KR20170104024A

KR20170104024A - 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170104024A
Application number: KR1020160025510A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 김재규; 최현일
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2017-09-14

Abstract

본 발명은 헬리코박터파일로리균에서 분리한 나노소포에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 위 조직에 특이적으로 부착하는 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포는 위 질환 치료용 또는 진단용 물질을 위 조직에 특이적으로 전달하여 원하지 않는 곳에 물질이 전달되는 것을 감소시킴으로써 이에 따른 부작용 및 환자의 고통과 불편을 줄일 수 있으며, 더욱이 특이세포 또는 특이조직으로만 물질을 전달함으로써 치료효과 또는 진단효율을 증가시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 전이암과 같은 기존의 항암치료 방법으로 치료가 어려운 경우, 효과적으로 전이암을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 및 이의 용도{Nanovesicles derived from Helicobacter pylori and Use thereof}

본 발명은 헬리코박터파일로리균에서 분리한 나노소포에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 위 조직에 특이적으로 부착하는 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 및 이의 용도에 관한 것이다.

질병 치료를 위해 약물을 개체에 투여하는 경우, 투여되는 약물이 최적의 효력을 발휘하도록 세포, 조직, 장기, 및 기관으로의 전달 및 방출을 제어하는 약물전달 시스템(drug delivery system; DDS)이 중요하다. 약물전달시스템은 약물의 혈중농도를 적절히 유지시켜 최대의 치료효과를 낼 수 있고 이를 이용하여 의약품의 약효 및 안정성 극대화, 약물제제의 시간 연장, 생물학적 이용도 증가, 및 부작용을 최소화하여 필요한 신체부위로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술이므로 의약품 자체에 못지않게 중요하다.

1960년대 초창기부터 주사 및 주입형태, 좌약식 형태, 비강 및 구강 투여, 그리고 피부나 폐를 통한 약물전달 시스템 개발이 이루어졌으며, 최근에는 환자 및 사용 목적에 따라 흡수촉진 및 제어형 DDS(경구, 경피, 점막), 약효지속형 DDS(주사제, 경구, 경피), 표적부위 타겟형 DDS(경구, 주사 등) 및 인공지능(intelligent) DDS(on demand형) 등 그 유형이 더욱 다양해지고 있다. 이중 표적부위만을 타겟할 수 있는 DDS는 특히 부작용이 심한 약물, 예컨대 암세포뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 강한 독성을 나타내는 항암제와 같은 약물들의 전달에 있어서 환자의 고통과 불편을 줄이기 위해 매우 중요하다.

1960년대에 처음 사용된 이래 약물 전달 시스템으로 널리 연구되어온 리포좀(liposome)은 다양한 인지질 성분으로 만들어지는 세포막과 유사한 인공막으로, 입자 크기범위가 나노형 즉, 콜로이드성 반고형 분산제제로 볼 수 있다. 리포좀 제제는 독성이 적고 처방에 따라 크기, 전하, 막 구성, 및 막 투과성 등의 조절이 가능하기 때문에 응용가능성이 매우 크다. 최근에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol (PEG))과 같은 폴리머를 리포좀과 접합(conjugation)하여 약물을 내포한 리포좀이 혈액에서 쉽게 제거되지 않도록 하여 약물의 혈액 내 유지 시간(circulatory half-life)을 증가시킨 스텔스 리포좀(stealth liposome)이 개발되었고, 이 방법으로 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 전달하는 독실(DOXIL)이 상용화되었다. 나아가, 인공적으로 합성된 지질로 이루어진 리포좀 대신 자연적인 세포막을 이용한 전달 시스템이 최근 연구되고 있다. 예컨대, 사람의 적혈구 세포막을 이용한 전달 시스템이 보고된바 있다(미국 공개특허 US2007/0243137). 그러나 상기 리포좀 제제 및 적혈구 유래 세포막들은 특정 세포를 인식하는 능력이 없기 때문에 특정 세포나 조직으로 약물을 전달하는 목적으로는 사용할 수 없다.

이에 따라 특정 표적에 결합할 수 있도록 단일표적항체 등을 접합한 리포좀이 개발되고 있고, 최근에는 미생물이 분비하는 미니셀을 약물에 전달에 이용하는 방법이 보고된바 있으나, 아직 임상 시험을 통과하여 상용화된 것은 없는 실정이다.

더욱이 아직까지 위 상피세포 혹은 상피조직에 특이적으로 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있는 약물 전달 시스템에 대해서는 공개된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 12지장궤양, 위염, 위궤양, 및 위염 환자들의 위액으로부터 나노소포를 분리하여 메타게놈 분석을 실시한 결과, 특히 위암 환자의 위액에 헬리코박터균 유래 나노소포가 다량 존재함을 확인하였고, 상기 나노소포가 위 조직에 특이적으로 부착하여 잔존하는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포를 포함하는, 위 특이적 물질전달용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포에 위 질환 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포를 포함하는, 위 특이적 물질전달용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포에 위 질환 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 나노소포는 평균 직경이 10 nm 내지 100 nm인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 나노소포는 헬리코박터파일로리균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노소포는 내포작용을 통해 위 조직 상피세포로 유입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 위 질환은 12지장궤양, 위염, 위궤양, 위하수증, 위산과다증, 위 확장증, 무산증, 공기연하증, 위경련, 유문협착, 위축염전증, 위폴립, 위석, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 질환일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 외부에서 주입된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 특이 세포 또는 조직에 전달하는 단계를 포함하는, 위 특이적 물질전달 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 위 질환 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위 질환 치료 또는 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 위 질환 치료 또는 진단 용도를 제공한다.

본 발명자들은 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포가 위에 특이적으로 부착하여 오랜 시간 잔존하며, 내포작용을 통해 위 조직 상피세포로 유입되는 것을 실험을 통해 직접적으로 확인하였는바, 본 발명에 따른 상기 나노소포는 위 질환 치료용 또는 진단용 물질을 위 조직에 특이적으로 전달하여 원하지 않는 곳에 물질이 전달되는 것을 감소시킴으로써 이에 따른 부작용 및 환자의 고통과 불편을 줄일 수 있으며, 더욱이 특이세포 또는 특이조직으로만 물질을 전달함으로써 치료효과 또는 진단효율을 증가시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 전이암과 같은 기존의 항암치료 방법으로 치료가 어려운 경우, 효과적으로 전이암을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 12지장궤양, 위염, 위궤양, 및 위암 환자들의 위액으로부터 나노소포를 분리하는 과정 중의 나노소포층 사진 및 분리된 나노소포의 단백질 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 12지장궤양, 위염, 위궤양, 및 위암 환자들의 위액으로부터 분리한 나노소포를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2b는 12지장궤양, 위염, 위궤양, 및 위암 환자들의 위액으로부터 분리한 나노소포의 크기를 동적광산란법으로 측정한 결과이다.
도 3은 12지장궤양, 위염, 위궤양, 및 위암 환자들의 위액으로부터 분리한 나노소포에 존재하는 박테리아 유전자의 비율을 확인하기 위해, 상기 나노소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈 분석을 실시한 결과이다.
도 4a는 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4b는 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 크기를 동적광산란법으로 측정한 결과이다.
도 4c는 헬리코박터파일로리균(Hp), Cag A가 없는 균주(Cag A KO), 및 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포(Hp EV)를 이용해 SDS-PAGE를 수행하여 헬리코박터균의 대표적 독소물질인 Cag A 및 Vac A의 존재여부를 확인한 결과이다.
도 5는 Cy7 형광이 결합된 헬리코박터파일로리 균주 및 이의 나노소포를 마우스에 경구 투여한 후 IVIS 장비로 이미징함으로써 상기 균주 및 나노소포가 마우스 위에 특이적으로 부착하여 잔존하는 것을 확인한 결과이다.
도 6은 형광염색을 통해 나노소포가 내포작용에 의해 사람 위장 상피세포 내로 유입되는 것을 확인한 결과이다(PBS: 대조군, Hp EV: 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 투여군).
도 7은 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 안전성을 평가하기 위해 헬리코박터파일로리 균주 또는 이의 나노소포 각각을 마우스에 경구 또는 복강 투여한 후 비장 내 면역세포 변화 및 혈청 내 IgG1 항체 양을 측정한 결과이다(Media 또는 PBS: 대조군, Bacteria: 헬리코박터파일로리 균주 경구 투여군, EV: 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 경구 투여군, IP Bacteria: 헬리코박터파일로리 균주 복강 투여군, IP EV: 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 복강 투여군).

본 발명자들은 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포가 위 조직에 특이적으로 부착하여 잔존하는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포를 포함하는, 위 특이적 물질전달용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 물질은 위 질환을 치료 또는 진단하기 위한 물질일 수 있으나, 치료 또는 진단 이외의 다른 목적이라도 위 특이적 전달이 필요한 경우라면 이에 제한되지 않는다.

상기 위 질환은 12지장궤양, 위염, 위궤양, 위하수증, 위산과다증, 위 확장증, 무산증, 공기연하증, 위경련, 유문협착, 위축염전증, 위폴립, 위석, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 헬리코박터파일로리균은 몇 개의 편모를 가지고 있는 그람음성 나선형 세균으로, 증식속도가 느리고 움직임이 빠른 특징을 가지고 있으며, 또한 위장점막에서 살아가는데 필수적인 요소분해효소(urease)를 가지고 있는 것이 특징 중 하나이다. 헬리코박터파일로리균은 위장점막에 주로 감염되어 위염, 위궤양, 12지장궤양, 위선암, 및 위 림프종 등을 유발하는 원인으로 작용한다. 주로 위장점막의 표면이나 위장의 점액에서 발견되며, 위장점막 세포 자체를 뚫고 감염되는 것은 매우 드물다.

본 발명에서 사용되는 용어, “나노소포(nanovesicle)"는 세포 간 정보교환을 위해 세균으로부터 분비되는 나노미터 크기의 세포밖 소포체(extracellular vesicles; EVs)를 의미한다. 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 세포밖 소포체는 구형의 이중막 구조의 단백질지질로 흔히 나노소포체(nanovesicles)라고도 불리며, 내독소(lipopolysaccharide) 뿐만 아니라 독성 단백질과 세균의 핵산인 DNA와 RNA도 가지고 있다. 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 나노소포체는 독성 단백질과 핵산 이외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 함유하고 있다고 알려져 있다. 본 발명에 따른 나노소포는 상기 헬리코박터파일로리균의 배양과정에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것으로서, 상기 나노소포는 원래 균주보다 작은 크기로 평균 직경이 10 nm 내지 100 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 나노소포는 헬리코박터파일로리균을 포함하는 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 나노소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.

발명자들은 본 발명의 실시예를 통해 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 발견하고, 상기 나노소포가 위 조직에 특이적으로 결합하여 잔존하는 것을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 12지장궤양, 위염, 위궤양, 위암 환자로부터 내시경 검사법 또는 수술장에서 위액을 얻어 나노소포를 분리하였고(실시예 1 참조), 상기 나노소포의 구조 및 크기를 분석하였으며(실시예 2 참조), 상기 나노소포에 존재하는 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 수행하여 세균의 비율을 분석한 결과, 특히 위암 환자의 위액에 헬리코박터균 유래 나노소포가 다량 존재하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 결과를 바탕으로 헬리코박터파일로리균을 배양하여 이로부터 나노소포를 분리하여 구조 및 크기를 분석하였고(실시예 4 참조), 헬리코박터파일로리 균주 또는 나노소포를 마우스에 경구 투여하였을 때 오랜 시간 동안 위에 잔존하는 것을 확인하였다(실시예 5 참조). 나아가 사람 위장 상피세포주를 이용한 형광염색 실험을 통해 상기 나노소포가 위장 상피세포에 내포작용을 통해 유입되는 것을 알 수 있었다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 헬리코박터파일로리 균주 또는 이의 나노소포를 마우스에 경구 또는 복강 투여하였을 때, 상기 나노소포가 균주와 비슷한 정도의 면역반응을 유도하였으며, 경구로 투여한 경우 복강 투여보다 낮은 면역반응을 유도함을 확인하였다(실시예 7 참조).

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포에 위 질환 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물을 제공한다.

상기 치료용 또는 진단용 물질은 외부에서 주입된 것으로, 항암제, 항염증제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있고, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 치료용 또는 진단용 물질은 하기와 같은 방법을 이용하여 상기 나노소포에 로딩될 수 있다. 첫째, 상기 물질을 헬리코박터파일로리균에 로딩한 후 상기 균으로부터 나노소포를 분리하는 방법, 예컨대, 치료용 또는 진단용 물질을 균주의 배양액에 포함시켜 균을 배양하면 상기 물질이 로딩된 균을 수득할 수 있다. 상기 물질이 로딩된 균으로부터 자연적으로 분비되는 나노소포 또는 인공적으로 제조된 나노소포에는 상기 물질이 로딩될 수 있다. 둘째, 나노소포의 제조과정에서 치료용 또는 진단용 물질을 나노소포에 로딩하는 방법, 예컨대, 헬리코박터파일로리균이 포함된 용액에 상기 물질을 첨가한 후 상기 균보다 크기가 작은 필터에 상기 용액을 통과시키면 나노소포에 물질이 로딩될 수 있다. 셋째, 나노소포를 제조한 후 치료용 또는 진단용 물질을 로딩하는 방법 등이 있으나, 상기 물질을 나노소포에 로딩하는 방법은 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 특이 세포 또는 조직에 전달하는 단계를 포함하는, 위 특이적 물질전달 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 위 질환 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위 질환 치료 또는 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료 또는 진단을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 나노소포 분리

내시경 검사법을 통해 12지장궤양, 위염, 위궤양, 위암 환자 및 수술장에서 위암 환자로부터 각각 10개의 위액 샘플을 얻었으며, 이로부터 나노소포를 분리하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 50 ㎖ 튜브에서 각 위액 10 ㎖와 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 혼합하고, 3,500 x g, 4℃의 조건으로 10분 동안 원심분리를 수행하여 부유물을 가라앉힌 후 상등액만을 새로운 50 ㎖ 튜브에 옮겼다. 상기 상등액을 0.22 ㎛ 필터로 걸러 세균 및 이물질을 제거하고, SW 32ti 튜브에 옮긴 후 최하층에 2.5 M 수크로오스(sucrose) 1 ㎖을 채우고, 그 위에 0.8 M 수크로오스 1 ㎖을 쌓아 충격 완충을 위한 수크로오스층을 만들었다. 이후 SW 32ti 로터로 190,000 x g, 4℃ 조건에서 2시간 동안 초고속원심분리를 수행하여 수크로오스층 사이의 나노소포 층만을 남기고 모두 제거하였다. 이어서 나노소포층과 50% Optiprep solution(D-1556; Sigma, USA)을 2:3의 비율로 혼합한 것을 5, 20%로 각 2.5 ㎖, 3 ㎖ 씩 SW 41ti 튜브에 쌓아 놓은 바닥에 넣어 밀도 층을 만든 후 SW41ti 로터로 100,000 x g, 4℃ 조건에서 2시간 동안 초고속원심분리를 수행하였다. 상기 초고속원심분리를 통해 도 1의 그림에 나타낸 바와 같이 생성된 하얀 나노소포 층만을 다시 모아 Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃ 조건에서 3시간 동안 다시 초고속원심분리를 수행하여 상등액을 버린 후 펠렛(pellet)을 생리식염수로 현탁하였다. 이후 대표적인 단백질 정량방법인 Bradford assay를 수행하여 나노소포를 얻었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 위액으로부터 분리한 나노소포의 구조 및 크기 분석

상기 실시예 1의 방법을 통해 위액으로부터 분리한 나노소포의 구조를 확인하기 위해, 투과전자현미경((Transmission electron microscopy, JEM 1011 electromicroscopy Jeol, Japan)을 이용하여 나노소포를 관찰하였다. 구체적으로, 50 ㎍/㎖ 농도의 상기 나노소포 20 ㎕을 준비하여 전자현미경 분석을 위한 그리드 표면에 7 ㎕를 떨어뜨리고, 10초 동안 흡착되도록 한 다음 티슈로 표면에 남은 용매를 흡수하여 제거하였다. 이후 음성염색을 위해 2% 우라닐아세테이트(uranyl acetate) 7 ㎕를 그리드 위에 떨어뜨리고 역시 10초 동안 흡착되도록 한 다음 티슈로 남은 용매를 제거하고 8시간 동안 상온에서 건조시킨 뒤 전자현미경으로 촬영하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 12지장 궤양, 위염, 위궤양, 및 위염 환자 유래 위액으로부터 원형의 나노소포가 분리되었음을 확인하였다.

다음으로, 동적광산란법(Dynamic light scattering, zetasizer nano ZS Malverk, UK)을 통해 상기 나노소포의 크기를 측정하였다. 이를 위해, 5 ㎍/㎖ 농도의 상기 나노소포 1 ㎖을 준비하여 큐벳(ZEN0112)에 옮겨 정위치 시킨 다음 30번씩 3번 촬영하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 상기 12지장 궤양, 위염, 위궤양, 및 위염 환자의 위액으로부터 분리한 나노소포는 10~100 nm 내외의 크기임을 확인하였다.

실시예 3. 나노소포로부터 DNA 추출 및 메타게놈 분석

상기 실시예 1의 방법을 통해 위액으로부터 분리한 나노소포로부터 박테리아 유전자의 비율을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 상기 나노소포 200 ㎕에서 DNeasy Blood & Tissue KIT(Quiagen : 69506)를 사용해 DNA를 분리한 후, 하기와 같은 방법으로 메타게놈 분석을 실시하였다.

구체적으로, 먼저 16S rRNA 프라이머를 사용하여 상기 나노소포로부터 분리한 DNA를 증폭시킨 후 시퀀싱을 수행하였다. 수집된 Roche GS FLX sequencer 결과를 SFF(Standard Flowgram Format) 파일로 출력하고, GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 시퀀스 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음, 리드의 신용도 평가를 확인하여 window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하고, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였다(Sickle version 1.33). 결과 분석을 위한 Operational Taxonomy Unit(OUT)분석을 위해서는 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75%의 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고, 각 OUT의 phylum, class, order, family, genus 레벨의 분류를 수행한 후, BLASTN와 GreenGenes의 16S rRNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME). 통계 분석은 t-test를 이용하였으며, 대조군과 실험군에 유의하게(각 군의 평균 분포 비율이 2-fold 이상 다르며 p-value <0.05) 다른 비율로 존재하는 박테리아를 마커로 선정하였다. 그리고 Hierarchical clustering, Principal Component Analysis (PCA) 등을 이용하여 샘플들 사이의 유사도를 분석하였다.

상기 방법으로 메타게놈 분석을 실시하여 나노소포를 분비하는 세균의 분포를 속 수준에서 분석한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 각 위 관련 질환별 환자의 위액에 존재하는 세균을 확인할 수 있었으며, 특히 위암 환자(gastric cancer, op gastric cancer)들의 위액에 위암의 원인 중 하나인 헬리코박터(Helicobacter)균의 나노소포가 상대적으로 많이 존재하는 것을 확인하였다.

실시예 4. 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 구조 및 크기 분석

상기 실시예 3의 결과를 바탕으로, 헬리코박터균 유래 나노소포의 구조 및 크기를 분석하고자 하였다. 이를 위해, 헬리코박터파일로리균(Helicobacter pylori, HP99, Korea)을 600 nm 파장에서 흡광도 1.5가 될 때까지 배양 후 일반적으로 알려진 박테리아 유래 나노소포 분리 방법에 따라 나노소포를 분리하였다.

먼저, 상기 나노소포의 구조를 관찰하기 위해, 50㎍/㎖ 농도의 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 20 ㎕를 준비하여 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 투과전자현미경으로 구조를 관찰한 결과, 원형의 나노소포를 관찰하였으며 이를 도 4a에 나타내었다.

다음으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 동적광산란법(Dynamic light scattering : zetasizer nano ZS Malverk, UK)을 수행하여 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 크기를 측정하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상기 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포는 10~100 nm 내외의 크기임을 확인하였다.

마지막으로, 상기 나노소포에 헬리코박터균의 대표적인 독성물질인 Cag A 및 Vac A가 존재하는지 확인하기 위해, 각각 헬리코박터파일로리균, Cag A가 없는 균, 및 상기 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포를 이용해 SDS-PAGE를 수행하였다.

그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 헬리코박터파일로리균 및 이의 나노소포에 Cag A 및 Vac A가 모두 존재하는 것을 확인하였다.

실시예 5. 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 위 특이적 결합 확인

헬리코박터파일로리균 유래 나노소포가 위에 특이적으로 결합하는지 검증하기 위하여, 상기 나노소포 100 ㎍과 나노소포 분리 시 이에 해당하는 균주 1 x 10⁵ CFU를 Cy7(17100-017; Gibco, USA)으로 형광 염색하고 쥐에게 경구 투여 한 다음, IVIS(IVIS Sepectrum CT; SelectScience, USA) 장비를 사용해 780~800 nm 파장으로 경구 투여 직후, 3시간 후, 24시간 후 나노소포의 이동경로를 확인해 보았다. 대조군으로는 슈도모나스(Pseudomonas) 균주 및 이의 나노소포체를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 균주는 시간이 경과함에 따라 위에서 장으로 이용하였고, 이의 나노소포는 전신으로 이동하는 것을 관찰하였다. 반면에 헬리코박터파일로리 균주 및 이의 나노소포의 경우에는 시간이 경과함에 따라 위에 특이적으로 부착하는 것을 확인하였으며, 초기에는 상기 나노소포의 형광세기가 균주보다 약했으나 시간이 지날수록 위 속에서 잔존하는 시간이 더 길다는 것을 확인하였다.

실시예 6. 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포의 인체 표피세포로의 유입 확인

상기 실시예 5에서 헬리코박터균 유래 나노소포가 위 점막에 특이적으로 잔존하는 것을 확인하였으므로, 나아가 사람의 위장 상피세포에 직접적으로 결합하는지를 확인하고자 하였다.

먼저, 붉은색을 나타내는 DiI(V22885; Invitrogen, USA)로 형광 염색한 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 100 ng을 사람 위장 상피 세포주인 AGS 1 x 10⁶개에 투여하고 18시간 동안 배양하였다. 이후 배양판에 부착하지 않은 잔여물들을 생리식염수로 제거하고, 일반적 세포염색법인 DAPI(D1306; Invitrogen, USA)로 형광염색하여 공초점 레이저 현미경(TCS SP5; Leica, Germany)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군(PBS)과는 달리 나노소포를 투여한 경우(Hp EV)에는 붉은색의 형광을 나타내는 나노소포가 위장 상피 세포주 내에 존재하는 것을 관찰하였다. 상기 결과를 통해 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포가 내포작용을 통해 상피세포주 내로 유입되는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. 헬리코박터 유래 나노소포의 in vivo 독성 평가

실제로 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포가 동물에게 경구로 투여되었을 때 안전한지 검증하고자 하였다. 이를 위해, 마우스를 5마리씩 5개 그룹 즉, 음성대조군(media 또는 PBS), 헬리코박터파일로리 균주 경구 투여군(Bacteria), 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 경구 투여군(EV), 헬리코박터파일로리 균주 복강 투여군(IP Bacteria), 및 헬리코박터파일로리균 유래 나노소포 복강 투여군(IP EV)으로 분류하고, 각 집단별로 1 x 10⁶ CFU의 헬리코박터 균주 또는 이의 나노소포 100 ㎍/hd을 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 14, 15, 21, 22일째 경구 또는 복강 투여하였다. 그리고 23일째에 각 그룹의 마우스들을 희생시켜 비장(Spleen)을 적출하여 단일세포로 분리한 다음, CD3/28 항체를 이용해 12시간 동안 T 림프구를 자극하는 실험을 수행하여 면역세포의 변화를 확인하였다. 또한, 상기 마우스들로부터 혈청을 분리한 후 ELISA를 통해 전체 IgG1 및 헬리코박터균 특이적인 IgG1 항체의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 나노소포를 마우스에 주입하였을 때, 균주와 유사한 정도로 면역반응을 유도하였으며, 복강 투여보다는 경구 투여 시 면역반응이 더 약하게 일어나는 것을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포를 포함하는, 위 특이적 물질전달용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노소포는 평균 직경이 10 nm 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노소포는 헬리코박터파일로리균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노소포는 내포작용을 통해 위 조직 상피세포로 유입되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 물질은 위 질환을 치료 또는 진단하기 위한 물질인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 위 질환은 십이지장궤양, 위염, 위궤양, 위하수증, 위산과다증, 위 확장증, 무산증, 공기연하증, 위경련, 유문협착, 위축염전증, 위폴립, 위석, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
헬리코박터파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 나노소포에 위 질환 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 나노소포는 평균 직경이 10 nm 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 나노소포는 헬리코박터파일로리균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 나노소포는 내포작용을 통해 위 조직 상피세포로 유입되는 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 위 질환은 십이지장궤양, 위염, 위궤양, 위하수증, 위산과다증, 위 확장증, 무산증, 공기연하증, 위경련, 유문협착, 위축염전증, 위폴립, 위석, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 치료용 또는 진단용 물질은 외부에서 주입된 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 위 질환 치료 또는 진단용 조성물.