CN109078009A - 一种肿瘤靶向的纳米微囊及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中,所述肿瘤微环境敏感的聚合物包括肿瘤微环境敏感交联剂和2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,所述肿瘤微环境敏感交联剂至少包括肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂。所述肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂优选为基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂和透明质酸酶可降解的多肽交联剂中的一种或多种;更优选为基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂中的一种或多种。本发明所述肿瘤靶向的纳米微囊,粒径小且均一,靶向肿瘤微环境,能够实现定点递送和释放包载的药物和试剂,而且还具有血液中长循环功能。
Description
技术领域
本发明属于生物医药学、制剂学和高分子材料学领域,具体涉及一种基于肿瘤微环境特征的肿瘤靶向纳米微囊及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤治疗的最终目标是通过降低药物的全身毒性而增加患者的存活时间,提高生活质量。药物的靶向输送和释放是提高疗效、降低毒性的关键环节,其中一个重要的分支就是包载了抗肿瘤活性物质的纳米微囊。
在正常组织的血管中,2个内皮细胞之间的距离约为2nm,而在肿瘤血管中,2个内皮细胞之间的距离为100~150nm,这种结构特征导致了肿瘤组织具备增强渗透阻滞效应(enhanced permeability and retention effect,EPR effect)。纳米微囊的粒径一般为10~150nm,具有超强的渗透力,可以渗透入肿瘤组织并产生蓄积。这种以肿瘤的EPR效应为基石的纳米靶向给药系统只能称为“被动靶向”。随着对肿瘤和对肿瘤微环境研究的深入,主动靶向的纳米微囊成为研究的热点。
早期的肿瘤研究重点是肿瘤细胞,主要关注肿瘤细胞的基因突变、增殖凋亡等方面。随着研究的深入,人们认识到肿瘤是由肿瘤细胞和多种基质细胞以及非细胞组分构成的有机体,其核心是肿瘤细胞,而周围的基质细胞和非细胞组分构成了肿瘤细胞的生长环境,即“肿瘤微环境”。肿瘤微环境中的基质细胞被肿瘤细胞转化(transformation)时,在其周围产生大量的生长因子、细胞趋化因子及基质降解酶,通过诱生新生血管、抑制免疫反应和孕育肿瘤干细胞促进肿瘤发展,调控着肿瘤的多种生物学行为(杜钢军,等.治疗癌症的新途径:靶向肿瘤微环境[J].国际药学研究杂志,2011,38(5):336-341)。
郜明等综述了微环境与肿瘤的恶变,指出微环境低氧、高压、大量生长因子和水解蛋白酶产生及其免疫炎性反应等是肿瘤组织代谢环境的主要生物学特征,其对于肿瘤的生长、侵袭、转移以及血管的新生等具有非常重要的影响(郜明,等.肿瘤微环境与肿瘤的恶变[J].癌变畸变突变,2008,20(5):412-417)。上述肿瘤血管的特点也是肿瘤微环境中大量血管生长因子作用的结果。
Ma等的研究表明,乳腺癌从正常组织到癌前病变到浸润性导管癌的过程中,肿瘤基质中的细胞外基质(extracellular matrix,ECM;其成分包括胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖复合物)、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)和细胞周期相关基因表达明显上调;癌前病变至浸润性改变的特征是几种基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-11和MMP-14)的高表达(Ma XJ,et al.Gene expression profiling of the tumor micro-environment during breast cancer progression[J].Breast Cancer Res,2009,11(1):R7.)。在前列腺癌中,MMP-1和MMP-13具有促进肿瘤细胞侵袭的作用;在众多的家族成员中,MMP-2和MMP-9(它们是MMP家族中唯一的两个明胶酶)是已知的与癌症转移和侵袭密切相关的重要成员(华丹,等.金属基质蛋白酶类抗癌靶点及靶向多肽药物研究进展[J].中国新药杂志,2014,23(19):2231-2237)。
王玉等在综述中指出,由于肿瘤增生很快,脉管系统提供的营养和氧气不能满足其需要,缺氧导致能量不足,从而产生乳酸及ATP水解产物,致使肿瘤细胞外酸性增加,pH值比正常组织低(王玉,等.pH敏感型纳米制剂概述[J].中国药剂学杂志,2009,7(2):72-76)。
总之,肿瘤微环境具有低氧、低pH、生长因子和蛋白酶聚集的特点。针对这些特点,近年来,研究人员对抗肿瘤纳米粒的主动靶向修饰开展了大量研究。Ge等在其综述中记载:“酶可降解交联剂连接嵌段共聚物的不同单元及其聚合物可以用于装载化学治疗药物或显影剂,并通过酶降解而释放装载的药物或显影剂。”该篇综述进一步指出,MMP-2可降解多肽序列
(Gly-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-Lys)交联温度敏感多嵌段共聚物和泊洛沙姆三嵌段共聚物;温敏凝胶在体温范围内凝结,在肿瘤组织中遇到过表达的MMP-2而降解(Ge,Z.S.et al.Functional block copolymer assemblies responsive to tumor andintracellular microenvironments for site specific drug delivery and enhancedimaging performance[J].Chemical Society Reviews.2013,42(17):7289-7325)。
Daniel等用开环易位聚合(ROMP)法,利用耐受钌基引发剂的高活性官能团合成了两亲性嵌段共聚物,进而设计并制备得到了对基质金属蛋白酶(MMPs)和活性氧(ROS)双响应的纳米粒,用于炎症类疾病的靶向递药(Daniel K.B.,et al.Dual-responsivenanoparticles release cargo upon exposure to matrix metalloproteinase andreactive oxygen species[J],Chemical Communications,2016,52(10):2162-2128)。
现有技术的研究表明,肿瘤微环境特异性高表达的酶,如MMPs,以及特殊的生化条件,如低氧、低pH,可以作为药物递送系统的靶点。但是基于肿瘤的复杂性,开发出具有临床使用价值的靶向纳米微囊还有许多困难需要克服。
发明内容
为满足临床的治疗和诊断需求,本发明提供了一种肿瘤靶向的纳米微囊,相较于传统的仅基于EPR效应的被动靶向的纳米微囊,本发明所述的纳米微囊可以对肿瘤微环境中的多种特异性因素响应,在肿瘤部位快速释放,实现主动靶向,从而提高肿瘤治疗药物的疗效、降低全身毒性,或者更有利于肿瘤的早期诊断。
为了实现上述发明目的,本发明采用了如下的技术方案:
一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中,所述肿瘤微环境敏感的聚合物包括肿瘤微环境敏感交联剂和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,所述肿瘤微环境敏感交联剂至少包括肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂。
优选的,所述肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂和透明质酸酶可降解的多肽交联剂中的一种或多种。
更优选的,所述肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂中的一种或多种。
优选的,所述基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂、基质金属蛋白酶-7可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂中的一种或多种;更优选基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂中的一种或两种。
优选的,所述肿瘤微环境敏感交联剂还可以选自pH敏感交联剂和氧化还原敏感交联剂中的一种或多种。
优选的,所述pH敏感交联剂选自酯类交联剂和/或席夫碱类交联剂;更优选为二甲基丙烯酸乙二醇酯。
优选的,所述氧化-还原敏感交联剂选自含二硫键交联剂;更优选为二烯丙基二硫。
优选的,所述肿瘤微环境敏感的聚合物还包括疏水性可聚合单体。
作为一个优选的实施方式,本发明提供一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中所述肿瘤微环境敏感的聚合物包括上述肿瘤微环境敏感交联剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和疏水性可聚合单体;优选的,上述肿瘤微环境敏感交联剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和疏水性可聚合单体的摩尔比为:
肿瘤微环境敏感交联剂∶2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱∶疏水性可聚合单体=1∶10∶1~1∶100∶1。
作为一个优选的实施方案,本发明提供一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中所述肿瘤微环境敏感的聚合物由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、疏水性可聚合单体和一种或一种以上基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂聚合而成;所述基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂、基质金属蛋白酶-7可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂。
作为另一个优选的实施方案,本发明提供一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中所述肿瘤微环境敏感的聚合物由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、疏水性可聚合单体和两种或两种以上基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂聚合而成;所述基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂、基质金属蛋白酶-7可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂。
还有一个优选的实施方案,本发明提供一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中所述肿瘤微环境敏感的聚合物由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、疏水性可聚合单体和两种或两种以上肿瘤微环境敏感交联剂聚合而成,所述肿瘤微环境敏感交联剂包括选自基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂、基质金属蛋白酶-7可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂中的一种或一种以上,和选自所述pH敏感交联剂或所述氧化-还原交联剂中的一种或一种以上。
优选的,所述疏水性可聚合单体选自丙烯酸类化合物,更优选自丙烯酸及其盐类、酯类、酰胺类衍生物,或烷基取代的丙烯酸及其盐类、酯类、酰胺类衍生物。
进一步优选的,所述疏水性单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、二甲基丙烯酸乙二酯、亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酸羟丙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、N-2-羟丙基-甲基丙烯酰胺中的一种或任意比例的多种。
优选的,所述具有抗肿瘤活性的物质选自抗肿瘤单克隆抗体、抗肿瘤单克隆抗体-小分子化合物共轭物、抗肿瘤双特异性抗体或抗肿瘤小分子化合物。
所述抗肿瘤单克隆抗体可以选自尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、地诺单抗(Denosumab)、易普利单抗(或称伊匹单抗,Ipilimumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、帕姆单抗(或称派姆单抗,Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、阿伦珠单抗(Alemtuzumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、阿托珠单抗(Obinutuzumab)、Dinutuximab等。
抗肿瘤单克隆抗体-小分子化合物共轭物选自(ado-trastuzumabemtansine)、(ziv-aflibercept)、(Gemtuzumab-ozogamicin)、(brentuximab-vedotin)、等。
所述抗肿瘤双特异性抗体可以选自(Catumaxomab)、(blinatumomab)等。
所述抗肿瘤小分子化合物可以选自长春花属生物碱(例如长春花碱、长春新碱#、长春氟宁§、长春地辛、长春瑞滨)、阿霉素及其衍生物、紫杉烷类(如卡巴他赛、多西他赛、拉罗他赛、奥他赛、紫杉醇、替司他赛等)、二氢叶酸还原酶抑制剂(如氨基蝶呤、氨甲蝶呤#、培美曲塞、普拉曲沙等)、胸苷酸合成酶抑制剂(如雷替曲塞、培美曲塞等)、腺苷脱氨酶抑制剂(如喷司他丁等)、卤化/核糖核苷酸还原酶抑制剂(如克拉屈滨、克罗拉滨、氟达拉滨、奈拉滨等)、硫嘌呤类(如硫鸟嘌呤、巯嘌呤等)、胸苷酸合成酶抑制剂(5-氟尿嘧啶#、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、氟尿苷)、聚合酶链式反应抑制剂(如阿糖胞苷等)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(如吉西他滨等)、DNA甲基化抑制剂(如阿扎胞苷、地西他滨等)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(如羟基脲)、喜树生物碱(如喜树碱、拓扑替康、伊立替康、鲁比替康、贝洛替康等)、鬼臼生物碱(如依托泊苷、替尼泊苷等)、蒽环类药物(如阿柔比星、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、氨柔比星吡柔比星、戊柔比星、佐柔比星)、蒽醌类药物(如米托蒽醌、匹杉琼等)、氮芥、环磷酰胺类(如环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺等)、苯丁酸氮芥(如美法仑、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀等)、亚硝脲类(如卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、链脲佐菌素等)、烷基磺酸酯类(如白消安等)、氮丙环类(如卡波醌、噻替哌、三亚胺醌、曲他胺等)、有机铂化合物(如卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸三铂、沙铂等)、肼衍生物(如丙卡巴肼等)、三氮烯类(如达卡巴嗪、替莫唑胺等)、六甲蜜胺、二溴甘露醇、哌泊溴烷、链霉菌霉素(如放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、普卡霉素等)、5-氨基酮戊酸/氨基乙酰丙酸甲酯、乙丙昔罗、卟啉衍生物(如卟吩姆钠、他拉泊芬、替莫泊芬、维替泊芬等)、酪氨酸激酶抑制剂(如甲磺酸伊马替尼、吉非替尼、拉帕替尼、尼罗替尼、替拉替尼、苹果酸舒尼替尼、盐酸埃罗替尼、来那替尼、达沙替尼、伯舒替尼、伊马替尼、阿西替尼、埃罗替尼、凡德他尼、塞卡替尼、卡纽替尼二盐酸盐、卡奈替尼、苏尼替尼、达沙替尼、坦度替尼、木利替尼、二对甲苯磺酸拉帕替尼、替尼达普、多韦替尼、来他替尼、N-去甲基伊马替尼、巴氟替尼、替拉替尼、巴非替尼、替尼索洛尔、吡替尼定、替尼酸、替尼西坦、阿法替尼、莫立替尼、尼罗替尼、卡那替尼、甲磺酸苏尼替尼、替尼拉平、安替尼特、替尼沙秦、伊玛替尼胺、盐酸埃诺替尼、甲苯磺酸索拉替尼、替尼达普钠等)、法尼基转移酶抑制剂(如替吡法尼等)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(如夫拉平度、塞利西利等)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米等)、磷酸二酯酶抑制剂(如阿那格雷等)、肌苷酸脱氢酶抑制剂(如噻唑呋林等)、脂氧合酶抑制剂(如马索罗酚)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(如奥拉帕尼)、组织蛋白去乙酰酶抑制剂(如伏立诺他、罗米地辛等)、内皮素受体拮抗剂(如阿曲生坦等)、视黄醇类X受体激动剂(如蓓萨罗丁等)、性类固醇(如睾内酯等)、安吖啶、曲贝替定、类维生素A(如9-顺式维甲酸、维A酸等)、三氧化二砷、降天冬酰胺剂(如门冬酰胺酶/昂卡司帕)、塞来昔布、秋水仙胺、伊利司莫、依沙芦星、依托格鲁、氯尼达明、硫蒽酮、米托胍腙、米托坦、奥利默森、高三尖杉酯碱、雷帕霉素靶蛋白抑制剂(如依维莫司、西罗莫斯等)等等。
本发明的另一个目的在于提供上述肿瘤靶向的纳米微囊的制备方法,通过原位聚合法,包括的步骤有:先将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和所述疏水性可聚合单体加入所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂的溶液,然后加入所述肿瘤微环境敏感交联剂,最后加入引发剂,0~30℃下反应0.1~24小时。
优选的,所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂与所述肿瘤微环境敏感交联剂的摩尔比为1:100~1:10000。
优选的,所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比为1:500~1:10000。
优选的,所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂与疏水性可聚合单体的摩尔比为1:100~1:10000。
优选的,所述引发剂由过硫酸盐和选自四甲基乙二胺、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠中的一种组成,两者的摩尔比为1:100~100:1;
还优选的,所述过硫酸盐选自过硫酸铵或过硫酸钾。
上述制备方法中,加入所述引发剂后的反应温度,以不使所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂失活为宜。对于单克隆抗体或双特异性抗体,反应温度不超过4℃.对于小分子化合物或显影剂,则可以在高一些的温度,例如室温下进行原位聚合。
本发明还提供上述肿瘤靶向的纳米微囊在制备肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物中的应用。
本发明所述金属基质蛋白酶-2可降解的多肽交联剂、金属基质蛋白酶-7可降解的多肽交联剂、金属基质蛋白酶-9可降解的多肽交联剂等,均已经商品化,可以通过公开的渠道购买。如实施例1所用的金属基质蛋白酶-2可降解的多肽交联剂即由上海强耀生物技术公司生产,含有“VPLGVRTK”的氨基酸系列。
本发明所述疏水性可聚合单体,分子结构中具有不饱和的双键,通过加成反应可以与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、交联剂键合。
本发明提供的肿瘤靶向的纳米微囊,具有壳-核结构。以交联剂为MMPs可降解的多肽,包载抗肿瘤单克隆抗体的肿瘤靶向纳米微囊为例,如图1所示,所述“壳”以所述MMPs可降解的多肽两端连接生物相容性好的亲水性的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和所述疏水性可聚合单体,或者连接由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和所述含有双键的疏水性单元各自的聚合链段或两者的嵌段共聚物,从而形成类似“网状”的壳结构。壳内包封的“核”为抗肿瘤单克隆抗体。该肿瘤靶向的纳米微囊经静脉注射进入血液循环,首先基于肿瘤组织的EPR效应在肿瘤组织内富集,纳米微囊囊壳中存在的MMPs可降解多肽被肿瘤微环境中高表达的基质金属蛋白酶(MMPs)降解,从而使纳米微囊解体,其中包载的单克隆抗体则快速被释放出来,作用于肿瘤细胞,抑制其增殖。
本发明所述肿瘤靶向的纳米微囊,粒径小且均一(在50nm以内),除了能够靶向肿瘤,定点递送和释放包载的药物和试剂外,还具有血液中长循环功能。以实施例1制备的纳米微囊为例,其血液中半衰期时间达到48h。由于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的生物相容性好,能够穿过血脑屏障等体内的“递送屏障”,因此本发明提供的纳米微囊特别为脑瘤的治疗或诊断提供了有利的手段和方法。
附图说明
下面结合附图,对本发明作详细说明。
图1示出的是本发明所述基质金属蛋白酶(MMPs)敏感的肿瘤靶向纳米微囊的原位聚合过程及其在肿瘤组织内降解过程的三维示意图;其中,表示2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,表示疏水性可聚合单体,表示MMPs可降解的多肽(两端具有双键),表示抗肿瘤单克隆抗体,表示基质金属蛋白酶(MMPs)。
图2示出的是实施例1制备的纳米微囊的透射电镜图片。
图3示出的是实施例1制备的纳米微囊的粒径分布图。
图4示出的是实施例1制备的纳米微囊的Zeta电荷分布图。
图5是实施例1制备的纳米微囊对U87胶质瘤裸鼠原位模型脑靶向功能的检测图,其中1是对照组,2是纯抗体治疗组,3是纳米微囊治疗组。
图6是实施例1制备的纳米微囊对U87胶质瘤裸鼠原位模型治疗效果评价图。
图7是实施例1制备的纳米微囊对MGC803胃癌裸鼠皮下模型治疗效果评价图。
图8示出的是实施例2制备的纳米微囊的透射电镜图片。
图9示出的是实施例3制备的纳米微囊的透射电镜图片。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明,但并不因此限制本发明的保护范围。如无特别说明,以下实施例中所涉及到的试剂或原料均可以通过公开的商业渠道获得。其中:
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱:Sigma公司
N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐:Sigma公司
基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂:上海强耀生物技术公司
尼妥珠单抗:百泰生物药业有限公司,批号0120120207
西妥昔单抗:德国默克公司,进口药品注册证号:S20130004
实施例1含有MMP-2可降解交联剂包载尼妥珠单抗纳米微囊的制备及表征
取含1mg尼妥珠单抗的溶液(200μL),加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐,尼妥珠单抗与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐的摩尔比是1:300,再加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,尼妥珠单抗与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比是1:4000;然后再按尼妥珠单抗与交联剂的摩尔比为1:500的比例加入基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂,静置10min,利用静电和氢键作用,在单抗的周围富集反应单体以及酶可降解多肽交联剂;然后加入过硫酸铵和四甲基乙二胺,尼妥珠单抗与过硫酸铵、四甲基乙二胺的摩尔比为1:500:1000,在4℃条件下反应2h,制备聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱包载的尼妥珠单抗纳米微囊。
对聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱包载的尼妥珠单抗纳米微囊进行透射电镜图观察,如图2所示,可见纳米微囊表面圆滑,粒径均一;进一步使用粒径分析仪(BI-90Plus,布鲁克海文仪器公司,美国)对所得产物进行粒径分布检测和表面电荷测试,可见纳米微囊表面圆滑,粒径均一,粒径(nm)为30±5(如图3所示);表面电荷(mV)为2.3(如图4所示)。
试验例1实施例1制备的纳米微囊对U87胶质瘤裸鼠原位模型治疗效果评价
病毒侵染前一天将U87细胞(ATCC,USA,HTB-14)铺于24孔板,密度为1×105-1×106,在5%CO2,37℃下恒温培养,培养基为DMEM培养基(GBICO,USA,11965-092),血清选用进口小牛血清(HyClone,SH30071.03)。24h后加入编码荧光素酶的病毒液10-500μl(上海吉玛制药技术有限公司),并加入海10-50μl美溴铵(polybrene)增加侵染效率;12h后更换为DMEM培养基;48h后加入筛选药物10-100μl嘌呤霉素(Puromycin),加压筛选2周后,获得阳性克隆,并扩大培养,以备移植入裸鼠颅内建立原位模型。
裸鼠麻醉稳定后,于头顶部开手术切口,并于颅骨上打孔,至于立体定向仪(美国Stoelting,lab standardTM)上放置好;将上述两种细胞消化后,重悬于适量培养基中,用注射器缓慢注射于鼠脑中,之后手术缝线缝合皮肤。接种肿瘤10天后活体成像观察肿瘤成瘤率,将动物随机分组,每组10只,尾静脉注射尼妥珠单抗和实施例1制备的纳米微囊,剂量为每公斤体重5mg,隔天注射,共计注射10次。每隔10天对动物颅内肿瘤大小采取活体成像仪(Xenogen,Waltham,MA,USA,200)进行监测,同时对动物生存期进行统计,统计结果为:对照组vs纯抗体治疗组,p=0.1745;对照组vs纳米胶囊治疗组,p=0.0385;纯抗体治疗组vs纳米胶囊治疗组,p=0.0061。
如图5、6所示,与纯抗体治疗组的动物脑部肿瘤生长速率相比,实施例1制备的纳米微囊治疗组动物脑部肿瘤生长速度明显减慢,对治疗开始后的5个时间观察点(10,20,30,40,50天)进行肿瘤大小的定量检测结果也进一步证实了上述结果。
试验例2实施例1制备的纳米微囊对MGC803胃癌裸鼠皮下模型治疗效果评价
利用100μl微量进样器将稳定表达荧光素酶的MGC803胃癌细胞按每注射点5×105个细胞接种于4周龄裸鼠皮下,从而建立瘤源。待皮下肿瘤达到长径3cm时,取下瘤块,均匀切碎,并植入各实验组(n=6)裸鼠皮下,继续喂养,当长径达到5mm左右,各实验组开始治疗。治疗方式为尾静脉注射,治疗剂量为每公斤体重5mg,治疗次数为一次。同时开始观察治疗效果,每两天通过活体成像仪采集肿瘤细胞的荧光素酶活性值,持续监测30天,然后将各处理组裸鼠处死,剥下瘤块。如图7所示,与纯尼妥珠单抗治疗组相比,实施例1制备的纳米微囊治疗组肿瘤增殖速率明显降低。
实施例2含有pH敏感交联剂的包载特异性双抗的纳米微囊的制备及表征
取含1mg双抗的溶液(200μL),加入丙烯酰胺单体,与丙烯酰胺的摩尔比是1:300,再加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,双抗与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比是1:4000;然后再按双抗与交联剂的摩尔比为1:500的比例加入二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂,静置10min,利用氢键作用,在双抗的周围富集反应单体以及pH敏感交联剂;然后加入过硫酸铵和四甲基乙二胺,双抗与过硫酸铵、四甲基乙二胺的摩尔比为1:500:1000,在4℃条件下反应2h,制备含pH敏感交联剂的包载特异性双抗的纳米微囊。
对上述制备的包载特异性双抗的纳米微囊进行透射电镜图观察,如图8所示,可见纳米微囊表面圆滑,粒径均一。
实施例3含有氧化还原敏感交联剂的包载西妥昔的纳米微囊的制备及其表征
取含1mg西妥昔单抗的溶液(200μL),加入丙烯酰胺单体,西妥昔单抗与丙烯酰胺的摩尔比是1:300,再加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,西妥昔单抗与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比是1:4000;然后再按西妥昔单抗与交联剂的摩尔比为1:500的比例加入二烯丙基二硫交联剂,静置10min,利用氢键作用,在西妥昔单抗的周围富集反应单体以及氧化还原敏感交联剂;然后加入过硫酸铵和四甲基乙二胺,西妥昔单抗与过硫酸铵、四甲基乙二胺的摩尔比为1:500:1000,在4℃条件下反应2h,制备含有氧化还原敏感交联剂包载西妥昔单抗的纳米微囊。
对上述制备的包载西妥昔单抗的纳米微囊进行透射电镜观察,如图9所示,可见纳米微囊表面圆滑,粒径均一。
对比例1
取含1mg双抗的溶液(200μL),加入丙烯酰胺单体,双抗与丙烯酰胺的摩尔比是1:300,再加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,双抗与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比是1:400;然后再按双抗与交联剂的摩尔比为1:500的比例加入二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂,静置10min;然后加入过硫酸铵和四甲基乙二胺,双抗与过硫酸铵、四甲基乙二胺的摩尔比为1:500:1000,在4℃条件下反应2h,结果在透射电镜下观察不到纳米微囊,说明未能制备得到包载双抗的纳米微囊。
对比例2
取含1mg西妥昔单抗的溶液(200μL),加入丙烯酰胺单体,西妥昔单抗与丙烯酰胺的摩尔比是1:30,再加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,西妥昔单抗与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比是1:4000;然后再按西妥昔单抗与交联剂的摩尔比为1:50的比例加入二烯丙基二硫交联剂,静置10min;然后加入过硫酸铵和四甲基乙二胺,西妥昔单抗与过硫酸铵、四甲基乙二胺的摩尔比为1:500:1000,在4℃条件下反应2h,结果在透射电镜下观察不到纳米微囊,说明未能制备得到包载西妥昔单抗的纳米微囊。
Claims (10)
1.一种肿瘤靶向的纳米微囊,包括肿瘤微环境敏感的聚合物包封的具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂;其中所述肿瘤微环境敏感的聚合物包括肿瘤微环境敏感交联剂和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱,所述肿瘤微环境敏感交联剂至少包括肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂。
2.根据权利要求1所述的纳米微囊,其特征在于,所述肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂和透明质酸酶可降解的多肽交联剂中的一种或多种;
优选的,所述肿瘤微环境中过表达的酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的纳米微囊,其特征在于,所述基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂、基质金属蛋白酶-7可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂中的一种或多种;
优选的,所述基质金属蛋白酶可降解的多肽交联剂选自基质金属蛋白酶-2可降解的多肽交联剂和基质金属蛋白酶-9可降解的多肽交联剂中的一种或两种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米微囊,其特征在于,所述肿瘤微环境敏感交联剂还选自pH敏感交联剂和氧化还原敏感交联剂中的一种或多种;
优选的,所述pH敏感交联剂选自酯类交联剂和/或席夫碱类交联剂,更优选为二甲基丙烯酸乙二醇酯;
优选的,所述氧化-还原敏感交联剂选自含二硫键交联剂,更优选为二烯丙基二硫。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米微囊,其特征在于,所述肿瘤微环境敏感的聚合物还包括疏水性可聚合单体;
优选的,所述肿瘤微环境敏感交联剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和所述疏水性可聚合单体的摩尔比为:
所述肿瘤微环境敏感交联剂∶2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱∶所述疏水性可聚合单体=1∶10∶1~1∶100∶1。
6.根据权利要求5所述的纳米微囊,其特征在于,所述疏水性可聚合单体选自丙烯酸类化合物,优选丙烯酸及其盐类、酯类、酰胺类衍生物,或烷基取代的丙烯酸及其盐类、酯类、酰胺类衍生物;
更优选的,所述疏水性可聚合单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、二甲基丙烯酸乙二酯、亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酸羟丙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、N-2-羟丙基-甲基丙烯酰胺中的一种或任意比例的多种。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米微囊,其特征在于,所述具有抗肿瘤活性的物质选自抗肿瘤单克隆抗体、抗肿瘤单克隆抗体-小分子化合物共轭物、抗肿瘤双特异性抗体或抗肿瘤小分子化合物。
8.权利要求1至7中的任一项所述纳米微囊的制备方法,通过原位聚合,包括的步骤有:先将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和所述疏水性可聚合单体加入所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂的溶液,然后加入所述肿瘤微环境敏感交联剂,最后加入引发剂,0~30℃下反应0.1~24小时。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂与所述肿瘤微环境敏感交联剂的摩尔比为1:100~1:10000;
优选的,所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的摩尔比为1:500~1:10000;
优选的,所述具有抗肿瘤活性的物质、肿瘤诊断试剂或显影剂与疏水性可聚合单体的摩尔比为1:100~1:10000;
优选的,所述引发剂由过硫酸盐和选自四甲基乙二胺、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠中的一种组成,两者的摩尔比为1:100~100:1;
还优选的,所述过硫酸盐选自过硫酸铵或过硫酸钾。
10.权利要求1至7中任一项所述的纳米微囊,或权利要求8或9所述制备方法制备得到的纳米微囊,在制备肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物中的应用。
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