CN114349950A - 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用 - Google Patents

一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114349950A
CN114349950A CN202111533428.9A CN202111533428A CN114349950A CN 114349950 A CN114349950 A CN 114349950A CN 202111533428 A CN202111533428 A CN 202111533428A CN 114349950 A CN114349950 A CN 114349950A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peg
antibody
poly
nano
nanostimulator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111533428.9A
Other languages
English (en)
Inventor
蔡林涛
廖健洪
郑明彬
潘宏
张保珍
黄国俊
唐晓帆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN202111533428.9A priority Critical patent/CN114349950A/zh
Publication of CN114349950A publication Critical patent/CN114349950A/zh
Priority to PCT/CN2022/138176 priority patent/WO2023109704A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen
    • C08G65/332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof
    • C08G65/3322—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof acyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group
    • C08G65/33317—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种抗体合成菌‑纳米刺激剂杂合体新型靶向给药系统，及其在抗肿瘤免疫治疗领域的应用，具体公开了pH响应共聚物、纳米刺激剂、抗体合成菌以及抗体合成菌‑纳米刺激剂杂合体系统及其制备方法和应用。

Description

一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用
技术领域
本发明属于靶向给药系统领域，涉及一种具有pH响应的细胞因子纳米刺激剂、抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，以及其在抗肿瘤治疗等中的应用。
背景技术
近年来，以程序性死亡受体1(PD-1)、程序性死亡受体配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)为靶点的免疫检查点抑制疗法取得了令人鼓舞的成果并成为研究热点。通过免疫检查点抑制剂阻断PD-1/PD-L1的相互作用，解除肿瘤微环境免疫抑制是抗肿瘤免疫治疗的一种有效途径。然而，由于传统免疫检查点抗体药物毒副作用大、不可再生和易产生耐药性等缺陷，在临床治疗上需多次给药，严重限制了其适用性。因此，如何提高免疫检查点抗体药物的靶向递送和持续有效性，进而克服CTLA-4或PD-1/PD-L1免疫检查点通路的抑制，增强效应T细胞的抗肿瘤活性，实现实体瘤的高效免疫治疗是现有技术需要着重解决的关键技术问题。
近期大量研究表明，T细胞在抗肿瘤免疫治疗中起决定性的作用，而浸润到肿瘤的效应T细胞(如CD8+、CD4+等)的数量和活性与实体瘤的治疗效果呈正相关。同时临床研究发现，通过肿瘤组织活检分析部分使用免疫检查点抗体药物治疗的患者免疫应答率低、疗效不佳，其主要原因是肿瘤病灶内效应T细胞不足。因此，肿瘤组织效应T细胞匮乏是导致免疫检查点抗体药物疗效差和免疫应答率低的根本原因。如何促进肿瘤部位效应T细胞的增殖、激活效应T细胞的抗肿瘤活性，进而解决免疫检查点抗体药物免疫应答率低、易复发和疗效受限等瓶颈也是需要解决的问题。
针对肿瘤效应T细胞不足，研究者采用了细胞因子等免疫活性蛋白来促进效应T细胞的增殖和抗肿瘤活性。如直接构建一种抗肿瘤因子纳米给药系统，通过靶向递送和免疫刺激效应T细胞的大量增殖来杀灭癌细胞。而又有研究者采用细胞因子和PD-1抗体联合给药策略用于转移性实体瘤的治疗，结果表明细胞因子能促进效应T细胞的增殖和活性，增强了免疫应答，进而减弱了实体瘤对PD-1抗体药物的耐药性。诸上策略虽能一定程度上解决效应T细胞不足并提高PD-1抗体的治疗效果，但均未能解决免疫检查点抗体药物的持续有效性以及细胞因子和抗体药物的同步精准递送等关键问题。
综上，如何构建一种安全、高效的新型生物活性精准递送系统，持续克服免疫检查点抑制、促进效应T细胞的增殖和抗肿瘤活性仍然是一个巨大的挑战。
现有免疫检查点相关抗体药物由于存在脱靶效应、价格昂贵、不可再生、易产生免疫相关不良反应等缺陷，严重限制了其临床适用性。因此，如何将所述抗体药物高效地递送至肿瘤病灶部位，如何实现对免疫检查点信号通路的持续阻断，进而长效地解除肿瘤微环境对T细胞的免疫抑制，增强T细胞的抗肿瘤活性，最终实现转移性实体瘤的高效免疫治疗，是本领域亟需解决的一个难题，也是本发明拟解决的技术问题。
肿瘤组织效应T细胞匮乏是导致免疫检查点抗体药物疗效差和免疫应答率低的根本原因。细胞因子纳米刺激剂能促进肿瘤部位效应T细胞的增殖、激活效应T细胞的抗肿瘤活性，进而解决免疫检查点抗体药物免疫应答率低、易复发和疗效受限等瓶颈，然而由于代谢动力学的差异，传统的鸡尾酒式给药无法使得活细胞药物和纳米药物同步递送至肿瘤病灶。因此，如何实现纳米药物和活细胞药物的同步递送是本发明拟解决的另一个技术问题。
利用基因工程技术赋予活细胞药物的药物合成功能，是持续阻断免疫检查点通路的一种有效途径。另一方面，利用纳米药物缓控释功能将T细胞刺激剂(细胞因子)包裹在纳米粒子中，缓释后能持续刺激T细胞的增殖和活化。然而，传统的化学反应将影响活细胞的功能和活性，造成不可逆的影响。因此，如何在不破坏活细胞药物功能活性的前提下实现纳米药物和活细胞药物的共递送是本发明拟解决的另一个技术问题。
针对肿瘤免疫检查点抑制与效应T细胞不足的科学问题，本发明基于大肠杆菌属Nissle1917(EcN)益生菌或减毒鼠伤寒沙门氏菌(VPN20009)，采用基因工程、纳米材料制备及生物正交技术构建能表达免疫检查点抑制剂和智能响应释放细胞因子的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统。利用该生物活性递送系统的靶向穿透、免疫检查点抑制剂和细胞因子的双重免疫调控，全面激活机体抗肿瘤效应，解决免疫检查点抑制剂等抗体药物的免疫应答率低和治疗疗效差的难题，为全面提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤治疗提供重要理论依据和技术手段。
发明内容
针对上述归纳和总结的现有技术长期存在，却仍未能有效解决的技术问题，本发明提供了一种具有pH响应的细胞因子纳米刺激剂，及其基于白细胞介素和抗肿瘤因子等免疫球蛋白的pH响应纳米粒子的抗肿瘤领域应用。还提供了一种抗体合成菌杂合体系统，其为通过基因工程构建的免疫检查点抗体药物合成菌，及其在抗肿瘤领域的应用。最后，本发明还涉及抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，其为将纳米刺激剂通过温和的Michael加成或“点击化学”反应偶联在工程菌的表面，制备得到抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，以及在抗肿瘤免疫治疗领域的应用。具体如下：
本发明提供了一种能响应肿瘤胞外微酸环境(pH<6.5)的共聚物，所述共聚物是Mal-poly(PEGn-co-His)或DBCO-poly(PEGn-co-His)或BCN-poly(PEGn-co-His)或Alkynyl-poly(PEGn-co-His)；
所述Mal-poly(PEGn-co-His)是由Mal-PEGn-NH2，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77(PEG数均分子量3400)，即Mal-poly(PEG77-co-His)；
所述DBCO-poly(PEGn-co-His)是由DBCO-PEGn-NH2，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77(PEG数均分子量3400)，即DBCO-poly(PEG77-co-His)；
所述BCN-poly(PEGn-co-His)是由BCN-PEGn-NH2，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77(PEG数均分子量3400)，即BCN-poly(PEG77-co-His)；
所述Alkynyl-poly(PEGn-co-His)是由Alkynyl-PEGn-NH2，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77(PEG数均分子量3400)，即Alkynyl-poly(PEG77-co-His)。
进一步地，所述Mal-poly(PEGn-co-His)的制备方法是采用Michael加成反应，其中HDDA、His、Mal-PEGn-NH2的摩尔比为1:0.05～0.95:0.05～0.95；优选为1:0.85:0.15。
进一步地，所述DBCO-poly(PEGn-co-His)的制备方法是采用Michael加成反应，其中HDDA、His、DBCO-PEGn-NH2的摩尔比为1:0.05～0.95:0.05～0.95；优选为1:0.85:0.15。
本发明还提供了一种pH响应共聚物，所述pH响应共聚物是Mal-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure BDA0003412250670000041
本发明还提供了一种pH响应共聚物，所述pH响应共聚物是DBCO-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure BDA0003412250670000051
本发明还提供了一种pH响应共聚物，所述pH响应共聚物是BCN-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure BDA0003412250670000052
本发明还提供了一种pH响应共聚物，所述pH响应共聚物是Alkynyl-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure BDA0003412250670000053
本发明还提供了一种根据上述共聚物制备的纳米刺激剂(NPs)，所述纳米刺激剂含有马来酰亚胺(Mal)标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂或DBCO标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂，所述免疫活性蛋白包裹于所述共聚物的内部，所述免疫活性蛋白包括细胞因子，所述细胞因子包括以下任一种或多种：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、TNF-α、IFN-α、IFN-γ。
进一步地，所述纳米刺激剂为IL-12纳米刺激剂(INPs)。
本发明还提供了一种由上述纳米刺激剂和抗体合成菌制备的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，所述抗体合成菌是巯基基团或叠氮基团标记的抗体合成菌；所述杂合体系统是通过马来酰亚胺(Mal)与抗体合成菌上的巯基基团Michael加成获得，或所述杂合体系统是通过DBCO与抗体合成菌上的叠氮基团的“点击化学”反应偶联获得。
进一步地，所述抗体合成菌是细菌，优选为鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌。
进一步地，所述鼠伤寒沙门氏菌包括VPN20009。
进一步地，所述大肠杆菌包括Nissle 1917。
进一步地，所述巯基基团来自三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原获得。
进一步地，所述叠氮基团来自N3-PEG-NHS或叠氮修饰的葡萄糖、半乳糖或甘露糖(Ac4GlcNAz、Ac4GalNAz或Ac4ManNAz)；优选地，所述叠氮修饰的葡萄糖、半乳糖或甘露糖的结构分别如下所示：
Figure BDA0003412250670000061
进一步地，所述抗体合成菌表达免疫检查点抗体；优选地，所述免疫检查点抗体包括以下任一种或多种：CTLA-4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体；更优选地，所述抗体选是哺乳动物源抗体、人源化抗体、纳米抗体、嵌合抗体或其功能活性片段，所述哺乳动物包括人、羊、鼠、兔、猴、猩猩、狒狒、猪、牛、马、狗、骆驼等。
进一步地，所述纳米刺激剂是经过薄膜分散法或微乳液法制备。
本发明还提供了一种上述纳米刺激剂的制备方法，采用薄膜分散法，包括如下步骤：
(a)有机相中溶解所述共聚物，旋蒸除去有机相，得薄膜聚合物层；
(b)将所述的免疫活性蛋白和PBS加入，探头超声获得免疫活性蛋白纳米粒子；
(c)超滤或透析，得到具有Mal、DBCO、BCN或Alkynyl修饰的核壳结构纳米粒子，即所述纳米刺激剂。
本发明还提供了一种上述纳米刺激剂的制备方法，采用微乳液法，包括如下步骤：
(a)有机相中溶解所述共聚物，加入聚乙烯醇(PVA)表面活性剂继续搅拌；
(b)缓慢滴入免疫活性蛋白溶液，继续搅拌，加入PBS并于超声探头下超声；
(c)超滤或透析，得到表面具有Mal、DBCO、BCN或Alkynyl修饰的核壳结构纳米粒子，即所述纳米刺激剂。
本发明还提供了一种上述共聚物的制备方法，包括如下步骤：通过Michael加成反应制备，称取适量1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)、组胺(His)与Mal-PEGn-NH2或DBCO-PEGn-NH2或BCN-PEGn-NH2或Alkynyl-PEGn-NH2按摩尔比1:0.05～0.95:0.05～0.95的比例混合并溶解在适量体积的二甲基亚砜(DMSO)中，在惰性气体中35-85℃条件下反应16-72h，提纯并冷冻干燥得到聚合物粉末，经分析、鉴定获得所述共聚物Mal-poly(PEGn-co-His)、DBCO-poly(PEGn-co-His)、BCN-poly(PEGn-co-His)或Alkynyl-poly(PEGn-co-His)。
进一步地，所述摩尔比优选为1:0.85:0.15；所述反应是在55℃条件下反应48h。
本发明还提供了一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的制备方法，包括以下步骤：
(a)将上述的抗体合成菌菌液收集在离心管中，离心并重悬于缓冲溶液中；
(b)加入适量的标记活性基团反应，离心提取标记活性基团的抗体合成菌；
(c)将权利要求4所述的纳米刺激剂加入到步骤(b)制备的标记活性基团的抗体合成菌中，在25-45℃下孵育0.5-4h，离心除去未偶联的纳米刺激剂，经检测，获得所述抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的混悬液。
进一步地，所述标记活性基团为巯基基团或叠氮基团；当所述标记活性基团为巯基基团时，所述纳米刺激剂为所述的Mal标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂；当所述标记活性基团为叠氮基团时，所述纳米刺激剂为所述的DBCO或BCN或Alkynyl标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂。
进一步地，所述巯基基团来自TCEP还原获得，所述叠氮基团来自N3-PEG-NHS或叠氮修饰的葡萄糖、半乳糖或甘露糖(Ac4GlcNAz/Ac4GalNAz/Ac4ManNAz)孵育获得。
进一步地，所述抗体合成菌的构建方法包括如下步骤：
(a)将含有编码所述免疫检查点抗体的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切、连接等步骤导入表达空载体，得到重组表达载体；
(b)将所述重组表达载体转化到宿主细菌中，得到表达所述免疫检查点抗体的重组细菌
(c)将步骤(b)得到的重组菌涂布在抗性培养基上筛选单克隆，经PCR阳性鉴定，测序，获得含有重组质粒的菌株，即表达所述免疫检查点抗体的抗体合成菌。
本发明还提供了上述的共聚物、纳米刺激剂和/或抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的应用，所述应用选自如下任一种或多种：
(1)在制备药物组合物中的应用；
(2)在制备用于细胞检测的试剂中的应用；
(3)在制备用于疾病诊断或治疗的试剂中的应用；
(4)在体外筛选药物中的应用；
(5)在不以疾病诊断为目的体外检测中的应用。
进一步地，上述细胞包括正常细胞或肿瘤细胞。
进一步地，上述疾病包括肿瘤。
本发明还提供了上述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统在制备免疫治疗试剂或药物中的应用。
进一步地，上述免疫治疗针对的是肿瘤。
本发明还提供了一种含有上述的共聚物、纳米刺激剂和/或抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的组合物。
进一步地，所述组合物是药物或检测试剂。
进一步地，所述组合物还含有药学或医学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，所述药物或所述组合物还包括抗肿瘤药物；优选地，所述抗肿瘤药物包括抗肿瘤广谱药物和/或抗肿瘤靶向药物；更优选地，所述抗肿瘤广谱药物选自喜树碱类药物、阿霉素类药物、紫杉醇类药物或铂类药物中任一种或多种，所述抗肿瘤靶向药物选自泽布替尼、尼罗替尼、伊马替尼、维莫德吉、维罗非尼、替西罗莫司、舒尼替尼、赛立替尼、瑞格非尼、阿法替尼、曲美替尼、普钠替尼、硼替佐米、帕唑帕尼、阿西替尼、罗米地辛、依维莫司、依鲁替尼、乐伐替尼、达拉菲尼、克唑替尼、卡非佐米、奥斯替尼、卡博替尼、卡比替尼、吉非替尼、伏立诺他、凡德他尼、艾乐替尼、狄诺塞麦、索尼德吉、索拉非尼、博舒替尼、贝利司他、奥拉帕尼、阿柏西普、拉帕替尼、达沙替尼、帕博西尼、帕比司他或厄洛替尼中任一种或多种。
进一步地，所述药物或所述组合物还包括多肽类物质，所述多肽包括抗原或抗体，更优选地，所述抗体选自阿达木单抗、西妥昔单抗、替伊莫单抗、曲妥珠单抗、纳武单抗、达雷木单抗雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗、派姆单抗、派姆单抗、奥法木单抗、博纳吐单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、奥宾尤妥珠单抗、本妥昔单抗、地努图希单抗、托西莫单抗、埃罗妥珠单抗、曲妥珠单抗或利妥昔单抗中任一种或多种。
进一步地，上述肿瘤包括癌，所述癌包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、食管癌、恶性胶质瘤、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、肾脏肿瘤、肉瘤、母细胞瘤、头癌、舌癌、口腔癌等。
进一步地，所述药物或所述组合物是口服剂、注射剂、片剂、丸剂、散剂、混悬剂、颗粒剂、气雾剂、乳剂、分散剂、胶囊剂、膏剂、栓剂中任一种或多种；优选地，所述注射剂包括皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、淋巴结内注射、瘤内注射或足下注射中任一种或多种。
本发明相比于现有技术，具有以下有益的技术效果：
本发明公开了一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体新型靶向给药系统，涉及纳米工程化活细胞制剂的应用，特别是在抗肿瘤免疫治疗领域的应用，具体公开了pH响应共聚物、纳米刺激剂、抗体合成菌以及抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其制备方法。该生物活性杂合体系统采用温和、高效的Michael加成或“点击化学”反应进行化学偶联。通过工程菌的缺氧靶向能实现肿瘤靶向定植，并能持续表达免疫检查点抗体药物，解除T细胞的免疫抑制。与此同时，细菌表面的纳米刺激剂能响应肿瘤胞外微酸环境(pH<6.5)，可控释放细胞因子，刺激T细胞的增殖活化，通过对T细胞的双重免疫调控全面激活机体抗肿瘤效应，进而解决免疫检查点抗体药物响应率低和免疫相关不良反应严重等临床难题。
本发明技术的主要优势：(a)工程菌能靶向、定植于肿瘤并持续合成、分泌抗体，可解除肿瘤微环境对T细胞的免疫抑制，增强T细胞浸润并提高抗肿瘤的免疫疗效；(b)菌表面纳米粒子响应释放细胞因子等免疫活性蛋白，有效促进效应T细胞增殖和抗肿瘤活性。该抗体合成菌杂合体系统通过对效应T细胞的双重免疫调控，可全面提高抗肿瘤免疫治疗效果。
本发明的主要技术效果：
1)Mal、DBCO、BCN或Alkynyl标记的纳米刺激剂能与工程菌表面标记的巯基或叠氮基团发生温和、高效的发生Michael加成或“点击化学”反应，而不影响工程菌的功能活性。
2)基于Mal-poly(PEGn-co-His)、DBCO-poly(PEGn-co-His)、BCN-poly(PEGn-co-His)或Alkynyl-poly(PEGn-co-His)的纳米刺激剂赋予纳米粒子具有响应肿瘤胞外微酸环境(pH<6.5)的功能，可控释放细胞因子等免疫活性蛋白。
3)通过基因工程技术构建的工程菌不仅能缺氧靶向、定植于肿瘤，还能持续稳定的表达免疫检查点抗体药物。
4)利用该生物活性递送系统能靶向共递送免疫检查点抑制剂和细胞因子，实现对T细胞的双重免疫调控，全面激活机体抗肿瘤效应，解决免疫检查点抑制剂等抗体药物的免疫应答率低和免疫相关不良反应严重等临床难题。
附图说明
图1为抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的示意图。
图2为Michael加成反应合成具有pH响应的Mal-poly(PEGn-co-His)共聚物的示意图。
图3为Michael加成反应合成具有pH响应的DBCO-poly(PEGn-co-His)共聚物的示意图。
图4为Michael加成反应合成具有pH响应的BCN-poly(PEGn-co-His)共聚物的示意图。
图5为Michael加成反应合成具有pH响应的Alkynyl-poly(PEGn-co-His)共聚物的示意图。
图6为表达免疫检查点抗体药物的重组细菌的构建示意图。
图7为“点击化学”反应制备抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统(DBCO标记)的示意图。
图8为Michael加成反应制备抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统(Mal标记)的示意图。
图9为基于大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)构建的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的SEM表征(A)和马尔文粒度仪表征(B)；其中，EcN为大肠杆菌属Nissle 1917，EcN/Ab.为表达抗体的EcN，NPs为纳米刺激剂，NPs@Bacteria/Ab.为构建的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统。
图10为基于大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)构建的PD-1抗体合成菌-白细胞介素12(IL-12)纳米刺激剂杂合体系统的pH响应释放曲线(A)以及工程菌表达PD-1抗体的WesternBloting表征(B)，其中，EcN为大肠杆菌属Nissle 1917，EcN/PD-1.为表达PD-1抗体的EcN，INPs为IL-12纳米刺激剂，INPs@Bacteria/Ab.为构建的抗体合成菌-IL12纳米刺激剂杂合体系统。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：Mal-poly(PEG77-co-His)的制备
Michael加成反应制备肿瘤胞外pH响应共聚物，如图2所示。称取一定量的1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)、组胺(His)和马来酰亚胺-聚乙二醇氨基(Mal-PEG77-NH2)按摩尔比1:0.85:0.15的比例混合并溶解在一定体积的二甲基亚砜(DMSO)中，在氩气氛围55℃条件下反应48h，提纯并冷冻干燥得到聚合物粉末。所述共聚物进一步通过凝胶渗透色谱/核磁分析、鉴定。
实施例2：DBCO-poly(PEG77-co-His)的制备
Michael加成反应制备肿瘤胞外pH响应共聚物，如图3所示。称取一定量的1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)、组胺(His)和二苯基环辛炔-聚乙二醇氨基(DBCO-PEG77-NH2)按摩尔比1:0.85:0.15的比例混合并溶解在一定体积的二甲基亚砜(DMSO)中，在氩气氛围55℃条件下反应48h，提纯并冷冻干燥得到聚合物粉末。所述共聚物进一步通过凝胶渗透色谱/核磁分析、鉴定。
实施例3：Mal标记的IL-12纳米刺激剂的制备
采用微乳液法制备IL-12纳米刺激剂：10μg的IL-12溶于微量超纯水中，10mg的Mal-poly(PEG77-co-His)共聚物溶于10倍当量体积二氯甲烷中，混合搅拌1min，加1％的聚乙烯醇(PVA)再搅拌1min，最后加入10mLPBS继续搅拌30min，即得IL-12纳米刺激剂溶液(INPs)。表面Zeta电位、粒径和PDI由DLS检测，形貌通过TEM和SEM观察，并采用IL-12p70ELISA试剂盒检测载药量和包封率。
实施例4：DBCO标记的IL-12纳米刺激剂的制备
采用微乳液法制备IL-12纳米刺激剂：10μg的IL-12溶于微量超纯水中，10mg的DBCO-poly(PEG77-co-His)共聚物溶于10倍当量体积二氯甲烷中，混合搅拌1min，加1％的聚乙烯醇(PVA)再搅拌1min，最后加入10mL PBS继续搅拌30min，即得IL-12纳米刺激剂溶液(INPs)。表面Zeta电位、粒径和PDI由DLS检测，形貌通过TEM和SEM观察，并采用IL-12p70ELISA试剂盒检测载药量和包封率。
实施例5：表达PD-1抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917(EcN/PD-1)，的制备
制备表达PD-1抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917(EcN/PD-1)，如图6所示，具体方法如下：
(a)将含有PD-1抗体编码的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切、连接等步骤导入表达空载体，得到重组表达载体；
(b)及将所述重组表达载体转化到大肠杆菌Nissle 1917(EcN)的宿主细菌中，得到表达所述抗体的重组细菌；
(c)涂布在抗性培养基上筛选单克隆，经PCR阳性鉴定，测序，获得含有重组质粒的菌株(EcN/PD-1)。
实施例6：表达PD-1抗体的重组鼠伤寒沙门氏菌的制备
制备表达PD-1抗体的重组鼠伤寒沙门氏菌，如图6所示，具体方法如下：
(a)将含有PD-1抗体编码的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切、连接等步骤导入表达空载体，得到重组表达载体；
(b)及将所述重组表达载体转化到鼠伤寒沙门氏菌(VPN20009)的宿主细菌中，得到表达所述抗体的重组细菌；
(c)涂布在抗性培养基上筛选单克隆，经PCR阳性鉴定，测序，获得含有重组质粒的菌株。
实施例7：表达CTLA-4抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917的制备
制备表达CTLA-4抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917，如图6所示，具体方法如下：
(a)将含有CTLA-4抗体编码的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切、连接等步骤导入表达空载体，得到重组表达载体；
(b)及将所述重组表达载体转化到大肠杆菌Nissle 1917(EcN)的宿主细菌中，得到表达所述抗体的重组细菌；
(c)涂布在抗性培养基上筛选单克隆，经PCR阳性鉴定，测序，获得含有重组质粒的菌株。
实施例8：表达CTLA-4抗体的重组鼠伤寒沙门氏菌的制备
制备表达CTLA-4抗体的重组鼠伤寒沙门氏菌，如图6所示，具体方法如下：
(a)将含有CTLA-4抗体编码的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切、连接等步骤导入表达空载体，得到重组表达载体；
(b)及将所述重组表达载体转化到鼠伤寒沙门氏菌(VPN20009)的宿主细菌中，得到表达所述抗体的重组细菌；
(c)涂布在抗性培养基上筛选单克隆，经PCR阳性鉴定，测序，获得含有重组质粒的菌株。
实施例9：基于DBCO标记的PD-1抗体合成菌EcN-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)的制备
采用“点击化学”反应制备PD-1抗体的合成菌EcN-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)，DBCO标记，如图7所示，包括如下步骤：
(a)将密度为108CFU/mL的大肠杆菌Nissle 1917(EcN)菌液收集在离心管中，5000rpm离心并重悬于PBS溶液中；
(b)加入一定量的N3-PEG-NHS反应2h，5000rpm离心提取叠氮标记的菌泥；
(c)将1mL的DBCO标记的IL-12纳米粒子(INPs)加入到108CFU的叠氮基标记大肠杆菌Nissle 1917(EcN)中在30℃下孵育2h，差速离心除去未偶联IL-12纳米粒子(INPs)，获得PD-1抗体合成菌EcN-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)混悬液；
(d)表面Zeta电位、粒径和PDI由DLS检测，形貌及偶联效率通过TEM和SEM观察分析；
(e)结合IL-12p70 ELISA试剂盒检测IL-12纳米刺激剂“点击化学”反应的偶联效率。最后，采用活/死细菌染色实验考察抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的活性影响。
实施例10：基于Mal标记的PD-1抗体合成菌EcN-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)制备及结构、控释和生物合成表征
采用Michael加成反应制备PD-1抗体的合成菌EcN-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)，Mal标记，如图8所示，包括如下步骤：
(a)将密度为108CFU/mL的大肠杆菌Nissle 1917(EcN)菌液收集在离心管中，5000rpm离心并重悬于PBS溶液中；
(b)加入一定量三(2-羧乙基)膦(TCEP)，反应15min，5000rpm离心提取巯基标记的菌泥；
(c)将1mL的Mal标记的INPs加入到108CFU巯基标记的大肠杆菌Nissle 1917(EcN)中在30℃下孵育2h，差速离心除去未偶联INPs，获得PD-1抗体的合成菌EcN-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)的混悬液；
(d)表面Zeta电位、粒径和PDI由DLS检测，形貌及偶联效率通过TEM和SEM观察分析；
结果如图9所示，基于大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)构建的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的SEM表征(A)和马尔文粒度仪表征(B)，其中，EcN为大肠杆菌属Nissle1917，EcN/Ab.为表达抗体的EcN，NPs为纳米刺激剂，NPs@Bacteria/Ab.为构建的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统。
(e)结合IL-12p70 ELISA试剂盒检测IL-12纳米刺激剂Michael加成反应的偶联效率。最后，采用活/死细菌染色实验考察抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的活性影响；
结果如图10所示，基于大肠杆菌属Nissle 1917(EcN)构建的PD-1抗体合成菌-白细胞介素12(IL-12)纳米刺激剂杂合体系统的pH响应释放曲线(A)以及工程菌表达PD-1抗体的WesternBloting表征(B)，其中，EcN为大肠杆菌属Nissle 1917，EcN/PD-1.为表达PD-1抗体的EcN，INPs为IL-12纳米刺激剂，INPs@Bacteria/Ab.为构建的抗体合成菌-IL12纳米刺激剂杂合体系统。
实施例11：基于Mal标记的CTLA-4抗体合成菌-IL12纳米刺激剂杂合体系统的制备
(a)将密度为108CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌液(VPN20009)收集在离心管中，5000rpm离心并重悬于PBS溶液中；
(b)加入一定量的TCEP孵育15min，5000rpm离心提取巯基标记的菌泥；
(c)将1mL的Mal标记的INPs加入到108CFU的叠氮基标记的鼠伤寒沙门氏菌(VPN20009)中在30℃下孵育2h，差速离心除去未偶联INPs，获得CTLA-4抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统混悬液；
(c)表面Zeta电位、粒径和PDI由DLS检测，形貌及偶联效率通过TEM和SEM观察分析；
(d)结合IL-12p70 ELISA试剂盒检测IL-12纳米刺激剂Michael加成反应的偶联效率。最后，采用活/死细菌染色实验考察抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的活性影响。
实施例12：基于DBCO标记的CTLA-4抗体合成菌-IL12纳米刺激剂杂合体系统的制备
(a)将密度为108CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌液(VPN20009)收集在离心管中，5000rpm离心并重悬于PBS溶液中；
(b)加入一定量的Ac4ManNAz孵育12h，5000rpm离心提取叠氮标记的菌泥；
(c)将1mL的DBCO标记的INPs加入到108CFU的叠氮基标记的鼠伤寒沙门氏菌(VPN20009)中在30℃下孵育2h，差速离心除去未偶联INPs，获得CTLA-4抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统混悬液；
(c)表面Zeta电位、粒径和PDI由DLS检测，形貌及偶联效率通过TEM和SEM观察分析；
(d)结合IL-12p70 ELISA试剂盒检测IL-12纳米刺激剂“点击化学”的偶联效率。最后，采用活/死细菌染色实验考察抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的活性影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (25)

1.一种能响应肿瘤胞外微酸环境的共聚物，所述共聚物是Mal-poly(PEGn-co-His)，DBCO-poly(PEGn-co-His)，BCN-poly(PEGn-co-His)或Alkynyl-poly(PEGn-co-His)。
所述Mal-poly(PEGn-co-His)是由马来酰亚胺-聚乙二醇-氨基(Mal-PEGn-NH2)，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77，即Mal-poly(PEG77-co-His)；更优选地，所述PEG数均分子量3400；
所述DBCO-poly(PEGn-co-His)是由二苯并环辛炔-聚乙二醇-氨基(DBCO-PEGn-NH2)，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77，即DBCO-poly(PEG77-co-His)；更优选地，所述PEG数均分子量3400；
所述BCN-poly(PEGn-co-His)是由环丙烷环辛炔-聚乙二醇-氨基(BCN-PEGn-NH2)，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77，即BCN-poly(PEG77-co-His)；更优选地，所述PEG数均分子量3400；
所述Alkynyl-poly(PEGn-co-His)是由炔基-聚乙二醇-氨基(Alkynyl-PEGn-NH2)，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)和组胺(His)制备，其中PEG重复单元n＝1-1000；优选地，PEG重复单元n＝77，即Alkynyl-poly(PEG77-co-His)；更优选地，所述PEG数均分子量3400。
2.根据所述权利要求1所示的共聚物，其中，所述Mal-poly(PEGn-co-His)的制备方法是采用Michael加成反应，其中HDDA、His、Mal-PEGn-NH2的摩尔比为1:0.05～0.95:0.05～0.95；优选为1:0.85:0.15；
所述DBCO-poly(PEGn-co-His)的制备方法是采用Michael加成反应，其中HDDA、His、DBCO-PEGn-NH2的摩尔比为1:0.05～0.95:0.05～0.95；优选为1:0.85:0.15；
所述BCN-poly(PEGn-co-His)的制备方法是采用Michael加成反应，其中HDDA、His、BCN-PEGn-NH2的摩尔比为1:0.05～0.95:0.05～0.95；优选为1:0.85:0.15；
所述Alkynyl-poly(PEGn-co-His)的制备方法是采用Michael加成反应，其中HDDA、His、Alkynyl-PEGn-NH2的摩尔比为1:0.05～0.95:0.05～0.95；优选为1:0.85:0.15。
3.一种pH响应共聚物，所述pH响应共聚物是Mal-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure FDA0003412250660000021
或
所述pH响应共聚物是DBCO-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure FDA0003412250660000022
或
所述pH响应共聚物是BCN-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure FDA0003412250660000023
或
所述pH响应共聚物是Alkynyl-poly(PEGn-co-His)，其结构示例如下：
Figure FDA0003412250660000031
4.一种由权利要求1-3任一项所述的共聚物制备的纳米刺激剂(NPs)，所述纳米刺激剂为马来酰亚胺(Mal)标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂、DBCO标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂、BCN标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂或Alkynyl标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂，所述免疫活性蛋白包裹于所述共聚物的内部，所述免疫活性蛋白包括细胞因子，所述细胞因子包括以下任一种或多种：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、TNF-α、IFN-α、IFN-γ；
优选地，所述纳米刺激剂为IL-12纳米刺激剂(INPs)。
5.一种由权利要求1-3任一项所述的共聚物或权利要求4所述的纳米刺激剂与抗体合成菌共价结合而制备的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统(NPs@Bacteria/Ab.)，所述抗体合成菌是巯基基团或叠氮基团标记的抗体合成菌；所述杂合体系统是通过马来酰亚胺(Mal)与所述抗体合成菌上的巯基基团Michael加成获得，或所述杂合体系统是通过DBCO、BCN或Alkynyl与所述抗体合成菌上的叠氮基团的“点击化学”反应偶联获得。
6.根据权利要求5所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，所述抗体合成菌是细菌，优选为鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌；更优选地，所述鼠伤寒沙门氏菌包括VPN20009；更优选地，所述大肠杆菌包括Nissle 1917(EcN)。
7.根据权利要求5所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，所述巯基基团来自三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原获得；所述叠氮基团来自叠氮-聚乙二醇-活性酯(N3-PEG-NHS)或叠氮修饰的葡萄糖、半乳糖或甘露糖；
优选地，所述叠氮基团来自叠氮修饰的葡萄糖Ac4GlcNAz、半乳糖Ac4GalNAz或甘露糖Ac4ManNAz，其结构分别如下所示：
Figure FDA0003412250660000041
8.根据权利要求5-7任一项所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，所述抗体合成菌表达免疫检查点抗体；优选地，所述免疫检查点抗体包括以下任一种或多种：CTLA-4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体；更优选地，所述抗体选是哺乳动物源抗体、人源化抗体、纳米抗体、嵌合抗体或其功能活性片段，所述哺乳动物包括人、羊、鼠、兔、猴、猩猩、狒狒、猪、牛、马、狗和/或骆驼。
9.根据权利要求8所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统，其是PD-1/PD-L1/CTLA-4抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统(NPs@Bacteria/PD-1/PD-L1/CTLA-4)，或PD-1/PD-L1/CTLA-4抗体合成菌Nissle 1917-纳米刺激剂杂合体系统(NPs@EcN/PD-1/PD-L1/CTLA-4)，或PD-1/PD-L1/CTLA-4抗体合成菌Nissle 1917-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1/PD-L1/CTLA-4)；
优选地，所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统为PD-1抗体合成菌Nissle 1917-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-1)或PD-L1抗体合成菌Nissle 1917-IL12纳米刺激剂杂合体系统(INPs@EcN/PD-L1)。
10.一种权利要求1-3任一项所述的共聚物的制备方法，包括如下步骤：称取适量1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)、组胺(His)与Mal-PEGn-NH2或DBCO-PEGn-NH2或BCN-PEGn-NH2或Alkynyl-PEGn-NH2按摩尔比1:0.05～0.95:0.05～0.95的比例混合并溶解在适量体积的二甲基亚砜(DMSO)中，在惰性气体中35-85℃条件下反应16-72h，提纯并冷冻干燥得到聚合物粉末，经分析、鉴定获得所述共聚物Mal-poly(PEGn-co-His)、DBCO-poly(PEGn-co-His)、BCN-poly(PEGn-co-His)或Alkynyl-poly(PEGn-co-His)。
11.根据权利要求10所述的方法，所述摩尔比优选为1:0.85:0.15；所述反应是在55℃条件下反应48h。
12.一种权利要求4所述的纳米刺激剂的制备方法，采用薄膜分散法或微乳液法制备，
所述薄膜分散法包括如下步骤：
(a)有机相中溶解所述共聚物，旋蒸除去有机相，得薄膜聚合物层，
(b)将所述的免疫活性蛋白和PBS加入，探头超声获得免疫活性蛋白纳米粒子，
(c)超滤或透析，得到具有Mal、DBCO、BCN或Alkynyl修饰的核壳结构纳米粒子，即所述纳米刺激剂；
所述微乳液法包括如下步骤：
(A)有机相中溶解所述共聚物，加入聚乙烯醇(PVA)表面活性剂继续搅拌，
(B)缓慢滴入免疫活性蛋白溶液，继续搅拌，加入PBS并于超声探头下超声，
(C)超滤或透析，得到表面具有Mal、DBCO、BCN或Alkynyl修饰的核壳结构纳米粒子，即所述纳米刺激剂。
13.一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统(NPs@Bacteria/Ab.)的制备方法，包括以下步骤：
(a)将权利要求5-9任一项所述的抗体合成菌菌液收集在离心管中，离心并重悬于缓冲溶液中；
(b)加入适量的标记活性基团反应，离心提取标记活性基团的抗体合成菌；
(c)将权利要求4所述的纳米刺激剂加入到步骤(b)制备的标记活性基团的抗体合成菌中，在25-45℃下孵育0.5-4h，离心除去未偶联的纳米刺激剂，经检测，获得所述抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的混悬液。
14.根据权利要求13所述的方法，所述标记活性基团为巯基基团或叠氮基团；当所述标记活性基团为巯基基团时，所述纳米刺激剂为所述的Mal标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂；当所述标记活性基团为叠氮基团时，所述纳米刺激剂为所述的DBCO、BCN或Alkynyl标记的免疫活性蛋白纳米刺激剂。
15.根据权利要求14所述的方法，所述巯基基团来自三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原获得；所述叠氮基团来自叠氮-聚乙二醇-活性酯(N3-PEG-NHS)或叠氮修饰的葡萄糖、半乳糖或甘露糖；
优选地，所述叠氮基团来自叠氮修饰的葡萄糖Ac4GlcNAz、半乳糖Ac4GalNAz或甘露糖Ac4ManNAz，其结构分别如下所示：
Figure FDA0003412250660000061
16.根据权利要求13-15任一项所述的方法，所述抗体合成菌的构建方法包括：
(a)将含有编码所述免疫检查点抗体的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切、连接等步骤导入表达空载体，得到重组表达载体；
(b)将所述重组表达载体转化到宿主细菌中，得到表达所述免疫检查点抗体的重组细菌
(c)将步骤(b)得到的重组菌涂布在抗性培养基上筛选单克隆，经PCR阳性鉴定，测序，获得含有重组质粒的菌株，即表达所述免疫检查点抗体的抗体合成菌。
17.根据权利要求1-3任一项所述的共聚物、权利要求4所述的纳米刺激剂和/或权利要求5-9任一项所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的应用，所述应用选自如下任一种或多种：
(1)在制备药物组合物中的应用；
(2)在制备用于细胞检测的试剂中的应用；
(3)在制备用于疾病诊断或治疗的试剂中的应用；
(4)在体外筛选药物中的应用；
(5)在不以疾病诊断为目的体外检测中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，所述细胞包括正常细胞或肿瘤细胞；所述疾病包括肿瘤。
19.一种权利要求5-9任一项所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统或权利要求13-16任一项所述的方法在制备用于免疫治疗或检测的试剂或药物中的应用，所述免疫治疗或检测的对象包括肿瘤或疑似具有肿瘤特征的细胞、组织或人。
20.一种含有权利要求1-3任一项所述的共聚物、权利要求4所述的纳米刺激剂和/或权利要求5-9任一项所述的抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统的组合物。
21.根据权利要求20所述的组合物，所述组合物是药物或检测试剂。所述组合物还含有药学或医学上可接受的载体或赋形剂。
22.根据权利要求17-21任一项所述药物或组合物，其还包括抗肿瘤化合物；优选地，所述抗肿瘤化合物包括抗肿瘤广谱药物和/或抗肿瘤靶向药物；更优选地，所述抗肿瘤广谱药物选自喜树碱类药物、阿霉素类药物、紫杉醇类药物或铂类药物中任一种或多种，所述抗肿瘤靶向药物选自泽布替尼、尼罗替尼、伊马替尼、维莫德吉、维罗非尼、替西罗莫司、舒尼替尼、赛立替尼、瑞格非尼、阿法替尼、曲美替尼、普钠替尼、硼替佐米、帕唑帕尼、阿西替尼、罗米地辛、依维莫司、依鲁替尼、乐伐替尼、达拉菲尼、克唑替尼、卡非佐米、奥斯替尼、卡博替尼、卡比替尼、吉非替尼、伏立诺他、凡德他尼、艾乐替尼、狄诺塞麦、索尼德吉、索拉非尼、博舒替尼、贝利司他、奥拉帕尼、阿柏西普、拉帕替尼、达沙替尼、帕博西尼、帕比司他或厄洛替尼中任一种或多种。
23.根据权利要求17-21任一项所述药物或组合物，其还包括多肽类物质，所述多肽包括抗原或抗体；优选地，所述抗体选自阿达木单抗、西妥昔单抗、替伊莫单抗、曲妥珠单抗、纳武单抗、达雷木单抗雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗、派姆单抗、派姆单抗、奥法木单抗、博纳吐单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、奥宾尤妥珠单抗、本妥昔单抗、地努图希单抗、托西莫单抗、埃罗妥珠单抗、曲妥珠单抗或利妥昔单抗中任一种或多种。
24.根据权利要求18-19所述的应用、权利要求22-23任一项所述的药物或组合物，所述肿瘤包括癌，所述癌包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、食管癌、恶性胶质瘤、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、肾脏肿瘤、肉瘤、母细胞瘤、头癌、舌癌或口腔癌。
25.根据权利要求17-24任一项所述药物或组合物，所述药物或所述组合物是口服剂、注射剂、片剂、丸剂、散剂、混悬剂、颗粒剂、气雾剂、乳剂、分散剂、胶囊剂、膏剂、栓剂中任一种或多种；优选地，所述注射剂包括皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、淋巴结内注射、瘤内注射或足下注射中任一种或多种。
CN202111533428.9A 2021-12-15 2021-12-15 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用 Pending CN114349950A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111533428.9A CN114349950A (zh) 2021-12-15 2021-12-15 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用
PCT/CN2022/138176 WO2023109704A1 (zh) 2021-12-15 2022-12-09 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体及其抗肿瘤应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111533428.9A CN114349950A (zh) 2021-12-15 2021-12-15 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114349950A true CN114349950A (zh) 2022-04-15

Family

ID=81098886

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111533428.9A Pending CN114349950A (zh) 2021-12-15 2021-12-15 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114349950A (zh)
WO (1) WO2023109704A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023109704A1 (zh) * 2021-12-15 2023-06-22 深圳先进技术研究院 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体及其抗肿瘤应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160331844A1 (en) * 2015-04-22 2016-11-17 Curevac Ag Rna containing composition for treatment of tumor diseases
US20180319936A1 (en) * 2015-07-10 2018-11-08 Université De Haute-Alsace Polymerization system using double click michael addition and photopolymerization
US20190194444A1 (en) * 2017-11-03 2019-06-27 Massachusetts Institute Of Technology Gene delivery carrier

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190209690A9 (en) * 2011-10-12 2019-07-11 The Johns Hopkins University Bioreducible Poly (Beta-Amino Ester)s For siRNA Delivery
CA3069523A1 (en) * 2017-07-11 2019-01-17 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
KR20210030973A (ko) * 2018-07-11 2021-03-18 액팀 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드 조작된 면역자극성 박테리아 균주 및 이의 용도
CN111358811A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 深圳先进技术研究院 细菌-光热纳米颗粒复合物及制备方法和应用
CN114349950A (zh) * 2021-12-15 2022-04-15 深圳先进技术研究院 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体系统及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160331844A1 (en) * 2015-04-22 2016-11-17 Curevac Ag Rna containing composition for treatment of tumor diseases
US20180319936A1 (en) * 2015-07-10 2018-11-08 Université De Haute-Alsace Polymerization system using double click michael addition and photopolymerization
US20190194444A1 (en) * 2017-11-03 2019-06-27 Massachusetts Institute Of Technology Gene delivery carrier

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023109704A1 (zh) * 2021-12-15 2023-06-22 深圳先进技术研究院 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体及其抗肿瘤应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023109704A1 (zh) 2023-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Irvine et al. Enhancing cancer immunotherapy with nanomedicine
EP3290440B1 (en) Bispecific antibody capable of being combined with immune cells to enhance tumor killing capability, and preparation method therefor and application thereof
Chu et al. Metal-organic framework nanoparticle-based biomineralization: a new strategy toward cancer treatment
JP2020196754A (ja) がん及び感染症の治療方法並びに治療用組成物
CN112203669A (zh) 微生物组相关的免疫疗法
WO2021104088A1 (zh) 一种纳米颗粒载药系统及其制备方法和应用
CA2554755A1 (en) Functionalized colloidal metal compositions and methods
EP4005591A1 (en) Anti-neoplastic combined pharmaceutical composition and application thereof
JP2023510158A (ja) 細菌及び微生物細胞外小胞を含有する固形剤形
CN112826808B (zh) 一种环二核苷酸或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂及其应用
CN110585131A (zh) 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用
CN112048002A (zh) 一种靶向t细胞的酶敏感纳米体系及其制备方法和应用
WO2023109704A1 (zh) 一种抗体合成菌-纳米刺激剂杂合体及其抗肿瘤应用
CN109078009A (zh) 一种肿瘤靶向的纳米微囊及其制备方法和应用
Hu et al. The application of nanoparticles in immunotherapy for hepatocellular carcinoma
CN116421719A (zh) 一种peg可脱落和双敏感纳米药物及其制备方法与应用
Jiao et al. Anti-tumor immune potentiation targets-engineered nanobiotechnologies: Design principles and applications
CN112791106B (zh) 药物组合物及其治疗疾病的用途
Yu et al. Combined application of nanotechnology and multiple therapies with tumor immune checkpoints
Mohseninia et al. Harnessing self-assembling peptide nanofibers to prime robust tumor-specific CD8 T cell responses in mice
KR20170104024A (ko) 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 및 이의 용도
Alsharedeh et al. Magnetosomes as Potential Nanocarriers for Cancer Treatment
Pan et al. Bioorthogonal chemistry mediated cell engineering for advanced cell and cell-derived vesicle therapies: Principles, progresses, and remaining challenges
Li et al. Monophosphoryl lipid A-assembled nanovaccines enhance tumor immunotherapy
Chen et al. NKG2D-IL-15 fusion protein encapsulated in N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium) propyl] chitosan chloride retards melanoma growth in mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination