菌株意味着这种菌株可以用作起始材料并且可以被修饰以产生特定细菌。
如本文所用，“表达盒”是指包括用于基因表达的调节序列的核酸构建体，其可操作地连接于编码开放阅读框(ORF)的核酸，该开放阅读框(ORF)编码有效载荷，例如治疗产物或其它蛋白质。
如本文所用，2A肽是长度为18至22个氨基酸(aa)的病毒寡肽，其在真核细胞中翻译期间介导多肽的切割。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域，不同的病毒2A通常以其来源的病毒命名。其中示例的是F2A(口蹄疫病毒2A)、E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2A)和T2A(明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A)。见例如Liuet al.(2017)Scientific Reports 7:2193，图1，编码序列。也见SEQ ID NO:327-330所示。这些肽通常共享DxExNPGP的核心序列基序，并存在于大量病毒家族中。其通过导致核糖体无法形成肽键来帮助分解多蛋白。2A肽提供给多顺反子载体，其中多种蛋白质从单个开放阅读框(ORF)表达。出于本文的目的，2A肽包括那些天然存在的肽及其任何修饰形式，例如与任何天然存在的2A肽具有97％、98％或99％序列相同性的任何肽，包括本文公开的那些，其导致从包含多个(2个或更多个)开放阅读框的转录物中转录和翻译单个多肽。
如本文所用，“干扰素病”是指由于参与调节或诱导干扰素表达的途径的基因产物中的突变而与干扰素上调相关的病症。所述产物的活性通常由介导物调节，如胞质DNA或RNA或核苷酸；当蛋白质产物被突变时，所述活性是组成型的。I型干扰素疾病包括一系列病症，包括重度形式的Aicardi-Goutières综合征(AGS)，和较轻的家族性冻疮红斑狼疮(Familial Chilblain Lupus，FCL)。可以在体外产生编码具有这些性质的突变产物的核酸分子，例如通过选择这样的突变，其产生与具有正常活性的等位基因产物相比具有功能获得性的产物，或与本文所述的疾病相关的功能获得性突变体相比具有进一步的功能获得性产物。
如本文所用，“功能获得突变”是与没有所述突变的相同蛋白质相比增加蛋白质活性的突变。例如，如果蛋白质是受体，其对于配体的亲和力则增加；如果其是酶，其将具有增加的活性，包括组成型活性。特别就产物而言，如STING、IRF3、IRF7、MDA5、RIG-I，组成型活性产物是指在没有其激活配体如STING的cGAS和/或在没有胞质核酸如DNA、RNA、核苷酸、二核苷酸、环状核苷酸和/或环二核苷酸或导致I型干扰素产生的其它核酸分子的情况下是活性的产物。胞质中的这些核酸分子发生于病毒或细菌感染和/或辐射或其它此类暴露，导致激活宿主对此类病原体的免疫应答。
如本文所用，“复制起点”是在染色体、质粒或病毒中在此处开始复制的DNA序列。对于小DNA，包括细菌质粒和小病毒，单个起点即足够。
复制起点决定了载体拷贝数，这取决于选择的复制起点。例如，如果表达载体源自低拷贝数质粒pBR322，则拷贝数在约15至20个拷贝/细胞之间，如果源自高拷贝数质粒pUC，则可以是500至700个拷贝/细胞。如本文所用，细胞中质粒的中等拷贝数是约或是150或小于150，低拷贝数是5至30，例如20或小于20。低至中等拷贝数小于150个拷贝/细胞。高拷贝数是大于150个拷贝/细胞。
如本文所用，“CpG基序”是包括由在中央CpG侧翼(在其3’和5’侧上)的至少一个碱基包围的未甲基化的中央CpG(“p”是指连续的C和G核苷酸之间的磷酸二酯键)的碱基模式。CpG寡聚脱氧核苷酸是长度至少约10个核苷酸及包括未甲基化的CpG的寡聚脱氧核苷酸。5’CG 3’中至少C是未甲基化的。
如本文所用，“RIG-I结合序列”是指直接的5’三磷酸(5’ppp)结构，或者从聚(dA-dT)序列由RNA pol III合成的5’三磷酸(5’ppp)结构，其通过与RIG-I的相互作用可以通过RIG-I途径激活I型IFN。所述RNA包括至少4个A核糖核苷酸(A-A-A-A)；其可以含有4、5、6、7、8、9、10或更多个核糖核苷酸。将RIG-I结合序列引入细菌的质粒中以转录成polyA。
如本文所用，“细胞因子”是在细胞信号传导中重要的小蛋白质(约5-20kDa)的宽松类别。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子是细胞信号传导分子，其有助于免疫应答中的细胞通信，并刺激细胞向炎症、感染和创伤部位移动。
如本文所用，“趋化因子”是指化学引诱(趋化性)细胞因子，其与趋化因子受体结合，包括从天然来源分离的蛋白质以及如通过重组方式或化学合成而合成制备的那些。示例的趋化因子包括但不限于IL-8、IL-10、GCP-2、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、ENA-78、PBP、CTAPIII、NAP-2、LAPF-4、MIG(CXCL9)、CXCL10(IP-10)、CXCL11、PF4、SDF-1α、SDF-1β、SDF-2、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、MIP-1γ(CCL9)、MIP-2、MIP-2α、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MIP-5、MDC、HCC-1、ALP、lungkine、Tim-1、嗜酸细胞激活趋化因子-1、嗜酸细胞激活趋化因子-2、I-309、SCYA17、TRAC、RANTES(CCL5)、DC-CK-1、淋巴细胞趋化因子、和分形趋化因子(fractalkine)以及其它本领域技术人员已知的趋化因子。趋化因子参与免疫细胞向炎症部位的迁移，以及免疫细胞的成熟和适应性免疫应答的产生。
如本文所用，“免疫刺激蛋白”是在肿瘤微环境中呈现或促进抗肿瘤免疫应答的蛋白质。示例的这种蛋白质是细胞因子、趋化因子和共刺激分子，例如但不限于：IFN-α，IFN-β，GM-CSF，IL-2，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15/IL-15Rα链复合物(在本文也称作IL-15/IL-15Rα、IL-15Rα-IL-15sc、IL-15复合物及其它变化用语，如本文所述)，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经修饰为不结合IL-2Ra的IL-2，CXCL9，CXCL10(IP-10)，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，参与T细胞潜在募集/持续性的分子，CD40，CD40配体(CD40L)，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，具有缺失的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)或具有部分缺失的(截短的)胞质结构域的4-1BBL，B7-CD28家族成员，以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
所述免疫刺激蛋白是截短的共刺激分子，例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L，每个都具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域的完全或部分缺失。这些截短的基因产物，例如缺失或部分缺失所述胞质结构域的那些基因产物，是截短的，由此其能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，但由于缺失或截短的胞质结构域而不能对APC发出反调节信号。
如本文所用，“胞质结构域缺失”是包含蛋白质的胞质结构域或胞内结构域的全部或部分氨基酸残基的缺失，其中所述缺失足以通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号传导，且足以抑制对APC发出反调节信号传导。例如，人4-1BBL(也称为TNFSF9)的胞质结构域包含SEQ ID NO:342的第1至28位氨基酸残基。人CD80的胞质结构域包含所述蛋白质的第264至288位氨基酸残基；人CD86的胞质结构域包含所述蛋白质的第269至329位氨基酸残基；人CD27L(也称为CD70)的胞质结构域包含所述蛋白质的第1至17位氨基酸残基；人B7RP1(也称为ICOSLG或ICOS配体)的胞质结构域包含所述蛋白质的第278至302位氨基酸残基；以及人OX40L(也称为TNFSF4或CD252)的胞质结构域包含所述蛋白质的第1至23位氨基酸残基。
如本文所用，“诱饵受体”是可以有效地特异性结合特定生长因子或细胞因子、但在结构上不能发出信号或激活预期受体复合物的受体。诱饵受体通过与配体结合并阻止其与其同源受体结合而起到抑制剂的作用。
例如，TGF-β家族受体包括细胞表面丝氨酸/苏氨酸激酶受体I型(TβRI或TGFβR1)和II型(TβRII或TGFβR2)，其在二聚配体存在下形成异聚复合物，以及包括III型受体β聚糖(TβRIII或TGFβR3)。TGF-β的可溶性诱饵受体，其阻止TGF-β与其受体结合，包括TβRI、TβRII或TβRIII(β聚糖)的可溶性胞外结构域(TGF-β结合区)，所述结构域可以与其它分子例如Fc结构域融合。此外，BAMBI(骨形态发生蛋白(BMP)和激活素膜结合抑制剂)在结构上与I型受体相关并充当抑制受体激活的诱饵。显性阴性TGFβR2(DN-TGFβR2)，其包含TGFβR2的细胞外结构域和跨膜区，但缺少信号传导所需的胞质结构域，也可用作TGF-β诱饵受体(见例如国际申请公开号WO 2018/138003)。
如本文所用，共刺激分子激动剂是在与共刺激分子结合后激活其或增加其活性的分子。例如，所述激动剂可以是激动剂抗体。CD40激动剂抗体包括例如CP-870,893、达西组单抗(dacetuzumab)、ADC-1013(mitazalimab)和Chi Lob 7/4。
如本文所用，胞质DNA/RNA传感器通路是由存在DNA、RNA、核苷酸、二核苷酸、环核苷酸和/或环二核苷酸或其它核酸分子引发的途径，其导致I型干扰素的产生。胞质中的核酸分子来自病毒或细菌或放射或其它这种暴露，导致宿主免疫应答的激活。
如本文所用，“I型干扰素途径蛋白”是诱导先天免疫应答、例如诱导I型干扰素的蛋白质。
如本文所用，“胞质DNA/RNA传感器”是导致免疫答介质如I型干扰素的表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的蛋白质。“胞质DNA/RNA传感器”包括I型干扰素途径蛋白。例如，如本文所述和本领域技术人员已知的，胞质DNA由cGAS感测，导致产生cGAMP和随后的STING/TBK1/IRF3信号传导及I型干扰素产生。细菌环二核苷酸(CDN，如细菌环状di-AMP)也激活STING。因此，STING是一种诱导I型干扰素的免疫刺激蛋白。5’-三磷酸RNA和双链RNA由RIG-I和单独的MDA-5或MDA-5/LGP2感测。这导致线粒体MAVS(线粒体抗病毒信号传导蛋白)聚合，并还激活TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3)。这种途径中的蛋白质是免疫刺激性的并导致先天免疫应答介质如I型干扰素的表达。可以修饰DNA/RNA传感器通路中的免疫刺激蛋白，使其在没有胞质核酸的情况下具有增加的活性或组成型作用，从而导致免疫应答，例如I型干扰素的表达。
如本文所用，先天免疫蛋白STING的“羧基末端尾区”或“C末端尾区”(CTT)是指STING蛋白的C末端部分，其在野生型STING蛋白中通过灵活的接头区域连接于cGAMP结合结构域。CTT包括IRF3结合位点、TBK1结合位点和TRAF6结合位点。STING通过TANK结合激酶1(TBK1)磷酸化STING蛋白C末端尾区(CTT)，而促进诱导干扰素β(IFN-β)产生。STING和TBK1之间的相互作用是由STING羧基末端尾区(CTT)中进化上保守型的8个氨基酸残基序列片段介导的。TRAF6催化STING上K63连接的遍在蛋白链的形成，导致转录因子NF-κB的激活和诱导另一STING依赖性基因表达程序。缺失或破坏CTT中的TRAF6结合位点可降低NF-κB信号传导的激活。用来自具有低NF-κB活化的物种的STING蛋白的CTT(或其相应部分)取代人STINGCTT(或其一部分)，可以降低所得修饰的人STING蛋白对NF-κB的激活。STING CTT是一段非结构化的约40个氨基酸的序列，含有STING磷酸化和IRF3募集所需的序列基序(参见deOliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。人STING残基S366已被鉴定是主要TBK1磷酸化位点，其是激活干扰素信号传导的先天免疫适配子蛋白所共有的LxIS基序的一部分(参见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。人STINGCTT含有第二个PxPLR基序，其包括TBK1结合所需的残基L374；LxIS和PxPLR序列在脊椎动物STING等位基因中是保守的(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。示例的STING CTT序列和IRF3、TBK1和TRAF6结合位点列于下表中：
如本文所用，经过修饰从而“在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少细胞死亡”或“在免疫细胞中诱导较少细胞死亡”的细菌是比未经修饰的细菌毒性小的细菌，或者与未经修饰的细菌相比毒力降低的细菌。这种修饰的示例是消除吞噬细胞中细胞焦亡和改变细菌上脂多糖(LPS)谱的那些修饰。这些修饰包括破坏或缺失鞭毛蛋白基因、pagP、SPI-1途径的一种或多种组分如hilA、杆状蛋白(例如prgJ)、针状蛋白(例如prgI)和QseC。
如本文所用，“经过修饰以使其优先感染肿瘤驻留免疫细胞”或“经过修饰以使其优先感染免疫细胞”的细菌在其基因组中具有修饰，从而降低其感染除免疫细胞之外的细胞的能力。这种修饰的示例是破坏3型分泌系统或4型分泌系统或影响细菌侵入非免疫细胞的能力的其它基因或系统的修饰。例如，修饰包括破坏/缺失SPI-1组分，该组分是沙门氏菌感染细胞例如上皮细胞所需的，但不影响沙门氏菌对免疫细胞例如吞噬细胞的感染。
如本文所用，“修饰”是指多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸或核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法对于本领域技术人员来说是常规的，例如通过使用重组DNA方法。
如本文所用，对细菌基因组或质粒或基因的修饰包括缺失、置换和插入核酸。
如本文所用，RNA干扰(RNAi)是生物学过程，其中RNA分子通过中和靶向的mRNA分子以抑制翻译并由此抑制靶向的基因的表达来抑制基因表达或翻译。
如本文所用，通过RNAi起作用的RNA分子是指借助其使靶向基因表达沉默而是抑制性的。沉默表达意味着靶向基因的表达被降低或阻抑或抑制。
如本文所用，经由RNAi的基因沉默被称作是抑制、阻抑、破坏或沉默靶向基因的表达。靶向基因含有与抑制性RNA中的序列相对应的核苷酸序列，从而抑制性RNA使靶mRNA的表达沉默。
如本文所用，抑制、阻抑、破坏或沉默靶向基因是指改变靶向基因的表达如翻译的过程，由此降低了由靶向基因编码的产物的活性或表达。降低包括完全敲除或部分敲除，由此参考本文提供的和本文施用的免疫刺激细菌，得以实现治疗。
如本文所用，小干扰RNA(siRNA)是通常长度为约21个核苷酸的小片段的双链(ds)RNA，在每个末端带有3’突出部分(2个核苷酸)，可通过在特定序列处结合并促进信使RNA(mRNA)的降解来“干扰”蛋白质的翻译。这样做时，siRNA基于其相应mRNA的核苷酸序列阻止特定蛋白质的产生。这个过程称为RNA干扰(RNAi)，也称为siRNA沉默或siRNA敲低。
如本文所用，短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹转角的人工RNA分子，可用于通过RNA干扰(RNAi)使靶基因表达沉默。shRNA在细胞中的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来完成。
如本文所用，肿瘤微环境(TME)是肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓衍生的炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ECM)。存在的病况包括但不限于血管生成增加、缺氧、低pH、乳酸浓度增加、丙酮酸浓度增加、间质液压力增加以及代谢物或代谢改变，例如较高的腺苷水平，这些表明存在肿瘤。
如本文所用，免疫沙漠肿瘤或免疫排斥肿瘤是指没有肿瘤浸润T细胞的肿瘤。免疫沙漠肿瘤是实体肿瘤，其中最小的效应免疫细胞侵润肿瘤中，并且肿瘤中没有免疫应答。沙漠肿瘤没有肿瘤浸润淋巴细胞，肿瘤包括肿瘤实质、基质和肿瘤周边中没有CD8+T细胞。
如本文所用，“细菌转染(bactofection)”是指细菌介导的基因或质粒DNA转移到真核细胞例如哺乳动物细胞中。
如本文所用，人I型干扰素(IFN)是调节免疫系统的活性的干扰素蛋白的亚组。所有I型IFN都与特定的细胞表面受体复合物例如IFN-α受体结合。I型干扰素包括IFN-α和IFN-β等。骨髓细胞是IFN-α和IFN-β的主要生产者，其具有主要参与先天性免疫应答的抗病毒活性。两种类型的IFN-β是IFN-β1(IFNB1)和IFN-β3(IFNB3)。
如本文所用，M1巨噬细胞表型和M2巨噬细胞表型是指巨噬细胞表型分成的两大类：M1(经典活化巨噬细胞)和M2(替代活化巨噬细胞)。M1巨噬细胞的作用是分泌促炎细胞因子和趋化因子，并呈递抗原，由此其参与正向免疫应答，起到免疫监测的作用。其产生的主要促炎细胞因子是IL-6、IL-12和TNF-α。M2巨噬细胞主要分泌精氨酸酶-I、IL-10、TGF-β及其它抗炎细胞因子，具有减轻炎症、促进肿瘤生长和免疫抑制功能。具有M1样表型的巨噬细胞分泌促炎细胞因子，并且不具有M2巨噬细胞的免疫抑制活性。将M2巨噬细胞转化为具有M1或M1样表型的巨噬细胞会将M2巨噬细胞转化为不具有免疫抑制作用但参与抗肿瘤应答的巨噬细胞。转化为具有M1或M1样表型的巨噬细胞的M2巨噬细胞表现出更多的促炎细胞因子/趋化因子和受体，例如CD80和CCR7，以及趋化因子，例如IFNγ和CXCL10。M1表型标志物包括但不限于CD80、CD86、CD64、CD16和CD32中的一种或多种。M1巨噬细胞中一氧化氮合酶(iNOS)的表达也可以作为表型标志物。CD163和CD206是鉴定M2巨噬细胞的主要标志物。M2型细胞的其它表面标志物还包括CD68。任何M2标志物的减少或消除，以及指示M1巨噬细胞的细胞因子/趋化因子的增加，均反映了从M2表型到M1或M1样表型的转变。下文的章节以及关于M2至M1样或M1表型转换的工作实施例，描述了示例的细胞因子谱和诱导的标志物。
如本文所用，核酸或编码的RNA靶向基因的表述是指其通过任何机制抑制或阻抑或沉默基因的表达。通常，这种核酸包括与靶向基因互补的至少一部分，其中该部分足以与互补部分形成杂交体。
如本文所用，“缺失”当指核酸或多肽序列时，是指与序列例如靶多核苷酸或多肽或天然或野生型序列相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失。
如本文所用，“插入”在指核酸或氨基酸序列时，描述了在靶、天然、野生型或其它相关序列内包含一个或多个另外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比包含一个或多个插入的核酸分子在序列的线性长度内含有一个或多个另外的核苷酸。
如本文所用，“添加”至核酸和氨基酸序列描述了与另一序列相比在任一末端添加核苷酸或氨基酸。
如本文所用，“取代”或“置换”是指用可选的核苷酸或氨基酸置换天然的、靶、野生型或其它核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸，而不改变分子的长度(如核苷酸数或残基数所述)。因此，分子中的一个或多个取代不会改变分子的核苷酸或氨基酸残基的数目。与特定多肽相比的氨基酸置换可以依据沿着多肽序列长度的氨基酸残基的数目表示。
如本文所用，“在对应于…的位置”或核苷酸或氨基酸位置“对应于”如序列表中所述的公开序列中的核苷酸或氨基酸位置的表述，是指在使用标准比对算法例如GAP算法与所公开的序列以使相同性最大化进行比对时鉴别的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守且相同氨基酸残基作为指导鉴别相应的残基。通常，为鉴别相应位置，将氨基酸序列进行比对，以获得最高位的匹配(见例如ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；和Carrillo et al.(1988)SIAM J.Applied Math 48:1073)。
如本文所用，序列的比对是指使用同源性来比对两个或更多个核苷酸或氨基酸序列。通常，将以50％或更多相同性相关的两个或更多个序列进行比对。比对的序列组是指在相应位置进行比对的及可以包括与基因组DNA序列比对的衍生自RNA的比对序列例如EST和其它cDNA的2个或更多个序列。相关或变体多肽或核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这种方法通常使匹配最大化，并且包括例如使用手动比对以及通过使用许多可用的比对程序(例如BLASTP)的方法，和本领域技术人员已知的其它方法。通过比对多肽或核酸的序列，本领域技术人员可以使用保守且相同氨基酸残基作为指导来鉴别相似的部分或位置。此外，本领域技术人员还可以使用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导，在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸或核苷酸残基。相应的位置也可以基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构的比对。在其它情况下，可以识别相应的区域。本领域技术人员还可以使用保守氨基酸残基作为指导，在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸残基。
如本文所用，多肽例如抗体的“性质”是指多肽表现出的任何性质，包括但不限于结合特异性、结构构型或构象、蛋白质稳定性、对蛋白水解的抗性、构象稳定性、耐热性和对pH条件的耐受性。性质的变化可以改变多肽的“活性”。例如，抗体多肽结合特异性的变化可以改变所述多肽结合抗原的能力和/或各种结合活性，例如亲和力或亲合力，或体内活性。
如本文所用，多肽例如抗体的“活性”或“功能活性”是指所述多肽表现出的任何活性。这些活性可以凭经验确定。示例的活性包括但不限于例如通过抗原结合、DNA结合、配体结合或二聚作用或酶活性例如激酶活性或蛋白水解活性与生物分子相互作用的能力。对于抗体(包括抗体片段)，所述活性包括但不限于特异性结合特定抗原的能力、抗原结合的亲和力(例如高或低亲和力)、抗原结合的亲合力(例如高或低亲合力)、结合率(on-rate)、解离率(off-rate)、效应子功能例如促进抗原中和或清除、病毒中和的能力、以及体内活性例如防止病原体感染或侵入，或促进清除，或穿透体内的特定组织或流体或细胞的能力。可以使用公认的测定法在体外或体内评估活性，所述测定例如ELISA、流式细胞计量术、表面等离子共振或等价测定以测量结合率或解离率、免疫组织化学和免疫荧光组织学和显微镜检查、基于细胞的测定和结合测定(例如淘选测定)。
如本文所用，“结合”、“结合的”或其语法上的变化是指分子参与与另一分子的任何有吸引力的相互作用，导致两个分子彼此紧邻的稳定缔合。结合包括但不限于非共价结合、共价结合(例如可逆和不可逆的共价结合)，及包括分子例如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子如包括药物在内的化合物之间的相互作用。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或完全合成的，例如重组产生的，包括含有免疫球蛋白分子的可变重链和轻链区的至少一部分的其任何片段，其足以形成抗原结合位点，以及在组装时足以特异性结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。例如，抗体是指含有两条重链(其可以表示为H和H’)和两条轻链(其可以表示为L和L’)的抗体，其中每条重链可以是足以形成抗原结合位点的全长免疫球蛋白重链或其一部分(例如，重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，每条轻链可以是足以形成抗原结合位点的全长轻链或其一部分(例如，轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。通常，抗体最少包括可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的全部或至少一部分。抗体还可以包括全部或部分恒定区。
出于本文的目的，术语抗体包括全长抗体及其一部分，包括抗体片段，例如抗CTLA-4抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、scFv-Fc片段(其中scFv中的VH结构域连接至Fc，例如人IgG1 Fc)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(anti-Id)抗体或上述任何一种抗体的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类别(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。用于人治疗的抗体通常是人抗体或人源化抗体。
如本文所用，“抗体片段”是指(i)含有可变重链和/或轻链的单价和单特异性抗体衍生物，或抗体的功能片段并且缺少Fc部分；和(ii)(如串联scFv)、双亲和重新定向抗体(DART)、其它二聚或多聚抗体、双抗体和单链双抗体(scDb)。因此，抗体片段包括：例如Fab、Fab’、scFab、scFv、Fv片段、纳米抗体(见例如衍生自双峰驼(Camelus bactriamus)、单峰驼(Camelus dromedarius)或羊驼(Lama pacco)的抗体)(见例如美国专利号5,759,808；和Stijlemans et al.(2004)J.Biol.Chem.279:1256-1261)、VHH、单域抗体(dAb或sdAb)、最小识别单元、单链双抗体(scDb)、/>抗体和DART抗体，及其它结合抗原的抗体构建体。通常，所述抗体片段具有低于60kDa的分子量。
如本文所用，“核酸”是指通常通过磷酸二酯键连接在一起的至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。术语“核酸”还包括核酸的类似物，例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA和其它这种类似物和衍生物或其组合。核酸还包括DNA和RNA衍生物，所述DNA和RNA衍生物含有例如核苷酸类似物或“主链”键而不是磷酸二酯键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。该术语还包括由核苷酸类似物和单链(有义或反义)和双链核酸制成的RNA或RNA的等价物、衍生物、变体和类似物。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
如本文所用，分离的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分开的核酸分子。当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其它化学品。本文提供的示例的分离的核酸分子包括编码本文提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”是指所述核酸区域在功能上彼此相关。其指的是一种并置，从而如此描述的组件处于允许其以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响或实现编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。例如，可以将编码前导肽的核酸可操作地连接于编码多肽的核酸，由此可以转录和翻译所述核酸以表达功能性融合蛋白，其中前导肽实现融合多肽的分泌。在一些情况下，将编码第一个多肽(例如前导肽)的核酸与编码第二个多肽的核酸可操作地连接，并且将核酸转录为单个mRNA转录物，但是mRNA转录物的翻译可以产生被表达的两个多肽之一。例如，琥珀终止密码子可以位于编码第一个多肽的核酸与编码第二个多肽的核酸之间，使得当引入到部分琥珀抑制细胞中时，所得单个mRNA转录物可以被翻译以产生含有第一个和第二个多肽的融合蛋白，或者可以被翻译仅产生第一个多肽。在另一个实例中，启动子可以与编码多肽的核酸可操作地连接，由此所述启动子调节或介导核酸的转录。
如本文所用，提及例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽时所用“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或基因或多肽分子。
如本文所用，天然存在的α-氨基酸的残基是在自然界中发现的那些20种α-氨基酸的残基，其通过带电荷的tRNA分子与其在人体内同源mRNA密码子的特异性识别而掺入蛋白质中。
如本文所用，“多肽”是指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
如本文所用，“肽”是指长度为2至约40或40个氨基酸的多肽
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基团的有机化合物。多肽包含两个或更多个氨基酸。出于本文的目的，所提供的抗体和免疫刺激蛋白中含有的氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸(见下表)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(例如其中α-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，存在于本文中出现的多肽的各种氨基酸序列中的氨基酸根据其熟知的三字母或单字母缩写识别(见下表)。存在于各种核酸分子和片段中的核苷酸以本领域常规使用的标准单字母名称命名。
如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键处化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基通常是“L”异构体形式。“D”异构体形式的残基可以被任何L-氨基酸残基取代，只要多肽保留期望的功能性质即可。NH2是指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽羧基末端的游离羧基。根据J.Biol.Chem.,243:3557-59(1968)中描述并在37C.F.R.§§1.821-1.822下接受的标准多肽命名法，氨基酸残基的缩写如下表所示：
本文中由式表示的氨基酸残基的所有序列在氨基末端至羧基末端的常规方向上是从左至右的方向。短语“氨基酸残基”定义为包括在以上对应表中列出的氨基酸，以及修饰的、非天然的和非常见的氨基酸。氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列或与氨基末端基团如NH2或与羧基末端基团如COOH的肽键。
在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守取代为本领域技术人员已知，通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，通常多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物学活性(见例如Watson et al.,MolecularBiology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224)。
这种取代可以根据下表中列出的示例取代进行：
示例的保守氨基酸取代
原始残基 示例的保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
其它取代也是允许的并可以根据经验确定或根据其它已知保守或非保守取代确定。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指存在于多肽中的20个L-氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但已被结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此，非天然存在的氨基酸包括例如除20个天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例的非天然氨基酸为本领域技术人员已知，包括但不限于2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(bAad)、β-丙氨酸/β-氨基丙酸(Bala)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁酸/哌啶酸(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2,4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链素(Des)、2,2’-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟基赖氨酸(Hyl)、别羟基赖氨酸(Ahyl)、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和鸟氨酸(Orn)。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其含有以自然界中未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工操作的结果存在，包括所操作的分子的克隆和其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5’至3’方向读取时，其编码特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以从天然来源中分离、体外合成、或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中根据核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)给出。在上下文允许的情况下，术语核苷酸是指单链和双链分子。当将该术语应用于双链分子时，其用于表示整个长度，且应理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员将认识到，双链多核苷酸的两条链在长度上可以略有不同，其末端可以是交错的；因此，双链多核苷酸分子中的所有核苷酸不能配对。这种未配对末端在长度上通常将不超过20个核苷酸。
如本文所用，通过重组方法产生是指使用分子生物学熟知的方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，“异源核酸”是编码产物(即RNA和/或蛋白质)的核酸，所述产物在体内不由产物在之中表达的细胞正常产生，或者异源核酸是处于通常其不存在于之中的基因座中的核酸，或者是介导或编码通过影响转录、翻译或其它可调节的生化过程来改变内源核酸如DNA的表达的介导物的核酸。异源核酸，如DNA，也称为外来核酸。本领域技术人员认识到或认为对于核酸在其中表达的细胞而言是异源或外来的任何核酸如DNA，在本文中均为异源核酸所涵盖；异源核酸包括也是经内源表达而外源加入的核酸。异源核酸通常对于其所导入之中的细胞而言不是内源的，而是已经从另一细胞获得或合成制备，或被导入其非天然存在于之中的基因组基因座中，或其表达处于调节序列或者不同于天然调节序列的序列的控制下。
本文的异源核酸的实例包括但不限于编码DNA/RNA传感器通路的蛋白质或其功能获得性或组成型活性变体的核酸，或者编码免疫刺激蛋白如细胞因子、趋化因子或共刺激分子的核酸，所述免疫刺激蛋白赋予或有助于在肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫性。还包括其它产物，例如抗体及其片段、诱饵受体、拮抗多肽和RNAi，其在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫性。在免疫刺激细菌中，异源核酸通常在所引入的质粒上编码，但是可以将其引入细菌的基因组中，例如改变细菌产物表达的启动子。异源核酸，如DNA，包括可以以某些方式介导编码治疗性产物的DNA的表达的核酸，或者其可以编码以某些方式直接或间接介导治疗性产物的表达的产物，例如肽或RNA。
如本文所用，细胞疗法涉及将细胞递送至受试者以治疗疾病或病症。所述细胞可以是同种异体或自体的细胞，被离体修饰，例如通过用本文提供的免疫刺激细菌感染，使其在导入受试者时递送或表达产物。
如本文所用，基因疗法涉及将异源核酸如DNA转移至患有寻求这种治疗的疾病或病症的哺乳动物特别是人的某些细胞例如靶细胞中。将核酸如DNA以使得异源核酸如DNA被表达并产生由此编码的治疗性产物的方式导入所选择的靶细胞中。基因疗法还可用于递送编码基因产物的核酸，所述基因产物取代缺陷基因或补充其导入的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码治疗性化合物，如生长因子或其抑制剂、或肿瘤坏死因子或其抑制剂，如其受体，其通常不由哺乳动物宿主正常产生或不以治疗有效量或在治疗有效时间产生。编码治疗性产物的异源核酸如DNA可以在导入到患病宿主的细胞之前被修饰，以增强或以另外改变产物或其表达。基因疗法还可包括递送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节物。
如本文所用，“表达”是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。可以使用本领域已知的任何方法评估多肽的表达水平，包括例如确定由宿主细胞产生的多肽的量的方法。这种方法可包括但不限于通过ELISA、凝胶电泳后的考马斯蓝染色、Lowry蛋白测定和Bradford蛋白测定来定量细胞裂解物中的多肽。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、维持、再生和/或扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达由载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸被复制，从而扩增核酸。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当将载体转化进合适的宿主细胞中时，可以从中核酸表达一种或多种异源蛋白质。关于载体，其包括通常通过限制性消化和连接可将编码多肽或其片段的核酸导入其中的那些载体。关于载体，还包括含有编码多肽如修饰的抗CTLA-4抗体的核酸的那些载体。载体用于将编码多肽的核酸导入宿主细胞中，以扩增核酸或表达/展示由核酸编码的多肽。载体通常保持游离型，但是可以设计为实现将基因或其部分整合到基因组染色体中。还考虑了是人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和使用是本领域技术人员熟知的。载体还包括“病毒性载体”或“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操作地连接，以将外源基因转移进细胞中(作为载体或传送物)。
如本文所用，“表达载体”包括能表达与调节序列如启动子区域可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列可以实现这种DNA片段的表达。这种另外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可以包含这两种元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或在导入合适的宿主细胞中导致克隆的DNA表达的其它载体。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及保持游离型的那些或整合入宿主细胞基因组中的那些。
如本文所用，“一级序列”是指多肽氨基酸残基序列或核酸分子核苷酸序列。
如本文所用，“序列相同性”是指在比较测试与参考多肽或多核苷酸之间相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基的数目。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列的序列比对以鉴别相似性或相同性区域而确定。出于本文的目的，通常通过比对以鉴别相同残基而确定序列相同性。比对可以是局部或全局比对。可以在比较的序列之间鉴别出匹配、错配和空位。空位是在比对序列的残基之间插入的空位氨基酸或核苷酸以排列相同或相似的字符。通常，可能存在内部和末端空位。当使用空位罚分时，可以确定序列相同性而对末端空位不罚分(例如对末端空位不罚分)。或者，可以在不考虑空位的情况下将序列相同性确定为总比对序列的相同位置的数目/长度×100。
如本文所用，“全局比对”是从头到尾比对两个序列，每个序列中的每个字母仅比对一次。无论序列之间是否存在相似性或相同性，均会产生比对。例如，基于“全局比对”具有50％序列相同性是指在两个比较的序列的全序列的比对中，每个长度为100个核苷酸的序列中50％的残基是相同的。应理解，即使比对序列的长度不同，全局比对也可以用于确定序列相同性。除非选择“对于末端空位无罚分”，否则在确定序列相同性时将考虑序列末端的差异。通常，全局比对用于在其大部分长度上具有显著相似性的序列。用于进行全局比对的示例的算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443)。用于进行全局比对的示例性程序是可公开获得的，且包括可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)上获得的全局序列比对工具，以及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的程序。
如本文所用，“局部比对”是比对两个序列、但是仅比对序列的具有相似性或相同性的那些部分的比对。因此，局部比对确定一个序列的子节段是否存在于另一序列中。如果不存在相似性，则不会返回比对信息。局部比对算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))。例如，基于“局部比对”具有50％序列相同性是指在任意长度的两个比较序列的全序列比对中，长度为100个核苷酸的相似性或相同性的区域在相似性或相同性区域中具有50％的相同的残基。
出于本文的目的，可以用每个供应商建立的默认空位罚分通过标准比对算法程序来确定序列相同性。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(含有对于相同性为1的值和对于非相同性为0的值)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745-6763的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence andStructure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)对于每个空位的罚分为3.0且对于每个空位中的每个符号附加0.10罚分；和(3)对于末端空位无罚分。无论任何两个核酸分子具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其它类似用语的核苷酸序列，还是任何两个多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其它类似用语的氨基酸序列，均可以使用基于局部或全局比对的已知计算机算法确定(见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software，其提供了数十个已知和可公开获得的比对数据库和程序的链接)。通常，出于本文的目的，使用基于全局比对的计算机算法确定序列相同性，如得自NCBI/BLAST的Needleman-Wunsch全局序列比对工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&Page_TYPE＝BlastHome)；LAlign(William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357))；以及可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的Xiaoqui Huang的程序。通常，在全局比对中，将每个比较的多肽或核苷酸的全长序列在每个序列的全长进行比对。当所比较的序列为基本相同的长度时，也可以使用局部比对。
因此，如本文所用，术语“相同性”表示测试与参考多肽或多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性实例中，“与…至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸具有90％至100％百分比相同性。在90％或更高水平的相同性表明以下事实：假设出于示例目的，比较了长度为100个氨基酸或核苷酸的测试与参考多肽或多核苷酸，测试多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中有10个)的氨基酸或核苷酸与参考多肽或多核苷酸的那些氨基酸或核苷酸不同。可以在测试与参考多核苷酸之间进行类似比较。这种差异可以表示为在氨基酸序列的整个长度上随机分布的点突变，或者其可以聚集在不同长度直至允许的最大长度的一个或多个位置，例如10/100个氨基酸差异(约90％相同性)。差异也可能是由于氨基酸残基的缺失或截短所致。差异被定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。取决于所比较序列的长度，在约85-90％以上的同源性或相同性水平，结果可以独立于程序和空位参数设置；通常无需依赖软件即可轻松评估出这种高水平相同性。
如本文所用，“疾病或病症”是指由某些原因或状况包括但不限于感染、获得性病况以及遗传病况等引起的生物体中的病理状况，且其特征在于可识别的症状。
如本文所用，“治疗”患有疾病或病况的受试者是指所述受试者的症状在治疗后部分或全部减轻或保持静态。
如本文所用，“治疗”是指改善疾病或病症的症状的任何作用。治疗包括预防、治疗和/或治愈。治疗还涵盖本文提供的任何免疫刺激细菌或组合物的任何药物用途。
如本文所用，“预防(prophylaxis)”是指预防(prevention)潜在疾病和/或预防疾病的症状恶化或进展。
如本文所用，“预防(prevention)”或预防(prophylaxis)及其语法等同形式是指降低进展为疾病或病况的风险或可能性的方法。
如本文所用，“药学有效物质”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂和常规治疗药，包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所用，“治疗作用”是指对受试者进行治疗而产生的改变、通常为改良或改善疾病或病况的症状或治愈疾病或病况的作用。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指一种物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，所述量在施用于受试者后至少足以产生治疗作用。因此，所述量是预防、治愈、改善、抑制或部分抑制疾病或病症的症状所需的量。
如本文所用，“治疗效力”是指一种物质、化合物、材料或包含化合物的组合物在已施用所述物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的受试者中产生治疗作用的能力。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”是指当将一种物质、化合物、材料或包含化合物的组合物施用于受试者时具有预期的预防作用的量，所述预防作用例如是预防或延迟疾病或症状的发作或复发、降低疾病或症状的发作或复发的可能性或降低病毒感染的发生率。通过施用一次剂量不需要发生完全的预防作用，以及可以是在施用一系列剂量后发生作用。因此，可以以一次或多次施用来施用预防有效量。
如本文所用，通过治疗例如通过施用药物组合物或其它治疗剂来改善特定疾病或病症的症状，是指可归因于组合物或治疗剂的施用或与组合物或治疗剂的施用相关的任何症状的减轻，无论永久的或暂时的、持续的或短暂的。
如本文所用，“抗癌剂”或“抗癌治疗剂”是指直接或间接对恶性细胞和组织具有破坏性或毒性的任何物质或治疗剂。例如，抗癌剂包括杀死癌细胞或另外抑制或损害肿瘤或癌细胞的生长的物质。示例的抗癌剂是化疗剂和免疫治疗剂。
如本文所用，“治疗活性”是指治疗性产物如多肽、核酸分子及其它治疗性分子的体内活性。通常，治疗活性是与治疗疾病或病况相关的活性。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，包括哺乳动物，如人。
如本文所用，患者是指人受试者。
如本文所用，“动物”包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊；以及猪和其它动物。非人动物除外人作为预期动物。本文提供的多肽来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数多肽是动物来源的，包括哺乳动物来源。
如本文所用，“组合物”是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水相的、非水相的或其任何组合。
如本文所用，“组合”是指两种或更多种物品之间或之中的任何关联。所述组合可以是两种或更多种单独的物品，例如两种组合物或两种集合，其混合物，如两种或更多种物品的单一混合物，或其任意变化。组合的元件通常在功能上关联或相关。
如本文所用，“组合疗法”是指施用两种或更多种不同治疗剂。所述不同的治疗剂可以单独、相继、间歇地提供和施用，或者可以在一个组合物中提供。
如本文所用，“试剂盒”是包装的组合，其任选包括其它元件，如另外的试剂和所述组合或其元件的使用说明，目的包括但不限于生物活性或性质的激活、施用、诊断和评估的目的。
如本文所用，“单位剂型”是指适于人和动物受试者以及如本领域中已知单独包装的物理上分立的单位。
如本文所用，“单一剂量制剂”是指直接施用的制剂。
如本文所用，“多剂量制剂”是指含有多剂量的治疗剂及可以直接施用以提供数个单剂量的治疗剂的制剂。所述剂量可以在几分钟、几小时、几周、几天或几个月的时间内施用。多剂量制剂可以允许剂量调节、剂量合并和/或剂量拆分。由于随着时间使用多剂量制剂，因此其通常含有一种或多种防腐剂以防止微生物生长。
如本文所用，“制造产物”是制备和销售的产物。如在本申请中通篇使用的，该术语旨在涵盖包含于包装物品中的本文提供的任何组合物。
如本文所用，“流体”是指可以流动的任何组合物。因此，流体涵盖半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、霜剂形式的组合物及其它这种组合物。
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白质(例如分离的抗体或其抗原结合片段)或其生物活性部分(例如分离的抗原结合片段)基本上不含细胞材料或来自所述多肽或蛋白质衍生自之中的细胞或组织的其它污染蛋白质，或基本不含化学合成时的化学前体或其它化学品。如果如通过本领域技术人员用来评估这种纯度的标准分析方法例如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC)所确定，所述制备物表现为不含容易检测到的杂质，或者制备物足够纯以至于进一步纯化不会可检测地改变该物质的物理和化学性质如酶和生物活性，则可以确定制备物是基本上不含这些物质。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可提高化合物的特异性活性。如本文所用，“细胞提取物”或“裂解物”是指从裂解或破坏的细胞中制备的制剂或级分。
如本文所用，“持续性病毒感染”是指病毒没有被清除，而是留在受感染者的特定细胞中。持续性感染涉及沉默和生产性感染的阶段，没有迅速杀死或甚至产生对宿主细胞的过度损害。有三种重叠的持续性病毒-宿主相互作用的类型，可定义为潜伏性、慢性和缓慢感染。由持续性病毒感染引起的疾病包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、AIDS相关的综合症、慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎(慢性麻疹脑炎)、慢性乳头状病毒脑炎(进行性多灶性白质脑病)、海绵状脑病(由朊病毒引起)、几种疱疹病毒引起的疾病以及一些肿瘤。引起这些和其它感染的病毒包括例如疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、麻疹病毒、人T细胞白血病病毒(HTLVs)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头多瘤空泡病毒(humanpapovaviruses)、人细小病毒、人乳头瘤病毒、肝炎病毒、腺病毒和细小病毒。
如本文所用，“对照”是指与测试样品基本相同的样品，除了其不使用测试参数进行处理，或者，如果是血浆样品，则其可以来自未受感兴趣的病况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括其复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，关于包含“免疫球蛋白结构域”的多肽，包括具有一个或多个免疫球蛋白结构域的多肽。
如本文所用，除非明确指出仅是可选方案或可选方案是互斥的，否则术语“或”用于表示“和/或”。
如本文所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。“约”还包括精确量。因此，“约5个氨基酸”是指“约5个氨基酸”以及也是指“5个氨基酸”。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。例如，任选地变体部分是指该部分是变体或非变体。
除非另有说明，否则如本文所用的关于任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写应与其常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature一致(见Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。
出于清晰公开而不是通过限制的方式，关于发明的详细描述分为以下段落章节。
B用于癌症治疗的免疫刺激细菌概述
关于细菌具有抗癌活性的认识可以追溯到十九世纪，当时几位医生观察到感染化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的患者肿瘤消退。William Coley开始了第一次利用细菌治疗终末期癌症的研究，并开发了一种由化脓性链球菌(S.pyogenes)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)组成的疫苗，该疫苗成功地用于治疗多种癌症，包括肉瘤、癌瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。从那时起，许多细菌物种，包括梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、单核细胞增生李斯特菌属(Listeriamonocytogenes)和埃希氏菌属(Escherichia)，已被研究作为抗癌疫苗的来源(见例如国际PCT申请公开号WO 1999/013053和WO 2001/025399；Bermudes et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Patyar et al.(2010)Journal ofBiomedical Science 17:21；和Pawlek et al.(2003)Lancet Oncol.4:548-556)。
作为一种治疗平台，与如溶瘤病毒等其它疗法相比，细菌具有几个优势。一些细菌物种可以被工程化为口服和全身(静脉内；IV)施用，其在体外和体内容易繁殖，并且可以在冻干状态下储存和运输。由于缺少外显子，细菌染色体很容易被操纵，并且许多菌株的完整基因组已得到充分鉴定(Felgner et al.(2016)mBio 7(5):e01220-16)。许多类型的细菌比病毒更便宜、更容易生产，并且工程化的细菌的适当递送比病毒递送更有利，因为其不会永久整合到宿主细胞基因组中，其优先感染骨髓细胞而不是上皮细胞，并且必要时可以用抗生素迅速消除而使其更安全。
本文提供了经修饰以利用这些有利性质的免疫刺激细菌。本文提供的细菌经过修饰，以使其在肿瘤微环境中感染并积累，特别是在肿瘤驻留免疫细胞(骨髓细胞)中，例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、树突状细胞(DC)和髓源抑制因子细胞(MDSC)，并且还被设计为表达和递送高水平的治疗性蛋白质及其组合，特别是互补组合。如本文所述，本文提供的免疫刺激细菌可用作预防和/或治疗癌症的疫苗，也可用作抗病原体的疫苗，包括细菌、病毒、寄生虫和其它病原体。这些用途依赖于本文提供的免疫刺激细菌在肿瘤驻留的巨噬细胞中积累的能力，和在直接施用时如通过肌肉注射或吸入在吞噬细胞中积累的能力，以及促进持久的免疫应答和免疫性的能力。用于治疗癌症的细菌的性质对其用作疫苗也是有利的。这些性质来自于降低TLR2和TLR4和5应答的基因组修饰，以及其它修饰，如允许在体外生长、但降低或消除体内生长的营养缺陷型，以及可以降低肿瘤微环境中积累的营养素如腺苷的免疫抑制作用的营养缺陷型，以及那些消除可以使T细胞失活的细菌酶如天冬酰胺酶的免疫抑制作用的基因组修饰。
本文提供的免疫刺激细菌具有优于现有细菌疗法以及细胞疗法、溶瘤病毒疗法和先前的细菌疗法的有利性质。本文提供的免疫刺激细菌，虽然可以通过任何合适的途径施用，但适合于全身性给药，如静脉注射。如本文所示和所述，本文提供的免疫刺激细菌可靶向主要免疫途径。
所提供的是免疫刺激细菌，其可用作或调适于作为抗癌疗法以及抗癌疫苗和病原体疫苗，也可作为RNA传递载体。可以根据特定的基因组修饰和有效载荷来选择特定的用途。所提供的免疫刺激细菌递送编码一种或多种治疗产物的基因载荷，包括例如截短的共刺激分子(受体或配体；例如4-1BBL、CD80/CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)，具有完全或部分的胞质结构域缺失，用于在抗原呈递细胞(APC)上表达，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体的参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域而无法向APC发出反调节信号。所述免疫刺激细菌可以编码多种出，包括那些组成型诱导I型干扰素(IFN)和那些刺激抗病毒类型的免疫应答如IL-15、特别是作为IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15复合物)提供的IL-15，以及组成型诱导I型IFN的工程化STING蛋白，也被修饰为具有降低的NF-κB信号传导，以消除或减少不良炎症反应。
所述免疫刺激细菌可以编码并表达以下一种或多种：IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-12，IL-15，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，干扰素-α，干扰素-β，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经修饰后不与IL-2Ra结合的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，胞质DNA/RNA传感器或I型IFN通路蛋白，如功能获得的组成型活性STING，IRF3，IRF7，MDA5或RIG-I变体(诱导I型IFN)，TGF-β的抑制剂，如TGF-β抑制性抗体，TGF-β多肽拮抗剂和TGF-β结合诱饵受体，抗体和其片段，如那些靶向免疫检查点和其它抗癌靶位如VEGF和IL-6，共刺激受体/分子，如4-1BBL，包括缺失或截短或以其它方式消除胞质结构域的4-1BBL，以及其它。所述免疫刺激细菌也可以编码和表达截短的共刺激分子(如4-1BBL、CD80/CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)，其在抗原提呈细胞(APC)上表达的胞质结构域完全或部分缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体的参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域而无法向APC发出反调节信号。其它编码的治疗产物包括那些被称为双特异性T细胞衔接蛋白(可以商标商购)的产物，如本文举例的DLL3 X CD3衔接蛋白。
这种治疗产物和制剂的组合可以在单一的治疗组合物中表达。通过对细菌基因组的修饰，所述免疫刺激细菌表现出肿瘤特异性定位和富集，并提供静脉内(IV)施用方式以激活抗肿瘤免疫途径，否则全身激活会有毒性。
本文提供的免疫刺激细菌在遗传学设计成安全的，并靶向肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤驻留的免疫细胞，并且在作为疫苗施用如直接施用时，还靶向吞噬细胞。本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰和其它修饰以及编码的治疗产物的组合，它们协同发挥作用，提供在肿瘤驻留免疫细胞中积累的免疫刺激细菌，并持续足够长的时间来递送治疗产物，特别是在肿瘤和肿瘤微环境中诱导或促进抗癌免疫刺激的组合，而没有毒副作用，或具有有限的毒副作用。当全身施用时，如静脉注射(IV)，所述免疫刺激细菌在肿瘤中富集，包括在转移性病变中；它们提供有效的免疫有效载荷的遗传转移，特别转移至肿瘤驻留的骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)，以及树突状细胞(DC)；它们诱导强大的局部免疫应答，破坏肿瘤并为针对未来复发进行接种；当治疗结束时，它们会被自然消除，如被感染的细胞吞噬和破坏，或者它们可以被一个疗程的抗生素迅速消灭。
本文提供的免疫刺激细菌由于设计的嘌呤/腺苷的营养缺陷型，在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留的免疫细胞中表现出优先积累，并表现出不能在吞噬细胞内复制。避免被血清补体失活的免疫刺激细菌可以直接在肿瘤微环境中以高浓度递送各种免疫治疗剂和治疗产物，同时对正常组织的毒性最小化，本文提供了这些免疫刺激细菌。
例如，如在C.9节中更详细地描述，本文提供的免疫刺激细菌包括基因组的一种或多种修饰，使其成为msbB-/pagP-，这改变了LPS中的脂质A，导致五乙酰化(野生型脂质A有6-7个脂肪酸链)，降低了TLR4的亲和力；是腺苷/腺嘌呤营养缺陷型，如purI-；是天冬酰胺酶II-(ansB-)，这改善T细胞的质量；缺少鞭毛(鞭毛蛋白缺陷的)；产生卷曲菌毛的基因/产物缺陷，如csgD-，这除去了卷曲菌毛；并包括其它任选的基因组修饰，如插入、缺失、破坏和任何其它修饰，从而使编码的产物不能以活性形式产生，如本文详细讨论。所述免疫刺激细菌包括质粒，该质粒在真核生物启动子的控制下编码一种或多种治疗产物，特别是抗癌产物。这些相同的修饰和性质使其可用作疫苗和RNA的递送载体，用于癌症治疗和癌症疫苗以及病原体疫苗，特别是当通过直接施用如吸入和IM以及其它直接途径将有效载荷递送到吞噬细胞时。
本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，如缺失、破坏和其它导致无活性编码产物的改变，如改变全部或部分基因的方向，从而使功能性基因产物不被表达。在所提供的免疫刺激细菌中，有那些被修饰过的细菌，使所产生的细菌是msbB-/purI-。在一些实施方案中，这些细菌是msbB-和purI-，其中msbB和/或purI基因的至少编码部分的全长被缺失。细菌的基因组也可以被修改修饰，从而使细菌缺少鞭毛。这通常在表达鞭毛的细菌中实现。在这样的细菌中，例如沙门氏菌中的fliC和fljB基因或其它物种中与fliC和fljB相当的基因，可以被缺失或以其它方式修饰，由此使功能性基因产物不被表达。所述细菌也可以被修饰，由此其是腺苷营养缺陷型，和/或是msbB-/pagP-。还提供了免疫刺激细菌和含有其的药物组合物，其中所述细菌不表达L-天冬酰胺酶II，由此所述细菌是ansB-。消除编码的天冬酰胺酶活性可改善或保留T细胞的活力/活性。治疗性细菌，如用作疫苗的灭活或减活细菌，可以通过修饰基因组以消除天冬酰胺酶活性而得到改进。这类疫苗的典范是卡介苗(BCG)和相关疫苗，用于对结核病进行免疫。众所周知，卡介苗的效力不一；消除天冬酰胺酶可以提高这种疫苗的效力，因为内源性细菌天冬酰胺酶会抑制或降低T细胞活性。
本文提供的免疫刺激细菌，向肿瘤驻留骨髓细胞递送治疗产物(如组成型活性STING变体和其它免疫调节蛋白和产物)，促进适应性免疫并增强T细胞功能。所述免疫刺激性细菌导致免疫抑制性肿瘤微环境的完全重塑，朝向适应性抗肿瘤表型，而远离其特征在于促进先天免疫和抑制适应性免疫的细菌表型。如本文所述，这些性质和有效载荷也可以被细菌利用作为疫苗和RNA递送平台。
与未修饰的细菌相比，或与VNP20009菌株相比，本文提供的免疫刺激细菌可表现出明显更多、例如至少约100,000倍的肿瘤浸润和富集。例如，本文提供的细菌含有基因组修饰，据此其感染肿瘤中的巨噬细胞(和其它吞噬细胞，当作为疫苗给药时)以递送其有效载荷，如工程化STING的组合(见整文关于各种工程化STING蛋白的讨论)，如具有功能获得突变的人STING，如N154S/R284G，以使I型IFN组成型诱导，以及来自非人STING的CTT，其与人STING相比具有较低的NF-κB信号传导活性，如来自袋獾的CTT，以及各种形式的IL-15，特别是IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15复合物)。本文表明，这种组合具有协同作用，并使T细胞、包括CD4+和CD8+细胞高度浸润肿瘤。这种组合由于在许多治疗干预点起作用而是综合免疫疗法。所述免疫刺激细菌被肿瘤激活的巨噬细胞(TAM)吞噬，将质粒递送至宿主细胞，宿主细胞表达编码的产物，如IL-15和工程化STING。
本文提供的免疫刺激细菌被肿瘤驻留的免疫细胞摄取，并递送其内容物，包括编码治疗产物的质粒，所述治疗产物在免疫细胞和肿瘤微环境中表达和产生，以产生抗肿瘤免疫力。是asd-且不包括在质粒上编码的互补基因以在宿主细胞控制下表达的细菌在宿主体内不复制。提供的细菌是thyA-，由于基因组修饰如缺失、插入、转位或修饰导致基因产物无活性或缺失，需要补充胸腺嘧啶才能生长，同样将有效载荷递送至吞噬细胞，但不能在这些细胞中复制。
1.细菌癌症免疫治疗
许多实体瘤类型已经进化出一种高度免疫抑制的微环境，这使得其对已批准的检查点疗法高度难治，例如抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1疗法。肿瘤对检查点疗法逐渐形成耐药性的一种机制是缺少肿瘤内T细胞和肿瘤抗原交叉呈递树突状细胞(DC)，被描述为T细胞排除、非炎性或“冷肿瘤”(Sharma et al.(2017)Cell 168(4):707-723)。对于少数肿瘤为T细胞炎性且对检查点免疫疗法有反应的患者，他们经常经历严重的自身免疫毒性，许多患者最终会复发并成为检查点难治性(见例如Buchbinder et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3377-3383；Hodi et al.(2010)N.Engl.J.Med.363(8):711-723；和Chen et al.(2015)J.Clin.Invest.125:3384-3391)。肿瘤启动多种机制来逃避免疫监视，重新编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫，排除和失活抗肿瘤T细胞，并对靶向癌症治疗产生耐药性(见例如Mahoney et al.(2015)Nat.Rev.Drug Discov.14(8):561-584)。解决这个问题将需要能够适当地使这些肿瘤产生炎性的免疫疗法，并产生可以提供长期肿瘤消退的抗肿瘤免疫。此外，肿瘤内治疗是棘手的，并且在转移性疾病情况中会受到很大限制。需要适当地使每个单独的转移性病变产生炎症并克服多种免疫抑制途径的全身施用疗法。凭借其特异性靶向肿瘤驻留免疫细胞和表达多种互补遗传有效载荷/治疗产物的能力，本文提供的免疫刺激细菌旨在解决这些问题。
2.现有靶向肿瘤微环境的治疗
已经开发了许多靶向肿瘤微环境(TME)并试图促进抗肿瘤免疫的疗法。每种疗法都有其自身的挑战和缺点，本文提供的免疫刺激细菌解决了这些挑战和缺点。
a.自体T细胞疗法的局限性
临床上已经研究了几种全身施用的治疗平台，目的是进入高度免疫抑制的肿瘤微环境，并诱导对炎症肿瘤的适当免疫应答，促进抗肿瘤免疫。这些平台包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其是通过从患者采集T细胞并对其进行重新工程化以将T细胞受体融合到特异于特定肿瘤抗原的抗体Ig可变胞外域而产生的。这赋予细胞抗体的抗原识别性质，以及活化的T细胞的溶细胞性质(见例如Sadelain et al.(2015)J.Clin.Invest.125(9):3392-3400)。尽管这项技术具有前景和效力，例如FDA批准了CD19 CAR-Ttisagenlecleucel(例如商标为)和axicabtagene ciloleucel(商标为/>)，但成功仅限于CD19+造血系统恶性肿瘤，并且以致命的免疫相关不良事件为代价(见例如Jackson et al.(2016)Nat.Rev.Clin.Oncol.13(6):370-383)。肿瘤可以快速突变以下调实体瘤的靶向肿瘤抗原，包括抗原CD19，从而促进免疫逃逸(见例如Mardiana et al.(2019)Sci.Transl.Med.11(495):eaaw2293)。没有过多的肿瘤特异性靶抗原。不在健康组织中表达的实体瘤靶点是CAR-T治疗的主要障碍。除此之外，由于缺少足够的T细胞趋化因子梯度，这是适当的T细胞浸润到肿瘤中所必需的，因此CAR-T疗法在进入实体瘤微环境方面还存在其它障碍。此外，一旦其浸润肿瘤，则其被迅速失活(见例如Brown et al.(2019)Nat.Rev.Immunol.19(2):73-74)。如果CAR-T细胞的安全性得到显著改善并将功效扩展到实体瘤，与这些费力疗法相关的可行性和成本仍然限制了这种疗法的更广泛采用。
b.病毒疫苗平台
溶瘤病毒(OV)具有天然和工程化性质，以诱导肿瘤细胞裂解，将T细胞募集到肿瘤中，并递送可被肿瘤细胞读取的遗传物质以产生免疫调节蛋白。例如，命名为Talimogenelaherparepvec(T-VEC)的溶瘤病毒是一种修饰的单纯疱疹病毒，编码抗黑色素瘤抗原和细胞因子GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，可在瘤内施用。其已获FDA批准用于转移性黑色素瘤(见例如Bastin et al.(2016)Biomedicines 4(3):21)。已证明T-VEC对一些黑色素瘤患者有临床益处，并且免疫毒性低于免疫检查点抗体或FDA批准的全身施用的细胞因子，例如IL-2和干扰素-α(见例如Kim et al.(2006)Cytokine Growth Factor Rev.17(5):349-366；和Paul et al.(2015)Gene 567(2):132-137)。
溶瘤病毒(OV)作为抗癌疗法具有许多局限性。首先，溶瘤病毒被血液中的人体补体系统迅速失活。已证明难以通过全身施用递送足够的病毒以产生所需的治疗效果。肿瘤内施用在转移性情况中受到限制(病变遍布全身)，对于大多数实体瘤类型(例如肺和内脏病变)而言是难治的，并且需要介入性、引导放射学进行注射，这限制了重复给药。病毒很难以商业规模生产和储存。大多数基于OV的疫苗，例如基于副粘病毒、呼肠孤病毒和小核糖核酸病毒等的疫苗，具有类似的局限性(见例如Chiocca et al.(2014)CancerImmunol.Res.2(4):295-300)。溶瘤病毒具有固有的免疫原性并能迅速从人体血液中清除，进入肿瘤的T细胞对病毒抗原的亲和力比对较弱肿瘤新抗原的亲和力要高得多(见例如Aleksic et al.(2012)Eur.J.Immunol.42(12):3174-3179)。因此，除了公认的平台技术限制外，迄今为止，OV刺激持久抗肿瘤免疫的能力有限(见例如Kedl et al.(2003)CurrOpinion Immunol.15:120-127；和Aleksic et al.,(2012)Eur.J.Immunol.42:3174-3179，其示出结合病毒抗原的TCR比结合癌症相关抗原的那些TCR具有更高的HLA-A2亲和力)。
c.细菌癌症治疗
在临床前动物研究中，当从远端部位注射时，许多细菌物种已证明在实体瘤内优先复制。这些细菌物种包括但不限于沙门氏菌属(Salmonella)、双歧杆菌属(Bifodobacterium)、梭菌属(Clostridium)和埃希氏菌属(Escherichia)。细菌的肿瘤归巢性质与宿主对细菌感染的先天免疫应答相结合，可以介导抗肿瘤反应。这种肿瘤组织趋向性不同程度地减小了肿瘤的大小。这些细菌物种的肿瘤趋向性的一个促成因素是在缺氧和低氧环境中复制的能力。许多这些天然的肿瘤嗜性细菌已被进一步工程化以增加抗肿瘤反应的效力(Zu et al.(2014)Crit.Rev.Microbiol.40(3):225–235；和Felgner et al.(2017)Microbial Biotechnology 10(5):1074–1078)。尽管在动物研究中进行了概念验证，但在动物模型中不存在的人血清中的补体因子可以使细菌失活，从而限制了其作为治疗癌症的疗法的用途。
为了口服或全身施用，所述细菌菌株被减毒以使其不会引起全身性疾病和/或感染性休克，但仍保持一定程度的感染性以有效地定植肿瘤，并抵抗补体失活。许多不同的细菌物种已被研究作为抗癌治疗的可能药物，这些细菌物种包括：梭菌属(Clostridium)(见例如Dang et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(26):15155-15160；美国专利公开号2017/0020931和2015/0147315；及美国专利号7,344,710和3,936,354)，分支杆菌属(Mycobacterium)(见例如美国专利公开号2015/0224151和2015/0071873)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)(见例如Dang et al.(2001)，和Kimura et al.(1980)Cancer Res.40:2061-2068)，乳杆菌属(Lactobacillus)(见例如Dang et al.(2001))，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(见例如Le et al.(2012)Clin.Cancer Res.18(3):858-868；Starks et al.(2004)J.Immunol.173:420-427；和美国专利公开号2006/0051380)和大肠杆菌(Escherichia coli)(见例如美国专利号9,320,787)。
本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，其解决了为治疗肿瘤而开发的现有细菌的问题。修饰通常包括基因组中使基因或基因产物失去活性的改变。这可以通过缺失一个基因或其部分、或破坏一个基因、或任何其它导致无活性产物的这种改变来实现。所述基因组修饰改善了细菌在肿瘤微环境中的靶向或积累，特别是经设计使细菌优先或仅感染肿瘤驻留免疫细胞而不是健康组织，从而降低毒性并改善编码产物的递送。所述免疫刺激细菌还旨在递送治疗产物，包括其组合，旨在消除肿瘤的免疫抑制作用，增强宿主的抗肿瘤应答，并提供抗肿瘤产物。
i.李斯特菌属(Listeria)
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种活的减毒的细胞内细菌，能够诱导强力CD8+T细胞启动以在小鼠癌症模型中表达肿瘤抗原，也已被探索作为细菌癌症载体(见例如Le et al.(2012)Clin.Cancer Res.18(3):858-868)。在一项基于单核细胞增生李斯特菌的疫苗的临床试验中，结合了肿瘤抗原间皮素，以及一种基于异基因胰腺癌的GVAX疫苗，采用初免-加强方法，表明在晚期胰腺癌患者的中位生存期为6.1个月，相应的单独使用GVAX疫苗治疗的患者的中位生存期为3.9个月(见例如Le et al.(2015)J.Clin.Oncol.33(12):1325-1333)。然而，这些结果并未在更大的2b期研究中重复，这表明人难以将外周免疫监视颠覆为低亲和力肿瘤新抗原。由于需要在吞噬作用后裂解细菌，这是有效质粒转移的先决条件，因此单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)对编码的肿瘤抗原也表现出有限的免疫应答，尚未证明单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)在人巨噬细胞中会发生这种情况。
ii.沙门氏菌属(Salmonella)物种
肠沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)是用作抗癌治疗剂的细菌物种的示例。鼠伤寒沙门氏菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，由于可以利用来自组织坏死、渗漏的肿瘤脉管系统的营养物质以及其在免疫抑制的肿瘤微环境中存活的可能性增加，其优先积聚在缺氧和坏死区域(见例如Baban et al.(2010)Bioengineered Bugs 1(6):385-394)。作为兼性厌氧菌，鼠伤寒沙门氏菌能够在需氧和厌氧条件下生长，因此能够定殖于缺氧较少的小肿瘤和缺氧较多的大肿瘤。
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)通过粪口途径传播导致局部胃肠道感染。这种细菌还可以进入血液和淋巴系统，感染如肝、脾和肺等全身组织。野生型鼠伤寒沙门氏菌的全身施用会过度刺激TNF-α和IL-6，导致细胞因子级联反应和感染性休克，如果不加以治疗，可能会致命。因此，必须对致病性细菌菌株如鼠伤寒沙门氏菌进行减毒以防止全身感染，而不能完全抑制其有效定植肿瘤组织的能力。减毒通常是通过突变可以通过病原体模式识别引发免疫应答的细胞结构来实现的，例如细菌外膜，或者通过限制细菌在没有补充营养物的情况下复制的能力来实现。
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)是一种细胞内病原体，可被巨噬细胞等吞噬性骨髓细胞迅速吸收，也可通过其沙门氏菌致病岛1(SPI-1)编码的III型分泌系统(T3SS1)直接侵入非吞噬细胞，如上皮细胞。一旦进入细胞，其可以通过SPI-2调节而在含沙门氏菌的液泡(SCV)内复制，也可以逃逸到一些上皮细胞的胞质溶胶中(见例如Agbor et al.(2011)Cell Microbiol.13(12):1858-1869；和Galan and Wolf-Watz(2006)Nature 444:567-573)。鼠伤寒沙门氏菌的遗传修饰的细菌菌株已被描述作为抗肿瘤剂以引发直接的杀肿瘤作用和/或递送杀肿瘤分子(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Bermudes,D.et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Zhao,M.etal.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:755-760；和Zhao,M.et al.(2006)CancerRes.66:7647-7652)。
用于减弱减毒细菌病原体的各种方法是本领域已知的。例如，营养缺陷型突变使细菌不能合成必需的营养物质，以及使用基因如aro、pur、gua、thy、nad和asd中的缺失/突变(见例如美国专利公开号2012/0009153)。由涉及这些基因的生物合成途径产生的营养物质在宿主细胞中通常是不可用的，因此细菌的生存受到挑战。例如，沙门氏菌和其它物种的减毒可以通过缺失或破坏作为莽草酸酯途径的一部分的aroA基因来实现，将糖酵解与芳香族氨基酸生物合成联系起来(见例如Felgner et al.(2016)mBio 7(5):e01220-16)。aroA的缺失或破坏导致芳香族氨基酸的细菌营养缺陷和随后减毒(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0175297、2012/0009153和2016/0369282；和国际申请公开号WO 2015/032165和WO 2016/025582)。类似地，已经缺失了参与芳香族氨基酸生物合成途径的其它酶，包括aroC和aroD，以实现减毒(见例如美国专利公开号2016/0369282；和国际申请公开号WO 2016/025582)。例如，鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207是芳香族氨基酸营养缺陷型(aroA-突变体)，菌株A1和A1-R是亮氨酸-精氨酸营养缺陷型。
减毒细菌的突变还包括但不限于在改变脂多糖(LPS)生物合成的基因中的突变，所述基因例如rfaL，rfaG，rfaH，rfaD，rfaP，rFb，rfa，msbB，htrB，firA，pagL，pagP，lpxR，arnT，eptA，和lpxT；引入自杀基因的突变，如sacB，nuk，hok，gef，kil，或phlA；引入细菌裂解基因的突变，如hly和cly；编码毒力因子的基因突变，如IsyA，pag，prg，iscA，virG，plc，和act；修饰应激反应的基因突变，如recA，htrA，htpR，hsp，和groEL；破坏细胞周期的基因突变，例如min；以及破坏或失活调节功能的基因突变，例如cya，crp，phoP/phoQ，和ompR(见例如美国专利公开号2012/0009153，2003/0170276和2007/0298012；美国专利号6,190,657；国际申请公开号WO 2015/032165；Felgner et al.(2016)Gut Microbes 7(2):171-177；Broadway et al.(2014)J.Biotechnology192:177-178；Frahm et al.(2015)mBio 6(2):e00254-15；Kong et al.(2011)Infection and Immunity79(12):5027-5038；和Konget al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(47):19414-19419)。一般来说，减毒突变是基因缺失，以防止可能导致反转为毒力表型的自发补偿突变。
另一种安全减毒鼠伤寒沙门氏菌的方法是使用PhoP/PhoQ操纵子系统，这是一种典型的细菌双组分调节系统，由膜相关传感器激酶(PhoQ)和胞质转录调节子(PhoP)组成(见例如Miller,S.I.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:5054-5058；和Groisman,E.A.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7077-7081)。PhoP/PhoQ是毒力所必需的；其缺失导致这种细菌在巨噬细胞中的存活率不佳，并且在小鼠和人中显著减毒(见例如Miller,S.I.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:5054-5058；Groisman,E.A.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7077-7081；Galan,J.E.andCurtiss,R.III.(1989)Microb.Pathog.6:433-443；和Fields,P.I.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5189-5193)。PhoP/PhoQ缺失菌株已被用作疫苗递送载体(见例如Galan,J.E.and Curtiss,R.III.(1989)Microb.Pathog.6:433-443；Fields,P.I.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5189-5193；和Angelakopoulos,H.andHohmann,E.L.(2000)Infect.Immun.68:2135-2141)。然而，如本文所述，如果细菌不被试图转移质粒，则菌株在巨噬细胞中的存活有限是不利的。
已发现这些减毒细菌菌株在静脉内(IV)施用时对小鼠、猪和猴子是安全的(见例如Zhao,M.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:755-760；Zhao,M.et al.(2006)Cancer Res.66:7647-7652；Tjuvajev J.et al.(2001)J.Control.Release 74:313-315；和Zheng,L.et al.(2000)Oncol.Res.12:127-135)，以及某些活的减毒沙门氏菌菌株在人体临床试验中口服施用后显示出良好的耐受性(见例如Chatfield,S.N.et al.(1992)Biotechnology 10:888-892；DiPetrillo,M.D.et al.(1999)Vaccine18:449-459；Hohmann,E.L.et al.(1996)J.Infect.Dis.173:1408-1414；和Sirard,J.C.et al.(1999)Immunol.Rev.171:5-26)。
其它已被减毒用于治疗的鼠伤寒沙门氏菌菌株是例如亮氨酸-精氨酸营养缺陷型A-1(见例如Zhao et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(3):755-760；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；美国专利号8,822,194；和美国专利公开号2014/0178341)，及其衍生物AR-1(见例如Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；Kawaguchi et al.(2017)Oncotarget 8(12):19065-19073；Zhao et al.(2006)CancerRes.66(15):7647-7652；Zhao et al.(2012)Cell Cycle 11(1):187-193；Tome et al.(2013)Anticancer Research 33:97-102；Murakami et al.(2017)Oncotarget 8(5):8035-8042；Liu et al.(2016)Oncotarget7(16):22873-22882；和Binder et al.(2013)Cancer Immunol.Res.1(2):123-133)；aroA-突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207(见例如Guo et al.(2011)Gene Therapy 18:95-105；和美国专利公开号2012/0009153、2016/0369282和2016/0184456)及其专性厌氧菌衍生物YB1(见例如国际申请公开号WO 2015/032165；Yu et al.(2012)Scientific Reports 2:436；和Leschner et al.(2009)PLoSONE 4(8):e6692)；aroA-/aroD-突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株BRD509，这是SL1344(野生型)菌株的衍生物(见例如Yoon et al.(2017)Eur.J.Cancer 70:48-61)；asd-/cya-/crp-突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株χ4550(见例如Sorenson et al.(2010)Biologics:Targets&Therapy4:61-73)，及phoP-/phoQ-鼠伤寒沙门氏菌菌株LH430(见例如国际申请公开号WO 2008/091375)。
然而，减毒会影响细菌在肿瘤驻留免疫细胞、肿瘤微环境和肿瘤细胞中积累的能力。这个问题在此得到解决。免疫刺激细菌，例如本文示例说明的沙门氏菌菌株，是通过修饰而减毒，所述修饰可以包括上述那些修饰中的一些，但也具有本文所述的增强作为癌症治疗剂的有效性的其它修饰和性质。
鼠伤寒沙门氏菌的减毒菌株具有在吞噬和降解后递送DNA的先天能力(见例如Weiss,S.(2003)Int.J.Med.Microbiol.293(1):95-106)。其已被用作基因治疗的载体。例如，鼠伤寒沙门氏菌菌株已被用于递送和表达多种基因，包括编码细胞因子、血管生成抑制剂、毒素和前药转化酶的那些基因(见例如美国专利公开号2007/0298012；Loeffler etal.(2008)Cancer Gene Ther.15(12):787-794；Loeffler et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104(31):12879-12883；Loeffler et al.(2008)J.Natl.Cancer Inst.100:1113-1116；Clairmont,C.et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Bermudes,D.et al.(2002)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5:194-199；Zhao,M.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:755-760；Zhao,M.et al.(2006)CancerRes.66:7647-7652；和Tjuvajev J.et al.(2001)J.Control.Release74:313-315)。
鼠伤寒沙门氏菌已被修饰以将肿瘤相关抗原(TAA)存活素(SVN)递送至抗原呈递细胞(APC)以引发适应性免疫(见例如美国专利公开号2014/0186401，和Xu et al.(2014)Cancer Res.74(21):6260-6270)。SVN是一种凋亡蛋白(IAP)抑制剂，可延长细胞存活并提供细胞周期控制，在所有实体瘤中均过度表达，而在正常组织中表达较差。这种技术使用SPI-2及其III型分泌系统以将TAA递送到APC的胞质中，然后被激活以诱导TAA特异性CD8+T细胞和抗肿瘤免疫(见例如Xu et al.(2014)Cancer Res.74(21):6260-6270)。与基于李斯特菌的TAA疫苗类似，这种方法已在小鼠模型中显示出前景，但尚未在人类中证明有效的肿瘤抗原特异性T细胞启动。
除了递送编码蛋白质的DNA外，鼠伤寒沙门氏菌还被用于递送用于癌症治疗的小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。例如，减毒的鼠伤寒沙门氏菌已被修饰以表达某些shRNA，例如靶向免疫抑制基因吲哚胺双加氧酶(IDO)的那些。在鼠黑色素瘤模型中沉默的IDO表达导致肿瘤细胞死亡和中性粒细胞显著的肿瘤浸润(见例如Blache et al.(2012)Cancer Res.72(24):6447-6456；国际申请公开号WO 2008/091375；和美国专利号No.9,453,227)。这个载体与透明质酸酶的共同施用在小鼠胰腺导管腺癌的治疗中显示出正向结果(见例如Manuel et al.(2015)Cancer Immunol.Res.3(9):1096-1107；和美国专利公开号No.2016/0184456)。在另一项研究中，鼠伤寒沙门氏菌菌株因phoP/phoQ缺失而减毒，并表达信号转导和转录激活因子3(STAT3)特异性shRNA，抑制肿瘤生长并减少转移器官的数量，延长C57BL/6小鼠的寿命(见例如Zhang et al.(2007)Cancer Res.67(12):5859-5864)。在另一个实例中，鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207已被用于递送靶向CTNNB1的shRNA，这是编码β-连环蛋白的基因(见例如Guo et al.(2011)Gene Therapy 18:95-105；及美国专利公开号2009/0123426和2016/0369282)。鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009已用于递送靶向STAT3的shRNA(见例如Manuel et al.(2011)Cancer Res.71(12):4183-4191；美国专利公开号2009/0208534,、2014/0186401和2016/0184456；及国际申请公开号WO 2008/091375和WO 2012/149364)。已使用鼠伤寒沙门氏菌菌株A1-R和VNP20009将靶向自噬基因Atg5和Beclin1的siRNA递送至肿瘤细胞(见例如Liu et al.(2016)Oncotarget 7(16):22873-22882)。
然而，已经发现这些菌株不能有效地刺激抗肿瘤免疫应答，也不能有效地定殖肿瘤以递送治疗剂量的编码产物。需要改进这些菌株，以使其更有效地刺激抗肿瘤免疫应答，例如本文提供的免疫刺激细菌。已公开的国际PCT申请号WO 2019/014398和美国公开号2019/0017050A1中描述了各种细菌的进一步和替代修饰。在这些出版物中的每一个中描述的细菌，也在本文中描述，可以如本文所述进行修饰，以进一步改善其免疫刺激和肿瘤靶向性质。
iii.VNP20009(YS1646)
可用作本文所述修饰的起始菌株的治疗性细菌的示例是称作VNP20009的菌株(ATCC#202165，YS1646)。这个病毒是临床候选病毒。通过缺失msbB和purI基因，VNP20009(ATCC#202165，YS1646)的安全性至少减毒50,000倍(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；Low et al.(2003)Methods in Molecular Medicine,Vol.90,Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews,pp.47-59；和Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology 19:19-25)。阻止msbB基因表达的缺失或破坏会改变脂多糖的脂质A结构域的组成，脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分(见例如Lowet al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。这样可以阻止脂多糖诱导的脓毒性休克，减毒细菌菌株并降低全身毒性，同时减少潜在有害的TNFα产生(见例如Dinarello,C.A.(1997)Chest 112(6Suppl):321S-329S；和Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。阻止purI基因表达的缺失或破坏以会使细菌对嘌呤是营养缺陷型的，这会进一步减毒细菌并使其在肿瘤微环境中富集(见例如Pawelek et al.(1997)Cancer Res.57:4537-4544；和Broadway et al.(2014)J.Biotechnology192:177-178)。如本文所示，VNP20009对于免疫抑制性核苷腺苷也是营养缺陷型的。腺苷可以在肿瘤中积累到病理性高水平，并有助于形成免疫抑制性肿瘤微环境(见例如Peter Vaupel and Arnulf Mayer,OxygenTransport to Tissue XXXVII,Advances in Experimental Medicine and Biology876chapter22,pp.177-183)。
当VNP20009被施用于携带同基因的或人异种移植肿瘤的小鼠时，与对照小鼠相比，所述细菌优先在肿瘤的细胞外组分中以超过300-1000比1的比率积累，并表现出肿瘤生长抑制以及生存期延长(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。VNP20009在动物模型中证明了成功靶向肿瘤和抑制肿瘤生长，同时引发的毒性非常小(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology192:177-178；Loeffler et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104(31):12879-12883；Luo et al.(2002)OncologyResearch 12:501-508；和Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。
人转移性黑色素瘤的1期临床试验结果表明，虽然VNP20009是相对安全的且耐受性良好，但观察到的抗肿瘤活性非常有限(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。虽然使用VNP20009并未导致转移性疾病荷载变化，但它确实证明了在最大耐受剂量(MTD)下肿瘤定植的证据。由于与高水平的促炎细胞因子相关的毒性，无法实现任何抗肿瘤活性所需的更高剂量。
本文提供的免疫刺激细菌提供了菌株VNP20009所缺少的许多改进和优势。在示例菌株中，VNP20009菌株(YS1646)被用作亲本菌株，通过引入额外的基因组修饰、包括消除鞭毛的那些修饰而被进一步修饰。所述菌株还通过完全缺失purI和/或msbB来改进。其它基因组修饰包括消除或失活卷曲菌毛，并使菌株成为thyA-，以便细菌不在体内复制，和/或成为ansB-以消除天冬酰胺酶的活性，该活性使T细胞失活或降低活性。这些基因组修饰单独或共同改良了细菌在吞噬细胞中积累或感染的能力，也改良了宿主的抗病毒型免疫应答。所述免疫刺激性细菌被修饰成包括各种有效载荷，以刺激免疫系统和/或减少免疫抑制，并提供治疗产物和免疫抗原和产物。
所述刺激细菌以肿瘤特异性方式将编码的遗传有效载荷递送瘤驻留骨髓细胞。所述刺激性细菌通过基因组修饰，例如基因的缺失或破坏以及基因组的其它修饰，表现出TLR2、TLR4和TLR5介导的炎症减少，例如通过鞭毛的消除、LPS的修饰以及卷曲菌毛的消除和生物膜形成的减少而呈现。如本文所示和所述，消除TLR2以及TLR2/4/5-介导的活性和应答可促进或增强I型干扰素的产生和/或减少当这些受体被激活或凭借TLR应答发生的I型IFN的任何减少或抑制。所述免疫刺激细菌增强T细胞功能，例如通过消除L-天冬酰胺酶II的表达，并促进、提供、允许和支持质粒维持。细菌仅或基本上仅在骨髓细胞、特别是肿瘤驻留骨髓细胞中积累(或靶向)，在吞噬作用后提供高效的质粒递送。本文提供的免疫刺激细菌在肿瘤微环境中定殖，并且可以全身施用。与VNP20009相比，本文提供的免疫刺激细菌表现出至少15倍改进的LD50。因此，与VNP20009相比，如果需要，可以施用更高剂量的本文提供的免疫刺激细菌而没有毒性作用(参见下文描述剂量和施用的部分F.5中的表)。
本文显示和描述了如本文所述修饰的免疫刺激细菌，包括鞭毛的消除、LPS修饰和其它修饰，所述细菌优先积累在或靶向骨髓细胞，特别是肿瘤驻留骨髓细胞。本文实施例证明所述免疫刺激细菌在全身施用如静脉内施用后在这些细胞中积累。实施例还描述并显示了从免疫刺激细菌到肿瘤驻留骨髓细胞的质粒转移，以及细菌细胞死亡后的持久蛋白质表达，从而递送治疗产物，包括导致抗癌反应和表型的产物。
iv.野生型菌株
VNP20009在肿瘤中的积累是由多种因素共同造成的，包括：亲本菌株ATCC 14028的固有侵袭性、其在缺氧环境中复制的能力以及对肿瘤间质液中存在的高浓度嘌呤的需求。如本文所述，不必要使用减毒菌株例如VNP20009作为起始细菌菌株。凭借本文所述的修饰，使细菌无毒或减毒。亲本菌株ATCC 14028或另一种野生型菌株可用作起始菌株，并如本文所述进行修饰。如本文所述，本文提供的免疫刺激细菌通过基因组修饰，侵润并定植于肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞以及肿瘤驻留巨噬细胞。当在不具有肿瘤的受试者中用作疫苗时，所述细菌在吞噬细胞如巨噬细胞中积累。
3.现有细菌癌症免疫疗法的局限性
如本文所示，并且根据本领域的知识也可以证明，TLR抑制或阻止I型IFN的诱导。本文提供的免疫刺激细菌，包括降低或抑制或消除TLR2/4/5应答/活性的修饰，从而克服了I型IFN的抑制作用。本文提供的免疫刺激细菌还包括增强I型IFN表达或组成型诱导I型IFN的性质和/或有效载荷。
相反，许多类别的免疫疗法具有限制其安全性和有效性的重大局限性，以及不太可能广泛使用的复杂平台。与例如溶瘤病毒相比，细菌、特别是本文提供的那些细菌具有用作抗癌治疗剂的许多有利性质。这些性质包括细菌可以很容易地在传播、制造、储存以及在治疗完成后将其从宿主中消除。然而，病毒也具有有利的性质，包括宿主应答。对细菌感染的应答是一种先天的炎症应答，这对于抗癌治疗是不利的。对病毒感染的应答类似于抗癌反应。下表对此进行了总结。
因此，与更类似于抗癌途径的病毒感知途径相比，细菌作为微生物抗癌平台的局限性源于特定的免疫程序，该程序在免疫系统感知细菌甚至细胞内细菌时启动。识别病毒的感知程序允许产生高效疫苗和持久的适应性免疫。然而，针对细菌的疫苗接种取得了有限的成功。例如，FDA批准的针对鼠伤寒沙门氏菌伤寒热的疫苗只有55％有效(见例如Hartet al.(2016)PLoS ONE 11(1):e0145945)，但是含有高度免疫原性的Vi荚膜和O:9抗原的伤寒沙门氏菌(S.typhi)不会出现在免疫原性较低的细菌菌株中，例如单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，目前尚无针对其的疫苗。
细菌和病毒含有称为病原体相关分子模式(PAMP)的保守结构，这些结构由宿主细胞模式识别受体(PRR)感知。PRR对PAMP的识别触发下游信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的诱导，并引发特定的免疫应答(见例如Iwasaki and Medzhitov(2010)Science327(5963):291-295)。PAMP参与先天免疫系统的方式以及来自哪种类型的感染因子，决定了是否会产生适当的先天或适应性反应来对抗入侵的病原体。
一类称作Toll样受体(TLR)的PRR，可识别源自细菌和病毒的PAMP，并位于细胞内的各个区室中。TLR可识别多种配体，包括脂多糖(TLR4)、脂蛋白(TLR2)、鞭毛蛋白(TLR5)、DNA中的未甲基化CpG基序(TLR9)、双链RNA(TLR3)和单链RNA(TLR7和TLR8)(见例如Akiraet al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680；和Kawai and Akira(2005)Curr.Opin.Immunol.17(4):338-344)。基于DNA和RNA的病毒可以在吞噬作用后在宿主胞质区室中被感知，也可以直接在胞质中被感知。I型干扰素(IFN-α、IFN-β)是宿主识别单链和双链DNA和RNA(病毒来源或来自摄取受损宿主细胞DNA)诱导的特征性细胞因子。例如，合成的dsRNA类似物聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly(I:C))是内体TLR3的激动剂，dsRNA更稳定的版本poly ICLC(例如以商标销售)，一直在临床开发中(见例如Caskey et al.(2011)J.Exp.Med.208(12):2357-2366)。类似地，内体中的单链RNA(ssRNA)被TLR7和TLR8(仅在人体中)感知，其已知的合成配体雷西莫特(resiquimod)和咪喹莫特(imiquimod)是FDA批准的局部癌症免疫治疗剂。
在胞质中，双链RNA(dsRNA)被RNA解旋酶感知，例如视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)，从而诱导I型干扰素(见例如Ireton and Gale(2011)Viruses 3(6):906-919)。dsDNA的胞质传感器是通过干扰素基因刺激因子(STING)介导的，STING是一种ER驻留的衔接蛋白，是感知来自感染性病原体或异常宿主细胞损伤的胞质dsDNA的主要介体(见例如Barber(2011)Immunol.Rev.243(1):99-108)。STING信号传导激活TANK结合激酶1(TBK1)/干扰素调节因子3(IRF3)轴和NF-κB信号传导轴，从而诱导IFN-β和其它强力激活先天和适应性免疫的促炎细胞因子和趋化因子(见例如Burdette et al.(2011)Nature 478(7370):515-518)。通过STING感知胞质dsDNA需要环状GMP-AMP合酶(cGAS)，这是一种直接结合dsDNA的宿主细胞核苷酸转移酶，且作为应答，合成环二核苷酸(CDN)第二信使环状GMP-AMP(cGAMP)，其结合并激活STING(见例如Sun et al.(2013)Science 339(6121):786-791；和Wu et al.(2013)Science 339(6121):826-830)。
STING还可以与细菌来源的CDN结合，例如细胞内单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)产生的c-di-AMP，或鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)产生的c-di-GMP。环状GMP-AMP合酶(cGAS)产生的非经典CDN可以激活对细菌衍生的经典CDN无应答的人STING等位基因。与细菌产生的CDN(其中两个嘌呤核苷通过具有3’-3’键的磷酸键桥连接)不同，cGAS合成的cGAMP中的核苷酸间磷酸键桥通过非经典的2’-3’键连接。这些2’-3’分子与STING结合的亲和力比细菌3’-3’c-di-GMP高300倍，因此是更有效的STING生理配体(见例如Civril et al.(2013)Nature 498(7454):332-337；Diner et al.(2013)Cell Rep.3(5):1355-1361；Gao et al.(2013)Sci.Signal 6(269):pl1；和Ablasser et al.(2013)Nature 503(7477):530-534)。人体中的cGAS/STING信号传导途径似乎已经进化为优先应答病毒病原体而不是细菌病原体。
因此，感知病毒的PRR和TLR如STING和RIG-I，诱导I型IFN，以及细胞因子和趋化因子，导致有效T细胞介导的适应性免疫。在肿瘤环境中，需要I型IFN信号传导来诱导T细胞运输趋化因子，例如CXCL10，以及还激活肿瘤抗原的DC交叉呈递以引发CD8+T细胞(见例如Diamond et al.(2011)J.Exp.Med.208(10):1989–2003；and Fuertes et al.(2011)J.Exp.Med.208(10):2005–2016)。
相比之下，宿主对细菌如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的监视主要通过TLR2、TLR4和TLR5介导(见例如Arpaia et al.(2011)Cell 144(5):675-688)。这些TLR通过MyD88(髓样分化初级反应蛋白88)和TRIF(含有衔接蛋白的Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域诱导干扰素-β)衔接分子发出信号，以介导NF-κB依赖性促炎细胞因子TNF-α和IL-6的诱导(见例如Pandey et al.(2015)Cold Spring Harb.Perspect.Biol.7(1):a016246)。鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)示出激活NLRP3炎性体通路，导致胱天蛋白酶-1的裂解和促炎细胞因子IL-1β和IL-18的诱导，从而导致细胞焦亡。TLR2、TLR4和TLR5的参与以及炎性体的激活，诱导趋化因子和细胞因子导致通过中性粒细胞和巨噬细胞清除细菌。例如，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)被T细胞清除的证据有限，并且针对其产生的抗体是非中和的(见例如McSorley(2014)Immunol.Rev.260(1):168-182)。此外，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)具有直接抑制T细胞功能的机制，从而削弱任何潜在的抗肿瘤T细胞反应的产生(见例如Kullas et al.(2012)Cell Host Microbe.12(6)791-798)。结果，细菌性癌症疗法如鼠伤寒沙门氏菌，导致被中性粒细胞和巨噬细胞的募集和清除，而这些细胞不是产生适应性抗肿瘤免疫所需的T细胞。本文描述了这些差异可以解释为什么先前的细菌抗癌疫苗，即使是那些含有宿主肿瘤抗原的疫苗，在人体中也是较差的T细胞启动载体。据报道，许多TLR都能诱导I型干扰素(IFN)，但本文发现并描述了这种教条对于原代人单核细胞衍生的巨噬细胞中的TLR2/3/4/5/7来说并不一定正确。使用TLR激动剂进行了实验，以评估对I型IFN的影响。结果显示，除非用IFNα预处理，否则TLR3和TLR4激动剂不会在原代人单核细胞中诱导I型IFN。即使用IFNα预处理激动TLR2也不诱导I型IFN。事实上，TLR2可以抑制I型IFN的诱导。这是一个迄今未鉴定的基于细菌的治疗方法的问题。
这些问题属于本文提供的免疫刺激细菌所解决的问题。本文提供的免疫刺激细菌被工程化为具有以前仅由病毒疗法提供的有利性质，并且还保留了细菌疗法的有利性质。本文提供的细菌可以全身施用，可以定位于肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境，克服免疫抑制，并适当激活抗肿瘤免疫，同时还限制现有全身免疫疗法的自身免疫相关毒性。本文提供的免疫刺激细菌有效定位于肿瘤驻留免疫细胞，及编码治疗性抗癌产物，并可编码多种这种产物。例如，本文提供的细菌可以编码互补治疗产物。文提供的免疫刺激细菌被修饰为降低或消除TLR2、4和5的激活。因此，它们不抑制I型IFN的诱导。本文提供的这种免疫刺激性细菌编码诱导I型IFN的有效载荷。这一发现具有普遍性，因此本文提供的疫苗和递送载体被设计成消除或降低TLR2应答，从而不阻止或抑制I型IFN。在一些实施方案中，TLR4和5应答被降低或消除，从而提供不抑制I型IFN的疫苗和其它免疫刺激治疗剂。
本文提供了一种优越的微生物抗癌、疫苗、RNA递送平台，经工程化为以保留细菌的有益性质，同时引发诱导有效适应性免疫的病毒样免疫应答。如本文所述，细菌，例如沙门氏菌和其它物种的细菌菌株，可以如本文所述进行修饰，以具有降低的炎症作用，并因此毒性更小。结果，例如可以施用更高的剂量。任何这些沙门氏菌菌株，以及本领域技术人员已知的和/或上文和本文中列出的其它细菌物种菌株，都可以如本文所述进行修饰。
本文提供的免疫刺激细菌被修饰为具有增加的肿瘤微环境、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤的定植。所述细菌经工程化，因此其具有降低的毒性，以及将其靶向肿瘤微环境的其它性质，包括腺苷营养缺陷型。本文提供的菌株也经过工程化，使得其不会被补体失活。这些特性，特别是那些导致吞噬细胞定植/感染的特性，也使所述细菌可用作疫苗平台和RNA递送载体。可以针对每种用途根据所选择的有效载荷、所采用的调节序列对其进行调适，这取决于是否使用细菌或宿主细胞转录/翻译机制来表达编码的产物，以及生产所述产物的宿主细胞或组织的基因座。
本文提供的细菌菌株经工程化以递送治疗产物。本文的细菌菌株递送免疫刺激蛋白，包括细胞因子、趋化因子和共刺激分子，以及可组成型诱发或诱导I型IFN表达的修饰的功能获得性胞质DNA/RNA传感器，以及其它治疗产物，例如但不限于，抗体及其片段、TGF-β和IL-6结合诱饵受体、TGF-β多肽拮抗剂、双特异性T细胞衔接蛋白RNAi，及其互补组合，促进抗肿瘤微环境中的肿瘤免疫应答。所述细菌菌株还包括减少吞噬细胞焦亡的基因组修饰，从而提供更强大的免疫应答，和/或减少或消除感染/侵入上皮细胞的能力，但保留感染/侵入吞噬细胞的能力，因此其在肿瘤、肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞中更有效地积累。所述细菌菌株也可以被修饰以抵抗人血清中补体因子的失活。所述细菌菌株还可以被修饰以编码治疗产物，包括单独或组合的例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子、I型IFN的组成型活性诱导剂和免疫检查点以及其它这种靶位的单克隆抗体(及其片段)。
提供了一种抗癌治疗产物，其递送编码截短的共刺激分子(受体或配体；例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)的遗传有效载荷，在抗原呈递细胞(APC)上表达，具有完整或部分胞质结构域缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域不能对APC发出反调节信号。
所述细菌还可以编码抗原，如肿瘤抗原和病原体抗原或蛋白质，以补充(或代替)免疫刺激蛋白，如STING和细胞因子。
C.免疫刺激细菌的修饰和增强以增加治疗指数和增加肿瘤驻留骨髓细胞的积累
本文提供了增强、包括修饰细菌基因组或免疫刺激细菌以例如降低毒性和提高抗肿瘤活性，例如通过增加肿瘤驻留骨髓细胞中的积累、提高对补体失活的抗性、减少免疫细胞死亡、促进适应性免疫以及增强T细胞功能而实现。所述修饰是关于沙门氏菌(Salmonella)、特别是鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)加以描述的；应当理解，技术人员可以在其它细菌物种如李斯特菌(Listeria)和大肠杆菌(E.coli)和其它沙门氏菌菌株中实现类似的性质/效力，以及表达相同的编码的有效载荷。这种增强/修饰的示例如下：
1.LPS生物合成途径中的基因缺失
革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)是细菌膜外叶的主要成分。其由三个主要部分组成：脂质A、非重复核心寡糖和O抗原(或O多糖)。O抗原是LPS的最外部分，并作为防止细菌渗透的保护层，但是O抗原的糖组分在菌株之间差异很大。脂质A和核心寡糖变化较小，以及更通常在相同物种的菌株中是保守型的。脂质A是LPS的包含内毒素活性的部分。其通常是以多种脂肪酸装饰的二糖。这些疏水性脂肪酸链将LPS锚定在细菌膜中，以及其余LPS从细胞表面突出。脂质A结构域是革兰氏阴性细菌大部分毒性的原因。通常，血液中的LPS被认为是重要的病原体相关分子模式(PAMP)，以及诱导极大的促炎应答。LPS是包含CD14、MD2和TLR4的膜结合受体复合物的配体。TLR4是一种跨膜蛋白，其可以通过MyD88和TRIF途径发出信号，以刺激NF-κB途径及导致促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β的产生，其结果可能是可以致命的内毒素性休克。哺乳动物细胞的胞质中的LPS可以直接与胱天蛋白酶4、5和11的CARD结构域结合，导致自体激活和焦亡性细胞死亡(见例如Hagar et al.(2015)Cell Research 25:149-150)。脂质A的组成和脂质A变体的产毒性是有据可查的。例如，与具有多个磷酸基团的脂质A相比，单磷酸化脂质A的炎性要低得多。脂质A上酰基链的数量和长度也会对毒性程度产生极大影响。来自大肠杆菌的规范脂质A有六个酰基链，并且这种六酰基化具有很强的毒性。鼠伤寒沙门氏菌脂质A与大肠杆菌的相似；其是一种葡糖胺二糖，带有四个一级和两个二级羟基酰基链(见例如Raetz et al.(2002)Annu.Rev.Biochem.71:635-700)。
a.msbB缺失
由鼠伤寒沙门氏菌中的msbB基因编码的酶脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶催化将末端肉豆蔻酰基添加到脂多糖(LPS)的脂质A结构域中(见例如Low et al.(1999)Nat.Biotechnol.17(1):37-41)。因此，msbB的缺失改变了LPS的脂质A结构域的酰基组成，LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分。例如，鼠伤寒沙门氏菌VNP20009菌株中msbB的缺失导致产生主要是五酰化脂质A，其毒性低于天然六酰化脂质A，并且允许全身递送而不诱导毒性休克(见例如Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology 19:19-25)。这种修饰显著降低了LPS诱导感染性休克、减毒细菌菌株的能力，从而提高了基于沙门氏菌的免疫疗法的治疗指数(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0109026、2004/0229338、2005/0255088和2007/0298012)。重要的是，不表达msbB产物的msbB突变体不能在细胞内复制，如本文所示例(见例如实施例2)，这是沙门氏菌毒力的要求(见例如Leung etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:11470-11474)。
可以将改变LPS表达的其它LPS突变，包括置换、缺失或插入，引入本文提供的细菌菌株包括沙门氏菌菌株中，由此显著降低毒力，从而提供更低的毒性，并允许施用更高的剂量。如本文所示例的，msbB-基因座可以部分缺失、或破坏、或易位。其也可以被完全缺失，这可以改善菌株的生长。
编码其它细菌物种中脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶的同源物或直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以达到类似的结果。这些基因包括但不限于例如在大肠杆菌(E.coli)中编码肉豆蔻酰基-酰基载体蛋白依赖性酰基转移酶的lpxM；和在鼠伤寒沙门氏菌(S.typhi.)中编码脂质A酰基转移酶的msbB。
b.pagP缺失或失活
如上所述，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的msbB-突变体不能进行脂质A的末端肉豆蔻酰化，并且主要产生比六酰化脂质A毒性低得多的五酰化脂质A。用棕榈酸酯对脂质A的修饰是由酶脂质A棕榈酰转移酶(PagP)催化的。pagP基因的转录在PhoP/PhoQ系统的控制下，该系统由低浓度的镁激活，例如在SCV内。因此，鼠伤寒沙门氏菌脂质A的酰基含量是可变的，对于野生型细菌，其可以是六酰化或五酰化的。鼠伤寒沙门氏菌将其脂质A棕榈酸化的能力增加了对分泌到吞噬溶酶体中的抗菌肽的抗性。
在野生型鼠伤寒沙门氏菌中，pagP的表达导致七酰化的脂质A。在msbB突变体(其中脂质A的末端酰基链不能添加)中，pagP的诱导导致六酰化脂质A(见例如Kong et al.(2011)Infection and Immunity 79(12):5027–5038)。六酰化脂质A已被证明是最促炎的。虽然研究小组试图利用这种促炎信号，例如通过缺失或破坏pagP以仅产生六酰化脂质A(见例如Felgner et al.(2016)Gut Microbes7(2):171-177；和Felgner et al.(2018)Oncoimmunology 7(2):e1382791)，但由于LPS的TNF-α介导的促炎性质，这可能导致耐受性差，并且自相矛盾的适应性免疫较少(见例如Kocijancic et al.(2017)Oncotarget 8(30):49988-50001)。
LPS是一种有效的TLR4激动剂，其诱导TNF-α和IL-6。在1E9 CFU/m2的静脉注射VNP20009临床试验中的剂量限制性毒性(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)，是细胞因子介导的(发热、低血压)，在2小时时血清中TNF-α水平>100,000pg/ml，IL-6水平>10,000pg/ml。尽管VNP20009中的msbB缺失及其产热原性降低，但LPS在高剂量下仍然可能有毒，可能是由于存在六酰化脂质A所致。因此，pagP-/msbB-菌株不能产生六酰化脂质A，仅产生五酰化脂质A，导致促炎细胞因子的诱导较低，在较高剂量下具有更好的耐受性，并且允许以在或高于1E9 CFUs/m2的剂量在人体中给药。更高的剂量会导致肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境的定植增加，从而增强所述免疫刺激细菌的治疗效力。由于导致细菌膜和结构的变化，因此宿主免疫应答如补体活性被改变，由此所述细菌在全身施用时不会被消除。例如，本文示出pagP-/msbB-突变株对补体失活的抗性增加，并且在人血清中的稳定性增加。
本文提供了免疫刺激细菌，例如活的减毒沙门氏菌菌株，例如示例的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株，其仅能产生具有五酰化脂质A的LPS，其含有msbB基因的缺失，并且进一步通过缺失/破坏pagP被修饰。如上所述，msbB表达的缺失阻止了脂质A的末端肉豆蔻酰化，而pagP表达的缺失阻止了棕榈酰化。经修饰以产生具有五酰化脂质A的LPS的菌株当进一步修饰以表达刺激肿瘤微环境中免疫应答的异源遗传有效载荷时，可降低促炎细胞因子水平，提高血液中的稳定性，对补体固定抗性，增加对抗菌肽的敏感性，增强耐受性，并增加抗肿瘤免疫性。
编码其它细菌物种中脂质A棕榈酰转移酶(PagP)的同源物和直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以达到类似的结果。这些基因包括但不限于，例如在大肠杆菌中编码脂质IVA棕榈酰转移酶的pagP；和在鼠伤寒沙门氏菌中编码抗微生物肽抗性和脂质A酰化蛋白的pagP。
2.营养缺陷型
本文提供的免疫刺激细菌可以通过使其对一种或多种必需营养素是营养缺陷型来减毒，所述营养素例如嘌呤(例如腺嘌呤)、核苷(例如腺苷)、氨基酸(例如芳香族氨基酸、精氨酸和亮氨酸)、三磷酸腺苷(ATP)或本领域已知和描述的其它营养素。
a.purI缺失/破坏
磷酸核糖氨基咪唑合成酶是一种由purI基因(与purM基因同义)编码的酶，参与嘌呤的生物合成途径。purI基因的破坏或缺失或失活因此使细菌对嘌呤是营养缺陷的。除了被减毒之外，purI-突变体在肿瘤环境中富集并且具有显著的抗肿瘤活性(见例如Paweleket al.(1997)Cancer Research57:4537-4544)。先前描述了这种定植是由于肿瘤细胞间液中存在的高浓度嘌呤所致，这是由于肿瘤的快速细胞更新所致。由于purI-细菌不能合成嘌呤，需要外部来源的腺嘌呤，被认为这将导致其在富含嘌呤的肿瘤微环境中的生长受限(见例如Rosenberg et al.(2002)J.Immunotherapy25(3):218-225)。虽然最初报道VNP20009菌株含有purI基因的缺失(见例如Low et al.(2003)Methods in Molecular MedicineVol.90,Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews,pp.47-59)，但随后对VNP20009的整个基因组的研究表明purI基因没有被缺失，而是被染色体倒位破坏(见例如Broadway etal.(2014)Journal of Biotechnology 192:177-178)。整个purI基因包含在VNP20009染色体的两个部分中，两侧是插入序列，其中一个具有活性转座酶。虽然purI基因的破坏限制了在肿瘤组织/微环境的复制，但其仍然允许细胞内复制和毒力。如本文所示例的(参见实施例2)，msbB和purI基因中的每一个的缺失或破坏是限制在肿瘤组织中细胞外空间生长并防止细胞内复制所必需的。本文提供了其中这些基因的编码部分被完全缺失以消除任何可能通过重组恢复为野生型的菌株。本文示出这种细菌的生长更为有效。
除了purI基因缺失或破坏，营养素营养缺陷可以通过例如aro、gua、thy、nad和asd等基因缺失/突变而引入免疫刺激细菌。由涉及这些基因的生物合成途径产生的营养素在宿主细胞中通常是不可用的，因此，细菌的生存具有挑战性。例如，沙门氏菌和其它细菌物种的减毒可以通过缺失aroA基因来实现，该基因是将糖酵解与芳香族氨基酸生物合成联系起来的莽草酸途径的一部分(见例如Felgner et al.(2016)mBio 7(5):e01220-16)。aroA的缺失导致芳香族氨基酸的细菌营养缺陷和随后的减毒(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0175297、2012/0009153和2016/0369282；以及国际申请公开号WO2015/032165和WO2016/025582)。类似地，已经缺失了参与芳香族氨基酸生物合成途径的其它酶，包括aroC和aroD，以实现减毒(见例如美国专利公开号2016/0369282；和国际申请公开号WO2016/025582)。例如，鼠伤寒沙门氏菌SL7207菌株是芳香族氨基酸营养缺陷型(aroA-突变体)；A1和A1-R菌株是亮氨酸-精氨酸营养缺陷型；VNP20009/YS1646是嘌呤营养缺陷型(purI-突变体)。如本文所示，VNP20009/YS1646对于免疫抑制性核苷腺苷和ATP也是营养缺陷型的(参见实施例1)。本文提供的菌株包括源自称作YS1646菌株的菌株，例如那些缺乏鞭毛、是pagP-或被修饰成产生五酰化LPS的菌株，并包括额外的修饰，包括完全缺失purI和/msbB，以及缺失卷曲菌毛，例如通过基因组修饰使细菌变成csgD-，以及需要各种营养素以生长的其它修饰，例如thyA-株。所述菌株也可以具有使其成为ansB-的基因组修饰，从而不产生可以抑制T细胞的天冬酰胺合酶，从而消除免疫刺激细菌的这种免疫抑制性。示例的菌株包括那些称作YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI，和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA的菌株。应了解的是这些命名是参考沙门氏菌基因；类似的修饰可以在其它细菌物种中实现，如李斯特菌(Listeria)，和大肠杆菌(E.coli)，如大肠杆菌尼斯勒(Nissle)。
编码磷酸核糖酰氨基咪唑合成酶(PurI)的同源物或直系同源物的相应基因，以及在其它细菌物种中嘌呤合成所需的其它基因，也可以被缺失或破坏以获得类似的结果。这些基因包括但不限于，例如，purM，在大肠杆菌中编码磷酸核糖酰甲酰基甘氨酰胺环连接酶；purM，在伤寒沙门氏菌中编码磷酸核糖酰甲酰基甘氨酰脒环连接酶；purA，编码腺苷酸琥珀酸合成酶，purQ，编码磷酸核糖酰甲酰基甘氨脒合酶II，及purS，编码单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)中磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶亚基PurS；purM(BL1122)，编码长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中磷酸核糖酰甲酰基甘氨脒环连接酶；及NT01CX_RS09765，编码AIR合酶，和NT01CX_RS07625(purM)，编码诺氏梭菌(Clostridium novyi)中磷酸核糖酰甲酰基甘氨脒环连接酶。
b.腺苷营养缺陷型
衍生自色氨酸和三磷酸腺苷(ATP)/腺苷途径的代谢产物是在肿瘤/肿瘤微环境(TME)内形成免疫抑制环境的主要驱动力。以游离形式存在于细胞内部和外部的腺苷是免疫功能的效应子。腺苷降低T细胞受体诱导的NF-κB的激活，并抑制IL-2、IL-4和IFN-γ。腺苷降低T细胞的细胞毒性，增加T细胞的免疫失能，并增加T细胞分化为Foxp3+或Lag-3+调节性T细胞(T-reg细胞，T-regs或Tregs)。对于自然杀伤(NK)细胞，腺苷降低IFN-γ产生，并抑制NK细胞的细胞毒性。腺苷阻断中性粒细胞的粘附和外渗，降低吞噬作用，以及减弱超氧化物和一氧化氮的水平。腺苷还降低巨噬细胞上TNF-α、IL-12和MIP-1α(CCL3)的表达，减弱II类主要组织相容复合物(MHC)的表达，以及增加IL-10和IL-6的水平。腺苷免疫调节活性在其释放到肿瘤的细胞外空间并激活靶免疫细胞、癌细胞或内皮细胞的表面上的腺苷受体(ADR)后发生。肿瘤微环境中高腺苷水平导致局部免疫抑制，这限制了免疫系统消除癌细胞的能力。
细胞外腺苷是由膜相关的胞外酶CD39(胞外-三磷酸核苷二磷酸水解酶1，或NTPDase1)和CD73(胞外-5’-核苷酸酶)的相继活性产生的，所述酶在肿瘤基质细胞上表达，通过由死亡细胞或垂死细胞产生的ATP或ADP的磷酸分解作用共同产生腺苷。CD39将细胞外ATP(或ADP)转化为5’AMP，其由CD73转化为腺苷。内皮细胞上的CD39和CD73的表达在肿瘤微环境的缺氧条件下增加，从而增加腺苷水平。肿瘤缺氧可以由血液供应不足和肿瘤脉管系统紊乱造成，从而削弱氧气递送(见例如Carroll and Ashcroft(2005)Expert.Rev.Mol.Med.7(6),DOI:10.1017/S1462399405009117)。发生在肿瘤微环境中的缺氧也抑制腺苷酸激酶(AK)，所述激酶可将腺苷转化为AMP，从而导致非常高的细胞外腺苷浓度。缺氧肿瘤微环境中腺苷的细胞外浓度已测量为10-100μM，这比约0.1μM的典型细胞外腺苷浓度高约100-1000倍(见例如Vaupel et al.(2016)Adv.Exp.Med.Biol.876:177-183；和Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。由于肿瘤中的缺氧区域远离微血管，因此腺苷在肿瘤某些区域的局部浓度可能高于其它区域。
为了指导抑制免疫系统的效应，腺苷还可以通过对癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响来控制癌细胞的生长和扩散。例如，腺苷可以主要通过刺激A2A和A2B受体来促进血管生成。刺激内皮细胞上的受体可以调节细胞间粘附分子1(ICAM-1)和E-选择素在内皮细胞上的表达，维持血管完整性并促进血管生长(见例如Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。腺苷激活各种细胞上的A2A、A2B或A3中的一种或多种可以刺激促血管生成因子的产生，例如血管内皮生长因子(VEGF)、白介素8(IL-8)或血管生成素2(见例如Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。
腺苷还可以通过与癌细胞上的受体相互作用来直接调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移。例如，研究表明A1和A2A受体的激活促进某些乳腺癌细胞系中的肿瘤细胞增殖，并且A2B受体的激活在结肠癌细胞中具有促进癌症生长的性质(见例如Antonioli et al.(2013)Nat.Rev.Can.13:842-857)。腺苷还可以触发癌细胞的凋亡，并且各种研究已经将该活性与通过A3的外在凋亡途径的激活或通过A2A和A2B的固有凋亡途径的激活相关联(见例如Antonioli et al.(2013))。通过增加细胞运动性、与细胞外基质的粘附，以及细胞粘附蛋白和受体的表达以促进细胞运动和运动性，腺苷可促进肿瘤细胞的迁移和转移。
三磷酸腺苷(ATP)的细胞外释放发生于受刺激的免疫细胞以及受损、垂死或应激的细胞。当受到这种ATP的胞外释放的刺激时，含NLR家族pyrin结构域蛋白3(NLRP3)炎性体激活胱天蛋白酶-l，并导致细胞因子IL-1β和IL-18的分泌，其进而激活先天性和适应性免疫应答(见例如Stagg and Smyth(2010)Oncogene 29:5346–5358)。ATP可以在肿瘤组织中积累到超过100mM的浓度，而在健康组织中发现的ATP水平非常低(约1-5μM)(见例如Songet al.(2016)Am.J.Physiol.Cell Physiol.310(2):C99–C114)。ATP通过CD39和CD73酶分解代谢为腺苷。激活的腺苷通过负反馈机制作为高度免疫抑制的代谢产物，并且在缺氧肿瘤微环境中对多种免疫细胞类型具有多效效应(见例如Stagg and Smyth(2010)Oncogene29:5346–5358)。腺苷受体A2A和A2B在多种免疫细胞上表达，并被腺苷刺激以促进cAMP介导的信号传导变化，从而导致T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤(NKT)细胞的免疫抑制表型。结果，腺苷水平可在病理组织例如实体瘤中累积至其正常浓度的100倍以上，该组织已显示过表达胞外核苷酸酶如CD73。腺苷也已显示出促进肿瘤血管生成和发展。因此，对腺苷呈营养缺陷型的工程化细菌将表现出增强的肿瘤靶向和定植。
可以例如通过缺失tsx基因(见例如Bucarey et al.(2005)Infection andImmunity 73(10):6210-6219)或通过缺失purD(见例如Husseiny(2005)Infection andImmunity 73(3):1598–1605)，使免疫刺激细菌例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)对于腺苷呈营养缺陷型。在革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)中，purD基因敲除菌株示出对腺苷呈营养缺陷型(见例如Park et al.(2007)FEMSMicrobiol.Lett.276:55-59)。如本文所示例，鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009由于其purI缺失而对腺苷呈营养缺陷型，因此不需要进一步修饰使其对腺苷呈营养缺陷型。因此，本文提供的免疫刺激细菌菌株的实施方案对腺苷呈营养缺陷型。这种营养缺陷型细菌选择性地在肿瘤微环境中复制，进一步增加所施用细菌在肿瘤中的积累和复制，并降低了肿瘤内和周围的腺苷的水平，从而减少或消除由腺苷积累引起的免疫抑制。本文提供的这种细菌的示例是含有purI-/msbB-突变以提供腺苷营养缺陷的鼠伤寒沙门氏菌的修饰的菌株。对于其它菌株和细菌，purI基因可以如在VNP20009中一样被破坏，或者其可以含有purI基因的全部或部分缺失，这确保不会恢复为野生型基因。如本文别处所述，在菌株VNP20009中，purI基因通过倒位失活。类似地，VNP20009中的msbB基因未完全缺失。如本文所示例，其中purI和msbB基因已被完全缺失以消除任何反转风险的菌株，通过体外培养生长评估显示出优异的适应性。
使用通过使免疫刺激细菌对一种或多种必需营养素例如嘌呤(例如腺嘌呤)、核苷(例如腺苷)、氨基酸(例如芳香族氨基酸、精氨酸和亮氨酸)或三磷酸腺苷(ATP)呈营养缺陷型而被修饰的免疫刺激细菌。特别地，在本文提供的免疫刺激细菌例如鼠伤寒沙门氏菌菌株的实施方案中，使所述细菌对腺苷和任选对ATP呈有营养缺陷型，并优先在肿瘤微环境(TME)中积累。因此，本文所述的免疫刺激细菌菌株被减毒，因为其需要嘌呤、腺苷和/或ATP来生长，并且其优先定殖在具有丰富的这些代谢物的TME中，如下所述。由于某些肿瘤的肿瘤微环境中的腺苷积累具有免疫抑制作用，因此腺苷营养缺陷消除了某些癌症的肿瘤微环境中积累的腺苷的免疫抑制作用。
c.胸苷营养缺陷型
可以引入基因组修饰以代替或补充下面讨论的失活/缺失(见第3节)。为生长所需的基因或基因产物的其它缺失或失活，如产生营养素的基因，可以用来代替或补充例如asd的失活/缺失。这些修饰包括例如使细菌成为thyA-的修饰(见例如Loessner et al.(2006)FEBS Lett 265:81-88)。呈现ThyA-的免疫刺激细菌具有基因组修饰，如插入、缺失、置换、转位和/或其它改变，导致胸苷酸合酶的生产无活性或消除。胸苷酸合酶催化dUMP还原甲基化为dTMP，这是一种DNA生物合成前体(dTTP的前体)。
产生这种产物的细菌基因组的表达或生产或其它减毒突变的消除，导致施用后在体内细菌细胞死亡时释放出编码的大分子。如下文所述，Asd是细菌细胞壁合成的一种基本酶；ThyA是DNA合成所需的一种酶。相应基因的突变使菌株对二氨基庚二酸(DAP)或胸苷单磷酸前体是营养缺陷的。剥夺互补底物后，这种细菌会因无DAP或无胸腺嘧啶而死亡，导致细菌蛋白和质粒的释放。Asd的失活或消除，导致大分子的释放。消除或失活ThyA(产生ΔThyA细菌，包括那些具有插入、缺失和其它修饰的细菌，由此不产生活性酶)的表达/活性不会导致在胸苷饥饿时释放大分子，包括蛋白质和质粒(Loessner et al.,(2006)FEBS Lett265:81-88)。
因此，其中的基因组被修饰从而不产生活性酶的ΔThyA细菌，是有利于例如在体内向宿主细胞递送质粒，因为该细菌不会过早地释放其内容物。由于本文提供的细菌感染或积累在骨髓细胞中如摄取细菌的吞噬细胞例如巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞中，因此完整的ΔThyA细菌在靶向的细胞内释放编码有效载荷的质粒，如治疗产物，例如表达(如果是RNA)，或分泌或呈递(如果是蛋白质)。因此，使细菌成为ThyA-的基因组修饰在特定的应用中具有优势，如在免疫、在细胞上的呈递、递送RNA以及其它此类应用中。
3.质粒维持和递送
a.asd缺失
如上所述，可以使所述这些细菌呈现为thyA-；也可以代替或补充使其呈现为asd-。特定的基因组修饰的选择取决于细菌的预期应用。对某些应用来说，thyA失活是有利的；对其它应用而言，细呈现asd-是有利的；选择特定的修饰属于技术人员的技能范围。细菌中的asd基因编码天冬氨酸-半醛脱氢酶。鼠伤寒沙门菌的asd-突变体对二氨基庚二酸(DAP)具有专性要求，这是细胞壁合成所必需的，并将在DAP剥夺的环境进行裂解。当asd基因在细菌中质粒上反式互补时，这种DAP营养缺陷可用于质粒选择和体内质粒稳定性的维持，而无需使用抗生素。基于非抗生素的质粒选择系统是有利的，并且允许1)在不良症状的事件下施用抗生素用作快速清除机制的用途，和2)在通常避免这种用途的情况下允许无抗生素的大规模生产。asd基因互补系统提供了这种基于无抗生素的质粒选择(见例如Galán et al.(1990)Gene 94(1):29-35)。预期使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中，以增加经工程化以递送编码遗传有效载荷/治疗产物的质粒的鼠伤寒沙门菌的效力，所述遗传有效载荷/治疗产物例如免疫刺激蛋白(例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子)；诱导I型IFN的胞质DNA/RNA传感器，如STING和IRF3及其功能获得/组成型活性突变体；抗体及其片段(例如检查点抑制剂，或抗IL-6或抗VEGF抗体)；双特异性T细胞衔接器(以商标销售)；干扰RNA；以及本文其它部分讨论的和本领域已知的其它治疗产物；以及所有前述治疗产物的互补组合。
鼠伤寒沙门菌的asd突变体的可选用途是利用DAP营养缺陷产生自溶(或自杀)菌株，用于将治疗产物/的分子递送至感染的细胞，而无需持久地定植于宿主肿瘤的能力。在体外或体内生长时，asd基因的缺失使细菌对DAP呈营养缺陷型。本文所述的实例提供了一种asd缺失菌株，该菌株对DAP呈营养缺陷型，并含有适合于递送免疫刺激蛋白的质粒，该质粒不包含asd互补基因，从而产生体内复制有缺陷的菌株。这个菌株在DAP存在下在体外繁殖并正常生长，然后作为免疫治疗剂施用于不存在DAP的哺乳动物宿主。所述自杀菌株能够侵袭宿主细胞，但是由于在哺乳动物组织中不存在DAP而不能复制，从而自动裂解并递送其胞质内容物(例如质粒或蛋白质)。
编码其它细菌物种中天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的同源物或直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以获得类似的结果。这些基因包括但不限于，例如，asd，编码大肠杆菌中的天冬氨酸-半醛脱氢酶；asd(STY4271)，编码伤寒沙门氏菌中天冬氨酸-半醛脱氢酶；asd(lmo1437)，编码单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)中天冬氨酸-半醛脱氢酶；asd(BL0492)，编码长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中天冬氨酸-半醛脱氢酶；和NT01CX_RS04325(asd)，编码诺氏梭菌(Clostridium novyi)中天冬氨酸-半醛脱氢酶。同样，如上所述，可以通过基因组修饰失活或消除thyA代替asd修饰。如上所述，胸苷酸合酶表达/活性的失活或消除在胸苷酸饥饿时不会导致大分子包括蛋白质和质粒的释放。
b.endA缺失/破坏
endA基因(例如SEQ ID NO:250)编码核酸内切酶(DNA特异性核酸内切酶，见例如SEQ ID NO:251)，该核酸内切酶介导双链DNA(dsDNA)在革兰氏阴性细菌的周质中的降解。实验室大肠杆菌的最常见菌株是endA-，因为endA基因的突变允许质粒DNA的更高产量。这个基因在物种之间是保守的。为了促进完整质粒DNA的递送，工程化的免疫刺激细菌的endA基因被缺失或突变以防止其核酸内切酶活性。这种突变的实例是E208K氨基酸取代(见例如Durfee et al.(2008)J.Bacteriol.190(7):2597-2606)或感兴趣的物种中的相应突变。endA，包括E208，在包括沙门菌属在内的细菌物种中是保守的。因此，E208K突变可用于消除包括沙门菌属物种在内的其它物种中的核酸内切酶活性。本领域技术人员可以引入其它突变或缺失以消除endA活性。在本文的免疫刺激细菌如沙门菌属中，进行这个突变或缺失或破坏基因以消除endA的活性，提高完整质粒DNA递送的效率，从而提高在质粒上编码的任一种、或两种或更多种免疫调节蛋白/治疗产物的表达，并增强抗肿瘤反应和抗肿瘤效力。
4.鞭毛蛋白敲除菌株
鞭毛是细菌表面上的细胞器，其由通过钩状体连接到旋转马达的长丝组成，该旋转马达可以顺时针或逆时针方式旋转以提供移位的手段。由于介导穿过肠胃道的黏液层的运动性的能力，例如鼠伤寒沙门菌中的鞭毛对于趋化性和对于通过口服途径建立感染很重要。虽然鞭毛已被证明是趋化性和肿瘤椭圆柱体外定植所必需的(见例如Kasinskas andForbes(2007)Cancer Res.67(7):3201-3209)，并且运动性已被证明对肿瘤穿透很重要(见例如Toley and Forbes(2012)Integr.Biol.(Camb)4(2):165-176)，但当细菌通过静脉内施用时，鞭毛对于在动物内肿瘤定植是不必需的(见例如Stritzker et al.(2010)International Journal of Medical Microbiology 300:449-456)。每个鞭毛丝由数万个鞭毛蛋白亚基组成。鼠伤寒沙门菌染色体包含两个基因，fliC和fljB，其编码抗原不同的鞭毛蛋白单体。当通过口服感染途径施用时，fliC和fljB均缺陷的突变体是非动性和无毒性的，但当在胃肠外施用时，则保持毒力。
鞭毛蛋白是沙门菌属的主要促炎性决定因子(见例如Zeng et al.(2003)J.Immunol.171:3668-3674)，并直接被细胞表面上的TLR5和胞质溶胶中的NLCR4识别(见例如Lightfield et al.(2008)Nat.Immunol.9(10):1171-1178)。这两种途径均导致促炎应答，从而导致分泌细胞因子，包括IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6。试图通过将细菌工程化为分泌创伤弧菌(Vibrio vulnificus)鞭毛蛋白B来增加对鞭毛蛋白的促炎反应，从而使基于沙门菌属的癌症免疫疗法更加有效，该创伤弧菌鞭毛蛋白B与fliC和fljB编码的鞭毛蛋白相比，诱导更大的炎症(见例如Zheng et al.(2017)Sci.Transl.Med.9(376):eaak9537)。
在本文中，沙门菌属细菌鼠伤寒沙门菌被工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基fliC和fljB，以减少TLR5介导的促炎信号传导。其它含有鞭毛的细菌也可以通过类似的工程化以消除鞭毛，并包括其它具有与示例的沙门氏菌的修饰基本相同效果的修饰。例如，如本文所示，将缺乏msbB和/或pagP的沙门菌属菌株(其导致降低的TNF-α诱导)与消除鞭毛组合，鞭毛的消除可以在沙门氏菌中通过fliC和fljB敲除而实现。这导致具有组合的TNF-α诱导降低和TLR5识别降低的沙门菌属菌株。这些细菌修饰msbB-、pagP-、fliC-和fljB-可以与免疫刺激质粒组合，该质粒任选含有CpG，编码治疗产物例如免疫调节蛋白及组合产物。由此产生的细菌减少了促炎信号传导，但具有强大的抗肿瘤活性。这些基因组修饰也可以与本文所述的其它基因组修饰组合。对于疫苗而言，编码的产物可以包括对其产生免疫保护或治疗应答的抗原和蛋白质。
例如，如本文示例和提供的，在鼠伤寒沙门菌的asd缺失菌株VNP20009中构建了fliC和fljB双突变体。VNP20009是通过破坏purI/purM来减毒，其含有msbB基因的修饰(部分缺失)，导致产生比野生型脂质A低毒性的脂质A亚基。这导致与具有野生型脂质A的菌株相比，在静脉内施用后小鼠模型中降低的TNF-α产生。所得菌株是针对细菌炎症减毒的示例菌株，通过修饰脂质A以减少TLR2/4信号传导和缺失鞭毛蛋白亚基的表达以降低TLR5识别和炎性体诱导而实现。
某些细菌物种的发病机制，包括沙门氏菌物种，如鼠伤寒沙门氏菌，涉及一组被称为沙门氏菌致病岛(SPI)的基因。沙门氏菌使用由沙门氏菌致病岛1(SPI-1)编码的3型分泌系统(T3SS)侵入非吞噬性肠上皮细胞，其形成针状结构，将效应蛋白直接注入宿主细胞的胞质中。这些效应蛋白导致真核细胞细胞骨架的重排以促进侵入肠上皮，并且还诱导促炎细胞因子。称作SPI-1的SPI介导上皮细胞的侵入。SPI-1基因包括但不限于：avrA，hilA，hilD，invA，invB，invC，invE，invF，invG，invH，invI，invJ，iacP，iagB，spaO，spaP，spaQ，spaR，spaS，orgA，orgB，orgC，prgH，prgI，prgJ，prgK，sicA，sicP，sipA，sipB，sipC，sipD，sirC，sopB，sopD，sopE，sopE2，sprB，和sptP。缺失这些基因中的一个或多个基因会降低或消除细菌感染上皮细胞的能力，但不影响其感染或侵入吞噬细胞(包括吞噬免疫细胞)的能力。例如，已证明fliC和fljB基因的同时缺失显著降低了SPI-1基因的表达，例如hilA、hilD、invA、invF和sopB的表达，从而降低了侵入非吞噬细胞的能力(见例如Elhadad etal.(2015)Infect.Immun.83(9):3355-3368)。
在如沙门氏菌等细菌中，除了SPI-1 3型分泌系统(T3SS)外，鞭毛蛋白是引发巨噬细胞焦亡所必需的，并且可以被巨噬细胞NLRC4炎性体检测到。鞭毛蛋白亚基的消除降低了巨噬细胞的焦亡。例如，与野生型菌株相比，具有fliC和fljB缺失的鼠伤寒沙门氏菌导致IL-1β分泌显著减少，而细菌的细胞摄取和细胞内复制不受影响。这表明鞭毛蛋白在炎性体激活中起重要作用。此外，发现经工程化以组成型表达fliC的鼠伤寒沙门氏菌菌株可诱导巨噬细胞焦亡(见例如Li et al.(2016)Scientific Reports 6:37447；Fink and Cookson(2007)Cellular Microbiology 9(11):2562-2570；和Winter et al.(2015)Infect.Immun.83(4):1546-1555)。
可以对本文的免疫刺激细菌的基因组进行修饰，以缺失或突变鼠伤寒沙门氏菌中的鞭毛蛋白基因fliC和fljB，从而减少肿瘤驻留免疫细胞例如巨噬细胞的细胞死亡，并增强所述免疫刺激细菌的抗肿瘤免疫应答。
鞭毛蛋白亚基的缺失与LPS的修饰的组合，可提高宿主的耐受性，限制仅吞噬细胞的摄取并降低其细胞焦亡，并针对递送治疗产物例如免疫调节蛋白的免疫刺激反应引导至TME，尤其是肿瘤驻留的骨髓细胞。由此产生的免疫刺激细菌引发抗肿瘤反应并促进对肿瘤的适应性免疫应答。
编码其它细菌物种中鞭毛蛋白的相应基因也可以被缺失以获得类似的结果。这些基因包括但不限于例如在大肠杆菌(E.coli)中，fliC，其编码鞭毛丝结构蛋白，和fliE，其编码鞭毛基体蛋白FliE；在伤寒沙门氏菌(S.typhi)中，fliC，其编码鞭毛蛋白，和flgB，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgB；在单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)中，flaA，其编码鞭毛蛋白，fliE，其编码鞭毛钩基体蛋白FliE，和flgB，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgB；及在诺氏梭菌(Clostridium novyi)中，NT01CX_RS04995、NT01CX_RS04990、NT01CX_RS05070和NT01CX_RS05075，其编码鞭毛蛋白，NT01CX_RS05080(flgB)，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgB，NT01CX_RS05085(flgC)，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgC，及NT01CX_RS05215(flgG)，其编码鞭毛基体杆状蛋白FlgG。
5.工程化细菌以促进适应性免疫和增强T细胞功能
L-天冬酰胺酶II(ansB)缺失/破坏
L-天冬酰胺酶II是一种催化L-天冬酰胺转化为氨和天冬氨酸的酶。一些细菌菌株，例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，利用L-天冬酰胺酶来清除果糖-天冬酰胺作为碳和氮源(见例如Sabag-Daigle et al.(2018)Appl.Environ.Microbiol.84(5):e01957-17)。恶性T细胞，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)，需要天冬酰胺，因为所述T细胞缺乏合成其的酶。自1970年代初以来，施用L-天冬酰胺酶一直是ALL的一线疗法(见例如Batool et al.(2016)Appl.Biochem.Biotechnol.178(5):900-923)。鼠伤寒沙门氏菌产生L-天冬酰胺酶II对于抑制T细胞是必要和充分的，因为它直接诱导T细胞受体(TCR)下调，减少T细胞细胞因子的产生，并抑制肿瘤细胞溶解功能(见例如Kullas et al.(2012)Cell HostMicrobe.12(6)791-798；和van der Velden et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(49):17769-17774)。在快速克隆扩展条件下，例如在肿瘤微环境中T细胞活化过程中发生的那些情况，天冬酰胺是必需的，其被L-天冬酰胺酶II消耗导致T细胞抑制。因此，L-天冬酰胺酶II已被用作癌症的抗癌治疗剂，其中T细胞抑制是一种治疗方式。
与L-天冬酰胺酶作为抗癌治疗剂的现有用途相反，本文示出在本文提供的免疫刺激细菌以及其它免疫刺激细菌和细菌疫苗如用于结核病(TB)和其它疾病接种的BCG疫苗中L-天冬酰胺酶活性的消除增强了T细胞在肿瘤微环境中的功能。L-天冬酰胺酶活性的消除可以通过修饰细菌基因组以消除活性酶的表达来实现。修饰包括核酸的插入、缺失、置换和其它改变，由此所得编码的酶没有活性，或不表达，或被消除。本文示出，编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或部分缺失或其破坏，以消除编码的酶在免疫刺激细菌中的表达，增强了T细胞在细菌定植的肿瘤微环境中的功能。L-天冬酰胺酶II活性的抑制是通过免疫刺激细菌中基因ansB的全部或部分缺失或中断/破坏来实现的，由此不产生L-天冬酰胺酶II。因此，提供了其基因组被修饰从而不产生L-天冬酰胺酶II的免疫刺激细菌。本文提供的免疫刺激细菌用于定殖肿瘤驻留免疫细胞以增强抗肿瘤免疫应答；基因组修饰中包括缺失、插入、破坏和/或消除L-天冬酰胺酶II表达的其它修饰。
如本文所示，本文中的免疫刺激细菌的基因组可以被修饰以缺失ansB，或破坏其或以其它方式修饰其，导致编码的L-天冬酰胺酶II失活，或消除天冬酰胺酶，从而防止T细胞抑制和增强体内抗肿瘤T细胞功能。本文示出，ansB是完整的菌株在用该菌株感染的T细胞中诱导显著的T细胞免疫抑制。ansB是缺失的菌株不诱导免疫抑制，因此解决了本领域中使用细菌将编码的治疗产物递送至肿瘤的另一个问题。因此，将ansB基因缺失或破坏而由此不表达功能性编码的酶与本文描述的导致在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中积累增加的其它修饰相组合的免疫刺激细菌，提供了优越的治疗性免疫刺激细菌。
在其它细菌物种中，编码L-天冬酰胺酶II(ansB)的同源物或直系同源物的相应基因也可以被缺失或破坏以获得类似的结果。这些基因包括但不限于例如：ansB，在大肠杆菌(E.coli)中编码L-天冬酰胺酶2；ansB(STY3259)，在伤寒沙门氏菌(S.typhi)中编码L-天冬酰胺酶；ansB(lmo1663)，在单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)中编码L-天冬酰胺合成酶；和BL1142，在长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中编码L-天冬酰胺酶前体。
6.产生卷曲菌毛所需的沙门氏菌基因缺失/破坏
细菌和真菌能够形成称为生物膜的多细胞结构。细菌生物膜包裹在分泌的和细胞壁相关的多糖、糖蛋白和糖脂以及细胞外DNA的混合物中，统称为细胞外聚合物。这些细胞外聚合物可以保护细菌免受多种侵害，例如清洁剂、抗生素和抗菌肽的侵害。细菌生物膜允许表面定植，并且是假体例如注射口和导管严重感染的原因。在感染过程中，生物膜也可以在组织中形成，这会导致细菌持续和脱落的持续时间延长，并限制抗生素治疗的有效性。细菌在生物膜中的长期存在与增加的肿瘤发生有关，例如在胆囊的伤寒沙门氏菌感染中(见例如Di Domenico et al.(2017)Int.J.Mol.Sci.18:1887).。
csgD缺失
在沙门氏菌例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中，生物膜形成受csgD调节，csgD激活csgBAC操纵子并导致卷曲菌毛亚基CsgA和CsgB的产生增加(见例如Zakikhany etal.(2010)Molecular Microbiology 77(3):771–786)。CsgA被TLR2识别为PAMP，并诱导人巨噬细胞产生IL-8(见例如Tukel et al.(2005)Molecular Microbiology 58(1):289-304)。此外，csgD通过激活编码二鸟苷酸环化酶的adrA基因间接增加纤维素产量。由adrA产生的小分子环状二鸟苷一磷酸(c-di-GMP)是一种普遍存在的次级信使，几乎存在于所有细菌物种中。c-di-GMP的增加增强了纤维素合酶基因bcsA的表达，这反过来又通过刺激bcsABZC和bcsEFG操纵子增加了纤维素的产生，从而导致纤维素生物膜的形成。因此，细菌如鼠伤寒沙门氏菌，可以在实体瘤中形成生物膜，以防止被宿主免疫细胞吞噬。不能形成生物膜的细菌突变体，例如沙门氏菌突变体，会更快地被宿主吞噬细胞吸收，并且更容易从感染的肿瘤中清除(见例如Crull et al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。吞噬细胞内细胞内定位的这种增加可以减少细胞外细菌的持久性，并且如本文所示，可以增强治疗产物如本文所述的免疫调节蛋白和其它抗癌治疗剂的质粒递送的有效性。免疫刺激细菌例如鼠伤寒沙门氏菌形成生物膜的能力的降低可以通过缺失或破坏参与生物膜形成的基因来实现，所述基因例如是csgD、csgA、csgB、adrA、bcsA、bcsB、bcsZ、bcsE、bcsF、bcsG、dsbA、或dsbB(见例如Anwar et al.(2014)PLoS ONE 9(8):e106095)。
本文示出，对免疫刺激细菌进行工程化以减少生物膜形成可提高从肿瘤/组织中的清除率，提高治疗的耐受性，并防止假体在患者体内定植，从而提高这些菌株的治疗益处。已知腺苷模拟物可抑制鼠伤寒沙门氏菌生物膜形成，这表明肿瘤微环境中的高腺苷浓度有助于肿瘤相关生物膜的形成(见例如Koopman et al.(2015)Antimicrob.AgentsChemother.59:76-84)。本文示出，由于更多的细菌摄取到肿瘤驻留骨髓细胞中，因此缺失csgD的菌株表现出改善的抗肿瘤功效。类似的基因组修饰可以在其它细菌菌株中实现，如大肠杆菌(E.coli)和李斯特菌(Listeria)，所述修饰改变生物膜的形成和/或卷曲菌毛的产生，从而使细菌可以更好地渗入血管，如肿瘤和肿瘤微环境中的血管。
在其它细菌物种中编码csgD的同源物和直系同源物的相应基因以及卷曲菌毛和生物膜形成所需的其它基因，也可以被缺失或破坏或以其它方式修饰以获得类似的结果。这些基因包括但不限于例如：csgD，在大肠杆菌中编码DNA结合转录双重调节因子CsgD；csgD(STY1179)，在伤寒沙门氏菌中编码调节蛋白CsgD；和lcp，在单核细胞增生李斯特菌中编码参与生物膜形成的李斯特菌纤维素结合蛋白。
细菌基因组的修饰，例如通过缺失或破坏基因以使细菌是csgD-，导致卷曲菌毛和炎性环状二核苷酸(CDN)消除，并消除纤维素分泌。由此消除了炎症和免疫抑制因素，通过改变的LPS酰化阻止TLR4识别，消除纤维素分泌及因此可能的生物膜形成，从而提高安全性和有效性。
如本文所述，细菌菌株例如鼠伤寒沙门氏菌菌株，其被工程化为腺苷营养缺陷型；并且通过修饰LPS和/或缺失鞭毛蛋白而降低其诱导促炎细胞因子的能力；和/或不表达L-天冬酰胺酶II以改善T细胞功能；和/或含有生物膜形成所需基因的缺失或破坏；和/或进一步修饰以在没有抗生素选择的情况下保持每个细胞显著的质粒拷贝数，至少低至中等拷贝数或更高；并且递送编码治疗产物的基因表达盒，促进强大的抗肿瘤免疫应答。所述质粒包括调节序列以促进编码的治疗产物分泌到肿瘤微环境中。
7.改良对补体的抗性
补体系统是抵御入侵病原体的第一道防线，这些病原体直接激活人体宿主中的凝集素途径或替代途径(AP)级联。补体系统涉及30多种可溶的和细胞膜结合蛋白，它们在先天免疫应答中发挥作用，以识别和杀死病原体，如细菌、病毒感染的细胞和寄生虫，并在抗体介导的免疫应答中发挥作用。补体级联的激活导致外来微生物的调理作用、趋化肽的释放，最后导致细菌细胞膜的破坏。补体系统中的三种同源糖蛋白C3、C4和C5在补体功能中起核心作用并与其它补体成分相互作用。分别由C3和C4产生的C3b和C4b是促进补体级联激活的转化酶的重要成分。C5的切割片段是C5a，其诱导吞噬细胞迁移到感染部位，和C5b，其启动膜攻击复合物的形成和细菌裂解(见例如Ramu et al.(2007)FEBS Letters 581:1716-1720)。
为了存活，病原体已形成策略来防止补体激活的有害后果。例如，外膜蛋白的Ail/Lom家族成员可以保护许多病原菌免受补体依赖性杀伤。Ail/Lom家族的成员，包括耶尔森氏菌(Yersinia)的Ail(附着侵入位点)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)，及包括沙门氏菌的Rck(补体杀伤抗性)和PagC，以及大肠杆菌的OmpX，这些家族成员是外膜蛋白，具有显著的氨基酸序列相似性和相同性，并具有相似的膜拓扑结构。虽然这个蛋白质家族的成员表现出不同的功能，但其中一些细菌，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)的Ail以及肠道沙门菌(S.enterica)的Rck，至少部分起到保护细菌免受补体介导的裂解的作用(见例如Bartra et al.(2008)Infection and Immunity76:612-622)。
另一种有助于避免或减轻补体的细菌产物是表面蛋白酶，在沙门氏菌中被称为PgtE(外膜丝氨酸蛋白酶)，以及omptin家族的其它成员。肠道沙门菌(S.enterica)的表面蛋白酶PgtE属于肠杆菌外膜天冬氨酸蛋白酶的omptin家族。PgtE和其它omptin需要粗糙型LPS才能激活，但会受到O抗原的空间抑制。pgtE的表达在沙门氏菌在巨噬细胞内的生长期间上调，并且从巨噬细胞释放的细菌表现出强力的PgtE介导的蛋白水解活性。PgtE蛋白水解激活哺乳动物血浆纤溶酶原为纤溶酶，使纤溶酶的主要生理抑制剂α2-抗纤溶酶失活，并介导细菌粘附到人细胞的细胞外基质。通过这种方式，PgtE介导细胞外基质成分的降解并产生强力的局部蛋白水解活性，这可以促进沙门氏菌穿过细胞外基质的迁移。PgtE还降解α-螺旋抗菌肽，这在沙门氏菌的细胞内生长期间可能很重要。鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)的omptin Pla是PgtE的密切直系同源物，并与PgtE共享功能。Pla切割C3，PgtE通过切割补体成分C3b、C4b和C5增加沙门氏菌的血清抗性。来自其它细菌物种的基因pgtE及其直系同源物可以包括在本文的免疫刺激细菌中以增加对补体的抗性。
本文示出，人血清中补体的作用解释了治疗性免疫刺激细菌例如沙门氏菌菌株VNP20009的失败，所述细菌已被证明在啮齿动物模型中有效地定植肿瘤。VNP20009的全身施用导致小鼠肿瘤定植(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002；和Bermudes et al.(2001)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18:219-33)；而在人患者中全身施用VNP20009导致非常少的定植。在晚期黑色素瘤患者的1期研究中，在30分钟静脉输注后，在人肿瘤中检测到非常少的VNP20009(见Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20:142-52)。进入评估更长的4小时输注VNP20009的随访研究的患者，在肿瘤活检后也表现出缺乏可检测的VNP20009(见Heimann et al.(2003)J.Immunother.26:179-180)。在瘤内施用药后，检测到VNP20009衍生物的定殖(见Nemunaitis et al.(2003)Cancer Gene Ther.10:737-744)。将VNP20009直接在肿瘤内施用于人肿瘤会导致更高的肿瘤定植，这表明人肿瘤可以在高水平上定植，并且小鼠和人之间的肿瘤定植差异仅在全身施用后才会出现。
本文示出并描述了虽然以前不知道在野生型鼠伤寒沙门氏菌中出现，但VNP20009被人补体失活，这解释了在全身施用VNP20009后在人体中观察到的低肿瘤定植的原因。本文提供的菌株表现出对补体的抗性。其可以被修饰为表达Rck和其它参与介导补体抗性或避性的蛋白质，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的Ail或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的PgtE，或者如果其天然表达这种蛋白质，则将其可以修饰为过表达Rck和/或其它这种蛋白质。Rck可以被引入缺乏同源物的细菌例如大肠杆菌中。
Rck表达
Rck(补体杀伤抗性)是一种17kDa的外膜蛋白，由沙门氏菌如肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌的较大毒力质粒编码，可诱导上皮细胞粘附和侵袭。已示出Rck蛋白通过抑制C9聚合和随后组装功能性膜攻击复合物来保护肠炎沙门氏菌免于补体破坏。与野生型菌株相比，rck突变体的上皮细胞侵袭减少了2-3倍，而野生型中的rck过表达导致侵袭增加。Rck蛋白通过受体介导的过程诱导细胞进入，促进局部肌动蛋白重塑，以及微弱和紧密粘附的膜延伸。因此，沙门氏菌可以通过两种不同的机制进入细胞：由T3SS-1复合物介导的触发机制和由rck诱导的拉链机制(见例如Manon et al.(2012),Salmonella,Chapter 17,eds.Annous and Gurtler,Rijeka,pp.339-364)。rck在沙门氏菌毒力质粒上的表达通过阻止膜攻击复合物的形成，赋予了对人补体中和的高水平抗性。当含有rck的鼠伤寒沙门氏菌毒力质粒在对血清高度敏感的大肠杆菌菌株中表达时，Rck能够恢复补体抗性。
本文提供的免疫刺激细菌保留或提供有Rck以赋予对人补体的抗性。本文示出，免疫刺激细菌例如大肠杆菌，可以通过在细菌中的质粒上编码rck进行修饰，从而赋予对补体的抗性。本文提供的免疫刺激细菌内源地编码rck，或者可以被修饰以编码其以增加对补体的抗性。还提供了赋予补体抗性的方法。例如，美国专利申请公开号2018/0325963和2018/0273956以及美国专利号9,889,164和9,688,967中描述的治疗性大肠杆菌物种可以通过修饰其中的细菌而被改良，例如通过引入在质粒上编码沙门氏菌rck基因的核酸，从而提高或提供对补体的抗性。可以全身施用对补体有抗性的细菌，并且足够的细菌可以存活以产生治疗效果。
将编码沙门氏菌rck基因的核酸引入细菌，例如治疗性大肠杆菌，从而赋予或增加补体抗性。
来自其它细菌物种的rck的其它直系同源物和同源物，同样可以在免疫刺激细菌中表达。例如，Ail是来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的Rck同源物，其增强异源表达下的补体抗性。PgtE是一种鼠伤寒沙门氏菌表面蛋白酶，其也已示出在异源表达下增强补体抗性。
8.缺失脂蛋白在沙门氏菌和其它革兰氏阴性菌中表达所需的基因
LPS和Braun(胞壁质)脂蛋白(Lpp)是革兰氏阴性肠道细菌外膜的主要成分，可作为炎症和免疫应答的强力刺激物。Braun(胞壁质)脂蛋白(Lpp)是鼠伤寒沙门氏菌外膜最丰富的成分之一，并导致TLR2诱导促炎细胞因子，例如TNFα、IL-6和IL-8(在人体中)。位于沙门氏菌细菌染色体上的脂蛋白基因的两个功能拷贝(lppA(SEQ ID NO:387)和lppB(SEQ IDNO:388))促成细菌毒力。lppA和lppB基因的缺失以及脂蛋白表达的消除，会降低毒力并减少促炎细胞因子的产生(见例如Sha et al.(2004)Infect.Immun.72(7):3987-4003；Fadlet al.(2005)Infect.Immun.73(2):1081-1096)。预计Lpp基因的缺失会减少细胞感染，从而减少质粒递送和编码的治疗产物或蛋白质的表达。然而，如下面的实施例18所示，虽然这些基因的缺失确实减少了肿瘤定植，但递送至靶细胞、肿瘤驻留免疫细胞、特别是巨噬细胞的质粒量显著增加。如本文所示，这些基因(lppA和lppB)的缺失或破坏因此导致由于无法在受感染的巨噬细胞中存活而降低的毒力，但导致免疫刺激细菌的质粒递送增强，从而增加编码的治疗基因在靶细胞即肿瘤驻留免疫细胞、特别是巨噬细胞中的表达。
本文提供的菌株是ΔFLG(缺乏鞭毛)，和/或ΔpagP，和/或ΔansB，和/或ΔcsgD。此外，所述菌株是ΔpurI(ΔpurM)、ΔmsbB和Δasd(在细菌基因组中)中的一种或多种。示例的菌株是ΔpurI(ΔpurM)、ΔmsbB、ΔpagP和ΔansB和Δasd，或ΔThyA代替Δasd。所述菌株也可以是lppA-和/或lppB-，特别是lppA-/lppB-。质粒被修饰以在宿主识别的启动子(例如真核启动子，如RNA聚合酶II启动子，包括来自真核生物和动物病毒的启动子)控制下编码治疗产物。所述质粒可以编码asd以允许细菌在体内复制，并且可以编码具有其它有益功能的核酸(例如CpG)，并且可以编码基因产物，如本文其它地方所述。
可以修饰本文提供的免疫刺激细菌以消除感染上皮细胞的能力，例如通过消除鞭毛实现。如本文别处所述，消除感染上皮细胞的能力也可以通过失活SPI-1依赖性侵入、通过失活或敲除参与SPI-1途径的一种或多种基因来实现。这些基因包括但不限于以下中的一种或多种：avrA，hilA，hilD，invA，invB，invC，invE，invF，invG，invH，invI，invJ，iacP，iagB，spaO，spaP，spaQ，spaR，spaS，orgA，orgB，orgC，prgH，prgI，prgJ，prgK，sicA，sicP，sipA，sipB，sipC，sipD，sirC，sopB，sopD，sopE，sopE2，sprB，和sptP。另外或或者，所述免疫刺激细菌可含有基因敲除或缺失以失活参与SPI-1非依赖性感染/侵入的产物，例如基因fljB、fliC、rck、pagN、hlyE、pefI、srgD、srgA、srgB和srgC中的一种或多种，和/或免疫刺激细菌可以含有敲除或缺失以失活诱导肿瘤驻留免疫细胞的细胞死亡的基因产物，例如编码被炎性体直接识别的蛋白质的基因，包括fljB、fliC、prgI(针状蛋白)和prgJ(杆状蛋白)。然而，rck基因是可取的，因为其免受补体失活作用。不内源性编码rck的细菌可以被修饰以编码异源rck基因。
所述免疫刺激细菌来源于合适的细菌菌株。细菌菌株可以是减毒菌株，或通过标准方法减毒的菌株，或通过本文提供的修饰而减毒的菌株，其定殖能力主要限于免疫豁免组织和器官，特别是肿瘤驻留免疫细胞，TME和肿瘤细胞，包括实体瘤。细菌包括但不限于例如如下菌株：沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，李斯特菌属(Listeria)，大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌属(Bifidobacteriae)。例如，细菌物种包括：宋内志贺菌(Shigella sonnei)，弗氏志贺菌(Shigella flexneri)，痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。其它合适的细菌物种包括：立克次体属(Rickettsia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，博德特氏菌属(Bordetella)，奈瑟菌属(Neisseria)，气单胞菌属(Aeromonas)，弗朗西斯氏菌属(Francisella)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，衣原体属(Chlamydia)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，布鲁氏菌属(Brucella)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，支原体属(Mycoplasma)，军团菌属(Legionella)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，螺杆菌属(Helicobacter)，弧菌属(Vibrio)，芽孢杆菌属(Bacillus)，和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)。例如立克次氏体立克次体(Rickettsia rickettsiae)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)，恙虫立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)，莫塞氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)，西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)，支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，嗜泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila)，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)，假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，马红球菌(Rhodococcus equi)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，小肠结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)，五日热罗卡利马氏体菌(Rochalimaea quintana)或根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)。
本文提供的免疫刺激细菌的示例是沙门氏菌属。如本文所述修饰的细菌的示例是沙门氏菌的野生型菌株，例如具有保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中登录号#14028的菌株的所有鉴别特征的菌株。工程化的鼠伤寒沙门氏菌菌株，例如菌株YS1646(ATCC目录#202165，也称为VNP20009；也参见国际PCT申请公开号WO99/13053)，用质粒进行工程化以补充asd基因敲除和允许无抗生素质粒维持。然后对菌株进行修饰以缺失鞭毛蛋白基因，和/或缺失pagP。鞭毛敲除和pagP缺失的组合使菌株对人血清补体具有高度抗性。这些菌株也被赋予嘌呤营养缺陷型，特别是腺苷，并且是asd-和msbB-。例如，purI和msbB被完全缺失的菌株比VNP20009菌株更适合(生长更快)，VNP20009中这些基因没有被缺失，而是被修饰以消除表达。可以在质粒上提供asd基因，用于在真核宿主体内复制。所述菌株还在ansB基因中进行了修饰，例如缺失、破坏或其它修饰，从而阻止其产生免疫抑制性L-天冬酰胺酶II，并改善肿瘤T细胞功能。所述菌株还经过修饰以消除生物膜的产生，例如通过csgD缺失实现，这使其无法产生卷曲菌毛、纤维素和c-di-GMP，从而减少不需要的炎症反应，并阻止其形成生物膜。
这些基因组缺失和质粒在本文别处描述和举例说明。编码治疗产物如免疫刺激蛋白和其它产物的任何核酸，在本文别处描述和/或本领域技术人员已知，可以包括在质粒上。如本文别处所述，质粒通常以低至中等拷贝数存在。治疗产物包括胞质DNA/RNA传感器的功能获得性突变体，其可以组成型引起/诱导I型IFN表达，以及包括其它免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子和共刺激分子，其促进肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答，以及包括本文所述的其它这种产物。质粒还可以编码抗体及其片段，例如单链抗体，其靶向免疫检查点和其它癌症靶标，例如VEGF、IL-6和TGF-β，以及其它分子，例如双特异性T细胞衔接器，或质粒还可以编码IL-6结合诱饵受体、TGF-β结合诱饵受体和TGF-β多肽拮抗剂。
9.强力的免疫刺激细菌，其基因组经过修饰以针对抗肿瘤治疗进行优化，并编码治疗产物，包括多种治疗产物
如本文所述，细菌菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌菌株，被工程化为腺苷营养缺陷型，并且通过修饰LPS和/或缺失鞭毛蛋白而降低其诱导促炎细胞因子的能力，和/或通过缺失或消除L-天冬酰胺酶II表达进行修饰以改善T细胞功能，和/或通过缺失或破坏生物膜形成所需的基因进行修饰，和/或由于rck表达增加而表现出增强的人血清存活力，所述细菌菌株被进一步修饰以递送治疗产物，例如免疫调节蛋白，并促进强力的抗肿瘤免疫应答。
下表总结了参考沙门氏菌基因的细菌的基因型/修饰，并理解在其它细菌物种的对应基因可以被修饰，其功能效果以及在此取得的一些效果/益处。
10.递送RNA(包括mRNA和其它形式的RNA)以便在真核宿主中表达的疫苗和细菌
作为RNA递送载体的免疫刺激细菌
提供了包含或表达编码的异源RNA的免疫刺激细菌，其中细菌感染真核宿主细胞，并将编码的RNA释放到宿主细胞的细胞质中(参见例如美国专利号7,390,646)。所述RNA可以是治疗产物，或者RNA由宿主细胞装置翻译成治疗产物。此类产物包括免疫刺激蛋白和来自病原体的抗原和/或肿瘤抗原，其可以在细胞例如吞噬细胞中表达，用于呈递以诱导免疫应答，包括T细胞应答、记忆T细胞和抗体。对于免疫，可以将细菌施用于该部位或通过与病原体的天然存在途径相同的途径施用，例如对于呼吸道病毒通过吸入或经鼻施用，对于胃和肠道病原体通过口服施用，对于病毒通过肌肉内施用，例如病毒，以及全身施用途径。这样可以导致原位免疫应答，从而提供终生免疫力。
可以修饰本文提供的任何免疫刺激细菌，使得细菌在体外细菌细胞内产生外源或异源RNA，例如在体外细胞培养期间、或在细菌细胞进入宿主真核细胞后，或在体外细胞培养期间以及细菌细胞进入宿主真核细胞后这两个阶段。在感染真核宿主细胞后，所述细菌将外源RNA释放到宿主细胞的细胞质中。RNA可以在细菌的质粒上编码，并且可以编码多种治疗产物。特别是，递送的RNA形式是任何可以由真核细胞装置翻译的形式。这包括mRNA、长链非编码RNA、RNAi、dsRNA、环状RNA(eRNA；参见例如美国专利号10,953,033)。
提供了含有或表达编码的异源RNA的免疫刺激细菌和基因组修饰的细菌，其中当细菌感染真核宿主细胞时，编码的RNA例如mRNA被释放到宿主细胞的细胞质中。所述细菌包括本文提供的任何免疫刺激细菌，特别是那些包括基因组修饰的细菌，由此其具有降低的TLR2、TLR4和TLR5信号传导。所述细菌还可以编码一种或多种治疗产物，特别是编码免疫刺激蛋白，包括细胞因子和STING蛋白，包括本文提供的修饰的STING蛋白，如果RNA编码用于疫苗接种或用于免疫刺激是有利的治疗的抗原或蛋白，则其可以充当佐剂。
编码RNA的核酸被修饰，使其在细菌中转录，但不翻译。这可以通过设计核酸使转录的RNA产物不被原核核糖体识别或不能翻译来实现。所述编码核酸进一步被设计成使得转录物被真核核糖体识别和翻译，所述核糖体例如存在于宿主如人中的核糖体。这可以通过例如包括编码不被原核核糖体识别但被真核核糖体识别的内部核糖体进入位点(IRES)的核酸来实现。编码的RNA通常是mRNA，但可以是其它形式的RNA，可以被翻译为治疗产物或免疫抗原或蛋白质。其它形式的RNA包括但不限于eRNA，其是环状RNA。eRNA是一种环状多核糖核苷酸，其：(a)含有编码多肽例如抗原的表达序列；(b)包含一个不被原核核糖体识别的内部核糖体进入位点(IRES)和一个终止元件；及(c)缺少poly-A序列、游离3’端和RNA聚合酶识别基序(参见例如描述此类环状RNA的美国专利第10,953,033号)。对细菌进行修饰，使转录的RNA在体内环化。
所述RNA可以是治疗产物，或者所述RNA由宿主细胞装置翻译成治疗产物。所述RNA可以编码抗原，由此当递送到宿主细胞中时被编码成蛋白质，以免疫宿主抵抗抗原和抗原来源的病原体或肿瘤。可以修饰核酸，从而修饰编码的抗原以改善其免疫性质，例如通过稳定抗体和其它适应性免疫应答所针对的抗原构象。例如，对于冠状病毒上的刺突蛋白已经如此操作，因此与宿主细胞受体结合的构象得到稳定，从而产生更强大的抗体应答。
可以修饰本文提供的任何免疫刺激细菌，使得细菌在体外细菌细胞内产生外源或异源RNA，例如在体外细胞培养期间，或在细菌细胞进入宿主真核细胞后，或在体外细胞培养期间和细菌细胞进入宿主真核细胞后这两个期间。在感染真核宿主细胞后，细菌将外源RNA释放到宿主细胞的细胞质中。所述RNA可以在细菌的质粒上编码，并且可以编码多种治疗产物。
编码RNA的核酸可操作地连接到细菌识别的启动子，或者细菌被修饰以编码识别启动子的RNA聚合酶，例如细菌启动子，或噬菌体T7 RNA聚合酶识别的噬菌体启动子。所述RNA可以是mRNA，或其它含有在真核宿主细胞中表达的调节序列的RNA分子。所述启动子可以是诱导型启动子。所述细菌可含有多个拷贝的编码的RNA，当引入真核宿主例如人中时，其会被释放到宿主细胞的细胞质中，如果是mRNA，则可在其中进行翻译。细菌转录与细菌翻译脱离，因此基因产物被转录，但不被翻译。在一些实施方案中，编码RNA的核酸不包括IRES序列，而是在起始密码子上游缺少Shine-Dalgamo(SD)序列，由此RNA不能被细菌或古细菌核糖体翻译，但可以被真核生物翻译核糖体。所述RNA可以含有序列，例如Kozak序列，其具有真核核糖体识别的起始密码子。Shine-Dalgamo序列包括，例如SEQ ID NO：389-392：
(1)
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(2)
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(3)
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(4)
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Shine-Dalgarno
(见例如，parts.igem.org/File：RBSAlignedSpacing.png)。所述RNA还可以含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)，其阻断或抑制原核核糖体的翻译。因此，RNA是在感染或已经感染骨髓细胞的细菌中产生的，从而将RNA递送到骨髓细胞，在那里，如果其是mRNA则在骨髓细胞中翻译，骨髓细胞由于Shine-Dalgamo序列、或IRES、或其它此类调节序列而识别所述RNA进行翻译。例如，在启动子和基因序列之间插入IRES，使转录与翻译脱离。因此，所述免疫刺激细菌充当RNA递送系统。
在实施方案中，细菌系统，例如本文提供的免疫刺激细菌，用于将遗传有效载荷递送至组织驻留和/或肿瘤驻留的骨髓细胞。在这种情况下，所述细菌是在体内给药；例如，所述细菌是asd-，并且不包括含有互补asd基因盒的质粒，因此其无法在体内复制。为了使所述细菌生长，将其在体外培养；将二氨基庚二酸(DAP)添加到培养基中以促进细菌在缺乏功能性asd基因的情况下进行复制。在这种情况下，当施用此类免疫刺激性细菌时，将一丸核酸递送至组织驻留或肿瘤驻留的骨髓细胞。在细菌被吞噬和在细胞内破坏后，编码治疗产物的RNA被释放到骨髓细胞的细胞质中进行翻译，从而当受感染的细胞是肿瘤驻留的骨髓细胞时，产生从骨髓细胞分泌到周围环境例如肿瘤微环境中的治疗产物。
体外培养的细菌编码RNA，但缺乏翻译RNA所需的信号/调节序列，例如Shine-Dalgarno序列，或者编码核酸含有阻断或不供原核核糖体翻译但被真核核糖体识别的序列，例如IRES，因此细菌产生但不翻译mRNA。如本文所述修饰的细菌，使其感染或积累在组织驻留或肿瘤驻留免疫细胞中，特别是组织驻留或肿瘤驻留骨髓细胞，将RNA递送至骨髓细胞，在那里其被翻译。可以递送任何RNA，包括编码抗原的RNA，例如来自病原体或肿瘤，和/或编码抗病毒治疗剂的RNA，所述治疗剂在原核启动子的控制下表达。对于此类应用，所述质粒可以以较高的拷贝数存在(例如，150个拷贝或更多，例如200、300、400、500或更多拷贝，例如500至700个拷贝)，以便大量的RNA产生并递送到骨髓细胞。
此外，如本文所述和示例以及上文所讨论的，可以制备编码和调节序列以在细菌中产生RNA，但是编码核酸包括抑制或阻止细菌核糖体翻译的调节序列，但其被真核宿主核糖体识别和/或增强、促进或允许真核宿主核糖体翻译。例如，mRNA在原核启动子的控制下转录。转录物中包括一个IRES序列，其阻断在原核细菌中翻译，但当递送到真核宿主细胞时，允许真核核糖体翻译。因此，所述细菌提供了不稳定的mRNA递送系统。可以使所述细菌大量生长，然后可以将其冻干或冷冻和/或在室温下储存。可以将其制成片剂或粉剂，也可以微粉化以供吸入。
所述细菌包括那些含有基因组修饰的细菌，从而与没有基因组修饰的细菌相比，toll样受体(TLR)2、4和5的应答减少。这些细菌任选可以另外含有基因组修饰，使得其对于所需的营养素或因子是营养缺陷型的，因此其不能在真核宿主中复制，但在提供营养素或因子时可以在体外复制。这些包括腺苷生物合成的缺陷，当用于治疗患有肿瘤和腺苷积聚的肿瘤微环境的癌症受试者时，具有降低免疫抑制的额外优势。其它缺陷包括胸腺嘧啶合成缺陷，如thyA-，已在上文部分描述和讨论，并在下文举例说明。
所述细菌含有含编码产物的核酸的质粒，或包含编码产物的RNA。所述质粒可以低、中或高拷贝数存在。当用于递送RNA时，质粒可以以高拷贝数存在，例如150个拷贝或更多。由核酸或RNA编码的产物是来自致病病毒、细菌、寄生虫的抗原序列，或者是肿瘤抗原，由此在宿主中表达编码的抗原后，宿主产生免疫保护应答或针对所述致病病毒、细菌或寄生虫或针对肿瘤抗原的免疫应答，或者所述产物是要递送给宿主的治疗产物。抗原序列的表达处于原核启动子的控制之下，因此编码所述抗原的RNA在细菌中产生，并且对于RNA递送，编码抗原的核酸包含抑制或阻止细菌核糖体翻译编码的RNA、但不抑制或阻止真核宿主核糖体翻译编码的RNA的调节序列，从而使细菌中翻译与转录脱离。凭借基因组修饰，当将所得细菌施用于真核生物受试者时，所得细菌对感染吞噬细胞具有选择性，并将核酸递送至吞噬细胞，在其中RNA被翻译。
特别感兴趣的是本文提供的免疫刺激细菌，其被修饰以使得其感染吞噬细胞，例如巨噬细胞。特别地，所述细菌可以是任何合适的物种/属，例如沙门氏菌属、李斯特氏菌属和大肠杆菌，其被如此修饰以使得其被一种或多种或全部修饰以产生具有五酰化脂质A的LPS，修饰为缺少鞭毛，及修饰为缺少卷曲菌毛；例如所述细菌是msbB-/pagP-、鞭毛蛋白-和csgD-(通过在特定物种中对每个编码基因或等效基因进行修饰，因此不会产生产物，或者即使产生也无活性)。所述细菌也被修饰，例如通过使其成为asd-，以便其可以通过提供适当的营养素如DAP而在体外生长，但其不会在真核宿主中复制，并最终在mRNA被递送至真核细胞中时死亡。所述细菌还可以编码额外的有效载荷，如本文所述，例如修饰的STING蛋白和/或细胞因子(所有均如本文别处所述和所列)，其用于刺激宿主免疫系统，从而充当佐剂。此类产物可以在细菌的质粒上编码，并且可以在具有编码抗原的mRNA的多顺反子构建体上编码，和/或可以在真核启动子的控制下编码以用于转录/翻译成蛋白质，如本公开全文所述。这些蛋白质可以被设计用于转录，或者适当地进行修饰，以便其被膜锚定以用于呈递。可以修饰免疫刺激细菌例如大肠杆菌，使其编码和表达rck以增加对补体的抗性。
11.针对特定抗原的细菌疫苗，包括来自病原体和肿瘤的抗原，用作抗病原体治疗和疫苗，以及抗癌治疗和/或预防。
疫苗可用于预防(降低风险)感染疾病或发生病症或癌症，或用于治疗疾病、病症或癌症，以及其组合。本文提供的免疫刺激细菌和其它疫苗可用于这些目的。
由于抗肿瘤应答和抗病毒应答之间免疫应答的相似性，本文提供的免疫刺激细菌也可用于治疗感染性疾病。所述细菌可以编码抗病毒或抗细菌治疗剂，例如病毒或细菌产物的抑制剂，或病毒或细菌产物表达的抑制剂，或病毒或细菌抗原。来自免疫刺激细菌和治疗性抗病原体产物的免疫应答，以及对免疫刺激蛋白和编码的免疫刺激蛋白的免疫应答的组合提供了用于疫苗接种和/或治疗感染性疾病、特别是病毒感染相关疾病如慢性病毒感染和潜伏病毒感染的治疗性免疫刺激细菌。感兴趣的是慢性病毒感染，例如肝炎病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、Epstein-Barr病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、麻疹病毒和其它长期感染受试者的此类病毒的感染。所述免疫刺激细菌也可用于治疗急性感染，例如慢性流感和冠状病毒的初始感染，例如严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)、和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2，导致COVID-19)。所述免疫刺激细菌可以编码来自病原体的抗原，例如病毒抗原，并用作预防感染或治疗现有感染的疫苗。免疫刺激细菌凭借其在免疫细胞(如抗原呈递细胞，如T细胞)中积累的能力，可以促进T细胞对病毒的应答。例如，本文提供的免疫刺激性细菌是天冬酰胺酶II缺陷的，其可增强T细胞的功能，从而促进抗病毒应答。病毒抗原的表达组合，例如来自必需病毒蛋白的抗原，例如在冠状病毒的情况下是来自核衣壳蛋白、M蛋白和/或S蛋白的抗原，这可以产生中和抗体以及增强长寿命循环和组织驻留的CD8+T细胞，并提供有效的疫苗和治疗。
现有疫苗的功效，例如灭活疫苗或减毒疫苗，例如用于结核病(TB)的卡介苗(BCG)疫苗，可以通过修饰基因组使天冬酰胺酶不表达，从而消除免疫抑制来提高。BCG疫苗的效力通常会降低。这是由于疫苗细菌分泌的天冬酰胺酶降低T细胞活性，从而起具有疫抑制作用。这可以通过修饰细菌以降低或消除天冬酰胺酶活性来缓解。如本文其它地方所讨论的，减少或消除TLR2或TLR2/4/5对细菌的应答的其它修饰消除了TLR2、或TLR4、或TLR5或其它toll样受体对细菌的活性或应答对I型IFN的任何阻断或抑制。如本文所述，TLRs对细菌的应答可以阻断或抑制I型IFN；通过消除这些TLR的应答对本文的细菌进行修饰消除了这种不良影响。
如上节所述，免疫刺激细菌可以编码抗病毒治疗剂或抗菌治疗剂，或用于免疫的抗原。此类治疗剂包括病毒基因和蛋白质的抑制剂，例如复制和/或包装所需的蛋白质，或者免疫刺激性细菌可以编码一种治疗剂，以防止病毒与受体结合或相互作用，促进或供病毒进入靶细胞。在一些实施方案中，治疗性蛋白质可处于原核启动子的控制之下。如上一节所述，细菌可以是递送RNA的那些细菌。
如上所述，细菌可用于递送RNA，包括用于针对病原体(例如SARS-CoV、SARS-CoV-2、流感病毒和其它病原体)进行疫苗接种的mRNA，以及用于抗肿瘤治疗。细菌还可以编码免疫刺激剂或其它免疫系统增强剂，或免疫阻抑物的抑制剂，例如免疫检查点蛋白。这些的示例是STING蛋白，包括本文提供的修饰的STING蛋白、细胞因子和其它此类免疫刺激蛋白。本文所述的任何有效载荷，包括用于治疗肿瘤的组合有效载荷，也可以由细菌编码/递送。抗肿瘤应答和抗病毒应答相似。对于疫苗，免疫刺激有效载荷用作增强免疫应答的佐剂。编码病原体抗原的核酸在原核启动子控制下；其它有效载荷也可以作为具有编码病原体抗原的核酸的多顺反子构建体提供，或者其可以在真核启动子的控制下编码，如本文抗肿瘤治疗所述。
细菌，如本文提供的那些细菌，其将有效载荷递送至吞噬细胞，并且含有改善其递送性质的各种基因组修饰，可用于递送RNA。细菌是优于纳米颗粒和其它此类递送载体的运载体，因为RNA在细菌细胞质中运载并且含有刺激I型IFN的佐剂。本文提供的用于递送RNA的细菌的优点包括：1)其允许“没有RNA”的RNA递送，即细菌递送载体避免了对复杂的RNA稳定性/制造的需要；2)其导致直接靶向吞噬性抗原呈递细胞(APC)；3)其允许包含提供I型IFN佐剂活性的有效载荷；4)其含有基因组修饰，因此细菌不会在真核(如人类)宿主中复制，例如通过使内源性asd活性失活且不在质粒上编码来使细菌成为asd-；以及5)可以通过基因组修饰去除是不良佐剂的细菌产物，例如通过去除鞭毛、修饰LPS、降低或消除生物膜形成，以及消除天冬酰胺酶II的活性。这些细菌的示例是msbB-/pagP-和鞭毛蛋白-，以及任选ansB-和csgD-，完全(干净)缺失purI基因。作为载体的细菌也允许快速工程化和部署；细菌易于扩展且易于制造；单个细菌可以编码多种不同的RNA；且细菌是稳定的，它们可以在室温下储存，可以被冻干，并且它们可以被配制成用于鼻内递送或通过吸入递送，以及用于静脉内递送，并且可以被配制成其它合适的递送途径。保留一些TLR2活性会使内皮血管细胞渗漏，包括使细菌呈csgD-的基因组修饰也是如此。
为了将抗癌治疗产物递送至肿瘤/肿瘤微环境，可以将编码的产物与运输信号例如分泌信号可操作地连接。所述产物还可以设计为在细胞表面表达，例如肿瘤驻留的骨髓细胞和其它吞噬细胞的细胞表面。可以修饰基因产物，使其锚定在膜上。例如，IL-12已在本文中进行了修饰，因此它通过向C末端添加跨膜结构域来进行膜锚定。其它蛋白质，包括例如IL-2、IL-12、IL-12p35、IL-21、IL-15和FLT-3L，可以通过添加跨膜结构域或其它此类锚定结构域进行类似修饰，例如GPI锚。将此类蛋白质锚定在被细菌感染的细胞膜上可降低毒性，因此它们不会全身分泌，而是在肿瘤微环境中发挥作用。具体而言，编码此类产物及其组合的免疫刺激细菌是那些具有基因组修饰的细菌，例如导致细菌为msbB-/pagP-且不具有鞭毛的修饰，从而通过toll样受体(TLR)2、4和5的应答与没有基因组修饰的细菌相比降低。
12.M2表型巨噬细胞转化为M1和M1样表型巨噬细胞
如本文所述，本文提供的免疫刺激细菌在巨噬细胞中积累和/或靶向巨噬细胞。巨噬细胞是吞噬性免疫细胞；其在清除衰老和凋亡细胞、吞噬免疫相关复合物和病原体以及维持体内稳态方面发挥作用。巨噬细胞的表型和功能可以被微环境极化。有两种类型：M1型(经典活化巨噬细胞)和M2型(替代活化巨噬细胞)。
M1巨噬细胞的作用是分泌促炎细胞因子和趋化因子，并呈递抗原，从而参与正向免疫应答并发挥免疫监测器的作用。M1巨噬细胞产生促炎细胞因子，包括IL-6、IL-12和TNF-α。M2巨噬细胞分泌精氨酸酶1、IL-10、TGF-β和其它抗炎细胞因子，具有减轻炎症、促进肿瘤生长和免疫抑制功能。因此，对于癌症和其它这种疾病和病症的治疗，M1或M1样表型是有利的。
M2巨噬细胞可以转化为M1巨噬细胞或具有M1样表型的巨噬细胞。本文提供的免疫刺激细菌感染巨噬细胞，可将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型。M1巨噬细胞表型标志物包括CD80(也称为B7、B7.1或BB1)、CD86(也称为B7.2)、CD64(也称为高亲和性免疫球蛋白γFc受体I)、CD16和CD32(也称为低亲和性免疫球蛋白γFc受体IIb)。M1巨噬细胞中一氧化氮合酶(iNOS)的表达也可以作为表型标记。CD163和CD206是鉴定M2巨噬细胞的标志物。精氨酸酶1(Arg1)和DECTIN-1也是鉴定M2巨噬细胞的理想表型指征。因此，可以通过这些标志物和/或这种巨噬细胞表型特征性的其它标志物的表达来监测或评估转化。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)与免疫抑制M2表型相关。本文提供的免疫刺激细菌可以将这种巨噬细胞转化为M1或M1样表型。本文提供的编码导致I型干扰素(IFN)表达的治疗产物的免疫刺激细菌可以实现这种转化。这是本文提供的免疫刺激细菌独有的性质，并利用了细菌的能力，包括导致感染巨噬细胞的基因组修饰。编码的治疗产物包括是胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的那些产物，例如STING变体(本文详细描述)。在感染肿瘤驻留巨噬细胞和表达治疗产物后，编码免疫刺激细菌可实现感染的巨噬细胞向M1表型(或M1样表型)的转化。这种转化巨噬细胞表型的能力在下面的实施例12中得到证明和举例说明。通过本文提供的感染巨噬细胞并表达STING蛋白的免疫刺激细菌表达修饰的STING蛋白，将M1巨噬细胞的表型转化为M2巨噬细胞表型。
本文提供的免疫刺激细菌，包括如本文所述的基因组修饰，例如鞭毛的消除和LPS修饰，将感染的M2巨噬细胞转化为诱导M1巨噬细胞特征性的一些或全部细胞因子谱的那些细胞。表达STING蛋白变体的免疫刺激细菌会导致在人原代M2巨噬细胞中的组成型I型IFN表达，将这些细胞转化为M1样(具有M1巨噬细胞典型的表型标记和/或表达谱)I型IFN产生细胞。
D.编码在肿瘤微环境中刺激免疫应答的遗传有效载荷的具有增强的治疗指数的免疫刺激细菌
本文提供的免疫刺激细菌被修饰，使其在肿瘤微环境和肿瘤驻留骨髓细胞中积累，在此在真核启动子的控制下表达所述治疗产物。所述细菌编码治疗产物，特别是抗癌产物，包括刺激免疫系统和/或反转或减轻肿瘤免疫抑制作用的产物。如本文所述，细菌可以编码多种产物，其中每种产物的表达均在在单独的启动子的控制下，或者其在一个启动子的控制下，并且可以包括导致分立的产物表达的序列，并且在适当的情况下，包括调节序列以确保编码的产物分泌到肿瘤微环境中。所述免疫刺激细菌在质粒上表达编码的治疗产物。如本文所讨论的，质粒可以编码一种产物或多种产物。每个产物可以在不同的真核启动子的控制下，或者多个编码的产物可以在单个启动子的控制下表达，例如通过在编码部分之间包括2A自切割肽，例如T2A(SEQ ID NO:327)、P2A(SEQ ID NO:328)、E2A(SEQ ID NO:329)和F2A(SEQ ID NO:330)。编码的产物包括本文所述的那些，它们可以是活性互补的抗癌免疫刺激产物。本文提供的免疫刺激细菌允许组合施用多种免疫调节产物或有效载荷(多重有效载荷)，否则如果全身施用则毒性太大。多重有效载荷的示例包括一种或多种的细胞因子，刺激或诱导I型IFN表达的免疫刺激蛋白，例如具有增加的活性或组成型活性的STING或其变体，以及共刺激分子，例如工程化的4-1BBL共刺激分子。
本文提供的免疫刺激细菌具有强力的抗肿瘤作用，包括提供治愈，例如在用多重有效载荷或单一药剂有效载荷IV给药后。所述免疫刺激细菌在全身施用时浸润并富集在实体瘤、TME和肿瘤驻留骨髓细胞中，在此表达编码的治疗产物，然后局部递送至肿瘤微环境。在肿瘤驻留骨髓细胞消耗(吞噬作用)后，细菌递送遗传有效载荷编码质粒，该质粒允许以肿瘤特异性方式异位、单一或多重有效载荷表达。
1.免疫刺激性蛋白
可以修饰本文的免疫刺激细菌以编码促进、诱导或增强抗肿瘤应答的一或多种免疫刺激蛋白。如本文举例说明和描述的，编码核酸在质粒上排列的顺序可以提高整体表达，对质粒的修饰如完全缺失或失活基因可以提高含有编码蛋白质的质粒的细菌的适应性。
可以在真核启动子如被RNA聚合酶II识别的启动子的控制下，在细菌中的质粒上编码免疫刺激蛋白，以在真核受试者中表达，特别是在待施用免疫刺激细菌的受试者如人体中表达。除真核启动子外，编码免疫刺激蛋白的核酸还可包括其它用于在细胞中表达或运输(例如用于在细胞表面上分泌或表达)的调节信号。
免疫刺激蛋白是在适当的环境例如肿瘤微环境(TME)中可以促进或参与或增强施用了免疫刺激细菌的受试者的抗肿瘤应答的那些蛋白质。免疫刺激蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，例如但不限于：IL-2，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-36γ，GM-CSF，IFNα，IFNβ，与IL-2Ra减弱结合的IL-2，和被修饰以不结合IL-2Ra的IL-2；趋化因子，例如但不限于CCL3，CCL4，CCL5，CXCL9，CXCL10，和CXCL11；和/或共刺激分子，例如但不限于CD40，CD40L，OX40，OX40L，4-1BB，4-1BBL，具有截短或缺失的胞质结构域的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，TNF/TNFR超家族成员(例如CD27和CD27L)，以及B7-CD28家族成员(例如CD80，CD86，ICOS，和ICOS配体(B7RP1))。
本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可以促进、增强或以其它方式增加或引起抗肿瘤反应的其它这种免疫刺激蛋白，预期用于在本文提供的免疫刺激细菌中编码。例如，所述免疫刺激细菌可以递送编码截短的共刺激分子(例如，4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L)的遗传有效载荷，具有在APC表达的胞质结构域的完全或部分缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短的胞质结构域而无法向APC发出反调节信号。如本文中所述，例如4-1BBL的修饰的截短的胞质结构域含有特定的残基，以确保蛋白质结构域的正确方向，从而增加蛋白质的表达。共刺激分子的胞质结构域的缺失(完全或部分)和修饰增强了共刺激分子的活化，而没有免疫抑制反向信号传导。
a.细胞因子和趋化因子
在一些实施方案中，本文的免疫刺激细菌被工程化以表达刺激免疫系统的细胞因子，包括但不限于例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、和IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15Rα-IL-15sc)、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、与IL-2Ra减弱结合的IL-2、经修饰不结合IL-2Ra的IL-2、IFN-α和IFN-β。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌可以被工程化以表达趋化因子，例如CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。
IL-2
白细胞介素-2(IL-2)是第一个被批准用于治疗癌症的细胞因子，其通过几种机制参与免疫系统的激活，包括激活和促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生长，产生淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，促进调节T细胞(Treg)细胞生长和增殖，刺激肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，及促进T细胞、B细胞和NK细胞增殖和分化。重组IL-2(rIL-2)被FDA批准用于治疗转移的肾细胞癌(RCC)和转移的黑色素瘤(见例如Sheikhi et al.(2016)Iran J.Immunol.13(3):148-166)。
IL-7
IL-7是IL-2超家族的成员，参与T细胞的存活、增殖和体内稳态。IL-7受体中的突变已示出导致T细胞的丧失和严重联合免疫缺陷(SCID)的发展，突出了IL-7在T细胞发育中的关键作用。IL-7是一种稳态细胞因子，可为静息的初始和记忆T细胞提供连续信号，以及在淋巴细胞减少症期间积累，导致T细胞增殖和T细胞库集多样性增加。与IL-2相比，IL-7选择性地扩展CD8+T细胞而不是CD4+FOXP3+调节性T细胞。重组IL-7已示出在小鼠中增强接种疫苗和过继细胞疗法后的抗原特异性T细胞应答。IL-7还可以在造血干细胞移植化疗后促进T细胞恢复中发挥作用。晚期恶性肿瘤患者的早期临床实验表明，重组IL-7在生物活性剂量下具有良好的耐受性和有限的毒性(即其中循环CD4+和CD8+T细胞的数量增加了3至4倍)(见例如Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers3:3856-3893)。已示出IL-7对肿瘤例如胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌和胶质母细胞瘤具有抗肿瘤作用，并且在小鼠模型中体内施用IL-7导致癌细胞生长减少。IL-7还被证实增强IFN-γ在大鼠胶质瘤肿瘤中的抗肿瘤作用，并诱导单核细胞产生IL-1α、IL-1β和TNF-α，从而抑制黑色素瘤生长。此外，在治疗小儿肉瘤后施用重组IL-7导致促进免疫恢复(见例如Lin et al.(2017)AnticancerResearch 37:963-968)。
IL-12(IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35))
促进细胞介导的免疫性的生物活性IL-12(IL-12p70)是一种异源二聚体，由p35和p40亚基组成，而IL-12p40单体和同源二聚体则作为IL-12拮抗剂。IL-12由抗原呈递细胞分泌，促进NK细胞和T细胞分泌IFN-γ，抑制肿瘤血管生成，导致NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化和增殖，增强天然CD4+T细胞分化为Th1细胞，以及促进针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。IL-12在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和肉瘤的小鼠模型中已示出抗肿瘤作用(见例如Kalinski et al.(2001)Blood 97:3466-3469；Sheikhi et al.(2016)Iran J.Immunol.13(3):148-166；and Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
IL-15和IL-15:IL-15Rα(IL-15/IL-15Rα)
IL-15在结构上与IL-2相似，虽然IL-2和IL-15均为T细胞的增殖和活化提供早期刺激，但IL-15阻断IL-2诱导的细胞凋亡，这是导致消除刺激的T细胞及诱导T细胞耐受、限制记忆性T细胞应答及潜在限制单独的IL-2的治疗功效的过程。IL-15还支持记忆CD8+T细胞的持久性，以维持长期抗肿瘤免疫性，并通过以抗原非依赖性方式直接激活CD8+效应T细胞，在临床前小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性。除了CD8+T细胞外，IL-15负责效应子自然杀伤(NK)细胞的发育、增殖和激活(见例如Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893；and Han et al.(2011)Cytokine 56(3):804-810)。
Il-IL-15/IL-15Rα链复合物可以代替IL-15，因为在体内的稳定性比单体IL-15长，对免疫细胞的活性比IL-15高10-100倍。IL-15/IL-15Rα刺激NK细胞、γδ(gamma delta)T细胞和T细胞的成熟、增殖和抗凋亡维持；并促进活化T细胞(CTL)的存活和长寿的CD8+CD44hi T细胞记忆细胞的产生。在临床上，IL-15优于IL-2，因为它不结合位于免疫抑制性Tregs上的IL-2Rα，也不诱发活化诱导的细胞死亡(AICD)或广泛的毛细血管渗漏综合症。本文显示，由工程化的STING诱导的I型干扰素有协同作用，以增强CD8+细胞功能。存在协同作用，以增强骨髓细胞介导的T细胞募集和CD8+T细胞功能。它们协同作用，激活人树突状细胞(DCs)，诱导抗病毒的CD8+T细胞应答，从而诱导抗癌免疫力。本文显示，这种组合在动物模型中诱发了高治愈率。小鼠常位T细胞排除的肿瘤中具有强烈T细胞浸润，以及基质肿瘤相关巨噬细胞(TAM)屏障的破坏。观察到明显的T细胞和NK募集。
IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)由抗原呈递细胞(例如单核细胞和树突状细胞)协同表达，并且IL-15通过IL-15Rα反式呈递给在CD8+T细胞和NK细胞表面上表达的IL-15βγc受体复合物。可溶的IL-15:IL15-Rα(IL-15/IL-15Rα)复合物已示出通过IL-15βγc复合物调节免疫应答，以及示出将IL-15以预先形成的IL-15和可溶的IL-15Rα复合物施用，IL-15的生物活性增加50倍，其半衰期与单独施用IL-15相比更长。这种通过与IL-15Rα预缔合显著提高IL-15的治疗功效已在鼠肿瘤模型中证实(见例如Han et al.(2011)Cytokine 56(3):804-810)。
IL-18
IL-18通过NK和CD8+T细胞诱导IFN-γ分泌，增强其毒性。IL-18还激活巨噬细胞并刺激Th1辅助CD4+T细胞的发育。IL-18在一些临床前小鼠模型中已示出有希望的抗肿瘤活性。例如，施用重组IL-18(rIL-18)通过激活CD4+T细胞和/或NK细胞介导的应答，导致同源小鼠的黑色素瘤或肉瘤消退。其它研究表明，IL-18的抗肿瘤作用是由IFN-γ介导的，并涉及抗血管生成机制。IL-18与其它细胞因子(如IL-12)或共刺激分子如CD80的组合增强了IL-18介导的抗肿瘤作用。晚期实体瘤和淋巴瘤患者的I期临床实验表明施用IL-18是安全的，并且导致免疫调节活性和患者中血清IFN-γ和GM-CSF水平增加及适度的临床应答。临床实验表明，IL-18可以与其它抗癌治疗剂组合，如单克隆抗体、细胞毒性药物或疫苗(见例如Fabbi et al.(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675；and Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
已发现经工程化为表达IL-18的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株，在全身施用后在同源小鼠中抑制皮下(S.C.)的肿瘤或肺转移瘤的生长，而没有任何毒性作用。使用这种工程化细菌进行治疗诱导肿瘤中T细胞、NK细胞和粒细胞的累积，并导致细胞因子的瘤内产生(见例如Fabbi et al.(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675)。
趋化因子
趋化因子是小细胞因子家族，介导白细胞迁移到损伤或炎症区域，并参与介导免疫和炎症应答。根据半胱氨酸残基在其序列中的位置，趋化因子分为四个亚家族，即XC-、CC-、CXC-和CX3C-趋化因子配体，或XCL、CCL、CXCL和CX3CL。趋化因子配体与其同源受体结合并调节免疫细胞的循环、归巢和滞留，其中每个趋化因子配体-受体对选择性地调节某种类型的免疫细胞。不同的趋化因子吸引不同的白细胞群体，并在体内形成浓度梯度，其中被吸引的免疫细胞通过梯度向趋化因子浓度较高的方向移动(见例如Argyle D.andKitamura,T.(2018)Front.Immunol.9:2629；和Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335)。趋化因子可以通过增加免疫细胞对肿瘤的浸润，促进抗原呈递细胞(APC)向肿瘤引流淋巴结移动，引发天然T细胞和B细胞，从而改良抗肿瘤免疫应答(见例如Lechner etal.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340)。本文的免疫刺激细菌可以被工程化以编码趋化因子，包括但不限于CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11。
CCL3、CCL4、CCL5
CCL3、CCL4和CCL5具有高度的同源性，并在人和小鼠中的结合一些细胞类型包括未成熟DC和T细胞上的CCR5(CCL3、CCL4和CCL5)和CCR1(CCL3和CCL5)。已示出治疗性T细胞通过CCL3、CCL4和CCL5的肿瘤特异性分泌诱导先天免疫细胞趋化于肿瘤部位(见例如Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335)。
诱导T辅助细胞1型(Th1)应答可释放CCL3。小鼠体内和体外研究表明，CCL3对中性粒细胞和单核细胞均有趋化性；具体而言，CCL3可以介导骨髓前体细胞(MPC)从骨髓动员，并具有MPC调节和刺激作用。用CCL3转染的人卵巢癌细胞示出肿瘤内增强的T细胞浸润和巨噬细胞，导致改良的抗肿瘤应答，并表明CCL3介导的中性粒细胞趋化性抑制了肿瘤生长。被CCL3招募的用肿瘤抗原人黑色素瘤相关基因(MAGE)-1转染的DC在黑色素瘤小鼠模型中表现出优异的抗肿瘤作用，包括增加淋巴细胞增殖、细胞溶解能力、存活力和降低肿瘤生长。
CCL3与MAGE-1的抗原特异性平台的组合使用也已用于治疗胃癌。CT26是一种高免疫原性小鼠结肠肿瘤，其产生的CCL3减缓体内肿瘤生长；这个过程被表明是由自然杀伤(NK)细胞的CCL3依赖性累积驱动，并因此IFNγ导致CXCL9和CXLC10的产生(见例如Allenet al.(2017)Oncoimmunology 7(3):e1393598；and Schaller et al.(2017)ExpertRev.Clin.Immunol.13(11):1049-1060)。
CCL3已被用作治疗癌症的佐剂。在小鼠肝细胞癌射频消融后施用CCL3活性变体ECI301增加了肿瘤特异性应答，并且进一步表明这种机制依赖于CCR1的表达。也已经示出CCL3在全身性癌症中作为佐剂取得了成功，在白血病/淋巴瘤模型中接种CCL3和IL-2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的小鼠表现出存活率增加(见例如Schaller et al.(2017)Expert Rev.Clin.Immunol.13(11):1049-1060)。
CCL3和CCL4在指导CD8+T细胞浸润进黑色素瘤和结肠癌的原发肿瘤部位中发挥作用。CCL4的肿瘤产生导致CD103+DC的累积；通过WNT/β-连环蛋白依赖性途径抑制CCL4，阻止黑色素瘤肿瘤的CD103+DC浸润(见例如Spranger et al.(2015)Nature 523(7559):231-235)。在结肠癌小鼠模型中，CCL3还显示出增强CD4+和CD8+T细胞向原发肿瘤部位的浸润(见例如Allen et al.(2017)Oncoimmunology 7(3):e1393598)。
CCL3或CCL5与其受体(分别为CCR1和CCR5)的结合将未成熟的DC、单核细胞、记忆和T效应细胞从循环中移至炎症或感染部位。例如，在结肠直肠肿瘤中的CCL5表达有助于T淋巴细胞的趋化作用和存活。CCL3和CCL5已在几个临床前模型中单独使用或组合疗法中使用以诱导肿瘤消退和免疫性。例如，研究表明，皮下注射经遗传修饰为表达CCL3的中国仓鼠卵巢细胞，导致肿瘤抑制和中性粒细胞浸润。在另一项研究中，重组溶瘤腺病毒表达CCL5(Ad-RANTES-E1A)在乳腺癌小鼠模型中导致原发肿瘤消退并阻止转移(见例如Lechner etal.(2011)Immunotherapy3(11):1317-1340)。
在结肠直肠癌的转化研究中，CCL5在巨噬细胞中诱导“抗病毒应答模式”。作为CXCR3介导的淋巴细胞在结直肠癌肝转移浸润边缘迁移的结果，产生了CCL5。阻断CCR5(CCL5受体)导致肿瘤死亡，这是由产生IFN的巨噬细胞和活性氧驱动的。虽然巨噬细胞存在于肿瘤微环境中，但CCR5抑制诱导从M2至M1的表型转变。CCR5阻断还导致结直肠癌患者的临床反应(见例如Halama et al.(2016)Cancer Cell 29(4):587-601)。
CCL3、CCL4和CCL5可用于治疗包括淋巴肿瘤、膀胱癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或肝癌的病症(见例如美国专利公开号US2015/0232880；国际专利公开号WO 2015/059303、WO 2017/043815、WO 2017/156349和WO 2018/191654)。
CXCL9、CXCL10、CXCL11
CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)和CXCL11(ITAC)由IFN-γ的产生而诱导。这些趋化因子结合CXCR3，优先在活化的T细胞上表达，并在血管生成抑制和白细胞的募集和活化中起作用。结直肠癌的预后与肿瘤浸润性T细胞密切相关，尤其是Th1和CD8+效应T细胞；CXCL9、CXCL10和CXCL11的高肿瘤内表达表明预后良好。例如，在163名结肠癌患者的样本中，具有高水平CXCL9或CXCL11的患者显示术后生存率增加，而CXC高表达患者的CD3+T细胞、CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞数量显著增加。在结直肠癌患者的肝转移中，CXCL9和CXCL10水平在浸润边缘增加，并且与效应T细胞密度相关。通过CXCL9和CXCL10对CXCR3的作用刺激淋巴细胞迁移导致在浸润边缘产生CCL5(见例如Halama et al.(2016)Cancer Cell 29(4):587-601；和Kistner et al.(2017)Oncotarget 8(52):89998-90012)。
在体内，CXCL9对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、活化的外周血淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞和Th1淋巴细胞起到化学引诱物的作用。CXCL9对于T细胞介导的皮肤肿瘤抑制也至关重要。例如，当与全身性IL-2组合时，CXCL9已被证实可通过增加CXCR3+单核细胞的肿瘤内浸润来抑制肿瘤生长。在结肠癌的小鼠模型中，huKS1/4-IL-2融合蛋白与CXCL9基因疗法的组合通过CD8+和CD4+T淋巴细胞的化学吸引和激活获得了优异的抗肿瘤效果和延长寿命(见例如Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335；和Ruehlmann et al.(2001)Cancer Res.61(23):8498-8503)。
CXCL10由活化的单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞产生，对活化的T细胞具有趋化性，并可作为体内血管生成的抑制剂。CXCL10在结直肠肿瘤中的表达已示出有助于细胞毒性T淋巴细胞的趋化作用和更长的生存期。已示出施用免疫刺激细胞因子如IL-12增强CXCL10产生的抗肿瘤作用。用肿瘤细胞裂解物引发及用CXCL10转染的树突状细胞(DC)疫苗在小鼠中具有增强的免疫保护作用和有效性；所述动物表现出对肿瘤挑战的抵抗力、肿瘤生长减慢和更长的存活时间。与未用融合蛋白治疗的肿瘤相比，使用CXCL10-粘蛋白-GPI融合蛋白在小鼠中进行的体内和体外研究导致肿瘤具有更高水平的募集的NK细胞。干扰素(可由浆细胞样树突状细胞产生；这些细胞与原发性黑色素瘤病变相关，以及可以被CCL20募集到肿瘤部位)可以作用于肿瘤DC亚群，例如CD103+DC，已示出在小鼠黑色素瘤模型中产生CXCL9/10，及在人疾病中与CXCL9/10相关。相对于原发性黑色素瘤样品，CXCL10在人转移性黑色素瘤样品中也显示出更高的表达。在治疗上，辅助IFN-α黑色素瘤疗法上调CXCL10的产生，而化学治疗剂顺铂诱导CXCL9和CXCL10(见例如Dubinett et al.(2010)Cancer J.16(4):325-335；Kuo et al.(2018)Front.Med.(Lausanne)5:271；Li etal.(2007)Scand.J.Immunol.65(1):8-13；和Muenchmeier et al.(2013)PLoS One 8(8):e72749).
已经确定CXCL10/11和CXCR3在源自基底细胞癌(BCC)的人角质形成细胞中表达。CXCL11在人基底细胞癌中还能促进免疫抑制性吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达以及增强角质形成细胞的增殖，这可以降低任何浸润性CXCR3+效应T细胞的抗肿瘤活性(见例如Kuoet al.(2018)Front.Med.(Lausanne)5:271)。
CXCL9、CXCL10和CXCL11可以在溶瘤病毒中编码以治疗癌症(见例如美国专利公开号US 2015/0232880；国际专利公开号WO 2015/059303)。假型溶瘤病毒或编码CXCL10基因的遗传工程化细菌可用于治疗癌症(见例如国际申请公开号WO 2018/006005和WO 2018/129404)。
b.共刺激分子
共刺激分子增强对肿瘤细胞的免疫应答，以及肿瘤细胞抑制共刺激途径而促进肿瘤发生。本文的免疫刺激细菌可以被工程化为表达共刺激分子，例如CD40，CD40L，4-1BB，4-1BBL，具有胞质结构域缺失的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，具有截短的胞质结构域的4-1BBL，OX40(CD134)，OX40L(CD252)，TNFR超家族其它成员(例如CD27，CD27配体，GITR，CD30，Fas受体，TRAIL-R，TNF-R，HVEM，和RANK)，B7，CD80，CD86，ICOS，ICOS配体(B7RP1)，和CD28。此外，免疫刺激细菌可以编码和表达截短的共刺激分子(例如，4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、OX40L)，具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域的完全或部分缺失(完全或截短或修饰以确保在细胞中表达时正确定向)。具有截短的胞质结构域(包括完全缺失)的基因产物呈现出通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于截短或缺失(或如本文所述以其它方式修饰)的胞质结构域而不能向APC发出反调节信号。所述截短足以提供信号传导，并且足以使修饰的共刺激分子无法向APC发出反调节信号。如本文所述，共刺激分子的胞质结构域的完全或部分缺失增强了共刺激分子的活化，而没有免疫抑制反向信号传导。胞质结构域的部分缺失(或截短)足以实现这些效果，而不影响共刺激分子的表达或表达的共刺激分子的方向。
还可以通过修饰胞质结构域中的氨基酸，包括插入、缺失和/或置换来修饰共刺激分子以消除或减少免疫抑制性细胞内/反向信号传导。特别地，通过修饰例如通过置换胞质结构域磷酸化位点来修饰共刺激分子。例如，用减少或消除反向信号传导的残基置换在适当基因座的一个或多个Ser残基，例如对于人4-1BBL，置换Ser5和Ser8。
本文中的免疫刺激细菌也可以被工程化为表达针对共刺激分子(例如4-1BB)的激动抗体以增强抗肿瘤免疫应答。
TNF受体超家族
TNF配体超家族(TNFSF)及其受体(TNFRSF)参与肿瘤和免疫效应细胞的增殖、分化、活化和存活。这个家族的成员包括诱导细胞凋亡的CD30、Fas-L、TRAIL-R和TNF-R，以及调节B和T细胞免疫应答的CD27、OX40L、CD40L、GITR-L和4-1BBL。其它成员包括疱疹病毒进入介导物(HVEM)。本文的免疫刺激细菌表达TNFSF和TNFRSF可增强抗肿瘤免疫应答。例如，已经表明，4-1BBL在小鼠肿瘤中的表达增强了免疫原性，以及肿瘤内注射OX40L表达增加的树突状细胞(DC)可导致小鼠模型中的肿瘤排斥。研究还表明，将表达重组GITR的腺病毒注射进B16黑色素瘤细胞中促进T细胞浸润并减小肿瘤体积。针对分子(例如4-1BB、OX40和GITR)的刺激性抗体也可由免疫刺激细菌编码以刺激免疫系统。例如，已显示激动性抗4-1BB单克隆抗体增强抗肿瘤CTL应答，而激动性抗OX40抗体已示出增加可移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。此外，激动性抗GITR抗体已示出增强抗肿瘤应答和免疫性(见例如Lechner etal.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；和Peggs et al.(2009)Clinical andExperimental Immunology 157:9-19)。
CD40和CD40L
CD40是TNF受体超家族的成员，由APC和B细胞表达，而其配体CD40L(CD154)由活化的T细胞表达。CD40和CD40L之间的相互作用刺激B细胞产生细胞因子，导致T细胞活化和肿瘤细胞死亡。研究表明，抗肿瘤免疫应答因T细胞上CD40L或树突状细胞上CD40的表达减少而受损。CD40在一些B细胞肿瘤如滤泡性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、成淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病的表面上表达，并且其与CD40L的相互作用已示出在CD40+肿瘤细胞中增加B7.1/CD80、B7.2/CD86和HLA II类分子的表达，以及增强其抗原呈递能力。CD40L在多发性骨髓瘤小鼠模型中的转基因表达导致CD4+和CD8+T细胞的诱导、局部和全身抗肿瘤免疫应答以及肿瘤生长减少。抗CD40激动性抗体也诱导抗肿瘤T细胞应答(见例如Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology 11:39；Dotti et al.(2002)Blood 100(1):200-207；和Murugaiyan et al.(2007)J.Immunol.178:2047-2055)。
4-1BB和4-1BBL
4-1BB(CD137)是一种可诱导的共刺激受体，主要由T细胞和NK细胞表达；其结合在APC、包括DC、B细胞和单核细胞上表达的其配体4-1BBL，以触发免疫细胞增殖和激活。4-1BB导致活化T细胞的应答时间更长以及范围更广。抗4-1BB激动剂和4-1BBL融合蛋白已示出增加免疫介导的抗肿瘤活性，例如由CD4+和CD+T细胞介导的针对肉瘤和肥大细胞瘤的免疫介导的抗肿瘤活性，以及肿瘤特异性CTL活性(见例如Lechner et al.(2011)Immunotherapy3(11):1317-1340；and Marin-Acevedo et al.(2018)Journal of Hematology&Oncology11:39)。4-1BBL受其胞质信号传导结构域的负调节。在巨噬细胞与T细胞上4-1BBL连接的后期，4-1BBL胞质结构域的反向信号传导诱导4-1BBL的表面易位与TLR4结合形成信号传导复合物。这会诱导高水平的TNF-α，与TLR4的LPS活化相当，从而导致适应性免疫应答的免疫抑制(见例如Ma et al.(2013)Sci.Signaling 295(6):1-11)。如本文所述，4-1BBL的胞质结构域缺失，增强4-1BBL的活化，但没有免疫抑制反向信号传导。
OX40和OX40L
OX40和OX40L
OX40(CD134)是TNF受体超家族的成员，其在激活的效应T细胞上表达，而其配体OX40L在APC包括DC、B细胞和巨噬细胞上表达，随后由TLR激动剂及CD40-CD40L信号传导激活。OX40-OX40L信号传导导致T细胞的激活、增强、增殖和存活，以及调节NK细胞功能和抑制Treg的抑制活性。通过OX40的信号传导还导致细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ)的分泌，增强Th1和Th2细胞应答。TIL对肿瘤抗原的识别导致通过TIL的OX40的表达增加，这与改善的预后相关。研究表明，用抗OX40激动抗体或Fc-OX40L融合蛋白的治疗在黑色素瘤、肉瘤、结肠癌和乳腺癌小鼠模型中增强肿瘤特异性CD4+T细胞应答及增加存活率，而掺入肿瘤细胞疫苗中的Fc-OX40L保护小鼠免受乳腺癌细胞的后续攻击(见例如Lechner et al.(2011)Immunotherapy 3(11):1317-1340；和Marin-Acevedo et al.(2018)Journal ofHematology&Oncology 11:39)。
B7-CD28家族
CD28是在T细胞表面表达的共刺激分子，其充当B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的受体，其是在抗原呈递细胞上表达的共刺激分子。CD28-B7信号传导是T细胞活化和存活以及防止T细胞无效能所需的，并导致白细胞介素如IL-6的产生。
最佳的T细胞引发需要两个信号：(1)MHC呈递的抗原的T细胞受体(TCR)识别，和(2)得自T细胞CD28与在APC上表达的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)连接的共刺激信号。在T细胞激活后，CTLA-4受体被诱导，然后在与B7-1和B7-2配体的结合方面胜过CD28。由于肿瘤细胞缺乏共刺激分子(例如B7-1/CD80和B7-2/CD86)的表达，导致无法激活T细胞受体复合物，因此肿瘤细胞的抗原呈递较差。结果，在肿瘤细胞表面上调这些分子可以增强其免疫原性。B7已成功诱导实体瘤和血液恶性病的免疫疗法，例如通过B7或可溶性B7免疫球蛋白融合蛋白的肿瘤细胞表达而实现。B7的病毒介导的肿瘤表达与其它共刺激配体如ICAM-3和LFA-3组合，已在治疗慢性淋巴细胞白血病和转移性黑色素瘤的临床前和临床实验中取得成功。此外，可溶的B7融合蛋白作为单药免疫疗法在实体瘤的免疫疗法中已示出有希望的结果(见例如Lechner et al.(2011)Immunotherapy3(11):1317-1340；and Dotti et al.(2002)Blood 100(1):200-207)。
2.刺激免疫应答和/或I型IFN、非人STING蛋白、STING嵌合体和修饰形式的组成型活性蛋白
I型干扰素(IFN；也称为干扰素1型)，包括IFN-α和IFN-β，是具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的多效细胞因子。IFN-β由大多数细胞类型产生；IFN-α主要由造血细胞产生，特别是浆细胞样树突状细胞。I型干扰素是在模式识别受体(PRR)感知病原体相关分子模式(PAMP)后产生的。它们参与针对病原体(主要是病毒)的先天免疫应答，是强力的免疫调节剂，可促进抗原呈递，介导树突状细胞(DC)成熟，激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞，并通过促进高亲和性抗原特异性T细胞和B细胞应答和免疫记忆的发生来激活适应性免疫系统。
I型干扰素对肿瘤具有抗增殖和促凋亡作用，对肿瘤新血管系统具有抗血管生成作用。它们诱导肿瘤细胞表面MHC I类分子的表达，增加肿瘤细胞的免疫原性，并激活针对其的细胞毒性。I型干扰素已被用作治疗癌症和病毒感染的治疗剂。例如，IFN-α(以商标-A销售)被批准用于治疗毛细胞白血病、恶性黑色素瘤、AIDS相关的Kaposi’s肉瘤和滤泡性非霍奇金淋巴瘤；其也用于治疗慢性髓系白血病(CML)、肾细胞癌、神经内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤、非滤泡性非霍奇金淋巴瘤、硬纤维瘤和皮肤T细胞淋巴瘤，但是由于全身免疫毒性而使用受到限制(见例如Ivashkiv and Donlin(2014)Nat.Rev.Immunol.14(1):36-49；Kalliolias and Ivashkiv(2010)Arthritis Research&Therapy 12(Suppl 1):S1；和Lee,S.and Margolin,K.(2011)Cancers 3:3856-3893)。
I型干扰素在肿瘤和肿瘤微环境中的表达是本文的免疫刺激细菌旨在引发的免疫应答之一。诱导或诱发I型干扰素为治疗癌症提供抗肿瘤免疫。
a.组成型STING表达和功能获得突变
I型干扰素、促炎细胞因子和趋化因子的诱导对于产生预防或抑制病毒病原体感染的免疫应答是必要的。这种反应也可以作为有效抗肿瘤剂。本文提供的免疫刺激细菌编码组成型诱导I型IFN的蛋白质。在这些蛋白质中，有发生在患有涉及免疫应答调节物过度产生的各种疾病或病症的个体中的蛋白质。例如，I型IFN和促炎细胞因子的过度产生或超量产生或的负调节缺陷，可导致不良影响，例如炎症和自身免疫性疾病。涉及I型IFN过度产生的疾病(通常是慢性)被称为干扰素病(见例如Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118；和Konno et al.(2018)Cell Reports 23:1112-1123)。与I型干扰素病相关的疾病和临床表型包括Aicardi-Goutiéres综合征(AGS)、婴儿期发病的STING相关血管病(SAVI)、Singleton-Merten综合征(SMS)、非典型SMS、家族性冻疮性狼疮(FCL)、系统性红斑狼疮病(SLE)、双侧纹状体坏死(BSN)、脑血管疾病(CVD)、遗传性对称性色素异常症(DSH)、痉挛性截瘫(SP)、X连锁网状色素异常症(XLPDR)、蛋白酶体相关自身炎症综合征(PRAAS)、颅内钙化(ICC)、呈孟德尔遗传的分枝杆菌病(MSMD)和脊椎软骨发育不良(SPENCD)(见例如Rodero et al.(2016)J.Exp.Med.213(12):2527-2538)。这些表型与特定基因型相关，涉及基因突变，导致参与I型IFN诱导的产物的组成型活性。
干扰素信号传导的持续激活可能是由于：1)功能丧失突变导致胞质DNA增加(例如，TREX1和SAMHD1中的突变)，或胞质RNA/DNA杂合体增加(例如，RNASEH2A、RNASEH2B，RNASEH2C和POLA1中的突变)；2)功能丧失突变导致RNA编辑缺陷和胞质中自身核酸RNA种类的异常感知(例如ADAR1中的突变)；3)功能获得突变导致胞质IFN信号传导途径的组成型激活/对胞质核酸配体的敏感性增加(例如，RIG-I、MDA5和STING中的突变)；4)功能丧失突变导致通过由未折叠蛋白应答紊乱所致MAVS的异常RNA信号传导(例如，SKIV2L中的突变)；5)负责限制IFN受体(IFNAR1/2)信号传导的分子中的功能丧失突变，导致不受控制的IFN刺激基因(ISG)产生(例如，USP18和ISG15中的突变)；6)蛋白酶体功能异常，通过未知机制导致IFN信号传导增加(例如，PSMA3、PSMB4和PSMB8中的突变)；和7)TRAP/ACP5和C1q的功能丧失突变，其中导致I型IFN信号传导的机制仍然不清楚(见例如Rodero et al.(2016)J.Exp.Med.213(12):2527-2538)。
本文感兴趣的是导致功能获得(GOF)的突变。STING、MDA5和RIG-I中存在已知的突变，这些突变与编码的蛋白质的组成型激活和/或与内源性配体增强的敏感性或增加的亲和性或结合有关。例如，STING中的GOF突变与SAVI和FCL相关；MDA5中的GOF突变与AGS和SMS相关；RIG-I中的GOF突变与非典型SMS相关。
TMEM173 STING等位基因
干扰素基因刺激因子(STING)由跨膜蛋白173(TMEM173)基因编码，该基因是一个长度约7kb的基因。人TMEM173基因的特征在于等位基因的显著异质性和人口分层。最常见的人TMEM173等位基因称为R232(指存在于残基232位置的氨基酸；见例如SEQ ID NO:305-309，列出了各种人TMEM173等位基因的序列)。超过一半的美国人口不是R232/R232。第二个最常见的等位基因是R71H-G230A-R293Q(HAQ)。其它常见等位基因包括AQ(G230A-R293Q)、Q(Q293)和R232H(参考在数据库中由Glen Barber首次鉴别和编目的STING等位基因后命名为REF)。
R232/R232是欧洲人最常见的基因型，而HAQ/R232是东亚人最常见的基因型。非洲人没有HAQ/HAQ基因型，但有Q等位基因，约4％的非洲人是AQ/AQ，这在其它种族人群中不存在(见例如Patel and Jin(2018)Genes&Immunity,doi:10.1038/s41435-018-0029-9)。REF、AQ和Q等位基因对细菌来源的CDN例如3’3’c-di-GMP高度耐药(见例如Corrales etal.(2015)Cell Reports11:1018-1030)。
STING功能获得突变
STING基因TMEM173中的几个激活或功能获得(GOF)突变，遗传的以及新生的，均与一种罕见的自身炎症性疾病SAVI(STING相关的婴儿期发病血管病变)有关。SAVI是一种常染色体显性遗传病，且其特征在于全身炎症、间质性肺病、皮肤血管炎和复发性细菌感染。具有新生TMEM173突变的SAVI的特征通常在于早发(<8周)和严重的表型，而家族性突变导致晚发(青少年到成人)和较轻的临床症状。遗传的TMEM173激活突变包括G166E和V155M，而新生突变包括N154S、V155M、V147M、V147L、C206Y、R284G、R281Q和S102P/F279L(见例如Patel and Jin(2019)Genes&Immunity20:82-89)。其它已鉴定的TMEM173激活突变包括R284M、R284K、R284T和R375A(见例如美国专利公开号2018/0311343)。TMEM173中另一个功能获得性突变是R284S，其导致高度组成型活性STING，并被发现在没有激活CDN的情况下触发先天免疫信号传导，导致促炎细胞因子的慢性产生(见例如Konno et al.(2018)CellReports 23:1112-1123)。
TMEM173突变，例如N154S、V155M和V147L，和/或下表中列出的任何突变，单独或与这些和任何其它这种突变如N154S/R284G的任何组合导致功能获得性STING，所述STING具有组成型活性并且不需要或对配体刺激高度敏感，导致STING-干扰素途径的慢性激活。这已经得到证实(见例如Liu et al.(2014)N.Engl.J.Med.371:507-518)。将突变的TMEM173(具有各个置换V147L、N154S、V155M和功能丧失突变体V155R)和非突变的TMEM173的构建体转染到STING阴性HEK293T细胞中，并用STING配体cGAMP进行刺激。用N154S、V155M和V147L突变体转染的细胞表现出高度升高的IFNB1(编码IFN-β的基因)报告基因活性，而用STING配体cGAMP刺激并未显著增强这种活性。用功能丧失突变体(V155R)、未突变的TMEM173或对照质粒转染的细胞没有显著的基线激活。用cGAMP刺激在具有未突变TMEM173的细胞中产生剂量依赖性模式的应答，以及在表达功能丧失突变体的细胞中仅在最高cGAMP浓度才产生最小应答(见例如Liu et al.(2014)N.Engl.J.Med.371:507-518)。这些结果表明，即使在没有cGAMP刺激的情况下，激活TMEM173突变也会导致STING的组成型激活。
G207E是另一种功能获得性STING突变，其导致脱发、光敏性、甲状腺功能异常和SAVI特征。G207E突变导致HEK细胞中炎症相关途径的组成型激活，以及患者外周血单核细胞(PBMC)中的异常干扰素特征和炎性体激活。使用具有R232或H232等位基因和GOF突变G207E的STING变体，示出在用CDN刺激后，R232+G207E变体导致IFN-β和STAT1/2途径的活性略有增加，而H232+G207E变体导致IFN-β水平保持不变，以及STAT1/2显示活性减弱。这两种变体在刺激后均示出相似的STAT3和NF-κB途径激活。这些结果表明，在第232位的残基R对于cGAMP结合和IFN诱导是重要的，并表明G207E突变体导致STING信号传导途径的组成型激活和NF-κB途径的配体依赖性过度激活。具有R232等位基因和G207E的患者患有的疾病更严重；这种多态性加强了突变体STING的组成型激活，导致下游靶标如IFN、IL1-β和IL-18的过度表达(见例如Keskitalo et al.(2018),available from:doi.org/10.1101/394353)。
将鼠STING(见例如SEQ ID NO:369)中的67个氨基酸单独或成组突变(见Burdetteet al.(2011)Nature 478(7370):515-518)，以鉴别参与环状di-GMP(c-di-GMP)结合和/或IFN诱导的氨基酸。其中鉴别的突变体是超活性突变体R196A/D204A、S271A/Q272A、R309A/E315A、E315A、E315N、E315Q和S271A(通过参照SEQ ID NO:305-309所示人STING序列而分别对应于R197A/D205A、S272A/Q273A、R310A/E316A、E316A、E316N、E316Q和S272A)，其自发诱导的IFN处于低水平转染及不应答c-di-GMP，以及突变体R374A、R292A/T293A/E295A/E299A、D230A、R231A、K235A、Q272A、S357A/E359A/S365A、D230A/R231A/K235A/R237A和R237A(通过参照SEQ ID NO:305-309所示人STING序列而分别对应于R375A、R293A/T294A/E296A(在人STING中没有E299A等价物)、D231A、R232A、K236A、Q273A、S358A/E360A/S366A、D231A/R232A/K236A/R238A和R238A)，当其过表达时诱导IFN，但不应答c-di-GMP。这些等位基因仍然可以应答内源性CDN 2’3’c-di-GAMP，因为后来发现一些人STING突变对细菌产生的3’3’CDN例如c-di-GMP的亲和性较低(见例如Corrales et al.(2015)Cell Reports 11:1018-1030)。
本文提供的编码具有功能获得性突变的这些蛋白质的免疫刺激细菌利用这些蛋白质的组成型激活来增加I型IFN和促炎细胞因子的产生。本文提供了编码具有功能获得性突变的STING、IRF3、IRF5、IRF7、MDA5和/或RIG-I的肿瘤靶向免疫刺激细菌。所述免疫刺激菌增加了肿瘤微环境中I型IFN介导的细胞因子和趋化因子的产生，增强了抗肿瘤免疫应答，提高了所述免疫刺激菌的治疗效果。编码STING的基因称为TMEM173，编码MDA5的基因是IFIH1，编码RIG-I的基因是DDX58。每个基因都有许多等位基因，并且已知突变可能发生在具有任何等位基因的基因中，导致功能获得或组成型激活。下面列出的突变可以单独出现，也可以任意组合使用。其它导致功能获得的突变可以通过常规筛选/突变方案进行鉴定。下表列出了STING/TMEM173(SEQ ID NO:305-309)、MDA5/IFIH1(SEQ ID NO:310)、RIG-I/DDX58(SEQ ID NO:311)、IRF3(SEQ ID NO:312)和IRF7(SEQ ID NO:313)中的每一个的示例功能获得突变。也可以被引入其它突变，例如缺失或置换一个或多个磷酸化位点，例如STING中的S324/L325/S326→S324A/L325/S326A，以及消除磷酸化位点以减少核因子-κB(NF-κB)在STING中的信号传导的其它置换，或使用这种信号传导的其它蛋白质。
所得蛋白质可以在本文提供的免疫刺激细菌中编码。蛋白质在免疫刺激细菌的质粒上编码。
施用编码野生型STING的核酸可以诱导免疫应答；在靶向肿瘤的递送载体中施用具有本文提供的组成型活性的功能获得性STING突变体导致更强力的免疫应答和更有效的抗癌治疗剂。通过靶向肿瘤地施用组成型活性STING或其它这种修饰的DNA/RNA传感器(例如本文提供的MDA5、RIG-I、IRF3或IRF7的功能获得性突变体)而增强的免疫应答，提供了治疗上更有效的抗癌治疗。例如，如本文所述，修饰所述免疫刺激细菌使其不感染上皮细胞，但保留感染包括肿瘤驻留免疫细胞在内的吞噬细胞的能力，有效地将免疫刺激细菌靶向肿瘤微环境，改良治疗效率和防止不期望的全身免疫应答。这些靶向肿瘤的细菌被工程化为编码功能获得性STING、MDA5、RIG-I、IRF3或IRF7突变体，其具有组成型活性，例如即使在没有配体刺激的情况下也提供强力的I型IFN应答以改善肿瘤微环境中的抗癌免疫应答。
因此，例如施用组成型激活的STING可以提供一种替代方法来增强STING信号传导，用于癌症的免疫治疗性治疗。在某些实施方案中，本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激细菌可以被修饰编码具有选自以下的功能获得性突变的STING/TMEM731(SEQ ID NO:305-309)：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，R197A，D205A，R197A/D205A，C206Y，G207E，D231A，R232A，K236A，R238A，D231A/R232A/K236A/R238A，S272A，Q273A，S272A/Q273A，F279L，S102P/F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R293A，T294A，E296A，R293A/T294A/E296A，R310A，E316A，E316N，E316Q，R310A/E316A，S324A/S326A，S358A，E360A，S366A，S358A/E360A/S366A，和R375A，及其保守突变。此外，与单个突变对应物相比，STING功能获得突变的组合如N154S/R284G可以显著增强STING信号传导。
示例的功能获得突变表
导致I型IFN持续表达的功能获得突变
参考如SEQ ID NO:305-309任一所示人STING的序列，氨基酸残基R197、D205、R310、R293、T294、E296、S272、Q273、E316、D231、R232、K236、S358、E360、S366和R238，分别对应于如SEQ ID NO:369所示小鼠STING的序列的氨基酸残基R196、D204、R309、R292、T293、E295、S271、Q272、E315、D230、R231、K235、S357、E359、S365和R237。还包括每个置换的保守取代(参见定义部分中的表，列出每个氨基酸的示例保守突变)。
b.组成型IRF3表达和功能获得突变
IRF3(干扰素调节因子3或IRF-3)和IRF7(或IRF-7)是I型IFN基因的关键激活物。在病毒诱导的C末端磷酸化之后(通过TBK1)，活化的IRF3和IRF7形成同源二聚体，从细胞质易位至细胞核，并与IFN刺激的应答元件(ISRE)结合以诱导I型IFN应答。IRF-3在未受刺激的细胞中组成型表达，以无活性的细胞质形式存在，而IRF7在细胞中不组成型表达，并且由IFN、脂多糖和病毒感染诱导。IRF3的过表达显著增加了病毒介导的I型IFN基因的表达，从而诱导抗病毒状态。IRF3激活也已显示出在病毒感染后上调CC-趋化因子RANTES(CCL5)的转录(见例如Lin et al.(1999)Mol.Cell Biol.19(4):2465-2474)。
IRF3的C末端结构域中的残基S385、S386、S396、S398、S402、T404和S405在病毒感染后被磷酸化，诱导构象变化，这导致IRF3激活。IRF3激活不仅由病毒感染诱导，也由脂多糖(LPS)和poly(I:C)诱导。在IRF3的C末端簇中可以磷酸化的7个残基中，单点突变S396D足以产生组成型活性形式的IRF-3。与野生型IRF3相比，IRF3(S396D)将IFNα1、IFN-β和RANTES启动子的反式激活分别提高了13、14和11倍。与野生型IRF3相比，另一个突变体IRF3(S396D/S398D)将IFNα1、IFN-β和RANTES启动子的反式激活分别提高了13、12和12倍。IRF3的另一个组成型活性突变体是IRF-3(5D)，其中第396、398、402、404和405位的丝氨酸或苏氨酸残基被拟磷酸天冬氨酸残基置换(IRF-3(S396D/S398D/S402D/T404D/S405D))。通过将免疫应答信号传导途径中的其它蛋白质如RIG-I、MDA5和STING中的丝氨酸残基突变为拟磷酸天冬氨酸，可以实现类似的功能获得性突变，导致免疫应答介导物的组成型活性，如I型干扰素的诱导。
IRF3(5D)显示组成型DNA结合和反式激活活性、二聚体形成、与转录辅激活因子p300(也称为EP300或E1A结合蛋白p300)/CBP(也称为CREB结合蛋白或CREBBP)缔合以及核定位。病毒感染不会进一步诱导其反式激活活性。IRF3(5D)是一种非常强的IFN-β和ISG15基因表达激活物；单独的IRF3(5D)刺激IFN-β表达与病毒感染一样强烈，以及与野生型IRF3相比使IFNα1、IFN-β和RANTES启动子的反式激活分别提高9倍、5.5倍和8倍(见例如Lin etal.(2000)J.Biol.Chem.275(44):34320-34327；Lin et al.(1998)Mol.Cell Biol.18(5):2986-2996；和Servant et al.(2003)J.Biol.Chem.278(11):9441-9447)。S385、S386、S396、S398、S402、T404和S405中任何位置可以单独或组合突变，以在本文提供的免疫刺激细菌中产生组成型活性的IRF3突变体。
c.非人STING蛋白及其具有增强或组成型活性的变体，以及STING嵌合体及其具有增强或组成型活性的变体
如上所述，胞质双链DNA(dsDNA)通过内质网(ER)驻留适配蛋白STING(IFN基因刺激因子)刺激I型干扰素(IFN)的产生，其激活转录因子干扰素调节因子3(IRF3)。TANK结合激酶(TBK1)/IRF3轴导致I型IFN的诱导，以及树突状细胞(DC)的激活和肿瘤抗原的交叉呈递，从而激活CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫性。STING信号传导还激活活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导轴，导致促炎应答，但不激活抗肿瘤免疫性所需的DC和CD8+T细胞。
基于2’3’cGAMP的识别，STING从内质网通过高尔基体易位，从而募集TANK结合激酶1(TBK1)并激活转录因子IRF3和NF-κB。STING的羧基末端尾区(C末端尾区或CTT)区域是激活TBK1和刺激IRF3磷酸化所必需且足够的；其也参与NF-κB信号传导。CTT是一段约40个氨基酸的非结构化片段，含有STING磷酸化和IRF3募集所需的序列基序。IRF3和NF-κB下游信号传导归因于在脊椎动物物种中保守的STING的C末端尾区(CTT)内特定序列基序。CTT中的模块基序，包括IRF3-、TBK1-和TRAF6-结合模块，其控制细胞信号传导和免疫应答的强度和特异性。
根据物种及其STING CTT离散元件的各自特征，IRF-3和NF-κB下游应答可能会受到影响，且有时甚至相反。STING CTT元件命令并微调两个信号传导途径之间的平衡，从而产生不同的生物应答。例如，在人和小鼠免疫细胞中，STING依赖性IRF3激活主要导致I型干扰素应答。人细胞中的STING信号传导还通过TRAF6募集通过经典和可能的非经典NF-κB途径驱动促炎应答。人STING残基S366(见例如SEQ ID NO:305-309)是主要的TBK1磷酸化位点，其是CTT中LxIS基序的一部分，这是IRF3结合所需的，而第二个PxPLR基序包括残基L374，是TBK1结合所需的。LxIS和PxPLR基序在所有脊椎动物STING等位基因中均高度保守。在其它物种中，STING信号传导主要导致NF-κB信号传导轴的激活。例如，负责NF-κB信号传导过度活化的斑马鱼CTT在C极末端含有一个具有高度保守型的PxExxD基序的延伸，这在人和哺乳动物STING等位基因中是不存在的；这个基序与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)结合位点具有相似性。虽然TRAF6在人STING信号传导中的作用不是必需的，但TRAF6募集对于斑马鱼STING诱导的NF-κB激活是必需的。人-斑马鱼STING嵌合体，其中人STING被工程化为含有斑马鱼STING CTT模块DPVETTDY，诱导NF-κB激活高100倍以上，表明这个区域对于引导增强的NF-κB信号激活是必要且足够的。加入斑马鱼CTT还导致STING干扰素应答增加(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。
本文利用物种中IRF3和NF-κB信号传导之间平衡的差异来产生修饰的STING蛋白，这些蛋白降低了NF-κB信号传导，和/或任选增加了IRF3信号传导，使得在STING蛋白被递送至TME并表达时，与未修饰的STING蛋白相比，所得应答是增强的抗肿瘤/抗病毒应答。
在一些实施方案中，来自具有低或无NF-κB信号传导活性的物种的STING蛋白被提供在递送载体中，包括本文描述的或本领域技术人员已知的任何免疫刺激细菌，及提供在其它递送载体中，例如病毒载体，包括溶瘤病毒载体、微细胞、外来体(exosome)、脂质体，以及提供在细胞中，如用于细胞疗法中和用于递送载体的T细胞，如细菌和溶瘤载体。
非人STING蛋白可包括但不限于来自如下物种的STING蛋白：袋獾(Sarcophilusharrisii；SEQ ID NO:349)，狨猴(Callithrix jacchus；SEQ ID NO:359)，牛(Bos taurus；SEQ ID NO:360)，猫(Fells catus；SEQ ID NO:356)，鸵鸟(Struthio camelus australis；SEQ ID NO:361)，朱鹮(Nipponia nippon；SEQ ID NO:362)，腔棘鱼(Latimeriachalumnae；SEQ ID NO:363-364)，野猪(Sus scrota；SEQ ID NO:365)，蝙蝠(Rousettusaegyptiacus；SEQ ID NO:366)，海牛(Trichechus manatus latirostris；SEQ ID NO:367)，鬼鲨(Callorhinchus milli；SEQ ID NO:368)，及小鼠(Mus musculus；SEQ ID NO:369)。这些脊椎动物STING蛋白易于激活人细胞中免疫信号传导，表明STING信号传导的分子机制在大多数脊椎动物中是共享的(见de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports27:1165-1175)。
在其它实施方案中，非人STING蛋白在所述非人STING中对应于人STING的那些的相应基因座中含有任何组成型STING激活和功能获得性突变，如上文所述(见实施例17，其提供了示例比对和各物种中相对应的突变，也见图1-13)。
在其它实施方案中，提供了STING蛋白的嵌合体。在嵌合体中，第一物种STING蛋白的CTT区域或其赋予或参与NF-κB信号传导/活性的部分被来自第二物种的相应CTT或其部分置换，第二物种的STING蛋白具有较低的或极少的、低于人STING的NF-κB信号传导活性。通常，第一物种是人，所述置换CTT或其部分来自如袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼和鬼鲨等物种的STING，具有更低的NF-κB活性。这因此获得诱导I型干扰素的STING蛋白，其对于抗肿瘤活性很重要，并且具有有限的或没有在抗肿瘤疗法中不希望的NF-κB活性。所述嵌合体可以进一步包括在相应基因座中的组成型STING激活和功能获得性突变，以增加或提供I型干扰素组成型活性。在所有实施方案中，可以缺失TRAF6结合基序以进一步降低或消除在抗肿瘤治疗剂中不期望的活性。这些非人STING蛋白、嵌合体和突变体在递送载体中提供，例如本文描述的或本领域技术人员已知的任何递送载体，包括溶瘤病毒载体、细胞(例如用于细胞疗法的干细胞和T细胞)、外来体、微细胞、脂质体和本文提供的免疫刺激细菌，其在肿瘤驻留免疫细胞中积累，并将编码的蛋白质递送至肿瘤微环境和肿瘤。非人STING蛋白、修饰的STING蛋白和嵌合体用作治疗剂，用于在如本文所述或本领域技术人员已知的其它方法中治疗肿瘤。还提供了含有STING蛋白、递送载体和编码核酸的药物组合物。
d.充当胞质DNA/RNA传感器的其它基因产物及其组成型变体
感知或与胞质核酸相互作用的其它基因产物是视黄酸可诱导的基因I(RIG-I)样受体(RLR)，包括RIG-I和MDA5(黑色素瘤分化相关蛋白5)。RLR是病毒dsRNA和细菌分泌的核酸的胞质传感器，以及包括RIG-I、MDA5和LGP2(遗传生理学实验室laboratory ofgenetics and physiology 2)。基于如病毒dsRNA等配体的结合，RIG-I和MDA5激活线粒体抗病毒信号传导适配蛋白或MAVS，其募集肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF)，以在线粒体外膜组装信号传导复合体。下游信号传导组分进一步被TRAF募集，导致IRF3(干扰素调节因子3)、IRF-7、NF-κB(活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子)以及AP-1(激活蛋白1)的磷酸化和激活。结果，诱导了干扰素、促炎细胞因子和参与病原体清除的其它基因的表达(见例如Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。与STING一样，由于功能获得性突变所致MDA5和RIG-I的组成型激活导致I型IFN的诱导，其可用于增强免疫刺激细菌的抗肿瘤免疫应答。
i.RIG-I
视黄酸可诱导的基因I(RIG-I)，也称为DDX58(DEXD/H-盒解旋酶58)是其组成型激活与如非典型Smith-Magenis综合征等干扰素疾病的发展有关的另一种蛋白质。RIG-I，与MDA5/IFIH1一样，是RIG-I样受体(RLR)家族的成员，以及是925个残基的胞质模式识别受体，在病毒dsRNA的检测中起作用。RIG-I通过促进I型和III型干扰素和促炎细胞因子表达的独立途径启动对病毒RNA的先天免疫应答(见例如Jang et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:266-274；和Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。
非典型Smith-Magenis综合征，没有标志性的牙齿异常，但具有可变的表型，包括青光眼、主动脉钙化和骨骼异常，已发现其是由DEXD/H-盒解旋酶58基因(DDX58)中的突变引起的，其编码视黄酸可诱导的基因I(RIG-I)。特别地，DDX58中的E373A和C268F突变被鉴别为导致RIG-I中的功能获得。突变的DDX58数量增加与NF-κB报道基因活性基础水平的显著增加有关，以及这种活性通过dsRNA类似物poly(I:C)刺激而进一步增加。RIG-I突变还在基础水平诱导IRF-3磷酸化和二聚化，并导致IFNB1、干扰素刺激基因15(ISG15)和趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)在基础的和poly(I:C)转染的HEK293FT细胞中的表达均增加。这些结果表明突变的DDX58/RIG-I导致组成型激活，导致增加的IFN活性和IFN刺激的基因表达(见例如Jang et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:266-274；和Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激细菌可以被修饰为编码具有功能获得性突变的RIG-I/DDX58(SEQ ID NO:311)，所述功能获得性突变例如但不限于E373A和C268F(单独或组合的)。
ii.MDA5/IFIH1
另一个干扰素疾病基因是具有含有解旋酶C结构域的蛋白1诱导的IFN(IFIH1)，也称为黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)，其是细胞质DExD/H盒RNA受体的RIG-I样家族成员。MDA5由IFIH1编码，是一种1025个氨基酸的细胞质模式识别受体，其感测细胞质中的病毒双链RNA(dsRNA)和分泌的细菌核酸，并通过适配分子MAVS(线粒体抗病毒信号传导蛋白)激活I型干扰素信号传导。MAVS募集肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF)，进而募集下游信号传导组分，导致IRF-3(干扰素调节因子3)、IRF-7、NF-κB(活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子)和AP-1(激活蛋白1)的磷酸化和活化。这样导致了干扰素、促炎细胞因子和参与病原体清除的其它基因的表达(见例如Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282；Rice et al.(2014)Nat.Genet.46(5):503-509；and Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。
功能获得性(GOF)IFIH1变体发生在患有自身免疫性病症的患者中，包括Aicardi-Goutiéres综合征(AGS)和Singleton-Merten综合征(SMS)，其特征在于显著的血管炎症。AGS是一种炎症性疾病，特别影响大脑和皮肤，且其特征在于干扰素诱导的转录物的上调。AGS通常是由于编码DNA外切核酸酶TREX1、RNase H2内切核酸酶复合物的3个非等位基因组分、三磷酸脱氧核苷三磷酸水解酶SAMHD1和双链RNA编辑酶ADAR1的任何基因中的突变所致而发生的。一些患有AGS的患者在任何这6个基因中没有突变，但IFIH1中有GOF突变，表明这个基因也与AGS有关。Singleton-Merten综合征(SMS)是一种常染色体显性遗传疾病，其特征在于异常的血管(如钙化)、牙齿(如早发性牙周炎、牙根吸收)和骨骼(如骨质减少、肢端骨质溶解、骨质疏松)。Singleton-Merten综合征患者中干扰素特征基因上调，这与IFIH1中的GOF突变有关(见例如Rice et al.(2014)Nat.Genet.46(5):503-509；和Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282)。
在表达低水平内源性病毒RNA受体的HEK293T细胞中比较了在AGS患者中鉴别的野生型IFIH1和6种IFIH1 GOF突变体(R720Q、R779H、R337G、R779C、G495R、D393V)的IFN-β报道子刺激活性。野生型IFIH1基于长的(>1kb)dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyI:C)结合被诱导，但不被短的162bp的dsRNA诱导，并且在没有外源RNA的情况下具有较低活性。除了应答polyI:C的强大信号传导外，IFIH1突变体还示出对162bp短dsRNA应答的显著诱导IFN信号传导。在没有外源配体的情况下，所述突变体也表现出高4至10倍的基线信号传导活性(见例如Rice et al.(2014)Nat.Genet.46(5):503-509)。
另一个功能获得性IFIH1突变R822Q被鉴别为通过触发I型干扰素产生引起Singleton-Merten综合征，并导致早期动脉钙化以及牙齿炎症和吸收。HEK293T细胞(其具有最低的内源性IFIH1表达水平)用于过表达野生型和R822Q MDA5。野生型IFIH1表达导致IFNB1(干扰素，β1，成纤维细胞)以剂量依赖性方式表达增加，而突变的IFIH1导致IFNB1表达增加约20倍。在用dsRNA类似物poly(I:C)刺激后，R822Q IFIH1较野生型IFIH1导致IFNB1高水平表达，表明R822Q IFIH1对非自身dsRNA过度活跃。在Singleton-Merten综合征患者的全血样本中干扰素特征基因如IFI27、IFI44L、IFIT1、ISG15、RSG15、RSAD2和SIGLEC1的表达也较高，这与通过R822Q IFIH1的IFNB1的较高表达水平一致(见例如Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282)。
在具有另一种IFIH1 GOF突变A489T的患者中观察到的干扰素特征指示I型干扰素疾病；IFIH1A489T与增加的干扰素产生和类似于冻疮狼疮、AGS和SMS的表型有关(见例如Bursztejn et al.(2015)Br.J.Dermatol.173(6):1505-1513)。A489T变体不仅在用长dsRNA类似物poly(I:C)刺激后导致IFN诱导，用短dsRNA刺激也如此。在具有SMS表型的患者中发现IFIH1中两个另外的功能获得性突变，T3311和T331R，这些患者表现为IFN诱导的转录物显著上调。T3311和T331R变体导致IFN-β表达增加，即使在没有外源dsRNA配体的情况下，这与观察到的MDA5的组成型激活一致(见例如Lu and MacDougall(2017)Front.Genet.8:118)。
A946T是另一种IFIH1 GOF突变，导致I型干扰素的产生增加，促进炎症并增加自身免疫的风险。IFIH1中的A946T突变当与TMEM173 R232等位基因和G207E GOF突变结合时产生累加效应，导致严重的早发表型，其特征类似于SAVI(见例如Keskitalo et al.(2018)preprint,，得自doi.org/10.1101/394353)。G821S是IFIH1中的GOF突变，已被证实导致小鼠模型中自发进展的狼疮样自身免疫症状(见例如Rutsch et al.(2015)Am.J.Hum.Genet.96:275-282)，而在患有AGS的个体中鉴别的IFIH1错义突变A452T、R779H和L372F示出导致I型干扰素过量产生(见例如Oda et al.(2014)Am.J.Hum.Genet.95:121-125)。
本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激细菌可以被修饰为编码具有选自如下(单独或任意组合的)功能获得性突变的MDA5/IFIH1(SEQ ID NO:310)：T331I，T331R，R337G，L372F，D393V，A452T，A489T，G495R，R720Q，R779H，R779C，G821S，R822Q和A946T。
iii.IRF7
IRF7(或IRF-7)的组成型活性形式包括其中不同的C末端丝氨酸被拟磷酸Asp取代的突变体，包括IRF-7(S477D/S479D)、IRF-7(S475D/S477D/S479D)和IRF-7(S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D)。IRF-7(S477D/S479D)是IFNA和RANTES基因表达的强反式激活物，并且刺激基因表达，即使在没有病毒感染的情况下。IRF-7(S475D/S477D/S479D)和IRF-7(S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D)没有进一步增强IRF-7(S477D/S479D)的反式激活活性，但是所有3个突变体的反式激活活性都受到病毒感染的进一步刺激。位于未感染细胞的细胞核的突变体IRF-7(Δ247-467)是IRF7的一种非常强的组成型形式；其在未受刺激和病毒感染的细胞中激活的转录比野生型IRF-7高1500倍以上(见例如Lin et al.(2000)J.Biol.Chem.275(44):34320-34327)。本文提供的免疫刺激细菌可以编码和表达组成型活性IRF7突变体，包括在残基475-477、479、483和487处具有置换的那些突变体，以及具有氨基酸缺失的那些突变体。所述免疫刺激细菌在由哺乳动物宿主(包括人)识别的启动子和任何其它希望的调节信号控制下在质粒上编码这些蛋白质。
e.其它I型IFN调节蛋白
参与识别激活I型IFN应答的DNA/RNA的其它蛋白质可以突变以产生组成型I型IFN表达。未修饰的和/或修饰的蛋白质可以在本文提供的免疫刺激细菌中编码，以用于将蛋白质递送至肿瘤微环境如递送至肿瘤驻留免疫细胞，以增加I型干扰素的表达。
这些蛋白质包括但不限于如下名称的蛋白质：TRIM56，RIP1，Sec5，TRAF2，TRAF3，TRAF6，STAT1，LGP2，DDX3，DHX9(DDX9)，DDX1，DDX21，DHX15，DHX33，DHX36，DDX60和SNRNP200。
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可以产生功能获得变体，例如通过筛选和/或通过诱变。可以在体外进行定点诱变，以鉴别具有增强活性的突变，其导致I型IFN更高水平表达和/或组成型表达。完整的基因组DNA可得自经历自身免疫和自身炎症症状的非相关患者及得自健康个体，以筛选和鉴别其表达导致I型IFN表达增加或组成型表达的其它产物。可以进行全外显子组测序，并且可以分析内含子和外显子，从而鉴别在与I型干扰素增加的或组成型表达相关的途径中具有突变的蛋白质。在鉴别突变后，将编码全长基因的cDNA分子(带有或不带有鉴别的突变)转染进报告细胞系中，其测量I型干扰素的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达置于IFN-β的启动子控制下。组成型活性的功能获得性突变体将促进IFN-β的表达，而未受刺激的野生型蛋白则否。刺激可以通过病毒感染、细菌感染、细菌核酸、LPS、dsRNA、poly(I:C)或通过增加蛋白质配体(例如CDN)的外源水平来实现。鉴定的蛋白质还包括增强针对对象中感兴趣的抗原的免疫应答的蛋白质。所述免疫应答包括细胞或体液免疫应答，其特征在于如下一项或多项：(i)刺激I型干扰素信号传导途径；(ii)刺激NF-κB信号传导途径；(iii)刺激炎症应答；(iv)刺激细胞因子产生；(v)刺激树突状细胞发育、活性或动员；(vi)表示产物的表达增强免疫应答的任何其它应答；以及(vii)前述(i)至(vi)的任何组合。
3.抗体和抗体片段
抗体工程化的进步导致了重组抗体片段的产生，这些片段比传统的单克隆抗体有许多改进，特别是在制备、组织渗透和易用性方面。其中的一个实例是单链片段可变区(scFv)，由抗体结合位点的重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成，通过通常为(G4S)3序列的灵活性肽接头连接在一起(见例如Weisser et al.(2009)Biotechnol.Adv.27(4):502-520)。其它实例包括scFv-Fc抗体片段，其中scFv的VH结构域与Fc区连接，以及本领域技术人员已知的二聚体和多聚体及其它抗体的组合和形式。抗体片段和其它构建体使得可以以如本文所示例的可在质粒上编码并由免疫刺激细菌递送的方式靶向抗原。靶向抗原的实例包括肿瘤抗原，包括下文实施例中讨论的抗原，以及下文和其它地方讨论的其它示例靶标。技术人员已知的任何靶标都包括在内，在构象或结构变化时形成的新抗原包括在内。
a.TGF-β
转化生长因子β(TGF-β)是一种在胚胎形成、伤口愈合、血管生成和免疫调节中具有多种作用的多效细胞因子。其以三种同种型存在于哺乳动物细胞中，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1是免疫细胞中最主要的(见例如Esebanmen et al.(2017)Immunol.Res.65:987-994)。TGF-β作为免疫抑制剂的作用可以说是其最主要的功能。特别是，其在肿瘤微环境中以潜在形式激活，对DC及其耐受抗原特异性T细胞的能力具有深远的免疫抑制作用。TGF-β还可以直接将Th1 CD4+T细胞转化为免疫抑制性Treg，进一步提高肿瘤耐受性(见例如Travis et al.(2014)Annu.Rev.Immunol.32:51-82)。基于其肿瘤特异性免疫抑制功能，无论其已知的癌细胞生长和转移促进性质如何，TGF-β的抑制都是癌症治疗的靶点。已经在几种人肿瘤类型中证实了高水平的TGF-β信号传导，包括结直肠癌(CRC)、肝细胞癌(HCC)、胰腺导管腺癌(PDAC)和非小细胞肺癌(NSCLC)(见例如Colak et al.(2017)Trends Cancer3(1):56-71)。TGF-β的全身施用抑制作用可导致不可接受的自身免疫毒性，其抑制作用应局限于肿瘤微环境。实现此目的的一种方法是产生可溶性TGF-β受体，该受体充当结合TGF-β的诱饵(见例如Zhang et al.(2008)J.Immunol.181:3690-3697)。因此，本文提供的含有TGF-β受体诱饵的肿瘤靶向免疫刺激细菌可以结合并从肿瘤微环境中去除TGF-β，从而破坏肿瘤免疫耐受并刺激抗肿瘤免疫。
除了TGF-β结合诱饵受体之外，还包括可以在肿瘤微环境中结合和消除或减少TGF-β从而破坏肿瘤免疫耐受并刺激抗肿瘤免疫的其它TGF-β多肽拮抗剂。例如包括抗TGF-β抗体或抗体片段、抗TGF-β受体抗体或抗体片段、和可溶性TGF-β拮抗剂多肽。
本文提供了在肿瘤微环境中、在肿瘤中、特别是在肿瘤驻留免疫细胞中积累的免疫刺激细菌，其含有编码TGF-β多肽拮抗剂的质粒，包括例如TGF-β结合诱饵受体(TGF-β受体诱饵)，抗TGF-β抗体或抗体片段，抗TGF-β受体抗体或抗体片段，和可溶性TGF-β拮抗剂多肽。抗体片段可包括本领域已知的或本文描述的任何抗体片段，例如但不限于scFv和scFv-Fc。
b.双特异性scFvs和T细胞衔接器(engager)
通过增加与靶结合的效价改良scFv的使用，通常通过使用由长接头连接在一起的一个或多个scFv片段(双特异性、三特异性等)。双特异性T细胞衔接器(以商标销售)构建体是一类用于癌症免疫治疗的人工双特异性单克隆抗体，通过连接两个单链可变片段(scFv)形成，由此一个scFv结合细胞毒性T细胞表面的CD3，另一个scFv结合特异性肿瘤相关抗原。因此，/>独立于MHCI类或共刺激分子将T细胞靶向肿瘤细胞，刺激T细胞活化、细胞因子产生和肿瘤细胞细胞毒性。双特异性T细胞衔接器/>的两个实例已获得FDA批准，包括针对肿瘤抗原EpCAM和CD3的卡妥索单抗(catumaxomab)，用于治疗恶性腹水，以及针对CD19和CD3的/>抗体贝林妥欧单抗(blinatumomab)，用于治疗复发性难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)(见例如Ahamadi-Fesharaki et al.(2019)Mol.Ther.Oncolytics14:38-56)。其它/>靶向其它抗原，包括癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、EGFR、EphA2、HER2/neu、ADAM17/TACE、前列腺干细胞抗原(PSCA)、δ样配体3(DDL3)和黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。如本文所示例的，/>抗体也可以在通过免疫刺激细菌递送后从质粒表达。
c.抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4抗体
i.抗-PD-1/抗-PD-L1抗体
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种免疫抑制受体，参与免疫应答的负调节。其同源配体程序性死亡配体1(PD-L1)在抗原呈递细胞(APC)上表达，与T细胞上的PD-1结合后导致CD8+T细胞效应功能丧失，诱导T细胞耐受性。在某些人体癌症中，PD-L1的表达通常与肿瘤侵袭性和降低的存活率有关(见例如Gao et al.(2009)Clin.Cancer Res.15(3):971-979)。
旨在阻断免疫检查点的抗体，例如抗PD-1(例如，派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab))和抗PD-L1(例如，阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)和度伐利尤单(durvalumab))抗体，可以防止T细胞无反应性和破坏免疫耐受。然而，只有一小部分接受治疗的患者表现出临床益处，而那些确实表现出临床益处的患者通常会出现与自身免疫相关的毒性(见例如Ribas(2015)N.Engl.J.Med.373(16):1490-1492；和Topalian et al.(2012)N.Engl.J.Med.366(26):2443-2454)。除了获得毒性外，抗PD-1/抗PD-L1治疗通常会导致耐药性，同时使用抗CTLA-4抗体(例如，易普利姆玛(ipilimumab))在临床试验中显示出有限的成功，具有显着的附加毒性。为了限制毒性和增强PD-1/PD-L1阻断的效力，含有编码抗体或抗体片段例如scFv或scFv-Fc的质粒的免疫刺激细菌以及本领域已知或本文描述的针对PD-1或PD-L1的其它制剂，将协同激活免疫细胞以增强抗肿瘤免疫。
ii.抗-CTLA-4抗体
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152(分化簇152)，是另一种免疫抑制受体，可作为免疫检查点，并下调免疫应答。CTLA-4在调节性T细胞(Tregs或Tregs)中组成型表达，并有助于其抑制功能，但仅在激活后在常规T细胞中上调。CTLA-4通过将抑制信号传递给T细胞发挥免疫检查点的作用。CTLA-4与T细胞共刺激蛋白CD28同源，这两种分子均与CD80(也称为B7-1或B7.1)和CD86(也称为B7-2或B7.2)配体在抗原呈递细胞(APC)上结合。CTLA-4与配体的结合将抑制信号传递给T细胞，而CD28的结合传递刺激信号。
T细胞活化后，CTLA-4受体被诱导，然后与T细胞上的CD28受体竞争结合APC表面上的CD80和CD86配体。CTLA-4以比CD28更高的亲和性和亲和力与CD80和CD86结合，从而使其在与配体结合方面胜过CD28。从而使其对于配体上胜过CD28，从而将抑制信号传递给T细胞，并产生免疫抑制反应。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4表达增加。
最佳T细胞启动需要T细胞CD28与CD80和/或CD86连接产生的共刺激信号。因此，阻断CTLA-4与这些配体的结合增强了T细胞启动，并允许诱导抗肿瘤免疫应答。
在一些实施方案中，本文提供的免疫刺激细菌菌株含有编码抗-CTLA-4抗体的质粒，包括其片段，例如但不限于抗-CTLA-4scFvs(见例如共同未决PCT申请国际申请号PCT/US2020/060307关于示例的人抗-CTLA-4scFv和scFv-Fc片段的序列；也参见实施例25)。
d.其它示例的检查点靶
针对其可以制备或示例的scFv或任何其它重组抗体片段的示例免疫检查点靶，包括但不限于下表中列出的那些：
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4.免疫调节蛋白的组合可以具有协同效应和/或互补效应
细胞因子是抗肿瘤免疫应答的强力调节剂。已知细胞因子组合对涉及T细胞、NK细胞和骨髓细胞(包括树突状细胞和巨噬细胞)的不同免疫区室具有深远的协同效应。已知细胞因子在树突状细胞的抗原引发、先天免疫细胞和抗原特异性T细胞的存活和增殖以及NK细胞和T细胞的细胞毒活性中起主要作用。必须正确选择细胞因子组合，以最大限度地提高生物反应并增强抗肿瘤免疫性。例如，在小鼠肝炎模型中，发现单独的IFN-α可增强病毒感染细胞的CD8+T细胞的细胞溶解功能，而单独的IL-15可增强活化淋巴细胞的增殖。它们一起最大程度地抑制了乙型肝炎(HBV)感染(见例如Di Scala et al.(2016)J.Virol.90(19):8563-8574)。在另一个实施例中，细胞因子的组合IL-15+IL-18和IL-15+IL-21能增强人NK细胞和T细胞产生IFN-γ(见例如Strengell et al.(2003)J.Immunol.170(11):5464-5469)。在另一个实例中，IL-2+IL-18协同作用以增强IFN-γ的产生并增加CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK淋巴细胞的细胞溶解功能(见例如Son et al.(2001)Cancer Res.61(3):884-888)。此外，发现IL-12和IL-18可协同促进人T细胞以抗原-CD3T细胞连接非依赖形式产生IFN-γ(见例如Tominaga et al.(2000)Int.Immunol.12(2):151-160)。细胞因子的组合是T细胞功能的强力增强剂，但FDA批准的抗癌细胞因子毒性太大，不能全身给药，因此很少使用，全身施用的细胞因子组合只会增加毒性(见例如Conlon et al.(2019)J.InterferonCytokine Res.39(1):6-21)。
本文提供的免疫刺激细菌解决了这些问题。提供了含有编码多种治疗产物例如免疫调节蛋白的质粒的免疫刺激细菌，其允许肿瘤特异性递送细胞因子组合和/或与其它治疗产物的组合，例如本文讨论的I型干扰素诱导剂等，包括共刺激分子、趋化因子和抗体及其片段。这些免疫刺激细菌实现了强力和协同的免疫激活作用，而没有与直接IV施用细胞因子和其它治疗产物相关的全身毒性和药代动力学(PK)倾向。
可以在本文提供的免疫刺激细菌中在质粒上编码的治疗产物的组合包括但不限于例如两种或更多种细胞因子；一种或多种细胞因子和I型IFN的诱导剂(例如，STING、IRF3、IRF7、MDA5、RIG-I及其组成型活性GOF变体)和/或共刺激分子(例如，4-1BBL和4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体和一种或多种细胞因子；TGF-β诱饵受体和I型IFN诱导剂；TGF-β诱饵受体，一种或多种细胞因子，和/或I型IFN诱导剂，和/或共刺激分子；抗体(例如，针对免疫检查点如CTLA-4)和一种或多种细胞因子；抗体和I型IFN诱导剂；抗体、一种或多种细胞因子和/或I型干扰素诱导剂和/或共刺激分子；共刺激分子激动剂(例如CD40激动剂)和一种或多种细胞因子；共刺激分子激动剂和I型IFN的诱导剂；以及共刺激分子激动剂，一种或多种细胞因子，和/或I型IFN的诱导剂，和/或共刺激分子。
如下文所讨论的，多治疗产物表达盒可以包括单启动子构建体和/或双重/多重启动子构建体，以及转录后调节元件，和其它调节元件，例如增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、信号肽等。可以对核酸序列进行密码子优化以增加蛋白质表达，并且通常在真核启动子的控制下。特定构建体及其细节在本文别处描述。
本文提供的免疫刺激细菌包括含有质粒的那些细菌，所述质粒编码免疫刺激蛋白(例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子)、和/或具有增加肿瘤微环境中的免疫应答的功能获得突变的基因产物(例如诱导I型IFN的胞质DNA/RNA传感器)，和/或其抗体及其片段，和/或增强抗肿瘤反应的其它治疗产物，例如TGF-β和/或IL-6诱饵受体，和/或TGF-β拮抗多肽。这些编码细胞因子、功能获得产物/I型IFN途径蛋白和/或趋化因子和/或共刺激分子和/或抗体及其片段例如单链抗体及其它本文讨论的治疗产物的免疫刺激细菌，包括优先侵润肿瘤微环境、肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞的免疫刺激细菌。所述免疫刺激细菌还包括基因组被修饰的那些细菌，从而其在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡，由此所述免疫刺激细菌在肿瘤驻留骨髓细胞中积累，以实现在靶细胞中多重遗传有效载荷的高水平异位表达，并将治疗产物/免疫调节蛋白递送至肿瘤微环境(TME)，以激发针对肿瘤的免疫应答。具体而言，本文提供的免疫刺激细菌包括多达约8种或8种如本文所述的修饰，包括但不限于腺苷营养缺陷型、csgD-、pagP-、msbB-、鞭毛蛋白-(fliC-/fljB-)、purI-、ansB-、asd-和本文所述或已知的任何其它修饰，以改善靶向肿瘤微环境和/或肿瘤驻留骨髓细胞或积累于之中，或改善安全性和耐受性(允许更高剂量)，降低免疫抑制细胞因子谱，改善T细胞质量和功能，限制在健康组织中的复制，消除生物膜和改善抗肿瘤免疫应答，或赋予本文其它地方讨论的任何希望的和有利的性质。
所述免疫刺激细菌还可以编码其它治疗产物，例如来自受试者肿瘤的肿瘤抗原，以增强对特定肿瘤的反应。本文提供的和上下文描述的任何免疫刺激细菌均可以被修饰以编码治疗产物，例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子和功能获得I型IFN途径产物。所述治疗产物在宿主识别的启动子和真核生物如人或其它动物或哺乳动物受试者中识别的任何其它所需调节序列的控制下在质粒上编码。通常，编码产物的核酸处于RNA聚合酶II启动子的控制之下。此外，本文所述用于修饰的任何细菌，例如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、双歧杆菌属(Bifidobacteriae)、立克次氏体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、李斯特菌属(Listeria)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、博德特氏菌属(Bordetella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、气单胞菌属(Aeromonas)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、霍乱菌属(Cholera)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、布鲁氏菌属(Brucella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、军团菌属(Legionella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和丹毒丝菌属(Erysipelothrix)，或其减毒菌株或其修饰菌株，均可以通过在细菌中引入含有或在质粒上编码在宿主识别的RNA聚合酶启动子控制下编码治疗产物的核酸的质粒来修饰。治疗产物在受感染受试者的细胞中表达。免疫刺激细菌包括如本文所述被修饰以在肿瘤、TME和/或肿瘤驻留骨髓细胞中积聚或优先感染的那些细菌。例如，编码导致I型干扰素(IFN)例如IFN-β和/或本文讨论的其它治疗产物表达或组成型表达的功能获得产物的免疫刺激细菌，进一步被修饰为具有降低的感染上皮细胞的能力或没有这个能力，但能够感染吞噬细胞，包括肿瘤驻留免疫细胞，和/或所述免疫刺激细菌被修饰以使其不杀死受感染的吞噬细胞。
如本文所述，参与SPI-1途径的基因和鞭毛激活吞噬细胞(免疫细胞)中的炎性体，引发细胞焦亡。敲除SPI-1基因和编码鞭毛的基因，减少或消除了吞噬细胞的焦亡，同时消除上皮细胞的感染，导致吞噬细胞的感染增加。提供了在吞噬细胞中积累的免疫刺激细菌，特别是肿瘤驻留免疫细胞，例如髓源抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和树突状细胞(DC)，其中它们表达在真核启动子控制下在质粒上编码的遗传有效载荷/治疗产物，例如由RNA聚合酶II识别的那些启动子，并包括如本文所讨论的其它真核调节信号。表达的治疗产物包括那些引起免疫应答的产物，例如通过增加或诱导I型干扰素的途径，从而增加肿瘤微环境中的宿主反应。所述免疫刺激细菌还可以编码免疫刺激蛋白，例如IL-2和/或其它细胞因子，和/或其它免疫刺激蛋白和治疗产物，如本文所讨论的，进一步增强肿瘤微环境中的免疫应答。
所述免疫刺激细菌可以编码产物，称为胞质DNA/RNA传感器，当暴露于细胞胞质中的核酸(例如RNA、DNA、核苷酸、二核苷酸、环核苷酸、环二核苷酸和其它这种分子)时会引发免疫应答。本文中的免疫刺激细菌编码组成型引起免疫应答的修饰的治疗产物，并且不需要在胞质中存在DNA/RNA。这样的示例是诱导I型干扰素表达的途径的组分。本文考虑的治疗产物包括这些胞质DNA/RNA传感器的修饰形式，其具有组成型活性或增加的活性(即功能获得产物)，使得I型干扰素在细胞胞质中不存在核苷酸、二核苷酸、环状核苷酸、环状二核苷酸和其它这种配体的情况下表达或产生。这些修饰产物在细胞中的表达，特别是在肿瘤细胞、包括肿瘤驻留免疫细胞中的表达，导致I型干扰素、包括干扰素-β在肿瘤微环境中的组成型表达。由于表达这些功能获得性产物的免疫刺激细菌在肿瘤细胞/TME/肿瘤驻留免疫细胞中积累或优先感染，因此所述治疗产物在肿瘤微环境中表达，导致肿瘤微环境中的免疫应答增加。
可以在免疫刺激细菌和其它载体中编码的示例基因产物包括但不限于感知或参与识别胞质DNA/RNA并激活I型干扰素产生的先天途径的蛋白质。参与先天DNA/RNA识别并激活I型干扰素的蛋白质包括但不限于：STING，RIG-I，MDA5，IRF3，IRF7，TRIM56，RIP1/RIPK1，Sec5/EXOC2，TRAF2，TRAF3，TRAF6，STAT1，LGP2/DHX58，DDX3/DDX3X，DHX9/DDX9，DDX1，DDX21，DHX15/DDX15，DHX33/DDX33，DHX36/DDX36，DDX60和SNRNP200。导致组成型I型干扰素表达的任何这些蛋白质中的功能获得性突变是已知的或可以被鉴定的，并且可以通过免疫刺激细菌将突变体递送到肿瘤微环境，例如通过感染吞噬细胞或通过靶向和结合肿瘤细胞而递送。
功能获得性突变包括从患有由组成型I型干扰素表达引起的疾病的个体中鉴定的突变。功能获得性产物的示例是出现在患有干扰素病的受试者中的那些产物。如上所述，突变可以通过筛选来鉴定，也可以产生功能获得性产物。
可以进一步修饰编码治疗产物的核酸以改善表达性质。修饰包括例如密码子优化以提高在哺乳动物、特别是人受试者中的转录效力，例如降低GC含量或CpG二核苷酸含量，去除隐蔽剪接位点，添加或去除(通常去除)CpG岛以改善在真核细胞中表达，置换Shine-Dalgarno(SD)序列，并置换TATA盒和/或末端信号以提高转录效力。可以通过改变密码子使用偏差、降低GC含量、减少mRNA二级结构、去除过早的PolyA位点、去除RNA不稳定性基序(ARE)、降低mRNA的稳定自由能、修改内部chi位点和核糖体结合位点及减少RNA二级结构来优化密码子以提高翻译效力。用于改善表达以及维持或增强细菌适应性的其它修饰已被掺入所述免疫刺激细菌中。这些修饰在以下部分中进行了描述，并在以下工作实施例中进行了详细描述和举例说明。
如上所述，由宿主识别胞质核酸(例如单链和双链RNA、环二核苷酸(CDN)和其它这种形式的核酸)介导的I型干扰素诱导途径诱导I型IFN。还存在Toll样受体(TLR)非依赖性I型IFN途径，由宿主识别胞质中的单链(ss)和双链(ds)RNA介导。这些由RNA解旋酶感知，包括视黄酸诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)，以及通过IFN-β启动子刺激物1(IPS-1)衔接器介导的磷酸化IRF3转录因子，导致IFN-β的诱导(见例如Ireton andGale(2011)Viruses 3(6):906-919)。如本文所讨论的，这些途径中的蛋白质可以被修饰，或可以作为变体存在，导致I型干扰素(也称为1型干扰素)的组成型表达，所述干扰素包括IFN-α和IFN-β。这种蛋白质的示例是本文提供的修饰的STING多肽，包括本文提供的那些。这些包括具有导致I型干扰素组成型表达的突变从而干扰素在不存在诱导的情况下表达的修饰的STING蛋白，包括修饰的非人STING蛋白和人STING蛋白，以及嵌合的STING蛋白，如其中C末端尾区(CTT)部分被来自第二物种的STING蛋白的CTT部分置换的那些嵌合蛋白，其中第二物种的STING蛋白具有比人STING的NF-κB信号传导活性低的NF-κB信号传导活性，及CTT中的TRAF6结合位点任选被缺失，以及嵌合STING蛋白进一步包括一个或多个功能获得突变。
使用本文提供的免疫刺激细菌的疗法可以与任何其它抗癌疗法组合，包括检查点抑制剂疗法以及如上文和本文其它地方所讨论的其它癌症疗法和化学疗法。
5.激活前药的分子
本文提供的免疫刺激细菌中的质粒可以包括编码分子的核酸，例如酶，所述酶例如通过裂解治疗产物例如前药(包括化疗前药、特别是毒素)的一部分而使其激活，通过酶促裂解激活。结果，无活性的前药可以全身施用，并且是无活性的。质粒编码的激活分子，例如酶，在递送本文提供的免疫刺激细菌后在肿瘤微环境中表达，从而使无活性的前药在肿瘤微环境中被激活，从而发挥其抗肿瘤作用。这种前药有很多实例，包括某些核苷和毒素缀合物。许多这样的前药和酶是已知的(见例如Malekshah et al.,(2016)Curr.Pharmacol.Rep.2:299-308)。这些包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、oxazaphosorines、铂类药物和酶如脱氨酶、硝基还原酶、磷酸化酶、细胞色素P450酶等的前药。
6.递送组合疗法的免疫刺激细菌
本文的免疫刺激细菌可用于提供一种以上的治疗产物，特别是那些用于抗癌治疗的产物。一般来说，这些产物是增强和重新编程抗肿瘤免疫应答的互补产物。所述免疫刺激细菌，凭借本文所述的基因组修饰，特别是asd-、鞭毛蛋白-(如fliC-/fljB-)、pagP-、csgD-、purI-、腺苷营养缺陷、msbB-、ansB-中的几种或全部的组合以及本文别处描述的或本领域技术人员已知的任何其它修饰，积累在肿瘤微环境(TME)中并感染肿瘤驻留免疫细胞(骨髓细胞)。所述免疫刺激细菌含有在宿主识别的一个或多个启动子以及在真核生物如人或其它动物或哺乳动物受试者中识别的任何其它所需调节序列的控制下编码互补治疗产物的质粒，以实现编码产物的表达以及所述产物的分泌。所述免疫刺激细菌积累在TME、特别是在肿瘤驻留免疫细胞中，包括髓源抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和树突状细胞(DC)，其中编码的治疗产物被表达，然后分泌到肿瘤微环境中，达到抗肿瘤作用。通过产物的适当组合，可以通过各种产物与宿主免疫系统的相互作用来增强抗肿瘤作用。
如本文别处所讨论的，含有编码治疗产物的质粒、具有单个启动子和开放阅读框(ORF)的免疫刺激细菌可以通过使用帽非依赖性病毒内部核糖体进入位点(IRES)或通过2A肽(例如T2A、P2A、E2A或F2A)的翻译通读，以及随后自我切割成同等表达的辅蛋白而表达两种(或多种)蛋白质。或者，可以使用双重或多重启动子构建体表达遗传有效载荷/治疗产物，其中每种蛋白质在单独启动子的控制下表达。质粒上也可以包括单个和双重/多重启动子构建体的组合，以表达三种或更多种蛋白质。通常，编码治疗产物的核酸处于RNA聚合酶II启动子的控制之下。例如，启动子包括但不限于EF-1α、CMV、SV40、UBC、CBA、PGK、GUSB、GAPDH、EIF41A、CAG、CD68和合成MND启动子。质粒可以含有在本文别处描述或本领域技术人员已知的其它调节元件，例如转录后调节元件(PREs；例如，WPRE、HPRE)、多聚腺苷酸化信号序列、终止子、增强子、分泌信号(也称为信号肽/序列、前导肽/序列)、DNA核靶向序列(DTS)和其它调节元件，其可以增强或增加编码的治疗产物的表达和/或分泌。
质粒上编码的遗传有效载荷或治疗产物包括免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子和共刺激分子；诱导I型IFN及其功能获得/组成型活性突变体的胞质DNA/RNA传感器；抗体及其片段；双特异性T细胞衔接器可溶性TGF-β受体，用作结合TGF-β的诱饵或TGF-β拮抗多肽；IL-6结合诱饵受体；干扰RNA(例如siRNA、shRNA、miRNA)；以及下文和本文其它地方讨论的以及本领域已知的其它治疗产物；以及所有前述治疗产物的互补组合。在一些实施方案中，细胞因子可以在免疫刺激细菌内的质粒上编码，具有膜锚定基序，例如跨膜结构域和胶原蛋白结合结构域。
可在质粒上编码的免疫刺激蛋白，包括细胞因子，趋化因子和共刺激分子，包括但不限于IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，干扰素-α，干扰素-β，与IL-2结合减弱的IL-2Ra，经修饰不与IL-2Ra结合的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CCL3，CCL4，CCL5，参与或影响或增强T细胞募集和/或持久性的蛋白质，CD40，CD40配体(CD40L)，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，具有胞质结构域缺失的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，ICOS，CD27，B7-CD28家族成员和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。免疫刺激蛋白还包括截短的共刺激分子，例如4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1和OX40L，具有在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域缺失，其中截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失的胞质结构域而不能向APC发出反调节信号。
诱导或激活I型IFN产生的胞质DNA/RNA传感器包括但不限于STING、RIG-I、MDA5、IRF3、IRF5和IRF7，以及其功能获得(GOF)或组成型活性变体。其它参与识别激活I型IFN反应的DNA/RNA的蛋白质，可以被突变以产生I型IFN组成型表达并可以在质粒上编码，包括但不限于TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF2、TRAF3、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
可在由本文的免疫刺激细菌递送的质粒上编码或可与所述细菌共同施用的增强或增加抗肿瘤反应的其它治疗产物包括但不限于抗体及其片段，例如TGF-β抑制性抗体；抗IL-6抗体；针对检查点抑制剂的抗体，例如PD-1、PD-L1和CTLA-4；以及针对VEGF、CD73、CD38、Siglec-15、EGFR、Her2、间皮素和BCMA的抗体或抑制剂。还涵盖在质粒上表达或与本文的免疫刺激细菌共同施用的是双特异性T细胞衔接器IL-6结合诱饵受体、TGF-β结合诱饵受体和TGF-β多肽拮抗剂。任何这些抗体、抑制剂或诱饵受体均可以与本文的免疫刺激细菌共同施用。在一些实施方案中，PARP(聚(ADP)-核糖聚合酶)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂和/或化学疗法也可以与上面列出的任何治疗产物单独或以任何组合共同施用。
可以在本文的免疫刺激细菌中在质粒上编码的治疗产物的互补组合的示例包括但不限于：
IL-2和IL-12p70；IL-2和IL-21；IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；IL-2，IL-21，和STING GOF变体；IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；IL-15/IL-15Rα，和IL-21；IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及IL-15/IL-15Rα，IL-21，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；IL-12p70，IL-21和STING GOF变体；IL-12p70，IL-21，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和STING GOF变体；IL-12p70，STING GOF变体，和及4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；IL-12p70和IL-18；IL-12p70，IL-18和STING GOF变体；及IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-21；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，和STINGGOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体和IL-12p70；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-18；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STINGGOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，及IL-18；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；CD40激动剂，IL-2，和IL-21；CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STINGGOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂和IL-12p70；CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，STINGGOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；及CD40激动剂和STING GOF变体。
下表列出了可在免疫刺激细菌中的质粒中编码的示例产物，以及这种产物的一些作用/特征，包括在实施例中讨论和证明的IL-15或IL-15复合物组合的协同效应。
*DC＝树突状细胞
在上述任何互补组合中，TGF-β诱饵受体可以用TGF-β拮抗多肽置换。如上所述，TGF-β诱饵受体是充当结合TGF-β以去除其的诱饵的任何受体，或者是TGF-β拮抗多肽(例如，抗TGF-β抗体或抗体片段，以及抗TGF-β受体抗体或抗体片段)。STING蛋白或其它诱导或激活I型IFN产生的DNA/RNA传感器可以是GOF/组成型活性变体，或可以是野生型蛋白质，包括本文描述和提供的修饰的STING多肽和嵌合STING多肽。上述任何互补组合也可以与以下任何一种或多种制剂组合施用：抗PD-1抗体，抗CTLA-4抗体，抗PD-L1抗体，抗IL-6抗体，抗Siglec-15抗体，抗VEGF抗体，抗CD73抗体，抗CD38抗体，抗EGFR抗体，抗Her2抗体，抗间皮素抗体，抗BCMA抗体，及其抗体片段，以及PARP抑制剂，HDAC抑制剂，或化学疗法，以及其组合。
本文提供的质粒和免疫刺激细菌编码治疗有效载荷的组合。这些包括编码任何或所有上表所列产物的核酸组合。评估了互补有效载荷的组合，示例的组合及其效力在实施例中进行描述。评估了各种有效载荷组合对抗原特异性T细胞活化和骨髓细胞分泌CXCL10(参与抗肿瘤T细胞募集的关键趋化因子)的影响。例如，有效载荷组合可以诱导骨髓树突状细胞(BMDC)强力分泌CXCL10。将IL-36γ与IL-12p70和STING R284G tazCTT组合导致BMDC分泌更高的CXCL10和IFN-γ。许多组合诱导CD8+T细胞应答的激活(例如，4-1BB表达)和IFN-γ的分泌。特定的细胞因子组合可以激活T细胞。例如以下组合：IL-12p70+IL-15；IL-12p70+IL-15+IFN-α2；IL-12p70+IL-15+抗4-1BB激动抗体；IL-12p70+IL-15+IL-36γ；IL-12p70+IL-15+IL-21；IL-12p70+IL-21+IL-36γ；IL-12p70+IL-36γ+IFN-α2；IL-12p70+IL-36γ+抗4-1BB激动抗体；IL-15+IL-36γ+IFN-α2；和IL-15+IL-36γ+抗4-1BB激动抗体，导致T细胞分泌高水平的IFN-γ，但相对较低水平的IL-6水平，使其成为最佳T细胞活化的理想组合，用于在肿瘤微环境中诱导抗肿瘤免疫。
此外，对于CD4+和CD8+T细胞，在有或没有抗CD3ε激动抗体刺激TCR的情况下，细胞因子(IL-15/IL-15Rα链复合物x、IL-12、IL-12p70、IL-15、IL-21和IL-36γ)和4-1BB参与的几种组合激活T细胞以分泌高水平的IFN-γ。本文所述的STING变体以及IL-12可以增加人CD8+T细胞的抗原特异性活化。数据还显示，在小鼠(mu)结肠直肠癌模型中，表达IL-15或4-1BBLΔcyt+IL-12组合的免疫刺激菌株比单独表达4-1BBL(Δcyt)或IL-12的相同菌株更强力抑制肿瘤生长抑制作用，并导致高完全反应率(50％治愈率)。还测试了其它组合并显示在体内具有强力的抗肿瘤活性。
有效载荷的组合可以包括共刺激分子，例如OX40L多肽，或4-1BBL多肽，或其胞质缺失或截短变体之一，和/或其在本文中描述和举例说明的修饰形式；或抗-免疫检查点抗体或其片段，例如抗-CTLA-4scFv-Fc或抗-CTLA-4scFv(分别见实施例25和SEQ ID NO:428和429)；一种或多种细胞因子/趋化因子，如IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、IFN-β、IFN-α2和CXCL10；TGF-β结合诱饵受体及其它TGF-β多肽拮抗剂，例如与人IgGl Fc融合的人可溶性TGFβ受体II(hu sTGFβRII-Fc；SEQ ID NO:437)，抗TGF-β抗体或抗体片段，抗TGF-β受体抗体或抗体片段，和可溶性TGF-β拮抗剂多肽；和一种或多种STING蛋白或修饰的和/或嵌合的STING蛋白，如本文所述和举例说明的。
有效载荷/产物/多肽可以编码为多顺反子构建体，在单个启动子(即，单一启动子系统)和根据需要的其它调节序列的控制下，并且还可以包括2A多肽或其它导致各个产物翻译的这种多肽。所述有效载荷也可以在含有两个单独的开放阅读框(ORF)的质粒上表达，每个开放阅读框在不同启动子的控制下(即双重启动子系统)。下表列出了以其在质粒上编码的顺序并且包括在多顺反子构建体中编码的2A肽的示例性有效荷载组合。该表包括2A多肽，但可以是取代物和/或产物的其它此类多肽可以单独编码。
示例的产物组合和示例的质粒上的顺序
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*4-1BBL＝具有胞质截短和残基修饰的修饰的4-1BBL，以使剩余的胞质结构域更积极保持相对于细胞膜的正确方向。
**嵌合STING＝具有袋獾CTT和R284G/N154S置换的STING。
sTGFβRIIFc#＝II型受体β聚糖
可以考虑其它产物的组合是的(见上述讨论和实施例)。其它感兴趣的此类组合包括任何经修饰的STING蛋白和细胞因子，如嵌合STING，如与袋獾CTT的人嵌合体，特别是具有一个或多个功能增益突变如N154S/R284G。本文讨论的互补组合可以提供协同结果。例如，实施例中所示的嵌合STING多肽和IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15Rα-IL-15sc)的组合可协同作用，以提高抗肿瘤效果。
可以选择本文提供的免疫刺激细菌的性质以覆盖癌症免疫周期，例如在肿瘤驻留骨髓细胞和TME中的积累，以及可以表达的产物/有效载荷的组合。所述周期中的每个步骤，以及免疫刺激细菌和有效载荷的作用总结如下：
1)癌细胞抗原的释放---所述免疫刺激细菌在肿瘤驻留骨髓细胞中积累；
2)癌症抗原呈递---本文提供的免疫刺激细菌编码和表达免疫刺激物，例如STING多肽及其变体和IL-12，导致I型干扰素包括IFN-α和IFN-β的表达；
3)启动和激活---所述免疫刺激细菌编码STING多肽及其变体，以及共刺激蛋白，例如4-1BBL和IL-12；
4)将T细胞运输到肿瘤---表达编码的STING变体，导致由此IFN-α和IFN-β表达；
5)T细胞浸润到肿瘤---血管渗漏和免疫抑制性骨髓细胞的复极化；
6)T细胞识别癌细胞---I型IFN和IFNγ，并上调MHC；和
7)杀死癌细胞---编码的细胞因子/趋化因子组合，例如IL-12、IL-15、IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15Rα-IL-15sc)、IL-21和/或IL-36γ，其诱导T细胞增殖和IFN-γ的释放，以及可溶性TGF-β诱饵受体的表达。
基于本文的公开内容和他们的知识，本领域技术人员可以鉴定在多顺反子构建体上编码的其它产物有效载荷组合和产物的其它顺序，其具有免疫激活和/或免疫抑制作用以增强本文提供的免疫刺激细菌的抗肿瘤活性。
E.免疫刺激细菌作为抗病毒治疗剂和针对其它感染性病原体的治疗剂
宿主免疫应答的免疫抑制在许多感染性疾病中起作用，特别是在持续的病毒感染以及肿瘤免疫抑制中。在持续性感染中，病毒保留在受感染者的特定细胞中。有几种类型的持续性病毒-宿主相互作用：潜伏感染、慢性感染和缓慢感染。在潜伏感染中，在复发性疾病发作之间没有可检测到的感染性病毒；在慢性感染中，原发感染后有感染性病毒持续存在，并有慢性或复发性疾病。缓慢感染的特点是潜伏期较长，随后是进展性疾病。在持续感染期间，病毒基因组可以稳定地整合到细胞DNA中，或者可以游离型存在。许多病毒和感染性病原体都会发生持续感染，包括但不限于人T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、麻疹病毒、乳多空病毒、朊病毒、肝炎病毒(包括甲、乙、丙、丁、戊型)、腺病毒、副病毒、冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、轮状病毒、黄热病病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和乳头瘤病毒。
细菌已被用作疫苗和其它抗病原体疗法的递送载体，并已被用作疫苗以引起对细菌载体的外来的肽的免疫应答。例如，含有VEGFR2编码质粒的伤寒沙门氏菌TY21a菌株在人体内可诱导VEGFR2特异性T细胞应答(见例如Schmitz-Winnenthal et al.(2016)Journalof Clinical Oncology34(15_suppl):3091-3091，DOI:10.1200/JCO.2016.34.15_suppl.3091)。然而，之前使用细菌作为疫苗载体的方法在临床上的成功率有限。FDA批准的基于细菌的疫苗仅用于对抗其它细菌性疾病，并没有有效地诱导人的抗肿瘤或抗病毒免疫力。正如本文所讨论的，本文提供的免疫刺激性细菌解决了这些问题。
抗病毒疫苗发挥作用的一种方式是递送抗原，诱发特异于包膜病毒表面糖蛋白的抗体，或特异于非包膜病毒的衣壳蛋白的抗体。抗体是适应性免疫的主要元素，它被设计为预先存在于保护性水平，并在再次接触病毒病原体时被呈递或诱导。预先存在的抗体以先天免疫的速度发挥作用，但具有更多的特异性、更高的亲合力和靶向功能性。免疫的一个免疫学目标是诱导出持久的保护性抗体应答。保护性抗体应答通常在其中和并抑制感染时效果最好。中和作用可以通过三种主要机制发生。第一种机制是病毒的聚集或固定化，通过阻止病毒到达靶细胞来减少感染性接种物。第二种机制是抗体通过阻断受体结合域而直接阻断病毒附着于靶细胞。第三种机制，中和可以在病毒附着于靶细胞后发生，通过阻止病毒进入细胞或通过融合抑制使病毒脱壳而实现。中和抗体需要识别其原生状态的低聚表面蛋白，或在融合过程完成前可能暂时存在的中间形式。这些表位一般是构象表位，而且往往是四级构象表位，在病毒蛋白的单体形式上不常出现。
尽管抗体被认为是疫苗诱导的保护性免疫的主要机制，但病毒特异性CD8+T细胞应答对于控制病毒感染和限制疾病的严重程度也很重要(见例如Graham(2013)Immunol.Rev.255(1):230-242)。抗体介导的效应机制是为了预防感染；CD8+T细胞介导的效应机制是为了识别和清除病毒感染的细胞。由于本文提供的免疫刺激细菌感染骨髓细胞，因此免疫刺激细菌可以增强抗原对T细胞的呈递，诱发T细胞介导的应答。抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是CD8+T细胞的一个亚组，通过与抗原的相互作用而被激活，这些抗原在细胞表面与主要组织相容性复合体I类(MHC I)复合呈递，这是哺乳动物细胞的胞质蛋白的呈递途径。抗原由细菌病原体合成，或细菌疫苗将抗原释放到细胞质中，引起CTL的细胞免疫应答。在这种激活之后，CTL针对显示与MHC I复合的相关抗原肽的感染细胞。抗原也可以由APC(抗原呈递细胞)上的MHC II类分子直接呈递给CD4+辅助细胞，这可以促进B细胞产生抗体。
先前的细菌疫苗和抗病原体策略的一个局限性是其依赖细菌感知途径作为佐剂，如本文所述，这并不能导致强大的适应性抗病毒或抗肿瘤免疫性。本文提供的免疫刺激细菌解决了这些限制。本文提供的免疫刺激细菌在强大的病毒感知免疫途径的背景下供给异源蛋白、包括病毒抗原和其它抗病毒治疗剂的引发，从而导致有效的抗病毒疫苗接种，以及抗肿瘤治疗。正如本文所详述的，本文提供的免疫刺激细菌缺乏许多细菌TLR感知途径，并消除了对先天性抗菌应答的免疫倾斜，同时保留了抗病毒的途径。在病毒感染期间，以及在患有癌症的受试者中，包括toll样受体(TLR)、视黄酸诱导基因-I(RIG-I)样受体(RLR)和细胞质DNA传感器等的先天免疫信号传导途径被激活以合成抗病毒分子，如I型干扰素(IFN)和促炎细胞因子。本文提供的免疫刺激细菌被设计为通过基因组修饰以及编码的治疗荷载如STING蛋白和修饰的STING蛋白、细胞因子和趋化因子来刺激此类途径。
本文提供的免疫刺激细菌通过基因组修饰以及任选编码的治疗产物，可以有利地指导宿主自然地抗病毒免疫应答。如所讨论的，本文提供的免疫刺激细菌感染骨髓细胞以递送编码的抗病原体治疗产物，如抗原、抗体和其它编码的治疗药物，并可编码额外的产物如免疫刺激蛋白，以增强宿主的免疫应答。因此，所述免疫刺激细菌可以提供对病原体的各种攻击。
本文提供的免疫刺激细菌，在患有肿瘤的受试者中，会在肿瘤驻留的免疫细胞中积累。在没有肿瘤的受试者中，这些细菌主要或仅感染吞噬性抗原提呈细胞(APC)，这些细胞非常能够转移可被真核细胞装置读取的质粒，并在其自然环境中产生蛋白质。所述质粒编码单个或多种异源蛋白，包括例如病毒抗原和其它抗病毒治疗剂，而且还可以编码单个或多种免疫有效载荷，诱导抗病毒免疫感知途径。其结果是适当的APC激活和抗原引发T细胞，导致持久的体液和细胞抗病毒免疫性，甚至在其中抑制的骨髓细胞阻止适应性免疫的慢性感染环境中。
因此，本文提供的是免疫刺激细菌，其递送蛋白质抗原和抗体，以及其它治疗剂，用于针对病原体进行接种，或用于治疗由此产生的感染，包括持续的病毒感染。所述病原体包括细菌、原生动物、病毒和朊病毒，以及其它导致疾病和病症的朊病毒颗粒。在所述免疫刺激细菌中，示例的此类细菌是沙门氏菌的菌株/种，如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。所述免疫刺激细菌可以在细菌或真核生物启动子的控制下编码抗病原体产物。所述启动子可以是组成型的，或者可以是诱导型的。启动子和其它调节序列的选择取决于各种因素，包括特定的产物、产物的表达时间和细菌的用途，例如它们是用于治疗现有的感染，还是用于疫苗接种。这些细菌通常是asd-，可以在质粒上编码asd，以便在宿主细胞感染该细菌时允许复制，而不需要抗生素选择盒。这允许细菌在体内进行复制。作为一种选择，自杀系统可用于将有效载荷(即治疗产物)递送到组织驻留的骨髓细胞。在这种情况下，使用缺乏含有互补的asd基因盒的质粒的asd-菌株在体内给药。在体外，加入二氨基庚二酸(DAP)以促进没有功能性asd基因的细菌复制；这种细菌不能在体内生长。在细菌被吞噬和在细胞内破坏后，一剂细菌核酸被递送到组织驻留的骨髓细胞。
本文提供的免疫刺激细菌，包括沙门氏菌，特异性靶向被感染生物体中的骨髓细胞，包括抗原呈递细胞(APC)。APC可以迁移到淋巴结、脾和肝脏，为淋巴结驻留的T细胞提供表达的抗原呈递。所述细菌可被树突状细胞摄取，然后由MHC I和MHC II表达呈递途径的抗原，并反过来启动特定的T细胞应答。本文提供的免疫刺激细菌在用作疫苗、或编码病毒抗原和/或其它蛋白质以对抗病原体如流感病毒、埃博拉病毒、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2，引起COVID-19)、牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)以及本文所述的和/或本领域技术人员已知的其它物质时，可以利用这些途径。靶标包括蛋白质，如冠状病毒的刺突蛋白(见例如SEQ ID NO:438)和牙龈卟啉单胞菌的牙龈素蛋白酶(见例如SEQ IDNO:442-447)，特别是来自牙龈卟啉单胞菌株ATCC 332277的赖氨酸-牙龈素蛋白酶(Kgp或Lys-牙龈素)(见例如SEQ ID NO:444)，以及来自牙龈卟啉单胞菌的其它菌株、包括菌株83、FDC381和HG66的赖氨酸-牙龈素蛋白酶(分别见例如SEQ ID NO:445-447)。细菌病原体包括例如埃希氏菌(Escherichia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、不动杆菌(Acinetobacter)和假单胞菌(Pseudomonas)的物种，特别是耐药物种和菌株。本领域的技术人员可以很容易地鉴定靶标抗原。对于抗肿瘤的应用，肿瘤抗原(见例如实施例中示例的肿瘤抗原)、蛋白酶、逆转录酶(对于RNA病毒)和DNA聚合酶以及其它复制酶都可以是靶标。示例的致病菌物种包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、粪肠球菌(E.faecalis)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)。
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种新型的β-冠状病毒，是2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行的致病因子。冠状病毒的病毒含有一种自体表面刺突(S)糖蛋白，其与宿主细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合，并通过宿主和病毒膜的融合介导进入。SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2受体的结合引起刺突蛋白较大的构象重排，从亚稳相融合前构象重排为高度稳定的融合后构象，这有利于膜融合。由于其介导细胞的附着和进入，因此刺突(S)蛋白对病毒的生命周期至关重要，是中和抗体的主要靶标，也是一种关键的疫苗抗原(见例如Hsieh et al.(2020)Science369:1501-1505)。
吸引最好或良好的CD8+的SARS-COV2病毒蛋白包括以下内容(见Cohen et al.(2021)Cell.Rep.Med.2:100354)：
刺突蛋白S1亚单位中的受体结合结构域(RBD；见例如SEQ ID NO:440)与ACE2直接相互作用。S蛋白的亚稳相融合前构象可称为“躺下(laying or down)”，而构象重排为ACE2可行的构象可称为“直上(up or standing)”。根据RBD的构象重排来区分“下”和“上”的姿态；从下到上的重排有利于受体的结合，而从上到下的重排则有助于病毒逃避免疫监视(见例如Shah et al.(2020)Computational and Structural Biotechnology Journal 18:3401-3414)。
与ACE2受体的结合随后被跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)裂解。ACE2和TMPRSS2都在呼吸道、肺和鼻/口腔粘膜以及肠道中大量表达。在中国(H49Y)、欧洲(V367F和D614G)和美国(G476S和V483A)已经鉴定了S蛋白的自然发生的突变，并且已经研究了其对SARS-CoV-2进入细胞的影响；在表达ACE2和TMPRSS2的细胞中，G476S突变导致细胞进入减少，V483A突变对细胞进入没有影响，而D614G、V367F和H49Y突变与野生型S蛋白相比导致细胞进入增强。与野生型S蛋白相比，D614G突变显示出高3.5倍的进入活性水平，这种效果在人小气道上皮细胞中也能看到。D614G突变还导致对ACE2受体的结合亲和力增加。此外，D614G突变体保留了SARS-CoV-2病毒的中和敏感性；抗SARS-CoV-2患者的血清能够有效地中和野生型SARS-CoV-2和具有D614G突变的SARS-CoV-2(见例如Ozono et al.(2021)NatureCommunications 12:848)。S蛋白以三聚体形式存在，结构分析表明D614G突变稳定，从而防止S三聚体过早解体(见例如Zhang et al.(2021)Science372:525-530)。与2019年12月首次分离的参考菌株wh-Hu-1相比，V367F突变体还显示出更高的与ACE2的结合亲和力，这可能是由于RBD结构的稳定化所致。还鉴定了同时具有V367F和D614G突变的病毒分离株。系统发生分析表明，V367F突变与D614G突变一起进化，提示感染性增加的协同效应(见例如Ouet al.(2021)bioRvix,doi:10.1101/2020.03.15.991844)。
N501Y突变在英国(B.1.1.7，或20B/501Y.v1)和南非(B.1.351，或20C/501Y.v2)的SARS-CoV-2系中自然出现，并发生在SARS-CoV-2S蛋白RBD上的人ACE2结合点。分子动态刺激显示，SARS-CoV-2S蛋白RBD中的N501位于人ACE2的疏水残基附近；因此，将亲水的N501突变为疏水的残基可以改善S蛋白和人ACE2之间的相互作用。实验筛选表明，N501突变为V、F、W或Y可以增强RBD与人ACE2的结合。这些结果在体外研究中得到了验证，显示N501Y、N501F、N501W和N501V的突变导致刺突蛋白的RBD与人ACE2之间的结合亲和力增强(见例如Luan etal.(2021)FEBS Letters,doi:10.1002/1873-3468.14076)。
SARS-CoV-2S-2P变体刺突蛋白的一个突变体(见例如Hsieh et al.(2020)Science369:1501-1505)，具有脯氨酸取代F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P，被命名为“HexaPro”，与它的亲本构建体相比显示了增加的表达水平和稳定性。HexaPro突变体的高产量和增加的稳定性应该允许亚单位疫苗的工业化生产；它还可以通过每个核酸分子产生更多的抗原来改进基于DNA或mRNA的疫苗，提高疗效和/或减少所需的剂量(见例如Hsieh et al.(2020)Science369:1501-1505)。
SARS-CoV-2刺突蛋白的其它突变，可以增强或改善其表达和/或其与ACE2受体的结合，包括例如V417K(见例如Shah et al.(2020)Computational and StructuralBiotechnology Journal18:3402-3414)；G502D、N501T和Q498Y，以及残基N439/R426、L452/R426、T470/N457、E484/P470、Q498/Y484和N501/T487中的突变(见例如Verkhivker et al.(2021)bioRxiv preprint；doi:10.1101/2021.02.21.432165)；及W436R和D364Y(见例如Ouet al.(2021)bioRvix,doi:10.1101/2020.03.15.991844；和美国专利号10,973,908)。
本文提供的免疫刺激细菌，当用作疫苗或编码病毒抗原和/或其它蛋白质以对抗病原体如严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2，引起COVID-19)时，可以编码全长野生型SARS-CoV-2刺突蛋白(见例如SEQ ID NO:438)，或可以编码SARS-CoV-2刺突蛋白的全长受体结合域(RBD)(见SEQ ID NO:440)，或可以编码刺突蛋白RBD的一部分，足以诱导或引起免疫应答，和/或对受试者进行抗SARS-CoV-2免疫或接种或保护。所述免疫刺激细菌还可以编码SARS-CoV-2刺突蛋白的突变体，其在刺突蛋白或其部分如RBD或其部分中具有突变，增加或增强刺突蛋白或RBD或其一部分的表达，和/或增加或增强刺突蛋白或RBD或其一部分与ACE2受体的结合。所述刺突蛋白或刺突蛋白RBD突变体包括本文描述的和本领域已知的任何突变体，包括但不限于包含突变V367F、D614G、G476S、V483A、H49Y、N501Y、N501F、N501W、N501V、F817P、A892P、A899P。A942P、K986P、V987P、V417K、G502D、N501T、Q498Y、W436R和D364Y的那些突变体，以及包含对应于刺突蛋白或其一部分的残基N439/R426、L452/R426、T470/N457、E484/P470、Q498/Y484和N501/T487的残基突变的那些突变体。所述免疫刺激细菌可以通过编码例如美国专利号10,973,908和10,702,600中描述的刺突蛋白或RBD包括其一部分的任何抗原序列或修饰形式，用作对抗SARS-CoV-2的疫苗。所述免疫刺激细菌也可用作疫苗，以递送Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗或Moderna COVID-19疫苗中利用的mRNA序列，其中：
1)世界卫生组织公布的Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗中的mRNA序列包括一个5’-加帽结构，一个5’非翻译区(UTR)，S糖蛋白的扩展信号序列，编码含有K986P和V987P突变的全长刺突(S)糖蛋白序列的核酸，以及一个poly(A)尾区，并且包括以下序列：
/>
/>
/>
其中Ψ＝1-甲基-3’-伪尿苷酰基，该序列具有以下特点：
且5’加帽结构的结构如下所示：
以及m1Ψ＝1-甲基-3’-伪尿苷酰基的结构如下所示：
；及
2)Moderna COVID-19疫苗的序列可得自例如：github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccine s-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies％20of％20putative％20SARS-CoV2-spike-encodin g％20mRNA％20sequences％20for％20vaccines％20BNT-162b2％20and％20mRNA-1273.docx.pdf。
或者可以使用得自以下的Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗的mRNA序列：github.com/NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccine s-BNT-162b2-and-mRNA-1273/blob/main/Assemblies％20of％20putative％20SARS-CoV2-spike-encodin g％20mRNA％20sequences％20for％20vaccines％20BNT-162b2％20and％20mRNA-1273.docx.pdf。
本文提供的免疫刺激细菌还可以编码抗原，以防止和/或治疗蜱传播和其它昆虫传播的疾病，以及其它感染性病原体如朊病毒和疟疾病原体，如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，以及细菌和病毒病原体。所述免疫刺激性细菌还可作为疫苗来防治细菌和原生动物病原体，包括疟原虫(Plasmodium)、艰难梭菌(C.difficile)和李斯特菌(Listeria)。沙门氏菌(Salmonella)和其它细菌已被用于疫苗；任何此类已知的疫苗都可以通过在本文提供的免疫刺激细菌中编码抗原来加以改进。
本文提供的免疫刺激细菌可以诱导针对病原体、特别是病毒病原体的免疫性或免疫应答，产生有效的抗体和T细胞应答。所述免疫刺激细菌，如沙门氏菌，包括基因组修饰，以使其主要或只感染骨髓细胞，并递送编码治疗产物的质粒，所述治疗产物如抗原和抗体，以及刺激或诱导抗病毒免疫应答的其它免疫刺激产物。所述免疫刺激细菌感染这些抗原呈递细胞，其中编码的治疗产物被表达。
所述免疫刺激细菌可以编码抗原，从而使宿主的免疫系统产生抗体，包括在病毒或细菌或其它病原体感染细胞之前识别其的抗体。用作抗病毒制剂的免疫刺激细菌不仅可以编码抗原，而且可以编码抗体和免疫刺激蛋白以增强宿主的抗病毒应答。对于用作疫苗，免疫刺激细菌通过编码抗原和其它异源蛋白，导致免疫或导致疾病的严重程度降低，或防止持续的病毒感染的复发。编码的抗体包括其单链形式，如单链可变片段(scFvs)、纳米抗体和其它此类结构。细菌的免疫刺激特性，包括那些来自编码免疫刺激蛋白(本文所述)如STING，增强或促进抗病毒免疫应答，并且细菌的基因组修饰，如消除或减少天冬酰胺酶II的表达的修饰，增强T细胞应答，导致强大的抗病原体治疗效力，包括激活I型IFN。正如本文所讨论的，灭活的病原体疫苗，如治疗结核病的BCG疫苗，可以通过修饰病原体以灭活或消除天冬酰胺酶的活性来改进。天冬酰胺酶可以减少或抑制对疫苗的免疫应答；消除或降低天冬酰胺酶的活性可以提高疫苗如BCG疫苗的有效性。
F.构建编码治疗产物的示例质粒以用于细菌递送
本文的免疫刺激细菌可以被修饰以编码一种或多种治疗产物，包括免疫调节蛋白，其促进或诱导或增强抗肿瘤应答。所述治疗产物可以在细菌中的质粒上编码，在真核启动子如RNA聚合酶II识别的启动子的控制下，用于在真核受试者中表达，特别是施用了所述免疫刺激细菌受试者，如人。编码治疗产物的核酸除了真核启动子之外还可以包括用于在细胞中表达或运输的其它调节信号，例如用于在细胞表面上分泌或表达的调节信号。免疫刺激蛋白是在合适的环境例如肿瘤微环境(TME)中可以促进或参与或增强施用了所述免疫刺激细菌的受试者中的抗肿瘤反应的那些蛋白质。免疫刺激蛋白包括但不限于细胞因子，趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，例如但不限于IL-2，IL-7，IL-12，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，经修饰不结合IL-2Ra的IL-2，IFN-α，和IFN-β；趋化因子，例如但不限于CCL3，CCL4，CCL5，CXCL9，CXCL10和CXCL11；参与或实现或增强T细胞募集和/或持久性的蛋白质；和/或共刺激分子，例如但不限于CD40，CD40L，OX40，OX40L，4-1BB，4-1BBL，具有胞质结构域缺失的4-1BBL(4-1BBLΔcyt)，ICOS，ICOS配体，CD27，CD27配体，CD80，CD86，TNF/TNFR超家族成员和B7-CD28家族成员。本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可促进、增强或以其它方式增加或引起抗肿瘤反应的其它这种免疫刺激蛋白，被考虑用于编码本文提供的免疫刺激细菌。
由本文的免疫刺激细菌编码的其它治疗产物包括诱导或激活I型干扰素产生的胞质DNA/RNA传感器，包括STING、MDA5、RIG-I、IRF3和IRF7，以及其功能获得和组成型活性变体，及如本文所述的嵌合STING多肽。例如，组成型活性STING变体包括具有突变V147L、N154S、V155M、C206Y、R281Q和/或R284G及其组合如N154S/R284G的那些变体，以及本文所述和本领域已知的其它变体，而组成型活性IRF3变体包括具有突变S396D、S398D、S402D、T404D和/或S405D的那些变体，以及本文描述的和本领域已知的其它变体。由本文的免疫刺激细菌编码的其它治疗产物包括抗体和抗体片段，包括单链可变区片段(scFvs)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fvs(dsFvs)、Fd片段、Fd’片段、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体，或上述任何抗体的抗原结合片段。抗体可针对免疫检查点，例如PD-1，PD-L1，CTLA-4，IDO 1和2，CTNNB1(β-连环蛋白)，SIRPα，VISTA和TREX-1以及本领域已知或本文所述的其它免疫检查点，或针对其它靶例如TGF-β，VEGF，HER2，EGFR，STAT3和IL-6，以及其抑制改善抗肿瘤反应的其它这种靶。所述免疫刺激细菌还可以编码RNAi，例如针对免疫检查点例如TREX1以及其抑制、阻抑或破坏可改善抗肿瘤反应的其它靶的siRNA(shRNA和miRNA)。
在一些实施方案中，本文中的免疫刺激细菌被工程化以编码一种或多种细胞因子以刺激免疫系统，所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12(IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35))、IL-15(和IL-15:IL-15Rα链复合物(IL-15/IL-Rα))、IL-18、IL-21、IL-23、IL-36γ、IFN-α和IFN-β。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌可以被工程化以编码趋化因子，所述趋化因子例如是CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11中的一种或多种。可以编码任何治疗产物的互补组合并将其递送至肿瘤微环境，以增强免疫刺激细菌的抗肿瘤效力。这些修饰以及编码其的免疫刺激细菌在上面讨论并在下面举例说明。
1.蛋白质异源表达的组成型启动子
本文提供的质粒被设计为编码治疗产物，例如免疫刺激蛋白，当其在哺乳动物受试者中表达时，在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫；所述免疫刺激蛋白或其它治疗产物在真核启动子控制下在细菌中的质粒上编码，所述启动子例如是RNA聚合酶II(RNAPII)识别的启动子。通常，所述启动子是组成型启动子，例如晚期真核病毒启动子。示例的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子，延伸因子-1α(EF-1α)启动子，遍在蛋白C(UBC)启动子，猿病毒40(SV40)早期启动子，磷酸甘油酸酯激酶1(PGK)启动子，鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子及其衍生启动子CAGG或CAG，β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子，MND启动子(一种合成启动子，含有修饰的MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR的U3区，具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子和缺失的阴性对照区)，真核起始因子4A-I(EIF4A1)启动子，CD68启动子和GAPDH启动子等(见例如Powell et al.(2015)Discov.Med.19(102):49–57)。CAG启动子包括：(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；(A)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一个外显子和第一个内含子；及(G)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。MND是一种合成启动子，含有修饰的MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR的U3区，具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子和缺失的阴性对照区(鼠白血病病毒衍生的MND启动子(骨髓增殖性肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的，dl587rev引物结合位点取代的(见例如Li et al.(2010)J.Neurosci.Methods 189:56-64)。
这些启动子中的两个或更多个启动子可以在质粒上的多个开放阅读框(ORF)中编码。某些启动子，包括但不限于CMV，含有多个cAMP应答元件结合蛋白(CREB)位点。当含有这些元件的质粒被释放到胞质中时，例如包含在鼠伤寒沙门氏菌中的那些质粒在细菌破坏后被释放到胞质中，它们可以使用CREB介导的宿主微管机制有效地穿梭到细胞核中(见例如Bai et al.(2017)Biosci.Rep.37(6):BSR20160616)。
所述质粒可以包括多个启动子，包括细菌启动子，例如用于表达asd的启动子，以及用于表达治疗产物的真核启动子。已经评估了启动子和其它调节序列的各种构型以改善治疗产物的表达并改善细菌生长和适应性。例如，在所测试的构型中，反转真核表达盒在质粒上的方向，并包含一个或多个细菌终止子，可以提高编码的有效载荷表达的效力，并可以改善细菌适应性。
2.多种重治疗产物表达盒
a.单一启动子构建体
可以实现从单个构建体在同一细胞中表达多个基因，并且当需要几种蛋白质的共表达以引发所需的生物学效应(例如抗肿瘤应答)时，这是有利的。内部核糖体进入位点(IRES)序列已用于在单一启动子的控制下分隔两个编码序列，然而第二个蛋白质的表达水平与第一个蛋白质相比可以降低，并且IRES序列的长度可以是在某些情况下是限制的，例如使用小包装容量的病毒时。发现了称为2A肽的短的(长度约18至22个氨基酸长)病毒衍生的肽序列，其介导核糖体跳跃事件，使得能够从单个mRNA以相似水平生成多个单独的肽产物。所述2A肽编码序列包含在编码多肽的转基因之间(见例如Daniels et al.(2014)PLoSOne 9(6):e100637)。
IRES和2A肽使用不同的机制在一个转录物中共表达多个基因。例如，当使用IRES在一个mRNA中表达多个基因时，直接位于启动子下游的基因通过典型的帽依赖机制翻译，而IRES下游的基因通过帽非依赖性机制翻译，所述帽非依赖性机制翻译机制具的翻译效力低于帽依赖性机制，导致表达不平衡，IRES驱动的基因的表达较低(见例如Chng et al.(2015)mAbs 7(2):403-412)。另一方面，2A连锁基因在一个开放阅读框(ORF)中翻译。由2A序列分隔的蛋白质的切割在非常规过程中共翻译地发生，在此2A肽中的C末端甘氨酸和脯氨酸之间通常无法形成肽键(即，肽键被“跳过”)。尽管如此，翻译仍在继续，两种不同的蛋白质以等量产生。编码大约20个氨基酸的2A肽序列的短片段足以引起键跳跃。然而，如果没有发生键跳跃，则会生成融合蛋白，该蛋白随后不会切割(见例如Daniels et al.(2014)PLoS One 9(6):e100637)。
已经描述了许多这些2A肽，包括但不限于来自Thosea asigna病毒的T2(SEQ IDNO:327)、来自猪捷申病毒(teschovirus)-1的P2A(SEQ ID NO:328)、来自马鼻炎A病毒的E2A(SEQ ID NO:329)，以及来自口蹄疫病毒的F2A(SEQ ID NO:330)等。不同的研究报告了各种2A肽的切割效力相互矛盾，2A肽的切割效力可能受所表达蛋白质的性质、2A序列侧翼基因的顺序、所用2A肽的长度和上游蛋白质和2A肽之间的接头的影响。切割效力和增强的蛋白质表达通常可以通过使用上游病毒切割序列来提高，例如但不限于肽弗林蛋白酶切割序列RRKR，以及通过紧接在2A肽之前插入GSG和SGS肽接头V5表位标签(GKPUPNPLLGLDST)或的3xFlag表位标签(见例如Chng et al.(2015)mAbs7(2):403-412)。
本文的免疫刺激细菌，含有编码治疗产物例如免疫调节蛋白的质粒，具有单个启动子和ORF，可以通过使用帽非依赖性病毒内部核糖体进入位点(IRES)或通过2A肽的翻译通读，以及随后的自我切割成同等表达的辅蛋白。所述质粒可以含有其它调节元件，如下文和本文其它地方所讨论的。例如，示例构建体(见实施例14)是CMV-muIL-2CO_T2A_muIFN-α2-WPRE，其中密码子优化的鼠IL-2与鼠IFN-α2共表达，使用CMV启动子和T2A肽。此外，还包括土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)，以增强表达。如果要通过质粒表达第三种治疗产物，则2A序列的侧翼是前两种蛋白质，它们在第一启动子例如CMV的控制下表达，第三种蛋白质在第二启动子例如EF-1α控制下。这种构建体的示例是CMV-muIL-15Rα/IL-15sc_T2A_muSTING-R283G+EF-1α-muIL-18-WPRE，其中鼠15Rα/IL-15sc和具有置换R283G或N153S/R283G(分别对应于在人STING中R284G或N154S/R284G)的鼠STING在CMV启动子控制下使用T2A共表达，鼠IL-18在EF-1α启动子的控制下单独表达。这个示例构建体还包括用于增强表达的WPRE。
如本文所述，免疫刺激细菌可用作疫苗，其中编码的抗原在细菌启动子的控制下表达以在细菌中转录，但包括调节序列如IRES，以阻止在细菌中翻译，但促进或允许在真核宿主如人中翻译。编码这种抗原的核酸构建体可以任选编码额外的免疫系统/应答增强蛋白，如STING蛋白，和/或细胞因子，和/或其它组合，这实际上是作为佐剂的作用。
b.双重/多重启动子构建体
或者，可以使用双重或多重启动子构建体表达遗传有效载荷/治疗产物，其中每种蛋白质在单独启动子的控制下表达。因此，编码以组合形式表达的治疗产物(例如免疫调节蛋白)的质粒可以含有多个启动子，每个启动子通过适当的终止密码子加工控制单个完整的ORF(即双重/多重启动子构建体)，或多个蛋白质可以在一个ORF中通过使用2A肽表达(即单个启动子构建体)；或质粒可以含有单个启动子和双重/多重启动子构建体的混合物，以表达三种或更多种蛋白质，如上所述。
3.调节元件
a.转录后调节元件
为了增强来自单个质粒的单个和多个治疗产物/免疫调节蛋白的表达，可以使用增强感兴趣的蛋白质的转录和翻译的调节元件。例如，土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件(PRE)，当插入到ORF的3’非翻译区时，可以将表达水平提高几倍(见例如Zuffereyet al.(1999)J.Virol.73(4):2886-2892)。类似地，其它这种元件，包括但不限于乙型肝炎病毒PRE(HPRE)，也可以增强表达。这些元件组合可用在多个ORF的3’末端，以改善多个蛋白质在单个质粒上的表达。
PREs WPRE和HPRE是肝炎病毒顺式作用RNA元件，可通过促进mRNA从细胞核输出而增加胞质mRNA的积累，并可增强转录后加工和稳定性。
b.聚腺苷酸化信号序列和终止子
质粒上可以增强蛋白质表达的其它元件包括多聚腺苷酸化信号序列和终止子。聚腺苷酸化是转录后在mRNA转录物的3’末端添加poly(A)尾，这是产生成熟mRNA进行翻译的过程的一部分。聚腺苷酸化信号序列对于核输出、mRNA稳定性和有效翻译很重要。终止子是定义转录物末端的序列，产生一个游离的3’末端，并启动新合成的mRNA从转录机制中的释放。然后，游离的3’末端可用于添加poly(A)尾。终止子位于待转录基因的下游，通常直接出现在任何3’调节元件例如聚腺苷酸化或poly(A)信号之后。表达质粒中常用的哺乳动物终止子包括猿病毒40(SV40)、人生长激素(hGH)、牛生长激素(BGH或bGH)和兔β-珠蛋白(rbGlob)polyA序列，其包括序列基序AAUAAA(SEQ ID NO：398)、并促进聚腺苷酸化和终止。
当置于ORF的3’末端时，猿病毒40polyA(SV40pA)或牛生长激素poly A(bGHpA)信号等序列导致在体外和体内表达增加数倍(见例如Powell et al.(2015)Discov.Med.19(102):49–57)。这些及其它这种元件可以进一步增强从单个质粒表达的多种治疗产物包括免疫调节蛋白的表达和翻译。
c.增强子
启动子和增强子位于质粒中多克隆位点(MCS)的上游，其共同决定转录速率。增强子是结合激活蛋白的序列，以使DNA形成环，并将特定的启动子带入起始复合物，从而提高转录速率。它们可以邻近或远离其影响的启动子，包括CMV、EF-1α、SV40和合成增强子，或MND启动子，这是是一种合成启动子，含有具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子的修饰的MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR的U3区域。本文的免疫刺激细菌含有质粒，其可以包含增强剂以增强在质粒上编码的治疗产物/蛋白质的表达。
d.分泌信号
分泌信号，也称为信号序列或肽、前导序列或肽、或定位信号或序列，是待分泌的新合成蛋白质的N末端的短肽。信号肽促进细胞转位蛋白质，通常转位到细胞膜。蛋白质分泌的效力很大程度上取决于信号肽。因此，本文中的免疫刺激细菌含有可以包含信号肽/分泌信号肽的质粒，以促进和/或增加编码的治疗产物的表达或分泌。
e.改良细菌适应性(fitness)
编码治疗产物的免疫刺激细菌中的质粒包括为细菌基因的表达和复杂的多顺反子真核有效载荷的表达提供的基因和调节元件。这种进化上不同的生物体之间的转换为原核生物和真核生物的正常功能带来了挑战。将细菌在体外培养，然后施用于真核对象，其中质粒被递送至癌症受试者的细胞，特别是肿瘤驻留骨髓细胞，有效载荷在其中被表达、加工和运输。细菌中来自真核启动子例如CMV启动子的转录渗漏，与大的真核基因和调节序列组合，可导致细菌适应性降低，表现为注射原液存活力低以及降低的肉汤培养的生长速度。
4.复制起点与质粒拷贝数
质粒是自主复制的染色体外环状双链DNA分子，其通过复制起点保持在细菌内。拷贝数影响质粒稳定性。当在细胞分裂中发生随机分配时，高拷贝数通常导致质粒的更大稳定性。质粒的高拷贝数通常降低生长速率，因此可能允许具有很少质粒的细胞主导培养，因为其生长更快。这可以通过使用基因减毒和基因给药策略来改善，这些策略限制了质粒上某些基因的表达，这些基因在以高拷贝数存在时可能对细菌有毒。复制起点还决定了质粒的兼容性：与同一细菌细胞内的另一质粒一起复制的能力。利用相同复制系统的质粒不能共存于同一细菌细胞中。据说其属于同一兼容性组。以来自同一兼容性组的第二个质粒的形式引入新的起点，模拟了存留质粒的复制结果。因此，在将两个质粒分离到不同的细胞以产生正确的复制前拷贝数之前，阻止任何进一步的复制。
许多细菌复制起点是本领域技术人员已知的。可以选择起点以获得所需的拷贝数。复制起点含有通过DNA依赖性DNA聚合酶被识别的序列作为质粒复制起始位点(见例如del Solar et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(2):434-464)。不同的复制起点在每个细胞内提供了不同的质粒拷贝水平，并且可以为1至数百个拷贝/细胞。常用的细菌质粒复制起点包括但不限于pMB1衍生的起点，其具有非常高的拷贝衍生物如pUC，及低拷贝衍生物如pBR322，以及ColE1、p15A、pSC101及具有低拷贝数的其它起点。这样的起点是本领域技术人员熟知的。例如，pUC19起点导致500-700个拷贝/细胞的拷贝数。pBR322起点具有15-20个拷贝/细胞的已知拷贝数。这些起点仅因单个碱基对而异。ColE1起点拷贝数为15-20个，并且衍生物如pBluescript具有300-500个拷贝数。例如，质粒pACYC184中的p15A起点导致约10个拷贝数。pSC101起点赋予约5个的拷贝数。可以从中获得复制起点的其它低拷贝数载体包括例如pWSK29、pWKS30、pWKS129和pWKS130(见例如Wang et al.(1991)Gene 100:195-199)。中等至低拷贝数小于150，或小于100。低拷贝数小于20、25或30。一般而言，低于中等拷贝数是小于150个拷贝，低于低拷贝数是小于约25或小于25个拷贝，通常拷贝数是指制剂中每个细菌的平均质粒拷贝数。本领域技术人员可以鉴定具有低、中等或高拷贝数的质粒。例如，为了通过实验确定，无论拷贝数是高还是低均进行小量制备。高拷贝质粒在每1ml的LB培养物应产生3-5μg的DNA；低拷贝质粒每ml的LB培养物将产生0.2-1μg的DNA。细菌质粒的序列，包括复制起点的鉴定和序列，是众所周知的(见例如snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/)。示例的复制起点及其质粒拷贝数总结在下表中。
复制起点 拷贝数 SEQ ID NO.
pMB1 Varies 254
p15A 10-12 255
pSC101 ～5 256
pBR322 15-20 243
ColE1 15-20 257
pPS10 15-20 258
RK2 ～5 259
R6K(α起点) 15-20 260
R6K(β起点) 15-20 261
R6K(γ起点) 15-20 262
P1(oriR) Low 263
R1 Low 264
pWSK Low 265
ColE2 10-15 266
pUC(pMB1) 500-700 267
F1 300-500 268
选择高拷贝质粒用于蛋白质的体外异源表达，因为相对于染色体基因的基因剂量增加，蛋白质的特异性产量更高，并且对于治疗性细菌，所编码治疗剂的治疗剂量更高。然而，本文显示，为了例如通过鼠伤寒沙门菌递送编码治疗产物(例如免疫调节蛋白)的质粒，在一些实施方案中高拷贝质粒可能是有利的。
如果表达的分子对生物体有毒，那么细菌维持高拷贝质粒的需求就可能成为一个问题。维持这些质粒的代谢要求可能以体内复制适应性为代价。用于递送治疗产物的最佳质粒拷贝数可以取决于工程化以递送质粒的菌株的减毒机制。如果需要，鉴于本文的公开内容，技术人员可以为细菌的特定免疫刺激物种和菌株选择合适的拷贝数。
对于用作疫苗和/或为了递送RNA(如mRNA)，其中编码的产物在细菌中表达，质粒可以是较高或高拷贝数(大于150)，以增加产生的RNA或mRNA的量。
5.CpG基序和CpG岛
未甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷(CpG)基序在细菌基因组DNA中普遍存在，但在脊椎动物基因组DNA中不存在。含有CpG基序的致病性DNA和合成寡脱氧核苷酸(ODN)激活宿主防御机制，导致先天性和获得性免疫应答。未甲基化的CpG基序含有一个中央未甲基化的CG二核苷酸加上侧翼区域。在人中，根据结构的差异及其诱导的免疫应答的性质，已经鉴别了四种不同类别的CpG ODN。K型ODN(也称为B型)含有1至5个CpG基序，通常位于硫代磷酸酯骨架上。D型ODN(也称为A型)具有混合的磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架，并具有单个CpG基序，侧翼是允许形成茎环结构的回文结构序列，以及在3’和5’末端的poly G基序。C型ODN具有硫代磷酸酯骨架并含有可形成茎环结构或二聚体的多个回文结构CpG基序。P类CpG ODN具有硫代磷酸酯骨架，并含有带有双回文结构的多个CpG基序，可以在其富含GC的3’末端形成发夹(见例如Scheiermann et al.(2014)Vaccine 32(48):6377-6389)。出于本文的目的，CpG在质粒DNA中编码；其可以作为基序或引入基因中。
Toll样受体(TLR)是感知病原体相关分子模式(PAMP)和激活针对病原体的先天免疫的关键受体(见例如Akira et al.(2001)Nat.Immunol.2(8):675-680)。TLR9识别原核生物DNA中非天然存在于哺乳动物DNA中的去甲基化CpG基序(见例如McKelvey et al.(2011)J.Autoimmun.36:76-86)。病原体被吞噬到免疫细胞亚群的内体中之后识别CpG基序，及激活先天免疫和适应性免疫。
本文提供了携带含有CpG岛/基序的质粒的免疫刺激细菌，例如沙门氏菌属物种，如鼠伤寒沙门氏菌菌株。这些细菌可以激活TLR9。如本文所示例，含有去甲基化CpG岛的细菌质粒可引发先天性和适应性抗肿瘤免疫应答，其与在质粒上编码的治疗产物组合可具有协同或增强的抗肿瘤活性，所述治疗产物例如免疫刺激蛋白和STING的组成型活性变体、IRF3和其它胞质DNA/RNA传感器。例如，asd基因(见例如SEQ ID NO:48)编码高频去甲基化CpG岛。如本文所述或从本文描述中明显可见，CpG基序可以与任何治疗性产物组合包括在所述免疫刺激细菌中，并从而在治疗的受试者中增强或改善抗肿瘤免疫应答。
免疫刺激性CpG可以包括在质粒中，通过包含编码基因产物的通常来自细菌基因的核酸以及通过加入编码CpG基序的核酸而实现。本文的质粒可包含CpG基序。示例的CpG基序是已知的(见例如美国专利号8,232,259、8,426,375和8,241,844)。这些包括例如合成的免疫刺激性寡核苷酸，长度在10至100、10至20、10至30、10至40、10至50或10至75个碱基对之间，具有通式(CpG)n，其中n是重复数。通常使用至少一或两次重复；非CG碱基可以散布于其中。本领域技术人员非常熟悉CpG基序通过调节TLR、特别是TLR9来诱导免疫应答的一般性用途。
6.质粒维持/组分选择
通常通过在质粒上包含抗生素抗性基因并在生长培养基中使用抗生素来确保质粒在实验室环境中的维持。如上所述，在质粒上使用与功能性asd基因互补的asd缺失突变体允许在不使用抗生素的情况下在体外进行质粒选择，并且允许在体内进行质粒维持。asd基因互补系统提供了这样的选择(见例如Galán et al.(1990)Gene 94(1):29-35)。使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中提高了鼠伤寒沙门菌及其它免疫刺激细菌菌株的效力，这些菌株被工程化以递送编码治疗产物的质粒，所述治疗产物例如免疫刺激蛋白质、组成型活性胞质DNA/RNA传感器、抗体、抗体片段，或如本文所述其它这种产物。
7.DNA核靶向序列
DNA核靶向序列(DTS)，如SV40 DTS，介导DNA序列通过核孔复合物的易位。据报道，这种转运机制依赖于含有核定位序列的DNA结合蛋白的结合。已示出在质粒上包含DTS以增加核转运和表达(见例如Dean,D.A.et al.(1999)Exp.Cell Res.253(2):713-722)，并已被用于增加鼠伤寒沙门菌递送的质粒的基因表达(见例如Kong et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(47):19414–19419)。
Rho非依赖性的或I类转录终止子，例如大肠杆菌的rrnB基因的T1终止子，含有DNA序列，其形成导致转录延伸复合物的解离的二级结构。转录终止子可包括在质粒中，以防止鼠伤寒沙门氏菌转录机制表达编码的治疗产物。这确保了编码的产物的表达仅限于宿主细胞转录机制。
作为本文所述的癌症疗法，用于转化沙门菌属例如鼠伤寒沙门菌的质粒含有以下所有或部分属性：1)一个或多个用于蛋白质异源表达的组成型启动子；2)一个或多个人免疫调节表达盒；3)细菌复制起点和优化的质粒拷贝数；4)免疫刺激性CpG岛；5)asd基因选择标记，用于质粒维持和选择；6)DNA核靶向序列；和7)转录终止子。
G.用作疫苗和治疗剂的示例细菌菌株和作用机制
正如整文描述的那样，所提供的免疫刺激细菌含有基因组修饰，这些修饰改善了其作为抗癌治疗剂、针对病原体的疫苗和RNA的递送载体的性质，其可被用作治疗产物，或者可被翻译为提供用于各种用途的免疫刺激产物、抗原及其组合。所述免疫刺激性细菌包括整文讨论的基因组修饰，这些修饰改善了其作为抗癌治疗剂、疫苗和RNA递送平台的性质，也减少了细菌的炎症性质，还包括有效载荷，包括增强了细菌在这些应用中的性质或与之共同作用有效载荷产物的组合。有效载荷和基因组修饰在本文的整个公开中得到讨论和描述，并在下面的工作实施例中得到例证。以下是对示例细菌、基因组修饰和有效载荷的组合的讨论，特别是对其作为疫苗使用的优势的讨论。整个公开描述了用作癌症治疗剂以及作为一般可用于适当的免疫刺激或调节用于治疗癌症和其它疾病和病况的治疗剂的性质、有效载荷和修饰。
应理解，熟练的技术人员可以在其它细菌如大肠杆菌和李斯特菌物种和菌株中进行类似的基因组修饰，以达到类似的效果和结果。此外，如上所述，非沙门氏菌物种可以被修饰为编码rck基因，如沙门氏菌的rck基因，以增加对补体的抗性。
对于疫苗接种，本文提供的细菌的用途和一般作用机制包括施用，特别是直接组织施用，如通过肌肉注射、吸入、皮内施用、阴道施用和其它此类途径，以产生对所述抗原或产物的原位免疫应答，这可以是针对病原体或癌症的预防(免疫以形成免疫保护性应答)或治疗。所述细菌能诱导持久的适应性抗病毒免疫。所述细菌根据所选途径适当地配制。这可以包括例如气雾剂、片剂、乳剂、粉末等制剂，视情况而定。如此配制施用的细菌通过吞噬作用被组织驻留的吞噬细胞吸收。为了这些目的，对细菌进行修饰，使其不在体内复制，而是将其有效载荷递送至细胞，如组织驻留的吞噬性抗原呈递细胞(APCs)。编码的产物包括例如用于呈递的抗原，诱导I型IFN的STING。编码的产物可进入淋巴结，通过CD4+和CD8+引发产生抗体，以及APC呈递引发和激活抗原特异性CD8+细胞，刺激IFN-γ，并且也参与直接杀死病毒感染的细胞；巨噬细胞吞噬凋亡的感染细胞，从而传播表位，导致T细胞进一步激活。
1.示例的免疫刺激细菌--原位癌症疫苗接种的作用机制(MOA)
本文提供的免疫刺激细菌是被设计为在肿瘤驻留的骨髓细胞如巨噬细胞中积累的免疫刺激细菌。这些细菌含有编码免疫刺激蛋白及其组合的质粒，诱发抗病毒/抗肿瘤免疫应答。所述基因组修饰包括消除鞭毛、改变LPS和消除卷曲菌毛。这些或具有类似效果的细菌菌株的修饰，减少了TLR2/4/5应答/信号传导，并导致在肿瘤微环境和骨髓细胞中积累。其它修饰包括营养缺陷型，如asd-或ThyA-使细菌无法在体内生长；以及其它营养缺陷型，如包括purI-，使细菌对腺苷是营养缺陷的，增加在具有免疫抑制作用的腺苷升高的肿瘤微环境中的积累；以及消除或灭活可抑制T细胞的天冬酰胺酶基因组修饰。部分或全部这些细菌修饰的组合导致细菌在肿瘤微环境和肿瘤的巨噬细胞中积累。这种免疫刺激细菌的示例是称作YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI的菌株。该菌株可用于例如原位癌抗原疫苗接种，其中所述菌株含有表达STING、eSTING(指工程STING，如本文提供的那些，特别是那些组成型诱导I型干扰素的STING)、IL-15(或IL-15受体复合物)+eSTING和其它产生I型IFN的有效载荷组合的质粒，在真核启动子如CMV启动子的控制下表达。所述质粒还含有编码全长肿瘤抗原或肽抗原片段的开放阅读框的序列。施用途径是静脉注射，通过这种方式将菌株输送到肿瘤中，并被肿瘤驻留的巨噬细胞吸收，导致质粒转移到细胞核中并表达有效载荷。在I型IFN的存在下，巨噬细胞在肿瘤内加工并呈递癌症抗原以引发CD8+T细胞，以及转运到淋巴结以诱引发CD4+和CD8+T细胞。被激发和激活的CD8+T细胞会消除带有引发抗原的肿瘤细胞，诱导长寿命的组织驻留记忆CD8+T细胞，以及在肿瘤被清除后作为记忆T细胞循环，防止肿瘤复发。
2.外周癌症疫苗接种的示例免疫刺激细菌及作用机制
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA菌株含有额外的胸苷营养缺陷型，可用于外周癌症抗原疫苗接种。该菌株在没有胸苷补充的情况下不能增殖，并且在施用时如通过肌肉注射到四肢，会被组织驻留的巨噬细胞吞噬，如在手臂IM注射后。所述菌株含有编码STING、eSTING、IL-15+eSTING或其它I型IFN产生组合以及全长肿瘤抗原或肽的序列的质粒，来自细菌启动子和IRES序列或真核生物启动子。对于含有细菌启动子的菌株，细菌将转录这些编码的有效载荷的RNA，并在被组织驻留的巨噬细胞吞噬和破坏时将其递送。对于含有真核生物启动子的菌株，吞噬细胞转录RNA。由此产生的mRNA被翻译成蛋白质，编码的抗原由巨噬细胞在存在IFN的情况下呈递，以引发CD8+T细胞。癌抗原引发的CD8+T细胞循环并消除癌细胞，如手术切除肿瘤后残留的细胞。像这样的菌株也被用作预防性疫苗，以减少发生某种特定癌症的风险，如用于预防可能导致肿瘤形成的家族性基因突变的疫苗。
3.用于病原体疫苗接种的示例免疫刺激细菌和作用机制(MOA)
还提供了包括额外营养缺陷的细菌菌株，如thyA-菌株。这样的实例包括YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA菌株，其具有额外的胸苷营养缺陷型。这样的菌株在没有胸苷补充的情况下不能增殖。这些菌株可用于针对病原体的疫苗接种。将其通过特定病原体自然发生的感染途径进行接种。施用后，如通过肌肉注射、鼻内、吸入或口服或其组合施用，取决于自然发生感染的部位，这些菌株从组织驻留的巨噬细胞中被清除，留下质粒。这些菌株含有在细菌启动子的转录控制下编码免疫刺激蛋白或其组合的质粒，所述免疫刺激蛋白如STING、工程化STING(eSTING)、IL-15+eSTING或其它I型IFN生产蛋白或蛋白组合以及抗原和/或肽的病原体序列，但包括真核序列如IRES，以便由真核核糖体翻译。细菌产生编码这些有效载荷的RNA，并且在施用后在被组织驻留的巨噬细胞吞噬和破坏后，递送编码的mRNA。所述mRNA被真核宿主细胞翻译成蛋白质，而抗原则由巨噬细胞在I型IFN存在的情况下呈递，以引发CD8+T细胞。I型IFN可以由编码的免疫刺激蛋白如STING或修饰的STING刺激。此外，细菌可以使用带有细菌启动子和供细菌转录和翻译序列的质粒提供I型IFN和病原体抗原作为蛋白质。然后巨噬细胞引发组织中的CD8+T细胞，并转运进入淋巴结以引发CD4+和CD8+T细胞。被引发和激活的CD8+T细胞然后作为巡逻记忆T细胞循环，以及返回原发组织作为组织驻留记忆CD8+T细胞。引发的CD4+T细胞诱导B细胞激活，产生高滴度的持久中和抗体。这种疫苗接种策略模仿了非常成功的天花、脊髓灰质炎、麻疹、水痘以及其它在自然发生疾病的组织中施用的减毒活疫苗。
H.药物制备、组合物和制剂
本文提供了生产含有本文提供的任何免疫刺激细菌和药学上可接受的赋形剂或添加剂的药物组合物和制剂的方法。所述药物组合物可用于治疗疾病，如过度增生性疾病或病况，例如肿瘤或癌症。所述免疫刺激细菌可以在单剂疗法中施用，也可以在与其它药剂或治疗的组合疗法中施用。组合疗法包括将与本文提供的免疫刺激细菌和/或其它递送载体的疗法与任何其它抗癌疗法或治疗方法组合，包括但不限于免疫疗法，例如CAR-T疗法和检查点抑制剂，放射，手术，化学治疗剂例如核苷类似物和铂化合物，以及细胞疗法。可以将组合物配制成单剂量施用或多剂量施用。可以将药剂配制为直接施用。所述组合物可以液体或干燥制剂形式提供。
1.制备
a.细胞库制备
由于本文所述免疫治疗剂的活性成分由工程化的自我复制细菌组成，因此将选择的组合物扩展为一系列细胞库，这些细胞库将维持长期保存并用作制备原料药的起始材料。根据美国联邦法规(CFR)21第211部分或其它相关监管机构的规定，在适当的生产工厂中在现行原料药生产质量管理规范(cGMP)下生产细胞库。由于所述免疫治疗剂的活性剂是活细菌，因此从定义上讲本文所述的产物是未经灭菌的且不能进行最终灭菌。必须注意确保在整个制备过程中使用无菌程序以防止污染。因此，在制备过程中使用之前，必须对所有原材料和溶液进行灭菌。
通过对所选细菌菌株进行连续系列单集落分离来生产主细胞库(MCB)，以确保起始材料中不存在污染物。用单个充分分离的细菌集落接种含有无菌培养基(可以是复合培养基，例如LB或MSBB或定义的培养基，例如补充有适当营养素的M9)的无菌培养容器，并使细菌可以复制，例如通过在37℃摇动温育。然后通过将细菌悬浮在含有一种或多种冷冻保护剂的溶液中制备细菌用于低温贮存。
冷冻保护剂的实例包括：蛋白质如人或牛血清白蛋白、明胶、和免疫球蛋白；碳水化合物，包括单糖(例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等)及其非还原性衍生物(例如甲基葡葡萄糖甙)、二糖(海藻糖、蔗糖等)、环糊精、和多糖(例如棉子糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐等)；氨基酸(例如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或组氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲胺，如甜菜碱；多元醇，如三羟或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；表面活性剂，例如或有机硫化合物，如二甲亚砜(DMSO)，及其组合。低温贮存溶液可以在溶液中包含一种或多种冷冻保护剂，其也可以包含盐(例如氯化钠、氯化钾、硫酸镁)，和/或缓冲剂，如磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)，以及其它本领域技术人员已知的这种缓冲剂。
可以通过在培养材料中加入一种或多种浓缩的冷冻保护剂以达到在冷冻和解冻期间保持细菌的活力的最终浓度(例如0.5％至20％丙三醇最终浓度)，或通过收获细菌(例如通过离心)并将其悬浮在含有适当终浓度的一种或多种冷冻保护剂的低温贮存液中，从而实现将细菌悬浮在低温贮存液中。然后将在低温贮存溶液中的细菌悬浮液装入具有容器封闭系统的合适的无菌小瓶(塑料或玻璃)中，该容器封闭系统可以在冷冻条件下保持封闭完整性(例如丁基医用螺旋帽和压接密封)。然后将主细胞库的小瓶冷冻(通过控制速率的冷冻机缓慢地冷冻，或通过直接放入冷冻机快速地冷冻)。然后将MCB冷冻贮存在保持长期活力的温度(例如-60℃或更低)。对解冻的主细胞库材料进行彻底鉴定，以确保相同性、纯度和活性符合相应当局的规定。
工作细胞库(WCB)以与主细胞库相同的方式生产，但起始材料来自MCB。MCB材料可以直接转移到含有无菌培养基的发酵容器中，并如上所述扩增。然后将细菌悬浮在低温贮存液中，装入容器中，密封并在-20℃或以下冷冻。可以由MCB材料生产多个WCB，且WCB材料可以用于制备另外的细胞库(例如制造商的工作细胞库MWCB)。将WCB冷冻保存并鉴定以确保相同性、纯度和活性。WCB材料通常是用于生产例如工程化细菌的生物学样品的起始材料。
b.原料药(Drug substance)制备
如上所述，在cGMP下使用无菌工艺制备原料药。工作细胞库材料通常用作在cGMP下制备原料药的起始材料，然而也可以使用其它细胞库(例如MCB或MWCB)。无菌加工用于所有细胞疗法的生产，包括基于细菌细胞的疗法。将来自细胞库的细菌通过发酵扩增；这可以通过产生预培养物(例如在摇瓶中)或通过直接接种发酵罐来实现。发酵是在无菌的生物反应器或烧瓶中完成的，该反应器或烧瓶可以是一次性使用的或可重复使用的。通过浓缩(例如通过离心、连续离心或切向流过滤)收获细菌。通过用缓冲剂交换培养基(例如通过渗滤)从培养基组分和细菌代谢物中纯化浓缩的细菌。散装药物产物被配制并保存为中间体(例如通过冷冻或干燥)或直接加工成药物产物。检测原料药的相同性、强度、纯度、效价和质量。
c.药物产物制备
药物产物定义为其最终容器中所含活性物质的最终制剂。药物产物是根据cGMP使用无菌工艺制备的。药物产物是由原料药生产的。如有必要，可将原料药解冻或重建，然后以适当的目标强度配制。因为药物产物的活性组分是活的工程化细菌，所以强度取决于悬浮液中所含CFU的数量。如下所述，将散装产物稀释成适合于储存和使用的最终制剂。填充于容器中，并用容器封闭系统密封，对药物产物贴标签。将药物产物贮存在适当的温度下以保持稳定性，检测其相同性、强度、纯度、效价和质量，并如果符合指定的接受标准则发布以供人使用。
2.组合物
药学上可接受的组合物是经监管机构或其它机构批准而制备的，根据公认的用于动物和人体的药典制备。所述组合物可以制备为溶液剂、混悬剂、粉剂或缓释制剂。通常，使用本领域熟知的技术和规程将化合物配制成药物组合物(见例如Ansel,Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,page 126)。所述制剂应适合于施用模式。
可以将组合物配制为通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、瘤内、硬膜外、鼻腔、口服、阴道、直肠、表面、局部、耳道、吸入、颊(例如舌下)和经皮施用或任何施用途径。也可以考虑其它施用模式。取决于治疗的部位，施用可以是局部、表面或全身的。可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、表面应用例如与手术后的伤口敷料联合、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物来局部施用到需要治疗的区域。组合物也可以与其它生物活性剂相继、间歇地或以在相同组合物中一起施用。施用还可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控释，例如通过泵。
在任何给定情况下，最合适的途径取决于多种因素，例如疾病的性质、疾病的进展、疾病的严重程度以及所使用的特定组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。特别地，可以将组合物配制成用于全身、局部腹膜内、口服或直接施用的任何合适的药物制剂。例如，可以将组合物配制成用于皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内施用。可以采用施用方法来减少活性剂暴露于降解过程，例如通过抗原和免疫原性应答的免疫干预。这种方法的实例包括在治疗部位的局部施用或连续输注。
可以将免疫刺激细菌配制成合适的药物制备物，例如用于口服施用的溶液剂、混悬剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂，以及透皮贴剂制备物和粉吸入剂。通常，使用本领域熟知的技术和规程将化合物配制成药物组合物(见例如Ansel,Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,page 126)。通常，制剂的模式取决于施用途径。可以将组合物配制成干燥(冻干的或其它玻璃化形式)或液体形式。当组合物以干燥形式提供时，其可以在即将使用之前通过加入适当的缓冲剂例如无菌盐溶液而重建。
3.制剂
a.流体、注射剂、乳剂
制剂通常被制成适于施用途径的模式。本文考虑到胃肠外施用通常特征在于以皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内注射或输注。用于胃肠外施用的细菌制备物包括备用于注射(直接施用)的悬浮液或在使用前解冻的冷冻悬浮液、备用于在使用前与再悬浮溶液组合的干燥的可溶性产物如冻干粉，以及乳剂。干燥的热稳定制剂例如冻干试剂可用于单位剂量的储存以备后用。
药物制备物可以是冷冻液体形式，例如悬浮液。如果以冷冻液体形式提供，则药物产物可以以浓缩制备物形式提供，以在使用前解冻并稀释至治疗有效浓度。
药物制备物也可以以不需要解冻或稀释而使用的剂型提供。这种液体制备物可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂适当制备，例如悬浮剂(例如山梨糖醇、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；以及适用于微生物治疗剂的防腐剂。所述药物制备物可以干燥形式存在，例如冻干或喷雾干燥的，在使用前用水或其它无菌的合适载体重建。
合适的赋形剂是例如水、盐水、葡聚糖、或甘油。溶液可以是水性或非水性的。如果静脉内施用，则合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及用于静脉内水合作用的其它缓冲溶液。对于瘤内施用，含有增稠剂例如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇的溶液，油乳剂及其混合物可以适合于维持注入物的定位。
药物组合物可以包括载体或其它赋形剂。例如，本文提供的药物组合物可含有以下的任何一种或多种：稀释剂、佐剂、抗粘剂、粘合剂、包衣、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、清洁剂、或吸附剂及其组合或施用修饰的治疗性细菌的载体。例如，胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载体或赋形剂包括水性载体、非水性载体、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂或赋形剂制备包括液体制备物在内的制剂。
药物组合物可以包括载体，例如稀释剂、佐剂、赋形剂或与施用所述组合物的载体。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中进行了描述。这样的组合物将包含治疗有效量的通常为纯化形式或部分纯化形式的化合物或试剂，以及合适量的载体，以提供适当施用于患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、和芝麻油。水是典型的载体。盐溶液和葡聚糖及甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。组合物除了活性成分还可包含：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙、或羧甲基纤维素；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、和滑石；和粘合剂，例如淀粉、天然树胶例如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其它本领域技术人员已知的这种粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、和乙醇。例如，合适的赋形剂是例如水、盐水、葡聚糖、丙三醇或乙醇。如果需要的话，组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其它这种试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载体包括水性载体、非水性载体、抗菌剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。水性载体的实例包括氯化钠注射液、林格注射液(RingersInjection)、等渗葡聚糖糖注射液、无菌水注射液、葡聚糖和乳酸林格注射液。非水性胃肠外载体包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。等渗剂包括氯化钠和葡聚糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括例如聚山梨酯，例如聚山梨酯80(TWEEN 80)。可以包括金属离子的掩蔽剂或螯合剂，例如EDTA。药物载体还包括用于水混溶性载体的聚乙二醇和丙二醇，以及用于调节pH值的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可以包括非抗微生物防腐剂。
药物组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其它这种试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。本文还预期植入缓释或持续释放系统，以维持恒定剂量水平(见例如美国专利号3,710,795)。这种胃肠外组合物中包含的活性化合物的百分比高度依赖于其特定性质以及化合物的活性和受试者的需求。
b.干燥的热稳定制剂
可以对细菌进行干燥。干燥的热稳定制剂，例如冻干或喷雾干燥的粉末和玻璃化的玻璃制品(vitrified glass)，可以重建为以溶液、乳剂和其它混合物形式施用。干燥的热稳定制剂可以由任何液体制剂例如上述悬浮液制备。药物制备物可以冻干或玻璃化形式存在，在使用前用水或其它合适的载体重建。
通过用无菌溶液重建干燥的化合物来制备施用的热稳定制剂。溶液可以包含赋形剂，其可以改善由粉末制备的活性物质或重建溶液的稳定性或其它药理学性质。通过将赋形剂例如葡聚糖糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适试剂溶解于合适的缓冲剂例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它本领域技术人员已知的这种缓冲剂中以制备热稳定制剂。然后，将原料药加入所得混合物中，并搅拌直至混合。将所得混合物分配到小瓶中以进行干燥。每个小瓶将包含单个剂量，包含每小瓶l×105至l×1011个CFU。干燥后，将产物小瓶用容器封闭系统密封，防止水分或污染物进入密封的瓶中。干燥的产物可以在适当的条件下存储，例如-20℃、4℃或室温下。用水或缓冲溶液重建所述干燥的制剂提供了用于胃肠外施用的制剂。精确量取决于所治疗的适应症和所选化合物。这种量可以根据经验确定。
4.用于其它施用途径的组合物
取决于所治疗的病况，本文还考虑了除胃肠外以外的其它施用途径，例如表面施用、透皮贴剂，口服和直肠施用。上述悬浮液和粉剂可以口服施用，或者可以重建以口服施用。用于直肠施用的药物剂型是作用于全身的直肠栓剂、胶囊和片剂以及凝胶胶囊。直肠栓剂包括插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，释放一种或多种药学或治疗活性成分。直肠栓剂中的药学上可接受的物质是基质或载体以及提高熔点的试剂。基质的实例包括可可脂(可可油)、甘油-明胶、(聚乙二醇)和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模制来制备。直肠栓剂的典型重量为约2至3克。用于直肠施用的片剂和胶囊是使用与口服施用制剂相同的药学上可接受的物质制备的及通过与口服施用制剂相同的方法制备的。适于直肠施用的制剂可以以单位剂量的栓剂提供。可以通过将原料药与一种或多种常规固体载体例如可可脂混合，并然后对所得混合物塑形而制备。
对于口服施用，药物组合物可以采取通过常规方式用药学上可接受的赋形剂制备的例如片剂或胶囊形式，所述赋形剂例如是粘合剂(例如预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羧乙酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法将片剂包被。
适用于颊(舌下)施用的制剂包括例如在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中含有所述活性化合物的锭剂(lozenges)；以及在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中含有所述化合物的糖锭剂(pastilles)。
如针对局部和全身施用所述制备局部表面施用混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，以及配制成霜剂、凝胶、软膏剂、乳剂、溶液剂、酏剂、洗剂、悬浮剂、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或其它适合局部表面施用的制剂。
所述组合物可以配制成用于局部用途的气雾剂，例如通过吸入(见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，描述了递送用于治疗肺部疾病的类固醇的气雾剂)。这些施用于呼吸道的制剂可以是单独或与惰性载体如乳糖组合以用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式或以用于吹入的微粉形式。在这种情况下，所述制剂的颗粒直径通常小于50微米或小于10微米。
可以将化合物配制成用于局部或表面施用，例如以凝胶、霜剂和洗剂形式表面应用于皮肤和粘膜例如眼中，以及应用于眼或脑池内或椎管内应用。预期表面施用是透皮递送，以及也施用于眼或粘膜，或用于吸入疗法。活性化合物的鼻用溶液也可以单独或与其它药学上可接受的赋形剂组合施用。
提供了适于透皮施用的制剂。其可以以任何合适的形式提供，例如适合于与接受者的表皮长时间保持紧密接触的分立贴剂。这种贴剂含有在任选缓冲水溶液中的活性化合物，所述缓冲水溶液例如对于活性化合物而言是0.1至0.2M的浓度。适于透皮施用的制剂也可以通过电离子透入疗法递送(见例如Tyle,P.(1986)Pharmaceutical Research 3(6):318-326)，以及通常采取活性化合物的任选缓冲水溶液的形式。
药物组合物也可以通过控释试剂和/或递送装置施用(见例如美国专利号3,536,809，3,598,123，3,630,200，3,845,770，3,916,899，4,008,719，4,769,027，5,059,595，5,073,543，5,120,548，5,591,767，5,639,476，5,674,533和5,733,566)。
5.剂量和施用
可以将所述组合物配制成用于单剂量或多剂量施用的药物组合物。所述免疫刺激细菌可以以对所治疗的患者不产生不良副作用的情况下足以发挥治疗有效作用的量包含于其中。例如，调节所述药物活性化合物的浓度，使得注射提供有效量以产生所需的药理作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中检测免疫刺激细菌而凭经验确定，例如通过使用本文所述或本领域已知的测定法。例如，可以采用标准的临床技术。可以采用体外测定法和动物模型以帮助确定最佳剂量范围。可以根据经验确定的精确剂量可以取决于患者或动物的年龄、体重、体表面积和病况、施用的特定免疫刺激细菌、施用途径、待治疗的疾病类型和疾病的严重性。
因此，应理解的是，精确的剂量和治疗持续时间取决于所治疗疾病，以及可以使用已知的检测方案凭经验确定或通过从体内或体外检测数据推断。浓度和剂量值也可以随待减轻的病症的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定的受试者，应根据个体需要及施用或监督施用所述组合物的人员的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，本文列出的浓度范围仅作为示例，并不意图限制组合物及包含其的组合的范围或用途。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年施用一次或仅施用一次。通常，选择剂量方案以限制毒性。应注意的是，主治医生知道根据毒性、骨髓、肝、肾或其它组织功能障碍如何以及何时终止、中断或调整疗法至更低剂量。相反，如果临床反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也知道如何以及何时将治疗调整到更高的水平。
所述免疫刺激细菌以足以发挥治疗有效作用的量包含在组合物中。例如，所述量是在治疗过度增殖性疾病或病况例如癌症中达到治疗效果的量，或者是作为疫苗有效的量，或者递送mRNA有效的量。示例的剂量可以是大约1×109CFU/m2，但取决于施用途径。如下表所示和上面提到的，可以施用更高的剂量。以下来自小鼠模型实验的数据显示，与VNP20009相比，具有本文所述基因组修饰的菌株的耐受性显著提高至少约15倍，因此可以以更高的量给药。
本文描述和提供的免疫刺激细菌可以通过任何合适的途径给药，包括但不限于经静脉注射(IV)和粘膜施用，如通过鼻/鼻内施用，以及通过吸入肺部。这在这样的实施方案中特别有利，其中所述细菌被用作针对病原体如细菌和病毒病原体的疫苗，包括例如严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)等病原体。所述细菌可以以片剂、粉剂或液体或其它合适的制剂形式提供；其可以冷冻储存，或冷藏，或在室温下储存，这取决于配方。因此，提供mRNA的细菌可以通过各种途径给药，并且可以方便地储存和配制。
具有药理学和治疗活性的化合物及其衍生物通常以单位剂量形式或多剂量形式配制和施用。每个单位剂量包含预定数量的治疗性活性化合物，足以产生所需的治疗效果，并与所需的药物载体、运载体或稀释剂相结合。单位剂量形式包括但不限于含有合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胃肠外混悬剂和口服溶液剂或混悬剂，以及水包油乳剂。单位剂量形式可以包含于小瓶、安瓿瓶和注射器中，或者是独立包装的片剂或胶囊剂。单位剂量形式可以其部分或多个施用。多剂量形式是包装在单个容器中以便以单独的单位剂型施用的多个相同的单位剂量形式。多剂量形式的实例包括片剂或胶囊小瓶或瓶或品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是在包装中未分开的多个单位剂量。通常，可以制备含有0.005％至100％范围的活性成分、其余部分由无毒载体平衡的剂型或组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。
单位剂量的胃肠外施用制备物包装在安瓿瓶、小瓶或带针头的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或重建的粉末制备物的体积取决于要治疗的疾病和选择用于包装的特定制备产物。如本领域已知和实践的，用于胃肠外施用的所有制备物必须是无菌的。
如所指出的，本文提供的组合物可以配制为本领域技术人员已知的任何途径，包括但不限于皮下、肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳道、透皮施用或任何施用途径。适用于这种途径的制剂为本领域技术人员已知。组合物也可以与其它生物活性物质相继、间歇地或在相同组合物中一起施用。
药物组合物可以通过控释制剂和/或递送装置来施用(见例如美国专利3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719；4,687,660；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,556；5,591,767；5,639,476；5,674,533；和5,733,566号)。已知各种递送系统，并可以用于施用预期在本文中使用的选择的组合物，并且这种颗粒可以容易地制备。
6.包装和制备产品
还提供了含有包装材料、本文提供的任何药物组合物和标示组合物用于治疗本文所述的疾病或病况的标签的制备产品。例如，标签可以标示所述治疗是针对肿瘤或癌症。
本文所述的免疫刺激细菌和另一种治疗剂的组合也可以包装在制备产品中。在一个实例中，所述制备产品包含含有所述免疫刺激细菌组合物的药物组合物，且不再包含其它试剂或治疗。在其它实例中，所述制备产品还包含另外治疗剂，例如不同的抗癌剂。在这个实例中，可以将所述试剂一起或分开提供，以包装为制备产品。
本文提供的制备产品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，每个专利均以其全部内容并入本文作参考。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适于选择的制剂和指定施用和治疗模式的任何包装材料。制备产品的示例是包括单室和双室容器的容器。所述容器包括但不限于管、瓶和注射器。容器可以进一步包括用于静脉内施用的针。
包装的选择取决于所述药剂，以及这些组合物是一起包装还是分开包装。通常，所述包装与其中所含的组合物不反应。在其它实例中，某些组分可以以混合物包装。在其它实例中，所有组分均单独包装。因此，例如可以将各组分包装为单独的组合物，在即将施用前混合，可以将其直接一起施用。可选地，可以将各组分包装为单独的组合物以分别施用。
包括选择的组合物的其制备产品的也可以以试剂盒提供。试剂盒可包括本文所述的药物组合物和以制备产品形式供施用的物品。所述组合物可以包含在用于施用的物品中，或者可以单独提供以随后加入。所述试剂盒可任选地包括使用说明，包括剂量、施用方案和施用方式说明。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。
I.治疗方法和用途
本文提供的方法包括施用或使用免疫刺激细菌用于治疗患有疾病或病况的受试者的方法，所述受试者的症状可通过施用这种细菌来改善或减轻，例如癌症。在特定的实例中，所述疾病或病况是肿瘤或癌症。本文提供的细菌还可作为疫苗和其它此类应用，如在上述各章节中讨论。在这些情况下，不仅可以像本节所述的那样，参照其作为抗癌剂的用途来施用细菌，还可以通过其它途径模仿各种病原体的自然进入途径施用。例如，如上述章节所讨论的，对于如针对病毒的疫苗接种，如呼吸道病毒，它们可以通过吸入鼻腔或肺部来施用。这些细菌在施用其的组织中引起T细胞应答和免疫应答，如在鼻子、食道和肺，以促进原位免疫应答，产生具有抗原特异性的记忆T细胞，以及B细胞，以提供长期应答。
另外，还提供了与一种或多种额外的药剂如抗癌剂或抗透明质酸剂的组合疗法的方法。所述细菌可以通过任何合适的途径施用，包括但不限于胃肠外、全身、表面和局部，例如通过瘤内、静脉内、直肠、口服、肌肉内、粘膜和其它途径。由于本文所述细菌的修饰，解决了与全身施用相关的问题。提供了适合于每种施用途径的制剂。本领域技术人员可以确立合适的方案和剂量及可以选择施用途径。
1.选择患者以进行治疗和监测治疗的诊断
a.患者选择
生物标志物可用于鉴定可能对用本文提供的免疫刺激细菌治疗有反应的患者。例如，腺苷特征和骨髓特征可以通过NanoString基因表达面板进行评估，肿瘤的T细胞浸润可以通过测试进行评估，该测试是在早期结肠癌患者中预测癌症复发风险的体外诊断测试，通过测量在肿瘤部位的宿主免疫应答进行。其肿瘤或体液指示免疫应答性或免疫应答的患者更可能对本文提供的免疫刺激细菌的治疗产生反应。
其它生物标志物包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CD73、CD39、TNAP(组织非特异性碱性磷酸酶)、CD38、CD68、PD-L1和FoxP3。例如，可以用本文提供的免疫刺激细菌治疗的肿瘤不包括T细胞，表现出高水平的嘌呤/腺苷，并且对PD-1/PD-L1靶向治疗无反应。
可以分析使用各种NanoString基因表达面板可确定的基因表达谱(GEP)，例如以鉴定肿瘤的“腺苷特征”。在某些肿瘤中发现了高浓度的腺苷，包括结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌等。具有高浓度嘌呤/腺苷的肿瘤患者可能对治疗有反应，因为本文中的免疫刺激细菌在富含嘌呤/腺苷的肿瘤微环境中积累和复制。因此，表达“腺苷特征”的肿瘤的鉴定可用于预测患者对治疗的反应。此外，本文中的免疫刺激细菌优先积累在并感染肿瘤驻留骨髓细胞。因此，“骨髓特征”也可用于预测患者对免疫刺激细菌治疗的反应。例如，已示出“腺苷特征”与“髓样特征”几乎相同，后者与肾细胞癌(RCC)患者对阿特珠单抗(抗PD-L1)单药治疗反应不佳有关，这表明腺苷在肿瘤逃避抗PD-L1治疗中的作用(见例如McDermott et al.(2018)Nature Medicine 24:749-757)。可获得肿瘤-骨髓和肿瘤-腺苷的NanoString特征板，且可用于选择患者。
巨噬细胞限制T细胞浸润到实体瘤中并抑制其功能，例如在三阴性乳腺癌中(见例如Keren et al.(2018)Cell 174:1373-1387)。在某些癌症中，例如CRC，巨噬细胞在肿瘤内免疫群体中占主导地位并促进T细胞排斥，因此与肿瘤相关的巨噬细胞与CRC的预后不良有关(见例如Bindea et al.(2013)Immunity 39:782-795)。是一种评估癌症患者预后的方法，基于浸润和包围癌症的免疫细胞，可用于测量T细胞排斥或T细胞浸润。将宿主免疫应答的影响纳入癌症分类并提高预后准确性。其测量肿瘤中心和周围两个T淋巴细胞群(CD3/CD8、CD3/CD45RO或CD8/CD45RO)的密度，当在两个区域发现这两种细胞类型的密度较低时，赋予从0开始的分值(I0)，当在两个区域均发现高密度时，赋予Immunoscore 4(I4)。T淋巴细胞的低浸润导致低/>这与高风险相关，而T淋巴细胞高浸润导致高/>这与低风险相关。因此，/>可以作为一种预期的生物标志物进行评估，以鉴定将对本文提供的免疫刺激细菌的治疗产生反应的患者。例如，可以治疗T细胞不佳/非炎症的肿瘤，因为本文提供的免疫刺激细菌在冷肿瘤中诱导T细胞浸润。这种肿瘤代表了对检查点抑制作用无效的高度需求人群。
胞外腺苷由膜相关胞外酶CD39(胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，或NTPDase1)和CD73(胞外5’-核苷酸酶)的连续活性产生，其在肿瘤基质细胞上表达，通过磷酸水解由死亡或垂死细胞产生的ATP或ADP一起产生腺苷。CD39将细胞外ATP(或ADP)转化为5’-AMP，后者被CD73转化为腺苷。在肿瘤微环境的缺氧条件下，内皮细胞上CD39和CD73的表达增加，从而增加了腺苷的水平。因此，CD39和CD73可用作指示富含腺苷的肿瘤的生物标志物，该肿瘤可被本文提供的免疫刺激细菌靶向。
CD38，也称为环状ADP核糖水解酶，是一种糖蛋白，存在于许多免疫细胞的表面，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞。作为细胞活化标志物的CD38的缺失与免疫应答受损有关，并且与白血病、骨髓瘤和实体瘤有关。此外，CD38表达增加是慢性淋巴细胞白血病的不利诊断标志物，并且与疾病进展增加有关。CD38也被用作已被批准用于治疗多发性骨髓瘤的达雷木单抗的靶。CD68由单核细胞、循环巨噬细胞和组织巨噬细胞(例如Kupffer细胞、小胶质细胞)高度表达。FoxP3参与免疫系统反应，并在具有免疫抑制作用的调节性T细胞(或Tregs)的发育和功能中充当调节剂。在癌症中，过度的调节性T细胞活性可以阻止免疫系统破坏癌细胞。因此，CD38、CD68和FoxP3也可用作生物标志物，用于选择可能对本文的免疫刺激细菌治疗有反应的患者。
b.评估或检测免疫刺激细菌活性的诊断表明治疗的有效性
生物标志物可用于监测治疗后的免疫刺激细菌。生物标志物存在于肿瘤样本和/或体液样本中，例如血液、血浆、尿液、唾液和其它体液。经验证的外周血生物标志物用于评估患者在治疗前和治疗期间的免疫状态，以确定与治疗效力相关的免疫状态变化。抗肿瘤免疫应答状态的改变或增加表明用免疫刺激细菌的治疗正在产生效力。可以评估本文提供的免疫刺激细菌的免疫调节活性，例如在剂量递增和扩展研究中。生物标志物的检验揭示了与疾病(例如肿瘤)状态及其治疗相关的预后和预测因素，这可有助于监测治疗。例如，评估肿瘤微环境可以深入了解肿瘤对免疫疗法的反应机制。用于检测免疫刺激细菌的免疫调节活性的血清生物标志物包括但不限于CXCL10(IP-10)、CXCL9、干扰素-β、干扰素-γ、促炎血清细胞因子(例如，IL-6、TNF-α、MCP-1/CCL1)和IL-18结合蛋白。
CXCL10和CXCL9是CD8+T细胞例如响应免疫疗法而活化和运输到肿瘤所必需的趋化因子。在作为抗PD-1免疫检查点抑制剂的纳武单抗(nivolumab)的3期试验中，对于治疗既往治疗的转移性肾细胞癌(mRCC)患者，鉴定了与施用的剂量无关的大多数患者都具有免疫药效学效应。使用基于Luminex技术(Rules-Based Medicine(RBM))的多重面板对IFN-γ调节的血清趋化因子CXCL9和CXCL10进行评估，结果表明与临床反应相关的CXCL9和CXCL10血清水平增加，以及在肿瘤中的转录增加。用纳武利尤单抗治疗后，外周血中趋化因子水平的中位数从基线水平增加101％(对于CXCL9)和37％(对于CXCL10)(见例如Choueiri et al.(2016)Clin.Cancer Res.22(22):5461-5471)。此外，使用MK-1454STING激动剂(Merck)治疗晚期实体瘤或淋巴瘤患者，导致肿瘤内给药后血清CXCL10呈剂量依赖性增加(见例如Harrington et al.ESMO Annual Meeting(2018))。
在瘤内给药ADU-S100 STING激动剂(Aduro)后，观察到血清IFN-β水平的剂量依赖性增加(见例如Meric-Bernstam et al.ASCO Annual Meeting(2019))。此外，VNP20009的静脉内施用诱导促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12的血清水平呈剂量依赖性增加(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。
IL-18参与对细胞内细菌、真菌和病毒的保护性免疫应答，并在肺癌、乳腺癌、肉瘤和黑色素瘤的临床前模型中显示出抗肿瘤活性。IL-18的生物活性在负反馈回路中受到IL-18结合蛋白(IL-18BP)的调节，通过IFN-γ诱导。因此，IL-18BP的血清水平可预测临床IFN-γ活性。为晚期癌症患者静脉内施用重组人IL-18(rhIL-18)导致血清IL-18结合蛋白浓度以剂量依赖性方式增加，以及IFN-γ、GM-CSF、和可溶性Fas配体也增加(见例如Robertsonet al.(2006)Clin.Cancer Res.12(14):4265-4273)。此外，观察到在尿和血清中IL-18BP水平与前列腺癌患者的肿瘤状态相关；尿IL-18BP水平在前列腺癌患者和非前列腺癌患者之间存在显著差异，血清IL-18BP水平升高例如与增加的前列腺癌Gleason评分相关，表明前列腺癌细胞分泌的IL-18BP升高可能表明癌症试图逃避免疫监视(见例如Fujita et al.(2011)Int.J.Cancer 129(2):424-432)。因此，IL-18BP可用作肿瘤免疫应答的生物标志物。
2.肿瘤
本文提供的免疫刺激细菌、组合、用途和方法适用于治疗所有类型的肿瘤，包括癌症，特别是实体瘤，包括肺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。所述方法也可用于血液学癌症。
通过本文提供的免疫刺激细菌、组合物、组合、用途和方法进行治疗的肿瘤和癌症包括但不限于源自免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳房、胰腺、胃肠道、中枢和周围神经系统、肾脏系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统包括关节、脂肪组织以及循环系统包括血管壁的那些肿瘤和癌症。可以用本文提供的免疫刺激细菌治疗的肿瘤的实例包括癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、腺癌、腺肉瘤、和腺瘤。这种肿瘤几乎可以发生在身体的所有部位，包括例如乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈、或肝脏。
骨骼系统的肿瘤包括例如肉瘤和母细胞瘤，例如骨肉瘤、软骨肉瘤和软骨母细胞瘤。肌肉和心脏肿瘤包括骨骼肌和平滑肌的肿瘤，例如平滑肌瘤(平滑肌的良性肿瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤(骨骼肌的良性肿瘤)、横纹肌肉瘤和心脏肉瘤。胃肠道的肿瘤包括例如口腔、食道、胃、小肠、结肠和结肠直肠的肿瘤，以及胃肠道分泌器官例如唾腺、肝、胰腺和胆道的肿瘤。中枢神经系统(CNS)的肿瘤包括脑、视网膜和脊髓的肿瘤，也可以起源于相关的结缔组织、骨骼、血管或神经组织。还考虑了周围神经系统肿瘤的治疗。周围神经系统的肿瘤包括恶性周围神经鞘瘤。肾脏系统的肿瘤包括肾的那些肿瘤，例如肾细胞癌，以及输尿管和膀胱的肿瘤。生殖系统的肿瘤包括子宫颈、子宫、卵巢、前列腺、睾丸和相关分泌腺的肿瘤。免疫系统的肿瘤包括基于血液的肿瘤和实体瘤，包括淋巴瘤，例如霍奇金(Hodgkin′s)和非霍奇金(non-Hodgkin′s)淋巴瘤。呼吸系统的肿瘤包括鼻道、支气管和肺的肿瘤。乳腺肿瘤包括例如小叶癌和导管癌。
可以通过本文提供的免疫刺激细菌和方法治疗的肿瘤的其它实例包括Kaposi肉瘤，中枢神经系统肿瘤，成神经细胞瘤，毛细血管性血管母细胞瘤，脑膜瘤和转移性脑肿瘤，黑素瘤，胃肠道癌和肾癌及肉瘤，横纹肌肉瘤，胶质母细胞瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)和平滑肌肉瘤。如本文提供的可以治疗的其它癌症的实例包括但不限于淋巴瘤，母细胞瘤，神经内分泌肿瘤，间皮瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，黑素瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤。这种癌症的实例包括恶性血液肿瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇氏金淋巴瘤(伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病，蕈样真菌病，套细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病和淋巴浆细胞白血病)，淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括B细胞型急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤，和T细胞型急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤，胸腺瘤，成熟T和NK细胞的肿瘤，包括外周T细胞白血病，成年T细胞白血病/T细胞淋巴瘤以及巨粒淋巴细胞白血病，朗格汉斯细胞组织细胞增多症，骨髓瘤形成例如急性髓性白血病，包括成熟型急性髓性白血病(AML)，无分化型AML，急性前髓细胞性白血病，急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞白血病，骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生性病症，包括慢性髓性白血病；中枢神经系统的肿瘤，例如神经胶质瘤、胶质母细胞瘤，成神经细胞瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，室管膜瘤和视网膜母细胞瘤；头颈部的实体瘤(例如，鼻咽癌，唾腺癌和食道癌)，肺癌(例如，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞癌)，消化系统癌症(例如胃癌，包括胃肠道癌，胆管或胆道癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌和肛门癌)，生殖系统癌(例如睾丸，阴茎或前列腺癌，子宫，阴道，外阴，子宫颈，卵巢和子宫内膜的癌症)，皮肤癌(例如黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，光化性角化病，皮肤黑素瘤)，肝癌(例如肝癌，肝癌瘤，肝细胞癌和肝细胞瘤)，骨癌(例如破骨细胞瘤和溶骨性骨癌)，其它组织和器官的癌症(例如胰腺癌，膀胱癌，肾脏癌或肾癌，甲状腺癌，乳腺癌，腹膜癌和卡波西肉瘤)，血管系统的肿瘤(例如血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)，威尔姆斯瘤(Wilms′tumor)，视网膜母细胞瘤，骨肉瘤和尤因氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)。
3.施用
在实践本文的用途和方法中，可以将本文提供的免疫刺激细菌施用于受试者，包括患有肿瘤或具有赘生性细胞的受试者或待免疫的受试者。可以在向受试者施用免疫刺激细菌之前、同时或之后进行一个或多个步骤，包括但不限于以适合于施用免疫刺激细菌的条件诊断受试者，确定受试者的免疫能力，对受试者进行免疫，用化学治疗剂治疗受试者，用放射治疗受试者或手术治疗受试者。
对于包括出于治疗目的而向荷瘤受试者施用免疫刺激细菌的实施方案，通常先前已经诊断出该受试者患有赘生病况。诊断方法还可包括确定赘生病况的类型，确定赘生病况的阶段，确定受试者中一种或多种肿瘤的大小，确定受试者的淋巴结中存在或不存在转移性或肿瘤细胞，或确定受试者存在转移。
为受试者施用免疫刺激细菌的治疗方法的一些实施方案可以包括确定原发肿瘤的大小或赘生性疾病的阶段的步骤，以及如果原发肿瘤的大小等于或大于阈值体积，或如果赘生性疾病的阶段处于或超过阈值阶段，则为受试者施用免疫刺激细菌。在相似的实施方案中，如果原发肿瘤的大小低于阈值体积，或者如果赘生性疾病的阶段处于或低于阈值阶段，则免疫刺激细菌尚未施用于受试者；这种方法可包括监测受试者直至肿瘤大小或赘生性疾病阶段达到阈值量，并然后将免疫刺激细菌施用于受试者。阈值大小可以根据一些因素而变化，包括肿瘤的生长速率、免疫刺激细菌感染肿瘤的能力以及受试者的免疫能力。通常，阈值大小将是足以使免疫刺激细菌在肿瘤内或附近累积和复制而不会被宿主的免疫系统完全去除的大小，且通常还是足以维持细菌感染足够长的时间以使宿主对肿瘤细胞产生免疫应答的大小，通常约一周或更长时间，大约十天或更长时间或大约两周或更长时间。示例的阈值阶段是超过最低阶段的任何阶段(例如，I阶段或等同阶段)，或者是原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或者是检测到转移性细胞的任何阶段。
可以使用为受试者施用微生物的任何方式，条件是施用方式允许免疫刺激细菌进入肿瘤或转移灶。施用方式可包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部、肿瘤内、多次穿刺、吸入、鼻内、口服、腔内(例如通过导管施用于膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用于肠道)、耳、直肠和眼部施用。
本领域技术人员可以选择与受试者和细菌相容以及也有可能导致细菌到达肿瘤和/或转移灶的任何施用方式。本领域技术人员可以根据多种因素中的任何一种来选择施用途径，包括疾病的性质、肿瘤的类型以及药物组合物中所含的特定细菌。可以例如通过弹道式递送以胶体分散系统的形式施用于靶部位，或者可以通过注射入动脉来进行全身施用。
剂量方案可以是多种方法和量中的任一种，以及可以由本领域技术人员根据已知的临床因素确定。对于治疗其中免疫刺激影响治疗的疾病或病症，单剂量可以是治疗有效的。这种刺激的示例是免疫应答，其包括但不限于特异性免疫应答和非特异性免疫应答之一或二者、特异性和非特异性应答二者、先天免疫应答、初级免疫应答、适应性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。
如医学领域所知，施用于受试者的剂量可以取决于许多因素，包括受试者的物种、体格、体表面积、年龄、性别、免疫能力和一般健康状况、施用的特定细菌、施用持续时间和途径、疾病的种类和阶段例如肿瘤大小以及同时施用的其它化合物例如药物。除了上述因素之外，如本领域技术人员可以确定的，这种水平还可以受到细菌的感染性和细菌的性质的影响。在本发明的方法中，细菌的合适的最小剂量水平可以是足以使细菌在肿瘤或转移灶中存活、生长和复制的水平。对于为65kg人施用细菌的示例的最低水平可包括至少约5×106集落形成单位(CFU)、至少约1×107CFU、至少约5×107CFU、至少约1×108CFU、或至少约1×109CFU。在本发明的方法中，细菌的合适的最大剂量水平可以是对宿主无毒的水平、不引起3倍或更大的脾肿大的水平、和/或在约1天后或约3天后或约7天后不会在正常组织或器官中产生集落或菌斑的水平。为65kg人施用细菌的示例的最大水平可包括不超过约5×1011CFU、不超过约1×1011CFU、不超过约5×1010CFU、不超过约1×1010CFU，或不超过约1×109CFU。
本文提供的方法和用途可包括为受试者单次施用免疫刺激细菌或为受试者多次施用免疫刺激细菌或其它各种方案，包括与其它抗肿瘤治疗剂和/或治疗的组合疗法。这些包括例如细胞疗法，例如施用经修饰的免疫细胞，CAR-T疗法，CRISPR疗法，免疫检查点抑制剂，如抗体(例如抗PD-1、抗PD-L1抗体，和抗CTLA-4抗体，及其它这种免疫治疗剂)，化学治疗性化合物，例如核苷类似物，手术和放疗。其它癌症治疗还包括抗VEGF、抗VEGFR、抗VEGFR2、抗TGF-β或抗IL-6抗体或其片段、癌症疫苗和溶瘤病毒。
在一些实施方案中，单次施用足以在肿瘤中建立免疫刺激细菌，其中细菌可以定植及可以在受试者中引起或增强抗肿瘤应答。在其它实施方案中，可以在不同的时机施用供本文方法中使用的免疫刺激细菌，时间间隔通常至少一天。在之前的施用可能无法有效地将细菌递送到肿瘤或转移灶的情况下，分开施用可以增加将细菌递送到肿瘤或转移灶的可能性。在实施方案中，分开施用可以增加肿瘤或转移灶上可能发生细菌定植/增殖的位置，或者可以以其它方式增加肿瘤中累积的细菌的滴度，这可以增加引发或增强宿主抗肿瘤免疫应答。
当进行分开施用时，每次施用可以是相对于其它施用剂量的量相同或不同剂量的量。在一个实施方案中，所有施用剂量的量是相同的。在其它实施方案中，第一剂量的量可以是比一个或多个后续剂量的量更大的剂量的量，例如，比后续剂量的量大至少10×，大至少100×或大至少1000×。在其中第一剂量的量大于一个或多个后续剂量的量的分开施用方法的一个实例中，所有后续剂量的量可以是相对于第一次施用而言相同的、较小的量。
分开施用可以包括两次或更多次施用中的任意数目，包括两次、三次、四次、五次或六次施用。根据本领域已知的用于监测治疗方法的方法和本文提供的其它监测方法，本领域技术人员可以容易地确定进行的施用次数，或进行一种或多种其它施用的需求。因此，本文提供的方法包括为受试者提供免疫刺激细菌的一次或多次施用的方法，其中可以通过监测受试者，并基于监视的结果确定是否要提供一次或多次其它施用来确定施用的次数。可以基于多种监测结果来决定是否提供一种或多种额外的施用，包括但不限于肿瘤生长的指示或肿瘤生长的抑制、新转移灶的出现或转移灶的抑制、受试者的抗细菌抗体滴度、受试者的抗肿瘤抗体滴度、受试者的整体健康状况和受试者的体重。
施用之间的时间段可以是多种时间段中的任何一个。施用之间的时间段可以取决于多种因素中的任何一个，包括关于施用次数所述的监测步骤，如关于施用次数所述，试者产生免疫应答的时间段，受试者清除正常组织中的细菌的时间段，或者肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段。在一个实例中，所述时间段可以取决于受试者产生免疫应答的时间段；例如，该时间段可以大于受试者产生免疫应答的时间段，例如大于约一周，大于约十天，大于大约两周或大于约一个月。在另一个实例中，所述时间段可以小于受试者产生免疫应答的时间段，例如小于约一周，小于约十天，小于约两周或小于约一个月。在另一个实例中，所述时间段可以取决于肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段；例如该时间段可以大于施用表达可检测标记的微生物后在肿瘤或转移灶中产生可检测信号的时间量，例如约3天，约5天，约一周，约十天，约两周或约一个月。
也可以通过施用含有本文提供的免疫刺激细菌的组合物例如混悬液和其它制剂来进行本文所用的方法。这种组合物包含如本文提供的或本领域技术人员已知的细菌和药学上可接受的赋形剂或载体。
如上所述，本文所提供的用途和方法除了为受试者施用免疫刺激细菌外，还包括为受试者施用一种或多种治疗性化合物，例如抗肿瘤化合物或其它癌症治疗剂。治疗性化合物可以独立地或与免疫刺激细菌一起发挥作用，用于肿瘤治疗作用。可以独立起作用的治疗性化合物包括各种已知的化学治疗性化合物中的任一种，所述化学治疗性化合物可以抑制肿瘤生长、抑制转移灶生长和/或形成、减小肿瘤或转移灶的尺寸、或消除肿瘤或转移灶，而不降低免疫刺激细菌在肿瘤中积累、在肿瘤中复制，以及引起或增强受试者的抗肿瘤免疫应答的能力。这种化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和对哌泊舒凡(piposulfan)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carubicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗雌激素包括，例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托米芬(toremifine，Fareston)；抗代谢物例如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、喋罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙基蜜胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylmelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylol melamine)；叶酸补充物(folic acid replenisher)，例如亚叶酸；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophos-phamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧二氯甲基二乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；蛋白质类如精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)和天冬酰胺酶(asparaginase)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮鸟苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和5-FU；紫杉烷类(taxanes)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel)以及其白蛋白化形式(即nab-紫杉醇和nab-多烯紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合酶抑制剂(如)；及其它化学治疗剂，包括乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰胼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)；/>丙亚胺(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2′2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside，“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)、去甲长春碱(Navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；/>伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-ll；视黄酸；esperamycin；卡培他滨(capecitabine)；和扑异构酶抑制剂如伊立替康(irinotecan)。可以使用上述中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
与免疫刺激细菌联合作用的治疗性化合物包括例如增加细菌的免疫应答引发性质的化合物，例如通过增加编码的治疗性产物的表达，所述治疗产物例如细胞因子，趋化因子，共刺激分子，组成型诱导I型IFN的蛋白质，抑制、阻抑或破坏检查点基因表达的RNAi分子，检查点抑制剂抗体和针对其它靶标的抗体或其片段，或可进一步增强细菌定植/增殖的化合物。例如，改变基因表达的化合物可以诱导或增加细菌中基因的转录，例如质粒上编码的外源基因，从而引发免疫应答。可以改变基因表达的多种化合物中的任何一种都是本领域已知的，包括IPTG和RU486。其表达可以上调的示例性基因包括编码蛋白质和RNA分子的那些基因，包括毒素、可以将前药转化为抗肿瘤药物的酶、细胞因子、转录调节蛋白、shRNA、siRNA和核酶。在其它实施方案中，可以与免疫刺激细菌联合起作用以增加细菌的定植/增殖或免疫应答引发性质的治疗性化合物是可以与细菌表达的基因产物相互作用的化合物，以及这种相互作用可以导致受试者中增加的肿瘤细胞杀死或增加的抗肿瘤免疫应答。可以与细菌表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可以包括例如前药或其它化合物，其在施用于受试者的形式几乎没有或没有毒性或具有其它生物活性，但是在与细菌表达的基因产物相互作用之后，所述化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但不限于细胞毒性、诱导凋亡的能力或触发免疫应答的能力。本领域已知多种前药样物质，包括更昔洛韦(ganciclovir)、5-氟尿嘧啶、6-甲基嘌呤脱氧核苷、头孢菌素-多柔比星、4-[(2-氯乙基)(2-甲硫氧基乙基))氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、对乙酰氨基酚、吲哚-3-乙酸、CB1954、7-乙基l0-[4-(l-哌啶基)-l-哌啶基]羰基氧喜树碱、双-(2-氯乙基)氨基-4-羟基苯基氨基甲酮28、1-氯甲基-5-羟基-1,2-二羟基-3H-苯并[e]吲哚、表柔比星-葡糖苷酸(epirubicin-glucoronide)、5’-脱氧5-氟尿苷、胞嘧啶阿糖胞苷和亚麻苦苷(linamarin)。
4.监测
本文提供的方法可进一步包括以下的一个或多个步骤：监测受试者、监测肿瘤和/或监测为受试者施用的免疫刺激细菌。本文提供的方法中可以包括多种监测步骤中的任一个，包括但不限于监测肿瘤大小、监测转移灶的存在和/或大小、监测受试者的淋巴结、监测受试者的体重或其它健康指标包括血液或尿液标记物、监测抗菌抗体滴度、监测可检测基因产物的细菌表达以及直接监测受试者的肿瘤、组织和器官中的细菌滴度。
监测的目的可以是简单地评估受试者的健康状态或受试者的治疗性处理的进展，或者可以确定是否需要进一步施用相同或不同的免疫刺激细菌，或者确定何时或是否将化合物施用于受试者，其中所述化合物可起到增加治疗方法的功效的作用，或者化合物可起到降低施用于受试者的细菌的致病性的作用。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括监测一种或多种细菌表达的基因。细菌，如本文提供的或本领域其它已知的那些细菌，可以表达一种或多种可检测的基因产物，包括但不限于可检测的蛋白质。
如本文所提供的，在细菌中表达的可检测基因产物的测量可以提供受试者中存在的细菌水平的准确测定。如本文进一步提供的，测量可检测基因产物的位置，例如通过包括断层成像方法的成像方法，可以确定细菌在受试者中的定位。因此，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定受试者的一个或多个器官或组织中细菌的存在与否，和/或受试者的肿瘤或转移灶中细菌的存在与否。此外，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定存在于一个或多个器官、组织、肿瘤或转移灶中的细菌的滴度。包括监测受试者中细菌的定位和/或滴度的方法可用于确定细菌的致病性，因为正常组织和器官的细菌感染，以及特别是感染水平可指示细菌的致病性。可以在多个时间点进行包括监测受试者中免疫刺激细菌的定位和/或滴度的方法，并因此可以确定受试者中的细菌复制速率，包括受试者的一个或多个器官或组织中的细菌复制率；因此，包括监测细菌基因产物的方法可以用于确定细菌的复制能力。本文提供的方法还可以用于定量存在于各种器官或组织以及肿瘤或转移灶中的免疫刺激细菌的量，并从而可以指示细菌在受试者中优先累积的程度；因此，细菌基因产物监测可用于确定细菌优先于正常组织或器官而在肿瘤或转移灶中累积的能力的方法。由于本文提供的方法中使用的免疫刺激细菌可以在整个肿瘤中累积或可以在肿瘤中的多个部位累积，并可以在转移灶中积累，本文提供的用于监测细菌基因产物的方法可用于确定肿瘤的大小或存在于受试者中的转移灶的数目。这种监测一段时间内肿瘤或转移灶中细菌基因产物的存在可用于评估肿瘤或转移灶的变化，包括肿瘤的生长或缩小，或新转移灶的进展或转移灶的消失，并可以用于确定肿瘤的生长或缩小的速率，或新转移灶的进展或转移灶的消失，或肿瘤的生长或缩小的速率变化，或新转移灶的进展或转移灶的消失。因此，通过确定肿瘤的生长或缩小的速率、或新转移灶的发展或转移灶的消失、或肿瘤的生长或缩小的速率变化、或新转移灶的进展或转移灶的消失，监测细菌基因产物可用于监测受试者的赘生性疾病，或确定治疗赘生性疾病的功效。
可以通过监测来检测多种可检测蛋白质的任一种，其示例是多种荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质)中的任一种、多种荧光素酶中的任一种、转铁蛋白或其它铁结合蛋白质；或受体、结合蛋白质、和抗体，其中特异性结合受体、结合蛋白或抗体的化合物可以是可检测物质或者可以用可检测物质(例如放射性核素或显像剂)进行标记。
肿瘤和/或转移灶大小可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种进行监测，包括外部评估方法或断层扫描或磁成像方法。除了本领域已知的方法，本文提供的方法例如监测细菌基因表达可用于监测肿瘤和/或转移灶大小。
在一些时间点监测大小可以提供有关肿瘤或转移灶的大小增加或缩小的信息，并还可以提供有关受试者中存在额外的肿瘤和/或转移灶的信息。在多个时间点监测肿瘤大小可以提供有关受试者中赘生性疾病进展的信息，包括治疗受试者中赘生性疾病的功效。
本文提供的方法还可以包括监测受试者中的抗体滴度，包括应答为受试者施用免疫刺激细菌而产生的抗体。本文提供的方法中施用的细菌可以引发对内源性细菌抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对由细菌表达的外源基因的免疫应答。本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对细菌抗原、细菌表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体滴度可用于监测细菌的毒性，治疗方法的功效或用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。
监测抗体滴度可用于监测细菌的毒性。在将细菌施用于受试者后的一段时间内，针对细菌的抗体滴度可能会有变化，其中在某些特定时间点，较低的抗(细菌抗原)抗体滴度可表示较高的毒性，而在其它时间点，高的抗(细菌抗原)抗体滴度可表示较高的毒性。本文提供的方法中使用的细菌可以是免疫原性的，并因此可以在将细菌施用于受试者后立即引发免疫应答。通常，当受试者的免疫系统可以从所有正常器官或组织中去除细菌时，受试者的免疫系统可以对免疫刺激细菌产生强烈免疫应答的免疫刺激细菌可以是具有低毒性的细菌。因此，在一些实施方案中，在将细菌施用于受试者之后不久，针对细菌抗原的高抗体滴度可以表明细菌的低毒性。
在其它实施方案中，监测抗体滴度可用于监测治疗方法的功效。在本文提供的方法中，抗体滴度如抗(肿瘤抗原)抗体滴度可以指示治疗方法例如治疗赘生性疾病的治疗方法的功效。本文提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答。因此，通过监测抗(肿瘤抗原)抗体的滴度，可以监测治疗方法引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答的功效。
在其它实施方案中，监测抗体滴度可用于监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。如本文所提供的，通过在肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中累积的微生物中表达外源基因，本发明方法可用于产生蛋白质、RNA分子或其它化合物。监测针对蛋白质、RNA分子或其它化合物的抗体滴度可以指示肿瘤累积的微生物产生的蛋白质、RNA分子或其它化合物的水平，以及可以直接指示特异于这种蛋白质、RNA分子或其它化合物的抗体的水平。
本文提供的方法还可以包括监测受试者健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括赘生性疾病治疗方法。如本领域中已知的，监测受试者的健康可以用于确定治疗方法的功效。本文提供的方法还可以包括为受试者施用本文提供的免疫刺激细菌的步骤。监测受试者的健康可以用于确定施用于受试者的免疫刺激细菌的致病性。如本领域中已知的，可以监测用于监测疾病例如赘生性疾病、感染性疾病或免疫相关疾病的多种健康诊断方法的任一种。例如，受试者的体重、血压、脉搏、呼吸、面色、温度或其它可观察到的状态均可以指示受试者的健康。另外，来自受试者的样品中一种或多种组分的存在或不存在或水平可以指示受试者的健康。典型的样品可以包括血液和尿液样品，其中一种或多种组分的存在或不存在或水平可以通过进行例如血液全系或尿液全系诊断测试来确定。指示受试者健康的示例组分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容和c-反应蛋白浓度。
本文提供的方法可以包括监测疗法，其中治疗决策可以基于监测的结果。本文提供的治疗方法可以包括为受试者施用免疫刺激细菌，其中细菌可以优先在肿瘤、肿瘤微环境或肿瘤驻留免疫细胞和/或转移灶中累积，在其中细菌可以引起或增强抗肿瘤免疫应答。这种治疗方法可以包括多个步骤，包括多次施用特定的免疫刺激细菌，施用第二种免疫刺激细菌或施用治疗性化合物。可以基于监测受试者的一种或多种结果来确定施用于受试者的免疫刺激细菌或化合物的量、时间或类型。例如，受试者中的抗体滴度可用于确定是否需要施用免疫刺激细菌和任选地化合物，施用的细菌和/或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如，低抗体滴度可指示期望施用额外的免疫刺激细菌、不同的免疫刺激细菌和/或治疗性化合物，例如诱导细菌基因表达的化合物或独立于免疫刺激细菌有效的治疗性化合物。
在另一个实例中，受试者的总体健康状况可以用于确定是否需要施用免疫刺激细菌和任选地化合物、施用的细菌或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如确定受试者是健康的可表示需要施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物如诱导细菌基因/遗传有效载荷/治疗产物表达的化合物。在另一个实例中，监测可检测的细菌表达的基因产物可以用于确定是否需要施用免疫刺激细菌和任选地化合物、施用的细菌或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如确定受试者是健康的可指示需要施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物如诱导细菌基因/遗传有效载荷/治疗产物表达的化合物。这种监测方法可以用于确定治疗方法是否有效，治疗方法对于受试者是否是致病性的，细菌是否已在肿瘤或转移灶中累积，以及细菌是否在正常组织或器官中累积。基于这种确定，可以得出进一步治疗方法的期望和形式。
在另一个实例中，监测可以确定免疫刺激细菌是否已经在受试者的肿瘤或转移灶中累积。基于这种确定，可以决定为受试者进一步施用额外的细菌、不同的免疫刺激细菌和任选的化合物。
J.实施例
仅用于说明示例目的包括以下实施例，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)营养缺陷型菌株
沙门氏菌菌株YS1646对于腺苷是营养缺陷型
本文提供的菌株被工程化为对于腺苷是营养缺陷型的。结果，其在体内是减毒的，因其不能在低腺苷浓度的正常组织中复制，且定植主要发生在腺苷水平高的实体瘤微环境(TME)中。沙门氏菌菌株YS1646是野生型菌株ATCC#14028的衍生物，由于purI基因(与purM同义)的破坏而被工程化为对于嘌呤是营养缺陷型的(见例如Low et al.(2004)MethodsMol.Med.90:47-60)。随后对YS1646整个基因组的分析表明，purI基因实际上并未缺失，而是被染色体倒位破坏(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnol.192:177-178)，整个基因仍包含在YS1646染色体的两部分中，其侧翼是插入序列，其中一个具有活性转座酶。purI基因的完整基因序列的存在通过染色体再联锁方式被破坏，留下回复为野生型基因的可能性。虽然之前已经证实YS1646的嘌呤营养缺陷型在体外连续传代>140代之后仍是稳定的，但不清楚回复率是多少(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。
本文表明，当提供腺苷时，菌株YS1646能在基本培养基中复制，而野生型亲本菌株ATCC#14028可以在未补充腺苷的基本培养基中生长。将YS1646在溶原性肉汤(LB)培养基中生长过夜，用M9基本培养基洗涤，然后在不含腺苷或增加浓度的腺苷的M9基本培养基中稀释。使用M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃下测量生长，每15分钟读取一次OD600。
结果表明，与能在所有腺苷浓度下生长的野生型菌株(ATCC#14028)不同，YS1646菌株仅在提供11至300微摩尔浓度的腺苷时才能复制，但在单独的M9或补充有130纳摩尔腺苷的M9中完全无法复制。这些数据表明purI突变体在肿瘤微环境中发现的腺苷浓度下能复制，但在正常组织中发现的浓度下不能复制。本文举例说明的工程化的腺苷营养缺陷型的菌株包括其中从染色体中缺失全部或部分purI开放读框的菌株，以防止回复为野生型。这种基因缺失可通过本领域技术人员已知的任何方法实现，包括如下所述的λred系统。
沙门氏菌菌株YS1646对于ATP是营养缺陷型的
除了嘌呤和腺苷营养缺陷外，还确定了purI缺失的菌株是否也能清除ATP。由于垂死的肿瘤细胞的渗漏，ATP在肿瘤微环境中累积到高水平。如本文所示，当提供ATP时，菌株YS1646能在基本培养基中复制，但在不补充ATP时无法生长。为了证实这一点，将菌株YS1646在LB培养基中生长过夜，用M9基本培养基洗涤，然后在不含ATP或增加浓度的ATP(Fisher)的M9基本培养基中稀释。使用M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃测量生长，每15分钟读取一次OD600。结果表明，当以0.012mM浓度提供ATP时，菌株YS1646能复制，但仅在M9中时不能。
实施例2
胞内复制缺陷归因于msbB突变
YS1646菌株在purI中包含突变，这样将复制限于含有高浓度嘌呤、腺苷或ATP的位点，及在msbB中的突变，其改变脂多糖(LPS)表面包被以减少TLR4介导的促炎信号传导。也已经确定，与野生型沙门氏菌不同，菌株YS1646无法在巨噬细胞中复制。进行实验以确定这些基因突变中的哪一个突变导致在野生型菌株ATCC 14028中赋予这个表型。
在这个测定中，将小鼠RAW巨噬细胞(InvivoGen,San Diego,Ca.)用含有purI、msbB或这两者缺失的野生型沙门氏菌菌株感染30分钟，感染复数(MOI)每个细胞约5个细菌，然后用PBS洗涤细胞，加入含有庆大霉素的培养基杀死胞外细菌。庆大霉素不能杀死细胞内细菌，因为其不能穿过细胞膜。在感染后的不同时间点，将细胞单层用水渗透压裂解，将细胞裂解物稀释并铺在LB琼脂上，以计算存活的集落形成单位(CFU)。
如下表所示，仅包含purI-突变的野生型沙门氏菌菌株仍然能复制。这解释了为什么单独purI缺失仅观察到耐受性的适度改善，同时实现了对肿瘤微环境的高度特异性。仅含有msbB-突变的菌株以及含有purI-和msbB-突变的菌株不能复制且在48小时内从细胞中迅速清除。
实施例3
沙门氏菌asd基因敲除菌株工程化和鉴定
制备菌株YS1646Δasd。其是衍生自菌株YS1646(可购自ATCC，目录号#202165)的减毒鼠伤寒沙门菌菌株，已被工程化为具有asd基因缺失。在这个实施例中，将鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)菌株YS1646Δasd使用如下文所述的Datsenko和Wanner方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))的修改进行工程化。
在YS1646菌株中引入λ-Red辅助质粒
如先前所述(Sambrook J.(1998)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory)，通过在LB中生长培养物并浓缩100倍，然后用冰冷的10％丙三醇洗涤三次将YS1646菌株制备为电感受态。使用λ-Red辅助质粒pKD46(SEQ ID NO:218)在以下设置下使用0.2cm间隙比色皿对所述电感受态菌株进行电穿孔：2.5kV，186ohms，50μF。在30℃将携带pKD46的转化株在具有氨苄青霉素和1mM L-阿拉伯糖的5mL SOC培养基中生长。然后如以上针对YS1646菌株所述将含有λ-Red辅助质粒pKD46的YS1646克隆制备为电感受态。
构建asd基因敲除盒
来自YS1646的基因组的asd基因(Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)用于设计asd基因敲除盒。将含有分别与asd基因的左侧和右侧区域同源的204bp和203bp的质粒转化到DH5-α感受态细胞中(Thermo Fisher Scientific)。将侧翼是lox P位点的卡那霉素基因盒克隆到这个质粒中。然后使用引物asd-l和asd-2(见表1)对asd基因敲除盒进行PCR扩增，并进行凝胶纯化。
asd基因的缺失
用凝胶纯化的线性asd基因敲除盒对携带质粒pKD46的YS1646菌株进行电穿孔。在SOC培养基中回收电穿孔的细胞，并将其铺板于补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/ml)的LB琼脂平板上。在这个步骤期间，λ-Red重组酶诱导染色体asd基因与kan盒的同源重组(由于存在于染色体asd基因上游和下游的同源侧翼序列)，并且发生asd基因的染色体拷贝的敲除。通过用来自破坏位点侧翼的YS1646基因组的引物(引物asd-3)和来自多克隆位点的引物(引物scFv-3)进行PCR扩增证实了选择的卡那霉素抗性克隆中存在被破坏的asd基因(见表1)。将集落也复制地铺板于有和没有补充DAP的LB平板上，以证实DAP营养缺陷。在没有补充DAP的情况下，所有具有asd基因缺失的克隆均无法生长，这表明DAP营养缺陷。
表1：引物信息
卡那霉素基因盒去除
通过使用Cre/loxP位点特异性重组系统去除kan选择性标记。用pJWT68(表达Cre重组酶的温度敏感质粒，SEQ ID NO:224)转化YS1646Δasd基因KanR突变体。在30℃选择AmpR集落；随后通过在42℃生长而消除pJWT68。然后通过复制铺板在具有和不具有卡那霉素的LB琼脂平板上检测选择的克隆的kan缺失，并使用来自在破坏位点侧翼的YS1646基因组的引物(引物asd-3和asd-4，引物序列见表1)通过PCR验证进行确认。
功能性asd缺失突变体菌株YS1646Δasd(也称作AST-101)的确认
Δasd突变体无法在37℃的LB琼脂平板上生长，但能在包含50μg/mL二氨基庚二酸(DAP)的LB平板上生长。在LB液体培养基中评估Δasd突变体生长速率；其无法在液体LB中生长，但能在补充有50μg/mL DAP的LB中生长，如通过在600nM测量吸光度所测定的。
asd基因缺失后菌株YS1646Δasd中asd基因座序列的序列确认
使用引物asd-3和asd-4(见表1)通过DNA测序来验证asd基因缺失菌株。对在asd基因座侧翼的区域进行测序，证实所述序列中asd基因从YS1646染色体缺失。
通过质粒的asd表达互补asd缺失
化学合成质粒(pATIU6)并组装(SEQ ID NO:225)。所述质粒包含以下特征：高拷贝(pUC19)复制起点，用于驱动短发夹表达的U6启动子，侧翼是随后去除的HindIII限制性位点的氨苄青霉素抗性基因，以及包含在起始密码子上游序列的85个碱基对的asd基因(SEQID NO:246)。通过用SpeI和XhoI进行限制性消化并连接和克隆到大肠杆菌DH5-α中，将靶向鼠TREX1的shRNA引入这个载体。所得的质粒称作pATI-shTREX1。
将质粒电穿孔进免疫刺激细菌菌株中
使用ECM600电穿孔仪，使用0.2cm间隙比色皿(BTX,San Diego,Calif)在以下设置下将含有编码免疫刺激蛋白和功能性asd基因的表达盒的选择的质粒电穿孔到缺乏asd基因的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株中：2.5kV，186ohms，50μF。将经电穿孔的细胞加入补加50μM二氨基庚二酸(DAP)的1mL SOC中，在37℃温育1小时，然后播布于不含DAP的琼脂平板上，以选择接受了具有功能性asd基因质粒的菌株。在分离单集落后，将一个充分分离的鼠伤寒沙门氏菌集落接种在无菌溶原性肉汤(LB)的烧瓶中，在37℃以250RPM搅拌温育，从而产生细胞库。将培养物生长至稳定期后，将细菌在含有10％甘油的PBS中洗涤，在低于-60℃的条件下等份冷冻保存。
将质粒pATI-shTREX1在大肠杆菌中扩增并纯化以通过电穿孔转化为YS1646Δasd菌株中，在LB Amp平板上克隆选择，以产生菌株YS1646Δasd-shTREX1。用与pATIU6衍生的质粒互补的YS1646Δasd突变体能在没有DAP的LB琼脂和液体培养基上生长。
在随后的迭代中，将来自pAT1-shTREX1的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)用卡那霉素抗性基因取代。这是通过用HindIII消化pATI-shTREX1质粒，然后进行凝胶纯化以去除AmpR基因而实现的。使用引物APR-001和APR-002(分别为SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:227)通过PCR扩增卡那霉素抗性(KanR)基因，然后用HindIII消化并连接到凝胶纯化的、消化的pATIU6质粒中。
在随后的迭代中，使用定向位点诱变试剂盒(New England Biolabs)和引物APR-003(SEQ ID NO:228)和APR-004(SEQ ID NO:229)在pUC19复制起点将单点突变引入pATIKan质粒中，以将第148位核苷酸T变为C。这个突变使所述复制起点与pBR322复制起点同源，后者是低拷贝复制起点，以减少质粒拷贝数。
使用asd互补系统在体内证实质粒维持
在这个实施例中，将CT26荷瘤小鼠用含有表达靶向TREX1的shRNA的质粒的菌株YS1646(YS1646-shTREX1)或含有带有功能性asd基因和靶向TREX1的shRNA的质粒的asd缺失的YS1646菌株(YS1646Δasd-shTREX1)处理。
CT26(结肠肿瘤#26)是一种肿瘤模型，源自将BALB/c小鼠暴露于N-硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯(NMU)，导致高度转移癌，重现侵润性、未分化和检查点难治性人结直肠癌(见例如Castle et al.(2014)BMC Genomics 15(1):190)。当经皮下植入侧腹时，与原位植入结肠相反，肿瘤免疫表型更具免疫抑制性和检查点难治性。虽然大量缺乏T细胞浸润，但肿瘤富含如巨噬细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)等骨髓细胞(见例如Zhao et al.(2017)Oncotarget 8(33):54775-54787)。由于这个模型更类似于人微卫星稳定(MSS)结直肠癌，因此是评估本文提供的治疗方法的理想模型。
对于这个实验，为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组3只)在右侧腹部经皮下(SC)接种CT26(购自ATCC)肿瘤细胞(在100μL PBS中2×105个细胞)。在第8、15和23天，为对带有8天龄植入的侧腹部肿瘤的小鼠经静脉注射3剂5×106CFU的YS1646Δasd-shTREX1菌株或亲本菌株YS1646-shTREX1。所述质粒编码shTREX1作为示例的治疗产物；任何其它希望的治疗产物均可被取代。
每周测量两次体重和肿瘤。使用电子卡尺(Fowler,Newton,MA)进行肿瘤测量。肿瘤体积采用修正的椭圆体公式1/2(长×宽2)计算。根据IACUC规定，当肿瘤大小达到体重的>20％或坏死时，对小鼠实施安乐死。
在最后一次注射沙门氏菌后12天，将肿瘤匀浆，并将匀浆连续稀释及铺板于LB琼脂平板上，以计算存在的集落形成单位(CFU)的总数，或铺板于含有卡那霉素的LB平板上以计算卡那霉素抗性集落数量。
结果表明，鼠伤寒沙门氏菌YS1646-shTREX1没有选择压力以维持shRNA质粒，并且表现出显著的质粒损失，因为卡那霉素抗性(KanR)集落百分比小于10％。使用asd基因互补系统进行质粒维持的菌株YS1646Δasd-shTREX1具有几乎相同数量的卡那霉素抗性和卡那霉素敏感性CFU。这些数据表明，asd基因互补系统足以在小鼠肿瘤微环境的背景下维持质粒。
使用asd互补系统增强的抗肿瘤效力
asd互补系统被设计为防止质粒缺失及增强鼠伤寒沙门氏菌菌株在体内递送治疗产物的抗肿瘤功效。为了测试这一点，将含有shTREX1质粒(YS1646Δasd-shTREX1)或含有功能性asd基因盒的乱序对照(YS1646Δasd-shSCR)的YS1646Δasd菌株在鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效与含有质粒pEQU6-shTREX1的YS1646菌株(YS1646-shTREX1)进行比较，质粒pEQU6-shTREX1是一种缺乏asd基因盒的质粒，因此没有质粒维持机制。shTREX1是示例的治疗产物。
对于这个实验，为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组8只)经皮下在右侧腹部接种CT26细胞(在100μL PBS中2×105个细胞)。在第8天和第18天，为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉注射5×106CFU的YS1646Δasd-shTREX1或YS1646-shTREX1，并与PBS对照组进行比较。
与PBS相比，YS1646-shTREX1菌株表现出增强的肿瘤控制(70％肿瘤生长抑制(TGI)，第28天)，尽管其质粒随着时间的推移而缺失。与PBS相比，含有具有asd基因互补系统的质粒和shTREX1的Δasd菌株(YS1646Δasd-shTREX1)显示出优于PBS的肿瘤生长抑制(82％ TGI，p＝0.002，第25天)。这些数据表明，与包含不具有asd基因互补系统的质粒的YS1646相比，通过防止质粒缺失、使用asd互补系统和shTREX1的递送，可以提高效力。因此，具有asd互补系统的菌株是优良的抗癌治疗剂。
实施例4
通过缺失fliC和fljB基因的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白敲除
菌株工程化和鉴定
在本文的实施例中，将含有asd基因缺失的活的减毒的鼠伤寒沙门菌菌株YS1646进一步工程化以缺失fliC和fljB基因，以除去两个鞭毛蛋白亚基。这样消除了促炎TLR5激活，以减少促炎信号传导和改良抗肿瘤适应性免疫。
fliC基因的缺失
在这个实施例中，如在前述实施例中详细描述的使用Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))的修改方法将fliC从YS1646Δasd菌株的染色体中缺失。简而言之，将在fliC基因侧翼含有224个和245个碱基的同源序列的合成的fliC基因同源臂序列，克隆进称为pSL0147的质粒(SEQ ID NO:230)中。然后将侧翼是cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到质粒pSL0147中，然后用引物fliC-l(SEQ ID NO:232)和fliC-2(SEQ ID NO:233)对fliC基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，然后通过电穿孔将其引入带有温度敏感性λ-Red重组质粒pKD46的YS1646Δasd菌株中。在SOC+DAP培养基中回收电穿孔的细胞，并铺板于补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/mL)的LB琼脂板上。选择集落并筛选以通过使用引物fliC-3(SEQ ID NO:234)和fliC-4(SEQ IDNO:235)进行PCR以插入敲除片段。然后通过在42℃培养选择的卡那霉素抗性菌株及筛选氨苄青霉素抗性丧失对pKD46进行处理。然后，通过电穿孔表达Cre重组酶的温度敏感质粒(pJW168)处理卡那霉素抗性标记，在30℃选择AmpR集落；随后通过在42℃生长培养物以消除pJW168。然后通过使用在破坏位点侧翼的引物(fliC-3和flic-4)进行PCR和在琼脂糖凝胶上的电泳迁移率的评估，以检测选择的fliC敲除克隆的卡那霉素标记缺失。
fljB基因的缺失
然后，使用上述修饰方法，在YS1646Δasd/ΔfliC菌株中缺失fljB。合成的fljB基因同源臂序列，其含有fliB基因侧翼的分别为249和213个碱基的左手侧和右手侧序列，将其合成并克隆到称为pSL0148的质粒中(SEQ ID NO:231)。然后将侧翼是cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0148中，然后用引物fljb-l(SEQ ID NO:236)和fljb-2(SEQ IDNO:237)(见表1)对fljB基因敲除盒进行PCR扩增及凝胶纯化，通过电穿孔将其引入带有温度敏感性λ-Red重组质粒pKD46的YS1646Δasd/ΔfliC菌株中。然后如上所述通过Cre-介导的重组以处理卡那霉素抗性基因，通过在非容许温度下生长以处理温度敏感性质粒。通过分别使用引物fliC-3和fliC-4或fljb-3(SEQ ID NO:238)和fljb-4(SEQ ID NO:239)进行PCR以扩增fliC和fljB基因敲除序列，通过DNA测序进行验证。将YS1646的这个突变衍生物命名为YS1646Δasd/ΔfliC/ΔfljB，或简短称作YS1646Δasd/ΔFLG。
工程化的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白敲除菌株的体外鉴定
通过将10μL的过夜培养物点样于游泳平板(含有0.3％琼脂和50mg/mL的DAP的LB)上以评估具有fliC和fljB缺失的YS1646衍生的asd-突变菌株(在本文称为YS1646Δasd/ΔFLG)的游泳运动性。虽然观察到了YS1646Δasd菌株的运动性，但YS1646Δasd/ΔFLG菌株明显没有运动性。然后将YS1646Δasd/ΔFLG菌株用含有asd基因的质粒电穿孔，评估其在没有DAP下的生长速率。具有asd互补质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株在不存在补充DAP的情况下能在LB中复制，并且以与含有asd互补质粒的YS1646Δasd菌株相当的速率生长。这些数据表明，鞭毛蛋白的消除不降低鼠伤寒沙门菌在体外的适应性。
鞭毛的消除降低鼠巨噬细胞中的细胞焦亡
在庆大霉素保护试验中以MOI约100用均具有asd互补质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株或亲本YS1646Δasd菌株感染5×105个小鼠RAW巨噬细胞(InvivoGen,San Diego,Ca.)。感染24小时后，使用PierceTMLDH细胞毒性测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma.)，收集培养物上清液并评估作为细胞死亡的标志的乳酸脱氢酶释放。YS1646Δasd菌株诱导75％的最大LDH释放，而YS1646Δasd/ΔFLG菌株诱导54％的最大LDH释放，表明鞭毛蛋白基因的缺失降低了鼠伤寒沙门菌诱导的感染的巨噬细胞的细胞焦亡。
鞭毛缺失的突变体导致感染的人单核细胞中较少的细胞焦亡
为了证实YS1646Δasd/ΔFLG菌株引起巨噬细胞中细胞死亡的能力降低，将THP-1人巨噬细胞(ATCC目录号#202165)用鼠伤寒沙门氏菌菌株YS1646和YS1646Δasd/ΔFLG菌株感染，Δasd菌株含有编码功能性asd基因的质粒以确保质粒维持。将5×104个细胞置于具有DMEM和10％ FBS的96孔培养皿中。将细胞用洗涤的鼠伤寒沙门氏菌对数期培养物感染1小时，MOI为100CFU/细胞，然后用PBS洗涤细胞，并将培养基替换为含有50μg/mL庆大霉素和50ng/mL的IFNγ的培养基，庆大霉素用以杀死细胞外细菌，IFNγ用以将单核细胞转化为巨噬细胞表型。24小时后，将THP-1细胞用CellTiter-试剂(Promega)染色，存活细胞的百分比使用发光细胞存活测定法确定，使用/>M3平板读器(Molecular Devices)以量化发光。感染YS1646菌株的细胞只有38％的存活率，而感染YS1646Δasd/ΔFLG菌株的细胞有51％的存活率，表明鞭毛蛋白基因的缺失导致人巨噬细胞的细胞死亡减少，尽管具有非常高的超生理性MOI。
在全身性施用后鞭毛不再为肿瘤定植所需要
为了评估在结肠癌小鼠模型中施用的鞭毛蛋白敲除菌株的影响，为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只小鼠)经皮下在右侧腹部接种CT26细胞(100μL PBS中的2×105个细胞)。带有10天已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉注射单剂量3×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株或亲本YS1646Δasd-shTREX1菌株。在肿瘤植入后第35天，对小鼠实施安乐死，将肿瘤均质化及铺板于LB平板上以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)数。YS1646Δasd-shTREX1菌株定植的肿瘤的平均值为每克肿瘤组织5.9×107CFU，而鞭毛缺失的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株定植的肿瘤的平均值几乎增加了2倍，为每克肿瘤组织1.1×108CFU。YS1646Δasd-shTREX1菌株的脾定植经计算为平均每克脾组织1.5×103CFU，而鞭毛缺失的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株的脾定植略低，平均为每克脾组织1.2×103CFU。
这些数据表明，在静脉内施用后，鞭毛的缺失不仅不会对肿瘤定植产生负面影响，而且与鞭毛完整菌株相比增强肿瘤定植。重要的是，鞭毛的缺失略微减少脾定植，使肿瘤与脾的比率是100,000倍。这些数据表明，与本领域的预期相反，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且其消除增强了肿瘤定植同时减少了脾定植。
鞭毛缺失的菌株在小鼠中证实增强的抗肿瘤活性
为了评估在结肠癌小鼠模型中施用鞭毛蛋白敲除菌株的影响，将6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种CT26细胞(在100μL PBS中2×105个细胞)。为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射单剂量3×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株或YS1646Δasd-shTREX1菌株，并与PBS对照组进行比较。通过卡尺测量监测小鼠的肿瘤生长。
结果表明，与亲本YS1646Δasd-shTREX1菌株相比，无法产生鞭毛的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株显示出增强的肿瘤控制(27％ TGI，第24天)，与PBS对照组相比具有显著的肿瘤控制作用(73％ TGI，p＝0.04，第24天)。这些数据表明，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且鞭毛的缺失可以增强抗肿瘤功效。
鞭毛缺失的菌株在鼠肿瘤模型中证实增强的适应性免疫
评估了鞭毛缺失对免疫应答的影响，以及肿瘤骨髓细胞向STING检查点基因TREX1递送shRNA而激活STING是否会促进适应性I型IFN免疫特征。使用CT26结肠癌小鼠模型，其中为6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种CT26细胞(100μL PBS中2×105个细胞)。携带已建立的侧腹肿瘤的小鼠在肿瘤植入后11天用5×106CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株、或亲本YS1646Δasd-shTREX1或乱序质粒对照菌株YS1646Δasd-shSCR进行静脉注射，并与PBS对照组进行比较。在给药后7天在肝素钠涂层管(BecktonDickinson)上对小鼠进行放血。然后用等体积的PBS稀释未凝固的血液，使用-M细胞分离试剂(Cedarlane)从全血的中间层中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过在室温以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤分离的PBMC，并重新悬浮在流动缓冲液中。在V形底96孔平板的每个孔中接种100万个PBMC。将细胞在室温(RT)下以1300RPM离心3分钟，然后在室温避光重悬于100μL流动缓冲液中45分钟，所述缓冲液中含有荧光染料缀合的AH1肽：MHCI类四聚体(MBL International)和细胞表面流式细胞术抗体CD4 FITC克隆的RM4-5、CD8aBV421克隆53-6.7、F4/80APC克隆BM8、CD11b PE-Cy7克隆M1/70、CD45 BV570克隆30-F11、CD3 PE克隆145-2C11、Ly6C BV785克隆HK1.4、I-A/I-E APC-Cy7克隆M5/114.15.2、Ly6GBV605克隆1A8和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69(均来自BioLegend)。45分钟后，通过以1200RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于含有DAPI(4’,6-二氨基-2-苯基吲哚，死/活(dead/live)染色)的PBS+2％ FBS中，立即使用/>流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取数据，并使用F1owJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
以下细胞类型被列举为总活细胞的百分比：CD11b+Gr1+中性粒细胞(可能是MDSC，但需要在离体功能测定中进一步表型)、CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD8+T细胞和识别CT26肿瘤排斥抗原gp70(AH1)的CD8+T细胞，鼠白血病病毒(MuLV)相关细胞表面抗原的包膜基因产物(见例如Castle et al.(2014)BMC Genomics 15(1):190)。
下表总结的结果表明，与PBS(p＝0.02)相比、与鞭毛完整的菌株YS1646Δasd-shTREX1(p＝0.02)相比、与鞭毛缺失的的菌株YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1(p＝0.01)(其具有最低水平的循环中性粒细胞)相比，含有编码非特异性乱序shRNA的质粒的YS1646Δasd-shSCR菌株引发了显著增加的中性粒细胞的典型抗菌免疫应答。相似地，与PBS(p＝0.01)相比、与YS1646Δasd-shTREX1菌株(p＝0.01)相比以及与YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株(p＝0.01)相比，在YS1646Δasd-shSCR菌株中细菌诱导的巨噬细胞也显著升高。因此，携带诱导I型IFN的有效载荷的两种菌株均能覆写正常的抗菌免疫应答，通过中性粒细胞和巨噬细胞清除细菌感染，并且不会诱导适应性T细胞介导的免疫。然而，虽然所有组中CD8+T细胞整体循环水平相似，但鞭毛缺失的YS1646Δasd/ΔFLG-shTREX1菌株与PBS相比显示出显著增加的AH1-四聚体+CD8+T细胞百分比(p＝0.04)。
这些数据表明对细菌进行工程化以将病毒样I型IFN诱导质粒递送至肿瘤驻留骨髓细胞的可行性。这导致免疫应答的明显重新编程为更多病毒免疫性和更少细菌免疫性。鞭毛的缺失进一步增强了从细菌募集的中性粒细胞和巨噬细胞向显著增加的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞转变。因此，消除细菌TLR5介导的炎症可增强适应性免疫。
SD＝标准差
鞭毛缺失菌株限于体内吞噬性骨髓免疫细胞区室
根据文献，ΔfljB/ΔfliC菌株显示出抑制许多与SPI-1介导的进入非吞噬细胞相关的下游基因。为了确定YS1646Δasd/ΔFLG菌株是否也缺乏非吞噬细胞摄取，将在细菌rpsM启动子控制下组成型表达mCherry(红色荧光蛋白)的YS1646Δasd/ΔFLG菌株经静脉注射到MC38皮下携带侧腹肿瘤的小鼠中。
MC38(鼠结肠腺癌#38)模型的衍生与CT26模型相似地使用诱变衍生，但使用二甲肼嗪和C57BL/6小鼠品系(见例如Corbett et al.(1975)Cancer Res.35(9):2434-2439)。与CT26类似，与原位植入结肠相比，皮下植入导致更多的T细胞排除和免疫抑制性肿瘤微环境(见例如Zhao et al.(2017)Oncotarget 8(33):54775-54787)。MC38具有比CT26更高的突变负荷，CD8+T细胞可以检测类似的病毒衍生的gp70抗原(p15E)，尽管其不被视为排斥抗原。虽然已发现MC38的变体对检查点疗法有部分反应，但大多数细胞系变体被认为是检查点难治性的及T细胞排除的(见例如Mariathasan et al.(2018)Nature 555:544-548)，包括本文使用的MC38细胞。
对于这个实验，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第34天，为带有较大的建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射l×106CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry菌株。静脉给药后7天切除肿瘤并切成2至3mm的小块，放入装有2.5mL酶混合物(RPMI-1640 10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mLDNase I)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离肿瘤块，将整个细胞制备物在37℃搅拌温育45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入肿瘤)程序进行第二轮解离，所得单细胞悬浮液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL的RPMI-1640+10％ FBS洗涤一次，然后使用新的70μM尼龙网将细胞再次过滤到新的50mL管中。将尼龙网用5mL的RPMI-1640+10％ FBS洗涤，然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将所得解离的细胞重新悬浮在PBS中并在染色之前在冰上保持。
对于流式细胞术染色，将100μL的单细胞悬浮液接种在V形底的96孔平板的孔中。每孔加入100μL含有死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc封闭试剂(BDBiosciences)的PBS，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于PBS+2％ FBS中，其中含有荧光染料缀合的抗体(CD4 FITC克隆RM4-5、CD8a BV421克隆53-6.7、F4/80APC克隆BM8、CD11b PE-Cy7克隆M1/70、CD45 BV570克隆30-F11、CD3 PE克隆145-2C11、Ly6C BV785克隆HK1.4、I-A/I-EAPC-Cy7克隆M5/114.15.2、Ly6G BV605克隆1A8和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69，均来自BioLegend)，在冰上避光温育30分钟。30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次，然后重悬在流式细胞术固定缓冲液(ThermoFisher Scientific)中。流式细胞术数据使用流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
结果表明，7.27％的肿瘤浸润单核细胞在肿瘤微环境中摄取了鞭毛缺失的mCherry菌株。相似地，8.96％的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和3.33％的肿瘤浸润树突状细胞(DC)摄取了鞭毛缺失的mCherry菌株。相反，在CD45-群体中，对应于基质细胞和肿瘤细胞，只有0.076％的mCherry表达呈阳性(与0.067％的背景染色相比)。这些数据表明鞭毛及其下游信号传导对SPI-1的影响对于使上皮细胞具有感染性是必要的，并且其缺乏将细菌的摄取限于仅肿瘤微环境(即肿瘤驻留免疫/骨髓细胞)的吞噬免疫细胞区室。
鞭毛的缺失赋予免疫刺激性鼠伤寒沙门氏菌菌株多种益处，包括消除TLR5诱导的抑制适应性免疫的炎性细胞因子，减少巨噬细胞焦亡，以及在全身施用时维持(或增强)肿瘤特异性富集，其中摄取被限于肿瘤驻留吞噬细胞。
实施例5
沙门氏菌pagP基因敲除菌株工程化和鉴定
在这个实施例中，对YS1646Δasd/ΔFLG菌株进一步修饰以缺失pagP基因。pagP基因在鼠伤寒沙门氏菌的感染性生命周期中被诱导，并编码用棕榈酸酯修饰脂质A的一种酶(脂质A棕榈酰转移酶)。在野生型鼠伤寒沙门氏菌中，pagP的表达产生七酰化的脂质A分子。在msbB-突变体中，其中不能加入脂质A的末端酰基链，因此pagP的表达产生六酰化脂质A分子。具有六酰化脂质A的LPS已示出具有高度的促炎性，并且对TLR4具有高亲和性(在野生型中发现的七酰化LPS对TLR4的亲和性最高)。在这个实施例中，缺失pagP和msbB的菌株只能产生五酰化脂质A，因此当所述细菌被工程化为递送编码免疫调节蛋白的质粒时可以由于其对TLR4的亲和性较低而减少促炎细胞因子，增强耐受性，以及增加适应性免疫。
ΔpagP菌株构建
使用前述实施例中描述的方法的修改，从YS1646Δasd/ΔFLG菌株中缺失pagP基因。合成的pagP基因同源臂序列在pagP基因的侧翼分别包含左侧和右侧序列的203和279个碱基，其被合成及克隆到称为pSL0191(SEQ ID NO:331)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0191中，使用引物pagp-1(SEQ ID NO:315)和pagp-2(SEQID NO:316)对pagP基因敲除盒进行PCR扩增(见表1)、凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ-Red重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，及通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。使用引物pagp-3(SEQ ID NO:317)和pagp-4(SEQ ID NO:318)通过PCR扩增pagP基因敲除序列，且通过DNA测序验证。所得YS1646突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP。
pagP缺失突变体具有五酰化脂质A的LPS及诱导减少的炎性细胞因子
使用Datsenko and Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))及上文所述的λ衍生的Red重组系统，从YS1646Δasd菌株中缺失pagP基因，产生菌株YS1646Δasd/ΔpagP。然后用含有功能性asd基因的质粒对这个菌株进行电穿孔，以补充缺失的asd基因并确保体内质粒维持。然后从这个菌株中提取脂质A并通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI MS)进行评估，并与来自野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株ATCC 14028、YS1646菌株(缺失msbB和purI)以及YS1646Δasd菌株的脂质A进行比较。由于存在功能性msbB基因，野生型沙门氏菌具有质量为2034的次要脂质A峰和质量为1796的主要峰，分别对应于七酰化和六酰化脂质A。msbB缺失菌株YS1646和YS1646Δasd具有在1828和1585处的主要峰，对应于六酰化和五酰化脂质A的混合物。msbB和pagP缺失菌株YS1646Δasd/ΔpagP只有一个质量为1585的单峰，对应于五酰化脂质A。这些数据表明pagP的缺失阻止脂质A的棕榈酰化，从而将其限制为单一的五酰化物质。
为了确定来自ΔpagP突变株的五酰化脂质A降低TLR4信号传导，将4μg来自野生型菌株、YS1646菌株或YS1646Δasd/ΔpagP菌株的纯化LPS加入THP-1人单核细胞中(ATCC目录号#TIB-202)，在24小时后使用Cytometric Bead Array(CBA)试剂盒(BD Biosciences)评估上清液中炎症细胞因子的存在。结果显示，与野生型LPS相比，来自YS1646Δasd/ΔpagP菌株的LPS诱导的TNFα量是野生型LPS的25％，诱导的IL-6比野生型LPS少7倍。来自YS1646Δasd/ΔpagP菌株的LPS诱导的IL-6比菌株YS1646少22倍，表明来自ΔpagP突变体的五酰化LPS物质在人细胞中的炎症显著降低，并表明ΔpagP突变体在人体中的耐受性更好。
在原代人M2巨噬细胞中pagP缺失诱导显著减少的IL-6
为了证实YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株在原代人M2巨噬细胞中也引起较少的炎症和剂量限制性IL-6，对这个菌株进行了评估，并与YS1646Δasd/ΔFLG和亲本YS1646菌株进行了比较。来自人供体的M2巨噬细胞代表了在排除T细胞的实体瘤中高度富集的免疫抑制表型。将从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1X非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，并在室温下以800RPM离心10分钟进行洗涤。将PBMC重悬于PBS+2％ FBS中，使用CD16耗竭试剂盒(depletion kit)(StemCell Technologies)负分离单核细胞。然后通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤分离的未接触的单核细胞，并重新悬浮在含有100ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。将分离的单核细胞(每孔3e5)接种到24孔平板中，终体积为750μL。接种两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的500μl完全培养基，持续48小时。然后在第6天，将细胞培养基完全吸出并替换为仅不含细胞因子的新鲜完全培养基，或替换为含有鼠伤寒沙门氏菌菌株对数期培养物(MOI为20)的培养基。感染细胞1小时，然后用PBS洗涤，更换含50μg/mL庆大霉素的新鲜培养基，以杀灭胞外细菌。然后将孔洗涤并更换为新鲜培养基，在37℃和5％ CO2下温育。48小时后，收集上清液并根据制造商的说明使用人IL-6细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒(BD Biosciences)测定细胞因子。
结果表明，感染亲本YS1646菌株的人原代M2巨噬细胞分泌的IL-6水平平均为14839±926pg/mL，而感染YS1646Δasd/ΔFLG菌株的IL-6水平明显较低，为2075±723pg/mL(p＝0.004)。这进一步证实了鞭毛的缺失和TLR5信号传导的消除对诱导IL-6的影响。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP引起最低的IL-6水平，为332±100pg/mL，表明这种修饰的LPS包被刺激TLR4的能力降低，从而显著降低了炎性IL-6的产生。
鞭毛和pagP组合缺失显著增强小鼠中的耐受性
为了确定上述修饰的菌株比亲本菌株YS1646减毒程度更高，进行了中位致死剂量(LD50)研究。为6-8周龄BALB/c小鼠(每组5只)静脉注射剂量范围为3e5至3e7 CFU的YS1646菌株或衍生菌株YS1646Δasd/ΔFLG、YS1646Δasd/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP。与菌株YS1646不同，衍生菌株还携带编码鼠IL-2的质粒，这是一种FDA批准的细胞因子，在全身施用时表现出显著的毒性。
发现菌株YS1646的LD50为4.4×106CFU(两项研究的平均值)，与先前发表的YS1646的LD50报告一致，与野生型鼠伤寒沙门氏菌相比提高了>1000倍(见例如Clairmont et al.(2000)J.Infect.Dis.181:1996-2002)。YS1646Δasd/ΔFLG菌株的LD50被确定为2.07×107CFU，表明与YS1646菌株相比毒力降低了4.5倍以上。YS1646Δasd/ΔpagP菌株的LD50被确定为1.39×106CFU，表明与YS1646菌株相比毒力降低了3.2倍，这是预期的，因为所述菌株仍然具有高度炎症性鞭毛。无法确定YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株的LD50，因为在给予的最高剂量时没有小鼠死亡，但LD50大于6.2×107CFU。因此，与亲本菌株YS1646相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株的毒力降低了>14倍。这些数据表明，上述遗传修饰降低了临床鼠伤寒沙门氏菌菌株YS1646(也称作VNP20009)的毒力，因此导致在人体中的耐受性提高。
在VNP20009的I期临床试验中(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)，在测试的两个最高剂量3×108CFU/m2(33％存在)和1×109CFU/m2(50％存在)观测到患者肿瘤中仅部分存在所述细菌，表明VNP20009的耐受剂量太低，无法实现肿瘤定植。通过上述修饰改良菌株的耐受性，如有必要，可以施用>14倍更高的剂量，改善肿瘤定植患者的百分比，并提高每个肿瘤的治疗性定植水平，从而解决施用VNP20009所观测到的问题。
鞭毛和PagP组合缺失显著限制小鼠中抗鼠伤寒沙门氏菌抗体的产生
来自3×106CFU给药组(N＝5，除了YS1646给药组中为N＝4)的存活小鼠在静脉给药后保持40天，此时对其放血取血清并通过改进的基于流动的抗体滴定系统评估对于鼠伤寒沙门氏菌的抗体滴度。洗涤YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry菌株的过夜培养物并用流式细胞术固定缓冲液固定。将来自先前处理过的小鼠和来自未经处理的对照小鼠的血清接种在96孔平板中，在PBS中进行系列稀释。接下来，将含有1×106CFU的25μL YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry培养物加入血清中，并室温下温育25分钟。然后通过以4000RPM的速度旋转5分钟，用PBS洗涤细菌两次。最后一次洗涤后，将细菌重悬于含有二级山羊抗小鼠Fc AF488抗体(原液的1/400稀释液)的PBS中，在室温下避光温育25分钟。然后将细菌以4000RPM旋转5分钟，用PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，将细菌重悬于PBS中，使用流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取数据，并使用MFI F1owJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
为评价流式细胞术的结果，选择所有组中具有信号的最高稀释度(1250×血清稀释度)，并绘制相应的平均荧光强度(MFI)值。在MFI为1000选择检测限度(LOD)，因为这是在没有染色以及仅使用山羊抗小鼠Fc AF488抗体背景染色的情况下获得的MFI。因此，MFI大于1000被认为是阳性信号，尽管具有MFI值，但所有等于或低于这个值均被认为是阴性结果。
这个测定的结果揭示了来自用3×106CFU的YS1646菌株的处理的小鼠的抗鼠伤寒沙门氏菌血清抗体的高MFI滴度(MFI为29196.3±20730)，与先前公布的YS1646能产生血清抗体(非中和)的数据一致。用YS1646Δasd/ΔFLG菌株处理的小鼠中检测到的抗体较少(MFI为11257±9290)，这可能是由于缺乏鞭毛佐剂活性所致。在用YS1646Δasd/ΔpagP菌株处理的小鼠中，与菌株YS1646(p＝0.033)相比，产生的抗体显著减少(MFI为4494±3861)，这可能是由于LPS表面包被改变所致。表明在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP治疗组中血清抗体降低最显著(MFI为1930±2445)，其中一些小鼠的MFI滴度低于1000，因此被认为血清抗体阴性(p＝0.021，相对于菌株YS1646)。因此，鞭毛和pagP基因的组合缺失既能提高安全性，又能显著降低免疫原性，这将可以在人体中重复给予高CFU剂量。
与菌株YS1646相比，pagP和鞭毛缺失的菌株及其组合在人血清中表现出显著更高的存活率
菌株YS1646在全身性施用后在人体中呈现出受限的肿瘤定植。本文示出菌株YS1646被人血液中的补体因子失活。为了证实这一点，将菌株YS1646和大肠杆菌D10B与本文提供的含有改变细菌表面的额外突变的示例免疫刺激细菌进行比较。这些示例修饰的菌株是YS1646Δasd/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP。除了YS1646和大肠杆菌D10B培养物外，将这三个菌株与来自集合的小鼠血液或集合的健康人供体(n＝3)的血清或热失活(HI)血清在37℃温育3小时。与血清温育后，将细菌连续稀释，铺板于LB琼脂平板上，测定集落形成单位(CFU)。
在小鼠血清中，所有菌株都保持100％的存活率，并且对补体失活完全抗性。在人血清中，所有菌株在热失活血清中均100％存活。3小时后，在全人血清中完全消除了大肠杆菌D10B菌株。在全人血清中，YS1646菌株仅显示6.37％的活集落，表明YS1646临床菌株的肿瘤定植由于人血中的补体失活而受到限制。对于YS1646Δasd/ΔFLG菌株，在与人血清温育3小时后，31.47％的活集落保留，而对于YS1646Δasd/ΔpagP菌株，72.9％的活集落保留。组合的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株对人血清中的补体完全抗性。
这些数据解释了菌株YS1646(VNP20009)在全身施用时为什么具有非常低的肿瘤定植。本文示出菌株YS1646对人血清中的补体失活高度敏感，但对小鼠血清中的补体失活不敏感。这些数据解释了为什么在人体中观察到的肿瘤定植有限，而小鼠肿瘤定植水平很高。fljB/fliC或pagP缺失或这些突变的组合，部分或完全挽救了这个表型。因此，在用YS1646Δasd/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株在人血清中观察到的增强的稳定性提供了增加的人肿瘤定植。
实施例6
沙门氏菌ansB基因敲除菌株工程化和鉴定
在这个实施例中，将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株进一步修饰以缺失ansB，即编码细菌L-天冬酰胺酶II的基因。在T细胞存在的情况下，鼠伤寒沙门氏菌分泌L-天冬酰胺酶II已示出通过降低T细胞受体(TCR)表达和削弱胞溶性细胞因子的产生直接削弱T细胞功能。因此，这几十年来，细菌衍生的天冬酰胺酶已成功用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)。ansB的缺失消除了鼠伤寒沙门氏菌产生L-天冬酰胺酶II的能力，从而增强了T细胞在细菌定植的肿瘤微环境中的功能。
ΔansB菌株构建
使用前述实施例中描述的方法的加以修改，从YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株中缺失ansB基因。合成的ansB基因同源臂序列分别含有位于ansB基因侧翼的左侧和右侧序列的236和251个碱基，将其合成并克隆到称为pSL0230(SEQ ID NO:332)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0230中，并用引物ansb-1(SEQ ID NO:319)和ansb-2(SEQ ID NO:320)对ansB基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ-Red重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。ansB基因敲除序列使用引物ansb-3(SEQ ID NO:321)和ansb-4(SEQ ID NO:322)(见表1)通过PCR扩增，并通过DNA测序验证。所得YS1646突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB。
ansB的缺失在体外消除天冬酰胺酶活性
为了确定YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株是否产生较少的L-天冬酰胺酶II，将该菌株的培养物与ansB完整的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株一起在LB中生长并使其达到稳定期。此时，根据制造商的说明，使用比色天冬酰胺酶检测试剂盒(Sigma-Aldrich)分析来自50μL条件培养基中培养物的天冬酰胺酶活性。温育40分钟后，使用M3分光光度计(Molecular Devices)读取在570nm的吸光度波长的吸光度单位。
与吸光度为1.95的重组L-天冬酰胺酶II阳性对照相比，ansB-完整的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株的吸光度为0.82。然而，在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失ansB会导致天冬酰胺酶活性的背景水平，在0.109的吸光度下检测到。这些数据证实ΔansB突变完全消除了天冬酰胺酶的活性。
ansB的缺失在体外共培养测定中恢复T细胞功能
为了在功能上鉴定ansB缺失菌株关于降低的L-天冬酰胺酶II活性对T细胞的影响，使用菌株感染的鼠原代骨髓衍生巨噬细胞(BMM)建立共培养测定，与脾纯化的T细胞一起培养。对于这个测定，从健康BALB/c小鼠分离和解离脾，使用小鼠T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)，按照制造商的说明分离脾CD4+和CD8+T细胞。从分离的T细胞中，将2e5细胞/孔添加到平底96孔平板中，该平板预先已用5μg/ml抗小鼠CD3ε抗体(克隆145-2C11，Thermo Fisher Scientific)包被。将在条件LB培养基中生长至静止期的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB培养物，通过0.45μM尼龙网过滤并加入T细胞中，添加或不添加10μg/ml用于共刺激的激动性CD28抗体。含有20U/mL重组天冬酰胺酶和正常培养基的对照组用作该测定中的对照。将平板在5％ CO2温育箱中于37℃下温育。在温育后24小时，从孔中收集100μL的共培养物上清液液，并进行鼠Th1特异性细胞因子珠阵列(CBA，BioLegend)。同时，收集T细胞并通过流式细胞术分析在CD4+和CD8+T细胞上表面T细胞受体β(TCRβ)的表达，以及IFNγ、TNFα和IL-2的细胞内染色。
结果证实，ansB-完整菌株(YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP)用于感染巨噬细胞并随后与T细胞共培养，可诱导严重的T细胞免疫抑制。与培养基对照和20U/mL重组天冬酰胺酶的阳性对照相比，CD4+和CD8+T细胞中TCRβ表面表达均显著下调(见下表)表明了这一点。与亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失ansB显著恢复了CD4+(p＝0.004)和CD8+T细胞(p＝0.002)中的TCRβ表面表达。
SD＝标准差
共培养24小时后，测量细胞因子的T细胞分泌作为T细胞胞溶功能的标志。如下表所示，与培养基对照相比，用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株处理后，细胞因子IFNγ、TNFα和IL-2的T细胞产生显著降低，并且通过在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失ansB而明显恢复(IFNγ(p＝0.05)，TNFα(p＝0.012)，及IL-2(p＝0.006))。这些数据表明，与亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株相比，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中ansB的缺失显著恢复了T细胞的胞溶功能。
SD＝标准差
ansB的缺失在体内恢复肿瘤驻留T细胞TCRβ的表达
在体外共培养测定中，通过流式细胞术编码ansB的表达对T细胞功能的免疫抑制作用，包括对T细胞TCRβ表达的下调。为了评估这是否会在体内同样发生，使用了结直肠癌的MC38小鼠模型。
对于这个实验，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组4只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第17天，为带有较大已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉内注射1×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-mCherry菌株。在经静脉内给药后7天切除肿瘤并切成2-3mm的碎片放入充填2.5mL酶混合物(含有10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL DNase I的RPMI-1640)的gentleMACSTMC管(Miltenyi Biotec)中。使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入的肿瘤)解离肿瘤碎片，然后在37℃下搅拌温育全细胞制备物45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入的肿瘤)程序进行第二轮解离，将所得单细胞悬浮液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL RPMI-1640+10％FBS洗涤一次，然后使用新的70μM尼龙网将细胞第二次过滤到新的50mL管中。将尼龙网用5mL RPMI-1640+10％FBS洗涤，然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将得到的解离细胞重新悬浮在PBS中，并在染色过程前保持在冰上。
对于流式细胞术染色，将100μL单细胞悬液接种在V形底96孔平板的孔中。以每孔100μL加入含有死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc阻断剂(BD Biosciences)的PBS，并将细胞在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％FBS洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于含有荧光染料缀合的抗体(CD45 BV570克隆30-F11；TCRβPE克隆H57-597；和CD4FITC克隆RM4-5；均来自BioLegend)和DAPI(BioLegend)的PBS+2％FBS中，避光在冰上温育30分钟。30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％FBS洗涤细胞两次，并重新悬浮在流式细胞仪固定缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中。使用ACEA流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如下表所示，TCRβ在肿瘤浸润的CD4+T细胞上的表面表达的平均荧光强度(MFI)在肿瘤内与定殖的亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株相互作用后显著ansB缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株(p＝0.042)，后者甚至高于PBS对照处理的小鼠。
MFI＝平均荧光强度；AVG＝平均值；SD＝标准差
总之，这些数据证实缺失ansB基因以恢复T细胞功能的必要性，因为细菌产生了免疫抑制性L-天冬酰胺酶II，并表明了在具有ansB缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中观察到的增强的T细胞功能。
实施例7
沙门氏菌csgD基因敲除菌株工程化和鉴定
将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株进一步修饰以缺失csgD，这是控制鼠伤寒沙门氏菌卷曲菌毛形成、纤维素产生和c-di-GMP产生的主要基因。csgD缺失消除了纤维素介导的生物膜形成的可能性，减少了促炎信号传导，并增强了宿主吞噬细胞的摄取。这种细胞内定位的增加将因此增强质粒递送和免疫调节蛋白产生的效力。
ΔcsgD菌株构建
使用前述实施例中描述的方法的修改，在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株中缺失csgD基因。合成的csgD基因同源臂序列分别含有位于csgD基因的侧翼的左侧和右侧序列的207和209个碱基，将其合成并克隆到称为pSL0196(SEQ ID NO:333)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到pSL0196中，用引物csgd-1(SEQ ID NO:323)和csgd-2(SEQ ID NO:324)对csgD基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ-Red重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ansB中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，通过在非许可温度下生长以处理温度敏感质粒。使用引物csgd-3(SEQ ID NO:325)和csgd-4(SEQ ID NO:326)通过PCR扩增csgD基因敲除序列，并通过DNA测序验证。亲本菌株YS1646的所得突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD。
csgD-缺失菌株在刚果红(Congo Red)平板上不能形成RDAR集落
在刚果红平板上生长后形成粗糙干燥和红色(RDAR)集落的能力是一种经过充分验证的细菌生物被膜形成试验。粗糙和干燥的质地是通过产生纤维素而发生的，红色是由于卷曲菌毛表面结构积累的色素所致。对于这个试验，将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株与YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株比较在刚果红琼脂平板上温育后形成RDAR表型的能力。
将刚果红琼脂平板用大豆蛋白(10g/L)和酵母提取物(5g/L)(改良的LB，不含NaCl)制备，并补充刚果红(40mg/L)和考马斯亮蓝G-250(20mg/L)。将5微升固定相细菌培养物点印在刚果红平板上并在37℃温育16小时，然后转移至30℃再温育120小时。进行集落形态和颜色的目测分析，每天记录以确认RDAR集落形态型的存在或不存在。
比较这两种菌株的集落形态型，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株具有平滑表型，集落缺少色素。相比之下，YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株仍然含有csgD基因，表现出经典的粗糙和干燥外观，以及色素吸收的明显证据。因此，功能性测定证实ΔcsgD菌株无法形成生物被膜，因为其缺乏卷曲菌毛和纤维素产生。
csgD缺失的菌株在三阴性乳腺癌的高度难治性小鼠模型中显示出卓越的抗肿瘤功效
评估了csgD缺失在免疫刺激细菌疗法定植肿瘤但显示功效有限的模型中的影响。这可以表明细菌产生的纤维素的存在可以限制肿瘤驻留骨髓细胞的摄取，从而限制治疗效果(见例如Crull et al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223–1233)。采用难治性EMT6模型，这是人三阴性乳腺癌的代表性模型(见例如Yu et al.(2018)PLoS ONE 13(11):e0206223)。当EMT6肿瘤细胞原位施用于乳腺脂肪垫时，与在侧腹部皮下注射相反，所述模型是T细胞排除的、高度转移及对免疫疗法包括对所有批准的检查点抗体而言是高度难治的模型(见例如Mariathasan et al.(2018)Nature 554:544–548)。
对于这个实验，将6-8周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)在左侧乳腺脂肪垫中接种EMT6肿瘤细胞(ATCC#CRL-2755)(100μL PBS中2×105个细胞)。为携带13天龄已建立的乳腺肿瘤(～55mm3)的小鼠静脉注射单剂量1×107CFU的csgD缺失菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD或亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB菌株，并与PBS对照组比较。所述细菌菌株含有表达组成型活性鼠STING(EF1αmuSTING R283G)的质粒。
在PBS处理的小鼠中的肿瘤生长均匀，在第35天达到最大肿瘤体积(1199.0±298.1mm3)。用csgD完整菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB处理的小鼠在这个模型中没有表现出抗肿瘤功效的迹象，在第35天也达到最大肿瘤体积(1689.1±537.0)。这些肿瘤的离体LB铺板显示所有肿瘤都被定植。然而，csgD缺失的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD导致5只小鼠中有3只完全治愈了其原发性和任何转移性疾病(第60+天)。总体TGI为45.7％，另外两个肿瘤之一在最终生长出之前部分应答。这两种细菌菌株含有相同的质粒有效载荷，但只有一种表现出显著功效。因此，在最难治疗和高度转移的同基因肿瘤模型之一中，原位具有csgD缺失的菌株EMT6能诱导全身抗肿瘤功效并导致60％的完全应答。
csgD缺失的菌株证实体内细胞内摄取增强
为了确定csgD缺失菌株是否因肿瘤驻留骨髓细胞更多的细菌摄取而表现出改善的功效，进行了离体庆大霉素保护试验(见Crull et al.(2011)Cellular Microbiology13(8):1223–1233)。对于这个试验，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组4只小鼠)皮下接种MC38细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第17天，为带有较大侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射1×107CFU的csgD缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株(N＝12)或亲本YS1646菌株(N＝4)。在静脉内给药后7天切除肿瘤，称重并在补充有1mg/mL胶原酶IV和20mg/mL DNase I的RPMI中切碎，在37℃振荡温育30分钟以产生单细胞悬浮液。30分钟后，将所述悬浮液通过70mm过滤器，回收的体积被分成两个独立的相同样品。将200mg/mL的庆大霉素(Thermo Fisher Scientific)加入每对样品之一中以杀死细胞外细菌，将样品在37℃振荡培养90分钟。然后将细胞悬浮液样品用0.05％ Triton X洗涤并裂解，并铺在LB琼脂板上以计数CFU。
结果表明，与未经庆大霉素处理的YS1646处理肿瘤的CFU(11925±19859CFU)相比，庆大霉素处理导致从肿瘤中检测到的CFU非常少(51±45CFU)。这表明细菌主要存在于这些肿瘤中的细胞外，因此对庆大霉素消除敏感。在csgD缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD处理组中，非庆大霉素处理的肿瘤产生高CFU，正如对定植良好的肿瘤所预期的那样，庆大霉素处理产生更少CFU(1276±2410CFU)，远高于亲本YS1646菌株处理的肿瘤。这是由于更多csgD缺失的细菌驻留于细胞内，因此受到了庆大霉素的保护。这些数据表明csgD缺失改善了细菌的细胞内摄取，这可以增强体内免疫调节蛋白的质粒递送。
实施例8
pATI-1.75和pATI-1.76载体构建
设计并合成质粒(pATI-1.75)，其含有以下特征：pBR322复制起点、asd基因、侧翼是HindIII位点用以处理的卡那霉素抗性基因，以及用于插入表达盒的多克隆位点。所述表达盒包含多个元件，包括真核启动子、开放读框(ORF)、转录后调节元件和聚腺苷酸化信号，将其以各种构型装配。
示例的启动子包括直接在CMV立即早期增强子序列下游编码的人巨细胞病毒(CMV)立即早期核心启动子和人延伸因子-1α(EF-1α)的核心启动子。开放读框(ORF)可以包括一个或多个序列，每个序列都被翻译成蛋白质，并且可以通过插入2A序列将其分离成不同的多肽，从而真核核糖体无法在2A序列内的Gly和Pro残基之间插入肽键。2A序列的示例是来自Thosea asigna病毒(TaV)衣壳蛋白的T2A肽(SEQ ID NO:327)和来自猪捷申(PTV)的P2A肽(SEQ ID NO:328)。上游弗林蛋白酶裂解位点(RRKR)和其它增强子元件被置于上游以促进裂解分离表达的蛋白。
转录后调节元件(PRE)的示例包括土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE，SEQ ID NO:346)和乙型肝炎病毒PRE(HPRE，SEQ ID NO:347)，其通过促进mRNA向细胞质的核输出、增强3’末端加工和稳定性而增加基因胞质mRNA的积累。聚腺苷酸化信号序列的示例包括SV40聚腺苷酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpolyA，或bGHpA)，二者均是3’调节元件，用于促进转录终止并含有由RNA裂解复合物识别的序列基序。
图1A-C示出pATI-1.7和pATI-1.76(分别为图1A和1B)质粒插入体；图1C示出将Shine-Dalgarno序列用Kozak序列置换以在真核细胞如骨髓细胞中翻译。具有这种序列和构建体的质粒可用于其中细菌被设计为递送RNA的实施方案中，所述质粒不能被细菌宿主翻译，但可以在真核细胞在体内翻译。
实施例9
设计的异源蛋白表达质粒诱导人细胞产生功能性蛋白
在人细胞中建立的细胞因子的最佳表达
为了举例说明免疫刺激性细胞因子可以在人细胞中从设计的质粒中表达，将一组细胞因子克隆到在EF-1α启动子控制下的pATI-1.75质粒中。所述细胞因子包括但不限于鼠IL-2(muIL-2)、muIL-12p70、muIL-23和人IL-2(huIL-2)。对于融合到IL-15单链的muIL-15受体-α(muIL-15Rα-IL-15sc)，测试了EF-1α和CMV启动子。将HEK293T STING Null细胞(InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植在用聚L-赖氨酸包被的24孔平板中，在5％ CO2温育器中于37℃下过夜，以达到80％汇合度。第二天，将200ng的每种细胞因子质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。在转染后24小时收集每个样品的细胞培养物上清液液，并通过特异于每种细胞因子的ELISA评估蛋白质表达。
根据制造商的说明，在鼠IL-2ELISA(R&D Systems)中评估muIL-2构建体，并且还评估了具有密码子优化的另一版本的muIL-2(muIL-2CO)。测试了纯上清液的浓度，对于muIL-2构建体，平均产生1680pg/mL的muIL-2，对于muIL-2CO构建体，平均产生1812pg/mLmuIL-2。这些数据证实了所述构建体的功能，并表明通过密码子优化可以提高产量。根据制造商的方案，在鼠IL-12ELISA(R&D Systems)中评估了muIL-12p70构建体。当加入纯净上清液时，测得分泌的muIL-12p70的平均值为400pg/mL，尽管这个值超出了线性范围。当将上清液稀释5倍时，检测到平均105pg/mL分泌的muIL-12p70。对于muIL-23质粒，根据试剂盒说明，使用鼠IL-23ELISA(BioLegend)实现蛋白质检测。加入纯净上清液，检测到平均966pg/mL的muIL-23。对于人IL-2质粒，根据试剂盒说明，使用人IL-2ELISA(Invitrogen)实现蛋白质检测。加入纯净上清液，检测到平均1422pg/mL的huIL-2。
对于使用EF-1α或CMV启动子表达的muIL-15Rα-IL-15sc构建体，按照试剂盒说明使用鼠IL-15ELISA(eBioscience,Inc.)。当加入纯净上清液时，带有EF-1α启动子的muIL-15Rα-IL-15sc质粒产生平均131pg/mL，而带有CMV启动子的muIL-15Rα-IL-15sc质粒产生平均289pg/mL。
这些数据验证了在人细胞中编码小鼠和人免疫调节细胞因子的质粒表达构建体。此外，数据表明密码子优化和启动子如CMV的使用可以增强蛋白质表达。
转录后调节元件增强细胞因子表达
为了确定在在ORF的3’末端添加的转录后调节元件(PREs)是否增强人细胞中免疫刺激细胞因子的表达，在pATI-1.75质粒中添加或不添加土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的条件下测试在EF-1α启动子控制下的huIL-2的表达。
将HEK293T STING Null细胞(InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植在用聚L-赖氨酸包被的24孔平板中，在5％ CO2温育器中于37℃下过夜，以达到80％汇合度。第二天，将200ng的每种细胞因子质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。根据制造商的说明，在转染后24小时收集每个样品的细胞培养物上清液液，并通过人IL-2ELISA(Invitrogen)评估其活性。上清液以纯净的形式加入，或稀释5倍。
结果表明，当加入纯净上清液时，与没有WPRE的huIL-2构建体(平均分泌1540pg/mL)相比，具有WPRE的huIL-2构建体分泌5511pg/mL，增加3.6倍。在5倍稀释的上清液中，非WPRE huIL-2构建体分泌315pg/mL的huIL-2，而具有WPRE的huIL-2构建体分泌1441pg/mL，增加4.6倍。因此，添加3’转录后调节元件，例如但不限于WPRE，可以显著改善人细胞中的蛋白质表达。
启动子优化和转录后调节元件增强原代M2巨噬细胞中的细胞因子产生
虽然通过使用CMV启动子在人HEK293T细胞中增强了muIL-15Rα-IL-15sc等细胞因子的表达，但要确定在供体来源的原代人M2巨噬细胞(排除T细胞的人实体瘤中的主要巨噬细胞表型)中是否可以类似地增强细胞因子的表达。此外，还确定了转录后调节元件(如WPRE)是否可以增强这些细胞中的表达。
为了确定是否可以改善蛋白质表达，测试了启动子EF-1α和CMV对于muIL-2表达的控制，并测试了WPRE转录后调节元件对于huIL-2表达的影响。从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1×非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，并且在室温下以800RPM离心10分钟洗涤。将PBMC重新悬浮在PBS+2％ FBS中，并使用CD16耗竭试剂盒(StemCell Technologies)负分离单核细胞。将分离的单核细胞在含有M-CSF和IL-4的RPMI培养基中培养6天，以产生M2巨噬细胞。为此，通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤分离的未接触的单核细胞，并重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(3e5/孔)种植在24孔平板中，最终体积为750微升。种植两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入500μL含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基，并温育48小时。在第6天，完全吸出细胞培养基，并更换为不含细胞因子的新鲜完全培养基，以使用RED mRNA和质粒转染试剂(Lipocalyx)进行转染。
根据制造商的说明使用RED进行转染。简而言之，将含有EF-1α-muIL-2构建体、CMV-muIL-2构建体、EF-1α-huIL-2构建体或EF-1α-huIL-2+WPRE构建体的500ng质粒DNA以及未转染的对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.2μL/>RED混合，在室温下温育15分钟以形成/>复合物。然后将/>RED复合物缓慢加入24孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在37℃的CO2温育器中温育24小时。在24小时收集上清液，并根据试剂盒说明使用鼠IL-2ELISA(R&D Systems)或人IL-2ELISA(Invitrogen)测定细胞因子。
结果表明，从在EF-1α启动子控制下的用muIL-2构建体转染的原代人M2巨噬细胞收获的纯上清液中muIL-2的表达，导致平均分泌59.7pg/mL的muIL-2。具有CMV启动子的muIL-2构建体平均产生275pg/mL的muIL-2，几乎增加了5倍。对于人IL-2ELISA，来自用缺乏WPRE的质粒转染的细胞的纯上清液平均产生170pg/mL的huIL-2。含有WPRE的huIL-2构建体平均产生219pg/mL的huIL-2。这些数据证实，CMV等启动子和WPRE等转录后调节元件可以显著改善多种细胞类型(包括原代人M2巨噬细胞)中的细胞因子表达。
由人细胞表达的共刺激受体配体4-1BBL
共刺激分子，例如4-1BBL，当在抗原呈递细胞(APCs)上表达时，可以与T细胞上表达的4-1BB结合，以促进最佳的T细胞功能。4-1BBL受其细胞质信号传导结构域的负调节。在4-1BBL使巨噬细胞与T细胞连接的后期，4-1BBL胞质结构域的反向信号传导诱导4-1BBL的表面易位以与TLR4结合并形成信号传导复合物。这会诱导高水平的TNF-α，与TLR4的LPS活化相当，从而导致适应性免疫反应的免疫抑制(见例如Ma et al.(2013)Sci.Signal.6(295):ra87)。
在这个实施例中，编码鼠4-1BBL的序列被克隆到pATI-1.75载体中。为了最大限度地衔接T细胞，通过缺失胞质结构域(对应于SEQ ID NO:344的氨基酸残基1-82)消除4-1BBL胞质结构域的反向信号传导，产生mu4-1BBLΔcyt。为了确定mu4-1BBLΔcyt是否可以在人细胞表面功能性表达，使用了HEK-293T细胞。将HEK293T STING Null细胞(InvivoGen)以200,000个细胞/孔种植于用聚L-赖氨酸包被的24孔平板中，在CO2温育器中于37℃下过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将编码mu4-1BBLΔcyt的200ng质粒DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。48小时后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次。然后将细胞重新悬浮在PBS+2％ FBS中，并用PE缀合的鼠抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1，BioLegend)和DAPI(死/活染色)染色。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次，并重悬于PBS+2％ FBS中。使用ACEA/>流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
作为活细胞的百分比，未转染的对照细胞对鼠4-1BBL的阳性染色百分比为14.6。相比之下，用编码mu4-1BBLΔcyt的质粒转染的细胞中有93.4％的细胞是4-1BBL表面表达阳性的。这些数据表明pATI-1.75质粒可以有效地用于在人细胞表面高水平表达4-1BBL。
人细胞表达可溶性TGFβ受体II
可溶性小鼠TGFβ受体II变体是通过去除完整TGFβ受体II的胞质和跨膜部分而设计的。此外，还添加了FLAG或Fc标签以进行检测。将这些变体克隆到在CMV启动子和3’WPRE元件控制下的pATI-1.75载体中。通过Sanger测序确认序列。将1.5×106HEK293T细胞在前一天铺板在用聚-L-赖氨酸包被的6孔平板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将3μgDNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到转染试剂(Promega)中。温育48小时后收集每个样品的细胞培养物上清液液。将一些上清液在10kDa离心柱(Millipore)中浓缩。使用小鼠TGF-β1(R&D系统)对转染的HEK293T细胞的上清液进行直接ELISA。下表提供了450nm吸光度的ELISA数据。
构建体 在450nm吸光度
浓缩的可溶性小鼠TGF受体II-Fc 1.522±0.025
可溶性小鼠TGF受体II-Fc 1.508±0.018
培养基(对照) 0.041±0.002
在T细胞测定中测试这些构建体的功能。使用磁性分离试剂盒(StemCellTechnologies)从脾中收获小鼠T细胞。将T细胞与具有或不具有可溶性受体的抗小鼠CD3ε抗体在不同浓度的小鼠TGF-β温育。使用小鼠TH1 CBA试剂盒(BioLegend)和CD4、CD8、4-1BB和CD69的流式细胞术标记对T细胞活化进行量化。
这些数据证明了从工程化为由免疫刺激细菌递送到真核细胞例如人细胞的质粒表达异源分子的能力，例如融合于Fc结构域的细胞外受体。
来自人细胞的CD3xCD19双特异性T细胞衔接器的表达
将含有FLAG标签和His标签的CD3xCD19双特异性T细胞衔接器克隆到在CMV启动子的控制下并带有3’WPRE元件的pATI-1.75载体中。通过Sanger测序确认序列。将1.5×106个HEK293T细胞在前一天铺板于用聚-L-赖氨酸包被的6孔平板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将3μg DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率添加到转染试剂(Promega)中。温育48小时后收集每个样品的细胞培养物上清液液。将一些上清液在10kDa离心柱(Millipore)中浓缩。
通过CD3xCD19与Raji和Jurkat-LuciaTMNFAT细胞(InvivoGen)的结合来测试该构建体的功能。使用流式细胞仪使用抗FLAG-APC(BioLegend)检测/>每种条件下运行一个包含50,000个细胞的孔。下表提供了APC阳性事件的平均荧光强度(MFI)和门控为APC阳性的细胞数。
此外，将这个构建体在Raji和Jurkat-LuciaTMNFAT细胞的共培养中进行测试。将细胞在有或没有CD3xCD19的条件下温育，在添加/>后6小时和24小时检测发光(对应于NFAT报告基因)。下表提供了这个测定的发光读数。
这些数据证明了在真核细胞例如人、细胞中从可以由本文的免疫刺激细菌递送的工程化质粒表达异源分子例如scFv、替代抗体构建体和双特异性T细胞衔接器的能力。
实施例10
免疫刺激细菌菌株在人体细胞中有效递送质粒和表达细胞因子
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失菌株在人单核细胞感染后诱导功能性IL-2蛋白表达
如上所述，从具有asd基因缺失的鼠伤寒沙门氏菌YS1646菌株中缺失鞭毛蛋白基因fljB和fliC，产生菌株YS1646Δasd/ΔFLG。用含有带有EF-1α启动子和鼠细胞因子IL-2(muIL-2)的表达盒的质粒对这个菌株进行电穿孔。此外，将YS1646Δasd/ΔFLG菌株用编码鼠IL-15δ的表达质粒电穿孔，作为非同源细胞因子的对照。使用CMV启动子产生另外的构建体。
为了确定这些含有表达质粒的菌株是否可以感染人单核细胞并诱导鼠类IL-2的产生，将THP-1人单核细胞在感染前一天以50,000个细胞/孔铺板于RPMI 1640(GibcoTM)+10％Nu-SerumTM 中。将细胞在RPMI中以50的MOI用各种菌株感染1小时，然后用PBS洗涤3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。48小时后从96孔平板收集上清液，并通过ELISA(R&D Systems)评估鼠IL-2的浓度。
正如预期的那样，在YS1646Δasd/ΔFLG-IL15δ对照孔中检测到的muIL-2浓度非常低(6.52pg/mL)，这可能反映了与内源性人IL-2受体的一些交叉反应性。相比之下，YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株平均诱导35.1pg/mL的muIL-2。这些数据证明了在人单核细胞中表达和分泌来自鼠伤寒沙门氏菌免疫调节平台菌株的功能性异源蛋白例如IL-2的可行性。
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失的和pagP缺失的菌株与在原代人M2巨噬细胞中转染的muIL-2DNA相比，表现出增强的IL-2表达
比较了在原代人M2巨噬细胞中针对muIL-2表达的转染(即直接转移质粒DNA)与细菌转染(bactofection)(即通过本文的免疫刺激菌株转移质粒DNA)的相对效率。将从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1×非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，并通过在室温下以800RPM离心10分钟进行洗涤。将PBMC重新悬浮在PBS+2％FBS中，并使用CD16耗竭试剂盒(StemCell Technologies)负分离单核细胞。然后将分离的未接触的单核细胞通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤，并重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(3e5/孔)种植在24孔平板中，最终体积为750微升。种植两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的500 μL完全培养基，并温育48小时。第6天，将细胞培养基完全吸出，更换为不含细胞因子的新鲜完全培养基，用RED mRNA和质粒转染试剂(Lipocalyx)进行转染。
根据试剂盒说明使用RED进行转染。简而言之，将来自在EF-1α启动子(EF-1α-muIL-2)的控制下或在CMV启动子(CMV-muIL-2)控制下编码muIL-2的构建体的500ng质粒DNA或未转染对照，在提供的缓冲液中稀释，与0.2μL的/>RED转染试剂混合，并在室温下温育15分钟以使DNA//>RED复合物形成。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入含有单核细胞的24孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在37℃的CO2温育器中温育24小时。在RPMI中用含有EF-1α-muIL-2构建体的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株或含有CMV-muIL-2构建体的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株以450的MOI感染其它孔的细胞1小时，然后用PBS洗涤3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。
24小时后，将细胞用350μL具有β-巯基乙醇(β-ME)的缓冲液RLT(Qiagen)裂解，并使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒加以以下修改进行RNA提取。将使用RNase-Free DNase试剂盒(Qiagen)去除基因组DNA的步骤包括在试剂盒中，以从总RNA中去除基因组DNA。使用NanoDropTMOneC UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也通过A260/A230吸收比进行评估。将RNA在-80℃储存，无需冻融，直到进行逆转录。根据制造商的说明，使用C1000 Touch热循环仪(Bio-Rad)和SuperScriptTMVILOTMMasterMix(Invitrogen)在30μL反应中使用0.4-1μg模板RNA进行cDNA合成。
使用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行qPCR(定量聚合酶链式反应)。用于鼠IL-2的引物(Assay ID：qMmuCED0060978)购自Bio-Rad。按照方案进行qPCR反应(20μL)，使用iTaqTMUniversal/>Green Supermix(Bio-Rad)。Bio-Rad CFX96TM实时系统上的标准热循环程序包括95℃变性30秒，然后是95℃进行5秒和60℃进行30秒的40个循环。每个平板上的每组引物都包括无模板对照的反应。所有样品均一式两份运行，并计算平均Cq值。使用Gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)参考mRNA(Bio-Rad，Assay ID：qMmuCED0027497)对靶mRNA的定量进行标准化。以靶(mu-IL2)和参考(Gapdh)基因之间的差异计算ΔCq。通过将处理组的ΔCq值标准化为非处理对照组的ΔCq值来获得ΔΔCq。增加倍数以2^-ΔΔCq计算。相对于未转染/未感染对照组的增加倍数如下表所示。
处理组 muIL-2增加倍数
YS1646 <1
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP，EF-1α-muIL-2(感染) 74
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP，CMV-muIL-2(感染) 668.2
转染，EF-1α-muIL-2 249.4
转染，CMV-muIL-2 1527
结果表明，无论是转染还是细菌转染，与EF-1α启动子相比，CMV启动子在人原代M2巨噬细胞中均表现出优异的muIL-2表达。虽然使用目前可用的最有效试剂进行转染产生最高水平的muIL-2表达，但细菌转染也引发了muIL-2的高表达水平，表明使用本文提供的细菌平台进行异源基因转移的高效性。
实施例11
细菌菌株在体内有效递送免疫调节质粒并显示出有效的抗肿瘤活性
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失菌株在结直肠癌小鼠模型中诱导强力的肿瘤抑制而无毒性
为了证明含有muIL-2表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌菌株可以诱导抗肿瘤效力而没有额外毒性，将含有muIL-2质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株与PBS对照在皮下侧翼MC38结肠直肠腺癌模型中比较安全性和有效性。在这项研究中，为6-8周大的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第11天，用5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株或PBS载体对照，为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠进行静脉注射。每周两次记录肿瘤测量值和体重。
结果表明，与PBS相比，YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株表现出显著的肿瘤生长抑制(TGI)(76.7％TGI，P＝0.005，第21天)，肿瘤在植入后第40天得到很好的控制，此时PBS小鼠被安乐死。即使没有进一步的菌株减毒，该疗法也具有良好的耐受性，并且与PBS对照在第40天相比，早期的体重减轻是短暂的，仅导致体重减少3.4％。因此，表达muIL-2的免疫刺激菌株在结肠直肠癌模型中以安全且无毒的方式抑制肿瘤生长抑制。
含有编码鼠IL-2的质粒的鞭毛缺失菌株在体内诱导肿瘤特异性IL-2产生
确定相对于脾的肿瘤muIL-2表达水平以确认递送的肿瘤特异性性质。为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结肠直肠腺癌细胞(100μLPBS中的5×105个细胞)。在第10天，用5×105CFU菌株YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2或PBS载体对照为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射。在肿瘤植入后第31天，切除肿瘤和脾，并使用GentleMACSTMOcto Dissociator和M管(Miltenyi Biotec)分子装置在2mL PBS中处理肿瘤提取物。根据制造商的说明，将匀浆以1300RPM旋转10分钟，收集上清液并使用muIL-2CBA试剂盒(BD Biosciences)进行分析。结果被量化为以表示pg/mL的muIL-2，并根据每克组织进行标准化。
PBS对照处理的肿瘤在肿瘤中表现出muIL-2的背景水平，平均每克肿瘤组织为134pg/mL。YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2处理的肿瘤产生了更高的平均每克肿瘤组织389.9pg/mL的muIL-2，证明检测由于肿瘤驻留骨髓细胞中的质粒递送而升高的muIL-2水平的能力。来自经注射YS1646Δasd/ΔFLG-muIL-2菌株的小鼠脾中的muIL-2水平平均为每克组织6.6pg/mL，低于PBS对照组。这种对肿瘤的特异性使得可以比非肿瘤靶向的常规细胞因子疗法更安全的方式递送免疫调节水平的IL-2。
含有编码鼠共刺激受体配体4-1BBL的质粒的减毒菌株在体内显示疗效
为了确定共刺激分子如4-1BBL的肿瘤特异性递送是否增强抗肿瘤功效，将含有在CMV启动子控制下编码4-1BBL(Δcyt)(如上所述)的质粒和含有3’WPRE元件的菌株在MC38鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。在这项研究中，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结肠直肠腺癌细胞(100μL PBS中的5×105个细胞)。在第10天，用1×107CFU的含有CMV-4-1BBL(Δcyt)-WPRE质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB或PBS载体对照，为已建立的侧腹肿瘤小鼠进行静脉注射。
该疗法的耐受性非常好，最初体重仅减轻2.2％，3天后完全恢复。与PBS相比，4-1BBL(Δcyt)疗法非常有效且具有治愈性(90.7％ TGI，60％完全反应(CR)，第30天)。这些数据证明了以肿瘤特异性方式递送含有编码共刺激分子的质粒的免疫刺激细菌的效力和安全性。
实施例12
鉴定促进组成型I型干扰素产生的基因中的功能获得性突变
出现具有严重自身炎症性病况和病因不明的血管病变的受试者病例，并且通常源自突变。已经且可以确定这些病症的原因。确定这种病理的突变基础的步骤如下。第一步，从出现症状的患者和健康个体中获取完整的基因组DNA。进行全外显子组测序，然后分析内含子和外显子。对与I型干扰素(IFN)表达相关的途径中的产物进行基因分析和突变鉴定。从这个分析中，在已知导致编码蛋白质的组成型功能激活以及随后持续表达I型IFN的基因中发现了突变。
在鉴定突变后，将编码全长基因的cDNA(带有或不带有已鉴定的突变)转染到报告细胞系中，以测量I型IFN的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达置于IFN-β启动子的控制之下。具有组成型活性的功能获得性(GOF)突变体促进IFN-β的表达，而未受刺激的野生型(WT)蛋白质则否。在已知STING SAVI(STING相关的婴儿期发病血管病变)突变体的情况下，IFN-β的WT-STING刺激需要增加cGAMP的外源性水平以直接激活WT-STING。组成型活性突变以cGAMP非依赖性方式刺激IFN-β的表达。STING、RIG-1、MDA5、IRF3和IRF7中的每一个中的示例性功能获得性突变在下文实施例15中阐述并在本文别处讨论。其中可以在受试者中鉴定或通过体外突变和筛选产生的功能获得性突变的其它这种基因包括但不限于TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
功能组成型I型IFN突变体在人细胞中的表达
将人STING(等位基因R232)和IRF3功能获得性(GOF)突变体(见下表)克隆到pATI-1.75载体中，通过PCR确认序列。为了确定STING和IRF3 GOF表达质粒是否能在人细胞中诱导功能性I型干扰素，使用不含内源性STING的HEK293T STING Null Reporter细胞(InvivoGen)对质粒进行评估。这些细胞表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性干扰素刺激的应答元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列已经使用敲入技术由SEAP ORF置换。可以通过监测细胞上清液中I型干扰素刺激的SEAP产生来评估I型干扰素活性。
为了检测GOF突变体产生的I型IFN的相对产量，前一天将1×105 293T-DualTMNull细胞(InvivoGen)铺板在用聚L-赖氨酸包被的平板上，以在24孔平板中达到80％的汇合度。在转染当天，将编码一组STING和IRF3 GOF突变体、包括STING野生型(WT)和IRF3 WT对照以及文献中报道的在人细胞中无功能的阴性对照突变(STING V155R阴性对照(NC))的200ng质粒在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)。过夜温育后收集每个样品的细胞培养上清液，将10μL细胞培养上清液加入50μLQUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)，用于测量SEAP。I型干扰素激活通过在/>M3分光光度计(Molecular Devices)上在650nm吸光度下测量ISRE诱导的SEAP活性来确定。
如下表所示，与不诱导I型IFN活性的野生型和阴性对照相比，所有GOF突变体均能在人细胞中以STING配体非依赖性方式诱导I型IFN活性。在人STING R284G和IRF3 S396D拟磷酸变体中观察到最高水平的I型IFN诱导。这些数据支持编码GOF突变体的质粒产生功能性的、组成型的STING和组成型的拟磷酸IRF3的能力，其以cGAMP非依赖性方式诱导I型干扰素。
感染含有编码组成型I型IFN突变体的质粒的鞭毛缺失菌株将人M2巨噬细胞转化为产生I型IFN的M1巨噬细胞
确定用含有编码组成型I型IFN GOF变体的质粒的鞭毛缺失的菌株感染的原代人M2巨噬细胞，是否可以转化为I型IFN和下游趋化因子如CXCL10(也称为IP-10)的生产物。
将从健康人供体中分离的冷冻人PBMC在完全培养基(RPMI-1640+1×非必需氨基酸+5％人AB血清)中解冻，在室温以800RPM离心10分钟进行洗涤。将PBMC重悬于PBS+2％FBS中，使用CD16耗竭试剂盒(StemCell Technologies)负分离单核细胞。为了产生原代人M2巨噬细胞，将分离的未接触的单核细胞通过在PBS+2％ FBS中离心洗涤，并重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(3e5/孔)种植于终体积为750μL的24孔平板中。种植两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/mL人M-CSF和10ng/mL人IL-4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入500μL的含有细胞因子的完全培养基，温育48小时。在第6天，将细胞培养基完全吸出并替换为不含细胞因子的新鲜完全培养基。将一式两份的孔以450的MOI在RPMI中用以下菌株感染1小时：含有编码野生型(WT)人(hu)STING的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；含有编码huSTING R284G变体的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；含有编码WT huIRF3的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；含有编码huIRF3 S396D变体的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG；或含有对照质粒的菌株。然后用PBS洗涤细胞3次，并重悬于RPMI+100μg/mL庆大霉素(Sigma)中。作为对照，将临床化合物ADU-S100的类似物STING激动剂3’5’RpRp c-di-AMP(InvivoGen)以10μg/mL加入细胞中。
24小时后，用具有β-ME(Qiagen)的350μL缓冲液RLT裂解细胞，使用Qiagen RNeasyMini试剂盒做以下修改进行RNA提取。基因组DNA去除步骤，包括使用RNase-Free DNase试剂盒(Qiagen)从总RNA中去除基因组DNA。使用NanoDropTM OneC紫外-可见分光光度计(Thermo Scientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也根据A260/A230吸收比进行评估。将RNA储存在-80℃，无需冻融直到进行逆转录。使用C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)和SuperScriptTM VILOTM Master Mix(Invitrogen)在30μL反应中根据制造商的说明从0.4-1μg模板RNA合成cDNA。
使用CFX96TM实时系统(Bio-Rad)进行qPCR。huCXCL10(qHsaCED0046619)、huIRF3(qHsaCID0013122)、huSTING(qHsaCID0010565)和huIFNβ1(qHsaCED0046851)的引物购自Bio-Rad。按照方案进行qPCR反应(20μL)，使用iTaqTMUniversal/>GreenSupermix(Bio-Rad)。BioRad CFX96TM实时系统上的标准热循环程序包括在95℃变性30秒，然后进行在95℃5秒和在60℃30秒的40个循环。每个平板上的每组引物均包括与无模板对照反应。所有样品均一式两份操作，计算平均Cq值。使用Gapdh参考mRNA(Bio-Rad，qMmuCED0027497)对靶mRNA定量进行标准化。以靶基因和参考基因之间的差异计算ΔCq。ΔΔCq是通过将处理的ΔCq值根据非处理对照的ΔCq值标准化而获得的。倍数增加以2^-ΔΔCq计算。这些值在下表中示出，是一式两份孔的平均值。
如下表所示，与对照质粒的感染相比，含有编码huSTING WT和huSTING R284G的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株诱导高水平的STING表达，这个水平显著高于对照质粒或小分子STING激动剂。相似地，含有编码WT huIRF3和huIRF3-S396D质粒的菌株诱导高水平的IRF3表达，显著高于对照质粒或小分子STING激动剂。与含有编码WT huSTING的质粒的菌株相比，含有编码huSTING R284G变体的质粒的细菌菌株诱导更高的IFNβ和CXCL10表达。这证实含有编码组成型STING GOF变体的质粒的菌株将人原代免疫抑制性M2巨噬细胞转化为I型IFN的M1生产细胞的能力。虽然含有编码WT huIRF3和huIRF3-S396D的质粒的菌株均诱导了更多或相似水平的IFNβ，但与huSTING-R284G变体相比，其诱导的CXCL10更少。
ND＝无数据
这些数据证实组成型GOF I型IFN变体在人原代M2巨噬细胞中表达，并将这些细胞转化为M1样I型IFN生产细胞。
实施例13
含有编码组成型I型IFN变体的免疫刺激细菌证实在鼠结肠直肠癌模型中强力的抗肿瘤免疫性
人GOF STING突变体示出在小鼠模型中的抗肿瘤活性
为了证实含有编码组成型活性STING变体的表达质粒的免疫刺激细菌菌株诱导抗肿瘤功效，将菌株YS1646Δasd/ΔFLG(鞭毛蛋白基因fljB和fliC均敲除)用在人延伸因子-1α(EF-1α)启动子之后含有具有等位基因R232和GOF突变V155M的人STING(huSTING V155M)的表达盒的质粒电穿孔，并将所述菌株与单独的菌株YS1646和PBS载体对照进行比较。编码huSTING V155M的基因使用DNA合成方法产生并克隆到pATI-1.75载体中。为了评估组成型人STING变体是否能在小鼠中具有抗肿瘤活性，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(在100μL PBS中5×105个细胞)。在第8天为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG huSTING V155M菌株、YS1646菌株或PBS对照。
结果表明，YS1646亲本菌株作为抗肿瘤疗法仅轻微有效，且不能治愈(35％ TGI，p＝NS(不显著)，第28天)，与先前公布的数据一致。然而，与PBS相比，含有编码组成型活性人STING的质粒的减毒程度更高的菌株YS1646Δasd/ΔFLG huSTING V155M引起了显著的肿瘤控制作用(60％ TGI，p<0.05，第28天)，且治愈率为20％。因此，递送组成型活性STING变体的免疫刺激细菌菌株有效抑制肿瘤生长抑制作用，并在结直肠腺癌模型中显示出疗效。
鼠拟磷酸IRF3示出体内治愈疗效
设计了拟磷酸人IRF3变体的鼠版本，命名为muIRF3-5388D，并在鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。将菌株YS1646Δasd/ΔFLG用在人延伸因子-1α(EF-1α)启动子后的含有具有GOF突变S388D的鼠IRF3(muIRF3-S388D)的表达盒的质粒电穿孔，并与PBS载体对照进行比较。使用DNA合成方法产生编码muIRF3-5388D的基因并克隆到pATI-1.75载体中。为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第10天对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的菌株YS1646Δasd/ΔFLG-EF-1α-muIRF3-S388D，并与PBS载体对照进行比较。
所述疗法的耐受性非常好，最初的体重减轻最低点仅为0.3％。与PBS相比，含有编码muIRF3-5388D GOF突变体的质粒的细菌菌株具有高效和治愈性(81.8％ TGI，60％治愈率，第42天)。这些数据证实以肿瘤特异性方式递送组成型I型IFN诱导变体的效力和安全性。
鼠STING GOF变体显示出强力和治愈性的抗肿瘤活性
设计一组在人患者中发现的人STING变体的鼠直向同源物。这些直向同源物与人变体有一个密码子不同，并将其克隆到EF-1α启动子控制下的pATI-1.75载体中，以产生以下一组突变体：muSTING N153S，muSTING V154M，muSTING R280Q，muSTING V146L，muSTINGR283G和muSTING C205Y等。在鼠腺癌MC38模型中评估STING变体的抗肿瘤功效。在研究中，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第10天，为带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG菌株，所述菌株含有带有驱动muSTINGN153S、muSTING V154M、muSTING R280Q、muSTING V146L或muSTING R283G表达的EF-1α的质粒，或乱序的shRNA对照质粒，并与PBS载体对照组相比。
在这个实验中，YS1646Δasd/ΔFLG EF-1α-shSCR(乱序对照质粒)与PBS对照相比表现出抗肿瘤功效(73％ TGI，第26天)，这比YS1646亲本菌株历史上显示的疗效更强力。这可能是由于质粒自身固有的免疫刺激元件例如CpG和RNAi刺激元件所致。这种疗法是组中耐受性最差的，示出9.9％的体重减轻最低点，仅在研究最终时恢复。相反，组成型活性鼠STING突变体导致较低的体重减轻，这种减轻是暂时的并在几天内恢复。这些变体的相对抗肿瘤功效揭示了活性差异，其中只有两个变体muSTING N153S和muSTING R283G表现出治愈疗效和超过质粒对照的增强的功效。
在后续研究中，对鼠STING C205Y变体与R283G和N153S变体一起进行检测，以比较其抗肿瘤功效。为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。在第9天，为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG菌株，所述菌株含有具有驱动muSTING N153S、muSTINGR283G或muSTING C205Y表达的EF-1α的质粒，并与PBS载体对照进行比较。与之前一样，STING变体的耐受性良好，并仅观察到体重减轻的短暂下降并迅速恢复。这可能是由于靶向疗法所致，因为在小分子STING激动剂中也观察到了这一点。两种组成型活性鼠STING变体muSTING N153S和muSTING R283G的功效与之前的研究几乎相同，但不明原因地体重减轻要少得多。muSTING C205Y变体也非常有效，但不能治愈。
来自这些研究的STING治愈的小鼠在初始肿瘤植入后第40天用MC38结肠直肠腺癌细胞(100μL PBS中5×105个细胞)皮下在对侧腹部进行再次挑战。与其中所有肿瘤均长出的天然小鼠(N＝5)相比，所有STING治愈的小鼠均排斥肿瘤，证实适应性免疫的参与。
这些数据验证了人组成型STING变体的鼠版本在鼠结肠直肠癌模型中的安全性和效力，并揭示了与其它STING变体相比具有增强效力的一个小组。这些高度活性的变体还引发保护性免疫，证实I型干扰素的肿瘤特异性产生的效力。
鼠STING GOF变体证实在静脉内给药后的显著的肿瘤重塑
接下来确定含有编码组成型STING变体的质粒的细菌菌株在静脉内给药后是否表现出重塑肿瘤微环境(TME)的能力的差异。为了检测这一点，为6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结肠直肠腺癌细胞(100μLPBS中5×105个细胞)。在第8天，对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉内注射5×105CFU的YS1646Δasd/ΔFLG菌株，所述菌株含有带有驱动muSTING N153S、muSTING V154M、muSTING R280Q、muSTINGV146L、muSTING R283G表达的EF-1α的质粒或质粒对照，并与PBS载体对照进行比较。
在肿瘤植入后第28天，切除肿瘤用于分析。将肿瘤切成2至3毫米的碎片，放入装有2.5mL酶混合物(RPMI-1640+10％ FBS和1mg/mL胶原酶IV和20μg/mL DNase I)的gentleMACSTM C管(Miltenyi Biotec)中。将肿瘤碎片使用OctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离，并将整个细胞制备物在37℃搅拌温育45分钟。温育45分钟后，使用OctoMACSTM(小鼠植入肿瘤)程序进行第二轮解离，并且所得单细胞悬浮液通过70μM尼龙网过滤到50mL管中。将尼龙网用5mL的RPMI-1640 10％ FBS洗涤一次，并使用新的70μM尼龙网将细胞再次过滤到新的50mL管中。将尼龙网用5mL具有10％ FBS的RPMI-1640洗涤，以及然后将过滤的细胞以1000RPM离心7分钟。将所得解离的细胞重新悬浮在PBS中并在染色过程之前保持在冰上。
通过流式细胞术在施用含有编码各种GOF muSTING突变体的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG菌株后，确定活的肿瘤浸润白细胞(TIL)的百分比，包括CD4+Tregs、CD4+Th1细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。对于流式细胞术染色，将100μL的单细胞悬浮液接种在V型底96孔平板的孔中。每孔加入100μL含死/活染色剂(Zombie AquaTM，BioLegend)和Fc封闭试剂(BD Biosciences)的PBS，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，通过以1300RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于PBS+2％ FBS中，其含有荧光染料缀合的抗体(CD4 FITC克隆RM4-5；CD8a BV421克隆53-6.7；F4/80APC克隆BM8；CD11b PE-Cy7克隆M1/70；CD45 BV570克隆30-F11；CD3 PE克隆145-2C11；Ly6C BV785克隆HK1.4；I-A/I-E APC-Cy7克隆M5/114.15.2；Ly6G BV605克隆1A8；和CD24 PercP-Cy5.5克隆M1/69；均来自BioLegend)，并在冰上避光温育30分钟。30分钟后，将细胞用PBS+2％ FBS以1300RPM离心3分钟洗涤两次，并重悬于流式细胞仪固定缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中。流式细胞术数据使用ACEA流式细胞仪(ACEABiosciences,Inc.)采集，并使用F1owJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如下表所示，带有EF-1α质粒对照的菌株YS1646Δasd/ΔFLG表现出主要是高嗜中性粒细胞浸润，尽管有一些CD8+T细胞募集，这可能是由于质粒上的免疫刺激元件所致。相反，不同的muSTING变体具有独特的肿瘤浸润免疫细胞特征，其中一些例如muSTING V146L和muSTING R283G，导致比PBS对照更少的免疫抑制性中性粒细胞。在施用突变体muSTINGR283G和muSTING N153S的小鼠肿瘤中观察到最有利的免疫特征，其具有大量CD4+Th1细胞和CD8+T细胞，以及少量中性粒细胞，这表示用于产生适应性免疫的高度有利的条件。此外，与PBS相比，muSTING R283G和muSTING N153S突变体在肿瘤中具有显著更高的p15e肿瘤抗原特异性CD8+T细胞。这些趋势也在总细胞计数中得到了重述，如下所示。因此，将组成型活性STING变体递送至肿瘤驻留骨髓细胞导致免疫抑制性肿瘤微环境的完全重塑，朝向适应性抗肿瘤表型，并远离特征在于促进先天免疫性和抑制适应性免疫的细菌表型。
活肿瘤侵润白细胞(TIL)的百分比
总细胞计数
实施例14
使用组合的质粒表达盒表达多种免疫调节蛋白
多模块质粒表达盒表明在人细胞中产生多种免疫调节蛋白的能力
使用在CMV和EF-1α启动子(双启动子系统)控制下的两个单独的ORF，或使用在ORF内的T2A肽和一个启动子(单启动子系统)，将编码GOF I型IFN诱导变体和细胞因子的核酸组合克隆到pATI-1.75载体中。所述构建体还任选地包括转录后调节元件(PRE)，例如3’WPRE或HPRE，和/或腺苷酸化信号序列，例如SV40或牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。制备的构建体包括编码细胞因子muIL-2、具有密码子优化的muIL-2(muIL-2CO)、muIL-21、muIL-12p70、muIL-15Rα-IL-15sc、muIL-18和muIFN-α2及其组合的那些构建体；具有突变R283G的muSTING变体；和/或缺失胞质结构域的鼠共刺激分子4-1BBL(mu4-1BBLΔcyt)。通过PCR确认序列。
为了确定含有GOF I型IFN诱导变体的组合质粒是否可以在人细胞中诱导功能性I型IFN，使用不含内源性STING的HEK293T STING Null Reporter细胞(InvivoGen)评估质粒。这些细胞表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激的反应元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列已使用敲入技术置换为SEAP ORF。可以通过监测细胞上清液中I型IFN刺激的SEAP产生来评估I型干扰素活性。此外，收集上清液并通过ELISA评估相对细胞因子浓度。
为了检测物I型IFN和共表达细胞因子的相对产生，前一天将2×105个293T-DualTMNull细胞(InvivoGen)铺板在用聚-L-赖氨酸包被的24孔平板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将500ng编码单独或各种组合的一组GOF变体、细胞因子和共刺激分子的质粒在无血清培养基中稀释并以适当的试剂:DNA比率添加到转染试剂(Promega)中。温育过夜后收集每个样品的细胞培养上清液，将20μL细胞培养上清液加入180μLQUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)中。通过在/>M3分光光度计(MolecularDevices)上在650nm的吸光度测量ISRE诱导的SEAP活性来确定I型干扰素活化。根据制造商的说明，在鼠IL-2ELISA(R&D Systems)中评估muIL-2构建体的muIL-2表达。根据制造商的建议，在鼠IL-12ELISA(R&D Systems)中评估muIL-12p70构建体。对于muIL-15Rα-IL-15sc构建体，按照试剂盒说明使用鼠IL-15ELISA(eBioscience)。使用RAW-LuciaTMISG报告细胞系(InvivoGen)测量IFN-α2。通过ELISA(Invitrogen)测量鼠IL-18和鼠IL-21。
如下表所示，为检测分泌的功能性蛋白质的存在而进行的测定显示出多种组合有效载荷的高表达。这些包括细胞因子组合，以及与I型IFN诱导GOF变体和/或共刺激有效载荷的组合。这些数据验证了本文提供的平台从单个表达盒表达多种免疫调节蛋白的能力。
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组成型I型IFN诱导变体具有独特的细胞因子和趋化因子谱
根据制造商的方案，使用人抗病毒CBA组(BD Biosciences)评估从HEK293T转染试验中收获的上清液的下游信号差异，所述转染试验是使用如上所述检测的一组人I型IFN诱导GOF变体。每个转染一式两份进行，并测量细胞因子水平。计算两次测量的平均值。与未转染的孔相比，计算平均细胞因子分泌的增加倍数，其中平均细胞因子分泌设置为1.00。
如下表所示，细胞中产生了低水平的人IL-12p70。然而，一些人I型IFN诱导GOF变体诱导I型IFN-α2和/或IFN-β的产生，包括拟磷酸IRF3变体(huIRF3-S396D)，以及一些组成型活性STING变体。许多这些GOF变体产生高水平的分泌的CXCL10，证明了这些表达的变体将T细胞募集到肿瘤微环境中的能力。在具有突变R284G的huSTING变体表达后，观察到最高水平的CXCL10表达。
这些数据验证了含有I型IFN诱导GOF变体的多重质粒表达构建体在诱导功能性下游细胞因子和趋化因子例如CXCL10/IP10中的应用。这些变体都具有独特的特征，STINGGOF变体诱导最高水平的CXCL10分泌，尤其是huSTING-R284G(对应于muSTING-R283G)。
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免疫细胞共培养测定鉴定了免疫调节靶的最佳组合
为了确定引发T细胞募集和激活的细胞因子的最佳组合，在巨噬细胞和T细胞共培养测定中测试了一组组合。如上文所述使用24孔平板产生Golden Ticket(STING缺陷型)鼠原代骨髓衍生巨噬细胞(BMM)(参见实施例6)。将每个孔使用转染试剂(Promega)用适当的DNA构建体转染。所述构建体包括编码muIL-2CO、muIL-12p70、muSTING-R283G、muIL-2CO+muIL-12p70、muIL-15Rα-IL-15sc+muIL-12p70和muIL-12p70+muSTING-R283G+muIL-18的那些构建体。
转染后24小时，从孔中收集100μL细胞培养上清液，用于基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(CBA)。同时，解剖来自C57BL/6小鼠的两个脾脏，按照小鼠T细胞分离试剂盒的说明(StemCell Technologies)分离脾CD4+和CD8+T细胞。然后将每孔200,000个分离的T细胞加入转染的细胞中，有或没有CD3ε抗体(克隆145-2C11，BioLegend)，最终浓度为每孔0.5μg/ml。在将T细胞加入转染细胞后24和48小时，从孔中收集100μL共培养上清液，用于基于流式细胞术的细胞因子珠阵列。分别使用鼠抗病毒和鼠Th1特异性细胞因子珠阵列分析来自转染的骨髓巨噬细胞(BMM)和骨髓巨噬细胞/T细胞共培养物的上清液的细胞因子含量。
如下表所示，只有编码muSTING-R283G的质粒引发巨噬细胞产生CXCL10，而编码muIL-12p70的质粒单独或与其它蛋白质组合从共培养的T-细胞中引发最高水平的IFNγ，高于得自CD3ε刺激产生的背景量。muIL-12p70+muIL-18+muSTING-R283G的组合能够诱导巨噬细胞产生CXCL10，以及共培养的T细胞产生IFNγ。
这些数据证明了从单个质粒表达多种免疫调节有效载荷的可行性，以及这些组合的协同活性。
联合免疫疗法在小鼠结肠直肠腺癌模型中显示出增强的抗肿瘤活性
为了确定细胞因子组合的肿瘤特异性递送是否增强抗肿瘤功效，将编码muIL-12p70、muIL-18和muSTING-R283G组合的构建体(CMV-muIL-12p70_T2A_muIL-18+EF-1α-muSTING-R283G-WPRE)在MC38小鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。在这项研究中，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种MC38结直肠腺癌细胞(100μLPBS中的5×105个细胞)。在第10天，给带有已建立侧腹肿瘤的小鼠静脉注射1×107CFU菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB，所述菌株含有编码muIL-12p70、muIL-18和muSTING-R283G组合的质粒(CMV-muIL-12p70_T2A_muIL-18+EF-1α-muSTING-R283G-WPRE)，或具有PBS载体对照。
所述联合疗法的耐受性非常好，最初体重减轻3.6％，3天后完全恢复。这与全身施用这些细胞因子(IL-12p70和IL-18)时观察到的毒性形成鲜明对比。与PBS对照相比，所述联合疗法非常有效且具有治愈性(92.3％ TGI，60％治愈率，第30天)。这些数据表明使用本文所述的免疫刺激细菌菌株以肿瘤特异性方式递送细胞因子组合的效力和安全性。
实施例15
蛋白质工程化筛选以鉴定STING、RIG-I、MDA5、IRF3、IRF7和其它干扰素途径基因中改进的功能获得性突变
从人体中鉴定了组成型活性并促进干扰素疾病的功能获得性(GOF)氨基酸突变体。许多GOF突变是由于单个碱基对核苷酸的变化而发生的，这些变化改变了基因中特定位置的氨基酸密码子。例如，在STING中，V147L突变是由于c.439G→C的突变而发生的；N154S是由于c.461A→G的突变而发生的；V155M是由于c.463G→A的突变而发生的。筛选的目的是鉴定导致高水平I型干扰素表达的组成型活性突变体。在已知当突变时促进人患者干扰素疾病的位点上设计的突变使得可以检测更多数量的氨基酸取代。在这个实施例中，在已知突变的位置(见下表列出促进干扰素病的基因中的突变)用设计的氨基酸进行定点诱变，以鉴定具有增强活性的突变，其导致高水平I型干扰素表达。
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参考SEQ ID NO:305-309所示人STING序列的氨基酸残基R197、D205、R310、R293、T294、E296、S272、Q273、E316、D231、R232、K236、S358、E360、S366和R238，分别对应于参考SEQ ID NO:369所示小鼠STING序列的氨基酸残基R196、D204、R309、R292、T293、E295、S271、Q272、E315、D230、R231、K235、S357、E359、S365和R237。
PCR引物是用在来自所述基因的同源cDNA序列5’和3’末端侧翼设计的取代产生的。定点诱变试剂盒(Agilent)或其它类似的可商购试剂盒用于产生掺入设计的突变的PCR产物。将PCR扩增的质粒用DpnI处理，然后在感受态大肠杆菌细胞中进行电穿孔。分离单个克隆，进行质粒小量制备(mini-preps)，并确认所需突变的序列相同性。然后进行更大规模的质粒制备(使用Qiagen试剂盒)并将DNA转染到不含内源性STING的HEK293TSTING报道细胞(InvivoGen)中。这些细胞表达LuciaTM荧光素酶，这是一种分泌的荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制之下；IFN-β的编码序列已使用敲入技术由LuciaTM荧光素酶ORF取代。然后通过测量IFN-β启动子诱导的荧光素酶活性表达来鉴别和分级组成型激活的突变体。
实施例16
与鼠伤寒沙门氏菌缺失相对应的各种具有失活缺失的免疫刺激细菌
上述实施例描述了对鼠伤寒沙门氏菌基因组的示例性修饰，以增加对鼠伤寒沙门氏菌在免疫驻留骨髓细胞和肿瘤微环境中的靶向和积累，向肿瘤递送治疗产物/有效载荷，并通过消除其感染其它细胞类型的能力降低细菌的毒性。类似地，这些遗传修饰可以引入其它细菌菌株和物种，例如通过缺失其它物种中的相应基因而实现，如下所述。
大肠杆菌(Escherichia coli)
lpxM、purM、asd、fliC、fliE、pagP、ansB和csgD基因的符合读框的染色体缺失是使用基于Datsenko和Wanner描述的重组工程方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))的技术在大肠杆菌菌株中相继制成的。大肠杆菌中的基因如下：
1)lpxM，编码肉豆蔻酰基-酰基载体蛋白依赖性酰基转移酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：945143]；
2)purM，编码磷酸核糖甲酰甘氨酰胺环连接酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：946975]；
3)asd，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：947939]；
4)fliC，编码鞭毛丝结构蛋白[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：949101]；
5)fliE，编码鞭毛基体蛋白FliE[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：946446]；
6)pagP，编码脂质IVA棕榈酰转移酶[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：946360]；
7)ansB，编码L-天冬酰胺酶2[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：947454]；
8)csgD，编码DNA结合转录双重调节因子CsgD[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：949119]；和
9)rpsM，编码30S核糖体亚基蛋白S13(启动子)[大肠杆菌菌株K-12，亚株MG1655；NCBI基因ID：947791]。
简而言之，特定的染色体序列被两侧是同源臂的可选择抗生素抗性标记所取代，随后通过cre/loxP系统去除。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并克隆到与抗生素抗性基因相对侧的质粒载体中。将包含抗生素抗性基因和侧翼5’和3’同源臂的基因缺失盒通过PCR扩增、凝胶纯化，并通过电穿孔引入大肠杆菌菌株。回收电穿孔的细胞，并在抗生素平板上选择转化体。然后使用cre/loxP重组系统处理抗生素标记，其中抗生素抗性克隆用表达cre的温度依赖性质粒转化。在30℃下选择菌落，随后在42℃下通过连续传代消除，然后筛选抗生素抗性的丧失。通过菌落PCR和序列分析确认抗生素敏感克隆的基因缺失。
增加大肠杆菌对人补体抗性或使其产生抗性
鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail(附着侵入位点)或鼠伤寒沙门氏菌pgtE(外膜丝氨酸蛋白酶)基因在大肠杆菌ΔlpxM/ΔpurM/Δasd/ΔfliC/ΔfliE/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株中的表达，是通过在质粒上(asd互补系统兼容的)编码组成型启动子例如大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌rpsM下游的rck、ail或pgtE基因序列，或通过插入在细菌染色体上(在任何的lpxM、purM、asd、fliC、fliE、pagP、ansB或csgD基因座)来实现。
伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)
msbB、purM、asd、fliC、flgB、pagP、ansB和csgD基因的符合读框地染色体缺失是在伤寒沙门氏菌菌株中使用上述基于大肠杆菌菌株的技术相继制成的。
在伤寒沙门氏菌ΔmsbB/ΔpurM/Δasd/ΔfliC/ΔflgB/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株中表达鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码组成型启动子如鼠伤寒沙门氏菌或伤寒沙门氏菌rpsM下游的rck、ail或pgtE基因序列，或者通过插入在细菌染色体上(在任何的msbB、purM、asd、fliC、flgB、pagP、ansB或csgD)来实现的。伤寒沙门氏菌中的基因如下：
1)msbB(STY2097)，编码脂质A酰基转移酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1248440]；
2)purM(STY2740)，编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1249054]；
3)asd(STY4271)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1250488]；
4)fliC(STY2167)，编码鞭毛蛋白[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1248507]；
5)flgB(STY1213)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgB[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1247617]；
6)pagP(STY0677)，编码抗菌肽抗性和脂质A酰化蛋白[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，CT18株；NCBI基因ID：1247137]；
7)ansB(STY3259)，编码L-天冬酰胺酶[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1249541]；
8)csgD(STY1179)，编码调节蛋白CsgD[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1247585]；和
9)rpsM(STY4380)，编码30S核糖体亚基蛋白S13(启动子)[肠道沙门氏菌亚种伤寒沙门氏菌血清型，菌株CT18；NCBI基因ID：1250594]。
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)
单核细胞增生李斯特菌中purA、purQ、purS、asd、flaA、fliC、flgB和ansB基因的符合读框地染色体缺失是通过使用温度敏感穿梭载体如pKSV7的等位基因交换技术实现的，该载体赋予抗生素抗性并允许在低温(30℃)下复制，但无法在更高温度(43℃)下复制。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并串联克隆到pKSV7载体中，将其转化为受体单核细胞增生李斯特菌，并通过铺板在具有抗生素的琼脂平板上进行选择。质粒的染色体整合是通过在42℃选择的抗生素抗性转化株的连续传代来诱导的。随后在30℃对所述菌株进行连续继代培养，产生细胞亚群，其中通过第二次交换事件切除质粒，产生恢复为原始野生型基因，或掺入5’和3’侧翼序列同源臂以生成靶向缺失突变体。在此步骤通过菌落PCR和序列分析筛选抗生素敏感克隆。
为了增加补体抗性，在单核细胞增生李斯特菌ΔpurA/ΔpurQ/ΔpurS/Δasd/ΔflaA/ΔfliC/ΔflgB/ΔansB菌株中鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因的表达，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码组成型启动子例如Phyper或Phelper下游的rck、ail或pgtE基因序列，或通过插入在细菌染色体上(在任何的purA、purQ、purS、asd、flaA、fliC、flgB或ansB基因座)而实现的。单核细胞增生李斯特菌中的基因如下：
1)purA(lmo0055)，编码腺苷酸琥珀酸合成酶[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：986069]；
2)purQ(lmo1769)，编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶II[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985972]；
3)purS(lmo1771)，编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒合酶亚基PurS[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985970]；
4)asd(lmo1437)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：986492]；
5)flaA(lmo0690)，编码鞭毛蛋白[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：987167]；
6)fliE(lmo0712)，编码鞭毛钩基体蛋白FliE[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985062]；
7)flgB(lmo0710)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgB[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID 985059]；和
8)ansB(lmo1663)，编码天冬酰胺合成酶[单核细胞增生李斯特菌菌株EGD-e；NCBI基因ID：985663]。
单核细胞增生李斯特菌中不存在msbB和pagP基因，这是一种革兰氏阳性细菌。CsgD在单核细胞增生李斯特菌中也不存在。相反，李斯特菌表达编码参与生物膜形成的李斯特菌纤维素结合蛋白的lcp，该基因也可以被缺失。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
长双歧杆菌中BL1122(purM)、BL0492(asd)和BL1142(编码L-天冬酰胺酶前体)的符合读框地染色体缺失是通过使用不相容质粒载体系统的等位基因交换技术实现的，其中最初将缺乏质粒复制基因repA的条件化复制载体如pBS423ΔrepA整合到基因组中，提供抗生素抗性。随后转化编码repA基因的第二个质粒如pTBR101-CM，并促进选择切除初始整合体的第二次交换事件。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并串联克隆到缺乏repA的条件化复制载体中，并转化为长双歧杆菌ΔBL1122/ΔBL0492/ΔBL1142菌株。交叉重组事件可以发生在同源臂序列上，选择成功的质粒整合体并在抗生素平板上分离。然后用编码repA功能拷贝的不相容质粒转化整合体，这有助于第二次交换事件和repA缺陷质粒的切除，其随后由于质粒不相容而丧失。通过菌落PCR和序列分析确认基因组缺失，通过去除选择和随后的Rif处理来处理剩余的质粒。
在长双歧杆菌ΔBL1122/ΔBL0492/ΔBL1142菌株中表达鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码强组成型启动子如Pgap下游的rck、ail或pgtE基因序列来实现的，或通过插入在细菌染色体上(在任何的BL1122、BL0492或BL1142基因座)而实现的。长双歧杆菌中的基因如下：
1)purM(BL1122)，编码磷酸核糖甲酰基甘氨酰胺环连接酶[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1022669]；
2)asd(BL0492)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1023089]；
3)BL1142，编码L-天冬酰胺酶前体(Ntn_天冬酰胺酶_2_样；NTN-水解酶超家族的L-天冬酰胺酶2型样酶)[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1023120]；和
4)BL1363 gap(启动子)[长双歧杆菌菌株NCC2705；NCBI基因ID：1022828]。
长双歧杆菌无能动性，缺乏鞭毛蛋白，是革兰氏阳性菌，缺乏msbB和pagP。存在ansB基因，但编码天冬氨酸解氨酶，该酶催化天冬氨酸(aspA/ansB)形成富马酸[BL0338，长双歧杆菌NCC2705；NCBI基因ID：1023259]。
诺氏梭菌(Clostridium novyi)
梭菌中NT01CX_RS09765、NT01CX_RS07625和NT01CX_RS04325(asd)；鞭毛蛋白基因NT01CX_RS04995、NT01CX_RS04990、NT01CX_RS05070和NT01CX_RS05075；鞭毛基体杆蛋白基因NT01CX_RS05080(flgB)、NT01CX_RS05085(flgC)和NT01CX_RS05215(flgG)的符合读框地染色体缺失是通过等位基因交换技术实现的，该技术需要包括毒素-抗毒素系统在内的反选择方法，这需要诱导型启动子和毒性基因，例如大肠杆菌mRNA干扰酶mazF。鉴定每个靶基因的5’和3’侧翼序列并克隆到含等位基因交换反选择载体中的frt侧翼抗生素抗性盒的相对侧的构型中，并转化为新梭菌。mazF基因在等位基因交换载体上在诱导型lac启动子的控制下编码，并允许通过在补充了乳糖的琼脂平板上生长来选择双交换事件。通过菌落PCR和序列分析确认基因组缺失。然后可以使用Flp-frt重组来处理染色体中的抗生素抗性盒。
在诺氏梭菌ΔNT01CX_RS09765/ΔNT01CX_RS07625/ΔNT01CX_RS04325/ΔNT01CX_RS04995/ΔNT01CX_RS04990/ΔNT01CX_RS05070/ΔNT01CX_RS05075/ΔNT01CX_RS05080/ΔNT01CX_RS05085/ΔNT01CX_RS05215菌株中表达鼠伤寒沙门氏菌rck(补体杀伤抗性)基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌同源物ail或鼠伤寒沙门氏菌pgtE基因，是通过在质粒(asd互补系统兼容的)上编码强组成型启动子如Pthl、Pptb或其它变体下游的rck、ail或pgtE基因序列来实现的，或者通过插入在细菌染色体(在任何的NT01CX_RS09765、NT01CX_RS07625、NT01CX_RS04325、NT01CX_RS04995、NT01CX_RS04990、NT01CX_RS05070、NT01CX_RS05075、NT01CX_RS05080、NT01CX_RS05085、或NT01CX_RS05215基因座)上实现的。诺氏梭菌中的基因如下：
1)NT01CX_RS09765，编码AIR合酶[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4541583]；
2)NT01CX_RS07625，编码磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540669]；
3)NT01CX_RS04325(asd)，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4541762]；
4)NT01CX_RS04995，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4541703]；
5)NT01CX_RS04990，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4539984]；
6)NT01CX_RS05070，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌NT；NCBI基因ID：4539886]；
7)NT01CX_RS05075，编码鞭毛蛋白[诺氏梭菌NT；NCBI基因ID：4539699]；
8)NT01CX_RS05080(flgB)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgB[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540637]；
9)NT01CX_RS05085(flgC)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgC[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540143]；和
10)NT01CX_RS05215(flgG)，编码鞭毛基体杆蛋白FlgG[诺氏梭菌菌株NT；NCBI基因ID：4540245]。
诺氏梭菌是革兰氏阳性菌，缺乏msbB和pagP。
实施例17
经修饰以表达比人STING诱导更强I型IFN信号传导和/或更弱NF-κB信号传导的脊椎动物STING变体的免疫刺激细菌
STING信号传导激活两种信号传导途径。第一种是TANK结合激酶(TBK1)/IRF3轴，导致I型干扰素的诱导，以及树突状细胞(DC)的激活和肿瘤抗原的交叉呈递以激活CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。第二种是激活的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导轴，导致促炎反应，但不激活抗肿瘤免疫所需的DC和CD8+T细胞。基于细菌的癌症免疫疗法在诱导I型IFN以募集和激活促进肿瘤抗原交叉呈递和持久抗肿瘤免疫所必需的CD8+T细胞方面的能力有限。因此，本文提供了诱导和/或增加I型IFN信号传导并且具有降低的NF-κB信号传导的免疫刺激细菌，从而增加CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫的诱导，并增强细菌的治疗功效。上述免疫刺激细菌编码修饰的STING蛋白，这些蛋白是STING的功能获得性突变体，其与野生型STING相比，可以增加I型IFN的诱导，或使I型IFN的表达成为组成型。在本实施例中(且也在详细描述中描述)，STING蛋白被修饰以降低或消除NF-κB信号传导活性，并保留诱导I型IFN的能力，和/或STING蛋白被修饰为增加I型干扰素表达或组成型表达I型干扰素。这导致产生免疫刺激细菌，其诱导抗肿瘤免疫，并且不诱导(或诱导较少)通常由细菌病原体感染引起的NF-κB信号传导。
来自不同物种的STING蛋白表现出不同水平的I型IFN和NF-κB信号传导活性。例如，人和小鼠细胞中的STING信号传导导致强I型IFN应答和弱促炎NF-κB应答。相比之下，鳍鱼类(ray-finned fish)如鲑鱼和斑马鱼中的STING信号传导引起主要是NF-κB驱动的应答的强烈激活，与IRF3驱动的(即I型IFN诱导的)应答相比高100倍以上。在其它物种例如袋獾中，STING信号传导导致I型IFN应答，但基本上没有NF-κB应答。本文提供的免疫刺激细菌编码来自非人物种的STING例如袋獾STING，以便利用STING诱导I型IFN应答的能力，但不会同时诱导NF-κB应答。如本文所述，这些非人STING蛋白也通过突变修饰以增加I型IFN应答，或使其成为组成型。在人STING中鉴定的具有这种效应的突变被引入到非人STING蛋白中。通过比对鉴定相应的残基。
还提供了嵌合体，其中STING的C末端尾部(CTT)在一个物种(例如人)中用来自表现出很少或没有NF-κB信号传导活性的第二个(例如非人)物种的CTT替换。CTT是一个约40个氨基酸的非结构化片段，其含有STING磷酸化和IRF3募集所需的序列基序。其可以通过改变I型IFN和NF-κB信号传导之间的平衡来塑造下游免疫。这通过CTT中的独立模块控制，包括IRF3、TBK1和TRAF6结合模块。例如，人STING残基S366(见例如SEQ ID NO:305-309)是主要的TBK1磷酸化位点，其是IRF3结合所需的CTT中LxIS基序的一部分，而第二个PxPLR基序，包括残基L374，是TBK1结合所需的。LxIS和PxPLR基序在所有脊椎动物STING等位基因中高度保守。用例如袋獾STING的CTT取代人STING的CTT产生诱导I型IFN应答但不诱导NF-κB应答的STING。
在这个实施例中，免疫刺激细菌被工程化为表达与野生型(WT)人STING(SEQ IDNO:305-309)相比具有增加的I型IFN信号传导和/或减少的NF-κB信号传导的STING变体。STING变体可以来自非人脊椎动物，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类物种。非人STING蛋白源自的物种包括但不限于袋獾(Sarcophilus harrisii；SEQ ID NO:349)，狨猴(Callithrix jacchus；SEQ ID NO:359)，牛(Bos taurus；SEQ ID NO:360)，猫(Fellscatus；SEQ ID NO:356)，鸵鸟(Struthio camelus australis；SEQ ID NO:361)，朱鹮(Nipponia nippon；SEQ ID NO:362)，腔棘鱼(Latimeria chalumnae；SEQ ID NO:363-364)，野猪(Sus scrofa；SEQ ID NO:365)，蝙蝠(Rousettus aegyptiacus；SEQ ID NO:366)，海牛(Trichechus manatus latirostris；SEQ ID NO:367)，鬼鲨(Callorhinchusmilli；SEQ ID NO:368)，和小鼠(Mus musculus；SEQ ID NO:369)。这些脊椎动物STING蛋白很容易激活人细胞中的免疫信号传导，表明STING信号传导的分子机制在脊椎动物之间是共享的(见例如de Oliveira Mann et al.(2019)Cell Reports 27:1165-1175)。与人STING相比，来自这些物种的STING蛋白诱导更少的NF-κB信号激活和/或更多的I型干扰素信号激活(见例如de Oliveira Mann et al.(2019)，图1A)。来自不同非人物种的野生型或修饰的STING蛋白可以由本文的免疫刺激细菌表达，其可以是人和非人STING蛋白的嵌合体。
各种非人STING蛋白被修饰，使得非人STING具有比人STING更低的NF-κB激活，并且任选地具有更高的I型干扰素激活。这些非人STING蛋白被修饰以包括一个或多个突变，以使其具有增加的I型IFN活性，或在没有胞质核酸配体(例如CDN)的情况下组成型地起作用。突变通常是与人干扰素疾病相关的氨基酸突变，例如功能获得性突变。相应的突变被引入非人物种STING蛋白，其中相应的氨基酸残基通过比对而鉴定。例如，突变包括但不限于S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A和S324A/S326A，其参照SEQ ID NO:305-309所示的人STING序列。下表列出了来自其它物种的STING中的相应突变。所得非人STING蛋白的变体包括一种或多种的这些突变，和任选CTT置换，以及任选TRAF6结合位点中的缺失。
STING变体包括磷酸化位点处的氨基酸丝氨酸(S)或苏氨酸(T)用拟磷酸的天冬氨酸(D)进行的一个或多个置换，由此产生增加的或组成型活性。其它突变包括缺失或置换一个或多个磷酸化位点，例如STING中的324-326SLS→ALA，以及其它置换以消除磷酸化位点，降低STING中的NF-κB信号传导。此外，还提供了人STING与来自其它物种的STING的嵌合体，其中人STING的C末端尾部(CTT)用来自另一个物种的具有更低NF-κB信号传导活性和/或更高I型IFN信号活性的STING的CTT置换。变体STING蛋白可以包括CTT的TRAF6结合位点中的缺失，以降低NF-κB信号传导。
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例如，修饰的STING变体包括具有突变C206Y(SEQ ID NO:350)或R284G(SEQ IDNO:351)的袋獾STING；其中人STING的CTT被袋獾STING的CTT取代的变体(SEQ ID NO:352)；具有突变C206Y(SEQ ID NO:353)或R284G(SEQ ID NO:354)的人STING，并且其中CTT被袋獾STING的CTT置换；具有TRAF6结合结构域中的缺失(对应于残基377-379，DFS))的野生型人STING(SEQ ID NO:355)；具有突变C205Y(SEQ ID NO:357)或R283G(SEQ ID NO:358)的猫STING；和其它这种修饰的STING变体。
为了确定STING突变的相应氨基酸残基，将来自各种非人物种的野生型STING序列各自与野生型人STING序列(SEQ ID NO:305(R232等位基因)或SEQ ID NO:306(H232等位基因)的等位基因变体的)进行比对。使用可从ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/获得的Kalign序列比对工具，或者可从ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得的EMBOSS needle序列比对工具进行比对。图1-13中描绘了人STING分别与来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、朱鹭、腔棘鱼、斑马鱼、野猪、蝙蝠、海牛、鬼鲨和小鼠物种的STING蛋白的示例性序列比对。
STING GOF杂合变体证实在树突状细胞中的显著提高的I型干扰素与NF-κB比率
为了确定在小鼠中引起最高水平CD8+T细胞趋化因子CXCL10的优化STING GOF突变体，在小鼠原代骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)中测试了一组突变体。这些包括具有组成型人GOF突变C206Y(tazSTING C206Y；SEQ ID NO:350)或R284G(tazSTING R284G；SEQ IDNO:351)的袋獾STING；具有组成型GOF突变体C205Y(muSTING C205Y；SEQ ID NO:399)或R283G(muSTING R283G；SEQ ID NO:400)的鼠STING；具有组成型GOF突变体C205Y(catSTINGC205Y；SEQ ID NO:357)或R283G(catSTING R283G；SEQ ID NO:358)的猫STING；以及以及其中人STING(SEQ ID NO:370)的CTT被袋獾STING(SEQ ID NO:371)的CTT置换并含有野生型人STING(huSTING tazCTT；见例如SEQ ID NO:352)或人STING GOF突变C206Y(huSTINGC206Y tazCTT；见例如SEQ ID NO:353)或R284G(huSTING R284G tazCTT；见例如SEQ IDNO:354)的变体。还包括具有组成型GOF突变C206Y(huSTING C206Y)或R284G(huSTINGR284G)的人STING变体。
为了测试这些，分离鼠骨髓并冲入1.5mL Eppendorf管并以1200RPM旋转5分钟以收集骨髓细胞。将细胞在RPMI-1640+10％ FBS中洗涤一次，然后种植在96孔TC处理的具有20ng/ml GM-CSF的RPMI-1640+10％ FBS平板中。每2天用新鲜的完全培养基更换50％的培养基。6天后，将非贴壁细胞从孔中吸出并以1e5/孔细胞重新种植在96孔平板中的RPMI-1640+10％ FBS中用于转染。根据制造商的说明，使用RED转染细胞。简而言之，将来自一组STING GOF突变体的200ng质粒DNA以及未转染对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.08μL的/>RED混合并在室温下温育15分钟以使得可以形成/>复合物。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入96孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在CO2温育器中在37℃温育。根据制造商的方案，在48小时收集上清液并使用基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(CBA)测定鼠CXCL10(IP-10)。
如下表所示，诱导鼠CXCL10最高表达的构建体人STING(huSTING R284G tazCTT)，其含有GOF突变R284G，并且含有人STING的CTT被置换为袋獾STING的CTT。次高的CXCL10表达是由含有GOF突变C206Y人STING变体(huSTING C206Y)和含有人STING GOF突变R284G的袋獾STING构建体(tazSTING R284G)诱导的。在原代鼠树突状细胞中，人STING GOF突变体(huSTING C206Y和huSTING R284G)比相应的鼠STING GOF突变体(分别为muSTING C205Y和muSTING R283G)更强效，后者甚至不如含有相同GOF突变(分别为catSTING C205Y和catSTING R283G)的猫STING强效。
构建体 muCXCL10(pg/mL)
未转染的 11.48±3.889
huSTING C206Y 861.0±58.48
huSTING R284G 769.7±95.16
muSTING C205Y 194±27.15
muSTING R283G 230.1±1.018
huSTING C206Y tazCTT 366.6±42.61
huSTING R284G tazCTT 1326±137.9
tazSTING C206Y 808.8±95.78
tazSTING R284G 831.3±30.15
catSTING C205Y 480.7±24.94
catSTING R283G 376.2±6.682
这些数据证实利用从其它物种例如袋獾获得的STING蛋白可以与组成型GOF人STING突变组合以引发强力的T细胞募集趋化因子。
STING GOF杂合变体证实在人单核细胞中的显著提高的I型干扰素与NF-κB比率
为了证实使用来自其它物种的STING GOF杂合变体可以改变STING诱导的I型干扰素与NF-κB信号传导比率，在人单核细胞系中测试了一个小组。该小组包括野生型人STING(huSTING)，和具有组成型人GOF突变C206Y或R284G的人STING突变体；野生型袋獾STING(tazSTING)，和具有组成型GOF突变C206Y或R284G的tazSTING突变体；野生型猫STING，和具有组成型GOF突变C205或R283G的猫STING突变体；具有组成型GOF突变C205Y或R283G的鼠STING突变体；以及其中人STING的CTT被置换为袋獾STING的CTT并含有野生型人STING或人STING突变C206Y或R284G的变体。还包括在TRAF6结合结构域具有缺失(相应于残基377-379，DFS，见例如SEQ ID NO:355)的野生型人STING，以及野生型斑马鱼STING。
对于这个实验，使用了THP1-DualTMKO STING细胞，这些细胞已经被改变为缺乏内源性STING，并且还表达LuciaTM荧光素酶，其是一种分泌型荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制之下。然后通过测量IFN-β启动子诱导的荧光素酶活性表达鉴定和分级组成型活性的STING GOF突变体。这些细胞还表达在内源性NF-κB启动子控制下的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，其中NF-κB的编码序列已使用敲入技术置换为SEAP ORF。STING GOF突变体诱导的NF-κB活性可以通过监测细胞上清液中的SEAP产生来评估。
对于这个实验，根据制造商指导，用RED转染THP1-DualTMKO STING细胞。简而言之，将来自一组STING GOF突变体的200ng质粒DNA以及未转染的对照在提供的缓冲液中稀释，与0.08μL的/>RED混合并在室温下温育15分钟以允许形成/>复合物。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入96孔平板的每个孔中(一式两份)，并将平板在CO2温育器中在37℃温育。此外，野生型STING变体用或不用STING激动剂3’5’RpRp c-di-AMP(CDN，InvivoGen)处理，该激动剂是临床化合物ADU-S100的类似物，在温育24小时后以10μg/mL加入到细胞。根据制造商的方案，在48小时收集上清液并测定NF-κB-SEAP和IFN-Lucia报告分子信号。简而言之，将10μL细胞培养上清液加入到50μL QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)(用于测量SEAP)。NF-κB活化是通过在/>M3分光光度计(MolecularDevices)上在吸光度(Abs)为650nm测量NF-κB诱导的SEAP活性而确定。为了测量来自IFN-Lucia的I型干扰素活性，将10μL细胞培养上清液加入50μL含有用于荧光素酶反应的腔肠素底物的QUANTI-LucTM，其产生光信号，使用/>M3分光光度计定量所述光信号，并表示为相对光单位(RLU)。
如下表所示，最高的I型IFN应答在其中人STING的CTT被袋獾STING的CTT置换并且含有人STING GOF突变R284G的变体(huSTING R284G tazCTT)中观察到，以及在具有CDNSTING激动剂的野生型斑马鱼STING(zfSTING WT+CDN)中观察到。然而，与具有非常高的NF-κB信号传导的野生型斑马鱼STING不同，huSTING R284G tazCTT变体具有高I型IFN信号传导，而NF-κB信号传导活性低得多。在含有人STING GOF突变R284G的袋獾STING变体(tazSTING R284G)中发现了较高I型IFN与较低NF-κB信号传导的最佳比率。
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SD＝标准差
这些数据进一步证实使用非人STING蛋白(例如来自袋獾的STING蛋白)并将其与人组成型功能获得性STING突变组合，以在人单核细胞中增强有益的I型干扰素活性，同时最小化免疫抑制性NF-κB活性。
实施例18
通过缺失lppA和lppB基因敲除鼠伤寒沙门氏菌脂蛋白
将含有Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD基因缺失的活的减毒鼠伤寒沙门氏菌YS1646菌株工程化以缺失lppA(SEQ ID NO:387)和lppB(SEQ ID NO:388)基因，以便去除膜表面脂蛋白。这减少了促炎TLR2的活化，从而减少了免疫抑制细胞因子并提高了抗肿瘤适应性免疫。如下所示，这也增强了肿瘤中的质粒递送和编码蛋白表达。
菌株工程化和鉴定
lppA基因的缺失
如上文详细描述，使用修改的Datsenko和Wanner方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))，从YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的染色体中缺失lppA。合成合成的lppA基因同源臂序列含有分别位于lppA基因两侧的231和200个碱基的左侧和右侧序列，将其克隆到称为pSL0148(SEQ ID NO：231)的质粒中。lppA基因的序列如SEQ ID NO:387所示；利用该基因序列设计了合适的PCR扩增引物。然后将两侧有cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到质粒pSL0148中，然后用引物lppA-1和lppA-2对lppA基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，然后通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株中。将电穿孔细胞回收在SOC+DAP培养基中，并铺板在补充有卡那霉素(20μg/mL)和二氨基庚二酸(DAP，50μg/mL)的LB琼脂板上。使用引物lppA-3和lppA-4，通过PCR选择并筛选插入敲除片段的菌落。然后通过在42℃培养选定的卡那霉素抗性菌株并筛选氨苄青霉素抗性的丧失来处理pKD46。然后通过电穿孔表达Cre重组酶的温度敏感质粒(pJW168)处理卡那霉素抗性标记，并在30℃下选择AmpR菌落；随后通过在42℃生长培养物消除pJW168。然后使用位于破坏位点侧翼的引物(lppA-3和lppA-4)，通过PCR检测选定的lppA敲除克隆的卡那霉素标记丢丧失，并在琼脂糖凝胶上评估电泳迁移率。菌株YS1646的这种突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppA。
lppB基因的缺失
然后使用上述方法的修改在YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/lppA菌株中缺失lppB。合成合成的lppB基因同源臂序列分别含有位于lppB基因的两侧224和231个碱基的左侧和右侧序列，并将其克隆到称为pSL0148(SEQ ID NO：231)的质粒中。lppB基因的序列如SEQ ID NO:388所示；利用该基因序列设计了合适的PCR扩增引物。然后将两侧有cre/loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到质粒pSL0148中，用引物lppB-5和lppB-6对lppB基因敲除盒进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/lppA。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长来处理温度敏感质粒。分别使用称为lppA-3和lppA-4、lppB-7和lppB-8的引物通过PCR扩增lppA和lppB基因敲除序列，并通过DNA测序验证。菌株YS1646的这种突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB，或绰号为YS1646ΔlppAB。
工程化的鼠伤寒沙门氏菌脂蛋白敲除菌株的体外鉴定
YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株具有lppA和lppB缺失，通过在LB中过夜培养来评估其生长。使用M3分光光度计(Molecular Devices)在37℃下测量生长，每15分钟读取一次OD600。结果表明，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB能够以与亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株相当的生长速率在LB中复制。这些数据表明，脂蛋白的消除不会降低体外鼠伤寒沙门氏菌的适应性。
脂蛋白缺失增强了全身施用后质粒向肿瘤的递送
由于TLR2在血管内皮细胞上表达，并且TLR2的活化增强了血管通透性，因此评估了ΔlppAB以及随后TLR2激动作用的降低对肿瘤定植的影响。还评估了对有效载荷表达的影响。如下所示，在全身给药后，虽然肿瘤的定植有所减少，但质粒递送和编码的基因表达显著增加。
为了证明脂蛋白敲除菌株对小鼠三阴性乳腺癌模型的影响，为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组4只小鼠)在4th乳腺脂肪垫中原位接种EMT6细胞(100μL PBS中5×105个细胞)。给已建立10天的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射单剂量的1×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株或亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，每个菌株均含有在CMV启动子控制下编码分泌的荧光素酶蛋白(荧光素酶或/>Promega)/>的质粒。在静脉内给药后第7天，将小鼠安乐死，将肿瘤均质化并铺在LB板上，以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(CFU)的数量。亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株以每克肿瘤组织平均3.3×106CFU定植肿瘤，而脂蛋白缺失的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株的肿瘤定植为平均1.18×106CFU/g肿瘤组织，相比之下减少2倍。
为了测量质粒递送至肿瘤以及随后的异源基因表达和蛋白质分泌，测量了的活性。为此，使用/>检测试剂(Promega)评估均质化肿瘤的荧光素酶活性，并在/>M3分光光度计/发光计(MolecularDevices)上读取。虽然亲本YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株诱导的平均发光相对光单位(RLUs)为4482.6，但YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔlppAB菌株诱导的平均发光相对光单位(RLU)增加了近10倍，达到33,926.6RLU。这些数据证明了脂蛋白缺失菌株改善肿瘤定植和增强有效载荷表达的能力。
这些数据表明，虽然脂蛋白的缺失在一定程度上减少了静脉内给药后的肿瘤定植，但其显著增强了肿瘤中的质粒递送和有效载荷表达。这些数据表明，与本领域的预期这些基因的缺失将减少定植相反，脂蛋白缺失增强了肿瘤微环境和肿瘤中的质粒递送和蛋白质表达。
实施例19
沙门氏菌全部purI清洁缺失基因敲除菌株工程化和鉴定
菌株YS1646(VNP20009)中的purI基因未被缺失；其被转座子(Tn10)插入破坏，导致16.6kbp(千碱基对)基因组倒位事件，从而随后两个插入序列(IS)元件被掺入基因组中，一个位于purI(purM)基因内，另一个位于acrD基因3’端直接侧翼的基因间区域上游16.6kbp。两个IS元件之间的区域是倒置的，含有18个基因，包括yffB、DC51_2568、upp、uraA、yfgE、yfgD、DC51_2573、perM、purC等。基因间区域中的插入序列元件编码全功能转座酶，并代表潜在的遗传稳定性问题(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。在治疗性菌株中存在这样的转座酶，可能会带来遗传稳定性的问题。这些元件被从菌株中移除，以便产生用作人治疗剂的菌株。purI基因的完整基因序列的存在，通过染色体重排而被破坏，留下了恢复为野生型基因的可能性。
菌株YS1646中的msbB基因也没有完全缺失，但被基因工程化的511bp缺失(972bp基因)破坏，导致pykA基因(编码丙酮酸激酶)的延伸，用13个新密码子置换了最后5个氨基酸密码子(见例如Broadway et al.(2014)J.Biotechnology 192:177-178)。
将菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD修饰为缺失purI基因的剩余部分，以及菌株YS1646中存在的两个转座子相关的插入序列。下文显示，在完全敲除purI的情况下，所得细菌细胞与如在亲本YS1646菌株中一样其中基因通过破坏而失活的细胞相比具有更高的存活力。
A.缺失purI基因片段和转座子相关的插入序列元件
第一个区域，位于yffB和purN基因之间，含有：1)1,209bp转座子插入序列元件，在得自Broadway et.al(2014)的序列中注释为DC51_2586(见GenBank登录号CP007804和CP008745)；和2)剩余的891bp purI基因片段的740bp(本文称为大purI基因片段)，将第一个区域靶向缺失，使用经修改的Datsenko和Wanner的方法(见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))。将891bp(大)purI基因片段的一小部分151bp保持完整，以避免影响相邻的下游基因purN。将含有分别与DC51_2586插入序列元件和purI基因片段的左侧和右侧区域同源的284和262bp的质粒pSL0165转化到DH5-α感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)中。将两侧有loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到这个质粒中，所得载体被命名为pSL0174。然后将DC51_2586插入序列元件和大purI基因片段敲除盒使用引物purm-1和purm-2(分别为SEQ ID NO:419和420；见表2)进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红色重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长处理温度敏感质粒。DC51_2586插入序列元件和大purI基因片段敲除序列使用引物purm-3和purm-4(分别为SEQ ID NO:421和422；见表2)通过PCR确认，并通过DNA测序验证。将所得亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的突变衍生物命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(large clean)。
第二个区域，位于acrD和DC51_2568基因之间，含有：1)1,209bp转座子插入序列元件，在得自Broadway et.al(2014)的序列中注释为DC51_2566(见，GenBank登录号CP007804和CP008745)；以及2)剩余的231bp purI基因片段(在本文中称为小purI基因片段)，将第二个区域使用修改的Datsenko和Wanner方法靶向缺失(见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640–6645(2000))。将含有分别与DC51_2566插入序列元件和小purI基因片段的左侧和右侧区域同源的241和265bp的质粒pSL0210转化到DH5-α感受态细胞(Thermo FisherScientific)中。将两侧有loxP位点的卡那霉素基因盒克隆到该质粒中，所得载体被命名为pSL0212。然后将DC51_2566插入序列元件和小purI基因片段敲除盒使用引物acrd-1和purm-5(分别为SEQ ID NO:425和423；参见表2)进行PCR扩增，凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ红重组质粒pKD46的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(large clean)中。然后如上所述通过Cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非允许温度下生长来处理温度敏感质粒。将DC51_2566插入序列元件和小purI基因片段敲除序列使用引物purm-6和acrd-3(分别为SEQ ID NO:424和426；参见表2)通过PCR确认，并通过DNA测序验证。将所得亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(large clean)的突变衍生物命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(full clean)，或YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI。
表2：引物序列信息
Fwd＝正向；Rev＝反向；KO＝敲除
质粒信息
B.菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI显示增强的注射原液细胞活率
为了评估细菌基因组中剩余purI基因序列片段和转座子相关插入序列元件的缺失对细菌体外适应性的影响，比较了具有或不具有完全purI基因缺失(F-ΔpurI)和待相同质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的细胞存活率。
通过直接比较在培养处理冷冻的注射原液后存活的CFUs，评估了菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI(含有质粒ADN-657(pATI1.76 CMV muIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA)或质粒ADN-750(pATI2.1CMVVCIP huIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA))的细胞存活率与表达相同质粒(ADN-657和ADN-750)的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的细胞存活率。质粒ADN-657编码鼠IL-15Rα-IL-15sc和修饰的人STING嵌合体，所述嵌合体具有用袋獾STING的CTT置换人STING的CTT，以及GOF突变N154S/R284G(huSTINGN154S/R284G tazCTT)。这两个有效载荷在CMV启动子控制下聪脑包含T2A肽的双顺反子构建体中表达。所述构建体还包括一个乙肝病毒转录后调节元件(HPRE)，和一个牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bGHpA)。质粒ADN-750编码人IL-15Rα-IL-15sc和相同的修饰的人STING嵌合体，其中两个有效载荷的表达是在CMV启动子的控制下，单启动子系统是使用内源性的人IRES(内部核糖体进入点)实现的，称为血管内皮生长因子和1型胶原蛋白诱导蛋白(VCIP；SEQ ID NO:434)，置于编码这两个有效载荷的核酸的上游，以及置于两个ORF之间的T2A肽序列。
对于这个实验，用等同的OD600nm光密度(OD)值的100μl的过夜静止期培养物接种到250ml带通风盖的挡板摇瓶中的25ml 4XYT培养基中，在37℃下振荡(225RPM)温育约6小时。在等同OD600nm值收获静止期的培养物，洗涤两次，调整到OD600nm＝2，等分，并在-80℃冷冻。第二天，解冻每个菌株的两个等分试样，测量OD600nm值，并将菌株铺板在琼脂板上以确定滴度和存活率。根据OD600nm与CFU/ml的比值确定存活率％。
确定均质YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI-(ADN-657)注射原液为77％存活，而确定菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-657)注射原液为62％存活。确定菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI-(ADN-750)注射原液为72％存活，而确定菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-750)注射原液为63％存活。
这些数据表明，与亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI的适应度相似或增强。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI在冷冻注射液制备后显示出增强的存活力，表明基因组缺失不仅减少了潜在的遗传不稳定性问题，而且还提供了代谢益处，从而提高细胞存活率。
C.菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI与YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD亲本菌株相比，在肉汤培养基中表现出相似的生长特性。
为了评估缺失剩余的purI基因序列片段和转座子相关的插入序列元件对细菌菌株体外适应性的影响，比较菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI(表达质粒ADN-657(pATI1.76 CMV muIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTTHPRE bGHpA)或质粒ADN-750(pATI2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc_T2A_huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA)与菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD(表达相同质粒(ADN-657和ADN-750))之间在肉汤培养基的生长状况。将冷冻的注射原液在室温下解冻，并通过在PBS中稀释标准化为1×107CFU/mL。将10μL标准化的样品用于接种在透明的平底96孔板中300μL LB培养基(1×105CFU/孔)，一式四份进行。将该板在37℃下振荡培养，并在16小时内以15分钟的间隔监测OD600nm值。绘制OD600nm值以构建生长曲线，计算生长的对数阶段的斜率并用于确定每个菌株的倍增时间。
每个菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI-(ADN-657)、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-657)、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI-(ADN-750)和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-750)产生相当的生长概况，并在静止期达到相似的细胞密度。菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI-(ADN-657)的倍增时间为77分钟，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-657)的倍增时间为62分钟，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI-(ADN-750)的倍增时间为72分钟，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-(ADN-750)的倍增时间为63分钟。这些数据证实菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI与亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD相比相似的适应性概况。与亲本菌株相比，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI在肉汤培养基中展示略增加的倍增时间，但产生相似的生长曲线图和静止期细胞密度。
实施例20
遗传修饰的菌株在人全血和人原代巨噬细胞中减少炎症
为了评估得自施用了所述免疫刺激细菌菌株的不同变体的炎症情况，将均携带编码荧光素酶(Promega)的质粒(CMV/>)的ATCC#14028(野生型(WT)鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、YS1646、YS1646Δasd、YS1646Δasd/ΔFLG、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD、YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI和大肠杆菌菌株NEB 5-α，与人血在37℃下温育2小时。温育是在96孔形式中进行的，具有200μl血液和5×103CFU的细菌。感染后2小时，将血液在300相对离心力(rcf)下离心5分钟，分离血清，按照制造商的说明通过人抗病毒细胞因子珠阵列分析(BioLegend)进行细胞因子谱分析。
在与不同的菌株温育后，对人血液中释放的细胞因子水平的分析表明，与和WT菌株ATCC14028温育相比，与菌株YS1646的温育导致促炎症细胞因子IL-6和TNF-α的水平降低。额外的基因组修饰进一步降低了人血液中释放的促炎症细胞因子的水平。
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STDEV＝标准差
为了确定细菌如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中的基因组修饰如何影响原代人类骨髓细胞感染期间的炎症，对人M2巨噬细胞进行细菌感染。将原代人单核细胞在含有100ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCellTechnologies)中分化5天。在第6天，为细胞补充含有150ng/ml M-CSF和60ng/ml huIL-4的额外培养基48小时，以产生M2巨噬细胞。然后用静止期的细菌菌株(上述菌株)感染细胞，将其在4XYT培养基中于37℃生长过夜，MOI为10。用细菌接种细胞，并在500rcf下离心5分钟，然后在37℃温育1小时。然后将细胞用DPBS洗涤两次，然后在具有100μg/ml庆大霉素的新鲜ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基中温育。在感染后0、2、6、24和48小时收获上清液。根据制造商的说明，通过MESO尺度分析进行细胞因子的测量。
下表总结的结果显示，在感染后24小时，用YS1646、YS1646Δasd和YS1646Δasd/ΔFLG菌株感染的巨噬细胞释放最高水平的IL-6，WT菌(ATCC 14028菌株)诱导的IL-6较少。连续的基因组修饰导致IL-6的分泌水平下降，菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔcsgD和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD诱导的IL-6的水平最低。用TNF-α也观察到类似的趋势。
实施例21
csgD缺失菌株诱导人血管内皮细胞中的血管渗漏
促进血管渗漏的能力是促进细菌进入肿瘤血管及促进更大的肿瘤定植的有利特征。这个实施例示出ΔcsgD菌株具有这一特征。
将亲本菌株YS1646与衍生菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD比较其在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中激活先天免疫感应的能力，以及刺激内皮单层通透性随后增加的能力。这是用体外血管通透性检测试剂盒(Millipore，目录号ECM642)评估的。使用均含有编码分泌的(EF-1α)的质粒的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD。根据制造商的说明，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种到96孔板室中的半透性胶原蛋白包被的膜上，浓度为5×105个细胞/孔。每天监测汇合情况，直到确认内皮单层形成，并确定有效闭塞了膜孔(接种后96小时)。/>
将细菌菌株在3mL 4XYT培养基(TEKNOVA，目录号2Y1085)中在37℃在带通气孔的盖的50mL锥形瓶中摇动生长过夜至静止期，并在第二天通过造粒和重新悬浮在PBS中制备。将细菌样品通过OD600nm标准化为2.5×108CFU/mL的浓度，并以100μL的体积加入HUVEC插入孔中，以达到MOI为50。将平板在500rcf下旋转5分钟，使CFU与HUVEC同步参与，然后将板在37℃下温育1小时。然后在插入孔中加入庆大霉素至最终浓度为200μg/mL。在细菌感染后24小时，收集插入孔中的培养基(并保存用于细胞因子分析)，并加入75μL异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran；稀释度为1:40)，将混合物在室温下避光温育20分钟。收集来自接收盘的培养基，在分光光度计上进行分析，激发波长为485nm，吸光波长为535nm，并直接运行1:40的FITC-Dextran溶液作为阳性对照。
在细菌感染后24小时，及用FITC-Dextran溶液温育后，没有用工程化的减弱的鼠伤寒沙门氏菌菌株处理的孔(即单独培养基处理)产生非常低的荧光值(35)，表明汇合及很小的渗透性破坏。亲本YS1646处理的孔允许最大量的FITC-Dextran通过膜(荧光＝155)，表明最强的先天免疫刺激和血管通透性的增加，而工程化的减弱的鼠伤寒沙门氏菌菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP和YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD允许较少的FITC-Dextran通过(荧光值分别为＝84和91)，但仍然保持促进血管通透性的能力。
为了测试这种效果是否依赖于HUVEC释放的细胞因子、特别是IL-6，根据制造商的说明在感染后6小时对HUVEC上清液进行人抗病毒细胞因子珠子阵列分析(BioLegend)。与未感染的对照组(27.19pg/mL)相比，亲代YS1646株感染的HUVEC表现出非常高的IL-6水平(1769.2pg/mL)。YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株诱导较低水平的IL-6(543.3pg/mL)，而观测到YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的IL-6量最低(272.8pg/mL)。因此，尽管产生较低水平的诱导血管渗漏的促炎细胞因子，但YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株表现出比YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP菌株更高的渗漏水平。因此，促进血管渗漏的能力是促进细菌进入肿瘤血管的一个重要特征，也是促进更大的肿瘤定植的重要特征。本文描述和提供的菌株具有这一特征。
实施例22
STING功能获得变体表明原代人M2巨噬细胞中CXCL10(IP-10)与IL-6的比率增加及IFN-β与IL-6的比率增加
为了确定各种STING功能获得(GOF)突变体(包括具有GOF突变的嵌合STING蛋白)，对人M2巨噬细胞下游细胞因子信号传导的影响，将GOF突变体克隆到上文实施例8所述的pATI-1.75(也称为pATI1.75)载体中，然后将其转染到人M2巨噬细胞中进行表达，并测定细胞上清液的分泌(表达)的细胞因子。
将分离自健康人供体的冷冻人单核细胞在完全培养基(RPMI-1640+10％ FBS)中解冻，并在室温下以600×g离心10分钟进行洗涤。将单核细胞重悬于含有100ng/mL人M-CSF+20ng/mL人IL-4+20ng/mL人IL-10的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCellTechnologies)中。然后将单核细胞(每孔8e5至1e6个细胞)接种在24孔板中，最终体积为750μL。三天后，向每孔加入750μL含有100ng/mL人M-CSF+20ng/mL人IL-4+20ng/mL人IL-10的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCell Technologies)，并将该板再温育四天。在第七天，根据制造商的说明，使用RED mRNA和质粒转染试剂(Lipocalyx GmbH)对细胞进行转染。将来自STING GOF突变体以及未转染对照的500ng质粒DNA在提供的缓冲液中稀释，并与/>RED转染试剂混合，在室温下温育15分钟以使/>RED复合物形成。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入到24孔板的每个孔中(一式三份)，并在37℃的5％二氧化碳培养箱中温育该板。温育48小时后收获上清液，根据制造商的方案使用基于流式细胞术的人抗病毒细胞因子珠阵列(BioLegend)检测人CXCL10(IP-10)和IL-6。计算三次测量的平均值，并通过将IP-10浓度除以IL-6浓度来计算IP-10与IL-6的比率。
下表总结的结果显示，导致IP-10与IL-6比率最高的STING变体是huSTING N154S/R284G tazCTT变体(即嵌合STING蛋白，含有其CTT用袋獾STING的CTT置换的修饰的人STING，以及GOF突变N154S/R284G)。含有用袋獾STING的CTT置换人STING的CTT的STING变体(huSTING tazCTT)，显示出比具有相同突变的相应全长人STING变体更高的IP-10和IL-6比率，因此表明改良的抗肿瘤应答。
用编码STING变体的质粒转染M2巨噬细胞后IP-10与IL-6蛋白表达的比率
评估人M2巨噬细胞在表达各种STING变体后，IFN-β与IL-6基因表达的比率。将分离自健康人供体的冷冻人单核细胞在完全培养基(RPMI-1640+10％FBS)中解冻，并在室温下以600×g离心10分钟进行洗涤。将单核细胞重新悬浮在RPMI-1640+1X非必需氨基酸(NEAA)+5％人AB血清中，其中含有200ng/mL人M-CSF+20ng/mL人IL-4。然后将单核细胞(每孔8e5至1e6个细胞)接种于24孔板，最终体积为750μL。三天后，在每个孔中加入750μL含有5％人AB血清+NEAA的RPMI，其中含有200ng/mL人M-CSF+20ng/mL人IL-4，并将该板再温育四天。在第七天，根据制造商的说明，使用RED转染试剂对细胞进行转染。将来自一组STING GOF突变体(包括修饰的嵌合STING蛋白)以及未转染对照的500ng质粒DNA在提供的缓冲液中稀释，并与/>RED转染试剂混合，在室温下温育15分钟，使DNA//>RED复合物形成。作为阳性对照，将STING激动剂3’5’RpRp c-di-AMP(InvivoGen)，一种临床化合物ADU-S100的类似物，以10μg/mL的浓度加入细胞中。然后将DNA//>RED复合物缓慢地加入24孔板的每个孔中(一式三份)，并将板在37℃在CO2培养箱中温育48小时。
转染后48小时收获细胞进行qPCR，用350μL含β-巯基乙醇的Buffer RLT裂解缓冲液(Qiagen)裂解。使用QiagenPlus Mini Kit进行RNA提取，并作如下修改。使用RNase-Free DNase试剂盒(Qiagen)，在该试剂盒中包括消除基因组DNA的步骤，以从总RNA中去除基因组DNA。使用NanoDropTMOneC紫外光-可见分光光度计(Thermo FisherScientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也通过A260/A230吸收比来评估。在进行逆转录之前，将RNA被储存在-80℃，无需冻融。
根据制造商的说明，用CFX96TM实时系统(Bio-Rad)和iScriptTMReverseTranscription Supermix for RT-qPCR(Bio-Rad)在20μL的反应中从0.5-1μg模板RNA进行cDNA合成。使用CFX96TM实时系统(Bio-Rad)进行qPCR。人IFNβ1(huIFNβ1；Assay ID：qHsaCEP0054112；Bio-Rad)和huIL-6(Assay ID：qHsaCEP0051939；Bio-Rad)的引物被用于qPCR。按照制造商方案使用SsoAdvancedTMUniversalGreen Supermix或iQTMMultiplex Powermix(Bio-Rad)进行qPCR反应(20μL)。Bio-Rad CFX96TM实时系统的标准热循环程序包括95℃变性150秒，然后是95℃进行15秒和60℃进行55秒的39个循环。靶mRNA的定量使用肌动蛋白参考mRNA(Bio-Rad公司，Assay ID：qHsaCEP0036280)进行标准化。ΔCq被计算为靶(huIFNβ或huIL-6)和参考(肌动蛋白)基因之间的差异。ΔΔCq是通过将处理(转染)的ΔCq值与非处理(即未转染)对照的ΔCq值进行标准化获得的。IFNβΔΔCq与IL-6ΔΔCq的比率显示在下面的表中。
下表总结的结果显示，在所有被筛选的STING GOF突变体中，huSTING N154S/R284G tazCTT变体导致免疫刺激性IFN-β与促炎IL-6表达的比率最高。此外，含有用袋獾STING的CTT置换人STING的CTT的嵌合STING构建体(如huSTING tazCTT)，通常比包含相同GOF突变的相应全长人STING构建体诱导更高的IFN-β与IL-6表达比率。
IFN-β表达的增加表明IRF3/I型IFN信号传导的增加，这是免疫刺激性和有益的，而IL-6表达的减少表明NF-κB信号传导的减少，这是促炎且无助于抗肿瘤应答。较高的IFN-β与IL-6表达的比率表示抗肿瘤/抗病毒型应答增加，而促炎应答减少。因此，STING蛋白中的CTT置换以及功能获得突变，增加了STING蛋白及因此免疫刺激细菌的抗肿瘤活性。
用STING变体转染M2巨噬细胞后IFN-β与IL-6基因表达的比率
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实施例23
IL-15受体-α和IL-15单链融合蛋白的设计
制备含有人蛋白或小鼠蛋白的融合蛋白。小鼠蛋白用于小鼠模型；人蛋白用于在免疫刺激细菌中编码以用作人治疗剂。
如下所述设计与人IL-15单链(sc)融合的人IL-15受体-α(IL-15Rα)。将对应于IL-15-Rα的前导序列和sushi结构域的人IL-15Rα(SEQ ID NO:401)氨基酸残基1-108(加上IL-15Rα的另外13个残基，见例如Bouchaud et al.(2008)J.Mol.Biol.382(1):1–12)符合读框地加入Gly-Ser接头，该接头具有四个重复序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即(GGGGS)4)。在接头之后加入对应于完全成熟的人IL-15sc的多肽序列，不含前导序列或前肽，并对应于SEQID NO:403的氨基酸残基48-162。得到的人IL-15Rα-IL-15sc融合蛋白(SEQ ID NO:404)的序列如下：
其中对应于人IL-15Rα的残基1-108的残基用下划线表示；Gly-Ser连接体用粗体字表示；对应于人IL-15的残基48-162的残基以双下划线表示。
相似地，通过将小鼠IL-15受体-α(IL-15Rα)蛋白的一部分与小鼠IL-15单链(sc)蛋白的一部分融合，制备小鼠IL-15Rα-IL-15sc融合蛋白(SEQ ID NO:407)。小鼠IL-15Rα(SEQ ID NO:405)的1-132个氨基酸残基，其中包括IL-15-Rα的前导序列和sushi结构，为其符合读框地加入一个(GGGGS)4接头。在接头之后加入对应于完全成熟的小鼠IL-15sc的多肽序列，其不含前导序列或前肽，并对应于SEQ ID NO:406的49-162个氨基酸残基。所得小鼠IL-15Rα--IL-15sc融合蛋白(SEQ ID NO:407)用于小鼠模型实验，其序列如下：
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其中对应于鼠IL-15Rα的残基1-132的残基以下划线示出；Gly-Ser连接体以粗体字示出；对应于鼠IL-15的残基49-162的残基以双下划线示出。
实施例24
IL-15Rα-IL-15sc在结直肠癌小鼠模型中诱发治愈疗效和保护作用免于肿瘤的再次挑战
这个实施例证实编码IL-15Rα-IL15sc融合蛋白(在此也称为IL-15/IL-15R alpha链复合体、IL-15/IL-15Rα链复合体和IL-15/IL-15Rα)的免疫刺激细菌作为单项治疗诱发了抗肿瘤的功效。为了证实这一点，制备了含有编码小鼠IL-15Rα-IL15sc(muIL-15Rα-IL15sc)的质粒的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株。将含有编码muIL-15Rα-IL15sc的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株(即YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL15sc；小鼠IL-15Rα-IL15sc用于在小鼠模型进行实验)与PBS对照比较了在皮下(SC)注射侧翼MC38结直肠腺癌模型的安全性和疗效。对于这项研究中，为6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组5只)用MC38细胞(5×105个细胞，100μL PBS)在右腹接种。在第8天，为已建立侧翼肿瘤的小鼠静脉(IV)注射2×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL15sc菌株或PBS载体对照为静脉注射。每周记录两次肿瘤测量和体重。
结果示出，在单次静脉注射后YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL15sc菌株表现出50％的治愈率(4/8相对于PBS组的0/8，p＝0.005，第21天)。在肿瘤植入后66天(静脉注射后第57天)，为治愈的小鼠(N＝4)在另一侧重新植入5×105个MC38细胞，并与未经实验的年龄匹配的小鼠(N＝5)比较肿瘤生长情况。在再次植入后的第30天，用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL15sc菌株治愈组的所有小鼠仍然没有肿瘤，而未经实验组的所有小鼠都达到了最大肿瘤体积。这些数据表明，通过免疫刺激细菌如YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD-muIL-15Rα-IL15s菌株)递送IL-15Rα-IL15sc融合蛋白的强大和治愈疗效，并证明在结直肠癌模型中诱导了持久的保护性免疫记忆。
实施例25
与抗CTLA-4scFv相比，抗CTLA-4scFv-Fc显示出对CD80/CTLA-4和CD86/CTLA-4相互作用的卓越阻断作用
使用伊匹单抗(ipilimumab)的氨基酸序列设计特异于人CTLA-4的scFv-Fc(核酸和蛋白质序列分别见SEQ ID NO:427和428)。伊匹单抗是一种全人IgG1κ单克隆抗体，特异性结合人CTLA-4(见例如美国专利公开号2002/0086014和美国专利号6,984,720中称作抗体10D1的抗体)，阻断CTLA-4的与CD80(也称为B7.1或B7-1)和CD86(也称为B7.2或B7-2)的免疫抑制相互作用。
为了产生伊匹单抗scFv抗体片段(见SEQ ID NO:429)，将伊匹单抗的可变轻链(VL)和可变重链(VH)与长度为20个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸(GS)接头((GGGGS)4)连接。为了产生scFv-Fc抗体片段(见SEQ ID NO:428)，将伊匹单抗scFv的可变重链与人IgG1 Fc连接，其中铰链区的游离半胱氨酸突变为丝氨酸(在SEQ ID NO:428的第272位)。前导序列(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；对应于SEQ ID NO:428中的残基1-20)衍生自人免疫球蛋白κ可变3-20(IGKV3-20)蛋白的序列。将序列使用GenScrip GenSmartTM密码子优化工具进行密码子优化。
将抗CTLA-4scFv-Fc的中和能力与抗CTLA-4scFv(缺乏人IgG1 Fc部分)的中和能力进行比较，使用竞争性ELISA来测量每个抗体片段阻断CTLA-4与其配体CD80和CD86之间相互作用的能力。使用转染试剂(Promega)，以适当的试剂:DNA比率用3微克编码抗CTLA-4scFv-Fc或抗CTLA-4scFv抗体片段构建体的DNA转染HEK293T细胞。转染后48小时，收获无HEK293T细胞培养上清液，过滤，并用于竞争性ELISA以评估抗CTLA-4抗体片段的阻断活性。
对于竞争性ELISA，将小鼠CD80或CD86重组蛋白(R&D Systems)在4℃以100ng/ml的浓度在高蛋白结合的96孔板上包被过夜。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤一次，并用ELISA阻断缓冲液在室温下将孔阻断1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤一次。将含有每个抗CTLA-4抗体片段的HEK293T细胞培养上清液与10ng/ml的重组鼠CTLA-4-人IgG1 Fc嵌合体(R&D Systems)混合，并加入孔中，在室温下温育2小时。然后将孔用PBS0.05％ Tween-20洗涤三次，在孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG1抗体(Jackson ImmunoResearch)，并在室温下温育一小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤三次，并在孔中加入检测试剂(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，Thermo FisherScientific)。用硫酸(BioLegend)停止酶促反应，并在450nm处读取光密度。
竞争性ELISA的结果总结在下面的表格中。抗CTLA-4scFv-Fc阻断CTLA-4与CD86的结合达75.5％，阻断CTLA-4与CD80的结合达40.6％；而抗CTLA-4scFv阻断CTLA-4与CD86的结合达32.5％，阻断CTLA-4与CD80的结合达7％。与CD80/CTLA-4阻断活性相比，所述两种抗体片段都具有更高的CD86/CTLA-4阻断活性，当与抗CTLA-4scFv-Fc相比，抗CTLA-4scFv-Fc具有更好的中和活性。
竞争性ELISA结果
抗-CTLA-4抗体片段 ％CD86阻断活性 ％CD80阻断活性
抗-CTLA-4scFv 32.5 7.0
抗-CTLA-4scFv-Fc 75.5 40.6
如上文关于相应的人抗CTLA-4抗体片段所述，也制备了来自9D9克隆的抗鼠CTLA-4scFv(SEQ ID NO:430)和抗鼠CTLA-4scFv-Fc(SEQ ID NO：431)。所述scFv含有IgK小鼠前导序列，以及来自克隆9D9的VL和VH结构域，通过(Gly4Ser)3接头连接。所述scFv-Fc还含有与VH结构域连接的小鼠IgG2a Fc。
在本文提供的免疫刺激细菌包括在质粒上编码的抗CTLA-4抗体及其片段的那些细菌，包括本文提供的抗CTLA-4scFv抗体片段和抗CTLA-4scFv-Fc抗体片段，以及与编码其它治疗产物的核酸分子的组合。
实施例26
用于编码的治疗产物的高水平多重表达的优化的表达盒
被称为内部核糖体进入点(IRES)的元件可以通过模拟5’mRNA帽来加强核糖体的结合和稳定mRNA，从而促进蛋白质翻译。来自病毒和哺乳动物细胞的IRES元件是众所周知的。其中，被称为血管内皮生长因子和1型胶原蛋白诱导蛋白(VCIP)的一种内源性人IRES，以前被证明增强从编码萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的双顺反子载体的表达，其中海肾荧光素酶是下游基因(即在VCIP IRES之后编码)，在体外和体内表达而不需要第二个启动子(见例如Licursi et al.(2011)Gene Therapy18(6):631-636)。
含有人或小鼠IL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT、或人或小鼠IL-15Rα-IL-15sc、huSTING N154S/R284G tazCTT和抗CTLA-4scFv-Fc组合的质粒，其中所述双顺反子和多顺反子构建体含有2A肽，对所述质粒检测每个编码的有效载荷/产物针对单一表达对照的表达情况。此外，还检测了含有VCIP IRES的组合构建体。
使用HEK293T STING裸细胞(293-DualTM Null Cells；InvivoGen)，其不包含内源性STING，并表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激应答元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列通过敲入技术被SEAP ORF置换。因此，可以通过监测IFN诱导的SEAP的产生来评估STING活性。293-DualTM裸细胞还表达LuciaTM荧光素酶，这是一种分泌的荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制下；IFN-β的编码序列通过敲入技术已被LuciaTM荧光素酶ORF置换。这样可以通过监测IFN-β的表达来评估STING的活性。使用这些细胞，可以通过监测ISRE诱导的SEAP产生和/或IFN-β依赖的LuciaTM荧光素酶的表达来评估STING活性。SEAP和LuciaTM荧光素酶这两种报告蛋白可以分别使用标准的检测方法和检测试剂如QUANTI-BlueTM和QUANTI LucTM检测试剂(InvivoGen)在细胞上清液中进行测量。
将细胞以每孔200,000个细胞接种在聚-L-赖氨酸包被的24孔板中，并在37℃在5％二氧化碳培养箱中温育过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将300ng的每个质粒DNA和40ng的CMV-GFP载体(即在CMV启动子控制下编码绿色荧光蛋白的载体)在无血清培养基中稀释并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。转染后48小时，收集每个样品的细胞培养上清液。
使用ISRE-SEAP和IFN-β-LuciaTM报告系统评估huSTING N154S/R284G tazCTT变体的STING活性。I型干扰素(IFN)活性(由STING诱导)通过监测细胞上清液中I型IFN刺激的SEAP的产生来评估。将20μL的细胞培养上清液加入180μL的QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)中，用于测量SEAP。通过在M3分光光度计(Molecular Devices)上测量ISRE诱导的SEAP活性来确定I型干扰素的激活，吸光波长为650nm。I型干扰素(IFN)活性(由STING诱导)也通过监测细胞上清液中I型IFN刺激的LuciaTM荧光素酶的产生来评估。将20μL的细胞培养上清液加入50μL的QUANTI-LucTM试剂(InvivoGen)中，用于测量LuciaTM荧光素酶活性。通过在/>M3分光光度计(Molecular Devices)上在发光设置下测量IFNβ诱导的LuciaTM荧光素酶活性来确定I型干扰素的激活。
还评估了细胞培养上清液中人或小鼠IL-15Rα-IL-15sc的表达(见实施例23)，以及人或小鼠抗CTLA-4scFv-Fc的表达(见实施例25)。对于muIL-15Rα-IL-15sc构建体，根据试剂盒说明使用小鼠IL-15Rα-IL-15sc ELISA(R&D)。对于huIL-15Rα-IL-15sc构建体，根据试剂盒的说明使用人IL-15Rα-IL-15sc ELISA(R&D)。对用编码抗人CTLA-4scFv-Fc和抗鼠CTLA-4scFv-Fc的质粒转染的细胞的细胞培养上清液，用人和鼠CTLA-4-Fc(R&D Systems)进行直接ELISA，以测量这些蛋白的表达水平。
通过流式细胞术检测GFP的产生，并用于将彼此的转染进行标准化。转染后48小时，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在具有DAPI(死/活染色)的PBS+2％ FBS中。使用ACEA流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如下表所示，所有含有huSTING N154S/R284G tazCTT变体的构建体都显示了ISRE-SEAP报告活性和IFNβ-LuciaTM荧光素酶报告活性。称作2.1CMV VCIP muIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT的构建体，含有VCIP IRES和T2A肽，用于表达muIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的组合，当通过GFP共转染标准化后获得最高的muIL-15Rα-IL-15sc表达水平。相似地，称作2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15scT2A huSTING N154S/R284G tazCTT的构建体，含有VCIP IRES和T2A肽，用于表达huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的组合，在通过GFP共转染标准化后获得最高的huIL-15Rα-IL-15sc表达水平。当通过GFP共转染标准化后，称作1.76CMV mu抗CTLA-4scFv-Fc的构建体导致小鼠抗CTLA-4scFv-Fc的最高表达水平，称作1.76CMV hu抗CTLA-4scFv-Fc的构建体导致人抗CTLA-4scFv-Fc的最高表达水平。
在HEK293T STING裸细胞中测量STING活性、IL-15Rα-IL-15c浓度和抗CTLA-4scFv-Fc浓度，通过GFP共转染标准化。
/>
SD＝标准差
*NA＝不适用
实施例27
编码huIL-15Rα-IL-15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT组合的表达质粒
为了鉴定具有最高huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT表达的质粒，克隆含有编码huIL-15Rα-IL-15sc和/或huSTING N154S/R284G tazCTT的核酸分子的质粒，其具有不同的2A肽(如T2A或P2A)和/或不同的转录后调节元件(如HPRE或WPRE)和/或不同的转录后调控元件(如HPRE或WPRE)和/或不同的poly(A)尾区(如牛生长激素poly(A)(bGHpA)或猿猴病毒40poly(A)(SV40pA))，和/或含有VCIP IRES。此外，在一些构建体中，包括RKR和RAKR及全体不同长度的间隔序列的短肽间隔序列，编码在编码第一个有效载荷(即huIL-15Rα-IL-15sc)的核酸之后，及在编码2A肽的核酸之前。RRKR和RAKR是设计的呋喃蛋白酶裂解位点，置于这个位置是为了便于对2A肽序列进行适当处理。首先通过在HEK293TSTING裸细胞(ISG/KI-IFNβ)细胞(InvivoGen)中转染来评估质粒的表达和功能。
使用HEK293T STING裸细胞(293-DualTM裸细胞(ISG-SEAP/KI-[IFN-β]Lucia；InvivoGen)，其不包含内源性STING，并表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激应答元件(ISRE)启动子的控制下，其中ISRE的编码序列通过敲入技术被SEAP ORF置换。如上所述，293-DualTM裸细胞还表达LuciaTM荧光素酶，这是一种分泌的荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制下，其中IFN-β的编码序列通过敲入技术被LuciaTM荧光素酶ORF置换。将细胞接种在聚-L-赖氨酸包被的24孔板中，每孔200,000个细胞，在37℃在5％二氧化碳培养箱中温育过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将300ng的每个质粒DNA和40ng的CMV-GFP载体在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA的比例加入转染试剂(Promega)，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。转染后48小时，收集每个样品的细胞培养上清液进行分析。
用HEK293T STING Null(ISG-SEAP/KI-[IFN-β]Lucia)报告细胞系(InvivoGen)评估了huSTING N154S/R284G tazCTT修饰的STING蛋白的STING活性。使用这些细胞，通过监测细胞上清液中I型IFN刺激的LuciaTM荧光素酶的产生来评估I型干扰素(IFN)活性(由STING诱导的活性)。IFNβ的诱导是用IFNβ-Lucia报告系统测量的。将20μL的细胞培养上清液加入50μL的QUANTI-LucTM试剂(InvivoGen)中，用于测量LuciaTM荧光素酶的活性。通过在M3分光光度计(Molecular Devices)上在发光设置下测量IFNβ诱导的LuciaTM荧光素酶活性来确定I型干扰素的激活。根据试剂盒说明，用ELISA(R&D)评估细胞培养上清液中人IL-15Rα-IL-15sc的表达。
通过流式细胞术检测GFP，并将GFP的表达水平(通过荧光测量)用于标准化彼此的转染。转染后48小时，通过在1300RPM离心3分钟，将细胞用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在具有DAPI(死/活染色)的PBS+2％ FBS中。使用ACEA流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如以下两表所示，从IFNβ-LuciaTM报告系统中，称作2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA的质粒构建体获得最高的标准化发光值(见下文第一个表)，而且通过ELISA测定表达的huIL-15Rα-IL-15sc的最高标准化浓度(见下文第二个表)。
如下文第一个表所示，如预期的那样，只编码huIL-15Rα-IL-15sc(而没有STING变体)的构建体没有表现出STING诱导的I型IFN活性。仅编码huSTING N154S/R284G tazCTT的构建体表现出高水平的STING诱导的I型IFN活性。对于编码这两种有效载荷的构建体，与T2A和P2A与HPRE的组合或T2A与WPRE的组合相比，P2A肽与WPRE的组合导致了更高的STING活性水平(即更高的STING表达水平)。此外，含有bGH poly(A)尾区的构建体比含有SV40poly(A)尾区的构建体的STING活性水平更高。加入短肽间隔序列如RAKR或RKR，与不含这些间隔序列的相同构建体相比，STING的活性水平略有提高。在某些构建体中，如称作2.1CMVVCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA、2.1CMV VCIPhuIL-15Rα-IL-15sc P2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA、2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT WPRE bGHpA、2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT WPRE SV40pA和2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc RAKR-T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA的构建体，与不含VCIP IRES的相同构建体相比，加入VCIP IRES增加STING的活性水平。
如下文第二个表所示，含有bGH poly(A)尾去的构建体的huIL-15Rα-IL-15sc的表达水平高于SV40 poly(A)尾巴的构建体，一般来说，含有WPRE的构建体导致huIL-15Rα-IL-15sc的表达水平高于含有HPRE的相同构建体。在编码CMV huIL-15Rα-IL-15sc T2AhuSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA的构建体中，在编码huIL-15Rα-IL-15sc的核酸序列之后加入RAKR短肽间隔序列，可提高huIL-15Rα-IL-15sc的表达水平。在所有构建体中，除了被称作2.1CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc P2A huSTING N154S/R284G tazCTTHPRE SV40pA的构建体外，在构建体上游加入VCIP IRES(除了2A肽外)，导致huIL-15Rα-IL-15sc的表达明显提高。例如在称作1.76CMV huIL-15Rα-IL-15sc VCIP huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA的构建体中，用VCIP IRES置换2A肽，导致相似的huIL-15Rα-IL-15sc表达水平。例如在称作1.76CMV huIL-15Rα-IL-15sc Longer spacer VCIP huSTINGN154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA的构建体中，用VCIP IRES置换2A肽，并在编码huIL-15Rα-IL-15sc的核酸与VCIP IRES之间加入较长的间隔序列，导致huIL-15Rα-IL-15sc的表达水平显著提高。构建体中的间隔序列是置于第一个ORF的终止密码子和第二个ORF上游的VCIP IRES之间的核酸序列。例如，在下表中称作“新间隔序列”的间隔序列具有序列ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC(SEQ ID NO:408)，在下表中称作“较长间隔序列”的间隔序列具有序列TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC(SEQ ID NO:409)。
这些结果表明，加入VCIP IRES通常会增加双顺反子构建体上编码的第一个有效载荷的表达水平，并在某些构建体中增加第二个有效载荷的表达水平。
在转染的HEK293T STING裸细胞中，通过IFNβ-LuciaTM报告系统的发光水平测量的STING诱导的I型IFN活性，并通过GFP共转染标准化。
SD＝标准差
*新间隔序列＝ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
**较长间隔序列＝TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
在转染的HEK293T STING裸细胞中，通过ELISA测量表达的huIL-15Rα-IL-15sc的浓度，并通过GFP共转染标准化。
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*新间隔序列＝ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
**较长间隔序列＝TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCT CGTGAAATAAAAGTGC
确定了不同的huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT构建体在人M2巨噬细胞中诱导的下游IFN-β信号的差异。将编码huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的核酸克隆到载体中，有或没有VCIP IRES，置于在huIL-15Rα-IL-15sc或huSTING N154S/R284G tazCTT编码序列的起始密码子之前。
将分离自健康人供体的冷冻人单核细胞在完全培养基(RPMI-1640+10％ FBS)中解冻，并在室温下以600xg离心10分钟进行洗涤。将单核细胞重新悬浮在含有100ng/mL人M-CSF的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCell Technologies)中。然后将单核细胞(每孔5e5个细胞)接种在24孔板中，最终体积为500μL。五天后，向每孔加入250μLImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCell Technologies)，其中含有300ng/mL人M-CSF+60ng/mL人IL-4+60ng/mL人IL-10，并将细胞再温育2天。在第7天，根据制造商的说明，使用RED mRNA和质粒转染试剂对细胞进行转染。将来自一组不同质粒构建体的750ng质粒DNA以及“无DNA”对照(编码/>)在提供的缓冲液中稀释，并与/>RED转染试剂混合，将混合物在室温下温育15分钟以使DNA//>RED复合物形成。然后将DNA/RED复合物缓慢加入到24孔板的每个孔中(一式三份)，并将该板在37℃在5％二氧化碳培养箱中温育。在48小时时收获细胞培养上清液，并根据制造商的方案使用人细胞因子板U-plex测定(Meso Scale Discovery)对IFN-β进行测定。计算三次测量的平均值，并减去无DNA对照的背景信号，以计算净IFN-β表达水平。
下表总结的结果显示，仅编码huIL-15Rα-IL-15sc(而没有STING)的构建体在转染的人M2巨噬细胞中不诱导任何IFN-β的表达。在转染的人M2巨噬细胞中导致最高IFN-β表达水平的构建体是称作pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284GtazCTT HPRE bGHpA的构建体。这种构建体(称作pATI2.1 CMV VCIP huIL-15Rα-IL-15scT2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA)导致IFN-β表达水平高于具有pATI1.76主链的构建体，后者完全没有VCIP IRES，或在huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284GtazCTT的ORF之间有一个VCIP IRES(即其中VCIP IRES置换了2A序列)。称作pATI2.1 CMVVCIP huIL-15Rα-IL-15sc T2A huSTING N154S/R284G tazCTT HPRE bGHpA的构建体与含有P2A序列而不是T2A序列的相应构建体相比导致较高的IFN-β信号。这些结果表明，含有在两个ORF上游的VCIP IRES和在两个ORF之间的2A序列(特别是T2A)的双顺反子构建体，导致第二个编码的有效载荷(在这种情况下是修饰的STING蛋白)的更高表达水平。
用各种构建物转染人M2巨噬细胞后IFN-β蛋白表达的净信号
*新间隔序列＝ACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCTCGTGAAATAAAAGTGC
**较长间隔序列＝TCCGAGCCAAGTAAGGAGGTCCCTCTCTCTCTCTCCCCCCACGTCTTCTCTTTTTAAAGGACCT CGTGAAATAAAAGTGC
实施例28
表达磷脂酶D作为改善质粒递送的方法
作为其发病机制的一部分，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型鼠伤寒沙门氏菌(Typhimurium)被骨髓细胞吞噬，并激活一个毒力程序以将吞噬体改变为含沙门氏菌的空泡(SCV)。虽然在质粒上编码的基因的异位表达需要质粒从SCV转位到细胞核，但这种转位事件的机制尚不清楚。这个实施例提供了一种工程化方法来改善工程化的免疫刺激细菌的质粒转移。
普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)是一种革兰氏阴性的细胞内病原体，其必须逃出吞噬体区以进入宿主胞质并复制。先前的工作表明，可以将分泌的普氏立克次体(R.prowazekii)毒力因子磷脂酶D(Pld)克隆到肠沙门氏菌(S.enterica)中，以促进从SCV中逃逸(见例如Whitworth et al.(2005)Infection and Immunity 73(10):6668-6673)。编码Pld(SEQ ID NO:432)的pld基因被置于ssaG启动子的控制下，其在SCV中被诱导(见例如Walthers et al.(2007)Molecular Microbiology 65(2):477-493)，以确保细菌被递送至吞噬细胞后高表达。将这种细菌表达盒克隆到称作CMV-和EF1α-/>的两个/>报告质粒的主链上，并在人巨噬细胞中评估质粒的递送。
为了测量质粒进入感染的细胞的情况，将原代人单核细胞在含有100ng/ml GM-CSF的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基(StemCell Technologies)中分化5天。在第6天，为这些细胞补充含有150ng/ml GM-CSF和60ng/ml升huIL-4的额外培养基48小时。然后用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD细菌的静止期菌株对细胞进行细菌感染，所述菌株包含CMV-、CMV-/>+pld、EF1α-/>或EF1α-/>+pld质粒之一。将细菌菌株在4XYT培养基中于37℃生长过夜，MOI(感染倍率)为100。将感染的细胞在500rcf下离心5分钟，然后在37℃下温育1小时，之后用DPBS洗涤三次，并在含有100μg/ml庆大霉素的新鲜ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基中温育以消除任何细胞外细菌。感染后24小时和48小时，收获细胞上清液，用荧光素酶测定(Promega)测量/>荧光素酶含量。将细胞用在PBS中的0.1％的Triton×裂解并铺板，以统计留在细胞内的菌落形成单位(CFU)的数量。
下表总结的结果显示，当置于CMV启动子的控制下时，在感染后24小时从pld编码组(即CMV-荧光素酶+pld质粒)表达的/>的水平大于从单独CMV-荧光素酶质粒表达的/>的水平；这一差异在感染后48小时扩大。
当被置于EF-1α启动子的控制下时，用编码pld的工程化免疫刺激菌对细胞进行细菌感染也会导致发光水平高于没有pld的相应感染。这一效果低于在有CMV启动子的组中观察到的效果，表明一些pld的表达因CMV启动子的渗漏而得到加强。
用含有编码Pld质粒的细菌菌株与不含编码Pld的质粒的细菌菌株感染的人巨噬细胞上清液中荧光素酶的表达水平的比较
hpi＝感染后小时数；SD＝标准差；RLUs＝相对光单位
结果还显示，在感染后24小时和48小时，留在细胞内的CMV-+pld编码菌株的CFU数量，比单独携带CMV-/>荧光素酶质粒的细菌CFU数量减少的速度更快，表明在同一个细胞内每个菌株的命运不同。
在不同时间点保留在细胞内的CFU
为了确定在细菌质粒中编码磷脂酶D是否能增强在同一质粒上编码的免疫调节有效载荷的递送，用含有有或无编码pld的核酸的质粒的细菌菌株感染RAW-DualTMTLR4-KO细胞(其表达STING；InvivoGen)。RAW-DualTMTLR4-KO在干扰素刺激应答元件(ISRE)的控制下编码LuciaTM荧光素酶报告蛋白。将细胞在DMEM+10％ FBS中培养，接种到孔中并允许粘附过夜。如上所述，使用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株进行细菌感染，所述菌株含有在ssaG启动子控制下编码huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的质粒，有或没有编码pld的核酸。未感染的细胞和用5μg/ml的STING激动剂3’5’RpRp c-di-AMP处理的未感染的细胞分别作为阴性和阳性对照。感染后48小时，收获细胞上清液，用荧光素酶测定(Promega)测量表达的LuciaTM荧光素酶的水平。
下表显示的结果表明，当pld在感染期间从也编码人IL-15Rα-IL-15sc和STING突变体多肽的质粒中表达时，ISRE活性(通过LuciaTM荧光素酶表达测量)高于不存在pld表达时。ISRE活性是衡量STING诱导的I型IFN活性的指标，因此指示编码STING变体的质粒的递送以及细胞中STING变体的表达。因此，磷脂酶D(pld)的表达增强了也编码免疫调节有效载荷的质粒的递送。
pld表达对通过免疫刺激细菌递送编码免疫调节有效载荷组合的质粒的影响
STDEV＝标准差
实施例29
小鼠IL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的组合及其与小鼠抗CTLA-4scFv-Fc的组合，诱导骨髓细胞分泌CXCL10并诱导T细胞的激活
评估了免疫调节有效载荷及其组合的表达对T细胞和骨髓细胞的激活和功能的影响。这个实施例描述并证实了通过本文提供的免疫刺激细菌递送各种免疫调节有效载荷组合对抗原特异性T细胞的激活(就CD25表达和IFN-γ分泌而言)的影响，以及对骨髓细胞分泌CXCL10(一种参与抗肿瘤T细胞募集的关键趋化因子)的影响。测量分泌的细胞因子如IFN-γ、IFN-β和CXCL10(IP-10)的水平作为保护性抗肿瘤免疫的相关因素，并监测CD25细胞表面表达作为T细胞激活的标志物。这是通过用编码各种有效载荷组合的质粒转染小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，将转染的树突状细胞与自体小鼠T细胞共培养，然后鉴定所产生的细胞因子来评估的。
编码免疫调节有效载荷/蛋白质的质粒包括编码单一有效载荷的那些质粒，以及编码有效载荷组合的那些质粒。例如，如下表所示，编码的有效载荷包括小鼠(mu)IL-15Rα-IL-15sc(也被称为IL-15/IL-15Rα复合物、IL-15/IL-15Rα链复合物，IL-15/IL-15R alpha链复合物，IL-15复合物和IL-15cplex)，小鼠抗CTLA-4scFv-Fc(克隆9D9)，和huSTINGN154S/R284G tazCTT(一种嵌合蛋白，含有GOF突变N154S和R284G的人STING，及用袋獾STING的CTT置换人STING的C端尾区(CTT))；以及其组合。
有效载荷的组合包括两个或三个有效载荷，使用T2A和/或P2A肽在一个质粒上表达，从而使蛋白质在同一启动子的控制下编码。所述有效载荷的组合包括：1)小鼠IL-15Rα-IL-15sc和人STING N154S/R284G tazCTT；及2)小鼠抗CTLA-4scFv-Fc、小鼠IL-15Rα-IL-15sc和人STING N154S/R284G tazCTT。
从缺乏STING的Goldenticket小鼠中分化出骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，将细胞用编码所研究的有效载荷的各种组合的质粒转染细胞。转染后24小时，收获细胞上清液，使用Meso Scale Discovery公司的U-plex检测平台，根据制造商的方案测量BMDC培养上清液中分泌的CXCL10的水平。
为了测量CD8+T细胞的激活，用鸡卵清蛋白(OVA)SIINFEKL(OVA257-264)肽脉冲转染的BMDC，所述肽是一种由CD8+T细胞识别的主要组织相容性复合物(MHC)I类(H-2Kb)限制肽。将分离自Rag1-/-OT-I小鼠的脾T细胞加入BMDC中进行共培养，这些T细胞表达特异于MHC I类分子H-2Kb呈递的SIINFEKL的T细胞受体(TCR)。BMDC/T细胞共培养24小时后，收获上清液，并根据制造商的方案使用Meso Scale Discovery公司的U-plex检测平台测量分泌的IFN-γ水平。
收获共培养的细胞，用藻红蛋白(PE)缀合的小鼠抗CD25抗体(克隆PC61，BioLegend)对CD8+T细胞进行染色，以确定CD25 T细胞活化标记物的表达水平。
下表对结果进行了总结，显示了BMDC在应答编码各种单一和组合有效载荷的质粒后分泌的CXCL10水平，及CD8+T细胞分泌的IFN-γ水平，以及与转染的BMDC共培养后的T细胞激活水平(以CD25的表达为准)。
结果显示，单独的huSTING N154S/R284G tazCTT能诱导BMDC分泌非常高水平的CXCL10。小鼠IL-15Rα-IL-15sc与huSTING N154S/R284G tazCTT的组合，或小鼠抗CTLA-4scFv-Fc+小鼠IL-15Rα-IL-15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT的组合，也诱导BMDC分泌高水平的CXCL10。
结果还显示了诱导人T细胞高水平分泌IFN-γ并诱导T细胞的活化(CD25表达)的编码的有效载荷的示例组合。观察到muIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT组合的效果增加。muIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT组合也导致增加的CD8+T细胞应答激活以及CD25的表达。这些结果表明，将IL-15Rα-IL-15sc和带有功能获得突变的修饰的STING嵌合体以及带有CTT置换以减少NF-κB信号传导的组合递送到肿瘤微环境中，增加有利的抗肿瘤免疫应答，并减少不良的炎症反应。
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SEM＝平均值的标准误差
通过本文提供的免疫刺激细菌，或通过其他递送载体如溶瘤病毒或载体，递送这种编码的有效载荷的组合，以在肿瘤驻留的骨髓细胞和/或肿瘤微环境中表达所述有效载荷，在接受治疗的受试者中提供了增加的抗肿瘤应答。正如以下实施例所示，细胞因子与具有功能获得突变的修饰的STING蛋白(包括嵌合体)的组合，在接受治疗的受试者中产生额外有利的抗肿瘤应答。
实施例30
人重组IL-15与小分子STING激动剂组合诱导骨髓细胞分泌CXCL10并诱导T细胞的激活
这个实施例显示了人免疫调节有效载荷及其组合的表达对T细胞和骨髓细胞的激活和功能的影响。测量分泌的细胞因子如IFN-γ和CXCL10(IP-10)的水平作为保护性抗肿瘤免疫的指标。这个实施例描述并证实了重组单体人IL-15细胞因子和小分子STING(smSTING)激动剂2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)对骨髓细胞分泌CXCL10(一种参与抗肿瘤T细胞募集的趋化因子)以及抗原特异性T细胞分泌IFN-γ的影响。smSTING激动剂是一种环状二核苷酸(CDN)，已知在被内质网驻留的STING识别后能诱导I型干扰素(IFN)的产生。2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)是3’3’-环腺苷单磷酸(c-di-AMP)的2’3’-二硫代磷酸酯类似物的Rp,Rp-异构体。由于存在一个2’-5’、3’-5’的混合键连，它对STING的亲和力比c-di-AMP高。这种类似物含有两个硫代磷酸酯二酯连接，以保护其不受宿主细胞或全身循环中的磷酸二酯酶的降解。2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)强力诱导相关细胞中I型IFN和CXCL10产生。
将人单核细胞衍生的树突状细胞(ModDCs)和自体人T细胞与小分子(smSTING)激动剂和重组IL-15共培养，并鉴定所得分泌细胞因子。使用ImmunoCultTM树突状细胞培养试剂盒(STEMCELL Technologies)，按照制造商的说明，从负分离的单核细胞分出人单核细胞(ModDC)，为期6天。分化6天后，用来自人巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和流感病毒(Flu)的32种MHC I类限制性病毒肽池(用于人CD8 T细胞的扩展的CEF肽池，MABTECH)脉冲ModDCs，然后加入自体CD8+T细胞，并用2.5nM的重组人IL-15和/或5μg/ml的smSTING处理。用病毒肽脉冲树突状细胞，使树突状细胞在其细胞表面呈递病毒抗原，并刺激抗原特异性T细胞产生IFN-γ。在ModDC/T细胞共培养48小时后，使用Meso Scale Discovery公司的U-plex检测平台，按照制造商的方案测量细胞培养上清液中分泌的IFN-γ和CXCL10的水平。
下表总结的结果显示，STING的激活和人IL-15活性对人树突状细胞在抗原特异性刺激下分泌CXCL10具有加成作用。结果还显示，STING激活和细胞因子如人IL-15的组合能协同激活抗原特异性CD8+T细胞，并诱导激活的CD8+T细胞分泌高水平的IFN-γ。
SEM＝平均值的标准差
实施例31
功能获得的STING变体和细胞因子的组合增强抗肿瘤免疫应答
人IL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的组合诱导骨髓细胞分泌IFN-β，并诱导T细胞的激活。
这个实施例证实了编码的人免疫调节有效载荷及其组合在递送至TME和/或肿瘤驻留的骨髓细胞中的表达，对人T细胞和树突状细胞的激活和功能的影响。测量树突状细胞和T细胞分别分泌的细胞因子如IFN-γ和IFN-β的水平，作为保护性抗肿瘤免疫的相关指标。这个实施例描述并证实了如通过本文例举的免疫刺激细菌和/或通过本文描述的其它递送载体向肿瘤微环境递送各种免疫调节有效载荷组合，对抗原特异性T细胞的激活(如通过IFN-γ分泌证明)，以及对IFN-β的分泌的影响，IFN-β是参与抗肿瘤免疫应答的关键因素。这是通过用编码各种有效载荷组合的质粒转染人单核细胞(ModDC)，将转染的树突状细胞与自体人T细胞共培养，并确定因此而分泌的细胞因子来实现的。编码免疫调节有效载荷/蛋白质的质粒包括编码单一有效载荷的质粒和编码有效载荷组合的质粒。例如，如下表所示，编码的有效载荷包括单独的huIL-15Rα-IL-15sc，单独的huSTING N154S/R284GtazCTT，以及huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT组合。
按照制造商的说明，使用ImmunoCultTM树突状细胞培养试剂盒(STEMCELLTechnologies)从负分离的单核细胞中分化出人单核细胞(ModDCs)，为期6天。分化6天后，使用RED mRNA和质粒DNA转染试剂(Origene)，将ModDCs用编码各种研究的有效载荷及其组合的质粒转染。转染后4小时，用来自人巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和流感病毒(Flu)的32种MHC I类限制性病毒肽池(用于人CD8 T细胞的扩展的CEF肽池，MABTECH)脉冲处理ModDC，之后向细胞培养中加入自体CD8+T细胞。将转染的树突状细胞也用人免疫缺陷病毒1(HIV-1)逆转录酶的不相关肽脉冲，并作为肽刺激T细胞的阴性对照。使用来自HIV-1阴性供体的CD8+T细胞。在ModDC/T细胞共培养48小时后，使用Meso ScaleDiscovery公司的U-plex检测平台，根据制造商的方案测量细胞培养上清液中T细胞分泌的IFN-γ水平。
在一个单独的实验中，使用RED mRNA和质粒DNA转染试剂(Origene)，将ModDCs用编码各种研究的有效载荷及其组合的质粒转染，并培养48小时。转染后48小时收获转染的ModDC的细胞培养上清液，根据制造商的方案，使用Meso Scale Discovery的U-plex检测平台测量分泌的IFN-β水平。为了分析编码的有效载荷对人树突状细胞分泌IFN-β的影响，将测量的质粒对照组(β-肌动蛋白)的IFN-β浓度从研究中的所有其它组中减去，提供仅由编码的有效载荷的活性产生的IFN-β净浓度。
下表总结的结果显示，huIL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT组合的活性对人树突状细胞分泌IFN-β有协同作用。结果还显示，huIL-15Rα-IL-15sc和huSTINGN154S/R284G tazCTT对抗原特异性CD8+T细胞的激活，以及从激活的T细胞诱导高水平的IFN-γ分泌的组合作用，所述作用至少是加成作用。
SEM＝平均值的标准误差
在下一个实施例中显示，编码的有效载荷的组合效应导致协同结果，在小鼠癌症模型中观察到的治愈效果证明了这一点。
实施例32
muIL-15Rα-IL15sc、huSTING N154S/R284G tazCTT和小鼠抗CTLA-4scFv-Fc的组合，在高度难治的三阴性乳腺癌小鼠模型中显示出卓越的抗肿瘤功效
在前一个实施例(实施例31)中观察到的协同效应，在这个实施例中进一步显示，示出所述有效载荷的组合在实现治愈方面具有协同作用。在CPI(免疫检查点抑制剂)难治性三阴性乳腺癌的原位、T细胞排除和转移模型中，评估了各种有效载荷组合的体内疗效。对于这个实验，为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组8只)在左侧乳腺脂肪垫中接种EMT6肿瘤细胞(CRL-2755TM)(1×106个细胞，100μL PBS)。为携带7天龄已建立的乳腺肿瘤(体积约65mm3)的小鼠经静脉注射1×107CFU的单剂量YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，其中含有编码各种有效载荷的质粒，单独注射或组合每周一次腹腔(IP)注射100μg的抗PD-L1抗体阿特朱单抗(atezolizumab)。将含有编码muIL-15Rα-IL15sc+huSTINGN154S/R284G tazCTT或muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT+muAnti-CTLA-4scFv-Fc的质粒或编码β-肌动蛋白的对照质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株与用PBS对照处理进行比较。
结果总结在下表中。经PBS处理的小鼠的肿瘤均匀生长，在第31天达到最大肿瘤体积。用对照的β-肌动蛋白质粒处理的小鼠没有表现出太多的抗肿瘤疗效证据(5％的肿瘤生长抑制(TGI)，2/8治愈)，单独用IP抗PD-L1治疗也是如此(17.9％TGI，1/8治愈)。用含有编码muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT的质粒的细菌菌株经IV注射治疗的小鼠显示了单药治疗的疗效(59.8％ TGI，3/8治愈)，与IP抗PD-L1联合治疗的疗效有所改善(77.3％ TGI，5/8治愈)。muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT+muAnti-CTLA-4scFv-Fc的组合也显示出明显的单药疗效(62.4％ TGI，4/8治愈)。
治疗性有效载荷组合的耐受性非常好，小鼠在研究期间没有体重下降。这些数据证明了在检查点抑制剂难治性三阴性乳腺癌(TNBC)的原位、T细胞排斥和转移模型中，静脉注射免疫刺激菌的体内效力，所述细菌编码muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284GtazCTT组合，单独注射或组合IP注射的抗PD-L1和muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT+muAnti-CTLA-4scFv-Fc的增强的效力。
由免疫刺激细菌递送的编码的有效载荷的组合，加上或不加上IP注射抗PD-L1，对检查点抑制剂难治性三阴性乳腺癌小鼠的肿瘤生长抑制和治愈率的影响
为了评估更高剂量的muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT联合治疗的疗效，并与单独给药的muIL-15Rα-IL15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的疗效进行比较，进行了后续研究。将含有编码muIL-15Rα-IL15sc、huSTING N154S/R284G tazCTT或其组合的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，以3e7 CFU的剂量静脉注射给具有7天龄乳腺肿瘤的小鼠，并与PBS对照组进行比较。PBS处理的小鼠的肿瘤均匀地生长，在第31天达到最大肿瘤体积。如下表所示，单独用含有编码muIL-15Rα-IL15sc或huSTING N154S/R284G tazCTT的质粒的细菌菌株治疗的小鼠各显示出2/10的治愈率，而muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT的组合导致7/10的治愈率。
这些数据显示了细胞因子与修饰的STING蛋白的组合，如muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT的组合，对促进完全应答具有协同作用。这是特别重要的，因为这些结果是在高度难治的乳腺癌模型中实现的，这突出了该组合的一般抗肿瘤治疗效力。这些结果表明，细胞因子如IL-15Rα-IL15sc融合蛋白与STING蛋白、特别是高活性的STING蛋白如功能获得组成型活性STING变体或进一步修饰为具有减少的NF-κB信号传导的功能获得组成型活性STING变体的组合，具有协同抗肿瘤效力。
来自muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT组合治疗组(如上所述)的治愈小鼠，然后在原位EMT6肿瘤再挑战研究中，以CD8+T细胞依赖的方式，评估其促进持久抗肿瘤免疫的能力。在这项研究中，20只治愈的小鼠被分为两组，每组10只，每只小鼠在肿瘤再挑战前的第3天和第1天经IP注射接受100μg的抗CD8β抗体(不耗竭CD8α+树突状细胞)或100μg的IgG同种型对照(分别为初始肿瘤植入后第56天和第58天)。在肿瘤再次挑战前，将小鼠放血以确认CD8+T细胞的耗竭，确定平均循环的CD8+T细胞为同种型对照的5.72％，为抗CD8β抗体的0.48％。然后在对侧乳腺脂肪垫上原位用1e6 EMT6肿瘤细胞再次挑战小鼠，并与未经实验的年龄匹配的对照小鼠(N＝10)进行比较。在第30天时来自未经实验组的小鼠都长出了肿瘤，达到最大的肿瘤体积。来自抗CD8β抗体耗竭组的再挑战小鼠比未经实验的小鼠更积极地生长肿瘤，而来自IgG同种型抗体对照组(即没有CD8+T细胞耗竭的小鼠)的所有10只再挑战小鼠都被保护免受肿瘤再挑战。这些数据表明，细胞因子与修饰的功能获得的组成型活性STING蛋白变体如的组合，例如当在免疫刺激细菌如包含编码muIL-15Rα-IL15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT组合的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD细菌菌株中递送时，具有显著和持久的抗肿瘤功效。治疗有效载荷/蛋白质的组合在静脉注射细菌后诱导高治愈率，小鼠以CD8+T细胞依赖的方式免受肿瘤的再次挑战。
实施例33
DLL3xCD3 T-细胞重定向抗体(TCRA)设计
T细胞重定向抗体(TCRA)或T细胞重定向双特异性抗体(TRBA)是T细胞受体(TCR)功能非依赖性的基于T细胞的免疫治疗剂，其中TCR复合物的一个组分--分化簇3(CD3)的epsilon(ε)结构域由一个结合结构域靶向，而第二个结合结构域靶向肿瘤细胞表面抗原。TCRA包括例如双特异性T细胞衔接器(以商标出售)，它是基于抗体的工程免疫治疗剂，是通过一个肽接头连接在一起的两个单链可变片段(scFvs)的融合蛋白。
TCRAs通过同时与肿瘤细胞表面抗原和T细胞上的CD3结合，以不依赖MHC和TCR功能的方式诱导T细胞和肿瘤细胞之间形成细胞溶解突触，将T细胞的细胞溶解活性选择性地引导到靶向的肿瘤细胞。细胞溶解突触形成后，T细胞释放细胞毒性蛋白，如穿孔蛋白和颗粒酶(例如，颗粒酶B)，导致肿瘤细胞凋亡。T细胞的激活导致细胞因子释放，使其它免疫细胞参与进来并诱发更广泛的抗肿瘤免疫应答。这导致非炎症(或冷)肿瘤环境转化为炎症(或热)环境，并导致T细胞的浸润和增殖，以及杀死肿瘤细胞。最初的抗体的半衰期很短；后来的/>抗体由于与Fc融合而延长了半衰期(见例如Hipp et al.(2020)Clin.Cancer Res.26:5258-5268；和Strohl,W.R.and Naso,M.(2019)Antibodies 8:41)。
Delta样配体3(DLL3)是一种抑制性Notch通路配体，在胚胎发育期间中对Notch信号传导起作用。DLL3在胚胎发育期间在正常组织的细胞内表达，在胎儿大脑中表达量最高，但在成人正常组织中不存在。DLL3在某些肿瘤中过表达，如小细胞肺癌(SCLCs)和其他高级别神经内分泌肿瘤，在这些肿瘤中，其不是在细胞内表达，而是逃逸到细胞表面，使其可以用基于抗体的治疗方法进行靶向治疗(见例如Hipp et al.(2020)Clin.Cancer Res.26:5258-5268)。DLL3也在其它神经内分泌来源的肿瘤类型中表达，包括黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤、小细胞膀胱癌、转移性去势抵抗性前列腺癌和神经内分泌肺肿瘤(见例如Owenet al.(2019)Journal of Hematology&Oncology 12:61)；因此，它是基于TCRA疗法的有用靶标。
从抗DLL3克隆hSC16.56抗体(见例如国际专利申请公开号WO 2013/126746)的轻链和重链可变区(分别为VL和VH)及抗CD3ε克隆145-2C11抗体(得自BioLegend)的轻链和重链可变区中，制备DLL3xCD3 TCRA(核苷酸和氨基酸序列分别见SEQ ID NO:410和411；另见Hipp et al.(2020)Clin.Cancer Res.26:5258-5268)。
所述构建体包括来自pSecTag2载体的小鼠IgGκ前导/信号序列(对应于SEQ IDNO:411的第1-21个残基；参见，例如addgene.org)，用于分泌TCRA。抗DLL3 VH结构域(对应SEQ ID NO:411的残基22-139)通过长度为15个氨基酸的(Gly4Ser)3接头(对应SEQ ID NO:411的残基140-154)与抗DLL3VL结构域(对应SEQ ID NO:411的残基155-261)连接，形成抗DLL3 scFv。在抗DLL3 scFv和抗CD3scFv之间插入了一个5个氨基酸长的Gly4Ser接头(对应于SEQ ID NO:411的残基262-266)。抗CD3scFv含有抗CD3 VH结构域(对应于SEQ ID NO:411的267-382残基)，通过第二个(Gly4Ser)3接头(对应于SEQ ID NO:411的383-397残基)与抗CD3 VL结构域(对应于SEQ ID NO:411的398-504残基)连接。这个构建体被命名为DLL3HL×CD3HL，以表示抗DLL3和抗CD3抗体的重链(H)和轻链(L)可变结构域在分子中出现的顺序。可以在该构建体的C末端加入一个FLAG标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:412)以进行检测(对于FLAG标签标记的DLL3xCD3 TCRA，命名为DLL3HL×CD3HL-FLAG TCRA，见SEQ ID NO:413)。
另一个DLL3xCD3 TCRA构建体，命名为DLL3LH×CD3HL TCRA(核苷酸和氨基酸序列分别见SEQ ID NO:414和415)，其构建方式与DLL3HL×CD3HL构建体类似，但正如其名称所暗示的，抗DLL3 scFv含有抗DLL3 VL结构域，置于抗DLL3 VH结构域N末端。TCRA的抗CD3scFv部分、GS接头和用于分泌的前导序列，都与上述DLL3HL×CD3HL构建体的描述相同。还构建了一个FLAG标签标记的DLL3LH×CD3HL TCRA构建体，命名为DLL3LH×CD3HL-FLAGTCRA(核苷酸和氨基酸序列分别见SEQ ID NOS:416和417)。
实施例34
关于靶结合、缀合和细胞毒性评估T细胞重定向抗体(TCRA)
针对CD(分化簇)抗原的抗体，如CD19和CD3，是抗癌靶标。某些CD抗原的表达仅限于特定系的淋巴造血细胞。针对淋巴细胞特异性抗原的抗体已被开发为治疗剂。CD19是一个有用的靶标，因为它在B细胞上表达，不脱落，在所有淋巴瘤细胞上统一表达，而且在干细胞中不存在。CD3作为T细胞受体(TCR)复合物的一部分在T细胞上表达，它含有三条链：CD3ε、CD3δ和CD3γ。CD3在T细胞上的簇集，如通过固定化的抗CD3抗体，导致T细胞激活，这与T细胞受体(TCR)的参与相似，但不依赖于其克隆典型特异性。针对CD19和CD3抗原的双特异性抗体，以MHC非依赖性的方式将T细胞的细胞毒性重新靶向CD-19阳性细胞(如淋巴瘤细胞)，并且不需要T细胞预刺激或共刺激。因此，这种分子在诱导持久的T细胞介导的抗肿瘤免疫中特别有用，并可作为抗癌治疗剂。
抗CD19和抗CD3 TCRA的FLAG标签变体序列，命名为MT103(SEQ ID NO:418；另见已过期的美国专利号7,112,324)，将其克隆到命名为pATI1.75的载体(如上所述)。MT103TCRA构建体含有一个前导序列(对应于SEQ ID NO:418的第1-19个残基)，随后是一个FLAG标签(DYKDDDDK；对应于SEQ ID NO:418的第20-27个残基)，以及与抗CD3 scFv连接的抗CD19 scFv。抗CD19 scFv包含一个抗CD19 VL结构域(对应于SEQ ID NO:418的残基28-138)，通过(GGGGS)3接头(对应于SEQ ID NO:418的残基139-153)与抗CD19 VH结构域(对应于SEQ ID NO:418的残基154-277)连接。抗CD19 scFv通过GGGGS接头(对应于SEQ ID NO:418的残基278-282)与抗CD3 scFv连接。抗CD3scFv含有抗CD3 VH结构域(对应于SEQ IDNO:418的残基283-401)，通过肽接头(VEGGSGGSGGSGGVD；对应于SEQ ID NO:418的残基402-419)与抗CD3 VL结构域(对应于SEQ ID NO:418的残基420-525)连接。所述构建体还包括一个His标签(His6；对应于SEQ ID NO:418的残基526-531)。
将HEK293T STING裸细胞(293-DualTM裸细胞；InvivoGen)以每孔1.5e6个细胞的数量接种在聚-L-赖氨酸包被的6孔板中，并在37℃在5％二氧化碳培养箱中温育过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将3000ng MT103质粒DNA在无血清培养基中稀释，并按适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)，对细胞进行转染，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。转染后48小时，收集每个样品的细胞培养上清液。将上清液保持纯净，或使用Ultra 4mL离心过滤器(Millipore Sigma)进行浓缩。
为了证实表达的MT103(CD19xCD3)TCRA的功能，使用Raji细胞(购自ATCC)和Jurkat-LuciaTMNFAT细胞(InvivoGen)进行了流式细胞术实验。Raji细胞是高度表达CD19的人淋巴细胞，Jurkat细胞是表达CD3的人T淋巴细胞。将200,000个Raji细胞和200,000个Jurkat细胞均通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤。然后，向细胞中加入50μL纯的或浓缩的细胞培养上清液，其中含有表达的TCRA，并在37℃在5％二氧化碳培养箱中温育30分钟。然后将细胞重新悬浮在PBS+2％FBS中，用APC标记的抗FLAG标签抗体(BioLegend)进行染色。加入APC标记的抗FLAG标签抗体是为了标记任何与Raji细胞上的CD19和/或Jurkat细胞上的CD3结合的任何MT103 TCRA(含有FLAG标签)。温育30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤两次，然后重悬浮于具有DAPI(死/活染色)的PBS+2％ FBS中。进行流式细胞计量术，以检测CD19xCD3MT103 TCRA与Raji细胞上CD19的任何结合，和/或所述TCRA与Jurkat细胞上CD3的结合。每个样品获得50,000个事件。使用ACEA流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
如下表所示，从与纯或浓缩的含MT103细胞培养物上清液温育的Raji和Jurkat细胞中检测到的APC的中位荧光强度(MFI)远远高于从与未转染的细胞培养上清液温育的细胞中检测到的MFI，表明MT103 TCRA与表达CD19和CD3的细胞结合。
用MT103(CD19xCD3)TCRA处理的细胞的流式细胞计量术数据
此外，将CD19xCD3 MT103 TCRA构建体在Raji和Jurkat-LuciaTMNFAT细胞的共培养中进行测试。Jurkat-LuciaTMNFAT报告细胞系含有NFAT可诱导的LuciaTM构建体，其中LuciaTM荧光素酶的表达由ISG54最小启动子驱动，所述启动子与NFAT(活化T细胞的核因子；一种转录因子)共有转录应答元件的六个拷贝融合。因此，Jurkat-LuciaTMNFAT细胞可以通过监测LuciaTM荧光素酶的活性来研究NFAT的激活；LuciaTM荧光素酶的水平可以用QUANTI-LucTM(一种LuciaTM荧光素酶检测试剂)在细胞培养上清液中测量。在这个实验中，MT103TCRA与表达CD19的Raji细胞和表达CD3的Jurkat细胞的结合，激活了Jurkat细胞(T细胞)，导致NFAT诱导的LuciaTM荧光素酶分泌，可以对此进行测量以确定Jurkat细胞的激活水平。
将Jurkat细胞以每孔5e4个细胞接种在96孔组织培养板中。将Raji细胞以每孔1e5或5e4个细胞接种，效应细胞:靶细胞(Jurkat：Raji)的比例分别为1:2或1:1。将共培养的细胞与纯的或浓缩的含MT103的细胞培养上清液一起温育或不一起温育。制备10倍、100倍和1000倍稀释的纯的或浓缩的上清液并与共培养物一起温育。在将TCRA加入共培养物后6小时和24小时，检测得自诱导的NFAT报告构建体的发光(即分泌的LuciaTM荧光素酶活性)。
结果总结在下面的表格中，显示与没有添加MT103的对照样品相比，以及与没有与Raji(靶)细胞共培养的对照样品相比，MT103 TCRA的活性导致Jurkat-LuciaTMNFAT报告细胞系的发光增加。得自NFAT诱导的LuciaTM报告构建体产生的发光以剂量依赖的方式随着MT103的稀释而减少。较长的温育时间(24小时相对于6小时)导致发光增加，正如预期的那样，这表明T细胞的激活增加。
用不同浓度的MT103及不同效应细胞与靶细胞比例下处理的共培养Jurkat和Raji细胞的NFAT-LuciaTM报告值
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SD＝标准差
使用人CD8+T细胞和Raji细胞(Burkitt淋巴瘤细胞；即肿瘤细胞)共培养，进行细胞毒性测定。使用EasySepTM人T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)分离人CD8+T细胞，然后重悬于RPMI+2％ FBS中，并接种于96孔板中。将CD8+T细胞以每孔1e5个细胞或每孔5e4个细胞接种，Raji细胞以每孔10,000个细胞接种，效应细胞:靶细胞(T细胞:Raji细胞)的比例分别为10:1或5:1。将含有浓缩或纯MT103的上清液在RPMI+2％ FBS中稀释10倍、100倍和1000倍，然后将50μL每种上清液样品加入共培养物中。共培养5小时后收集上清液，按照制造商的说明用CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega)进行分析。根据制造商的说明计算细胞毒性的百分比。
如下表所示，MT103的量(浓度)越高，细胞毒性的百分比就越高。当含MT103的上清液被稀释10倍、100倍和1000倍时，细胞毒性的百分比以剂量依赖性方式下降。
与CD8+T细胞和不同浓度的MT103共培养的Raji细胞的裂解(细胞毒性％)
SD＝标准差；NA＝不适用
实施例35
在表达质粒中编码的肿瘤相关抗原的免疫刺激性细菌递送
这个实施例描述了可由免疫刺激细菌递送的示例的肿瘤相关抗原(TAA)。在用工程化免疫刺激细菌治疗后，将肿瘤相关抗原递送至肿瘤驻留的骨髓细胞，例如巨噬细胞和树突状细胞，从而引发和激活抗原特异性T细胞，从而产生抗肿瘤应答。
在免疫刺激细菌中由质粒编码的肿瘤相关抗原是那些被归类为癌胚抗原或癌病毒抗原。其中一些抗原在肿瘤中过表达，或在在肿瘤中积累。所述抗原包括细胞系限制的、突变的或翻译后改变的那些抗原。下表列出这些类别中每个类别中的肿瘤相关抗原及其相关癌症类型(适应症)的非限制性实例。
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实施例36
真核细胞中来自细菌衍生RNA递送的异位蛋白质合成
如详细描述中所述，除了质粒DNA递送外，免疫刺激性细菌还可用于将细菌衍生的RNA例如mRNA直接递送到受感染的骨髓细胞中。RNA的直接递送避免了需要质粒递送DNA，所述质粒DNA递送依赖于真核转录和翻译机制，以及将质粒DNA正确运输到宿主细胞核。直接递送RNA例如mRNA绕过宿主运输和转录过程，仅依靠真核翻译机器来生产蛋白质。细菌衍生的RNA的递送需要细菌转录与细菌翻译的脱离，以防止细菌中外源蛋白质翻译的问题。许多真核蛋白质是复杂的蛋白质，需要适当的折叠条件、内质网、适当的翻译后修饰(包括二硫键)和用于折叠的宿主伴侣。外源蛋白在细菌中的过表达可降低菌株适应性、缩短倍增时间并降低菌株稳定性。
为了证实在用所述免疫刺激细菌治疗期间会发生mRNA递送，将一系列质粒用驱动mu4-1BBL_T2A_muIL-12p70 HPRE bGHpA表达的真核或细菌启动子工程化，存在或不存在干预脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(EMCV IRES)。所述EMCV IRES在细菌中无功能，可减少原核细胞翻译并增强真核细胞翻译。只有一种已知的真核IRES来自双顺反子病毒科病毒，在细菌中起作用(见例如Colussi et al.(2015)Nature 519(7541):110-113)。因此，一般来说，IRES元件在细菌中不起作用。启动子-IRES(或启动子-Kozak)组合也被克隆到mCherry荧光报告基因(Takara Bio)中，因此可以通过荧光快速评估来自调节序列的细菌表达。
为了测量荧光mCherry蛋白的细菌表达，将细菌菌株的过夜培养物在PBS中洗涤，并通过OD600标准化为0.1。对于每种细菌培养物，使用流式细胞仪(ACEABiosciences,Inc.)通过流式细胞术分析mCherry表达的百分比。使用受感染的原代人M2巨噬细胞和HEK-BlueTMIL-12报告细胞(InvivoGen)的共培养系统，测量细菌转染后的异位基因表达水平。HEK-BlueTMIL-12细胞是表达IL-12受体以及IL-12信号传导途径中的基因和STAT4诱导型SEAP报告基因的HEK293细胞。IL-12与HEK-BlueTMIL-12细胞表面的IL-12受体结合触发信号级联反应，从而激活STAT-4，随后产生SEAP。使用QUANTI-BlueTM溶液可以很容易地评估HEK-BlueTMIL-12细胞上清液中SEAP的检测。因此，这些报告细胞用于测量IL-12的表达。
将原代人单核细胞在含有100ng/ml M-CSF的ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基中分化3天，然后补充含有200ng/ml M-CSF、20ng/ml IL-4和20ng/ml IL-10的额外的培养基，再培养4天。然后用静止期免疫刺激细菌感染细胞，将其在4XYT培养基中在37℃生长过夜，MOI为50。为细胞接种细菌并以500rcf离心5分钟，然后在37℃下温育1小时。然后将细胞用DPBS洗涤两次，然后在含有100μg/ml庆大霉素的新鲜ImmunoCultTM-SF巨噬细胞培养基中温育，以去除细胞外细菌。然后将感染的巨噬细胞与HEK-BlueTMIL-12报告细胞以2.5:1(巨噬细胞比HEK-BlueTM细胞)的比例共培养。感染后48小时，将5μl细胞培养上清液与180μlQUANTI-BlueTM溶液(检测SEAP)一起温育孵育，并在37℃下温育以显色。因此，通过测量上清液中的SEAP水平来评估受感染巨噬细胞的IL-12表达，所述SEAP是由HEK-BlueTM细胞在IL-12与其细胞表面上的IL-12受体结合后产生的。
结果总结在下表中，表明受感染的对照(EF-1α-荧光素酶)刺激原代人M2巨噬细胞中IL-12表达的基线水平，并且细菌中mCherry表达的荧光非常少。CMV-Kozak对在细菌感染后驱动更高水平的IL-12表达，以及更高水平的mCherry蛋白表达。这归因于细菌中CMV启动子产生的低水平细菌“渗漏”。被测试的两种细菌启动子rpsM和MTL，当与Kozak序列配对时在原代人M2巨噬细胞中诱导的IL-12表达水平低于CMV启动子，但高于EF-1α-NanoLuciferase对照，并且这两种启动子在细菌中均驱动高水平的mCherry蛋白表达。这些结果表明发生mRNA递送，因为细菌启动子在真核宿主中是无功能的。当细菌启动子与IRES偶联时，IL-12报告蛋白的表达水平更高，表明递送的mRNA的蛋白质表达在真核IRES的存在下在翻译水平上得到增强。IRES的存在也减少了细菌中mCherry的表达量，表明即使与细菌启动子偶联，RNA的二级结构也抑制表达。
在启动子下游和起始密码子之前在构建体中包含IRES，可抑制或阻止细菌翻译，从而使细菌充当mRNA的递送剂。细菌，如本申请中提供的免疫刺激细菌，被设计为感染宿主细胞，如组织驻留巨噬细胞(例如肿瘤驻留骨髓细胞)，并将编码的RNA递送到宿主细胞中。所述细菌可以是营养缺陷型的，例如asd-，因此其可以在体外生长，但是当引入宿主例如人时不生长。所述细菌将其内容物递送到宿主细胞，并且不繁殖。
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将细菌在体外培养以产生编码的RNA，由于IRES或其它阻止或抑制细菌翻译的这种调节序列的存在，导致RNA的产生，如细菌的mRNA。细菌感染真核宿主细胞如人巨噬细胞后，所述RNA被翻译，产生编码的产物如抗原。
细菌是RNA递送的有利容器，因为细菌很容易被大量培养，然后被储存和/或配制或提供为粉末、片剂或注射用液体。它们可以通过任何合适的途径施用，包括静脉注射和通过鼻或肺部的粘膜给药。它们非常稳定，并将提供大量稳定的RNA。
本文提供的免疫刺激细菌，当用于递送RNA如mRNA时，例如当用作疫苗或编码病毒抗原和/或其它蛋白质以对抗病原体如严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2，引起COVID-19)起保护作用时，可以编码全长野生型SARS-CoV-2刺突蛋白(见例如SEQ IDNO:438)，或可以编码SARS-CoV-2刺突蛋白的全长受体结合域(RBD)(见SEQ ID NO:440)，或可以编码刺突蛋白RBD的一部分(见例如SEQ ID NO:441)，所述部分足以诱导或引起免疫应答，和/或对受试者对抗SARS-CoV-2进行免疫或接种或保护受试者。所述免疫刺激细菌还可以递送编码SARS-CoV-2刺突蛋白突变体的mRNA，所述突变在刺突蛋白或其一部分，如RBD或其一部分发生突变，所述突变增加或增强刺突蛋白或RBD或其一部分的表达，和/或增加或增强刺突蛋白或RBD或其一部分与ACE2受体的结合。
所述刺突蛋白或刺突蛋白RBD的突变体包括本文所述和本领域已知的任何突变体，包括但不限于包含以下突变的那些突变体：V367F，D614G，G476S，V483A，H49Y，N501Y，N501F，N501W，N501V，F817P，A892P，A899P，A942P，K986P，V987P，V417K，G502D，N501T，Q498Y，W436R和D364Y，以及在对应于刺突蛋白或其一部分的残基N439/R426、L452/R426、T470/N457、E484/P470、Q498/Y484和N501/T487的残基包含突变的那些突变体。通过递送编码SARS-CoV-2刺突蛋白或RBD(包括其一部分)的任何抗原性序列或修饰形式的mRNA，所述免疫刺激细菌可用作针对SARS-CoV-2的疫苗，例如美国专利号10,973,908和10,702,600所述。所述免疫刺激细菌也可用作疫苗/用于mRNA递送，以递送Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗和Moderna COVID-19疫苗中的mRNA，如本文别处所述。用作抗原的SARS-CoV-2蛋白包括例如刺突蛋白、核衣壳蛋白和M蛋白及其抗原性部分。所述免疫刺激细菌可用于递送通用流感抗原，例如流感疫苗，其引发来自各种流感病毒株(例如甲型流感病毒株(H1和H3)和乙型流感病毒株)的HA蛋白的抗体。其它组合包括HA表位的重复模式，例如FlusMos-v1。见例如Nachbaguer et al.(2021)Nature Medicine 27:106-114，提供了一种基于嵌合血凝素的通用流感疫苗。
实施例37
含有人IL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT的免疫调节菌株定殖在小鼠原位肿瘤
之前有报道称，减毒沙门氏菌菌株YS1646能够在4T1小鼠乳腺移植模型中定植肿瘤(平均肿瘤大小400mm3，平均CFU/g＝108)，但明显不太能定植在自发BALB-NeuT乳腺肿瘤模型(平均肿瘤大小400mm3，平均CFU/g＝103；见例如Drees et al.(2015)J.Cancer 6(9):843-848)。
为了表明本文提供的免疫刺激细菌在定殖自发肿瘤方面与定植移植肿瘤没有类似的缺陷，从原位移植的EMT6乳腺癌小鼠模型收集肿瘤，并与从自发MMTV-PyMT乳腺癌模型的肿瘤对比。对于EMT6模型，将EMT6细胞(100μL PBS中的1×106个细胞)原位接种到6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(每组5只小鼠)的第四象限乳腺脂肪垫中。对带有7天建立的侧腹肿瘤(平均肿瘤大小为56mm3)静脉注射单次剂量的3×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，其含有编码huIL-15Rα-IL-15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT组合的质粒。在IV给药后第4天，对小鼠实施安乐死，将肿瘤均质化并铺板在LB平板上以计算每克肿瘤组织的菌落形成单位(CFU)数。定殖肿瘤的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株的平均值为每克肿瘤组织1.7×107CFU。
对于自发乳腺癌模型，当其最大肿瘤经测量平均体积为272mm3时，为MMTV-PyMT小鼠静脉注射3×107CFU的相同细菌菌株。在IV给药后第6天收集肿瘤。将肿瘤均质化并铺板在LB平板上以计算每克肿瘤组织的CFU数。尽管肿瘤重量在一定范围内(0.05g至0.36g，N＝7)，但发现所有收集到的肿瘤都很好地被定植，平均为2.89×106CFU/g。这些数据表明，与亲本YS1646菌株不同，免疫调节性YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株(含有编码huIL-15Rα-IL-15sc+huSTING N154S/R284G tazCTT组合的质粒)能够定殖自发MMTV-PyMT肿瘤，其定植水平与定植移植的EMT6肿瘤相当(P＝0.18，NS)。
由于与移植肿瘤不同，自发肿瘤具有与人类肿瘤更相似的脉管系统，因此这些数据表明所述免疫刺激细菌将以比晚期癌症患者的I期临床试验中报告的亲本YS1646菌株高得多的速率/水平定殖人类肿瘤(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。
实施例38
含有编码人IL-15Rα-IL-15sc和huSTING N154S/R284G tazCTT质粒或荧光素酶对照质粒的免疫调节菌株在非人灵长类动物中具有良好的耐受性
在I期人体临床试验中，据报道亲本YS1646菌株的最大耐受剂量(MTD)为3×108CFUs/m2，剂量限制毒性(DLT)剂量为1×109CFUs/m2(见例如Toso et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1):142-152)。在这些剂量下，毒性和不良事件，如发烧、低血压、血小板减少、贫血、呕吐、腹泻、恶心和低磷血症，归因于在IV给药后4小时测量的非常高的血清促炎细胞因子水平，包括TNF-α(约500,000pg/mL)、IL-6(约500,000pg/mL)和IL-1β(约200pg/mL)。在一项单独的研究中，在使用食蟹猴的非人灵长类动物(NHP)研究中评估了菌株YS1646。在这项研究中，发现1×109CFU/猴的剂量是MTD(人等效剂量(HED)＝4×109CFU/m2)，而1×1010CFU/猴的剂量被认为是不可耐受的(HED＝4×1010CFU/m2)。最高剂量的DLT归因于肝脏相关不良事件(AE)，并且未测量血清细胞因子(见例如Lee et al.(2000)International Journal of Toxicology 19:19-25)。由于NHP对菌株YS1646的耐受性比人类好得多，MTD值比人类MTD高出一个对数，因此可以推断猴子的细胞因子水平大约比在人类中测量值的低一个对数。
为了确定本文提供的免疫刺激细菌例如缺乏鞭毛和是msbB-/pagP-的菌株在NHP中的MTD和血清细胞因子概况，进行了耐受性研究。在这项研究中，使用了15只以前未经治疗的雄性食蟹猴，年龄从24个月到50个月不等。为所述NHP静脉注射YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI菌株(上文讨论)，其含有编码huIL-15Rα-IL-15sc+huSTINGN154S/R284G tazCTT组合的质粒，剂量为3×108CFU/猴、1×109CFU/猴、或3×109CFU/猴(每个给药组3个NHP)，或静脉注射YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，其含有编码荧光素酶的质粒，剂量为3×108CFU/猴(每组3个NHP)，并与盐水载体对照组(N＝3)进行比较。根据制造商的方案，在给药前、给药后4小时和给药后24小时对NHP取血，并使用猴细胞因子U-Plex板(Meso Scale Discovery)测量血清细胞因子水平。
结果总结在下表中，表明所述细菌菌株在所有测试剂量水平下都具有良好的耐受性，并且没有报告与盐水(PBS)对照组有显着差异的临床发现。因此，本研究无法确定MTD。总体而言，血清细胞因子水平非常低，特别是对于在使用菌株YS1646的人体临床试验中归因于剂量限制毒性(DLT)的细胞因子，例如在3×109CFU/猴给药组中在IV给药后4小时测量的细胞因子(HED＝1.2×1010CFU/m2)，包括TNF-α(平均浓度4.6pg/mL)、IL-6(平均浓度376.9pg/mL)和IL-1β(平均浓度0.88pg/mL)。在最高剂量组中在给药后4小时仅IP-10/CXCL10(平均浓度为10,549.6pg/mL)和MCP-1/CCL2(平均浓度为6247.7pg/mL)的血清细胞因子水平较高，并在给药后24小时保持升高。这些分析物与毒性无关，并且可以指示更有利的免疫特征。总之，本文提供的免疫刺激细菌，包括那些含有编码有效载荷的质粒的细菌，在NHP中具有很好的耐受性。因此，从这些数据可以推断，所述免疫刺激细菌菌株在人类中将具有高水平的耐受性。
给药前血清细胞因子水平
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SD＝标准差血清细胞因子水平，给药后4小时
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SD＝标准差血清细胞因子水平，给药后24小时
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SD＝标准差
实施例39
胸苷营养缺陷型菌株
鼠伤寒沙门氏菌必需基因thyA编码胸苷酸合酶，这是DNA合成中的关键酶。该基因的缺失或突变导致菌株是胸苷营养缺陷型。在耗竭互补底物后，发生细菌细胞死亡，并且已经证明在胸苷饥饿时没有大分子从thyA突变体释放(Loessner et al.,FEMS MicrobiolLett.265(1):81-88(2006))，减少了PAMP的潜在释放和随后的先天炎症应答激活。为了产生无法在体内复制并且在没有补充胸苷的情况下迅速死亡的胸苷营养缺陷型，使thyA从菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI中缺失。
使用Datsenko和Wanner方法加以修改(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640-6645(2000))，将含有thyA基因的690bp区域(SEQ ID NO:464；DC51_3078)进行靶向缺失。为了破坏thyA基因，通过重叠PCR构建了thyA基因敲除盒。该盒含有卡那霉素抗性(KanR)盒，两侧是两个I-SceI切割位点，以及在5’端(345bp)和3’端(332bp)上的同源区域以促进重组。紧邻KanR盒的5’端的是75bp的DNA序列，其与KanR盒3’端的75bp完全同源。这个重复元件(thyA MHA)在切除KanR盒后留下无痕缺失。
具体地，参考下表中的序列，使用引物thya-1和thya-2从YS1646扩增thyA左侧同源臂序列，使用引物thya-1与KanR盒进行PCR重叠，以及使用引物tha-3和thya-4从YS1646扩增scFv-thyA右侧同源性的臂序列，与thyA MHA(使用引物loxp-4和thya-4从供应商(IDT)制备合成的gBlock基因片段)进行PCR重叠。
表3：thyA基因KO同源臂长度信息
表4：thyA KO引物序列信息
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>thyAMHA gBlock片段
注意：thyA KO中间同源臂(ggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccgGGTACCggcaagTAGGGATAACAGGGTAATgttaTCTGC Agaccaaggacccagattatgcagcaacacgtttcctgaggaaccatgaaacagtatttagaactgatgcaaaaagtgctggatgaaggcacacagtgaaattgaaggctatgatccgcac；SEQ ID NO:479)用于在使用I-SceI去除Kan基因期间的λ-Red重组步骤。
然后使用引物thya-1和thya-4(见上表)通过重叠PCR构建全长thyA基因敲除盒，经凝胶纯化，并通过电穿孔引入携带温度敏感的λ-Red重组质粒pSL0304的菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI中。然后如先前Yang and Yang(Applied andEnvironmental Microbiology,80:3826-3834(2014))所述，通过I-SceI/λ-Red介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。使用引物thya-5和thya-6(表2)通过PCR确认thyA基因片段敲除序列，并通过DNA测序验证。亲本菌株YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI的所得突变衍生物被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA。
将胸苷缺失菌株在补充有250μg/mL胸苷的DasGip发酵系统中生长6小时，随后将培养物处理为注射原种。将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA在存在250μg/mL胸苷(Sigma Aldrich T1895-1G)和50μg/mL二氨基庚二酸下培养以产生电转感受态细胞。将YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA用质粒ADN-86、ADN-870或ADN-872(见下表)转化，以分别产生菌株STST-321、STST-326和STST-328。将含有指示的质粒(见下表)的称作STST-321、STST-326和STST-328的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA菌株，在DasGip发酵系统中以1L规模培养在存在250μg/mL胸苷的条件下与不存在胸苷补充的CRST-2000(携带质粒ADN-838的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI)平行生长6小时。
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在整个发酵过程中分析发酵培养物的OD600。观察到胸苷缺失菌株的生长与CRST-2000对照相当。
为了证实胸苷营养缺陷，与对照CRST-2000相比，对菌株STST-321、STST-326和STST-328在有或没有补充250μg/mL胸苷的培养基中的生长进行了评估。将注射原种在室温下解冻，并使用2.5μL接种有/无胸苷的250μL培养基，一式三份在底部透明的96孔板中接种；在Spectramax微板读器(Molecular Devices)中通过OD600评估在37℃下振荡12小时的生长情况。使胸苷缺失菌株在补充或不补充250μg/mL胸苷的肉汤中生长，并在12小时的时程中以15分钟的间隔监测OD600。
结果表明，在没有补充胸苷的情况下，STST-321、STST-326和STST-328未观察到生长，而CRST-2000表现出稳健生长至稳定期。在补充250μg/mL胸苷的情况下，STST-321、STST-326和STST-328生长至稳定期，其生长曲线与CRST-2000相似，证实精确且可控的胸苷营养缺陷型。
实施例40
IRF3、IFNα2和IFN-β表达盒的优化表达
含有人IRF3 S396D或小鼠IRF3 S388D、或人或小鼠IFNα2、或人或小鼠IFN-β的组合的质粒，其中双顺反子构建体含有T2A肽，针对单个表达对照对所述质粒测试每个编码的有效载荷/产物的表达。
使用HEK293T STING裸细胞(293-DualTM裸细胞；InvivoGen)，其不含内源性STING，表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激的应答元件(ISRE)启动子的控制之下，其中使用敲入技术将ISRE的编码序列由SEAP ORF置换。因此，通过监测I型干扰素诱导的SEAP产生来评估STING活性。293-DualTM裸细胞还表达LuciaTM荧光素酶，这是一种分泌型荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制之下；IFN-β的编码序列已通过使用敲入技术由LuciaTM荧光素酶ORF置换。这样可以通过监测IFN-β的表达来评估STING活性。使用这些细胞，可以通过监测ISRE诱导的SEAP产生和/或LuciaTM荧光素酶的IFN-β依赖性表达来评估STING活性。SEAP和LuciaTM萤光素酶这两种报告蛋白可以分别使用标准测定法和检测试剂例如QUANTI-BlueTM和QUANTILucTM检测试剂(InvivoGen)在细胞上清液中进行测量。
将细胞以每孔200,000个细胞接种在聚L-赖氨酸包被的24孔板中，并在37℃、5％CO2培养箱中温育过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将300ng每种质粒DNA和40ng CMV-GFP载体(即在CMV启动子控制下编码绿色荧光蛋白的载体)在无血清培养基中稀释并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)中，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。转染后48小时收集每个样品的细胞培养上清液。
使用ISRE-SEAP和IFN-β-LuciaTM报告系统评估构建体的活性。通过监测细胞上清液中I型干扰素刺激的SEAP产生来评估I型干扰素(IFN)活性。将20μL细胞培养上清液加入180μL用于测量SEAP的QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)中。I型干扰素激活是通过在M3分光光度计(MolecularDevices)上在650nm的吸光度波长下测量ISRE诱导的SEAP活性来确定的。I型干扰素(IFN)活性也通过监测细胞上清液中I型干扰素刺激的LuciaTM荧光素酶的产生进行评估。将20μL细胞培养上清液加入到50μL QUANTI-LucTM试剂(InvivoGen)中，该试剂用于测量LuciaTM荧光素酶活性。I型干扰素激活是通过在M3分光光度计(Molecular Devices)的发光设置下测量IFNβ诱导的LuciaTM荧光素酶活性来确定的。
A.BMDCs中小鼠IRF3、IFNα2和IFNβ转染产生的细胞因子
将含有小鼠IRF3 S388D、小鼠IFNα2、小鼠IFN-β的各种单一表达质粒和组合质粒与hSTING N154S/R284G tazCTT质粒进行比较。表达结果在下表中提供。在所有人构建体以及以及mIFNα2T2A mIRF3 S388D和mIRF3 S388D T2A mIFNα2中，ISRE-SEAP报告基因活性高于hSTING N154S/R284G tazCTT。对于单独的拟磷酸化hIRF3、hIFNα2T2A hIRF3 S388D和hIRF3 S388D T2A hIFNα2，IFNβ-Lucia报告基因活性高于hSTING N154S/R284G tazCTT。这些结果表明，可以通过表达单个I型IFN信号传导组分以及组成型I型IFN信号传导组分的组合来诱导高水平的I型IFN产生。
通过转染效率标准化小鼠和人IRF3、IFNα2和IFN-β表达
B.含有人IRF3 S396D或小鼠IRF3 S388D、或人或小鼠IFNα2、或人或小鼠IFN-β及其组合的质粒，其中双顺反子构建体含有T2A肽，通过测试在小鼠原代骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)中转染测试所述质粒的表达。
为了测试这些，分离Golden Ticket小鼠骨髓并冲洗到1.5mL Eppendorf管中，并以1200RPM离心5分钟，以收集骨髓细胞。将细胞在RPMI-1640+10％ FBS中洗涤一次，然后在RPMI-1640+10％FBS和20ng/ml GM-CSF中接种到经TC处理的96孔板中。四天后，将非粘附细胞从孔中移出，并在RPMI-1640+10％ FBS中以每孔2e5个细胞重新接种到96孔板中的进行转染。根据制造商的说明，使用RED转染细胞。简而言之，将300ng质粒DNA以及“无DNA”对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.08μL/>RED混合并在室温下温育15分钟，使DNA//>RED复合物形成。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入96孔板的每个孔中(一式两份)，并将板在37℃的CO2培养箱中温育。在48小时收集上清液，并根据制造商的方案使用基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(CBA)测定鼠IFNα、IFN-β、CXCL10(IP-10)和IL-6。
将编码小鼠IRF3 S388D、小鼠IFNα2、小鼠IFN-β的各种单一表达质粒和组合质粒与hSTING N154S/R284GtazCTT质粒进行比较。如下表所示，用构建体mIFNα2、mIFN-β和mIFNα2T2A mIFN-β转染比hSTING N154S/R284G tazCTT具有较高水平的IFN-α和IFN-β。mIFN-β和mIFNα2T2A mIFN-β构建体比hSTING N154S/R284G tazCTT具有较高水平的CXCL10。mIRF3S388D、mIFNα2T2A mIRF3 S388D和mIRF3 S388D T2A mIFNα2构建体与hSTING N154S/R284GtazCTT相比均具有较低水平的IL-6。这些数据证明了通过表达的I型IFN组分的多种组合单独和组合地诱导I型IFN信号传导的能力，以及促炎IL-6的最小诱导。IFN-β的单独表达诱导了所有测试靶标中最高的I型IFN活性。
BMDC中小鼠IRF3、IFNα2和IFN-β转染产生的细胞因子
C.小鼠IFN2T2AIFN-β在小鼠原位乳腺癌模型中体内表达
对于这个实验，将6-8周大的雌性BALB/c小鼠(每组5只小鼠)接种在左侧乳腺脂肪垫中接种EMT6肿瘤细胞(ATCC#CRL-2755)(100μL PBS中的1×106个细胞)。给携带9日龄已建立的乳腺肿瘤(体积约100mm3)的小鼠静脉注射单剂量2×107CFU的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(大清除)菌株，所述菌株含有编码mIFNα2T2A mIFN-β的双顺反子质粒，并与PBS对照相比。
确定肿瘤mIFNα2和mIFN-β相对于肌动蛋白的表达水平，以评估肿瘤特异性有效载荷递送。在IV注射后第4天，切除肿瘤并使用TissueLyser II(Qiagen)在1.2mL RLT加裂解缓冲液中提取RNA。根据制造商的说明，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)收集匀浆用于RNA分离。使用NanoDropTM2000紫外-可见光分光光度计(Thermo Scientific)测量总RNA浓度。每个样品的纯度也通过A260/A230吸收比率进行评估。根据制造商的说明，使用CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad)和iScriptTMg DNA Clear cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)在20μL反应中从0.5-1μg模板RNA合成cDNA。使用CFX96Real-Time System(Bio-Rad)进行qPCR。mIFNα2(qMmuCEP0043629)、mIFNβ1(qMmuCEP0058870)的PrimePCRTMProbe Assay购自Bio-Rad。使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix或iQ MultiplexPowermix(Bio-Rad)按照方案进行qPCR反应(20μL)。在Bio-Rad CFX96 Real-Time System上的标准热循环程序包括95℃变性150秒，然后是95℃进行15秒和60℃进行55秒的39个循环。使用肌动蛋白参考mRNA(Bio-Rad，qMmuCEP0039589)标准化靶mRNA的定量。ΔCq是计算的靶基因和参考基因之间的差异。
数值如下表所示，为五只小鼠(PBS组)或三只小鼠(mIFNα2+mIFN-β组)的平均值。与PBS对照组相比，含有编码mIFNα2和mIFN-β质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(大清除)菌株显著增加了EMT6肿瘤中mIFNα2和mIFN-β基因的表达。
为了测量质粒向肿瘤的递送，以及随后的异源基因表达和蛋白质分泌，测量了这些肿瘤中mIFNα2和mIFN-β蛋白的量。为此，根据制造商的方案，从均质化的肿瘤中收集裂解物，并使用基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(CBA)评估蛋白质表达。
如下表所示，含有编码mIFNα2和mIFN-β的质粒的YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/ΔpurI(大清除)菌株与PBS对照肿瘤相比在每克肿瘤中表现出高水平的mIFNα2和mIFN-β蛋白，证明在IV施用后mIFNα2和mIFN-β有效地递送到肿瘤中。
实施例41
膜结合人和小鼠IL-12在小鼠和人细胞中的表达
小鼠膜结合IL-12p70(SEQ ID NO:466)是用小鼠IL-12p40(SEQ ID NO:399的残基3009-4010)和随后的15个氨基酸接头(SEQ ID NO:480；GGGGSGGGGSGGGGS)和IL-12p35(SEQID NO:399的残基4056-4634)构建的。鼠CD80的跨膜和胞质部分(SEQ ID NO:481；PPEDPPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTV FL)在这个序列之后。人膜结合的IL-12p70(SEQ ID NO:467)是用人IL-12p40(SEQ ID NO:482；MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRC EAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS)构建的，随后是15个氨基酸接头序列(GGGGSGGGGSGGGGS,SEQ ID NO:480)和人IL-12p35(RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTV EACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMD PKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYL NAS,SEQ ID NO:483)。人CD80的跨膜和胞质部分(SEQ ID NO:484；DNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV)在这个序列之后。
将HEK细胞以每孔200,000个细胞接种在聚L-赖氨酸包被的24孔板中，并在37℃、5％ CO2在培养箱中温育过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将300ng每种质粒DNA和40ngCMV-GFP载体(即在CMV启动子控制下编码绿色荧光蛋白的载体)在无血清培养基中稀释并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)，，未转染的孔用作阴性对照(一式两份)。转染后48小时收集每个样品的细胞培养上清液。
使用转染的HEK细胞与HEK-Blue IL-12(InvivoGen)细胞的共培养来评估构建体的活性。转染后24小时，将5e4个HEK细胞分离并接种在96孔TC板中。此外，将5e4个HEK-BlueIL-12细胞接种在相同的孔中。转染后48小时，收集在转染后48小时来自每个样品的细胞培养物上清液。人和小鼠IL-12的生物活性是通过测量SEAP报告基因来确定的，这是测量IL-12与其受体结合下游的STAT-4通路的激活。通过在M3分光光度计(MolecularDevices)上在650nm的吸光度波长下测量ISRE诱导的SEAP活性来确定IL-12生物活性。
构建体的表达结果在下表中提供。鼠和人膜结合的IL-12p70中的每一个都激活HEK-Blue IL-12细胞中的STAT4-SEAP报告基因，其程度至少与可溶的鼠和人IL-12p70相同，从而证实了所述构建体的功能性。
通过转染效率标准化的小鼠和人膜结合的IL-12p70表达
通过流式细胞术测试膜结合的IL-12p70构建体在转染的HEK细胞表面上的表达。使用与上述相同的条件用鼠或人IL-12p70转染HEK野生型细胞，并在转染后48小时收获。将细胞通过PBS分离并接种在V形底96孔板的孔中。将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％FBS洗涤一次。然后将细胞重悬于含有1:10稀释的抗人IL-12p70 APC(Miltenyi)或1:10稀释的抗小鼠IL-12p70APC(Miltenyi)的50μL PBS+2％FBS中，并在冰上避光温育30分钟。将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％FBS洗涤两次，并重悬于以1:6000稀释于PBS+2％FBS中的DAPI中。使用ACEA流式细胞仪(ACEABiosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(TreeStar,Inc.)进行分析。只有1.67％的未转染细胞为APC阳性，而膜结合的人IL-12p70是40.4％阳性的，膜结合的鼠IL-12p70是59.9％阳性的。因此，这些膜结合的IL-12构建体在人细胞上良好表达。
通过在鼠原代骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)中转染来测试含有人或鼠膜结合IL-12p70的质粒的表达。分离野生型小鼠骨髓并冲洗到1.5mL Eppendorf管中，并以1200RPM离心5分钟，以收集骨髓细胞。将细胞在RPMI-1640+10％FBS中洗涤一次，然后接种到96孔经TC处理的板的RPMI-1640+10％ FBS和20ng/ml GM-CSF中。在第3天，将额外的RPMI-1640+10％FBS和20ng/ml GM-CSF加入细胞中。六天后，将非贴壁细胞从孔中移出，并以每孔2e5个细胞重新接种到96孔板中的RPMI-1640+10％ FBS中进行转染。根据制造商的说明，使用RED转染试剂转染细胞。简而言之，将300ng质粒DNA以及“无DNA”(仅转染试剂)对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.08μL/>RED转染试剂混合并在室温下温育15分钟以允许DNA//>RED复合物形成。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入96孔板的每个孔中(一式两份)，并将板在37℃的CO2培养箱中温育。转染后48小时收获细胞，并使用流式细胞术测定IL-12表面表达。
将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％FBS洗涤一次。然后将细胞重新悬浮在50μL PBS+2％ FBS中，其中含有1:10稀释的抗人IL-12p70 APC(Miltenyi)或1:10稀释的抗小鼠IL-12p70APC(Miltenyi)、1:1稀释的CD11bPE、1:200稀释的ClassII APC-Cy7，在冰上避光温育30分钟。将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤两次，并重悬于以1:6000稀释于PBS+2％FBS中的DAPI染色剂中。使用ACEA流式细胞仪(ACEABiosciences，Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(TreeStar，Inc.)进行分析。在树突状细胞群中，只有0.205％±0.021％的未转染细胞和0.685％±0.262％的VCIP IRES CMV NanoLuc转染的细胞为APC阳性，而膜结合人IL-12p70是6.14％±1.27％阳性的，膜结合小鼠IL-12p70是2.64％±0.87％阳性的。这些结果显示在小鼠骨髓树突细胞的表面上检测到高于背景的膜结合的IL-12构建体。
也通过在鼠原代骨髓衍生巨噬细胞(BMM)中的转染来测试含有鼠膜结合IL-12p70的质粒表达。分离野生型小鼠骨髓并冲洗到1.5mL Eppendorf管中，并以1200RPM离心5分钟以收集骨髓细胞。将细胞在RPMI-1640+10％ FBS中洗涤一次，然后接种到24孔TC处理的板的RPMI-1640+10％ FBS和20ng/ml M-CSF中。三天后，吸出培养基并补充20ng/ml M-CSF。根据制造商的说明，使用RED转染试剂转染细胞。简而言之，将750ng质粒DNA以及“无DNA”对照在提供的缓冲液中稀释，并与/>RED转染试剂混合，在室温下温育15分钟以允许DNA//>RED复合物形成。然后将DNA//>RED复合物缓慢加入96孔板的每个孔中(一式两份)，并将板在37℃的CO2培养箱中温育。转染后48小时收获细胞，并分离以使用流式细胞术测定IL-12表面表达。
将细胞用10mM EDTA分离，并通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤一次。然后将细胞重悬于50μL PBS+2％ FBS中，其中含有1:10稀释的抗人IL-12p70 APC(Miltenyi)或1:10稀释的抗小鼠IL-12p70 APC(Miltenyi)、1:10稀释的CD11bPE、1:200稀释的ClassII APC-Cy7，在冰上避光温育30分钟。将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤两次，并重悬于以1:6000稀释于PBS+2％ FBS中的DAPI中。使用ACEA流式细胞仪(ACEABiosciences，Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(TreeStar，Inc.)进行分析。只有0.01％±0.003％的未转染的细胞和0.36％±0.028％的VCIP IRES CMV NanoLuc转染的细胞为APC阳性，而膜结合鼠IL-12p70为1.945％±0.106％。因此，这些膜结合的IL-12构建体在小鼠骨髓巨噬细胞表面上高于背景被检测到。
实施例42
人细胞中DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器的表达
使用抗DLL3抗体SC16.15、SC16.34和SC16.56的氨基酸序列设计DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器(以商标出售)，其靶向在小细胞肺癌中选择性表达的δ样配体3以及含有FLAG标签的CD3+T细胞，参见例如国际专利公开号WO2017/031458A2。这种BiTE构建体的抗CD3臂是从克隆145-2C11设计的。这些抗体是在CMV启动子和3’HPRE的控制下克隆到pATI-1.76载体中的完全鼠序列。对于施用于人，对所述抗体可以适当地进行人源化。序列通过Sanger测序确认。
所得构建体的序列如下所示：
SC16.56 DLL3HLxCD3HL(SEQ ID NO:485)
所述构建体以下列顺序包括：小鼠IgGK前导序列，SC16.56 VH，15个氨基酸GS接头，SC16.56VL，5个氨基酸接头，145-2C11 VH，15个氨基酸GS接头，145-2C11 VL，及Flag标签，如SEQ ID NO:485所示，及以下：
SC16.56 DLL3LHxCD3HL(SEQ ID NO:486)
所述构建体以以下顺序包括：小鼠IgGK前导序列，SC16.56 VL，15个氨基酸GS接头，SC16.56VH，5个氨基酸接头，145-2C11 VH，15个氨基酸GS接头，145-2C11 VL及Flag标签，如SEQ ID NO:486所示，及以下：
SC16.15 DLL3HLxCD3HL(SEQ ID NO:487)
所述构建体以以下顺序包括：小鼠IgGK前导序列，SC16.15 VH，15个氨基酸GS接头，SC16.15VL，5个氨基酸接头，145-2C11 VH，15个氨基酸GS接头，145-2C11 VL，及Flag标签，如SEQ ID NO:487所示，及以下：
SC16.15 DLL3LHxCD3HL(SEQ ID NO:488)
所述构建体以以下顺序包括：小鼠IgGK前导序列，SC16.15 VL，15个氨基酸GS接头，SC16.15VH，5个氨基酸接头，145-2C11 VH，15个氨基酸GS接头，145-2C11 VL，及Flag标签，如SEQ ID NO:488所示，及以下：
SC16.34 DLL3HLxCD3HL(SEQ ID NO:489)
所述构建体以以下顺序包括：小鼠IgGK前导序列，SC16.34 VH，15个氨基酸GS接头，SC16.34VL，5个氨基酸接头，145-2C11 VH，15个氨基酸GS接头，145-2C11 VL，和Flag标签，如SEQ ID NO:489所示，及以下：
SC16.34 DLL3LHxCD3HL(SEQ ID NO:490)
所述构建体以以下顺序包括：小鼠IgGK前导序列，SC16.34 VL，15个氨基酸GS接头，SC16.34VH，5个氨基酸接头，145-2C11 VH，15个氨基酸GS接头，145-2C11 VL，和Flag标签，如SEQ ID NO:490所示，及以下：
/>
前一天，将1.5×106个HEK293T细胞铺板于聚L-赖氨酸包被的6孔板上，以达到80％的汇合度。在转染当天，将3μg DNA在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)中。温育48小时后收集每个样品的细胞培养物上清液。将一些上清液在10kDa旋转柱(Millipore)中浓缩。
这些用DLL3xCD3 BiTE编码质粒转染的细胞的功能通过将细胞上的DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器与表面具有DLL3的SHP77细胞(ATCC)结合来证明。将500,000个SHP77细胞接种在V形底96孔板的孔中。将细胞通过以1300RPM离心3分钟用PBS+2％ FBS洗涤一次。将细胞重新悬浮在50μL PBS+2％ FBS中，其中含有对应于未转染的细胞或用BiTE转染的细胞的浓缩的HEK上清液。30分钟后，将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤两次。然后将细胞重悬于50μL PBS+2％ FBS中，其中含有1:100稀释的抗Flag生物素(Sigma)或1:200稀释的蛋白L生物素(Genscript)，并在冰上温育30分钟。将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤两次。随后，将细胞用1:200稀释的链霉亲和素APC(Biolegend)染色，并在冰上避光温育30分钟。
将细胞通过以1300RPM离心3分钟，用PBS+2％ FBS洗涤两次，并重悬于以1:6000稀释于PBS+2％ FBS中的DAPI中。使用ACEA流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取流式细胞术数据，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Inc.)进行分析。
下表提供了作为APC阳性门控的阳性细胞的百分比，对应于用BiTE染色并通过蛋白L或抗Flag抗体检测的细胞。SC16.56 DLL3LHxCD3HL、SC16.34 DLL3HLxCD3HL和SC16.34DLL3LHxCD3HLBiTE在SHP77细胞上都有类似的检测结果，而其他BiTE未检测到。因此，SC16.56DLL3LHxCD3HL、SC16.34 DLL3HLxCD3HL和SC16.34 DLL3LHxCD3HL结合DLL3。
表达DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器的细胞与DLL SHP77细胞结合
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还使用ELISA评估了表达的DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器与DLL3和CD3的结合。开发此ELISA是为了在同一测定中检测正确折叠的DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器与DLL3和CD3的结合。将人DLL3(R&DSystems)在4℃以1μg/ml的浓度在高蛋白结合96孔板上包被过夜。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，并在室温下用ELISA封闭缓冲液封闭1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次。将含有DLL3xCD3双特异性T细胞衔接器剂的HEK293T细胞培养物上清液加入孔中，并在室温下温育2小时。将孔用0.05％ Tween-20的PBS洗涤次，将人IgG Fc缀合的CD3e加入孔中(AcroBiosystems)，在室温下温育1小时。将孔再次用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人抗体温育1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，并将检测试剂(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，ThermoFisherScientific)加入孔中。用硫酸(BioLegend)终止酶促反应，并在450nm处读取光密度。
下表提供了这个ELISA的结果，以在450nm处的吸光度示出。检测到所有SC16.56DLL3LHxCD3HL、SC16.34 DLL3HLxCD3HL和SC16.34 DLL3LHxCD3HL BiTE抗体，表明这些BiTE抗体是完全功能性的。SC16.34 DLL3LHxCD3HL在这个ELISA中具有最高的结合力，但由于在这个测定中使用了细胞上清液，因此无法区分这是由于这种双特异性T细胞衔接器的浓度较高所致，还是与其他3个双特异性T细胞衔接器相比与其靶标的亲和力更高所致。在单独的实验中，使用ANTI-FLAG M2亲和凝胶(Sigma)纯化所述双特异性T细胞衔接器，并在此ELISA上运行。SC16.34DLL3LHxCD3HL是唯一示出高于背景的ELISA信号的纯化的BiTE。
通过ELISA测定的BiTE结合
实施例43
抗CTLA-4scFv-Fc显示出对CD80/CTLA-4和CD86/CTLA-4相互作用的阻断，并与人STING N154S/R284G tazCTT共同表达
使用伊匹单抗(ipilimumab)的氨基酸序列设计特异于人CTLA-4的scFv-Fc(核酸和蛋白质序列分别参见SEQ ID NO:427和428)。伊匹单抗是一种全人IgG1κ单克隆抗体，特异性结合人CTLA-4(见例如美国专利公开号2002/0086014和美国专利号6,984,720中称作10D1的抗体)，阻断CTLA-4与CD80(也称为B7.1或B7-1)和CD86(也称为B7.2或B7-2)的免疫抑制相互作用。
为产生伊匹单抗scFv抗体片段(参见SEQ ID NO:429)，将伊匹单抗的可变轻链(VL)和可变重链(VH)与长度为20个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸(GS)接头((GGGGS)4)连接。为了产生scFv-Fc抗体片段(参见SEQ ID NO:428)，将伊匹单抗scFv的可变重链与人IgG1 Fc连接，含有铰链区游离半胱氨酸突变为丝氨酸(SEQ ID NO:428的第272位)。前导序列(METPAQLLFLLLLWLPDTTG；对应于SEQ ID NO:428中残基1-20)衍生自人免疫球蛋白κ可变3-20(IGKV3-20)蛋白的序列。使用GenScript GenSmartTM密码子优化工具(ATGGAGACACCTGCCCAGCTGCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCCGACACCACCGGC)对所述序列针对人进行密码子优化；所述序列示于SEQ ID NO:491。
使用竞争性ELISA测定抗CTLA-4scFv-Fc的中和能力，以测量抗体片段阻断CTLA-4与其配体CD80和CD86之间相互作用的能力。将HEK293T细胞用3微克编码抗CTLA-4scFv-Fc抗体片段构建体的DNA转染，使用转染试剂(Promega)，以适当的试剂:DNA比率进行。转染后48小时，收获无HEK293T细胞培养物上清液、过滤，并用于竞争性ELISA以评估抗CTLA-4抗体片段的阻断活性。
对于竞争性ELISA，将人CD80或CD86重组蛋白(R&D Systems)在4℃下以100ng/ml的浓度在高蛋白结合96孔板上包被过夜。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，并在室温下用ELISA封闭缓冲液封闭1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次。将含有每个抗CTLA-4抗体片段的HEK293T细胞培养物上清液与10ng/ml重组人CTLA-4-人IgG1 Fc嵌合体(R&D Systems)混合，加入孔中并在室温下温育2小时。然后将孔用0.05％ Tween-20的PBS洗涤3次，并向孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗人IgG1抗体(JacksonImmunoResearch)，并在室温下温育1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，并将检测试剂(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，Thermo Fisher Scientific)加入孔中。用硫酸(BioLegend)终止酶促反应，并在450nm处读取光密度。
竞争性ELISA的结果总结在下表中。抗CTLA-4scFv-Fc阻断94.14％的CTLA-4与CD86的结合，并阻断83.46％的CTLA-4与CD80的结合。与CD80/CTLA-4阻断活性相比，CTLA4scFv-Fc具有更高程度的CD86/CTLA-4阻断活性。
竞争性ELISA结果
将人抗CTLA4 scFv-Fc(SEQ ID NO:427)克隆到表达载体中，其具有含有或不含血管内皮生长因子和1型胶原诱导蛋白(VCIP)IRES的huSTING N154S/R284G tazCTT。使用HEK293T STING Null细胞(293-DualTM Null Cells；InvivoGen)，其不含内源性STING，表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，置于内源性IFN刺激的应答元件(ISRE)启动子的控制之下，其中使用敲入技术将ISRE的编码序列由SEAP ORF置换。因此，通过监测I型干扰素诱导的SEAP产生来评估STING活性。293-DualTM Null细胞还表达LuciaTM荧光素酶，这是一种分泌型荧光素酶，置于内源性IFN-β启动子的控制之下；使用敲入技术将IFN-β的编码序列由LuciaTM荧光素酶ORF置换。这样可以通过监测IFN-β的表达来评估STING活性。使用这些细胞，可以通过监测ISRE诱导的SEAP产生和/或LuciaTM荧光素酶的IFN-β依赖性表达来评估STING活性。SEAP和LuciaTM萤光素酶这两种报告蛋白可以分别使用标准测定法和检测试剂(例如QUANTI-BlueTM和QUANTI LucTM检测试剂(InvivoGen))在细胞上清液中进行测量。
将细胞以每孔200,000个细胞接种在聚L-赖氨酸包被的24孔板中，并在37℃、5％CO2培养箱中温育过夜，以达到80％的汇合度。第二天，将300ng每种质粒DNA和40ng CMV-GFP载体(即在CMV启动子控制下编码绿色荧光蛋白的载体)在无血清培养基中稀释并以适当的试剂:DNA比率加入转染试剂(Promega)，未转染的孔作为阴性对照(一式两份)。转染后48小时收集每个样品的细胞培养物上清液。
使用ISRE-SEAP和IFN-β-LuciaTM报告系统评估huSTING N154S/R284G tazCTT变体的STING活性。I型干扰素(IFN)活性(由STING诱导)通过监测细胞上清中I型干扰素刺激的SEAP产生来评估。将20μL细胞培养物上清液加入180μL用于测量SEAP的QUANTI-BlueTM试剂(InvivoGen)中。I型干扰素活化是通过在M3分光光度计(Molecular Devices)上测量在650nm吸光度波长的ISRE诱导的SEAP活性来确定的。I型干扰素(IFN)活性(由STING诱导)也通过监测细胞上清中I型干扰素刺激的LuciaTM荧光素酶产生进行评估。将20μL细胞培养物上清液加入到50μLQUANTI-LucTM试剂(InvivoGen)中，该试剂用于测量LuciaTM荧光素酶活性。I型干扰素活化是通过在/>M3分光光度计(Molecular Devices)的发光设置下测量IFNβ诱导的LuciaTM荧光素酶活性来确定的。
还评估了细胞培养物上清液中人CTLA4 scFv-Fc的表达。将人CTLA4(R&DSystems)在4℃以1μg/ml的浓度在高蛋白结合96孔板上包被过夜。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，并在室温下用ELISA封闭缓冲液封闭1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次。将含有抗CTLA4scFv-Fc的HEK293T细胞培养物上清液加入孔中并在室温下温育2小时。将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人抗体温育1小时。然后将孔用PBS 0.05％ Tween-20洗涤3次，并将检测试剂(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，ThermoFisherScientific)加入孔中。用硫酸(BioLegend)终止酶促反应，并在450nm处读取光密度。
人抗CTLA4 scFv-Fc+hSTING N154S/R284G tazCTT构建体的表达结果如下所示。含有两种有效载荷的构建体保留了每种蛋白质的表达。人抗CTLA4 scFv-Fc T2A hSTINGN154S/R284G tazCTT构建体在没有VCIP IRES的情况下具有更好的STING活性。通过ELISA测定抗CTLA4 scFv-Fc从不含VCIP IRES的构建体的表达更高，表明单个靶标可能需要独特的元素来改善表达。
通过转染效率标准化的人抗CTLA4 scFv-Fc+STING表达
/>
实施例44
细菌菌株感染巨噬细胞允许MHC-I分子呈递免疫原性肽
这个实施例表明，本文提供的细菌通过mRNA递送或质粒DNA递送感染抗原呈递细胞，并且所得表达产物由抗原呈递细胞呈递。用于这个论证的抗SIINFEKL/H-2Kb抗体仅在由MHC-I(H-2Kb)呈递在IC21细胞表面时与卵清蛋白SIINFEKL[SEQ ID NO:492]肽特异性结合。这表明本文提供的疫苗株，如编码STING+IL-15受体复合物+癌抗原的疫苗株，可以治疗免疫沙漠瘤，也可以作为新辅助环境下的癌症疫苗，也可以用作为预防性疫苗接种呈递病原体抗原的平台，以及可用于治疗病原体感染，例如MRSA、慢性病毒性肝炎感染、慢性牙龈卟啉单胞菌、HIV和其他慢性感染以及急性感染。
在以上的论证中，本实施例中的实验示出被命名为YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD的示例菌株感染抗原呈递细胞如何导致I类主要组织相容性复合物呈递免疫原性肽(MHC-I)至CD8+T细胞。产生YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株，其在真核CMV启动子和原核MTL启动子控制下编码鸡卵清蛋白，具有或不具有脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(IRES)。鸡卵清蛋白是一种模型抗原，监测来自鸡卵清蛋白的免疫显性SIINFEKL肽由小鼠H-2Kb MHC-I分子在抗原呈递细胞表面的呈递情况。小鼠腹膜巨噬细胞系IC21(ATCC)用作测定中的抗原呈递细胞。
将96孔平底板的每孔5万个IC21细胞接种在100μl RPMI 10％ FBS中，并在37℃和5％ CO2培养箱中过夜。第二天，将IC21细胞用YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD菌株感染，所述菌株含有在CMV或MTL启动子调节下编码鸡卵清蛋白的质粒。将细菌菌株加入到培养的细胞中，并将平板在室温下以500g离心5分钟。然后将细胞在37℃下温育1小时，并加入含有庆大霉素的培养基，使终浓度为50μg/ml。将感染细胞在37℃和5％ CO2培养箱中放置7小时。感染7小时后，使用PBS10mM EDTA分离IC21细胞，并用抗鼠F4/80APC缀合的抗体和抗SIINFEKL/H-2Kb PE缀合的抗体(均来自Biolegend)染色，并使用ACEA Novocyte流式细胞仪获取数据。
只有当由MHC-I(H-2Kb)在IC21细胞表面呈递时，抗SIINFEKL/H-2Kb抗体才会特异性结合卵清蛋白SIINFEKL肽。测量感染后7小时IC21细胞呈递H-2Kb/SIINFEKL的平均荧光强度。结果显示在下表中，其显示了在用卵清蛋白编码菌株处理的组中观察到的超过未感染细胞的净平均荧光强度(净MFI)。
/>
*SEM＝平均值的标准差
这个实施例示出菌株例如YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD递送由抗原呈递细胞处理的抗原并在递送时呈递给CD8+T细胞的能力，从而产生针对病原体或癌细胞相关的或来自之中的抗原的T细胞特异性应答。
由于修改对本领域技术人员来说是显而易见的，因此本发明旨在仅由所附权利要求的范围限制。

Claims (393)

1.一种免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中所述细菌包含基因组修饰，由此该细菌不产生活性胸苷酸合酶，并且需要生长补充剂。
2.权利要求1的免疫刺激细菌，其中所述生长补充剂包括胸腺嘧啶、胸腺嘧啶衍生物、胸苷、胸苷衍生物、胸腺嘧啶前体、胸苷前体或胸苷一磷酸前体。
3.权利要求1或权利要求2的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含减少或消除TLR2及任选TLR4和/或TLR5的活化的基因组修饰。
4.免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中：
所述细菌包含基因组修饰，由此该细菌不分泌活性天冬酰胺酶；和
所述细菌包含减少或消除TLR2及任选TLR4和/或TLR5活化的基因组修饰。
5.权利要求1至4任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏或修饰编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌是ansB-并且不表达活性L-天冬酰胺酶II。
6.免疫刺激细菌，其包含减少或消除TLR2活化的基因组修饰，由此I型IFN的诱导不被TLR2抑制，其中：
所述免疫刺激细菌包含基因组修饰，由此其不能在体内复制，但在体外并补充营养生长时可以复制；和
所述基因组修饰消除或失活胸苷酸合酶，由此所述细菌是thyA-。
7.免疫刺激细菌，其包含减少或消除TLR2活化的基因组修饰，由此I型IFN的诱导不被TLR2抑制，其中所述免疫刺激细菌包含编码干扰素、或编码组成型诱导I型干扰素的修饰的STING蛋白及并编码来自病原体或肿瘤的抗原或蛋白质的质粒。
8.免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中：
所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌被修饰以产生具有五酰化脂质A的脂多糖(LPS)；
与野生型细菌相比，具有六酰化脂质A的脂多糖显著减少至少10倍，或者不存在；
所述细菌的基因组被修饰为必需营养素的营养缺陷型；
所述细菌的基因组被修饰，由此细菌本身不抑制或阻止在感染的免疫细胞中I型干扰素(IFN)的诱导；和
所述细菌的基因组被修饰，由此其不编码或产生活性天冬酰胺酶和/或胸苷酸合酶。
9.免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中：
所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此细菌被修饰以产生具有五酰化脂质A的脂多糖(LPS)；
与野生型细菌相比，具有六酰化脂质A的脂多糖显著减少至少10倍，或者不存在；和
所述细菌的基因组被修饰，由此其不产生活性胸苷酸合酶，因此所述细菌是thyA-。
10.免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中：
所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此该细菌缺少鞭毛；
未修饰的免疫刺激细菌具有鞭毛；和
所述细菌的基因组被修饰，由此其不产生活性胸苷酸合酶。
11.权利要求9或权利要求10的免疫刺激细菌，其中基因组修饰包括缺失、插入和/或置换，由此所述细菌是thyA-。
12.权利要求1至11任一项的免疫刺激细菌，其中所述基因组被修饰使得所述细菌缺少卷曲菌毛。
13.权利要求1至12任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含减少或消除TLR4和/或TLR5活化的基因组修饰。
14.权利要求1至13任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述基因组修饰导致细菌不具有鞭毛；和
所述细菌的野生型有鞭毛。
15.权利要求1至14任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌不产生卷曲菌毛。
16.权利要求1至15-任一项的免疫刺激细菌，其中所述基因组修饰产生五酰化脂多糖。
17.权利要求1至16任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌没有鞭毛并且是msbB-/pagP-。
18.一种免疫刺激细菌，其包含减少或消除TLR2活化的基因组修饰，由此I型IFN的诱导不被TLR2抑制，其中：
所述免疫刺激细菌可在真核宿主体内复制；和
所述免疫刺激菌包含编码肿瘤相关抗原、或编码肿瘤抗原和STING蛋白、或编码肿瘤相关抗原和干扰素α、或编码肿瘤相关抗原和干扰素β的质粒。
19.权利要求1至18任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌编码STING蛋白，其是修饰的STING蛋白，与未修饰的人STING蛋白相比具有增加的I型干扰素诱导。
20.权利要求19的免疫刺激细菌，其中所述修饰的STING蛋白是根据权利要求406至431任一项的修饰的STING蛋白。
21.权利要求20的免疫刺激细菌，其中所述修饰的STING蛋白包含置换N154S/R284G。
22.权利要求1至21任一项的免疫刺激细菌，其中在所述质粒中编码的治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或者编码的产物是干扰素-α或干扰素-β，或编码的产物既是IFN-α又是IFN-β。
23.权利要求22的免疫刺激细菌，其中作为导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的治疗产物是STING蛋白。
24.权利要求1至23任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码来自病原体或肿瘤的抗原、表位或蛋白质。
25.一种免疫刺激细菌，其包含编码异源产物组合的质粒，其中：
所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此该细菌具有减弱的TLR2及任选TLR4和TLR5之一或两者的识别；
一种产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分；和
第二产物是抗原、表位或来自抗原的表位，或者是用于针对病原体或肿瘤进行免疫的蛋白质。
26.权利要求25的免疫刺激细菌，其中所述细菌的基因组被修饰，由此所述细菌不具有卷曲菌毛。
27.一种免疫刺激细菌，其包含可操作地连接至原核启动子的核酸，其中：
所述核酸编码缺少原核生物翻译所必需的序列的RNA，由此所述RNA是在细菌中产生的；和
所述编码的RNA缺少Shine-Dalgarno序列，和/或包含内部核糖体进入位点(IRES)，和/或翻译通读2A肽。
28.一种免疫刺激细菌，其包含可操作地连接至原核启动子的核酸，其中所述核酸包含缺少原核生物翻译所必需的序列的RNA。
29.权利要求28的免疫刺激细菌，其中所述RNA缺少Shine-Dalgarno序列。
30.权利要求27至29任一项的免疫刺激细菌，其中所述2A肽是T2A、P2A、E2A或F2A中的一种或多种。
31.权利要求1至30任一项的免疫刺激细菌，其中：
编码治疗产物的核酸可操作地连接至原核启动子，其中：
所述核酸编码缺少原核生物翻译所必需的序列的RNA，由此所述RNA在细菌中产生，其中：
所述RNA缺少Shine-Dalgarno序列，且包含内部核糖体进入位点(IRES)，或翻译通读2A肽。
32.权利要求27至31任一项的免疫刺激细菌，其中所述原核启动子是细菌启动子或噬菌体启动子。
33.权利要求32的免疫刺激细菌，其中所述启动子是噬菌体启动子。
34.权利要求32或权利要求33的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌编码噬菌体RNA聚合酶。
35.权利要求32的免疫刺激细菌，其中所述启动子选自分别包含SEQ ID NO:393-396任一的启动子：
attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtataatgcagcaag，或
ttatgcttgacgctgcgtaaggtttttgttataatacaccaag，或
attatgtcttgacatgtagtgagtgggctggtaaatgcagcaag，或
gatcccggagttcatgcgtgatgcaatgaaagtgccgttctacttcggtgggacctcactgcttatcgttgttgtcgtgattatggactttatggctcaagtgcaaactctgatgatgtccagtcagtatgagtctgcattgaagaaggcgaacctgaaaggctacggccgttaattggtcgcctgagaagttacggagagtaaaaatgaaagttcgtgcttccgtcaagaaattatgccgtaactgcaaaatcgttaagcgtgatggtgtcatccgtgtgatttgcagtgccgagccgaagcataaacagcgccaaggctgattttttcgcatatttttcttgcaaagttgggttgagctggctagattagccagccaatcttttgtatgtctgtacgtttccatttgagtatcctgaaaacgggcttttcagcatggtacgtacatattaaatagtaggagtgcatagtggcccgtatagcaggcattaacattcctgatcagaaacacgccgtgatcgcgttaacttcgatctacggtgtcggcaagacccgttctaaagccatcctggctgcagcgggtatcgctgaaaatgttaagatcctctagatttaagaaggagatatacat(Salmonella rpsm启动子)。
36.权利要求27至35任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌包含基因组修饰，由此所述细菌感染组织驻留的骨髓细胞，而不感染上皮细胞。
37.权利要求36的免疫刺激细菌，其中：
所述细菌缺少鞭毛；和
没有所述基因组修饰的细菌包含鞭毛。
38.一种免疫刺激细菌，其包含编码治疗产物的质粒，其中所述细菌感染巨噬细胞将人M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型巨噬细胞。
39.权利要求38的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分。
40.权利要求39的免疫刺激细菌，其中I型IFN的表达是组成型的。
41.权利要求39或权利要求40的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是作为胞质DNA/RNA传感器通路的一部分的治疗产物的功能获得(GOF)变体，其中所述变体GOF产物不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸来导致I型IFN的表达。
42.权利要求39至41任一项的免疫刺激细菌，其中所述产物是变体STING蛋白。
43.权利要求38至42任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌的感染将人M2巨噬细胞转化为M1样I型IFN生产细胞。
44.权利要求1至43任一项的缺少鞭毛的免疫刺激细菌，其中所述野生型细菌具有鞭毛，并且是pagP-/msbB-。
45.权利要求44的免疫刺激细菌，其是沙门氏菌菌株。
46.权利要求1至45任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是抗癌治疗剂。
47.权利要求1至45任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是抗病毒治疗剂或抗病原体细菌治疗剂。
48.权利要求47的免疫刺激细菌，其中所述抗病毒治疗剂抑制病毒酶或抑制病毒复制。
49.权利要求47的免疫刺激细菌，其中所述治疗剂是病毒抗原抗病毒治疗剂，其表达导致针对病毒的免疫保护应答，或者所述抗病毒治疗剂是结合病毒抗原或与其相互作用的抗体，从而抑制或阻断病毒，或产生抗病毒免疫。
50.权利要求47的免疫刺激细菌，其中所述治疗剂是细菌抗原抗菌治疗剂，其表达导致针对细菌病原体的免疫保护应答，或者所述抗菌治疗剂是结合细菌抗原或与其相互作用的抗体，从而抑制或阻断病原菌，或产生抗病原菌免疫。
51.权利要求47至50任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌编码用于治疗引起持续感染的病毒或感染原的抗病毒治疗剂。
52.权利要求47至49和51任一项的免疫刺激细菌，其中所述抗病毒治疗剂是病毒抗原或抗原表位，并且所述抗原包含病毒表面蛋白，或病毒核衣壳蛋白，或病毒非结构蛋白，或病毒开放读框蛋白。
53.权利要求51的免疫刺激细菌，其中所述病毒或感染原引起慢性感染。
54.权利要求51的免疫刺激细菌，其中所述病毒或感染原引起潜伏感染。
55.权利要求51的免疫刺激细菌，其中所述病毒或感染原引起缓慢感染。
56.权利要求51的免疫刺激细菌，其中所述病毒或感染原选自T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、麻疹病毒、乳多空病毒、朊病毒、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒、腺病毒、细小病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、轮状病毒、黄热病病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和乳头瘤病毒。
57.权利要求51的免疫刺激细菌，其中所述病毒是HIV或肝炎病毒。
58.权利要求51的免疫刺激细菌，其中所述感染原是朊病毒或原生动物。
59.权利要求47至58任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是足以在宿主中产生免疫应答的病毒表面抗原或其部分。
60.权利要求51至59任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物干扰病毒基因表达或复制。
61.权利要求1至60任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌编码免疫刺激蛋白。
62.权利要求61的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激蛋白是干扰素基因刺激因子(STING)蛋白、修饰的STING蛋白、细胞因子、趋化因子或共刺激受体或配体。
63.权利要求1至62任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含基因组修饰，由此缺少鞭毛。
64.权利要求1至63任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌包含基因组修饰，由此其是pagP-或msbB-/pagP-。
65.权利要求1至64任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述细菌包含细菌基因组修饰，由此其不表达天冬酰胺酶或不激活分泌的天冬酰胺酶的合成；和/或
通过缺失或破坏编码L-天冬酰胺酶II的ansB基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此该细菌是ansB-并且不表达活性L-天冬酰胺酶II。
66.权利要求65的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌是在肿瘤和/或肿瘤微环境中定植的抗癌治疗剂，由此ansB-表型减少或消除活性天冬酰胺酶的产生。
67.一种免疫刺激细菌，其包含可操作地连接至原核启动子的核酸，其中：
所述核酸包含缺少原核生物翻译所必需的序列的RNA，由此所述RNA在细菌中产生，但不能被细菌翻译；
所述细菌具有基因组修饰，因此感染仅限于骨髓细胞；和
所述RNA编码治疗产物或者其是治疗产物。
68.一种RNA递送系统，其包含主要或单独感染骨髓细胞的免疫刺激细菌，并且包含所述细菌在原核启动子控制下编码的RNA，其中：
所述RNA缺少细菌翻译所必需的调节序列；和
所述RNA编码治疗产物或者其是治疗产物。
69.权利要求67的免疫刺激细菌或权利要求68的RNA递送系统，其中所述转录的RNA缺少Shine-Dalgarno序列。
70.权利要求67的免疫刺激细菌或权利要求68的RNA递送系统，其中所述转录的RNA缺少Shine-Dalgarno序列并且包含Kozak共有序列。
71.权利要求70的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中所述Kozak共有序列是ACCAUGG(SEQ ID NO:397)。
72.权利要求67至70任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中所述细菌缺少鞭毛并且含有基因组修饰，由此其是pagP-/msbB-。
73.权利要求67至72任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中编码所述治疗产物的RNA或其是治疗产物的RNA是在质粒上编码的。
74.权利要求67至73任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中编码RNA的核酸可操作地连接至可诱导的原核启动子。
75.权利要求67至73任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中编码RNA的核酸可操作地连接至组成型的原核启动子。
76.权利要求67至75任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中编码RNA的核酸包含内部核糖体进入位点(IRES)。
77.权利要求1至76任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中通过缺失或破坏编码L-天冬酰胺酶II的ansB基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌是ansB-并且不表达活性L-天冬酰胺酶II。
78.权利要求1至77任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中通过缺失或破坏编码L-天冬酰胺酶II的基因ansB的全部或足够部分以及通过缺失或破坏基因csgD的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌是ansB-且不表达活性L-天冬酰胺酶II，并且是csgD-且不激活卷曲菌毛的合成。
79.权利要求1至78任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中所述细菌基因组还包含编码鞭毛的基因的全部或足够部分的缺失或破坏，由此所述细菌是鞭毛蛋白-且不产生鞭毛，其中野生型细菌具有鞭毛。
80.权利要求79的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中所述细菌的基因组通过缺失或破坏基因csgD的全部或足够部分而进一步修饰，由此所述细菌是csgD-或在基因组中具有另一种或另外的修饰，由此生物膜形成受到损害。
81.权利要求79的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中所述细菌的基因组通过缺失或破坏全部或足够部分的基因而进一步修饰，由此所述细菌是csgD-/msbB-/pagP-。
82.权利要求69至81任一项的免疫刺激细菌或RNA递送系统，其中所述细菌包含基因组修饰，由此所述细菌缺少鞭毛。
83.一种免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌缺少鞭毛，并且是lppA-/lppB-，及任选是csgD-。
84.权利要求1至83任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是嘌呤营养缺陷型的。
85.权利要求1至83任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是腺苷营养缺陷型的或者是腺苷、腺嘌呤和ATP营养缺陷型的。
86.权利要求1至85任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是purI-。
87.权利要求1至86任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是pagP-。
88.权利要求1至87任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是asd-或thyA-或这两者。
89.权利要求1至88任一项的免疫刺激细菌，其是天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)，其中所述细菌由于编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的全部或部分破坏或缺失而呈asd-，由此不表达内源性asd或不产生功能性酶，或者由于全部或部分内源性基因的破坏或缺失而呈thyA-，由此不表达内源性胸苷酸合酶或不产生功能性酶。
90.一种天冬氨酸-半醛脱氢酶-(asd-)免疫刺激细菌，其中：
所述细菌由于编码天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的内源基因的全部或部分破坏或缺失而呈asd-，由此不表达内源性asd或不产生功能性酶；和
所述细菌由于内源基因的全部或部分的破坏或缺失而呈thyA-，由此不表达内源胸苷酸合酶或不产生功能性酶。
91.权利要求90的免疫刺激细菌，其中所述未修饰的细菌是沙门氏菌。
92.权利要求1至91任一项的免疫刺激细菌，其在细菌启动子的控制下在质粒上编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。
93.权利要求1至92任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是msbB-。
94.权利要求1至93任一项的免疫刺激细菌，其是asd-，purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-。
95.权利要求1至94任一项的免疫刺激细菌，其是asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-；或thyA-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-。
96.权利要求1至95任一项的免疫刺激细菌，其是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-；或ansB-、thyA-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-。
97.权利要求1至96任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是抗癌治疗剂。
98.权利要求1至97任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码修饰的STING和IL-15或IL-15/IL-15Rα链复合物，其中STING在不存在cGAS和/或任何STING配体的情况下组成型诱导I型IFN。
99.权利要求1至98任一项的免疫刺激细菌，其中所述细菌是ansB-、thyA-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-。
100.权利要求1至99任一项的免疫刺激细菌，其中编码治疗产物的核酸可操作地连接至编码分泌信号的核酸，由此当表达时，所述治疗产物被分泌。
101.权利要求1至100任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是抗病毒产物。
102.权利要求1至100任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码的治疗产物是病毒抗原。
103.权利要求100至102任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码的治疗产物是抗病毒抗体。
104.权利要求100至103任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述编码的治疗产物是抗病毒产物；和
所述选择的病毒是引起慢性感染或潜伏感染的病毒。
105.权利要求100至104任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述编码的治疗产物是抗病毒产物；和
所述病毒选自肝炎病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、痘病毒、麻疹病毒和逆转录病毒。
106.权利要求1至105任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒的拷贝数大于150。
107.权利要求1至105任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒的拷贝数为150个拷贝或更少，或者小于或等于150个。
108.权利要求1至105任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒以低拷贝数存在，并且所述低拷贝数是小于25或小于20或小于约25或小于约20个拷贝。
109.权利要求1至108任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是核酸或蛋白质。
110.权利要求109的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是蛋白质。
111.权利要求1至110任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码两种或更多种治疗产物。
112.权利要求109至111任一项的免疫刺激细菌，其中在质粒上编码的治疗产物是抗癌治疗剂。
113.权利要求109至111任一项的免疫刺激细菌，其中在质粒上编码的治疗产物是抗病毒治疗剂。
114.权利要求112或权利要求113的免疫刺激细菌，其中所述细菌编码两种或更多种选自细胞因子、组成型诱导I型IFN的蛋白质和共刺激受体或分子的产物。
115.权利要求114的免疫刺激细菌，其中所述共刺激分子缺少细胞质结构域。
116.权利要求1至115任一项的免疫刺激细菌，其中编码一种或多种治疗产物的核酸包含编码用于从包含所述细菌的细胞分泌治疗产物的信号的核酸。
117.权利要求1至116任一项的免疫刺激细菌，其中在质粒上编码所述产物的核酸可操作地连接至真核宿主识别的调节序列。
118.权利要求1至117任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌编码两种或更多种产物，并且每种产物的表达处于单独启动子的控制之下，或者所有的表达处于单个启动子的控制之下，并且每种产物被编码2A肽的核酸分开，以实现每个编码的治疗产物的单独翻译。
119.权利要求118的免疫刺激细菌，其中所述核酸编码T2A、F2A、E2A或P2A肽以实现在单一启动子控制下表达的治疗产物的单独表达。
120.权利要求1至119任一项的免疫刺激细菌，其中所述真核启动子是RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子。
121.权利要求120的免疫刺激细菌，其中所述启动子是RNA聚合酶II启动子，其是病毒启动子或哺乳动物RNA聚合酶II启动子。
122.权利要求121的免疫刺激细菌，其中所述启动子是选自巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、Epstein Barr病毒(EBV)启动子、疱疹病毒启动子和腺病毒启动子的病毒启动子。
123.权利要求1至121任一项的免疫刺激细菌，其中控制质粒上一种或多种编码的治疗产物或异源蛋白质表达的启动子是延伸因子-1(EF-1)α启动子，或MND启动子，或UBC启动子，或PGK启动子，或CAG启动子。
124.权利要求1至121任一项的免疫刺激细菌，其中控制质粒上一种或多种编码的治疗产物或异源蛋白表达的启动子是EF-1α、腺病毒2或5晚期启动子、CMV、SV40、MND、PGK、EIF4A1、CAG或CD68启动子。
125.权利要求1至121任一项的免疫刺激细菌，其中控制质粒上一种或多种编码的治疗产物或异源蛋白质表达的启动子是病毒启动子，其是晚期启动子。
126.权利要求1至125任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含调节序列，所述调节序列包含选自SV40、hGH、BGH、MND、鸡β-球蛋白和rbGlob(兔球蛋白)基因的终止子和/或启动子，以控制治疗产物的表达。
127.权利要求1至126任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码的治疗产物可操作地连接至用于从含有质粒的细胞中分泌的信号序列。
128.权利要求1至127任一项的免疫刺激细菌，其中编码治疗产物的质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、编码治疗产物或异源蛋白质的开放读框，和polyA尾区。
129.权利要求1至128任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、IRES、编码治疗产物或异源蛋白质的开放读框，和polyA尾区。
130.权利要求1至129任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒包含构建体，所述构建体包括增强子、启动子、IRES、定位序列、编码治疗产物或异源蛋白的开放读框，以及polyA尾区。
131.权利要求130的免疫刺激细菌，其中编码治疗产物或异源蛋白质的质粒上的构建体包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)或乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
132.权利要求1至131任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒含有编码治疗产物的核酸，所述治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或所述治疗产物的变体。
133.权利要求132的免疫刺激细菌，其中未修饰形式的治疗产物直接或间接感知胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸或与其相互作用，以诱导I型IFN的表达，并且所述变体蛋白在不存在感应或与胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸相互作用的情况下诱导I型IFN表达。
134.权利要求132的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是当在受试者中表达时导致I型IFN的组成型表达的变体。
135.权利要求132的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是功能获得(GOF)变体，其不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸来导致I型IFN的表达。
136.权利要求1至135任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-5、IRF-7、IRF-8、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
137.权利要求1至135任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
138.权利要求132至137任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是具有增加的活性或导致I型干扰素(IFN)的组成型表达的变体。
139.权利要求1至138任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码在人体中促进或引起干扰素病的蛋白质的功能获得性、组成型活性变体。
140.权利要求132至139任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是包含突变的变体，所述突变消除所述蛋白质中的磷酸化位点从而减少活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导。
141.权利要求132至140任一项的免疫刺激细菌，其中诱导I型IFN的治疗产物是STING、RIG-I、IRF-3或MDA5；或者其中诱导I型IFN的治疗产物是IRF-5或IRF-8。
142.权利要求132至141任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述诱导I型IFN表达的治疗产物是其具有增加的活性或组成型活性的变体；和
所述治疗产物是STING、RIG-I、IRF-3、IRF-5、IRF-8或MDA5。
143.权利要求132至142任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是STING、RIG-1、IRF-3、IRF-5、IRF-8或MDA5的变体，其包含导致I型干扰素的表达增加的功能获得性突变。
144.权利要求132至143任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是STING、RIG-I、IRF-3、IRF-5、IRF-8或MDA5的变体，其中由于病毒感染而磷酸化的一个或多个丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基被天冬氨酸(D)置换，由此产生的变体是组成型诱导I型干扰素的拟磷酸化物。
145.权利要求132至144任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述治疗产物是IRF-3，其在参考SEQ ID NO:312的位置396、398、402、404和405的残基有一或多个置换；和
所述残基被天冬氨酸残基置换。
146.权利要求145的免疫刺激细菌，其中IRF-3包含参考SEQ ID NO:312的置换S396D。
147.权利要求145的免疫刺激细菌，其中IRF-3包含参考SEQ ID NO:312的置换S396D/S398D/S402D/T404D/S405D。
148.权利要求132至147任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-7、IRF-5、IRF-8、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60和SNRNP200。
149.权利要求132至148任一项的免疫刺激细菌，其中：
感知胞质DNA/RNA的治疗产物是变体STING、MDA5、RIG-I或IRF-3；和
未修饰的STING具有SEQ ID NO:305-309任一所示序列，未修饰的MDA5具有SEQ ID NO:310所示序列，未修饰的RIG-I具有SEQ ID NO:311所示序列，并且未修饰的IRF-3具有SEQID NO:312所示序列。
150.权利要求132至149任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物选自STING、MDA5、IRF-3和RIG-I，并且包含使STING、MDA5、IRF-3、IRF-5、IRF-8或RIG-I具有组成型活性的功能获得性突变，由此I型IFN的表达是组成型的。
151.权利要求149或权利要求150的免疫刺激细菌，其中所述突变选择如下：
a)在STING中，参考SEQ ID NO:305-309，选自以下的一或多个突变：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A，N154S/R284G，和S324A/S326A；
b)在MDA5中，参考SEQ ID NO:310，选自以下的一或多个突变：T331I，T331R，A489T，R822Q，G821S，A946T，R337G，D393V，G495R，R720Q，R779H，R779C，L372F，和A452T；
c)在RIG-I中，参考SEQ ID NO:311，选自E373A和C268F之一或这两个突变；及
d)在IRF-3中，参考SEQ ID NO:312的突变S396D。
152.权利要求132至151任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是变体STING，其含有参考SEQ ID NO:305-309选自以下的一或多个氨基置换：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A，N154S/R284G，和S324A/S326A，及其保守置换。
153.权利要求114和132至152任一项的免疫刺激细菌，其中所述I型IFN是干扰素-α或干扰素-β。
154.权利要求1至153任一项的免疫刺激细菌，其编码双特异性抗体。
155.权利要求154的免疫刺激细菌，其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞衔接剂。
156.权利要求1至155任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码结合DLL3和CD3的双特异性T细胞衔接蛋白抗体。
157.权利要求156的免疫刺激细菌，其中所述双特异性T细胞衔接蛋白抗体包含抗DLL3抗体和抗CD3抗体的重链和轻链。
158.权利要求156或157的免疫刺激细菌，其中所述双特异性T细胞衔接蛋白抗体选自在命名为SC16.15、SC16.34和SC16.56的构建体中编码的抗体，其编码结合DLL3和CD3中的每一个的抗体的可变重链和可变轻链，其序列如SEQ ID NO:485-491所示，或其人源化变体，以及与其具有至少95％序列相同性的变体。
159.权利要求157或权利要求158的免疫刺激细菌，其中所述双特异性T细胞衔接蛋白抗体包含a)至f)的组合，由此所得构建体可以结合DLL3和CD3中的每一个：
a)包含SEQ ID NO:487的氨基酸残基154-260的轻链，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
b)包含SEQ ID NO:487的氨基酸残基22-138所示氨基酸残基序列的重链，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
c)包含SEQ ID NO:489的氨基酸残基155-261所示氨基酸残基序列的轻链，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
d)包含SEQ ID NO:489的氨基酸残基22-139所示氨基酸残基序列的重链，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
e)重链和轻链，其中：
所述轻链包含SEQ ID NO:485的氨基酸残基155-261所示氨基酸残基序列，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
所述重链包含SEQ ID NO:485的氨基酸残基22-139所示氨基酸残基序列，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
f)抗CD3抗体的重链和轻链，其中：
抗-CD3抗体的轻链包含SEQ ID NO:485的氨基酸残基398-504所示氨基酸残基序列，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体；和
抗CD3抗体的重链包含SEQ ID NO:485的氨基酸残基267-382所示氨基酸残基序列，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体。
160.权利要求156至159任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码的双特异性T细胞衔接蛋白抗体构建体包含前导序列。
161.权利要求160的免疫刺激细菌，其中所述前导序列是IgGK前导序列。
162.权利要求156至161任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述双特异性抗体包含连接一或多个轻链和重链的Gly-Ser接头；和
Gly-Ser接头连接双特异性T细胞衔接蛋白抗体的抗DLL3和抗CD3部分。
163.权利要求162的免疫刺激细菌，其中所述接头包含SEQ ID NO:485的残基383-397所示氨基酸序列。
164.权利要求156至163任一项的免疫刺激细菌，其中所述双特异性T细胞衔接蛋白抗体包含标记标签。
165.权利要求164的免疫刺激细菌，其中所述标记标签包含SEQ ID NO:485的残基505-512所示氨基酸序列。
166.权利要求156至165任一项的免疫刺激细菌，其包含编码前导序列、抗DLL抗体的重链和轻链以及抗CD3抗体的重链和轻链的核酸构建体，及任选的一或多个肽接头，以及任选的标记标签。
167.如权利要求156至166任一项的免疫刺激细菌，其中所述编码的双特异性T细胞衔接蛋白抗体构建体包含SEQ ID NO:485-491任一所示的氨基酸残基序列，或其人源化变体，或与其具有至少95％序列相同性的变体，以及与其具有至少95％序列相同性的序列。
168.权利要求1至167任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码肿瘤相关抗原。
169.权利要求1至168任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌编码组成型诱导I型干扰素的修饰的STING蛋白。
170.权利要求169的免疫刺激细菌，其中所述STING蛋白包含置换N154S、或R284G、或N154S/R284G。
171.根据权利要求1至170任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码IL-15或IL-15/IL-15Rα链复合物。
172.权利要求1至171任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码修饰的STING、IL-15/IL-15Rα链复合物、肿瘤相关抗原和/或双特异性T细胞衔接蛋白抗体的组合。
173.权利要求1至172任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码在肿瘤微环境中赋予或促成抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白，其选自以下的一或多种：IL-2，IL-7，IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)，IL-15，与IL-2Ra结合减弱的IL-2，IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15Rα-IL-15sc)，IL-18，IL-21，IL-23，IL-36γ，修饰后不结合IL-2Ra的IL-2，CXCL9，CXCL10，CXCL11，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，CCL3，CCL4，CCL5，参与或实现或加强T细胞募集和/或持续存在的蛋白质，CD40，CD40配体(CD40L)，CD28，OX40，OX40配体(OX40L)，4-1BB，4-1BB配体(4-1BBL)，B7-CD28家族成员，CD47拮抗剂，抗IL-6抗体或IL-6结合诱饵受体，TGF-β多肽拮抗剂和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。
174.权利要求173的免疫刺激细菌，其中：
所述免疫刺激蛋白是选自CD40、CD40配体(CD40L)、CD28、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB和4-1BB配体(4-1BBL)的共刺激分子，其任选被截短并且缺少在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域；和
所述截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于胞质结构域缺失而无法向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
175.权利要求173或权利要求175的免疫刺激细菌，其中在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白是细胞因子或趋化因子。
176.权利要求173至175任一项的免疫刺激细菌，其中在肿瘤微环境中赋予或促成抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白是共刺激分子或其胞质结构域缺失形式。
177.权利要求176的免疫刺激细菌，其中在肿瘤微环境中赋予或促成抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白选自4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、CD24L、B7RP1和OX40L。
178.权利要求1至177任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码是TGF-β多肽拮抗剂的治疗产物。
179.权利要求1至178任一项的免疫刺激细菌，其中所述治疗产物是抗体或其抗原结合片段。
180.如权利要求179的免疫刺激细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、纳米抗体、双抗体片段和单链抗体的抗原结合片段。
181.权利要求179或权利要求180的免疫刺激细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或人抗体或其抗原结合片段。
182.权利要求179至181任一项的免疫刺激细菌，其中所述抗体或其抗原结合片段是PD-1、PD-L1、CTLA-4、VEGF、VEGFR2、CD24或IL-6的拮抗剂。
183.权利要求1至182任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码选自以下的两种或更多种治疗产物：
a)在肿瘤微环境中赋予或促进抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白；
b)一种或多种蛋白质，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或其具有增加I型干扰素表达的活性的变体，或其导致I型干扰素的组成型表达的变体；和
c)抗癌抗体或其抗原结合部分。
184.权利要求183的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激蛋白是缺少用于在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其足够部分的共刺激分子，由此截短的共刺激分子能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且无法向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
185.一种免疫刺激细菌，其包含在单个启动子控制下编码两种或多种治疗产物的质粒，其中：
所述治疗产物选自：
a)在肿瘤微环境中赋予或促进抗肿瘤免疫应答的免疫刺激蛋白；
b)一种或多种蛋白质，其是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分，或其具有增加I型干扰素表达的活性的变体，或其导致I型干扰素的组成型表达的变体；和
c)抗癌抗体或其抗原结合部分；和
所述编码核酸由IRES序列或2A肽分开，并且编码每种产物的每个核酸任选可操作地连接至编码信号序列的核酸，由此在编码的mRNA翻译后，每种产物分别从包含所述细菌和/或质粒的细胞中表达和分泌。
186.权利要求185的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激蛋白是缺少用于在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域或其足够部分的共刺激分子，由此截短的共刺激分子能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且无法向抗原呈递细胞(APC)发出反调节信号。
187.权利要求1至186任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码至少两种治疗产物，所述治疗产物选自细胞因子、组成型诱导I型IFN的蛋白质、共刺激分子和抗癌抗体或其抗原结合部分。
188.权利要求1至187任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌包含编码至少两种治疗产物的质粒，所述治疗产物选自细胞因子、组成型诱导I型IFN的蛋白质、共刺激分子，和抗癌抗体或其抗原结合部分，并且还编码抗原或抗原蛋白。
189.权利要求188的免疫刺激细菌，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
190.权利要求189的免疫刺激细菌，其中所述肿瘤相关抗原是癌胚抗原、致癌病毒抗原(Oncoviral Antigen)和过表达/积累的抗原、肿瘤-睾丸抗原、线性限制抗原、突变抗原、翻译后改变的抗原或独特型抗原。
191.权利要求190的免疫刺激性菌，其中所述肿瘤相关抗原选自以下抗原：
/>
192.权利要求1至191任一项的免疫刺激细菌，其是抗癌治疗剂。
193.权利要求192的免疫刺激细菌，其中编码的有效载荷在真核启动子的控制下表达。
194.权利要求1至193任一项的免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌是鞭毛蛋白-、asd-、msbB-、pagP-和csgD-，或者是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-。
195.权利要求1至194任一项的免疫刺激细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌是thyA-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-和pagP-。
196.权利要求1至195任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌是用于治疗或预防癌症或病原体感染的疫苗。
197.权利要求196的免疫刺激细菌，其中编码的有效载荷在原核启动子的控制下表达，并且编码有效载荷的核酸包含由真核核糖体而非细菌核糖体识别的翻译调节信号。
198.权利要求1至197任一项的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌中的质粒编码来自病原体的抗原或蛋白质或其表位。
199.权利要求198的免疫刺激细菌，其中所述病原体引起慢性病毒感染，例如肝炎病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、Epstein-Barr病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和麻疹病毒；或者是病毒或其它病原体长期感染受试者；或者是引起急性感染的病原体，例如慢性流感和冠状病毒的初始感染，例如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，导致COVID-19)。
200.权利要求199的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码来自病原体的抗原或其表位或表位组合，例如来自必需病毒蛋白的抗原，例如在冠状病毒情况下来自核衣壳蛋白、M和/或S蛋白的抗原，其可产生中和抗体，并增强长寿命的循环和组织驻留CD8+T细胞。
201.权利要求198至200任一项的免疫刺激细菌，其中编码所述抗原、表位或抗原性蛋白质的核酸可操作地连接至所述细菌识别的原核启动子；并且所述编码序列包括真核核糖体识别的翻译调节序列，由此所述细菌不能翻译编码的RNA，或者所述编码序列不包括细菌核糖体识别的Shine Dalgarno序列，由此编码的mRNA不被翻译；并且所述mRNA被递送到所述细菌被递送到之中的真核宿主细胞。
202.权利要求1至201任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述质粒在单个启动子的控制下编码两种或多种治疗产物；和
编码至少两种或所有产物的核酸的表达在单个启动子的控制下，并且编码每种产物的核酸被编码2A多肽的核酸分开，由此在翻译时，每个产物被单独表达。
203.权利要求198至202任一项的免疫刺激细菌，其中编码一种或多种治疗产物的核酸可操作地连接至编码指导表达的产物分泌的序列的核酸。
204.权利要求1至203任一项的免疫刺激细菌，其中：
所述治疗产物是一种共刺激分子，具有用于在抗原呈递细胞(APC)上表达的胞质结构域缺失；和
所述截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向T细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于胞质结构域缺失而无法向APC发出反调节信号。
205.权利要求204的免疫刺激细菌，其中所述缺少胞质结构域的共刺激分子是4-1BBL、CD80、CD86、CD27L、B7RP1、CD24L或OX40L。
206.权利要求1至205任何一项的免疫刺激细菌，其编码两种或更多种治疗产物，其中至少一种产物选自a)，且至少一种产物选自b)，其中：
a)是IL-2、IL-7、IL-12p70(IL-12p40+IL-12p35)、IL-15、IL-23、IL-36γ、与IL-2Ra减弱结合的IL-2、IL-15/IL-15Rα链复合物(IL-15Rα-IL-15sc)、IL-18、被修饰以不结合IL-2Ra的IL-2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、干扰素-α、干扰素-β、CCL3、CCL4、CCL5、参与或实现或增强T细胞募集和/或持久存在的蛋白质、CD40、CD40配体(CD40L)、OX40、OX40配体(OX40L)、4-1BB、4-1BB配体(4-1BBL)、B7-CD28家族成员、TGF-β多肽拮抗剂、或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员；及
b)是STING、RIG-I、MDA-5、IRF-3、IRF-5、IRF-7、IRF-8、TRIM56、RIP1、Sec5、TRAF3、TRAF2、TRAF6、STAT1、LGP2、DDX3、DHX9、DDX1、DDX9、DDX21、DHX15、DHX33、DHX36、DDX60或SNRNP200。
207.权利要求1至206任一项的免疫刺激细菌，其编码或进一步编码TGF-β抑制性抗体、TGF-β结合诱饵受体、抗IL-6抗体和IL-6结合诱饵受体中的一种或多种。
208.权利要求1至207任一项的免疫刺激细菌，其细菌编码一种或多种以下治疗产物的组合：
IL-2和IL-12p70；
IL-2和IL-21；
IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；
IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
IL-15/IL-15Rα和IL-21；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；
IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和STING GOF变体；
IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-18；
IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-18；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-2，和IL-21；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和IL-12p70；CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
肿瘤相关抗原；
CD40激动剂和STING GOF变体。
209.权利要求208的免疫刺激细菌，进一步编码肿瘤相关抗原。
210.权利要求208或209的免疫刺激细菌，其中STING的功能获得(GOF)变体选自权利要求149至153任一项所述。
211.一种免疫刺激细菌或细胞，编码一种或多种以下治疗产物的组合：
IL-2和IL-12p70；
IL-2和IL-21；
IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)，其中Δcyt是缺失的胞质结构域；
IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα和IL-12p70；
IL-15/IL-15Rα和IL-21；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-21；
IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和STING GOF变体；
IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
IL-12p70和IL-18；
IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-2，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-21；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和IL-12p70；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，和IL-18；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
TGF-β诱饵受体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
TGF-β诱饵受体和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-21；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和IL-12p70；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，和IL-18；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
抗-CTLA-4抗体，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
抗-CTLA-4抗体和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-2，和IL-21；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-2，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-2，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-12p70；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，和IL-21；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；CD40激动剂，IL-15/IL-15Rα，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-21；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-21，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和IL-12p70；**
CD40激动剂，IL-12p70，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂，IL-12p70，和IL-18；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，和STING GOF变体；
CD40激动剂，IL-12p70，IL-18，STING GOF变体，和4-1BBL(包括4-1BBLΔcyt)；
CD40激动剂和STING GOF变体；
双特异性T细胞衔接剂(BiTe)+STING蛋白，BiTe+IL-15，BiTe+IL-15+STING蛋白，其中BiTe靶向DLL3，EGFR，Her2，CEA，间皮素，PSMA，EpCAM，CD74，叶酸受体，Nectin4，EphA2，CA-IX，B7H3，Siglec-15，Muc1，或Lewis Y抗原；
肿瘤抗原+STING功能获得变体；
肿瘤抗原和IL-15的治疗组合物；
肿瘤抗原和IL-15+STING功能获得变体的治疗组合物；
一或多种抗原和IFN；
一或多种抗原和IFNα；
一或多种抗原，和IFNα2或IFNα1-16；
一或多种抗原和任何的IFNα1-16；
一或多种抗原和IFN-β；
一或多种抗原，IFNα2，和IFN-β；
一或多种抗原和具有S396D突变的IRF3 GOF变体；
一或多种抗原，IFNα2或IFNα1-16，和具有突变S396D的IRF3 GOF变体；
IFNα2+IRF3-S396D；
IFNα1-16+IRF3-S396D；
IFNα2+IFN-β；
IFNα1-16+IFN-β
FLT-3L，或唾液酸酶，或IL-12p35，或天青蛋白，或膜锚定的IL-2，IL-12，IL-12p35，IL-21，IL-15，FLT-3L，单独或与其它免疫刺激蛋白组合；和
TLR8激动剂，其中所述激动剂是polyU或polyU/G、microRNA或miR-21，单独或与任何免疫刺激蛋白组合。
212.权利要求202至211任一项的免疫刺激细菌，还编码肿瘤相关抗原。
213.权利要求1至212任一项的免疫刺激细菌，其中所述质粒编码如权利要求191所述的肿瘤相关抗原。
214.权利要求1至213任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是双特异性T细胞衔接蛋白。
215.权利要求214的免疫刺激细菌，其中所述双特异性T细胞衔接蛋白结合δ样配体3(DLL3)和CD3。
216.权利要求1至215任一项的免疫刺激细菌，其编码细胞因子和修饰的或变体STING蛋白。
217.权利要求215的免疫刺激细菌，其中所述STING蛋白是如权利要求406至436任一项所述的STING蛋白。
218.权利要求215或权利要求216的免疫刺激细菌，其中所述细胞因子是IL-15/IL-15Rα链复合物，或IL-15，或IL-12。
219.权利要求215至218任一项的免疫刺激细菌，其中所述细胞因子是IL-15/IL-15Rα链复合物或IL-15。
220.权利要求215至219任一项的免疫刺激细菌，其中所述STING蛋白是包含人STING蛋白和袋獾CTT的嵌合STING蛋白，或者是包含人STING蛋白和袋獾CTT的嵌合STING并具有一个或多个功能获得突变。
221.权利要求215至220任一项的免疫刺激细菌，其中所述STING蛋白包含为N154S、或R284G、或N154S/R284G的功能获得突变。
222.权利要求214至221任一项的免疫刺激细菌或细胞，其中所述STING功能获得变体选自权利要求405至430任一项所述的任何变体。
223.权利要求1至191任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含Fc结构域。
224.权利要求1至221任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含B7蛋白质跨膜结构域。
225.权利要求1至224任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是肿瘤相关抗原。
226.权利要求1至225任一项的免疫刺激细菌，其中编码的产物是双特异性T细胞衔接蛋白抗体。
227.权利要求1至226任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物是GPI-锚定的。
228.权利要求1至227任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含人血清白蛋白或其增加编码的产物的血清半衰期的衍生物。
229.权利要求1至228任一项的免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含与胶原蛋白的融合物。
230.权利要求1至229任一项的免疫刺激细菌，其是称作YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI或YS1646Δasd/ΔFLG/ΔpagP/ΔansB/ΔcsgD/F-ΔpurI/ΔthyA的菌株。
231.一种基因组修饰的细菌，其包含基因组修饰，由此与没有基因组修饰的细菌相比，toll样受体(TLR)2、4和5的应答降低，其中：
所述细菌包含进一步的基因组修饰，由此其对所需的营养素或因子是营养缺陷型的，因此不能在真核宿主中复制，但在提供所述营养素或因子时可以在体外复制；
所述细菌包含含有编码产物的核酸的质粒，或包含编码所述产物的RNA；
由所述核酸或RNA编码的产物是来自病原体的抗原序列，所述病原体是致病病毒、细菌或寄生虫，或者是肿瘤抗原，由此编码的抗原在宿主中表达后，宿主产生针对致病病毒、细菌、寄生虫或肿瘤抗原的免疫保护应答或免疫应答，或者所述产物是治疗产物；
抗原序列的表达在原核启动子的控制下，以便在细菌中产生编码抗原的RNA；
编码抗原的核酸包含调节序列，其抑制或阻止细菌核糖体翻译编码的RNA，但不抑制或阻止真核宿主核糖体翻译编码的RNA，由此翻译与细菌中的转录脱离；
当施用于真核生物受试者时，所得细菌对感染吞噬细胞具有选择性，并将所述核酸递送到吞噬细胞中，其中RNA被翻译。
232.权利要求231的细菌，其中编码抗原序列的核酸包含内部核糖体进入位点(IRES)序列，由此促进或增强宿主细胞翻译，并抑制或阻止细菌翻译。
233.权利要求232的细菌，其中所述IRES是血管内皮生长因子和1型胶原诱导蛋白(VCIP)IRES。
234.权利要求232或权利要求233的细菌，其中编码抗原的核酸包含VCIP或其它IRES，其抑制或减少细菌中的翻译，并允许且任选地促进或增强在真核宿主中的翻译。
235.权利要求331至233任一项的细菌，其中IRES或VCIP IRES包含在质粒中，位于启动子的3’位置和抗原编码序列的5’位置。
236.权利要求233至235任一项的细菌，其中VCIP IRES的序列在SEQ ID NO:434中列出。
237.权利要求231至236任一项的细菌，其中所述病原体是细菌或病毒。
238.权利要求231至237任一项的细菌，其中所述编码的抗原是肿瘤抗原。
239.权利要求231至238任一项的细菌，其中所述细菌是预防或治疗病毒感染或细菌感染的疫苗。
240.如权利要求236的细菌，其中所述病原体选自引起慢性病毒感染的病毒。
241.权利要求240的细菌，其中所述感染选自肝炎病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、Epstein-Barr病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、麻疹病毒和其它慢性感染受试者的病毒。
242.权利要求239至241任一项的细菌，其中所述感染是急性感染。
243.如权利要求242的细菌，其中所述感染是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)或严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，导致COVID-19)引起的感染。
244.权利要求231至243任一项的细菌，其中所述病原体是埃希氏菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、放线菌属、古细菌属、分枝杆菌属或卟啉单胞菌属的菌种。
245.权利要求231至243任一项的细菌，其中病原体是牙龈卟啉单胞菌、SARS-CoV或大肠杆菌或流感嗜血杆菌。
246.权利要求231至245任一项的细菌，其中所述细菌中的质粒还编码免疫刺激蛋白或其它佐剂。
247.权利要求246的细菌，其中所述质粒编码免疫刺激蛋白或其它治疗性蛋白的组合。
248.权利要求247的细菌，其中所述免疫刺激蛋白是STING蛋白。
249.权利要求248的细菌，其中所述STING蛋白包含功能获得性突变和/或是嵌合的STING蛋白。
250.权利要求248或权利要求249的细菌，其中所述STING蛋白是权利要求406至436任一项的STING蛋白。
251.权利要求231至250任一项的细菌，其中所述细菌包含编码治疗产物的组合的质粒。
252.权利要求250的细菌，其是权利要求1至251任一项的免疫刺激细菌。
253.权利要求231-252任一项的细菌，其中：
所述免疫刺激蛋白和/或其它治疗蛋白在质粒中编码为多顺反子序列的一部分，抗原的表达在细菌识别的原核启动子的控制下；或者
所述免疫刺激蛋白和/或其它治疗蛋白在真核宿主识别的真核启动子的控制下在质粒上编码。
254.权利要求231至253任一项的细菌，其中所述细菌包含编码抗原的mRNA和在原核启动子控制下表达的通过体外培养细菌产生的任何其它蛋白质。
255.权利要求231至254任一项的细菌，其包含基因组修饰，由此所述细菌缺少鞭毛并产生具有五酰化脂质A的LPS。
256.权利要求231至255任一项的细菌，其是asd-或thyA-或这两者。
257.权利要求231至256任一项的细菌，其是腺苷营养缺陷型和csgD-之一或两者，并且任选是ansB-。
258.权利要求231至257任一项的细菌，其包含编码TLR8激动剂的核酸。
259.权利要求258的细菌，其中所述TLR8激动剂是polyU、polyU/G、microRNA或miR-21。
260.权利要求231至259任一项的细菌，其是msbB-/pagP-，缺少鞭毛，并且是asd-或thyA-或asd-和thyA-。
261.权利要求1至260任一项的细菌，其是埃希氏菌属(Escherichia)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacteria)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌种或菌株。
262.权利要求1至261任一项的细菌，其是沙门氏菌(Salmonella)菌株。
263.权利要求262的细菌，其是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株。
264.权利要求262或权利要求263的细菌，其中所述未修饰的沙门氏菌(Salmonella)是野生型菌株，或者所述未修饰的沙门氏菌(Salmonella)菌株是减毒的。
265.权利要求1至264任一项的细菌，其中所述细菌源自菌株VNP20009或YS1646，或源自菌株ATCC 14028，或源自具有菌株ATCC 14028的所有鉴定特征的菌株。
266.权利要求231至265任一项的细菌，其中所述基因组修饰是基因中的缺失、插入、破坏和其它修饰中的一或多种，由此不产生由所述基因编码的产物，或者如果产生则是无活性的。
267.权利要求231至266任一项的细菌，其中所述原核启动子是细菌启动子或细菌噬菌体启动子。
268.权利要求231至267任一项的细菌，其中所述真核宿主是人。
269.一种疫苗，其包含一定量的且在运载体中的权利要求1至269任一项的细菌，以施用于受试者以在受试者中引发适应性免疫应答。
270.权利要求269的疫苗，其配制为气雾剂、或粉末、或片剂、或栓剂。
271.权利要求269或权利要求270任一项的疫苗，其被配制用于口服施用、鼻腔施用、吸入施用、直肠施用、阴道施用、眼内施用、颅内施用、皮内施用或肌内施用。
272.一种疫苗，其包含编码来自病毒的蛋白质或来自病毒冠状病毒的蛋白质的抗原的核酸，配制用于鼻腔或肺部吸入，其中所述疫苗不足以激活TRL2，由此所述疫苗诱导I型IFN。
273.权利要求272的疫苗，其中所述病毒是冠状病毒。
274.权利要求273的疫苗，其中所述病毒是SARS-COV2冠状病毒。
275.权利要求272至274任一项的疫苗，其也不足以激活TLR4和/或TRL5应答以足以降低或抑制I型IFN。
276.一种疫苗，其包含编码来自病原体或肿瘤的抗原或蛋白质或表位的核酸，其中：
所述疫苗引发针对病原体或肿瘤的免疫应答；
所述病原体是感染呼吸系统(包括肺和/或鼻咽)的呼吸道病原体；
所述肿瘤是肺肿瘤；
所述疫苗是配制为通过鼻或肺部吸入的；
述疫苗将核酸递送至吞噬性巨噬细胞，将免疫抑制性吞噬性巨噬细胞转化为免疫刺激性吞噬性巨噬细胞，这些巨噬细胞能够将抗原原位交叉呈递给CD8+T细胞，并迁移至淋巴结以引发CD4+和CD8+T细胞。
277.权利要求276的疫苗，其也不激活TLR4和/或TRL5应答以足以降低或抑制I型IFN。
278.权利要求276或权利要求277的疫苗，其不激活TLR2/4/5以足以降低或抑制型IFN。
279.权利要求272至278任一项的疫苗，其中所述疫苗引发针对病毒的免疫应答。
280.权利要求279的疫苗，其中所述病原体是病毒。
281.权利要求269至280的疫苗，其中所述病原体是RNA病毒。
282.权利要求281的疫苗，其中所述病毒是冠状病毒或流感病毒。
283.权利要求282的疫苗，其中所述病毒是冠状病毒。
284.权利要求283的疫苗，其中所述病毒是SARS病毒。
285.权利要求284的疫苗，其中所述病毒是SARS-COV2病毒。
286.权利要求269至285的疫苗，其中所述抗原、蛋白质或表位是病毒抗原、蛋白质或表位。
287.权利要求286的疫苗，其中所述蛋白质是衣壳蛋白或核蛋白。
288.权利要求269至287任一项的疫苗，其中所述病毒是SARS-COV2，并且所述蛋白质或表位是来自称作或由S1、S2、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b和ORF8编码的蛋白质。
289.权利要求269至288任一项的疫苗，其中所述病毒是SARS-COV2，并且所述蛋白质或表位是或来自或是刺突蛋白。
290.权利要求269至289任一项的疫苗，其中所述疫苗包含编码所述蛋白质或抗原的mRNA。
291.权利要求290的疫苗，其中所述mRNA经修饰以增加所述mRNA的稳定性或所述编码的蛋白质或抗原或表位的稳定性。
292.权利要求290的疫苗，其中所述mRNA编码修饰的病毒蛋白，其中所述修饰改变所述蛋白的结构以改变与宿主细胞蛋白的相互作用。
293.权利要求269至292任一项的疫苗，其是包含核酸的递送载体，所述核酸编码来自病原体的抗原或蛋白质，或编码肿瘤抗原。
294.权利要求269至293任一项的疫苗，其包含免疫刺激细菌，其中所述细菌包含基因组修饰，由此其具有五酰化脂多糖(LPS)并且缺少鞭毛，其中野生型细菌具有鞭毛。
295.权利要求294的疫苗，其中所述免疫刺激细菌具有基因组修饰，由此其不产生卷曲菌毛。
296.权利要求294或权利要求295的疫苗，其中所述免疫刺激细菌包含编码针对病原体或肿瘤抗原的抗原的质粒。
297.权利要求296的疫苗，其中所述质粒编码的治疗产物是导致I型干扰素(IFN)表达的胞质DNA/RNA传感器通路的一部分。
298.权利要求297的疫苗，其中所述产物是STING、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、MDA5、RIG-I或其包含功能获得性突变的修饰形式，由此I型干扰素的表达是组成型的。
299.权利要求1至298任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其是减毒细菌或革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
300.权利要求1至299任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述细菌是沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、双歧杆菌(Bifidobacteriae)、立克次体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、李斯特氏菌(Listeria)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、博德特氏菌属(Bordetella)、奈瑟菌属(Neisseria)、气单胞菌属(Aeromonas)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、霍乱弧菌属(Cholera)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、布鲁氏菌属(Brucella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、军团菌属(Legionella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)或丹毒丝菌属(Erysipelothrix)，或古细菌属(Archaeobacteria)的菌株，任何前述细菌的减毒菌株或修饰菌株。
301.权利要求1至299任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述细菌是立克次氏体立克次体(Rickettsia rickettsiae)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、恙虫立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)、莫塞氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、嗜泉气单胞菌(Aeromonas eucrenophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、马红球菌(Rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)、五日热罗卡利马氏体菌(Rochalimaea quintana)或根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)。
302.权利要求1至301任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其是沙门氏菌(Salmonella)菌株。
303.权利要求302的免疫刺激细菌或疫苗，其是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
304.权利要求302或权利要求303的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述未修饰的沙门氏菌是野生型菌株。
305.权利要求302或权利要求303的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述未修饰的沙门氏菌菌株是减毒的。
306.权利要求1至305任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述免疫刺激细菌来源于菌株VNP20009或YS1646，或菌株ATCC 14028，或具有菌株ATCC 14028的所有鉴定特征的菌株。
307.权利要求301至305任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其是ansB-、asd-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-、和pagP-，或其是ansB-、thyA-、csgD-、purI-、msbB-、鞭毛蛋白-、和pagP-。
308.权利要求1至307任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述细菌编码并表达补体杀伤(rck)抗性基因。
309.权利要求308的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述rck基因是沙门氏菌rck基因。
310.权利要求308或权利要求309的免疫刺激细菌或疫苗，其是大肠杆菌(E.coli)菌株。
311.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的运载体中的权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌或疫苗细菌。
312.权利要求311的药物组合物，其被配制用于全身施用。
313.权利要求311或权利要求312的药物组合物，其被配制用于肠胃外施用、或静脉内施用、或肌肉内施用、或肿瘤内施用、或腹膜内施用、或口服施用、或直肠施用、或阴道施用、或眼内施用，或皮内施用，或颅内施用，或粘膜施用，或通过口或鼻吸入施用。
314.一种治疗受试者的包括实体瘤或血液恶性肿瘤的癌症的方法，包括施用权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌、细菌或疫苗，或权利要求311至313任一项的药物组合物。
315.一种免疫方法，包括施用权利要求269至298任一项的疫苗。
316.权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌、细菌、病毒或疫苗或权利要求311至313任一项的药物组合物在治疗受试者的癌症中的用途，所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
317.权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌、细菌或病毒或疫苗或权利要求311至313任一项的药物组合物，用于在受试者中治疗包括实体瘤或血液恶性肿瘤的癌症或针对这些癌症进行免疫，或用于针对病原体的免疫。
318.权利要求314至317任一项的方法、用途、免疫刺激细菌或药物组合物或疫苗，其中所述受试者是人。
319.权利要求314至318任一项的方法、用途、免疫刺激细菌或药物组合物或疫苗，其中所述受试者患有包括实体瘤或包括血液恶性肿瘤的癌症。
320.权利要求314至319任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、药物组合物或疫苗，其中所述治疗包括联合治疗，其中施用第二抗癌剂或治疗法。
321.权利要求320的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中第二抗癌剂或治疗法在施用所述免疫刺激细菌或药物组合物之前、同时、之后或间歇地施用。
322.权利要求320或权利要求321的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述第二抗癌剂或治疗法是免疫治疗。
323.权利要求314至322任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌或药物组合物或疫苗的施用是肠胃外施用。
324.权利要求314至322任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌或药物组合物或疫苗的施用是口服、或经直肠施用，或通过气雾剂吸入肺和/或鼻，或经粘膜、或颅内、或皮内、或瘤内施用。
325.权利要求314至324任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌或疫苗或药物组合物的施用是经静脉内、肌内、鼻内或皮下施用。
326.权利要求314至325任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、药物组合物或疫苗，其中所述癌症选自白血病；淋巴瘤；胃癌；以及乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、结肠直肠、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的癌症。
327.权利要求314至326任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫治疗包括施用抗-PD-1、或抗-PD-L1、或抗-CTLA-4抗体。
328.权利要求314至327任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是是沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属或大肠杆菌物种。
329.权利要求314至328任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是沙门氏菌属。
330.权利要求314至329任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌是鼠伤寒沙门氏菌菌株。
331.权利要求314至330任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述免疫刺激细菌的施用是通过腹膜内或瘤内施用。
332.权利要求314至331任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，其中所述受试者患有转移的癌症。
333.权利要求314至332任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，包括施用第二抗癌治疗，其中所述第二治疗选自抗-PD-1、抗-CTLA-4、抗-PD-L1、抗IL-6、抗-Siglec-15、抗-VEGF、抗-CD73、抗-CD38抗体。
334.权利要求314至333任一项的方法、用途、免疫刺激细菌、疫苗或药物组合物，包括施用第二或进一步的抗癌治疗，其中所述第二或进一步的治疗选自聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、化疗剂、抗EGFR抗体、CAR-T细胞、抗Her2抗体、抗间皮素抗体和抗-B细胞成熟抗原(BCMA)抗体。
335.一种治疗病毒感染或另一种感染原感染的方法，包括施用权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其中所述免疫刺激细菌或疫苗包含或编码来自所述病毒或病原体的抗原、蛋白质或其表位。
336.权利要求335的方法，其中所述免疫刺激细菌在该细菌识别的启动子的控制下编码所述抗原、蛋白质或其表位；并且所述免疫刺激细菌包含基因组修饰，由此其不在体内复制。
337.权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌或疫苗，或权利要求335和336的方法，用于治疗病毒感染或另一种感染原的感染。
338.一种进行免疫以预防病毒或其它感染原感染(降低风险)的方法，包括施用免疫剂量的权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌或疫苗，其中由所述免疫刺激细菌编码的产物是抗病毒或抗病原体治疗剂或抗原、表位或蛋白质。
339.权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌或疫苗，用于针对病毒或另一种感染原进行免疫、保护或降低其感染的严重性或降低其感染的风险，其中由所述免疫刺激细菌编码产生的是一种抗病毒或抗病原体治疗剂或抗原、表位或蛋白质。
340.权利要求335至339任一项的免疫刺激细菌或疫苗或方法，其中所述病毒或感染原是病毒。
341.权利要求1至340任一项的免疫刺激细菌、或疫苗、或药物组合物、或方法、或用途，其中所述免疫刺激细菌包含编码RNA的质粒，所述质粒可操作地连接至由细菌中存在的聚合酶识别的启动子，其中在感染真核宿主细胞后，RNA被释放到真核宿主的细胞质中。
342.权利要求341的免疫刺激细菌、或疫苗、或药物组合物、或方法、或用途，其中释放到真核宿主细胞质中的RNA是mRNA。
343.权利要求341或权利要求342的免疫刺激细菌、或疫苗、或药物组合物、或方法或用途，其中所述启动子是诱导型启动子。
344.权利要求341至343任一项的免疫刺激细菌、或疫苗、或药物组合物、或方法或用途，其中所述免疫刺激细菌还编码识别启动子的聚合酶。
345.权利要求341至344任一项的免疫刺激细菌、或疫苗、或药物组合物、或方法或用途，其中所述聚合酶是T7 RNA聚合酶。
346.权利要求341至345任一项的免疫刺激细菌、或疫苗、或药物组合物、或方法、或用途，其中所述免疫刺激细菌是asd-或thyA-或两者。
347.权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌或疫苗，用于治疗肿瘤或病毒感染，其中所述细菌编码抗癌或抗病毒治疗产物或形成病毒或肿瘤的抗原、蛋白质或表位或其组合。
348.一种治疗癌症或病毒感染的方法，包括为患有癌症和/或病毒感染的受试者施用权利要求68至80任一项的RNA递送系统，或权利要求1至310任一项的编码肿瘤相关抗原或病毒抗原、蛋白质或表位的免疫刺激细菌或疫苗。
349.一种将M2巨噬细胞转化为M1或M1样表型的方法，包括为患有通过增强抗病毒或抗肿瘤免疫应答进行治疗的病况、疾病或病症的受试者施用权利要求38至82任一项的免疫刺激细菌。
350.权利要求38至82任一项的免疫刺激细菌或权利要求38至82任一项的免疫刺激细菌在患有通过增强抗病毒或抗肿瘤免疫应答进行治疗的病况、疾病或病症的受试者中将M2巨噬细胞转变为M1或M1样表型巨噬细胞中的用途。
351.权利要求349的方法或权利要求350的用途或细菌，其中所述疾病、病症或病况是癌症和/或病毒或其它病原体感染。
352.一种递送编码治疗产物的RNA的方法，包括施用权利要求16至25任一项的免疫刺激细菌以治疗疾病、病况或病症。
353.权利要求68至82任一项的免疫刺激细菌或权利要求68至82任一项的免疫刺激细菌用于递送编码治疗疾病、病况或病症的治疗产物的RNA的用途。
354.权利要求352的方法或权利要求353的用途或细菌，其中所述疾病、病症或病况是癌症和/或病毒或其它病原体感染。
355.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的运载体中的权利要求231至310任一项的细菌。
356.如权利要求355的药物组合物，其配制为疫苗、液体、粉末或片剂。
357.权利要求231至313、355和356任一项的细菌或药物组合物，用于治疗或预防(降低发生风险)疾病或病症或感染或癌症。
358.一种治疗或预防(降低发生风险)疾病或病症或感染或癌症的方法，包括施用权利要求231至313、355和356任一项的细菌或药物组合物。
359.一种递送RNA的方法，包括施用权利要求231至310和355至357任一项的细菌或药物组合物。
360.权利要求231至310和355至357任一项的细菌，用于递送RNA。
361.权利要求359的方法或权利要求360的细菌，其中所述RNA是mRNA。
362.权利要求231至310和355至357任一项的细菌，其中所述产物是治疗产物，并且所述细菌中的质粒编码所述产物以产生不被所述细菌翻译的mRNA。
363.一种向受试者递送RNA的方法，包括施用权利要求400的细菌。
364.权利要求400的细菌，用于将RNA递送至受试者。
365.一种用于将RNA递送至受试者的细菌，其包含编码异源产物的质粒，其中：
编码所述异源产物的核酸与细菌识别的启动子相连；和
编码所述产物的核酸包含不被细菌识别的用于翻译的真核序列，由此所述细菌产生RNA，但不翻译RNA。
366.权利要求403的细菌，其是权利要求1至310任一项的免疫刺激细菌，其中编码RNA的核酸编码治疗产物。
367.权利要求403或权利要求404的细菌，其中所述细菌编码来自病原体或肿瘤的抗原或蛋白质以引发针对所述抗原或蛋白质的免疫应答。
368.一种来自非人物种的经修饰的干扰素基因刺激因子(STING)蛋白，其中所述非人STING与人STING相比具有较低NF-κB信号传导活性，并且任选与人STING相比具有较高的I型干扰素(IFN)通路信号传导活性，其中：
所述非人STING蛋白被修饰以包括一个或多个突变，以使其在没有胞质核酸的情况下具有增加的活性或组成型作用；
所述突变是氨基酸的插入、缺失和/或置换；及
所述STING蛋白任选具有TRAF6结合位点的缺失或破坏。
369.来自非人物种的修饰的干扰素基因刺激因子(STING)蛋白，或嵌合人STING蛋白及其修饰，包含一个或多个与功能获得(GOF)相关的突变，导致编码的STING蛋白的组成型活化和/或增强的敏感性，或与内源性配体增加的亲和性或结合，由此所述STING蛋白通过一个或多个氨基酸的插入、缺失和置换中的一个或多个被修饰；
与人STING相比，所述STING蛋白具有IFN-β信号传导活性，和减弱的活化的B细胞核因子κ-轻链增强子(NF-κB)信号传导活性；及
所述突变导致增加的STING活性或诱导IFN-β产生的组成型活性。
370.权利要求406或权利要求407的修饰的STING蛋白，其中所述人STING蛋白包含SEQID NO:305-309任一所示序列，或者是其与SEQ ID NO:305-309任一所示氨基酸序列具有至少98％序列相同性的人等位基因变体。
371.权利要求406至408任一项的修饰的STING蛋白，其中：
所述STING蛋白是嵌合体，包含用来自第二物种的STING蛋白的CTT置换来自第一物种的STING蛋白中的C末端尾区(CTT)区域；
所述第二物种的STING蛋白的NF-κB信号传导活性低于人STING的NF-κB信号传导活性；及
CTT中的TRAF6结合位点任选被缺失。
372.权利要求406至409任一项的修饰的STING蛋白，其中所述突变是对应于与自身炎症性疾病STING相关血管病变(SAVI)相关的那些突变的任何突变。
373.一种修饰的干扰素基因刺激因子(STING)蛋白，其是一种嵌合体，包括用来自第二物种的STING蛋白的CTT置换来自第一物种的STING蛋白中的CTT(C末端尾区)区域，其中：
所述第二物种STING蛋白的NF-κB信号传导活性低于人STING的NF-κB信号传导活性；和
所述CTT中的TRAF6结合位点任选被缺失。
374.权利要求406至411任一项的修饰的STING蛋白，其中所述人STING蛋白包含SEQ IDNO:305-309任一所示序列，或者是其与SEQ ID NOs:305-309所示序列具有至少98％序列相同性的人等位基因变体。
375.如权利要求406至411任一项的修饰的STING蛋白，其中所述第一物种是人类，并且所述第二物种选自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠和鬼鲨。
376.权利要求406至413任一项的修饰的STING蛋白，其中所述I型IFN信号传导活性是野生型人STING蛋白相应活性的至少或至少约30％。
377.权利要求406至414任一项的修饰的STING蛋白，其中所述NF-κB信号传导活性小于野生型人STING NF-κB信号传导活性的30％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％。
378.权利要求406至415任一项的修饰的STING蛋白，其中所述非人物种或第二物种选自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠和鬼鲨。
379.权利要求406至416任一项的修饰的STING蛋白，其中STING的修饰是通过参考人STING并与其比对而对应于在干扰素病中发生的突变的一个或多个突变，其中用于实现比对的人STING序列在SEQ ID NO:305-309任一中列出。
380.权利要求406至417任一项的修饰的STING蛋白，其包含用来自与人STING的NF-κB信号传导活性相比具有降低的NF-κB信号传导活性的STING蛋白的CTT置换所述C-末端尾区(CTT)。
381.权利要求418的修饰的STING蛋白，其中置换CTT来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨STING蛋白。
382.权利要求418的修饰的STING蛋白，其中置换CTT来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨STING蛋白，并且其置换人STING CTT。
383.权利要求419或权利要求420的修饰的STING蛋白，其中置换CTT选自以下物种，并具有以下序列：
袋獾
RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF SEQ ID NO:371，
狨猴
EEEEVTVGSLKTSEVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRSDLF SEQ ID NO:372，
牛
EREVTMGSTETSVMPGSSVLSQEPELLISGLEKPLPLRSDVF SEQ ID NO:373，
猫
EREVTVGSVGTSMVRNPSVLSQEPNLLISGMEQPLPLRTDVF SEQ ID NO:374，
鸵鸟
RQEEYTVCDGTLCSTDLSLQISESDLPQPLRSDCL SEQ ID NO:375，
野猪
EREVTMGSAETSVVPTSSTLSQEPELLISGMEQPLPLRSDIF SEQ ID NO:376，
蝙蝠
EKEEVTVGTVGTYEAPGSSTLHQEPELLISGMDQPLPLRTDIF SEQ ID NO:377，
海牛
EREEVTVGSVGTSVVPSPSSPSTSSLSQEPKLLISGMEQPLPLRTDVF SEQ ID NO:378，
朱鹮
CHEEYTVYEGNQPHNPSTTLHSTELNLQISESDLPQPLRSDCF SEQ ID NO:379，
腔棘鱼(变体1)
QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKRQVC SEQ ID NO:380，
腔棘鱼(变体2)
QKEEYFMSEQTQPNSSSTSCLSTEPQLMISDTDAPHTLKSGF SEQ ID NO:381，
鬼鲨
LTEYPVAEPSNANETDCMSSEPHLMISDDPKPLRSYCP SEQ ID NO:383，及
小鼠
EKEEVTMNAPMTSVAPPPSVLSQEPRLLISGMDQPLPLRTDLI SEQ ID NO:384，
或每个这些序列的等位基因变体，与其有至少98％的序列相同性。
384.权利要求420或421的修饰的STING蛋白，其中人CTT包含序列EKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(SEQ ID NO:370)，或是与其具有至少98％序列相同性的等位基因变体。
385.权利要求411至422任一项的修饰的STING蛋白，其中所述修饰的STING蛋白是嵌合体，其中人STING CTT被来自袋獾STING的CTT置换。
386.权利要求423的修饰的STING蛋白，其中来自袋獾STING的C端尾区(CTT)包含序列：RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF(SEQ ID NO:371)，或者是与其具有至少98％序列相同性的等位基因变体。
387.权利要求406至424任一项的修饰的STING蛋白，其包含TRAF6结合位点的缺失或破坏。
388.权利要求425的修饰的STING蛋白，其中所述STING蛋白是人STING蛋白，并且所述TRAF6结合位点包含在C末端的氨基酸残基DFS。
389.权利要求406至426任一项的修饰的STING蛋白，其包含增加I型干扰素信号传导活性或在不存在胞质核酸的情况下使该活性是组成型活性的修饰。
390.权利要求427的修饰的STING蛋白，其中通过参考人STING并与其比对，所述修饰对应于在干扰素病中发生的突变，其中所述人STING蛋白具有SEQ ID NO:305-309任一所示序列。
391.权利要求406至428任一项的修饰的STING蛋白，其中所述修饰是对应于以下一个或多个氨基酸置换：S102P，V147L，V147M，N154S，V155M，G166E，C206Y，G207E，S102P/F279L，F279L，R281Q，R284G，R284S，R284M，R284K，R284T，R197A，D205A，R310A，R293A，T294A，E296A，R197A/D205A，S272A/Q273A，R310A/E316A，E316A，E316N，E316Q，S272A，R293A/T294A/E296A，D231A，R232A，K236A，Q273A，S358A/E360A/S366A，D231A/R232A/K236A/R238A，S358A，E360A，S366A，R238A，R375A，和S324A/S326A，参考SEQ ID NO:305-309任一所示人STING序列。
392.权利要求429的修饰的STING蛋白，其包含参考SEQ ID NO:305-309任一所示人STING的序列对应于C206Y或R284G的置换。
393.权利要求430的修饰的STING蛋白，其是袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠或鬼鲨STING蛋白。
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