KR20200033759A - 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게 헬리코박터 파일로리 표면에 선택적으로 결합하는 시알릴락토오스를 접합시킨 수용성 고분자-광감작제 복합체는 헬리코박터 파일로리 균주에 대한 우수한 선택력 및 결합력을 가지며, 레이저 조사 시 상기 복합체 내 광감작제가 일항산소를 발생시킴으로써 헬리코박터 파일로리의 불활성화를 효과적으로 유도하는 것이 확인됨에 따라, 상기 복합체를 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체로 제공하여 위 장관 내에서 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 검출하고 종래의 항생제 내성 문제를 해결하기 위한 헬리코박터 파일로리 광역학 치료제로 제공하고자 한다.

Description

헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물{Helicobacter pylori selective polymer complex and composition for photodynamic treatment comprising the same}
본 발명은 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)는 사람 및 동물 등의 위장에 사는 나사 모양의 그람음성균으로, 유레이스(Urase)라는 효소를 만들어내고, 이 효소로 위 점액 중의 요소를 암모니아와 이산화탄소로 분해하여 국소적으로 헬리코박터 파일로리 주변의 위산을 중화시키면서 위에서 정착(감염)하여 살아간다.
또한, 헬리코박터 파일로리 표면에는 SabA(Sialic acid binding adhesin)이라는 세포 표면 구성 부착소가 있는데 이는 헬리코박터 파일로리가 위 상피세포에 감염이나 접착하는 것을 용이하게 하는데, 헬리코박터 파일로리의 SabA는 세포 표면상의 Sialylated/fucosylasted glycan에 부착한다고 알려져있다.
글리코실레이트된 상피 세포에 결합하는 능력은 헬리코박터 파일로리가 지속적인 감염 및 질병을 일으키는 데 필수적이라고 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리에 감염되는 것은 만성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위암들의 발생으로도 이어진다고 알려져 있으며, 국제 암 연구소가 규정한 1등급 발암 물질이다.
이러한 헬리코박터 파일로리의 감염은 서방국가 일반인구의 30 내지 50%를 감염시킨다고 알려져 있으며, 현재 세계적으로 임상에서 사용되는 헬리코박터 파일로리 치료법은 양성자 펌프 억제제인 오메프라졸(omeprazole), 아목시실린(amoxicillin) 및 클라리스로마이신(clarithromycin)으로 구성된 삼제요법이 1차 표준요법으로 사용되어 왔으나, 클라리스로마이신의 내성 증가가 제균 치료실패의 주요 원인으로 알려져 있다.
상기 삼제요법을 이용한 1차 치료가 실패하거나 내성균이 있을 경우, 대체제로 메트로니다졸(metronidazole), 테트라사이클린(tetracycline), 퀴놀론(quinolone) 등이 사용되고 있으나, 이들 역시 항생제 내성 증가의 문제점이 있다. 이에 따라, 헬리코박터 파일로리 항생제 기반 치료제의 한계점을 해결할 수 있는 새로운 헬리코박터 파일로리 치료 방법에 대한 연구 및 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0104024호 (2017.09.14. 공개)
본 발명은 종래의 항생제 내성 문제로 완전한 제균이 어려웠던 헬리코박터 파일로리 균 감염을 효과적으로 치료하기 위한 헬리코박터 파일로리 광역학 치료용 고분자 조성물에 관한 것으로, 상기 고분자 조성물은 헬리코박터 파일로리 균과 선택적으로 결합하고 레이저 조사시 고분자와 결합된 광감작제에서 생성되는 일항산소를 통하여 헬리코박터 파일로리 균을 감염을 치료할 수 있다.
본 발명은 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 제공한다.
본 발명은 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 포함하는 헬리코박터 파일로리에 의해 유도되는 위 질환 광역학 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 헬리코박터 파일로리 표면에 선택적으로 결합하는 시알릴락토오스를 접합시킨 수용성 고분자-광감작제 복합체는 헬리코박터 파일로리 균주에 대한 우수한 선택력 및 결합력을 가지며, 레이저 조사 시 상기 복합체 내 광감작제가 일항산소를 발생시킴으로써 헬리코박터 파일로리의 불활성화를 효과적으로 유도하는 것이 확인됨에 따라, 상기 복합체를 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체로 제공하여 위 장관 내에서 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 검출하고 종래의 항생제 내성 문제를 해결하기 위한 헬리코박터 파일로리 광역학 치료제로 제공하고자 한다.
도 1은 헬리코박터 파일로리 인지능 폴리머가 헬리코박터 파일로리 표면에 있는 SabA와 상호작용하여 헬리코박터 파일로리 표면에 결합하는 모습과 레이저 조사시 광감작제에서 발생되는 일항산소의 작용으로 헬리코박터 파일로리 사멸을 유도하는 모습을 나타내는 모식도이다.
도 2는 NCA-카르보벤조일옥시-L-라이신 [NCA-Carbobenzyloxy-L-lysine]의 H1-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 부틸-폴리(카르보벤질옥시-라이신)10 [Butyl-poly(Cbz-lysine)10]의 H1-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 부틸-폴리(Cbz-라이신)10-Pheoa [Butyl-poly(Cbz-lysine)10-Pheoa]의 H1-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 부틸-폴리(라이신)10-Pheoa [Butyl-poly(lysine)10-Pheoa]의 H1-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa [Butyl-poly(3SL-lysine)10-Pheoa]의 H1-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 일항산소 생성능 확인한 결과이다.
도 8은 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa와 헬리코박터 파일로리 26695 균주의 상호작용 및 광응답제에 의한 헬리코박터 파일로리의 불활성화를 확인한 공초점현미경 분석 결과이다.
도 9는 AGS 세포에서 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 농도별 세포독성을 확인한 결과이다.
도 10은 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 레이저 조사량에 따른 세포독성을 확인한 결과이다.
도 11은 생체 외(In vitro)에서 헬리코박터 파일로리 26695 균주에 대한 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 항균활성을 확인한 CFU 분석 결과이다.
도 12는 생체 외(In vitro)에서 헬리코박터 파일로리 SS1 균주에 대한 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 항균활성을 확인한 CFU 분석 결과이다.
도 13은 생체 외(In vitro)에서 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 세포 흡수율을 확인한 결과이다.
도 14는 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa와 헬리코박터 파일로리 SS1 균주의 상호작용 및 광응답제에 의한 헬리코박터 파일로리의 불활성화를 확인한 공초점현미경 분석 결과이다.
도 15는 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa의 Balb/c mouse 헬리코박터 파일로리 SS1 균주 감염 모델에 대한 헬리코박터 파일로리 감염치료 효과를 확인한 결과이다.
도 16은 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-클로린 e6 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-Chlorin e6] 합성 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 17은 카르보벤질옥시 기를 제거하는 과정 및 카르보벤질옥시 기가 제거된 부틸-폴리(라이신)10-클로린 e6를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 18은 부틸-폴리(라이신)10-클로린 e6와 시알릴락토오스(3SL)의 접합과정 및 이를 통한 혼성화 물질 부틸-폴리(3SL-라이신)10-클로린 e6를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 19는 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-프로토포르피린 IX [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-Protoporphyrin IX] 합성 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 20은 카르보벤질옥시 기를 제거하는 과정 및 카르보벤질옥시 기가 제거된 부틸-폴리(라이신)10-프로토포르피린 IX를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 21은 부틸-폴리(라이신)10-프로토포르피린 IX와 시알릴락토오스(3SL)의 접합과정 및 이를 통한 혼성화 물질 부틸-폴리(3SL-라이신)10-프로토포르피린 IX를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 22는 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-헤마토포르피린 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-Hematoporphyrin] 합성 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 23은 카르보벤질옥시 기를 제거하는 과정 및 카르보벤질옥시 기가 제거된 부틸-폴리(라이신)10-헤마토포르피린을 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 24는 부틸-폴리(라이신)10-헤마토포르피린과 시알릴락토오스(3SL)의 접합과정 및 이를 통한 혼성화 물질 부틸-폴리(3SL-라이신)10-헤마토포르피린을 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 25는 숙시닐화 실리콘 프탈로시아닌(SSiPC) 합성 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 26은 폴리-(Cbz-라이신)10-실리콘 프탈로시아닌 [poly-(Cbz-Lysine)10-silicon phthalocyanine] 합성 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 27은 카르보벤질옥시 기를 제거하는 과정 및 카르보벤질옥시 기가 제거된 부틸-폴리(라이신)10-실리콘 프탈로시아닌을 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 28은 부틸-폴리(라이신)10-실리콘 프탈로시아닌과 시알릴락토오스(3SL)의 접합과정 및 이를 통한 혼성화 물질 부틸-폴리(3SL-라이신)10-실리콘 프탈로시아닌을 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 29는 동결건조하여 정제된 키토산 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 30은 키토산과 시알릴락토오스(3SL)의 접합과정 및 이를 통한 혼성화 물질 키토산-3'-시알릴락토오스 [Chitosan-(3'-Sialyllactose)]을 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 31은 키토산-3'-시알릴락토오스와 클로린계 광감작제인 페오포르비드 a (Pheoa)를 결합시킨 키토산-3SL-Pheoa 복합체 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 32는 3'-시알릴락토오스-폴리에틸렌글리콜(PEG)-Pheoa 복합체 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 33은 3'-시알릴락토오스-폴리에틸렌글리콜-Pheoa 복합체를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 34는 풀루란(Pullulan)-페오포르비드 a [PU-Pheoa] 복합체 제조 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 35는 풀루란(Pullulan)-페오포르비드 a [PU-Pheoa] 복합체의 아민화 과정 및 이를 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 36은 풀루란(Pullulan)-페오포르비드 a [PU-Pheoa] 복합체와 시알릴락토오스(3SL)의 접합과정 및 이를 통한 혼성화 물질 3SL-풀루란-페오포르비드 a [3SL-Pullulan-Pheoa]을 확인한 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 37은 Butyl(3SL-lysine)10-Ce6 및 Butyl(3SL-lysine)10-PPIX의 헬리코박터 파일로리 균에 대한 항균활성을 확인한 CFU(Colony forming units) 분석 결과이다.
도 38은 Butyl(3SL-lysine)10-HPP 및 Butyl(3SL-lysine)10-SSiPC의 헬리코박터 파일로리 균에 대한 항균활성을 확인한 CFU(Colony forming units) 분석 결과이다.
도 39는 키토산-3SL-Pheoa 복합체의 헬리코박터 파일로리 균에 대한 항균활성을 확인한 CFU(Colony forming units) 분석 결과이다.
도 40은 3SL-폴리에틸렌글리콜(PEG)-Pheoa 복합체의 헬리코박터 파일로리 균에 대한 항균활성을 확인한 억제 영역(Inhibition zone) 분석 결과이다.
도 41은 3SL-풀루란-페오포르비드 a 복합체의 헬리코박터 파일로리 균에 대한 항균활성을 확인한 CFU(Colony forming units) 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 제공할 수 있다.
상기 고분자 복합체는 수용성 고분자의 아민기 또는 하이드록시기와 광감작제의 카르복시기가 결합하는 것일 수 있다.
상기 고분자 복합체는 수용성 고분자의 아민기와 시알릴락토오스의 하이드록시기가 결합하는 것일 수 있다.
보다 상세하게는 시알릴락토오스 글루코스 고리(glucose ring)의 중간체가 가지는 알데하이드와 수용성 고분자의 아민기(amine group)가 결합하여 이중결합이 형성되고, 이때 NaCNBH3 첨가제에 의하여 이중결합이 환원되면서 단일결합으로 바뀌어 최종적으로 시알릴락토오스의 하이드록시기와 수용성 고분자의 아민기가 결합하는 것일 수 있다.
상기 고분자 복합체는 광감작제의 카르복시기와 시알릴락토오스의 하이드록시기가 수용성 고분자의 서로 다른 아민기와 각각 결합하는 것이거나, 광감작제의 카르복시기와 수용성 고분자의 하이드록시기가 결합하고 시알릴락토오스의 하이드록시기와 수용성 고분자의 아민기가 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것을 아니다.
상기 수용성 고분자는 폴리라이신, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 광감작제는 클로린류(chlorins), 포피린류(phophyrins) 및 프탈로시아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 페오포르비드 a(Pheophorbide a)일 수 있다.
상기 시알릴락토오스는 3'-시알릴락토오스(sialyllactose)일 수 있다.
보다 상세하게는 상기 3'-시알릴락토오스는 헬리코박터 파일로리 표면에 있는 SabA와 상호작용하여 결합이 가능하여 헬리코박터 파일로리를 보다 정확하게 인지할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)의 헬리코박터 파일로리 불활성화 효과를 확인하기 위해, 혼성화 고분자 내 헬리코박터 파일로리 인지능을 나타내는 3'-시알릴락토오스(3SL) 또는 상기 3'-시알릴락토오스의 이성질체인 6'-시알릴락토오스(6SL)가 결합된 혼성화 고분자 간의 헬리코박터 파일로리 26695 균주에 대한 항균활성 효과를 비교하였으며, 시알릴락토오스와 경쟁적으로 상호작용하는 Pre3SL + 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 실험군과의 비교를 통하여 HSP의 3'-시알릴락토오스(3SL)의 인지능이 헬리코박터 파일로리 항균 작용에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 11과 같이 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)가 처리된 헬리코박터 파일로리 26695 균주의 경우, 1.2 J/cm2 레이저가 조사된 실험군은 음성 대조군과 비교하여 5×105 내지 5×104 CFU/ml 수준의 헬리코박터 파일로리 콜로니 갯수가 감소하였으며, 2.4 J/cm2 이상의 레이저가 조사된 실험군에서는 헬리코박터 파일로리의 성장이 더 이상 확인되지 않았다.
반면, 동일한 조건의 레이저가 조사된 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa 및 Pre3SL + 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 대조군의 경우, 모두 헬리코박터 파일로리와 제대로 상호작용하지 못하고 세척단계에서 대부분 씻겨나가 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)와 비교하여 매우 낮은 항균활성을 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)의 헬리코박터 파일로리 불활성화 효과가 매우 우수한 것이 확인되었으며, 모든 시알릴락토오스가 동일한 효과를 나타내는 것이 아님이 확인되었다.
상기 헬리코박터 파일로리 균주는 헬리코박터 파일로리 26695, 헬리코박터 파일로리 SS1, 헬리코박터 파일로리 51 및 헬리코박터 파일로리 52로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에 있어서, X는 1 내지 15의 정수일 수 있으며, 보다 바람직하게는 X는 10일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 포함하는 헬리코박터 파일로리에 의해 유도되는 위 질환 광역학 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 위 질환은 십이지장궤양, 위염, 위궤양, 위하수증, 위산과다증, 위 확장증, 무산증, 공기연하증, 위경련, 유문협착, 위축염전증, 위폴립, 위석, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 화학식 1과 같이 표시되는 고분자를 포함하는 헬리코박터 파일로리 관련 위 질환 광역학 치료용 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 화학식 1과 같이 표시되는 고분자의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 폴리라이신-페오포르피드 a 광감작제 접합체와 시알릴락토오스 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
1-1. NCA- 카르보벤조일옥시 -L- 라이신 (NCA- Carbobenzyloxy -L-Lysine; NCA- Cbz -Lysine) 합성
[화학식 1]
Figure pat00002
테트라하이드로퓨란(THF) 50 ml이 담겨있는 200ml 둥근 바닥 플라스크에 N6-Carbobenzyloxy-L-Lysine 3g을 넣고 완전히 용해시킨 후 상기 둥근바닥 플라스크에 트라이포스겐 (Triphosgene) 3g을 첨가하고 마그네틱바를 이용하여 혼합하면서 완전히 용해시켰다.
그 후 오일 수조 (Oil bath)에서 60℃로 4시간 동안 반응시켰다. 이후 유리종이 여과지 (glass & paper filter)를 이용하여 여과한 후에 900 ml 헥산 (Hexane)을 한 방울씩 떨어뜨려 침전 반응을 진행하였다. 그 후 유리종이 여과지를 이용하여 다시 한번 여과한 후, 진공펌프를 이용하여 반응물에서 12시간 동안 헥산을 완전히 제거하였다. 그 결과 도 2와 같이 약 3g의 NCA-카르보벤조일옥시-L-라이신 (NCA-Cbz-Lysine)을 회수하였으며, 상기 화합물을 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR)을 통하여 확인되었다.
1-2. 폴리 - 카르보벤질옥시 -L- 라이신 [ Poly - Carbobenzyloxy -L-Lysine; poly(Cbz-Lysine) x ] 합성
[화학식 2]
Figure pat00003
폴리-카르보벤질옥시-L-라이신 (poly-Carbobenzyloxy-L-Lysine)을 만들기 위하여 반응개시자로 부틸-아민(Butyl-amine) 90 μl을 DMF 10ml에 용해시켰으며, 상기 실시예 1-1에서 회수된 NCA-카르보벤조일옥시-L-라이신 3g을 DMF 20 ml에 용해시켰다. 상기 NCA-카르보벤조일옥시-L-라이신 용액을 부틸-아민 용액에 한 방울씩 떨어뜨려 반응을 진행시키고 48시간 동안 반응시킨 후, 300 ml 에테르(Ether)에 한 방울씩 떨어뜨려 침전 반응을 진행시켰다.
침전반응 용액을 50 ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 나눠 담고 3000 rpm으로 5 분 동안 원심분리한 후에 상층액을 버리고 새로운 에테르 용액으로 5번 반복하여 미반응물을 제거하였다.
이후 진공펌프를 이용하여 12시간 동안 에테르를 완전히 제거하고 반응물을 회수하고, 핵자기공명스펙트럼 (1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 3과 같은 화합물을 얻었으며 x는 약 10으로 확인되었다.
1-3. 폴리라이신 -페오포르비드 a 접합체 [ poly -( Cbz -Lysine) 10 - Pheophorbide a] 합성
[화학식 3]
Figure pat00004
페오포르비드 a(Pheophorbide a; Pheoa) 250 mg과 DCC (Dicyclohexylcarbodiimide) 108 mg, NHS (N-Hydroxysuccinimide) 66 mg을 DMF (Dimethylformamide) 10ml에 용해시키고 4시간 동안 혼합하여 활성화 시킨 후 상기 실시예 1-2에서 회수된 부틸-폴리(카르보벤질옥시-라이신)10 [Butyl-poly(carbobenzyloxy-lysine)10] 1g을 10ml DMF에 용해시켰다.
그 후 0.45 주사기 필터를 이용하여 상기 활성화된 페오포르비드 a 용액에서 DCU (Dicyclohexyl urea)를 제거한 후 부틸-폴리(카르보벤질옥시-라이신)x 용액을 한 방울씩 첨가한 후 24시간 동안 반응시켰다.
24시간 후 에테르를 첨가하여 침전 반응을 진행시킨 후 50 ml 팔콘 튜브에 옮겨 담고, 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 상층액을 버리고 새로운 에테르 용액으로 재부유시켰으며, 상기 과정을 5번 반복하여 미반응물을 제거하였다.
이후 진공펌프를 이용하여 12시간 동안 에테르를 완전히 제거한 뒤 반응물인 부틸-폴리(Cbz-라이신)10-Pheoa [Butyl-poly(Cbz-lysine)10-Pheoa]을 회수하였으며, 도 4와 같은 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 결과를 얻었다.
1-4. 폴리(라이신) 10 - Pheoa [ poly(lysine) 10 - Pheoa ] 제조
[화학식 4]
Figure pat00005
앞서 실시예 1-3에서 회수된 부틸-폴리(Cbz-라이신)10-Pheoa [Butyl-poly(Cbz-lysine)10-Pheoa] 접합체에서 카르보벤질옥시기(carbobenzyloxy group; Cbz)를 제거하기 위해, 500 mg 부틸-폴리(Cbz-라이신)10-Pheoa를 TFA 3 ml에 용해시켰으며, 아세트산 3 ml에 HBr을 33% 농도로 용해시킨 후 20 ml 바이알에 넣고 30분간 혼합하였다.
상기 혼합액에 에테르/에탄올 용액(50/50 vol %) 100ml를 첨가하여 침전반응을 수행한 후 50ml 팔콘 튜브에 옮겨 담고, 3000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 새로운 에테르/에탄올 용액(50/50 vol %)을 첨가하여 동일한 과정을 수행하였다.
상기 과정을 5회 반복하여 미반응물을 제거하고 진공펌프를 이용하여 12시간 동안 에테르/에탄올 용액을 완전히 제거한 후 반응물을 회수하였다.
그 결과, 도 5와 같은 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 나타내는 부틸-폴리(라이신)10-Pheoa 접합체를 확인하였다.
1-5. 폴리라이신 -페오포르비드 a 접합체와 시알릴락토오스 접합을 통한 혼성화 고분자 제조
[화학식 5]
Figure pat00006
상기 1-4에서 회수된 부틸-폴리(라이신)X-Pheoa 300mg을 아세테이트 완충용액 10ml (pH 5.5)에 용해시켰다. 3'-시알릴락토오스 (sialyllactose; 3SL) 150mg(부틸-폴리(라이신)10-Pheoa 몰수의 1.5 배)을 5ml 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해시켰으며, NaCNBH3 15 mg(부틸-폴리(라이신)10-Pheoa 몰수의 1.5 배)을 DMSO에 1 ml에 용해시켜 준비하였다.
그 후 50ml 둥근 바닥 플라스크에 상기 용액을 첨가하여 혼합한 후 24시간 동안 반응시켰다. 이후 반응용액에 증류수를 혼합하고 투석막(molecular weight cutoff size 1000 Da)을 이용하여 72시간 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 72시간 동안 동결 건조하여 분말 형태의 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-pheoa [Butyl-poly(3SL-lysine)10-pheoa]를 회수하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 6과 같이 확인하였다.
<실시예 2> 폴리라이신-클로린 e6 광감작제 접합체와 시알릴락토오스 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
2-1. 폴리라이신-클로린 e6 접합체 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine) 10 -Chlorin e6] 제조
상기 실시예 1-3과 같은 과정으로 부틸-폴리-(Cbs-라이신)10-클로린 e6 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-Chlorin e6(Ce6)] 접합체를 제조하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 16과 같이 확인하였다.
2-2. 폴리(라이신) 10 -Ce6 [Butyl-poly(Lysine) 10 -Ce6] 제조
상기 실시예 2-1에서 회수된 부틸-폴리-(Cbs-라이신)10-클로린 e6 접합체에서 카르보벤질옥시 기(carbobenzyloxy group; Cbz)를 제거하기 위해, 실시예 1-4와 같은 과정을 수행하여 부틸-폴리(라이신)10-Ce6 [Butyl-poly(Lysine)10-Ce6] 접합체를 회수하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 수행하여 도 17과 같이 확인하였다.
2-3. 폴리(라이신) 10 -Ce6와 시알릴락토오스의 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
상기 실시예 1-5와 같은 과정으로 실시예 2-2에서 회수된 부틸-폴리(라이신)10-Ce6에 시알릴락토오스를 접합시켜 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Ce6 [Butyl-poly(3SL-Lysine)10-Ce6] 혼성 고분자를 제조하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 이용하여 도 18과 같이 확인하였다.
<실시예 3> 폴리라이신-프로토포르피린 광감작제 접합체와 시알릴락토오스 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
3-1. 폴리라이신-프로토포르피린 접합체 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine) 10 -Protoporphyrin Ⅸ (PPⅨ)] 합성
상기 실시예 1-3과 같은 과정으로 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-PPⅨ [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-PPⅨ] 접합체를 제조하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 19와 같이 확인하였다.
3-2. 폴리(라이신) 10 -PPⅨ [Butyl-poly(Lysine) 10 -PPⅨ] 제조
실시예 1-4와 같은 과정을 수행하여 상기 실시예 3-1-1에서 회수된 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-PPⅨ 접합체에서 카르보벤질옥시 기(carbobenzyloxy group; Cbz)를 제거하여 부틸-폴리(라이신)10-PPⅨ [Butyl-poly(lysine)10-PPIX]접합체를 회수하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 이용하여 도 20과 같이 확인하였다.
3-3. 부틸-폴리(라이신) 10 -PPⅨ 접합체와 시알릴락토오스(3SL)의 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
실시예 1-1-5와 같은 과정으로 상기 실시예 3-1-2에서 회수된 부틸-폴리(라이신)10-PPⅨ 접합체에 시알릴락토오스를 접합시키고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 21과 같이 확인하였다.
<실시예 4> 폴리라이신-헤마토포르피린 광감작제 접합체와 시알릴락토오스 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
4-1. 폴리라이신-헤마토포르피린 접합체 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine) 10 -Hematoporphyrin (HPP)] 합성
상기 실시예 1-3과 같은 과정으로 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-헤마토포르피린 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-HPP] 접합체를 제조하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 22와 같이 확인하였다.
4-2. 폴리(라이신) 10 -헤마토포르피린 [Butyl-poly(Lysine) 10 -HPP] 접합체 제조
실시예 1-4와 같은 과정을 수행하여 상기 실시예 3-2-1에서 회수된 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-헤마토포르피린 접합체에서 카르보벤질옥시 기(carbobenzyloxy group; Cbz)를 제거하여 부틸-폴리(라이신)10-HPP 접합체를 제조하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 23과 같이 확인하였다.
4-3. 부틸-폴리(라이신) 10 -HPP 접합체와 시알릴락토오스(3SL)의 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
실시예 1-5와 같은 과정으로 상기 실시예 3-2-2에서 회수된 부틸-폴리(라이신)10-HPP 접합체에 시알릴락토오스를 접합시키고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 24와 같이 확인하였다.
<실시예 5> 폴리라이신-프탈로시아닌 접합체와 시알릴락토오스 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
5-1. 숙시닐화 실리콘 프타로시아닌 합성
실리콘프탈로시아닌(Silicon phthalocyanine : SiPC) 200 mg을 100 ml 반응기에 넣고 피리딘(pyridine) 10 ml에 용해시켰다. 이후 숙신산무수물(Succinyl anhydride) 348 mg과 DMAP(4-Dimethylaminopyridine) 213 mg을 피리딘 5 ml에 용해시키고 SiPC 용액에 첨가한 후 100℃에서 24시간 동안 질소 퍼지를 시키며 반응시켰다. 피리딘을 모두 증발시킨 후 고형의 반응물을 에탄올에 녹이고 저온의 증류수에 침전 반응을 진행시켰다. 50 ml 팔콘 튜브에 옮겨 담은 후 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 새로운 증류수로 상기 과정을 3번 반복하여 미반응물을 제거하였다. 이후 72시간 동안 동결건조를 하여 숙시닐화된 SiPC (SSiPC)를 회수하였다. 그 결과, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 25와 같이 확인하였다.
5-2. 폴리라이신-프탈로시아닌 접합체 [Butyl-Poly-(Cbz-Lysine) 10 -silicon phthalocyanine (SiPC)] 합성
상기 실시예 4-1에서 회수된 숙시닐화된 SiPC (SSiPC)를 이용하여 실시예 1-3과 같은 과정으로 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-프탈로시아닌 접합체 [Butyl-poly-(Cbz-Lysine)10-SiPC]를 합성하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 26과 같이 확인하였다.
5-3. 폴리(라이신) 10 -SiPC [Butyl-poly(lysine) 10 -SiPC] 제조
실시예 1-4와 같은 과정을 수행하여 상기 실시예 4-2에서 회수된 부틸-폴리-(Cbz-라이신)10-프탈로시아닌 접합체에서 카르보벤질옥시 기(carbobenzyloxy group; Cbz)를 제거하여 부틸-폴리(라이신)10-SiPC [Butyl-poly(lysine)10-SiPC] 접합체를 제조하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 27과 같이 확인하였다.
5-4. 부틸-폴리(라이신) 10 -SiPC 접합체와 시알릴락토오스(3SL)의 접합을 이용한 혼성 고분자 제조
실시예 1-5와 같은 과정으로 상기 실시예 4-3에서 회수된 부틸-폴리(라이신)10-SiPC 접합체에 시알릴락토오스를 접합시키고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 28과 같이 확인하였다.
<실시예 6> 키토산을 기반으로 광역학 치료가 가능한 헬리코박터 파일로리 인지용 복합체 제조
6-1. 키토산 (Chitosan; Low molecular, LM) 정제
키토산(LM) 671mg을 weighing 하여 1% 아세트산 용액 50ml에 12시간 동안 교반시켜 완전히 용해시켰다. 완벽히 용해된 키토산 용액을 투석막(12k-14k)에 옮겨 담고 72시간 동안 투석을 진행한 후 동결건조를 통하여 정제된 키토산을 회수하였으며, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 29와 같이 확인하였다.
6-2. 키토산-시알릴락토오스 [Chitosan-(3'-Sialyllactose)] 접합체 합성
키토산에 헬리코박터 인지용 3'-Sialyllactose (3SL)를 접합하기 위해서 정제된 키토산 90mg을 weighing한 후 2ml의 1% 아세트산 용액에 교반하여 용해시키고, 1차 증류수를 4ml을 추가하여 혼합한 다음 용액의 pH를 확인(pH 4-5)하였다. 3SL과 NaBH3CN을 각각 weighing하여 5ml 바이알에 각각 1ml 1차 증류수에 용해시키고, Oil bath(55도)dp 넣고 교반하면서 48시간 동안 반응시켰다. 이후에 투석막(12k-14k)에 용액을 옮기고 3일간 투석 진행 후 동결건조시키고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 30과 같이 확인하였다.
6-3. 키토산-시알릴락토오스-클로린계 광감작제 복합체 합성
동결건조를 통하여 회수된 키토산-시알릴락토오스 접합체 (Chitosan-3SL)와 클로린계 광감작제인 페오포르비드 a (Pheoa)와의 복합체 형성을 위하여 먼저 Pheoa, DCC (Dicyclohexylcarbodiimide) 및 NHS (N-Hydroxysuccinimide)를 1:1.2:1.2 비율로 4시간 동안 상온에서 DMSO 5 ml로 녹이고 반응시켰다. 4시간 뒤에 3000rpm에서 5분 동안 원심분리를 통하여 발생한 반응 부산물 DCU (Dicyclohexyl urea)를 제거하였다.
상기 Pheoa 용액과 증류수 20ml에 녹인 키토산-3SL 접합체 300mg을 혼합한 후 24시간 동안 상온에서 반응시키고 3일 동안 투석(12k-14k)하였다. 이후에 Co-solvent로 침전된 과도한 유리 Pheoa를 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 미반응물을 제거한 뒤 동결 건조시켜 키토산-3SL-Pheoa를 회수하였으며, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 31과 같이 확인하였다.
<실시예 7> PEG를 기반으로 광역학 치료가 가능한 헬리코박터 파일로리 인지용 복합체 제조
3'-시알릴락토오스-폴리에틸렌글리콜-페오포르비드 a [3SL-PEG-Pheoa] 복합체 제조
도 32와 같은 과정으로 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 6k에 클로린계 광감작제인 Pheoa를 접합하기 위해, 먼저 Pheoa, DCC (Dicyclohexylcarbodiimide) 및 NHS (N-Hydroxysuccinimide)를 1:1.2:1.2 비율로 4시간 동안 상온에서 DMF 5 ml로 녹이고, 4시간 뒤에 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 발생된 반응 부산물 DCU (Dicyclohexyl urea)를 제거하였다. 상기 PEG를 Pheoa와 1:1.2 비율로 반응시킨 후 소수성 컬럼(LH20)을 이용하여 PEG-Pheoa를 정제하였다.
정제된 PEG-Pheoa와 3SL을 1:1.2 비율로 1% 아세트산(pH 5.2)에 녹여 60℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 투석(12k-14k)하여 미반응물을 제거하고 동결건조를 통해서 최종 3SL-PEG-Pheoa 복합체를 회수하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 33과 같이 확인하였다.
<실시예 8> 풀루란(Pullulan) 기반으로 광역학 치료가 가능한 헬리코박터 파일로리 인지용 복합체 제조
8-1. 풀루란-페오포르비드 a [PU-Pheoa] 복합체 제조
PU-Pheoa 접합체를 제조하기 위해, PU (50 mg) 및 Pheoa (10 mg)를 DMSO (10 ml)에 각각 용해시켰다. 촉매 및 커플링 시약으로서 DMAP 및 DCC를 각각 1 : 1 : 1.5의 몰비로 Pheoa 용액에 첨가 하였다. 4 시간 후, Pheo A 용액을 PU 용액에 적가하고 2 일 동안 교반하였다.
반응하지 않은 물질은 3일 동안 12,000-14,000 MWCO의 막을 사용하여 투석하여 제거하고, 정제된 PU-Pheoa 접합체를 동결건조시킨 후 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 도 34와 같이 확인하였다.
8-2. 풀루란-페오포르비드 a [PU-Pheoa] 복합체의 아민화
100 ml 반응기에 플루란-페오포바이드 a 복합체를 (PU-Pheoa) 500 mg을 DMF(Dimethylformamide) 10 ml에 용해시키고 피리딘(Pyridine) 100 μl를 첨가하였다. 이후 후드 내에서 염화티오닐(SOCl2) 90μl을 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응기를 고무마개로 막아준 후 바늘 2개를 꽂아주었다.
반응 후 반응물을 에테르에 첨가하여 침전 반응을 진행시킨 후 50 ml 팔콘 튜브에 옮겨 담고, 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 상층액을 버리고 새로운 에테르 용매로 재부유시켰으며, 상기과정을 3번 반복하여 미반응물을 제거하였다. 이후 진공펌프를 이용하여 12시간 동안 에테르를 완전히 제거한 뒤 반응물을 회수하였다. 회수한 반응물을 DMF 10 ml에 용해시킨 후 DMF 15 ml에 에틸렌다이아민(C2H4(NH2)2) 1ml을 첨가하였다. 그 후 반응물 용액에 에틸렌다이아민 용액을 한 방울씩 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응물을 에테르에 첨가하여 침전 반응을 진행시킨 후 50 ml 팔콘 튜브에 옮겨 담고 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후에 상층액을 버리고 새로운 에테르 용액으로 동일한 과정을 수행하였다. 이후에 진공펌프를 이용하여 12시간 동안 에테르를 완전히 제거한 뒤 반응물을 회수하고, 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 분석을 진행하여 도 35와 같이 확인하였다.
8-3. 3SL-풀루란-페오포르비트 a [3SL-PU-Pheoa] 복합체 제조
정제한 아민-PU-Pheoa와 3SL을 1:1.2 비율로 각각 DMSO와 1% 아세트산(pH 5.2)에 용해시켰다. NaCNBH3 (amine-PU-pheoa 몰수의 1.5 배)을 DMSO에 용해시키고 60℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 투석막 (MWCO :12k-14k)를 이용한 투석을 진행하여 미반응물을 제거하고 동결건조시켜 최종 3SL-PEG-Pheoa 복합체를 회수하였다. 회수된 복합체를 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)으로 분석하여 도 36과 같이 확인하였다.
< 실험예 1 > 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자의 일항산소 (SOG) 생성능 확인
실시예 1과 같이 제조된 헬리코박터 파일로리 인지능 혼성화 과분자가 수상에서 레이저 조사에 따라 일항산소를 생성하는지 확인하였다.
실시예 1에서 제조한 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa [butyl-poly(3SL-lysine)10-Pheoa]과 페오포르비드 a을 UV spectrophotometer를 이용하여 1 μg/mL 농도로 희석한 뒤 SOSG(singlet oxygen sensor green) 용액과 1:1(v/v)로 혼합하고 20 mW 세기의 레이저를 20초씩 조사하고 형광분광 광도계를 이용하여 일항산소(SOG) 생성능을 확인하였다.
그 결과 도 7과 같이 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa은 400초까지 레이저를 조사하였을 때, 시간 경과에 비례하여 형광강도 값이 증가하여 일항산소 생성이 증가되는 것이 확인된 반면, 페오포르비드 a는 레이저를 조사하여도 형광 강도 값이 거의 증가하지 않았다.
상기 결과로부터 실시예 1에서 제조한 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa는 수상에서 난용성을 가지는 페오포르비드 a와 비교하여 매우 우수한 일항산소 생성능을 가지는 것이 확인됨에 따라, 종래의 페오포르비드 a가 가진 난용성 문제를 효과적으로 해결할 수 있을 것으로 판단된다.
< 실험예 2 > 공초점 현미경을 통한 헬리코박터 파일로리 인지능 혼성화 고분자의 상호작용 및 불활성화 확인
실시예 1과 같이 합성된 헬리코박터 파일로리 인지능 혼성화 고분자가 생체 외 (in vitro)에서 헬리코박터 파일로리와 상호작용하며, 레이저 조사에 의해 헬리코박터 파일로리의 불활성화를 유도할 수 있지 확인하였다.
실시예 1에서 제조한 혼성화 고분자인 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa [butyl-poly(3SL-lysine)10-Pheoa]를 페오포르비드 a (Pheophorbide a) 1 μg/ml 기준으로 UV spectrophotometer를 이용하여 정량 후 증류수를 이용하여 희석하였다.
헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori; 26695 균주) 1×106 CFU/ml에 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 용액를 혼합하여 37℃, 2시간 동안 인큐베이션하였다.
대조군으로 3'-시알릴락토오스(3'-Sialyllactose; 3SL) 5mg/ml을 미리 30분 동안 헬리코박터 파일로리 1ml(1×106 CFU/ml)에 첨가하여 인큐베이션한 후 원심분리 (4000 rpm, 2분)하여 상층액을 제거하였다. 이후, 증류수로 재분산시켰으며, 상기 과정을 2번 반복 수행하고 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa를 처리하여 37℃, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 또한, 대조군으로 헬리코박터 파일로리 인지능을 갖지 않는 부틸-폴리(Cbz-라이신)10-Pheoa [butyl-poly(Cbz-lysine)10-Pheoa, Cbz =carbobenzyloxy, nHSP로 표기]을 37℃, 2시간 동안 인큐베이션하였다.
상기 인큐베이션 후 각 실험군을 원심분리(400rpm, 2분)하여 상층액을 제거고 증류수(D.W)로 재분산시켰으며, 상기 과정을 2번 반복하였다. 이후, 50mW 레이저 세기로 총 10 J/cm2의 레이저를 조사하였다.
또한, 헬리코박터 파일로리를 SYTO 9 과 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide)를 이용하여 염색하였으며, SYTO 9 (Green, Ex/Em 485/498), 프로피디움 아이오다이드(Red, Ex/Em 535/617), Cy5(pupple, Ex/Em 650/670)의 조건으로 형광이미지를 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 8과 같이 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)가 처리된 헬리코박터 파일로리군에서는 정상 헬리코박터 파일로리 세포에서 나타나는 STYTO 9(Green)와 HSP의 페오포르비드 a의 Cy5(pupple)의 형광이 대부분 일치하는 것이 확인됨에 따라, HSP가 헬리코박터 파일로리와 상호작용하는 것이 확인되었다.
반면, 부틸-(Cbz-라이신)10-Pheoa (nHSP)가 처리된 헬리코박터 파일로리군에서는 STYTO 9(Green) 형광이 나타났으나 페오포르비드 a의 Cy5(pupple) 형광이 나타나지 않는 것이 확인됨에 따라, nHSP는 헬리코박터 파일로리와 상호작용하지 않는 것이 확인되었다.
또한, 3'-시알릴락토오스(3SL)를 30분간 전처리한 후 HSP 처리한 헬리코박터 파일로리군(Pre3 + HSP)에서는 정상 헬리코박터 파일로리 세포에서 나타나는 STYTO 9(Green)가 확인되었으나, 페오포르비드 a의 Cy5(pupple) 형광이 나타나지 않는 것이 확인됨에 따라, 상기 HSP가 단독 처리된 경우와 다르게 헬리코박터 파일로리와 HSP가 상호작용하지 않는 것이 확인되었다.
한편, 레이저 조사에 따른 헬리코박터 파일로리 불활성화능을 확인한 결과, 도 8과 같이 HSP가 처리된 헬리코박터 파일로리군에 레이저를 조사[Laser (+)]한 경우, HSP와 헬리코박터 파일로리의 상호작용 후 레이저 조사에 의해 페오포르비드 a에서 발생된 일항산소로 인한 헬리코박터 파일로리 세포막의 손상을 나타내는 프로피디움 아이오다이드(Red) 형광이 확인되었다.
또한, 다른 실험군에서는 레이저 조사 유무에 따라 정상적인 헬리코박터 파일로리에서 나타나는 STYTO 9(Green) 형광이 나타난 반면, 프로피디움 아이오다이드(Red) 형광은 확인되지 않았다.
상기 결과로부터 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)는 헬리코박터 파일로리를 정확하게 인지하여 상호작용하고, 레이저 조사 시 상호작용된 HSP의 광감작제에서 발생하는 일항산소를 통하여 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 불활성화시키는 것이 확인되었다.
< 실험예 3 > 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자의 세포독성 확인
상기 실시예 1과 같이 합성된 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)의 세포독성을 확인하기 위해, AGS 세포(사람 위암세포)를 96웰 플레이트에 5 × 103cells/well 농도로 100 μl씩 각 웰에 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후 각 웰에 상기 실시예 1에서 제조한 인지능 혼성화 고분자를 0.5 내지 50μg/mL 농도로 처리하고 4시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 반응 시키고 MTT 시험법을 수행한 후 형광강도를 570nm에서 멀티리더기 (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek)을 이용하여 확인하고, 페오포르비드 a만 처리되 대조군과 비교하여 세포 생존율을 계산하였다.
그 결과, 도 9와 같이 HSP는 페오포르비드 a 0.5 μg/mL 이하의 농도에서 세포 독성을 거의 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자의 세포 광독성 확인
상기 실시예 1과 같이 합성된 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)가 항균활성을 나타내는 농도 및 레이저 세기에서 세포 독성을 확인하였다.
24 웰 플레이트에 AGS 세포를 2 × 104 cells/well의 농도로 1ml씩 각 웰에 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후 UV spectrophotometer를 이용하여 각 웰에 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)을 페오포르비드 a 기준 0.5 μg/mL 농도로 무혈청 RPMI 배지를 이용하여 처리하고 항균활성 실험 시에 효능을 나타냈던 30분 동안, 37℃, 5% CO2 조건에서 반응시켰다.
반응 후 50 mW 세기의 레이저를 이용하여 0 ~ 4.0 J/cm2 범위로 레이저를 조사하고 MTT 어세이를 수행하여 세포 생존율을 대조군과 비교하여 계산하였다.
대조군은 상기 고분자와 동일한 농도로 페오포르비드 a만을 처리하였으며, MTT 용액 처리 후 나타나는 형광강도를 570nm에서 멀티리더기 (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek)을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 10과 같이 0.5 μg/mL 농도의 페오포르비드 a를 처리하여 30분간 인큐베이션한 후 레이저를 조사한 대조군에서는 0.8 J/cm2 레이저 세기부터 세포독성이 나타났으며, 레이저 조사량 증가에 따라 4.0 J/cm2 에서는 약 50% 수준의 세포독성이 확인되었다.
반면 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)는 2.4 J/cm2 레이저 조사까지는 세포독성이 거의 나타나지 않았으며, 3.2 J/cm2 레이저 조사부터 약간의 세포독성이 확인되어 4.0 J/cm2 에서는 약 30% 수준의 세포독성이 확인되었다.
상기 결과로부터 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa는 페오포르비드 a보다 낮은 세포독성이 나타나는 것이 확인되었다.
< 실험예 5> 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자의 세포 흡수 확인
실시예 1에서 제조된 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)가 세포 내로 흡수되는 수준을 확인하였다.
부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa와 페오포르비드 a의 농도를 동일하게 페오포르비드 a 기준 0.5 ml 농도로 맞추고 AGS 세포에 각각 처리하여 36℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 DPBS로 2번 세척하고 트립신 처리하여 세포를 수집한 후 원심분리(1500 rpm, 3분)하여 상층액을 제거하였다.
그 후 AGS 세포를 1×105 cell/ml 농도로 DPBS 1ml에 분산시키고 FACS를 이용하여 AGS 세포에 흡수된 페오포르비드 a와 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa의 세포 흡수 정도를 페오포르비드 a 형광강도로 확인하였다.
그 결과, 도 13과 같이 페오포르비드 a는 대조군과 비교하여 7×102 정도 더 많인 세포내로 흡수되는 것이 확인된 반면, 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa는 대조군과 거의 유사한 수준의 페오포르비드 a 형광강도를 나타내었다.
< 실험예 6> 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자의 헬리코박터 파일로리 항균활성 확인
상기 실시예 1과 같이 합성된 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)의 헬리코박터 파일로리 불활성화 효과를 확인하였다.
또한, 상기 혼성화 고분자 내 헬리코박터 파일로리 인지능을 나타내는 3'-시알릴락토오스(3SL) 또는 상기 3'-시알릴락토오스의 이성질체인 6'-시알릴락토오스(6SL)가 결합된 혼성화 고분자 간의 항균활성 효과를 비교하였으며, 시알릴락토오스와 경쟁적으로 상호작용하는 Pre3SL + 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 실험군과의 비교를 통하여 HSP의 3'-시알릴락토오스(3SL)의 인지능이 헬리코박터 파일로리 항균 작용에 미치는 영향을 확인하였다.
헬리코박터 파일로리 26695 균주(H. pylori strain 26695)와 헬리코박터 파일로리 SS1 균주 (H. pylori strain SS1)를 헬리코박터 파일로리 균주은행에서 분양받았다. 상기 균주들을 10% 말 혈청(Welgene, Korea)을 첨가한 브루셀라브로스(brucellabroth; Difco, USA; bacto tryptone 10g, bacto peptamin 10g, bacto dextrose 1g, bacto yeast extract 2g, sodium chloride 5g, sodium bisulfite 0.1g)를 이용하여, 10%의 CO2, 95% 이상의 습도 및 37℃의 인큐베이터에서 혐기성 조건을 유지하여 배양하였다.
각각 배양된 헬리코박터 파일로리 균주 1 ml(5×105 CFU/m)에 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (페오포르비드 a 기준 0.5 μg/ml 농도)를 첨가하여 혼합하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 원심분리(4000 rpm, 2분)하여 상층액을 제거하고 증류수(D.W) 1 ml를 이용하여 분산시켰으며, 상기 과정 2회 반복하여 헬리코박터 파일로리와 반응하지 않는 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa를 제거하고, CFU 어세이를 수행하여 항균활성을 평가하였다.
6'-시알릴락토오스(6SL)가 결합된 혼성화 고분자 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa 역시 상기와 동일한 방법으로 항균활성을 평가하였다.
또한, 3'-시알릴락토오스 (3SL)와의 경쟁적 인지능 저해 효과를 확인하기 위하여 3SL 5 mg/ml을 증류수에 용해시켜 헬리코박터 파일로리와 37℃, 30분 동안 사전 인큐베이션을 진행하였다. 인큐베이션 후 원심분리(4000 rpm, 2분)하여 상층액을 제거하고 1 ml의 증류수를 이용하여 분산시켰으며, 이 과정 2회 반복한 후 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa를 첨가하여 37℃, 30분 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후 원심분리(4000 rpm, 2분)하여 상층액을 제거하고 1 ml의 증류수를 이용하여 분산시켰으며, 상기 과정 2회 반복하여 헬리코박터 파일로리와 반응하지 않은 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa를 제거하였다. 이후 헬리코박터 파일로리 26695 균주 실험군에 50 mW 세기로 0, 24, 48, 72 및 96초 동안 레이저 조사를 한 후 CFU assay를 수행하였으며, 헬리코박터 파일로리 SS1 균주 실험군에는 50 mW 세기로 0, 12, 48 및 60초 동안 레이저를 조사하여 CFU assay를 수행하였다.
그 결과, 도 11과 같이 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)가 처리된 헬리코박터 파일로리 26695 균주의 경우, 1.2 J/cm2 레이저가 조사된 실험군은 음성 대조군과 비교하여 5×105 내지 5×104 CFU/ml 수준의 헬리코박터 파일로리 콜로니 개수가 감소하였으며, 2.4 J/cm2 이상의 레이저가 조사된 실험군에서는 헬리코박터 파일로리의 성장이 더 이상 확인되지 않았다.
반면, 동일한 조건의 레이저가 조사된 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa 및 Pre3SL + 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 대조군의 경우, 모두 헬리코박터 파일로리와 제대로 상호작용하지 못하고 세척단계에서 대부분 씻겨나가 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)와 비교하여 매우 낮은 항균활성을 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 12와 같이 헬리코박터 파일로리 SS1 균주의 경우, 음성 대조군(NC)와 레이저만 조사된 실험군과 비교하여 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)가 처리된 실험군에서는 1.2 J/cm2 레이저가 조사된 실험군에서부터 CFU(coliny forming units)가 감소하여 2.4 J/cm2가 조사된 실험군에서는 헬리코박터 파일로리 콜로니가 나타나지 않아 항균활성을 나타내는 레이저 조사량으로 확인되었다. 반면, 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa 및 Pre3SL + 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 대조군에서는 음성 대조군과 유사한 수준의 헬리코박터 파일로리 개체수가 유지되는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 2.4 J/cm2 세기로 레이저가 조사될 경우 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa가 매우 우수한 헬리코박터 파일로리 항균활성을 나타내는 것이 확인되었으며, 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)는 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa 및 Pre3SL + 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa 대조군보다 헬리코박터 파일로리와 매우 우수하게 상호작용하는 것이 확인되었다.
< 실험예 7> 공초점 현미경 분석을 이용한 헬리코박터 파일로리 인지능 혼성 화 물질의 상호작용 및 불활성화 확인
실시예 1과 같이 합성된 헬리코박터 파일로리 인지능 혼성화 고분자가 생체 외 (in vitro)에서 헬리코박터 파일로리 SS1 균주와 상호작용하며, 레이저 조사에 의해 헬리코박터 파일로리의 불활성화를 유도할 수 있지 확인하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (HSP)를 페오포르비드 a (1 μg/ml) 기준으로 UV spectrophotometer를 이용하여 정량 후 증류수를 이용하여 희석하고 헬리코박터 파일로니 SS1 균주 1×106 CFU/ml와 혼합하여 37℃, 2시간 동안 인큐베이션하였다.
또한, 헬리코박터 파일로리 인지능을 갖지 않은 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa를 상기와 동일한 과정으로 헬리코박터 파일로니 SS1 균주와 혼합하여 37℃, 2시간 동안 인큐베이션한 후 상기 대조군을 6SL-LRP로 표기하였다.
또 다른 대조군으로 3'-시알릴락토오스 (Pre3SL) 5 mg/ml를 미리 30분 동안 헬리코박터 파일로니 SS1 균주 1ml (1×106 CFU/ml)과 인큐베이션한 후 원심분리(4000rpm, 2분)하여 상층액을 제거하였다. 이후 D.W로 재분산시키고 상기 과정을 2번 반복 실시하였다. 이후 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa을 처리하고, 37℃, 2시간 동안 인큐베이션하였으며, 상기 대조군을 3SL-LRHSP로 표기하였다.
각 실험군의 인큐베이션이 끝난 후 각각의 실험군을 원심분리 (4000 rpm, 2분)한 후 상층액을 제거하였다. 이후 D.W로 재분산시켰으며 상기 과정을 2번 반복하였다.
그 후, 50 mW 레이저 세기로 총 10 J/cm2 의 레이저를 조사하고, 헬리코박터 파일로리를 SYTO 9과 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide)로 염색한 후 SYTO 9 (Green, Ex/Em 485/498), 프로피디움 아이오다이드(Red, Ex/Em 535/617), Cy5(pupple, Ex/Em 650/670)의 조건으로 형광이미지를 확인하였다.
그 결과, 도 14와 같이 HSP의 경우 정상적인 헬리코박터 파일로리에서 나타나는 STYTO 9(Green)의 형광과 3SL-LRHSP의 페오포르비드 a의 Cy5(pupple) 형광이 대부분 일치하는 것이 확인됨에 따라, 3SL-LRHSP가 헬리코박터 파일로리와 상호작용하는 것이 확인하였다. 반면에 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa이 처리된 실험군(6SL-LRP)의 경우에는 정상적인 헬리코박터 파일로리에서는 STYTO 9(Green)의 형광을 나타내지만 HSP의 페오포르비드 a의 Cy5(pupple) 형광이 나타나지 않았으며, 또 다른 실험군으로 3'-시알릴락토오스를 30분 동안 전처리한 후 HSP를 처리한 실험군(Pre3SL + LRHSP) 역시 정상적인 헬리코박터 파일로리에서는 SYTO 9(Green)의 형광을 나타났지만 HSP의 페오포르비드 a의 Cy5(pupple) 형광은 나타나지 않았다.
상기 결과로부터 부틸-폴리(6SL-라이신)10-Pheoa와 3'-시알릴락토오스 전처리 후 처리된 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa은 헬리코박터 파일로리와 상호작용하지 않는 것이 확인되었다.
한편, 레이저 조사한 실험군 [Laser (+)로 표기]과 레이저를 조사하지 않은 실험군[Laser (-)로 표기]을 비교한 경우, 3SL-LRHSP 실험군은 3SL-LRHSP가 헬리코박터 파일로리와 상호작용 하기 때문에 레이저 조사에 의해 3SL-LRHSP의 페오포르비드 a에서 발생한 일항산소로 인하여 헬리코박터 파일로리 세포막의 손상으로 유도되고 이에 따라 헬리코박터 파일로리 내부로 들어가 형광 값을 나타내는 Propodium iodide(Red)가 확인되었다.
그러나 다른 6SL-LRP Laser(+), Laser(-), Pre3SL + 3SL-LRHSP Laser(+), Laser(-) 실험군에서는 레이저 조사 유무에 따라서 정상적인 헬리코박터 파일로리에서 나타나는 SYTO 9(Green) 형광만 확인되었을 뿐 프로피디움 아이오다이드(적색) 형광은 확인되지 않았다.
상기 결과로부터 3SL-LRHSP는 헬리코박터 파일로리를 인지하여 성공적으로 상호작용함에 따라, 레이저 조사에 시 페오포르비드 a에서 발생한 일항산소로 인하여 헬리코박터 파일로리가 효과적으로 불활성화되는 것이 확인되었다.
< 실험예 8> in vivo 헬리코박터 파일로리 인지능 혼성화 고분자의 헬리코박터 파일로리 감염 치료 효과 확인
실시예 1과 같이 제조된 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자 부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa(3SL-LRHSP)의 헬리코박터 파일로리 감염치료 효과를 확인하기 위해 생체 내(in vivo)에서 확인하였다.
헬리코박터 파일로리(H. pylori) SS1 균주를 10% 말 혈청(Welgene, Korea)이 첨가된 brucellabroth(bacto tryptone 10 g, bacto peptamin 10 g, bacto dextrose 1 g, bacto yeast extract 2 g, sodium chloride 5 g, sodium bisulfite 0.1 g; Difco, USA)를 이용하여 배양하였다. 혐기성 조건을 유지시켜 주기 위하여 인큐베이터는 10%의 CO2, 95% 이상의 습도를 유지하였으며, 온도는 37℃를 유지하였다.
또한, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) SS1 균주 200 μl(3×108 CFU/m)를 balb c 마우스에 일주일 동안 이틀 간격으로 총 3번 경구투여하여 접종 및 감염을 유발시켰다.
이후 2주 동안 감염 발달을 진행시키고 헬리코박터 파일로리 감염 치료에 효과가 있는 항쟁제 기반의 삼제요법 [OCA; 오메프라졸(Omeprazole) 400 μmol/kg, 아목시실린(amoxicillin) 68 μmol/kg, 및 클라리스로마이신(clarithromycin) 19.1 μmol/kg)을 3일 동안 1일 간격으로 경구 투여하였으며(경구 투여 6시간 전부터 balb c는 절식), 3SL-LRHSP[부틸-폴리(3SL-라이신)10-Pheoa (pheophorbide a 기준 0.5 μg/ml 농도)]를 3번째 OCA 투여 시 함께 투여하고 30분 후 미세 섬유 레이저 (micro fiber laser)를 이용하여 위 속으로 레이저를 조사하였다.
레이저 조사는 40mW 레이저를 250초 동안 총 10 J/cm2 조사하였으며, 대조군으로 PBS와 OCA가 투여된 동물실험군에도 같은 양의 레이저를 조사하여 추가 비교하였다. (레이저를 조사한 그룹은 (+)로 표기, 레이저를 조사하지 않은 그룹은 (-)로 표기) 최종 약물 투여 이후 이틀 뒤, balb c의 위를 떼어내어 반을 가르고 PBS 10 ml로 위 조직을 씻어내고 cell strainer를 이용하여 위 속 부유물을 걸러내고, 남은 헬리코박터 파일로리 SS1 균주(H.pylori SS1 strain) 용액을 이용하여 CFU assay를 수행하였다.
CFU assay에 사용된 배지는 Skirrow's supplement[반코마이신 (10 mg/l), 폴리믹신 B (2-5 IU/ml), 트리메소프림 (5 mg/l)]가 포함되었으며, 2-3일 후 배지에 나타난 콜로니 수를 세어 CFU assay를 통해 최종적인 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질의 감염 치료 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 15와 같이 PBS(-) 및 PBS(+) 그룹의 경우, 각각 약 1.1×107 CFU/stomach, 1.4×107 CFU/stomach의 헬리코박터 파일로리 콜로니가 확인되었으며, OCA(-) 및 OCA(+) 실험군에서는 각각 2.6×106 및 4.4×106 CFU/stomach의 헬리코박터 파일로리 콜로니가 확인되었다. 마지막으로 3SL-LRHSP(-) 및 3SL-LRHSP(+) 실험군에서는 각각 1.6×107 및 6.7×104 CFU/stomach의 헬리코박터 파일로리 콜로니를 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 PBS(-), PBS(+) 및 3SL-LRHSP(-) 실험군의 CFU assay 결과가 유사한 수준으로 확인됨에 따라, 상기 실험군들에서는 레이저 조사 유무에 의한 헬리코박터 파일로리의 감염 수준 감소 영향은 크게 차이 나지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 기존의 헬리코박터 파일로리를 치료하는 항생제 기반 방법인 OCA(-) 및 OCA(+) 대조군에서도 레이저 조사 유무에 의한 영향은 거의 나타나지 않는 것이 확인되었다.
반면, 3SL-LRHSP이 처리된 실험군에서는 PBS(-), PBS(+) 및 3SL-LRHSP(-)와 비교하여 약 1.5×102 ~ 2.3×102 배의 콜로니가 감소하였으며, 기존의 헬리코박터 파일로리 치료제가 처리된 OCA(-) 및 OCA(+) 실험군 보다도 3.8 ~ 6.5 배의 콜로니가 감소된 것이 확인되었다.
콜로니 감소는 위장관 내 감염력을 가지는 헬리코박터 파일로리 개수가 감소된 것을 의미하는 데, 상기 실시예 1과 같이 제조된 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 고분자는 기존의 항생제를 이용한 헬리코박터 파일로리 치료 효과보다 약 3.8 ~ 6.8배 정도 더 우수한 감염 치료 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
<실험예 9> 폴리라이신 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질의 in vitro 헬리코박터 파일로리 항균 활성 확인
상기 실시예 2, 3, 4 및 5에서 제조된 폴리라이신 기반의 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질 Butyl(3SL-lysine)10-Ce6, Butyl(3SL-lysine)10-PPIX, Butyl(3SL-lysine)10-HPP 및 Butyl(3SL-lysine)10-SSiPC가 헬리코박터 파일로리 불활성 효과를 나타내는 농도 및 항균활성을 In vitro에서 확인하였다.
1. 실험 방법
헬리코박터 파일로리 SS1 (Helicobacter pylori strain SS1)을 헬리코박터 파일로리 균주은행에서 분양받아 사용하였다. 균의 배양에는 10% 말혈청 (Welgene, Korea)을 첨가한 brucellabroth (Difco,USA)를 이용하였으며, 배지의 조성은 bacto tryptone 10 g, bacto peptamin 10 g, bactodextrose 1 g, bacto yeast extract 2 g, sodium chloride 5 g, sodium bisulfite 0.1 g으로 구성되었다. 혐기성 조건을 유지시켜 주기 위하여 인큐베이터는 10%의 CO2, 95% 이상의 습도를 유지하였으며, 온도는 37℃를 유지하였다.
또한 헬리코박터 파일로리 (SS1 strain) 1 ml(5*105 CFU/ml)에 3‘-Sialyllactose (3SL로 표기)의 헬리코박터 파일로리 인지능 효과를 확인하기 위하여 같은 농도의 유리 광응답제(Ce6, PPIX, HPP, SSiPC)를 DMSO에 과량 녹여 증류수로 희석하여 헬리코박터 파일로리 인지용 복합체와 각 농도를 맞추었다.
또한 각각의 물질은 헬리코박터 파일로리와 미리 37℃, 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 4000 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 1 ml의 PBS를 이용하여 분산시켰다. 상기 과정을 2회 반복하여 헬리코박터 파일로리와 반응하지 않은 미반응물을 제거한 후 Butyl(3SL-lysine)10-Ce6, Butyl(3SL-lysine)10-PPIX, Butyl(3SL-lysine)10-HPP, Butyl(3SL-lysine)10-SSiPC (각각의 광응답제 Ce6, PPIX, HPP, SSiPC 기준 0 - 50 μg/ml 농도)와 섞어주고 37℃, 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 4000 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이후 PBS 1 ml를 이용하여 재분산시켰다. 상기 과정 2회 반복하여 헬리코박터 파일로리와 반응하지 않는 미반응물들을 제거하였다.
이 후 각각의 실험군에 50 mW 세기로 각각 200초 동안 레이저를 조사한 후 희석하여 CFU assay를 진행하였다.
2. 실험 결과
도 37과 같이 Butyl(3SL-lysine)10-Ce6는 Ce6 농도 기준 0.5 μg/ml에서부터 헬리코박터 파일로리 콜로니 수가 감소하여 1.0 μg/ml에서는 콜로니가 거의 나타나지 않는 것이 확인됨에 따라, 레이저(10.0 J/cm2) 조사 시 항균활성을 나타내는 적정 농도임이 확인되었다. 또한, Butyl(3SL-lysine)10-PPIX는 PPIX 농도 기준 5.0 μg/ml 에서부터 헬리코박터 파일로리 콜로니 수가 감소하여 10.0 μg/ml는 콜로니가 거의 나타나지 않는 것이 확인됨에 따라, 레이저(10.0 J/cm2) 조사 시 항균활성을 나타내는 적정 농도인 것을 확인되었다.
반면, 대조군으로 유리 Ce6 및 PPIX가 각각 처리된 헬리코박터 파일로리 콜로리에서는 유리 Ce6 및 PPIX 농도 기준 50.0 μg/ml에서 NC군에 대비하여 절반을 상회하는 콜로니 결과 값을 확인하였다.
한편, 도 38을 참고하면 [butyl(3SL-lysine)10-HPP]은 HPP 농도 기준 10.0 μg/ml 이면서 10.0 J/cm2 레이저가 조사되었을 때 1*105 CFU/ml에서 3*103 CFU/ml로 헬리코박터 파일로리 콜로니의 갯수가 감소하였으며, 특히 HPP 농도 기준 25.0 μg/ml 이상의 농도에서는 대조 실험군인 유리 HPP 비교군에 비하여 헬리코박터 파일로리가 더 이상 자라지 않는 것이 확인되었다. 또한, [butyl(3SL-lysine)10-SSiPC]은 SSiPC 농도 기준 25.0 μg/ml 이면서 10.0 J/cm2 레이저가 조사하였을 때 1*105 CFU/ml에서 4*103 CFU/ml로 헬리코박터 파일로리 콜로니의 갯수가 감소하는 것이 확인되었으며, 50.0 μg/ml는 콜로니가 나타나지 않아 레이저(10.0 J/cm2) 조사 시 항균활성을 나타내는 적정 농도임이 확인되었다.
반면, 대조군으로 유리 HPP 및 SSiPC가 각각 처리된 헬리코박터 파일로리 콜로리에서는 유리 HPP 및 SSiPC 농도 기준 50.0 μg/ml에서 NC군에 대비하여 절반을 상회하는 콜로니 결과 값을 확인하였다.
상기 결과로부터 butyl(3SL-lysine)10-Ce6, butyl(3SL-lysine)10-PPIX, butyl(3SL-lysine)10-HPP 및 butyl(3SL-lysine)10-SSiPC 혼성화 물질은 우수한 헬리코박터 파일로리 불활성화 효과를 나타내는 것이 확인된 반면, 유리 Ce6, PPIX, HPP 및 SSiPC는 같은 레이저 양을 조사하였을 때 헬리코박터 파일로리와 상호작용하는 시알릴락토오스(3SL)가 존재하지 않아서 헬리코박터 파일로리와 제대로 상호 작용하지 못하여 항균 활성 효과가 거의 나타나지 않는 것이 확인됨에 따라, 상기 혼성화 물질들은 우수한 헬리코박터 파일로리 인지능을 나타내어 항균 활성 효과를 향상시킬 수 있음이 확인되었다.
<실험예 10> 키토산 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질의 in vitro 헬리코박터 파일로리 항균 활성 확인
상기 실시예 6에서 제조된 키토산 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질 3‘-Sialyllactose-Chitosan-Pheophorbide a (3SL-Chitosan-Pheoa)의 헬리코박터 파일로리 불활성 효과를 나타내는 농도 및 항균활성을 In vitro에서 확인하였다.
앞서 진행된 실험예 9의 실험방법과 동일한 과정으로 CFU assay를 수행하여 Helicobacter pylori(SS1 strain) 5*105 CFU/ml 기준으로 Negative control(NC로 표기)과 레이저만 조사한 실험군(Only laser로 표기) 대비 키토산 기반 헬리코박터 파일로리 인지용 광감작 혼성화 물질 3SL-Chitosan-Pheoa과 유리 Pheoa 비교군의 콜로니 수를 확인하였다.
그 결과, 도 39와 같이 3SL-Chitosan-Pheoa의 경우 Pheoa 농도 기준 10.0 μg/ml 에서부터 헬리코박터 파일로리 콜로니 수가 감소하기 시작하여 25.0 μg/ml는 콜로니가 나타나지 않아 일정량의 레이저(10.0 J/cm2)을 조사하였을 때 항균활성을 나타내는 적정 농도임이 확인되었다. 반면 대조 실험군 유리 Pheoa에서는 Pheoa 농도 기준 50.0 μg/ml 일 때 NC 대비하여 절반에 조금 못 미치는 콜로니 결과 값을 확인하였다.
상기 결과로부터 Pheoa 농도 기준 25.0 μg/ml 이상의 농도에서는 대조 실험군인 유리 Pheoa 비교군 보다 헬리코박터 파일로리 더 이상 자라지 않는 것으로 보아 3SL-Chitosan-Pheoa의 우수한 항균활성능을 나타내는 것이 확인된 반면, 유리 Pheoa는 같은 레이저 양을 조사하였을 때 헬리코박터 파일로리와 상호작용하는 시알릴락토오스(3SL)가 존재하지 않아서 헬리코박터 파일로리와 제대로 상호 작용하지 못하고 이후에 세척 단계에서 헬리코박터 파일로리와 상호작용하지 못한 물질들이 대부분 씻겨져 나가서 헬리코박터 파일로리 혼성화 물질 3SL-Chitosan-Pheoa에 비하여 항균 활성 능력을 거의 나타내지 못하는 것이 확인되었다.
<실험예 11> 폴리에틸렌글리콜(PEG) 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질의 in vitro 헬리코박터 파일로리 항균 활성 확인
상기 실시예 7에서 제조된 PEG 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질 3‘-Sialyllactose-PEG-Pheophorbide a (3SL-PEG-Pheoa)의 헬리코박터 파일로리 불활성 효과를 나타내는 농도 및 항균활성을 In vitro에서 확인하였다.
1. 실험방법
헬리코박터 파일로리 SS1 (Helicobacter pylori strain SS1)을 헬리코박터 파일로리 균주은행에서 분양받아 사용하였다. 균의 배양에는 10 % horse serum(Welgene, Korea)을 첨가한 brucellabroth (Difco,USA)를 이용하였으며, 배지의 조성은 bacto tryptone 10 g, bacto peptamin 10 g, bactodextrose 1 g, bacto yeast extract 2 g, sodium chloride 5 g, sodium bisulfite 0.1 g으로 구성되었다. 혐기성 조건을 유지시켜 주기 위하여 인큐베이터는 10%의 CO2, 95% 이상의 습도를 유지하였으며, 온도는 37℃를 유지하였다.
또한 Helicobacter pylori(26695 strain) 1 ml(1*105 CFU/m)l에 3SL-PEG-Pheoa의 농도를 고정(50 μg/ml) 후 레이저 세기에 따른 광역학 항균 치료 효과를 확인하였다. 또한 각각의 물질은 헬리코박터 파일로리와 미리 37℃, 30분 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후 4000 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 1 ml의 PBS를 이용하여 분산시켰다. 상기 과정 2 회 반복하여 헬리코박터 파일로리와 반응하지 않은 미반응물을 제거한 후 3SL-PEG-Pheoa (Pheoa 기준 50 μg/ml 농도)와 섞어주고 37℃, 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 4000 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, PBS 1 ml를 이용하여 재분산시켰다. 상기 과정을 2회 반복하여 헬리코박터 파일로리와 반응하지 않는 미반응물들을 제거하였다.
이후 Brucellebroth 아가 배지에 반응 헬리코박터 파일로리를 플레이트에 고르게 접균한 뒤 각각의 실험군에 100 mW 세기로 각각 0-50 J/cm2의 레이저를 조사하고, 이틀 뒤 플레이트에 3SL-PEG-Pheoa에 의한 광역학 치료 효과로 억제 영역(Inhibition zone) 형성을 확인하였다.
2. 실험 결과
도 40과 같이 3SL-PEG-Pheoa의 경우 Pheoa 농도 기준 (50.0 μg/ml) 에서 10 J/cm2에서 헬리코박터 파일로리가 자라지 않는 억제 영역이 확인이 되었으며, 30, 40, 50 J/cm2의 레이저 세기에서도 역시 억제 영역을 확인되었다. 반면, 레이저가 조사되지 않은 비교군에서는 억제 영역이 나타나지 않았다.
상기 결과로부터 3SL-PEG-Pheoa 혼성화 물질은 우수한 헬리코박터 파일로리 불활성화 효과를 나타낼 수 있으며, 특히, 헬리코박터 파일로리 광역학적 불활성화가 가능한 혼성화 물질의 잠재성을 가진 것이 확인되었다.
<실험예 12> 풀루란(Pullulan) 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질의 in vitro 헬리코박터 파일로리 항균 활성 확인
상기 실시예 8에서 제조된 풀루란 기반 헬리코박터 파일로리 인지능 광감작 혼성화 물질 3'-Sialyllactose-Pullulan-Pheophorbide a (3SL-PU-Pheoa)의 헬리코박터 파일로리 불활성 효과를 나타내는 농도 및 항균활성을 In vitro에서 확인하였다.
앞서 진행된 실험예 9의 실험방법과 동일한 과정으로 CFU assay를 수행하여 Helicobacter pylori(SS1 strain) 5*105 CFU/ml 기준으로 Negative control(NC로 표기)과 레이저만 조사한 실험군(Only laser로 표기) 대비 풀루란 기반 헬리코박터 파일로리 인지용 광감작 혼성화 물질 3SL-PU-Pheoa과 유리 광감작제 Pheoa 비교군의 콜로니 수를 확인하였다.
그 결과, 도 41과 같이 3SL-PU-Pheoa의 경우 Pheoa 농도 기준 20.0 μg/ml에 10.0 J/cm2 레이저 조사하였을 때 1*105 CFU/ml에서 5*103 CFU/ml로 헬리코박터 파일로리 콜로니의 갯수가 감소하는 것이 확인되었다. 반면, Pheoa 농도 기준 50.0 μg/ml 이상의 농도에서는 대조 실험군인 유리 Pheoa 비교군 보다 헬리코박터 파일로리기 더 이상 자라지 않는 것이 확인되었다.
반면, 비교군 유리 Pheoa에서는 같은 레이저 양을 조사하였을 때 Pheoa 농도 기준 50.0 μg/ml에서도 9*102 CFU/ml의 헬리코박터 파일로리 콜로니를 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 3SL-Chitosan-Pheoa 혼성화 물질은 우수한 헬리코박터 파일로리 항균활성능을 나타내는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 고분자 복합체는 수용성 고분자의 아민기 또는 하이드록시기와 광감작제의 카르복시기가 결합하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 고분자 복합체는 수용성 고분자의 아민기와 시알릴락토오스의 하이드록시기가 결합하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 수용성 고분자는 폴리라이신, 폴리에틸렌글리콜, 폴리 에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 광감작제는 클로린류(chlorins), 포피린류(phophyrins) 및 프탈로시아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 시알릴락토오스는 3'-시알릴락토오스(sialyllactose)인 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 헬리코박터 파일로리 균주는 헬리코박터 파일로리 26695, 헬리코박터 파일로리 SS1, 헬리코박터 파일로리 51 및 헬리코박터 파일로리 52으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체.
    [화학식 1]
    Figure pat00007

    상기 화학식 1에 있어서, X는 1 내지 15의 정수임.
  9. 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 포함하는 헬리코박터 파일로리에 의해 유도되는 위 질환 광역학 치료용 약학조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 위 질환은 십이지장궤양, 위염, 위궤양, 위하수증, 위산과다증, 위 확장증, 무산증, 공기연하증, 위경련, 유문협착, 위축염전증, 위폴립, 위석, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 관련 위 질환 광역학 치료용 약학조성물.
  11. 광감작제; 시알릴락토오스; 및 연결체로서 수용성 고분자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 진단용 조성물.
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